EA010163B1 - СВЯЗАННЫЕ С МАТРИЦЕЙ ПЕПТИДОМИМЕТИКИ β-ШПИЛЕЧНОЙ СТРУКТУРЫ С АКТИВНОСТЬЮ АНТАГОНИСТОВ CXCR4 - Google Patents

Abstract

Связанные с матрицей β-шпилечные пептидомиметики общей формулы (I)где Z представляет собой связанную с матрицей цепочку из 12, 14 или 18 α-аминокислотных остатков, которые, в зависимости от положения в цепи (считая, начиная с N-концевой аминокислоты), представляют собой Gly, NMeGly, Pro, или Pip, или остатки определенных типов, которые, как и остальные символы в приведенной выше формуле, определены в описании и формуле изобретения, и соли этих соединений, которые обладают свойствами антагонистов CXCR4 и могут применяться для предотвращения ВИЧ-инфекций у здоровых людей или для замедления или остановки развития вируса у инфицированных пациентов; или в случае, если рак опосредован или вызван активностью рецептора CXCR4; или в случае, если иммунологические заболевания опосредованы или вызваны активностью рецептора CXCR4; или для лечения иммуносупрессии; или при аферезном сборе стволовых клеток периферической крови. Эти β-шпилечные пептидомиметики можно получать при помощи способа, основанного на смешанной стратегии твердофазного синтеза и синтеза в растворе.

Description

Настоящее изобретение обеспечивает связанные с матрицей пептидомиметики β-шпилечной структуры, включающие связанные с матрицей цепи из 12, 14 или 18 α-аминокислотных остатков, которые, в зависимости от положения в цепи, представляют собой О1у, ΝΜοΟΙν. Рго или Ρίρ, или определенные остатки, описанные ниже. Эти связанные с матрицей β-шпилечные миметики обладают активностью антагонистов СХСК4. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает эффективный процесс синтеза, согласно которому эти соединения можно при желании получать параллельно в формате библиотеки. Эти β-шпилечные пептидомиметики демонстрируют повышенную эффективность, биодоступность, период полураспада и, что наиболее важно, значительно улучшенное соотношение между активностью антагонистов СХСК.4, с одной стороны, и гемолизом по отношению к эритроцитам и цитотоксичностью, с другой стороны.

К настоящему времени доступные терапии в лечении ВИЧ-инфекций приводили к значительному улучшению симптомов и к восстановлению от заболевания у инфицированных людей. Хотя высокоактивная антиретровирусная терапия (НААКТ терапия), включающая комбинацию ингибиторов обратной транскриптазы и протеазы, значительно улучшила клиническое лечение пациентов со СПИД или ВИЧ, все еще оставалось несколько серьезных проблем, включая множественную лекарственную устойчивость, значительные побочные эффекты и высокую стоимость. Наиболее необходимыми являются агенты против ВИЧ, блокирующие ВИЧ-инфекцию на ранней стадии, такой как проникновение вируса.

Недавно было обнаружено, что для эффективного проникновения в клетки-мишени вирусам иммунодефицита человека необходимы хемокиновые рецепторы ССК5 и СХСК4, а также первичный рецептор СБ4 (Ν. Ьеуу, Епд1. 1. Мей., 335, 29, 1528-1530). Соответственно, агент, способный блокировать хемокиновые рецепторы СХСК4, должен предотвращать инфекцию у здоровых людей и снижать или останавливать прогрессию вируса у инфицированных пациентов (8с1епсе, 1997, 275, 1261-1264).

Среди различных типов ингибиторов СХСК4 (М. 8сйетаг/, Т.КС. Ае11з, А.Е.1. РгоийТоо!, Кесер1ог8 и СйаппеН, 2001, 7, 417-428) один выявленный класс основан на встречающихся в природе аналогах катионных пептидов, происходящих от пептида Ро1урйети81п II, имеющего антипараллельную структуру β-слоев и β-шпильку, поддерживаемую двумя дисульфидными мостиками (Н. Ν;·ι1<;·ΐ51ιίιη;·Γ М. Мазийа, Т. Мигакатц Υ. Коуападк А. Ма!8ито!о, Ν. ЕиЩ, Ν. Уатато!о, Апйт1сгоЫа1 Адеп1з и Сйето!й. 1992, 36, 1249-1255; Н. Тататига, М. Кигойа, М. Мазийа, А. О1ака, 8. ЕипакокЫ, Н. Nака8Й^та, Ν. Υататоΐо, М. Аак1, А. Ма!8ито!и, ЕМ. Ьапсейп, Ό. Коййа, 8. Та!е, Е. 1падак1, Ν. ЕиЩ, ВюсЫт. Вюрйуз. Ас!а 1993, 209, 1163; АО 95/10534 А1).

Синтез структурных аналогов и изучение структуры методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) показало, что катионные пептиды принимают четкие β-шпилечные конформации благодаря удерживающему влиянию одного или двух дисульфидных мостиков (Н. Тататига, М. 8идюка, Υ. Ойадак1, А. Отадап, Υ. Кайи, 8. Окйк Н. Nака8Й^та, Ν. Υататоΐо, 8.С. Ре1рег, Ν. Натапака, А. О!ака, Ν. ЕиЩ, Вюогд. Мей. Сйет. Ьей. 2001, 359-362). Эти результаты показывают, что β-шпилечная структура играет важную роль в активности антагониста СХСК4.

Дополнительные исследования структуры показали, что на антагонизирующую активность также может влиять модулирующая амфифильная структура и фармакофор (Н. Тататига, А. Отадап, К. Н1гата!8и, К. Оо!ой, Т. Капато!о, Υ. Хи, Е. Койата, М. Майиока, Т. Найоп, Ν. Υататоΐо, Н. Nака8Й^та, А. О!ака, Ν. Еищ, Вюогд. Мей. Сйет. Ьей. 2001, 11, 1897-1902; Н. Тататига, А. Отадап, К. Нйата^и, 8. О18Й1, Н. НаЬазййа, Т. Капато!о, К. Оо!ой, Ν. Υататоΐо, Н. Nака8Й^та, А. О1ака Ν. ЕиЩ, Вюогд. Мей.Сйет. 2002, 10, 1417-1426; Н. Тататига, К. Нйата!8и, К. М1уато!о, А. Отадап, 8. О18й1, Н. Nака8й1та, Ν. Υататоΐо, Υ. Кигойа, Т. Nакада^а, А. О1ак1, Ν. ЕиЩ, Вюогд. Мей. Сйет. Ьейегз 2002, 12, 923928).

Основной проблемой в разработке пептидов-антагонистов СХСК4 является селективность. Аналоги, полученные из Ро1урйети8ш II, несмотря на улучшения, еще вызывают цитотоксичность (К. Ма!вихакг М. Рикш, Ν. Еи)й, К. М1уа_рта, ВюсЫт. Вюрйуз. Ас!а 1991, 259, 1070; А. О1ака, Н. Тататига, Υ. Тегака^а, М. Мазийа, Т. Ко1йе, Т. Мигакатц Н. Nака8Й^та, К. МаЕнхакк К. М1уа_цта, Т. Ыика, М. Аак1, А. Ма!8ито!о, Ν. Υататоΐо, Ν. Еи)й Вю1. Рйагт. Ви11. 1994,17, 1669 и ссылки, процитированные выше).

Такая цитотоксичность существенно сдерживает применение Ы у1уо и представляет серьезный недостаток при клиническом применении. Перед рассмотрением возможности внутривенного применения следует адекватно оценить такие серьезные проблемы, как общая токсичность, протеин-связывающая активность в сыворотке крови, а также стабильность протеазы.

Недавно было показано, что рецептор СХСК4 участвует не только в проникновении ВИЧ, но и в хемотаксической активности раковых клеток, такой как метастаз рака молочной железы или метастаз рака яичников (А. Ми11ег, В. Нотеу, Н. 8о!о, Ν. Ое, Ό. Са1гоп, М.Е. Висйапап, Т. Мс С1апайап, Е. Мигрйеу, А. Υиаи, 8.Ν. Аадпег, I. Ьшз Валета, А. Мойаг, Е. УегаЧедик А. 21о1п1к, №11иге 2001, 50, 410, I. М. На11, К. 8. Когасй, Мо1еси1аг Епйосппо1оду, 2003, 1-47), неходжкинской лимфомы (Е. ВейоНЫ, С. Бе11Адпо1а, Р. Мапизсо, С. КаЬазсю, А. ВшйЫ, 8. Мопезйгой, А. ОойЫ, О. Ргипеп, О. МагйпеШ, Сапсег Кезеагсй 2002, 62, 3106-3112) или рака легких (Т. Кгрта, О. Маийк, Р.С. Ма, Е.У. Т1Ьа1й1, К.Е. Тигпег, В. КоШпз, М. 8а!Йег, В.Е. Ыйпвоп, К. 8а1д1а, Сапсег Кезеагсй 2002, 62, 6304-6311), меланомы, рака простаты,

- 1 010163 рака почки, нейробластомы, рака поджелудочной железы, множественной миеломы, хронической лимфоцитарной лейкемии (Н. Тататига е! а1. ЕеЬк Ьейегк 2003, 550, 79-83, процитированные ссылки). Блокирование хемотаксической активности при помощи ингибитора СХСВ4 должно остановить миграцию раковых клеток.

Рецептор СХСВ4 также задействован в росте и пролиферации опухолей. Было показано, что активация рецептора СХСВ4 имеет критическое значение для роста как злокачественных неврональных и глиальных опухолей, так и немелкоклеточных опухолей легких. Более того, системное введение антагониста рецептора СХСВ4 АМЭ3100 ингибирует рост внутричерепной глиобластомы и ксенотрансплантатов медуллобластомы путем усиления апоптоза и снижения пролиферации раковых клеток (ВиЫп 1.В., Кипд А.Ь., К1ет В.8., Скал 1.А., 8ип Υ., 8с1ишй1 К., Кгегаи М.А., Ьик1ег Ά.Ό., 8еда1 В.А. Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А. 2003 100(23): 13513-13518, ВагЬего 8., Вопау1а В., Ва)ейо А., Рогсйе С., Рпаш Р., ВауеЫ 1.Ь., 2опа С.Ь., 8рах1ап1е В., Б1опо Т., 8сйей1ш С. 8йота1 Сапсег Век. 2003, 63(8): 1969-1974, Кгрта Т., Маи11к С., Ма Р.С., Т1Ьа1й1 Е.У., Тигпег В.Е., ВоШпк В., 8ай1ег Μ., 1оРпкоп В.Е., 8а1ща В. Сапсег Век. 2002; 62(21):6304-6311, Сапсег Век. 2002;62(11):3106-3112).

Хемокинетический полученный из стромальных клеток фактор-1 (СХСЬ12/8ЭЕ-1) и его рецептор СХСВ4 вовлечены в транспорт В клеток и гемопоэтических предшественников. Было показано, что рецептор СХСВ4 играет важную роль в высвобождении стволовых клеток из костного мозга в периферическую кровь. Например, рецептор экспрессирован на клетках СЭ34+ и вовлечен в процесс миграции и хоминга клеток СЭ34+. Эта активность рецептора СХСВ4 может иметь важное значение для эффективного аферезного сбора стволовых клеток периферической крови. Собственные клетки периферической крови обеспечивают быстрое и продолжительное гемопоэтическое восстановление после аутотрансплантации после введения высоких доз химиотерапии или радиотерапии у пациентов с гематологическими злокачественными образованиями и солидными опухолями. (А.С. Ьйек е! а1., В1оой 2003, 102, 27282730).

Появляется все больше данных, позволяющих предположить, что хемокинез в общем и взаимодействие между хемоаттрактантом СХСЕ12/фактором-1, полученным из стромальных клеток, и его рецептором СХСВ4, в частности, играет ведущую роль в ангиогенезе. Хемокинез индуцирует ангиогенез непосредственно путем связывания родственных рецепторов на эндотелиальных клетках, или опосредованно путем способствования инфильтратам воспалительных клеток, что дает дополнительный ангиогенный стимул. Было показано, что ряд провоспалительных хемокинов, включая интерлейкин 8 (1Ь-8), онкоген, регулируемый ростом, фактор 1, полученный из стромальных клеток (8ΌΕ-1), хемотактический белок моноцита 1 (МСР-1), эотаксин 1 и 1-309 действуют как непосредственные индукторы ангиогенеза. (Скеп X., ВеиНег РА., МсС1оий Т.С., ЬоеЫе1т А., Υаид Ь., Эопд Н.Е., Сйейоу Ο.Υ., 8а1сейо В., ОррепРеип П., Но\гагй О.М. С1ш Сапсег Век. 2003, 9(8):3115-3123, 8а1сейо В., ОррепРеип 1.1. МюгосйсЫайоп 2003, (3-4):359-370).

Хорошо известно, что хемокины вовлечены в ряд воспалительных патологий, и некоторые из них играют ключевую роль в модулировании развития остеокласта. Иммуноокрашивание для обнаружения 8ΌΕ-1 (СХСЬ12) в биопсиях синовиальной и костной тканей в образцах как с ревматоидным артритом (ВА), так и с остеоартритом (ОА), выявило значительное повышение уровней экспрессии в условиях воспаления. (Сгакк1 Е., СгсакОпо 8., Топедихх! 8., Р1асеп11п1 А., ЕассЫш А., ЬЬщпоИ С. 1 Се11 Р11укю1. 2004; 199(2):244-251). Кажется вероятным, что рецептор СХСВ4 играет важную роль в воспалительных заболеваниях, например, в таких, как ревматоидный артрит, астма или множественный склероз (К.В. 8йай1й1 е! а1., 8сапйша\'1ап 1оигпа1 оР 1штцпо1о§у, 2003, 57, 192-198, 1. А. Сопха1о 1. 1ттипо1. 2000, 165, 499-508, 8. На!ке е! а1., ЕЕВ8 Ьейегк, 2002, 527, 255-262 и процитированные ссылки).

Опосредование пополнения пула иммунных клеток в местах воспаления может быть остановлено ингибитором СХСВ4.

В описанных ниже соединениях использована новая стратегия для стабилизации β-шпилечных конформаций в циклических пептидомиметиках с изогнутым остовом, обладающих высокой активностью антагонистов СХСВ4, применимых для эффективного аферезного сбора стволовых клеток периферической крови, и обладающих противораковой и противовоспалительной активностью.

Эта стратегия включает пересадку катионной и гидрофобной последовательности шпильки на матрицу, функцией которой является удержание петли скелета пептида в рамках геометрии шпильки. На жесткость шпильки далее можно влиять введением дисульфидного мостика. Связанные с матрицей шпилечные пептидомиметики описаны в литературе (Ό. ОЬгесЫ, М. АЙогРег, 1.А. ВоЫпкоп, Айу. Мей. Сйет. 1999, 4, 1-68; 1.А. ВоЫпкоп, 8уп. Ьей. 2000, 4, 429-441), однако, такие молекулы ранее не оценивали с точки зрения разработки пептидов - антагонистов СХСВ4. Тем не менее, теперь обоснована возможность получения β-шпилечных пептидомиметиков при использовании методов комбинаторного и параллельного синтеза (Ь. Лапд, К. Моей1е, В. ЭРапараР Ό. ОЬгесЫ, 1.А. ВоЫпкоп, Не1у. СЫт. Ас!а. 2000, 83, 30973112).

Эти методы позволяют синтезировать и скринировать большие библиотеки шпилечных миметиков, что, в свою очередь, значительно способствует исследованиям зависимости активность от структуры и,

- 2 010163 следовательно, обнаружению новых молекул с высокой активностью антагониста СХСК4 или противораковой или противовоспалительной активностью и низкой хемолитической активностью по отношению к эритроцитам человека.

β-шпилечные пептидомиметики, полученные описанным здесь способом, применимы в качестве анти-ВИЧ-агентов, противораковых агентов, в качестве ингибиторов роста опухолей или индукторов апоптоза, антиметастатических и противовоспалительных агентов или агентов, которые можно применять в аферезном сборе стволовых клеток периферической крови.

β-шпилечные пептидомиметики согласно настоящему изобретению представляют собой соединения общей формулы

К

Матрица где

I

I к

Матрица представляет собой группу, характеризуемую одной из формул

А-СО означает °Рго, °О1п, 4-{2-[2-(метоксиэтокси)этокси]ацетиламино}-°Рго или О1у;

В-СО означает ^[Рго, ^[С1п, 4-{2-[2-(метоксиэтокси)этокси]ацетиламино}-^ЕРго или О1у; но А-СО и В-СО не могут оба быть О1у;

Ζ означает цепь из η α-аминокислотных остатков, причем η означает целое число 12, 14 или 18, а положения указанных аминокислотных остатков в цепи считают, начиная с Ν-концевой аминокислоты, причем эти аминокислотные остатки представляют собой, в зависимости от их положения в цепи, следующие:

если η означает 12, α-аминокислотные остатки в положениях с 1 по 12 цепи Ζ представляют собой

ΡΙ:	Туг;
Р2:	Аг^,
РЗ:	Сй;
Р4;	Уа1, РЬе, 61у, Не, Ж 61п, Суз;
Р5:	Аге;
Р6;	Аге, °Аге;
Р7:	Аге;
Р8:	Тгр, 2-ΝαΙ;
Р9:	Уа1, Рйе, С1у, Ле, ТЬг, С1п, Суз;
РЮ:	Туг;
Р11:	Сй, 61у; и
Р12;	Ьуз; или

Суз в положении Р4 и Р9 образует дисульфидный мостик;

если η означает 14, α-аминокислотные остатки в положениях с 1 по 14 представляют собой

Р1: Туг, С1п, Аг§, ΗΪ3, Не, Тгр, ТИг, С1и, Зег, Уа1, Мег, РЬе, С1у, Лир,

Теи, Ρίρ;

Р2: Аг§, Н 1з, Ьуз, 4-РугА 1а;

РЗ: С1(; Аг§, Юз, Не, Туг, Тгр, Рго, 01 и, Азп, Азр, Ьуз, А1а, Ьей, Уа1,4ЕРЬе, Ме1, Зег, Ткг, 01п, Туг;

Р4: Уа1, РЬе, Туг, (-ВиО, Суз, Зег, ОаЬ, С1и;

Р5: Аг§, ОаЬ, Зег, (ЕА)О;

Р6: Рго, 01 у, РИе, Уа1, СЙ, А 1а;

Р7: срго, Рго, О1у, Уа1;

Р8: Аг§, Туг, Тгр, Ткг, 4Р-РЬе, ОаЬ, 4-Руг А1а, 1зот, (1т)С, СЙ, Нгз, (рерОаЬ, °Рго;

Р9: Агё, (Ρΐρ)Ο, (ЕА)0, От, Рго;

РЮ: 2-Ыа1, Тгр, Туг;

Р11: РЬе, Туг, Уа1, г-ВиО, Суз, Азп, 01 и, ОаЬ, Аг§;

Р12: Туг, СЙ;

Р13: СЙ, 01п, Аг§, Ηίκ, Туг, Азп, Азр, Ьуз, А1а, Зег, Ьей, Мег,ММеО1у,

ТЪг, Суз; и

Р14; Ьуз, 01и, 01п, Азп, Азр, А1а, Зег, ΝΜεΚ;

при условии, ЧТО аминокислотный остаток в положении Р1 представляет собой Ρίρ или С1у; и/или аминокислотный остаток в положении РЗ представляет собой С1и, Аки, Акр, Т1п или С1и; и/или аминокислотный остаток в положении Р4 представляет собой Сук, 8ег или С1и; и/или аминокислотный остаток в положении Р5 представляет собой §ег или (ЕА)С; и/или аминокислотный остаток в положении Р6 представляет собой Р1гс. Уа1 или А1а; и/или аминокислотный остаток в положении Р7 представляет собой Уа1, Рго или ^ϋΡτο; и/или аминокислотный остаток в положении Р8 представляет собой Туг, Тгр, 4Е-Р11е, 4-РугА1а, (1т)С, Ηίκ или ^ϋΡτο; и/или аминокислотный остаток в положении Р9 представляет собой (ЕА)С; и/или аминокислотный остаток в положении Р11 представляет собой Уа1 или ί-ВиО; и/или аминокислотный остаток в положении Р12 представляет собой Туг или Сй; и/или аминокислотный остаток в положении Р13 представляет собой С1и. С1п. Акр, Аки, §ег, Т1п. Сук или ΝΜοΟΙν: и/или

Сук в положении Р4 и Р11 образуют дисульфидный мостик; и/или

С1и в положении Р4 и ОаЬ в положении Р11 образуют лактамовый мостик; и/или

ОаЬ в положении Р4 и С1и в положении Р11 образуют лактамовый мостик;

если и означает 18, α-аминокислотные остатки в положениях с 1 по 18 представляют собой

Р1:	Аг§;
Р2:	Аг§;
РЗ:	2-Ν31, Тгр, Туг;
Р4:	Суз;
Р5:	Туг;
Р6:	СИ, С1п, Аг§;
Р7:	Ьуз;
Р8:	Суз, С1у;
Р9:	Туг;
РЮ:	Туз, С’Ьуз, °Рго;
РН:	С1у, Рго, сРго;
ΡΙ2:	Туг;
Р13:	Суз, 01у;

-4010163

Р14:	Туг;
Р15:
Р16:	СИ, ТЬг, Ьуз;
Р17:	Сук; и
Р18:	Аг@; или

Су8 в положении Р4 и Р17 и/или в положении Р8 и Р13 образует дисульфидный мостик; и их фармацевтически приемлемые соли.

Согласно настоящему изобретению эти β-шпилечные пептидомиметики можно получить согласно способу, включающему:

(а') связывание соответствующим образом функционализированной твердой подложки с соединением общей формулы он X

Н—

Матрица

П где фрагмент о=

ВЦМатрица соответствует приведенному выше определению, а X представляет собой Ν-защитную группу, или, альтернативно, (а'а) связывание указанной соответствующим образом функционализированной подложки с соответствующим образом Ν-замещенным производным аминокислоты общей формулы

НООС-В-Н III или

НООС-А-Н IV где В и А соответствуют определениям выше, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(а'Ъ) удаление Ν-защитной группы с полученного таким образом продукта; и (а'с) связывание полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты вышеуказанной общей формулы IV и, соответственно, III, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(Ъ') удаление Ν-защитной группы с продукта, полученного на этапе (а') или (а'с);

(с') связывание полученного таким способом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится в положении 12, если η означает 12, или положении 14, если η означает 14, или положении 18, если η означает 18, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(сГ) удаление Ν-защитной группы с полученного таким образом продукта;

(е') связывание полученного таким способом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится на одно положение дальше от положения 12, если η означает 12, или положения 14, если η означает 14, или положения 18, если η означает 18, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Νзащищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(£) удаление Ν-защитной группы с полученного таким образом продукта;

(§') повторение этапов (е') и (£) до введения всех аминокислотных остатков;

(11') по желанию, селективное снятие защиты с одной или нескольких защищенных функциональных групп молекулы и соответствующее замещение освобожденной таким образом реакционноспособной группы (групп);

(Г) по желанию, формирование одной, двух или трех межцепочечных связей между боковыми цепями соответствующих аминокислотных остатков в противоположных положениях области β-цепи;

0') отсоединение полученного таким способом продукта от твердой подложки;

(к') циклизация продукта, отщепленного от твердой подложки;

- 5 010163 (1') удаление любых защитных групп на функциональных группах любых членов цепи аминокислотных остатков, и, по желанию, любых защитных групп, которые могут дополнительно присутствовать в молекуле; и (т') по желанию, превращение полученного таким способом продукта в фармацевтически приемлемую соль или превращение фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли, полученной таким способом, в соответствующее свободное соединение формулы I или в другую, фармацевтически прием лемую, соль.

Структурный элемент -А-СО- обозначает аминокислотные строительные блоки, которые в сочетании со структурным элементом -В-СО- образуют матрицы (а1) или (а2). Матрицы (а1) или (а2) составляют строительные блоки, Ν-концы и С-концы которых ориентированы в пространстве таким образом, что расстояние между этими двумя группами находится в пределах 4,0-5,5А. Пептидная цепь Ζ связана с С-концом и Ν-концом матриц (а1) или (а2) через соответствующие Ν- и С-концы таким образом, что матрица и цепь образуют циклическую структуру, такую как приведена в формуле I. В случае, если расстояние между Ν- и С-концами матрицы находится в пределах 4,0-5,5А, матрица индуцирует сеть Нсвязей, необходимую для формирования β-шпилечной конформации в пептидной цепи Ζ. Таким образом матрица и пептидная цепь образуют β-шпилечный миметик.

β-шпилечная конформация в высокой степени соотносится с активностью β-шпилечных миметиков настоящего изобретения в качестве антагонистов СХСК4. β-шпилечные стабилизирующие конформационные свойства матриц (а1) или (а2) играют ключевую роль не только для селективной активности антагониста СХСК4, но также и для синтетического процесса, описанного выше, поскольку включение матриц в начало или около середины линейных защищенных пептидных предшественников значительно повышает выходы циклизации.

Наиболее предпочтительными аминокислотными остатками в цепи Ζ являются производные природных α-аминокислот. Ниже приведен список аминокислот, которые, или остатки которых, подходят для целей настоящего изобретения, сокращения соответствуют общепринятой практике: трехбуквенный код

А1а	Ь-аланин	А
Аг§	Ь-аргинин	К
Азп	Ь-аспарагин	N
Азр	Ь-аспарагиновая кислота	ϋ
Суз	Ь-цистеин	С
С1и	Ь-глутаминовая кислота	Е
С1п	Ь-глутамин	Ω
С1у	глицин	6
Н18	Ь-гистидин	н
Не	Ь-изолейцин	I
Ьеи	Ь-лейцин	ь
Ьуз	Ь-лизин	к
Ме1	Ь-метионин	м
РЬе	Ь-фенил аланин	Е
Рго	Ь-пролин	Р
°Рго	ϋ-пролин	Ор
8ег	Ь-серин	8
ТЬг	Ь-треонин	Т
Тгр	Ь-триптофан
Туг	Ь-тирозин	Υ
Уа1	Ь-валин	V

однобуквенный код

К другим α-аминокислотам, которые, или остатки которых, подходят для целей настоящего изобретения, относятся

Сй Ь-цитруллин

От Ь-орнитин

- 6 010163

1-ВиС	Ь-трет-бутилглицин
2-ΝβΙ	Ь-2 - н афти ла лани н
Ρίρ	Ь-пипеко линовал кислота
ММеОу	Ν-метилглицин
Ϊ5ΟΓΠ	ί-(Ν' ,Ν'-ди изобутил) о р н ити н
ΝΜεΚ	Ε-Ν-метил ли зин
ОаЬ	Ь-1,4-диамино-масляная кислота
(РедОаЬ	Ь~2-амино-4{2-[2-(2-метокси-этокси)этокси]-
	ацети лам и но} масляная кислота
4-РугА1а	Ь-2-(4'пиридил)аланин
(ЕА)С	N -(2-ам и ноэти л)гл и ц и н
(1ш)С	Ъ1-[3-(Г-имидазолил)пропил]глицин
(Р!р)С	Ν- {3-[ Г -(4’ -метил пиперазини л)]пропи л} глицин
4Р-РЬе	Ь-4 -фторфе нилаланин

Пептидная цепь Ζ в β-шпилечных миметиках по изобретению содержит 12, 14 или 18 аминокислотных остатков. Положения с Р1 по Р12 и, соответственно, по Р14 или Р18 каждого аминокислотного остатка в цепи Ζ определяются следующим образом: Р1 представляет собой первую аминокислоту в цепи Ζ, которая своим Ν-концом связана с С-концом группы -В-СО- в матрице (а1) или группы -А-СО- в матрице (а2); а Р12 и, соответственно, Р14 или Р18 представляет собой последнюю аминокислоту в цепи Ζ, которая своим С-концом связана с Ν-концом группы -А-СО- в матрице (а1) или группы -В-СО- в матрице (а2).

К наиболее предпочтительным β-пептидомиметикам настоящего изобретения относятся пептидомиметики, описанные в примерах 21, 22, 38, 45, 51, 52, 53, 55, 56, 60, 61, 68, 75, 84, 85, 87, 101, 102, 105, 110, 120, 132, 147, 151, 152 и 160.

Процессы согласно настоящему изобретению можно с преимуществом проводить как параллельные матричные синтезы для получения библиотек связанных с матрицей β-шпилечных пептидомиметиков указанной выше общей формулы I. Такие параллельные синтезы позволяют получать наборы из многих (в норме от 24 до 192, обычно - из 96) соединений общей формулы I с высокими выходами и определенной чистоты, при минимизации образования димерных и полимерных побочных продуктов. Таким образом, ключевую роль играет правильный выбор функционализированной твердой подложки (т.е. твердой подложки с линкерной молекулой), матриц и мест циклизации.

Функционализированную твердую подложку удобно получать из полистирола, сшитого с, предпочтительно, 1-5% дивинилбензола; полистирола, покрытого полиэтиленгликолевыми спейсерами (Теи1аде1^к); и полиакриламидных смол (см. также ОЬгесЫ, Ό.; УШа1догбо, 1.-М., 8оНб-8ирроПеб СотЫпаЮпа! апб Рага11е1 Ξνηΐΐιεδίδ οί 8та11-Мо1еси1аг-Ае1д1й Сотроипб ЫЬгапек, Тс1га11сс1гоп Огдашс Сйепйк1гу 8епе§, Уо1. 17, Регдатои, ЕЕсуюг 8с1еисе, 1998).

Твердую подложку функционализируют посредством линкера, т.е. бифункциональной спейсерной молекулы, содержащей на одном конце якорную группу для прикрепления к твердой подложке, а на другом - селективно отщепляемую функциональную группу, используемую в процессах последующих химических превращений и отщепления. Для целей настоящего изобретения используют два типа линкеров.

Линкеры типа 1 разработаны для высвобождения амидной группы в кислых условиях (Шик Н., Тс1гайебгои Ьей. 1987, 28, 3783-3790). Линкеры этого типа образуют амиды карбоксильной группы аминокислот; примерами смол, функционализированных такими линкерными структурами, являются 4-[(((2,4диметоксифенил)Ешос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил]полистироловая (Р8) смола, 4[(((2,4-диметоксифенил)Ешос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил]-4-метилбензгидриламин полистироловая смола (амидная полистироловая МВНА смола Ринка, Шик апйбе МВНА Р8 Κεκίη) и 4[(((2,4-диметоксифенил)Ешос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил]бензгидриламин полистироловая смола (амидная полистироловая ВНА смола Ринка, Шик апйбе ВНА Р8 геыи). Предпочтительно подложку получают из полистирола, сшитого с, наиболее предпочтительно, 1-5% дивинилбензола, и функционализированного посредством 4-(((2,4-диметоксифенил)Етос-аминометил)феноксиацетамидо) линкера.

Линкеры типа 2 разработаны для высвобождения карбоксильной группы в кислых условиях. Линкеры этого типа образуют лабильные в кислых условиях сложные эфиры с карбоксильной группой аминокислот, обычно лабильные в кислых условиях сложные эфиры с бензилом, бензгидрилом и тритилом;

-7010163 примеры таких линкерных структур включают 2-метокси-4-гидроксиметилфенокси (линкер 8азг1п^К), 4(2,4-диметоксифенил-гидроксиметил)фенокси (линкер Ринка), 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифенокси)масляную кислоту (линкер НМРВ), тритил и 2-хлортритил. Предпочтительно подложку получают из полистирола, сшитого с, наиболее предпочтительно, 1-5% дивинилбензола, и функционализированного посредством 2-хлортритилового линкера.

При проведении параллельного матричного синтеза процессы согласно настоящему изобретению преимущественно проводят, как описано ниже, но специалисту в данной области техники будет понятно, как эти процессы следует модифицировать в случае необходимости синтеза одного соединения вышеуказанной формулы I.

В ряд реакционных сосудов (в норме от 24 до 192, обычно - 96) по количеству соединений, синтезируемых параллельным методом, загружают от 25 до 1000 мг, предпочтительно 100 мг, соответствующей функционализированной твердой подложки, предпочтительно 1-3% сшитого полистирола или смолы Теп1а§е1.

Используемый растворитель должен позволять смоле набухать, к таким растворителям относятся, без ограничения, дихлорметан (ДХМ, ИСМ), диметилформамид (ДМФ, ИМЕ), Ν-метилпирролидон (НМП, ΝΜΡ), диоксан, толуол, тетрагидрофуран (ТГФ, ТНЕ), этанол (Е1ОН), трифторэтанол (ТФЭ, ТТЕ), изопропиловый спирт и подобные. Смеси растворителей, содержащие по крайней мере один полярный растворитель (например, 20% ТЕЕ/ИСМ, 35% ТНЕ/ΝΜΡ) являются преимущественными для обеспечения высокой реактивности и сольватации связанных со смолой пептидных цепей (Е1е1бз, О. В., Е1е1бз, С. О., 1. Ат. СНет. 8ое. 1991, 113, 4202-4207).

С разработкой различных линкеров, высвобождающих С-концевую карбоксильную группу кислоты в умеренно кислых условиях, не влияющих на кислотолабильные группы, защищающие функциональные группы боковой цепи(ей), был достигнут значительный прогресс в синтезе защищенных пептидных фрагментов. Линкер - производное 2-метокси-4-гидроксибензилового спирта (линкер 8азг1п^К, Мегд1ег е1 а1., ТеЕаНебгоп Реп. 1988, 29, 4005-4008) отщепляется разбавленной трифторуксусной кислотой (0,5-1% ТЕА в ИСМ) и стабилен в условиях снятия защиты Етос в течение пептидного синтеза, причем с этой схемой защиты совместимы дополнительные защитные группы, основанные на Вос/1Ви. К другим линкерам, подходящим для процесса по настоящему изобретению, относятся суперкислотолабильный 4-(2,4диметоксифенил-гидроксиметил)фенокси линкер (линкер Ринка, Ктк, Н. ТеЕаНебгоп 1,еИ. 1987, 28, 37873790), при котором для удаления пептида требуется 10% уксусная кислота в ИСМ или 0,2% трифторуксусная кислота в ИСМ; линкер - производное 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифенокси)масляной кислоты (линкер НМРВ, Е1бг8Йе1тег & Каткег, Рерйбез 1991, 1990 131), который также отщепляется 1% ТЕА/ИСМ с образованием пептидного фрагмента, содержащего все кислотолабильные защитные группы боковой цепи; и, в дополнение, 2-хлортритилхлоридный линкер (Ваг1оз е1 а1., ТеЕаНебгоп 1,еИ. 1989, 30, 3943-3946), позволяющий отщепление пептида при использовании смеси ледяной уксусной кислоты/трифторэтанола/ИСМ (1:2:7) в течение 30 мин.

Подходящими защитным группами для аминокислот и, соответственно, их остатков, являются, например для аминогруппы (которая присутствует, например, также в боковой цепи лизина)

СЬг бензилоксикарбонил

Вос трет-бутоксикарбонил

Ртос 9-фторенилметоксикарбонил

АПос аллилоксикарбонил

Теос триметилсилилэтоксикарбонил

Тсс трихлорэтоксикарбонил

Νρβ о-нитрофенилсульфонил;

Тг1 трифенилметил или тритил для карбоксильной группы (которая присутствует, например, также в боковой цепи аспарагиновой и глутаминовой кислот) путем превращения в сложные эфиры со спиртовыми компонентами

- 8 010163

1Ви	трет-бутил
Вп	бензил
Ме	метил
РЬ	фенил
Рас	фенацил
	аллил
Тзе	триметилсилилэтил
Тсе	трихлорэтил;

для гуанидиногруппы (которая присутствует, например, в боковой цепи аргинина)

Рте 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-б-сульфонил

Тз тозил (т.е. п-толуолсульфонил)

СЬг бензилоксикарбонил

РЬ£ пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил для гидроксигруппы (которая присутствует, например, в боковой цепи треонина и серина)

1Ви	трет-бутил
Вп	бензил
тп	тритил

и для меркаптогруппы (которая присутствует, например, в боковой цепи цистеина)

Аст	ацетамидометил
ΐΒυ	трет-бутил
Вп	бензил
ТН	1п1у1
М1г	4-метокситритил.

Для конструирования связанных с матрицей β-шпилечных петельных миметиков формулы I предпочтительно используют 9-фторенилметоксикарбонил-(Ршос)-защищенные производные аминокислот. Для снятия защиты, т.е. для отщепления Ршое-группы, можно использовать 20% пиперидин в ΩΜΡ или 2% ΏΒυ/2% пиперидин в ΏΜΡ.

Ν-замещенные производные глицина, используемые в качестве строительных блоков для конструирования определенных соединений формулы I, получают из 9-фторенилметоксикарбонил-(Ршос)защищенных производных аминокислот или, как вариант, получают в два этапа из предшественников глицина, содержащих уходящую группу, таких как бром-, хлор- или йодуксусная кислота, и подходящих строительных блоков первичного амина ΝΗ₂-Κ⁸⁶. Первый этап синтеза состоит из прикрепления ацетилирующего агента, содержащего уходящую группу, такого как бромуксусная кислота, к связанному со смолой промежуточному соединению путем образования амидной связи. Второй этап - нуклеофильное замещение - проводят при использовании строительных блоков первичного амина, в которых остатки при необходимости соответствующим образом защищены группами, описанными выше для боковых цепей аминокислот.

Для введения Ν-замещенных производных глицина в качестве строительных блоков в связанные с матрицей β-шпилечные петельные миметики общий процесс синтеза для сбора шпилечных миметиков осуществляют, как описано здесь.

Количество реагента, т.е. производного аминокислоты, обычно составляет от 1 до 20 экв. по отношению к миллиэквивалентам в грамме (мэкв./г) загрузки функционализированной твердой подложки (обычно от 0,1 до 2,85 мэкв./г для полистироловых смол), изначально навешанной в реакционную пробирку. Для завершения реакции в течение приемлемого времени можно использовать дополнительные эквиваленты реагентов. Реакционные пробирки вместе с блоком держателя и трубопроводом помещают в блок резервуара и собирают аппарат. Через трубопровод подают газ для обеспечения контролируемой среды, например азота, аргона, воздуха и т.п. Поток газа перед подачей в трубопровод может быть нагрет или охлажден. Нагрев или охлаждение реакционных сосудов достигается внешним нагреванием реакционного блока или охлаждением смесью изопропанола и сухого льда или подобного, для проведения тре

- 9 010163 буемых реакций синтеза. Перемешивание обеспечивается встряхиванием или магнитной мешалкой (внутри реакционной пробирки). Предпочтительными рабочими станциями являются (однако, без ограничения) станция ЬаЬкоитсе'к СотЫ-сйет и синтезатор МиШ8уи ТесН'к-8уго.

Образование амидной связи требует на этапе ацилирования активации α-карбоксильной группы. Когда такую активацию проводят посредством обычно используемых карбодиимидов, таких как дициклогексилкарбодиимид (ЭСС, 8НееНап & Некк, 1. Ат. С1ет. 8ос. 1955, 77, 1067-1068) или диизопропилкарбодиимид (ΩΙΟ. 8атап1ак15 е! а1. Вюсйет. Вюрйук. Век Соттип.1976, 73, 336-342), получающаяся дициклогексилмочевина и диизопропилмочевина нерастворима и, соответственно, растворима в обычно используемых растворителях. В вариации карбодиимидного метода к смеси для связывания в качестве дополнительного агента добавляют 1-гидроксибензотриазол (НОВ!, Кбгад & Сещег С1ет. Вег 1970, 103, 788-798). НОВ! предотвращает дегидратацию, подавляет рацемизацию активированных аминокислот и действует в качестве катализатора для ускорения медленных реакций присоединения. В качестве непосредственных связывающих агентов использовали определенные фосфониевые реагенты, такие как бензотриазол-1-ил-окситрис-(диметиламино)фосфония гексафторфосфат (ВОР, Сайто е! а1., Те!тайебгоп Ье!!. 1975, 14, 1219-1222; 8уп!йейк, 1976, 751-752), или бензотриазол-1-ил-окситрис-пирролидино-фосфония гексафторфосфат (Ру-ВОР, Сойе е! а1., Те!тайебгоп Ье!!. 1990, 31, 205-208), или 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат (ТВТИ) или гексафторфосфат (НВТИ, Кпогг е! а1., Те!тайебгоп Ье!!. 1989, 30, 1927-1930); эти фосфониевые реагенты также подходят для образования ш й!и сложных эфиров НОВ! с защищенными производными аминокислот. Недавно в качестве агентов присоединения также были использованы дифеноксифосфорил азид (ЭРРА) или О-(7-аза-бензотриазол-1-ил)-^^№,№тетраметилурония тетрафторборат (ТАТИ) или О-(7-аза-бензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетраметилурония гексафторфосфат (НАТИ)/7-аза-1-гидрокси бензотриазол (НОА!, Сатршо е! а1., Те!гайебгоп Ье!!. 1994, 35, 2279-2281).

Из-за того факта, что существенными являются почти количественные реакции присоединения, желательно иметь экспериментальное доказательство завершения реакции. После каждого этапа присоединения можно легко и быстро проводить нингидриновый тест (КаЕег е! а1., Апа1. ВюсНепийгу 1970, 34, 595), в котором положительный колориметрический ответ на аликвоту связанного со смолой пептида количественно указывает на наличие первичного амина. Химия Ртос позволяет спектрофотометрическое определение хромофора Ртос, когда он высвобождается с основанием (Ме1еп1юГег е! а1., 1п!. 1. Рерйбе Рто!еш Век. 1979, 13, 35-42).

Связанное со смолой промежуточное соединение в каждой реакционной пробирке отмывают от избытка оставшихся реагентов, или растворителей и побочных продуктов повторяющейся обработкой чистым растворителем(ями) одним из следующих методов:

1) реакционные сосуды заполняют растворителем (предпочтительно 5 мл), реакционные пробирки в комбинации с блоком держателя и трубопроводом погружают и встряхивают от 5 до 300 мин, предпочтительно 15 мин, и осушают под действие силы тяжести, а затем под давлением газа, подаваемого через вход трубопровода (при закрытом выходе) для удаления растворителя;

2) из блока держателя удаляют трубопровод, через верх реакционных пробирок вносят аликвоты растворителя (предпочтительно 5 мл) и дают ему стечь под действием силы тяжести через фильтр в приемный сосуд, такой как пробирка или флакон.

Обе процедуры промывки повторяют до 50 раз (предпочтительно около 10 раз), отслеживая эффективность удаления реагента, растворителя и побочных продуктов такими методами, как ТСХ (тонкослойная хроматография), ГХ (газовая хроматография) или исследование смывов.

Описанный выше процесс реакции связанного со смолой соединения с реагентами в реакционных сосудах с последующим удалением избыточных реагентов, побочных продуктов и растворителей повторяют с каждым последующим превращением до тех пор, пока не получат конечный связанный со смолой полностью защищенный линейный пептид.

Перед отщеплением этого полностью защищенного линейного пептида от твердой подложки можно, при желании, снять защиту с одной или нескольких защищенных функциональных групп, присутствующих в молекуле, и соответствующим образом заместить освободившиеся реакционные группы. Для этого рассматриваемая функциональная группа(ы) должна быть изначально защищена защитной группой, которую можно избирательно удалить без воздействия на оставшиеся защитные группы. А11ос (аллилоксикарбонил) является примером такой аминозащитной группы, которую можно селективно удалить, например, при использовании Рб° и фенилсилана в СН₂С1₂, без воздействия на остальные присутствующие защитные группы, такие как Ртос. Освободившуюся таким образом реакционную группу можно затем обработать агентом, подходящим для введения требуемого заместителя. Так, например, аминогруппу можно ацилировать при использовании ацилирующего агента, соответствующего вводимому ацильному заместителю. Для образования пэгилированных аминокислот, таких как 1РедК, или 8РедК, предпочтительно раствор 5 экв. НАТИ (Ы-[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-Ь]пиридин-1илметилен]-Ы-метилметанаминия гексафторфосфат Ν-оксида) в безводном ΌΜΡ и раствор 10 экв. И1РЕА (диизопропил этиламина) в безводном ΌΜΡ и 5 экв. 2-[2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислоты (1Ред) и, соответственно, 2-(2-метоксиэтокси)уксусной кислоты (кРед), вводят в реакцию с освободив

- 10 010163 шейся аминогруппой соответствующей боковой цепи аминокислоты в течение 3 ч. После фильтрации и промывки смолы процесс повторяют со свежими растворами реагентов в течение еще 3 ч.

Перед отщеплением от твердой подложки этого полностью защищенного линейного пептида возможно, при желании, образовать межцепочечную связь(и) между боковыми цепями соответствующих аминокислотных остатков в противоположных положениях области β-цепи.

Межцепочечные связи могут, например, представлять собой дисульфидные мостики, образованные остатками цистеина и гомоцистеина в противоположных положениях β-цепи; или лактамовые мостики, образованные остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот, связанными с остатками орнитина и, соответственно, лизина, или остатками глутаминовой кислоты, связанными с остатками 2,4диаминомасляной кислоты, расположенными в противоположных положениях β-цепи, путем образования амидных связей. Образование таких межцепочечных связей можно осуществить методами, известными в данной области техники.

Для образования дисульфидных мостиков предпочтительно используют раствор 10 экв. раствора йода в ΌΜΤ или в смеси СН₂С1₂/МеОН в течение 1,5 ч, этот этап повторяют в течение еще 3 ч со свежим раствором йода после фильтрации раствора йода, или в смеси растворов ΌΜ8Ο (диметилсульфоксида, ДМСО) и уксусной кислоты, забуференной 5% №1НСО₃ до рН 5-6, в течение 4 ч, или в воде после доведения рН раствором гидроксида аммония до 8, при перемешивании в течение 24 ч, или в растворе ΝΜΡ и три-н-бутилфосфина (предпочтительно 50 экв.).

Для образования лактамовых мостиков предпочтительно используют раствор 2 экв. НАТи (Ν[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло [4,5-Ь]пиридин-1-илметилен]А-метилметанаминия гексафторфосфат Ν-оксида) в безводном ΌΜΤ и раствор 4 экв. ΌΙΡΕΑ (диизопропил этиламина) в безводном ΌΜΕ в течение 16 ч.

Открепление полностью защищенного линейного пептида от твердой подложки осуществляют погружением реакционных пробирок в комбинации с блоком держателя и трубопроводом в реакционные сосуды с раствором отщепляющего агента (предпочтительно от 3 до 5 мл). Поток газа, контроль температуры, перемешивание и отслеживание реакции устанавливают, как описано выше и как требуется для осуществления реакции отщепления. Реакционные пробирки вместе с блоком держателя и трубопроводом отсоединяют от блока резервуара и поднимают выше уровня раствора, но ниже верхней кромки реакционных сосудов, и устанавливают давление газа через вход трубопровода (при закрытом выходе) для эффективного вытеснения раствора конечного продукта в резервуары. Смолу, остающуюся в реакционных сосудах, затем промывают от 2 до 5 раз, как указано выше, 3-5 мл соответствующего растворителя для экстрагирования (вымывания) максимально возможного количества отщепленного продукта. Полученные растворы продукта объединяют, избегая перекрестного смешивания. Отдельные растворы/экстракты затем обрабатывают, как требуется, для выделения целевых соединений. Типичные манипуляции включают, без ограничения, упаривание, концентрирование, экстракцию жидкость/жидкость, подкисление, подщелачивание, нейтрализацию или дополнительные реакции в растворе.

Растворы, содержащие полностью защищенные производные линейного пептида, отщепленные от твердой подложки, нейтрализуют основанием и упаривают. Затем проводят циклизацию в растворе, используя такие растворители, как ЭСМ. ΌΜΕ, диоксан, ТНЕ и подобные. Для циклизации можно использовать различные агенты присоединения, указанные выше. Продолжительность циклизации составляет 6-48 ч, предпочтительно около 16 ч. Прохождение реакции отслеживают, например, методом ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии). Затем растворитель удаляют выпариванием, полностью защищенное циклическое производное пептида растворяют в растворителе, не смешивающемся с водой, таком как ЭСМ, и раствор экстрагируют водой или смесью смешивающихся с водой растворителей, для удаления избытка связывающего агента.

Как вариант, открепление от твердой подложки и полное снятие защиты полностью защищенного пептида можно проводить вручную в стеклянных сосудах.

Наконец, полностью защищенное производное пептида обрабатывают 95% ТФУ, 2,5% Н₂О, 2,5% ΤΙ8 или другой комбинацией вытеснителей для осуществления отщепления защитных групп. Время реакции отщепления обычно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно около 2,5 ч. Летучие компоненты выпаривают досуха, и неочищенный пептид растворяют в 20% АсОН в воде и экстрагируют изопропиловым эфиром или другими подходящими растворителями. Водный слой собирают и упаривают досуха, и в качестве конечного продукта получаю полностью свободное от защиты циклическое производное пептида формулы Ι. В зависимости от чистоты это производное пептида можно либо непосредственно использовать для биологических тестов, либо дополнительно очищать, например, методом препаративной ВЭЖХ.

Как указано ранее, затем возможно, при желании, превратить полученный таким образом полностью свободный от защиты продукт формулы Ι в фармацевтически приемлемую соль или превратить фармацевтически приемлемую или неприемлемую соль, полученную таким образом, в соответствующее свободное соединение формулы Ι или в другую, фармацевтически приемлемую, соль. Любой из этих процессов можно осуществить методами, хорошо известными в данной области техники.

- 11 010163

Матричные исходные вещества формулы II, используемые в процессах согласно изобретению, предварительные исходные соединения и получение этих исходных и предварительных соединений, описано в международной заявке РСТ/ЕР02/01711 этих же заявителей, опубликованной под номером νθ 02/070547 А1.

Исходные соединения формулы Η₂ΝΚ⁸⁶ известны или могут быть получены методами, известными в данной области техники.

β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению можно широко использовать для предотвращения ВИЧ-инфекции у здоровых людей и замедления или остановки развития вирусной инфекции у инфицированных пациентов, или при раке, опосредованном или являющемся результатом активности рецептора СХСК4-, или при иммунологических заболеваниях, опосредованных или являющихся результатом активности рецептора СХСР4. или β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению можно использовать для лечения подавления иммунитета, или их можно использовать при аферезном сборе стволовых клеток периферической крови.

β-шпилечные пептидомиметики можно вводить непосредственно или в виде соответствующего состава вместе с носителями, разбавителями или наполнителями, хорошо известными в данной области техники.

При использовании для лечения или предотвращения ВИЧ-инфекции или рака, такого как рак молочной железы, мозга, простаты, легких, почек, такого как нейробластома, неходжкинская лимфома, рак яичников, множественная миелома, хроническая лимфоцитарная лейкемия, рак поджелудочной железы, меланома, ангиогенез или кроветворных тканей; или воспалительных заболеваний, таких как астма, аллергический ринит, заболевания гиперчувствительности легких, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильная пневмония, гиперчувствительность замедленного типа, интерстициальное заболевание легких (1ЬО), идиопатический пульмонарный фиброз, ШИ, связанное с ревматоидным артритом, системная эритематозная волчанка, анкилозирующий спондилит, системный склероз, синдром Шегрена (8_)одгеп), системная анафилаксия или гиперчувствительный ответ, лекарственные аллергии, ревматоидный артрит, псориатический артрит, астенический бульбарный паралич (шуаййеша дтауй), ювенильный диабет, гломерулонефрит, аутоиммунный тиреоидит, отторжение трансплантата, включая отторжение аллотрансплантата или реакцию трансплантат против хозяина, воспалительные заболевания кишки, воспалительные дерматозы; или для лечения иммуносупрессии, включая иммуносупрессию, вызванную химиотерапией, радиотерапией или реакцией отторжения трансплантата, β-шпилечные пептидомиметики можно вводить по одному, в виде смесей нескольких β-шпилечных пептидомиметиков, в комбинации с другими анти-ВИЧ-агентами, или противомикробными агентами или противораковыми агентами или противовоспалительными агентами, или в комбинации с другими фармацевтически активными агентами. βшпилечные пептидомиметики можно вводить в чистом виде или в виде фармацевтических композиций.

Фармацевтические композиции, содержащие β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению, можно получить традиционными методами смешивания, растворения, гранулирования, получения покрытых оболочкой таблеток, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, улавливания или лиофилизации. Фармацевтические композиции можно составлять традиционным способом, при использовании одного или более физиологически приемлемых носителей, разбавителей, наполнителей или вспомогательных веществ, которые способствуют превращению активных β-шпилечных пептидомиметиков в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Конкретный состав зависит от выбранного способа введения.

Для местного применения β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут быть в составе растворов, гелей, мазей, кремов, суспензий и подобных форм, известных в данной области техники.

Составы для системного применения включают составы, разработанные для введения методом инъекций, например, подкожных, внутривенных, внутримышечных, интратекальных или внутрибрюшинных, а также составы для трансдермального, пульмонарного введения и введения через слизистые оболочки.

Для инъекций β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению можно вводить в состав соответствующих растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хинка, Рингера или физиологический солевой буфер. Растворы могут содержать суспендирующие, стабилизирующие агенты и/или агенты, способствующие распределению. Альтернативно, β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут быть в виде порошка для комбинирования перед применением с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой.

Для введения через слизистые оболочки в составе используют агенты, способствующие проникновению через соответствующий барьер, известные в данной области техники.

Для орального применения составы можно получать комбинированием активных β-шпилечных пептидомиметиков согласно изобретению с фармацевтически приемлемыми носителями, известными в данной области техники. Такие носители обеспечивают получение таких составов с активными βшпилечными пептидомиметиками согласно изобретению, как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и т.д., для орального введения пациенту. Для пероральных составов,

- 12 010163 таких как, например, порошки, капсулы или таблетки, подходящие наполнители включают сахара, такие как лактоза, сахароза, маннит и сорбит; препараты целлюлозы, такие как кукурузный, пшеничный, рисовый, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, и/или поливинилпирролидон (ПВП, РУР); гранулирующие агенты и связывающие агенты. При желании можно добавлять дезинтегрирующие агенты, такие как сшитые поливинилпирролидоны, агар или альгиновая кислота или ее соль, например, альгинат натрия. При желании твердые дозировочные формы можно покрыть сахаром или кишечно-растворимым покрытием при использовании стандартных методов.

Для пероральных жидких препаратов, таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы, подходящие носители, наполнители или разбавители включают воду, гликоли, масла, спирты и т.п. Кроме того, можно добавлять отдушки, консерванты, красители и подобные агенты.

Для защечного применения составы могут быть в форме таблеток, лепешек и т.п., полученных обычным способом.

Для введения в виде ингаляции β-шпилечные пептидомиметики по изобретению делают в форме распыляемого аэрозоля в флаконах под давлением или пульверизаторах, с использованием соответствующего вытеснителя, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением дозирование обеспечивается клапаном, подающим отмеренное количество. Для использования в ингаляторе или инсуффляторе можно применять капсулы и картриджи из, например, желатина, содержащие порошковую смесь β-шпилечных пептидомиметиков согласно изобретению и подходящей основы, такой как лактоза или крахмал.

Соединения также могут быть в виде составов для ректального и вагинального применения, таких как суппозитории, вместе с основами, такими как масло какао или глицериды.

В дополнение к составам, описанным выше, β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут быть в виде препаратов для депонирования (беро! ртератабоик). Такие долгодействующие составы можно вводить в виде имплантатов (подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Для получения таких препаратов β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению комбинируют с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле), или с ионообменными смолами, или в виде труднорастворимых солей.

Кроме того, можно использовать другие фармацевтические системы доставки, такие как липосомы и эмульсии, хорошо известные в данной области техники. Также можно использовать определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид. Кроме того, β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению можно вводить в виде лекарственной формы с замедленным высвобождением, такой как полупроницаемые матрицы из твердых полимеров, содержащие терапевтический агент. Были разработаны различные материалы для замедленного высвобождения, хорошо известные специалистам в данной области техники. Капсулы замедленного высвобождения могут, в зависимости от их химической природы, высвобождать соединения в течение периода от нескольких недель до более 100 дней. В зависимости от химической природы и биологической стабильности терапевтического агента можно применять дополнительные стратегии для стабилизации белка.

Поскольку β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут содержать заряженные остатки, эти пептидомиметики могут быть включены в описанные выше составы как сами по себе, так и в виде фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемые соли имеют тенденцию к большей растворимости в водных и других протоносодержащих растворителях, чем соответствующие свободные формы.

β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению или их композиции обычно используют в количестве, эффективном для достижения желаемой цели. Следует понимать, что используемое количество зависит от конкретного применения.

Для местного применения для лечения или предотвращения ВИЧ-инфекций терапевтически эффективную дозу можно определить, например, в анализах ίη νίΐτο, приведенных в примерах. Лечение можно применять, когда ВИЧ-инфекция видима, или даже когда она невидима. Специалист с обычной подготовкой сможет определить терапевтически эффективное количество для лечения местных ВИЧинфекций без чрезмерного экспериментирования.

Для системного применения терапевтически эффективную дозу можно изначально оценить по анализам ίη νίΐτο. Например, можно определить дозу на животных моделях для достижения спектра концентраций циркулирующего β-шпилечного пептидомиметика, включающего 1С₅₀, определенную в культуре клеток (т.е. концентрацию исследуемого вещества, летальную для 50% культуры клеток). Такую информацию можно использовать для более точного определения пригодных доз для человека.

Начальные дозы также можно определить по данным ίη νίνο, например, по животным моделям, при использовании методов, хорошо известных в данной области техники. Специалист с обычной подготовкой может легко оптимизировать применение у человека на основании данных, полученных на животных.

Дозировки для применения в качестве анти-ВИЧ-агента можно корректировать индивидуально для

- 13 010163 обеспечения уровней β-шпилечных пептидомиметиков согласно изобретению в плазме, достаточных для поддержания терапевтического эффекта. Терапевтически эффективные уровни в сыворотке могут быть достигнуты введением множественных доз ежедневно.

В случаях местного применения или селективного поглощения эффективная местная концентрация β-шпилечных пептидомиметиков согласно изобретению может быть не связана с концентрациями в плазме. Специалист с обычной подготовкой сможет оптимизировать терапевтически эффективные местные дозы без чрезмерного экспериментирования.

Количество вводимых β-шпилечных пептидомиметиков будет, конечно, зависеть от конкретного пациента, его веса, серьезности заболевания, способа введения и мнения лечащего врача.

Анти-ВИЧ-терапию можно периодически повторять, если инфекции обнаружимы, или даже если они не обнаружимы. Можно проводить монотерапию или терапию в комбинации с другими лекарствами, такими как, например, другие анти-ВИЧ-агенты, или противораковые агенты, или другие антимикробные агенты.

В норме терапевтически эффективная доза описанных здесь β-шпилечных пептидомиметиков обеспечивает терапевтический эффект, не вызывая существенной токсичности.

Токсичность β-шпилечных пептидомиметиков согласно изобретению можно определить стандартными фармацевтическими методами в культуре клеток или на экспериментальных животных, например, путем определения ΤΌ₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) или ЬПюо (дозы, летальной для 100% популяции). Соотношение доз терапевтического и токсического эффектов представляет собой терапевтический индекс. Предпочтительными являются соединения с высоким терапевтическим индексом. Данные, полученные в этих исследованиях в культуре клеток и на животных моделях, можно использовать для определения диапазона доз, не токсичных при применении у человека. Доза β-шпилечных пептидомиметиков согласно изобретению предпочтительно находится в пределах циркулирующих концентраций, включающих эффективную дозу с низкой токсичностью или отсутствием токсичности. Дозировка может варьировать в пределах спектра в зависимости от дозировочной формы и способа введения. Конкретный состав, способ введения и доза могут быть выбраны конкретным врачом с учетом состояния пациента (см., например, Ртд1 е! а1., 1975, ТИе Рйаттасо1од1са1 Вак15 оГ Тйегареийск, СИ. 1, р.1).

Следующие примеры иллюстрируют изобретение более подробно, но никоим образом не ограничивают его. В этих примерах использованы следующие сокращения:

НВТИ: 1-бензотриазол-1-ил-тетраметилурония гексафторфосфат (Кпогг е! а1. Те!тайебгоп Ье!!. 1989, 30, 1927-1930);

НОВ!: 1-гидроксибензотриазол;

ΌΙΕΑ: диизопропилэтиламин;

НОАТ: 7-аза-1 -гидроксибензотриазол;

НАТИ: О-(7-аза-бензотриазол-1-ил)-М,М,М',М'-тетраметилурония гексафторфосфат (Сатршо е! а1., Те!тайебтоп Ьей. 1994, 35, 2279-2281).

Примеры

1. Синтез пептида.

Связывание первого защищенного аминокислотного остатка со смолой.

В сухую колбу вносят 0,5 г 2-хлортритилхлоридной смолы (Ват1ок е! а1. Те!тайебтоп Ьей. 1989, 30, 3943-3946) (0,83 ммоль/г, 0,415 ммоль). Смолу суспендируют в СН₂С1₂ (2,5 мл) и оставляют набухать при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Смолу обрабатывают 0,415 ммоль (1 экв.) первого соответствующим образом защищенного аминокислотного остатка (см. ниже) и 284 мкл (4 экв.) диизопропилэтиламина (ΌΙΕΑ) в СН₂С1₂ (2,5 мл), смесь встряхивают при 25°С в течение 4 ч. Цвет смолы меняется на пурпурный, а раствор остается желтоватым. Смолу встряхивают (СН₂С1₂/МеОН/О1ЕА :17/2/1), 30 мл в течение 30 мин; затем промывают в следующем порядке СН₂С1₂(1х), ΌΜΡ (1х), СН₂С1₂ (1х), МеОН (1х), СН₂С1₂ (1х), МеОН (1х), СН₂С1₂ (2х), Е!₂О (2х) и сушат в вакууме в течение 6 ч. Загрузка обычно составляет 0,6-0,7 ммоль/г.

Были получены следующие предварительно загруженные смолы: Ртос-РтоО-хлортритил смола, Ртос-^сРтоО-хлортритил смола и Ртос-8-(4-8-А11ос-амино)-РтоО-хлортритил смола.

Синтез полностью защищенного пептидного фрагмента.

Синтез проводят при использовании пептидного синтезатора 8уто (Ми1!15уп!есй) при использовании от 24 до 96 реакционных сосудов. В каждый сосуд помещают 60 мг (масса смолы перед загрузкой) указанной выше смолы. Программируют и проводят следующие циклы реакций:

- 14 010163

Этап Реагент

СНгСЬ, промывка и набухание (ручной) ϋΜΡ, промывка и набухание

40 % пиперидин/ϋΜΡ ϋΜΡ, промывка

5 экв. Ртос аминокислоты/ϋΜΡ + 5 экв. нвти + 5 экв. НОВ!

+ 5 экв. ϋΙΕΑ

Время х 1 мин х 5 мин х 5 мин

5x2 мин х 120 мин ϋΜΡ, промывка 4x2 мин

СН₂С1₂, промывка (в конце синтеза) 3x2 мин

Этапы с 3 по 6 повторяют для добавления каждой аминокислоты.

Пэгилирование аминофункций боковых цепей 2-[2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислотой и 2-(2-метоксиэтокси)уксусной кислотой.

Смолу (0,040 ммоль), содержащую пептид, оставляют набухать в 5 мл свеже перегнанного СН₂С1₂ в течение 30 мин, а затем последовательно добавляют палладиевый катализатор Ρά(ΡΡΗ₃)₄, 14 мг, 0,3 экв., и РЬ81Н₃, 0,8 ммоль, 20 экв. Смолу встряхивают в течение 2 ч и фильтруют реакционный раствор. Реакцию повторяют еще раз с тем же количеством реагентов и через 2 ч смолу промывают СН₂С1₂ и ϋΜΡ, а затем ΕΪ2Ο.

Смолу снова оставляют набухать в свежеперегнанном СН₂С1₂ (2 мл) в течение 30 мин, растворитель отфильтровывают и оставляют смолу набухать в ϋΜΡ в течение 1 ч. Последовательно добавляют раствор ϋΙΡΕΑ (10 экв.) в 1 мл ϋΜΡ и 2-[2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусную кислоту или 2-(2метоксиэтокси)уксусную кислоту (5 экв.) и затем раствор НАТИ (5 экв.) в 1 мл ϋΜΡ. Смолу встряхивают в течение 3 ч и реакционный раствор фильтруют. Реакцию повторяют снова с тем же количеством реагентов и через 3 ч смолу промывают СН₂С1₂ и ϋΜΡ и затем Εΐ₂Ο.

Процедуру пэгилирования проводят как возможный вариант, после окончания синтеза полностью защищенного пептидного фрагмента, а затем проводят процедуру А, В или С, описанные ниже, в зависимости от того, нужно или нет образовывать межцепочечные связи, дисульфидные связи β-цепи или лактамовые связи β-цепи.

Процедура А. Циклизация и обработка пептидов с циклизованным остовом.

Отщепление полностью защищенного пептидного фрагмента.

После завершения синтеза смолу суспендируют в 1 мл (0,39 ммоль) 1% ТФУ в СН₂С1₂ (по объему) в течение 3 мин, фильтруют, а фильтрат нейтрализуют 1 мл (1,17 ммоль, 3 экв.) 20% ϋΙΕΑ в СН₂С1₂ (об./об.). Этот процесс повторяют дважды для обеспечения полного отщепления. Фильтрат упаривают досуха, а с продукта полностью удаляют защиту [смесь для отщепления содержит 95% трифторуксусной кислоты (ТФУ), 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана (ΤΙ8)] для анализа методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С₁₈) и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (Ε8Ι-Μ8) для отслеживания эффективности синтеза линейного пептида.

Циклизация линейного пептида.

100 мг полностью защищенного линейного пептида растворяют в ϋΜΡ (9 мл, конц. 10 мг/мл). Затем добавляют 41,8 мг (0,110 ммоль, 3 экв.) НАТИ, 14,9 мг (0,110 ммоль, 3 экв.) НОА! и 1 мл (0,584 ммоль) 10% ϋΙΕΑ в ϋΜΡ (об./об.) и смесь встряхивают при 20°С в течение 16 ч, а затем концентрируют в высоком вакууме. Остаток делят между СН₂С1₂ и Н₂О/СН₃С№ (90/10: об./об.). Фазу СН₂С1₂ упаривают, получают полностью защищенный циклический пептид.

Снятие защиты и очистка циклического пептида.

Полученный циклический пептид растворяют в 1 мл смеси для отщепления, содержащей 95% трифторуксусной кислоты (ТФУ), 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана (ΤΙ8). Смесь оставляют стоять при 20°С в течение 2,5 ч и затем концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в растворе Н₂О/уксусная кислота (75/25: об./об.), и смесь экстрагируют диизопропиловым эфиром.

Водную фазу сушат в вакууме, а затем продукт очищают препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ.

После лиофилизации получают продукты в виде белых порошков и анализируют их методом Ε8Ι-Μ8. Аналитические данные, отражающие чистоту после препаративной ВЭЖХ и спектры Ε8Ι-Μ8, приведены в табл. 1-3.

Аналитический метод 1.

Время удержания при аналитической ВЭЖХ (КТ, в минутах) определяют при использовании колонки УУОАС 218Μ85215 со следующими растворителями А (Н₂О+0,02% ТФУ) и В (С11₃С\) и гради

- 15 010163 ентом: 0 мин: 92% А, 8%В; 8 мин: 62% А 38% В; 9-12 мин: 0% А, 100% В.

Аналитический метод 2.

Время удержания при аналитической ВЭЖХ (КТ, в минутах) определяют при использовании колонки ЕХ (8.и. 217808-2) со следующими растворителями А (Η₂0+0,02% ТФУ) и В (ΟΗ₃ΟΝ) и градиентом: 0 мин: 95% А, 5% В; 8 мин: 30% А, 70% В; 9 мин: 0% А, 100% В; 9-12 мин: 95% А, 5% В.

Процедура В. Циклизация и обработка пептидов с циклизованным остовом, содержащих дисульфидные связи β-цепи.

Образование дисульфидной связи β-цепи.

После окончания синтеза смолу оставляют набухать в 3 мл безводного ΌΜΕ в течение 1 ч. Затем в реактор добавляют 10 экв. раствора йода в ΌΜΕ (6 мл), с последующим перемешиванием в течение 1,5 ч. Отфильтровывают смолу и добавляют свежий раствор йода (10 экв.) в ΌΜΕ (6 мл), с последующим перемешиванием в течение 3 ч. Смолу отфильтровывают и промывают ΌΜΕ (3 х) и СН₂С1₂ (3 х).

Циклизация остова, отщепление и очистка пептида.

После образования дисульфидной связи β-цепи смолу суспендируют в 1 мл (0,39 ммоль) 1% ТФУ в СН₂С1₂ (об./об.) в течение 3 мин и отфильтровывают, а фильтрат нейтрализуют 1 мл (1,17 ммоль, 3 экв.) 20% ЭГЕА в СН₂С1₂ (об./об.). Процесс повторяют дважды для обеспечения полного отщепления.

Удаляют летучие фракции и добавляют в пробирку 6 мл безводного ΌΜΕ. Затем к пептиду добавляют 2 экв. НАТи в безводном ΌΜΕ (1 мл) и 4 экв. ΌΙΡΕΑ в безводном ΌΜΕ (1 мл), с последующим перемешиванием в течение 16 ч. Летучие фракции выпаривают досуха. Неочищенный циклизованный пептид растворяют в 7 мл СН₂С1₂ и экстрагируют 10% ацетонитрилом в Н₂0 (4,5 мл) три раза. Слой СН₂С1₂ упаривают досуха. Для полного удаления защиты с пептида добавляют 3 мл смеси для отщепления ТЕА:Т18:Н₂0 (95:2,5:2,5) и выдерживают смесь 2,5 ч. Летучие фракции выпаривают досуха и неочищенный пептид растворяют в 20% АсОН в воде (7 мл) и экстрагируют три раза изопропиловым эфиром (4 мл). Собирают водный слой, упаривают досуха, а остаток очищают препаративной обращеннофазовой ВЭЖХ.

После лиофилизации получают продукты в виде белых порошков и анализируют их аналитическим методом ΕδΙ-Μδ 1 или 2. Аналитические данные, отражающие чистоту после препаративной ВЭЖХ и спектры ΕδΙ-Μδ, приведены в табл. 1-3.

Процедура С. Циклизация и обработка пептидов с циклизованным остовом, содержащих лактамовые связи β-цепи.

Образование лактамовой связи β-цепи.

0,036 ммоль смолы берут из реактора и оставляют набухать в безводном ΌΜΕ в течение 1 ч. Добавляют 41,60 мг (1 экв.) Рб(РРй₃)₄ и 0,133 мл (30 экв.) ΡΗδίΚ^ и перемешивают в течение ночи. Отфильтровывают смолу и тщательно промывают Οί'Μ и ΌΜΕ. Смолу снова оставляют набухать в безводном ΌΜΕ в течение 1 ч. Добавляют 1 мл раствора Э1РЕА в ΌΜΕ (24,64 мкл Э1РЕА в 1 мл ΌΜΕ, 4 экв.), а затем 1 мл раствора НАТи в ΌΜΕ (27,37 мг НАТи, 2 экв.), конечный объем реакционной смеси составляет 7 мл, и перемешивают в течение ночи. Смолу тщательно промывают ΌΜΕ, СН₂СН₂, ΌΜΕ, СН₂СН₂.

Циклизация остова, отщепление и очистка пептида.

Пептид отщепляют от смолы 1% ТФУ в ЭСТИ и упаривают досуха, в пробирку добавляют 8 мл безводного ΌΜΕ. Затем к пептиду добавляют 2 экв. НАТи в безводном ΌΜΕ (1 мл) и 4 экв. Э1РЕА в безводном ΌΜΕ (1 мл), с последующим перемешиванием в течение 16 ч. Летучие фракции выпаривают досуха. Неочищенный циклизованный пептид растворяют в 7 мл ЭСТИ и экстрагируют 10% ацетонитрилом в Н₂О (4,5 мл) три раза. Слой ЭСТИ упаривают досуха.

Неочищенный циклизованный пептид растворяют в 7 мл СН₂С1₂ и экстрагируют 10% ацетонитрилом в Н20 три раза. Слой СН2С12 упаривают досуха. Для полного удаления защиты с пептида добавляют 3 мл смеси для отщепления ТЕА:ТК:Н₂О (95:2,5:2,5) и выдерживают смесь 2,5 ч. Летучие фракции выпаривают досуха и неочищенный пептид растворяют в 20% Ас0Н в воде (7 мл) и экстрагируют три раза изопропиловым эфиром (4 мл). Собирают водный слой, упаривают досуха, а остаток очищают препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ.

После лиофилизации получают продукты в виде белых порошков и анализируют их аналитическим методом ΕδI-Μδ 1 или 2. Аналитические данные, отражающие чистоту после препаративной ВЭЖХ и спектры ΕδI-Μδ, приведены в табл. 1-3.

Примеры 1-6 и 8-11 (п=12) приведены в табл. 1. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Ешос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРго-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем пептиды отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре А.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 1, как описано выше:

пример 1 (4,98); пример 2 (4,62); пример 3 (5,63); пример 4 (5,33); пример 5 (5,12), пример 6 (4,75);

- 16 010163 пример 8 (5,08); пример 9 (6,17); пример 10 (6,28); пример 11 (6,57).

Примеры 7 и 12-14 (п=12) приведены в табл. 1. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Ртос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРго-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образовывали дисульфидные мостики, пептиды отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 1, как описано выше:

пример 7 (4,48); пример 12 (4,83); пример 13 (5,30); пример 14 (4,08).

Примеры 15-50 (п=14) приведены в табл. 2. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Ртос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРго-Р14-Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем пептиды отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре А.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 1, как описано выше:

пример 15 (5,35); пример 16 (5,48); пример 17 (5,85); пример 18 (5,78); пример 19 (4,82); пример 20 (5,33); пример 21 (5,77), пример 22 (5,85); пример 23 (6,22); пример 24 (6,22); пример 25 (4,48); пример 26 (5,08); пример 27 (6,17); пример 28 (6,28); пример 29 (6,57); пример 30 (6,73); пример 31 (5,60); пример 32 (5,58); пример 33 (5,85), пример 34 (6,20); пример 35 (6,33); пример 36 (5,43); пример 37 (5,85); пример 38 (5,92);. пример 39 (5,47); пример 40 (6,0, 6,37)*; пример 41 (5,13); пример 42 (5,00); пример 43 (5,00); пример 44 (5,33, 5,67)*, пример 45 (5,03); пример 46 (4,75); пример 47 (5,27); пример 48 (5,65, 6,08)*; пример 49 (5,03); пример 50 (5,75).

* двойные пики, показывающие правильный М8.

Примеры 51-115, 117-141, 143-148 (п=14) приведены в табл. 2. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Ртос-РгоОхлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рто-^сРго-Р14Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образовывали дисульфидные мостики, пептиды отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 1, для примеров 51-53, 138-139, для примеров 54-115, 117-137, 140-141, 143-148 - градиент метода 2, как описано выше:

пример 51 (4,68); пример 52 (4,67); пример 53 (5,05), пример 54 (3,16), пример 55 (3,41), пример 56 (3,07), пример 57 (2,95), пример 58 (2,99), пример 59 (3,18), пример 60 (3,16), пример 61 (3,27), пример 62 (2,91), пример 63 (2,88), пример 64 (2,88), пример 65 (2,98), пример 66 (3,17), пример 67 (2,93), пример 68 (2,91), пример 69 (2,90), пример 70 (2,88), пример 71 (3,08), пример 72 (3,00), пример 73 (3,14), пример 74 (3,02), пример 75 (2,99), пример 76 (3,56), пример 77 (3,14), пример 78 (3,18), пример 79 (3,02), пример 80 (3,18), пример 81 (3,13), пример 82 (3,38), пример 83 (3,27), пример 84 (3,32), пример 85 (3,37), пример 86 (3.57) , пример 87 (3,35), пример 88 (3,08), пример 89 (3,10), пример 90 (3,14), пример 91 (3,18), пример 92 (3,17), пример 93 (3,25), пример 94 (3,10), пример 95 (3,18), пример 96 (3,15), пример 97 (3,31), пример 98 (3,26), пример 99 (3,32), пример 100 (3,28), пример 101 (3,83), пример 102 (3,00), пример 103 (3,29), пример 104 (2,98), пример 105 (2,77), пример 106 (2,74), пример 107 (3,00), пример 108 (2,81), пример 109 (2,69, 2,75), пример 110 (2,76, 2,82*), пример 111 (2,73, 2,78), пример 112 (2,71), пример 113 (2,51), пример 114 (2,97), пример 115 (2,95), пример 117 (2,70), пример 118 (2,78), пример 119 (2,83), пример 120 (2,80), пример 121 (3,09), пример 122 (3,45), пример 123 (2,82), пример 124 (3,29), пример 125 (3,27), пример 126 (3,19), пример 127 (3,05), пример 128 (3,86), пример 129 (4,76), пример 130 (4,43), пример 131 (4.57) , пример 132 (4,45), пример 133 (4,39), пример 134 (4,27), пример 135 (4,33), пример 136 (2,75), пример 137 (2,72), пример 138 (4,75), пример 139 (4,25), пример 140 (4,77), пример 141 (3,27), пример 143 (3,01), пример 144 (3,24), пример 145 (2,84), пример 146 (2,80), пример 147 (2,91), пример 148 (2,76).

* двойные пики, показывающие правильный М8.

Пример 116 (п=14) приведен в табл. 2. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Ртос-8-(4-8-А11ос-амино)-РтоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейный пептид синтезирован на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-8-(4-8-А11ос-амино)Рто-^сРто-Р14Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем провели процесс пэгилирования при использовании 2-[2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислоты, в результате которого получили ^сРтоА8-42 в качестве матрицы. Затем образовывали дисульфидный мостик, пептид отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 116 (3,00).

- 17 010163

Пример 142 (п=14) приведен в табл. 2. Пептид синтезирован, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейный пептид синтезирован на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРго-Р14-Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-ОаЬ-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3Р2-Р1. Затем провели процесс пэгилирования при использовании 2-[2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислоты. Затем образовывали дисульфидный мостик, пептид отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 142 (3,18).

Пример 149 (п=14) приведен в табл. 2. Пептид синтезирован, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейный пептид синтезирован на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-^сС1п-Р14-Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3Р2-Р1. Затем образовывали дисульфидный мостик, пептид отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 149 (2,76).

Пример 150 (п=14) приведен в табл. 2. Пептид синтезирован, начиная с аминокислоты ^сРго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-^сРгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейный пептид синтезирован на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-^сРго-С1у-Р14-Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3Р2-Р1. Затем образовывали дисульфидный мостик, пептид отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 150 (2,61).

Пример 151 (п=14) приведен в табл. 2. Пептид синтезирован, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейный пептид синтезирован на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРго-Р14-Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3Р2-Р1. Затем пептид отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре А.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 151 (2,86).

Примеры 152-153 (п=14) приведены в табл. 2. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРго-Р14-Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образовывали лактамовые мостики, пептиды отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре С.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше:

пример 152 (2,87), пример 153 (2,87, 2,88*).

* двойные пики, которые показывают правильный М§.

Примеры 154-155 (п=18) приведены в табл. 3. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-^сРго-С1у-Р18-Р17-Р16-Р15-Р14-Р13-Р12Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образовывали дисульфидные мостики, используя следующую процедуру.

Для образования дисульфидного мостика в положении Р4 и Р17 защищенный циклический пептид (36 мкмоль) оставляли набухать в безводном ЭМЕ в течение 1 ч. Сливали ЭМЕ и заменяли его 2 мл ΝΜΓ и 444 мкл три-н-бутилфосфина (50 экв.) в атмосфере аргона. Смолу встряхивали в течение 2 ч. Удаляли растворители и смолу промывали один раз 5 мл ΝΜΓ. Затем смолу встряхивали снова с 2 мл ΝΜΓ и 444 мкл три-н-бутилфосфина (50 экв.) в атмосфере аргона в течение 2 ч. Смолу промывали ЭМЕ и переносили с 90 мл ЭМЕ в 250 мл колбу. Добавляли 1 ммоль (330 мг) [К₃Ее(СЦ)₆] в 10 мл воды и суспензию аккуратно перемешивали в течение ночи при 25°С в темноте. Смолу переносили в реактор и промывали один раз 7 мл воды и два раза 5 мл ЭМЕ.

Для образования второго дисульфидного мостика в положении Р8 и Р13 пептид обрабатывали 9 экв. (83 мг) йода в 6 мл безводного ЭМЕ в течение 2 ч. Смолу промывали один раз ЭМЕ и повторяли обработку 9 экв. (83 мг) йода в 6 мл безводного ЭМЕ. Смолу промывали три раза 5 мл ЭМЕ, затем три раза 5 мл СН₂С1₂. Затем пептид отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

- 18 010163

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 154 (3,18), пример 155 (3,06).

Чистота: %-чистота соединений после препаративной ВЭЖХ: пример 154 (97), пример 155 (95).

Масс-спектр: [М+ЗН]/3: пример 154 (785,4), пример 155 (875,4).

Примеры 156-157 (п=18) приведены в табл. 3. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-' РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-^сРго-61у-Р18-Р17-Р16-Р15-Р14-Р13-Р12Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-РЗ-Р2-Р1. Затем образовывали дисульфидные мостики, пептиды отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 156 (3,00), пример 157 (2,98).

Чистота: %-чистота соединений после препаративной ВЭЖХ: пример 156 (95), пример 157 (76).

Масс-спектр: [М+ЗН]/3: пример 156 (845,5), пример 157 (848,8).

Примеры 158-159 (п=18) приведены в табл. 3. Пептиды синтезированы, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Ешос-РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-Рго-61у-Р18-Р17-Р16-Р15-Р14-Р13-Р12Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-РЗ-Р2-Р1. Затем образовывали дисульфидные мостики, пептиды отщепляли от смолы, циклизовали, удаляли защиту и очищали, как указано в процедуре В. Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 158 (3,41), пример 159 (3,25).

Чистота: %-чистота соединений после препаративной ВЭЖХ: пример 158 (95), пример 159 (83). Масс-спектр: [М+ЗН]/3: пример 158 (848,8), пример 159 (822,1).

Пример 160 (п=18) приведен в табл. 3. Пептид синтезирован, начиная с аминокислоты Рго, которая была связана со смолой. Исходной смолой являлась Етос-'РгоО-хлортритиловая смола, полученная, как описано выше. Линейные пептиды синтезированы на твердой подложке согласно процессу, описанному выше, в следующей последовательности: Смола-^сРго-61у-Р18-Р17-Р16-Р15-Р14-Р13-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8Р7-Р6-Р5-Р4-РЗ-Р2-Р1. Затем применяли следующую процедуру.

Пептид (36 мкмоль) отщепляли от смолы 1% ТФУ в СН₂С1. После упаривания досуха в пробирку добавляли 8 мл безводного ЭМЕ. Затем добавляли 2 экв. НАТО в безводном ЭМЕ (1 мл) и 4 экв. Э1РЕА в безводном ЭМЕ (1 мл) и перемешивали в течение 16 ч. Летучие фракции выпаривали досуха. Неочищенный циклизованный пептид растворяли в 7 мл ОСМ и экстрагировали 10% ацетонитрилом в Н₂О (4,5 мл) три раза. Органический слой упаривали досуха. Для полного удаления защиты с пептида добавляли 3 мл смеси для отщепления ТЕА:Т1§:Н₂О (95:2,5:2,5) и выдерживали 3 ч. Летучие фракции выпаривали досуха и неочищенный пептид растворяли в 20% уксусной кислоте в воде (7 мл) и экстрагировали три раза изопропиловым эфиром (4 мл). Водный слой разбавляли водой до 200 мл. Доводили рН до 8 раствором гидроксида аммония. Реакционную смесь встряхивали 24 ч. Раствор подкисляли уксусной кислотой до рН 5, упаривали досуха, продукт очищали ВЭЖХ.

Время удержания при ВЭЖХ (в минутах) определяли, используя градиент метода 2, как описано выше: пример 160 (2,92).

Чистота: %-чистота соединений после препаративной ВЭЖХ: пример 160 (93). Масс-спектр: [М+ЗН]/3: пример 160 (785,3).

Таблица 1

Примеры п=12

Р2

РЗ

Р4

РЗ

Рб

Р7

Р8

Ρ9

РЮ

РИ

Р12

Матрица

Чистота%м

[М+ 2Н]/2

Пример Послед.

ΡΙ

1

3Ε910ΝΟ:!

Туг

Агв

СИ

Уа1

Аг§

“Аге

Аг8

2-Ца!

РЬе

Туг

СИ

Ьуя

Рго'-Рго

83

1016.1

2

8ΕΡ1ΠΝΟ2

Туг

Аге

СИ

Уа1

Аге

°Аге

Аге

2-ΝϋΙ

Уа1

Туг

СИ

Ьуз

°РгокРго

100

992.4

3

5ΕΡ1ΠΝΟ3

Туг

Аг£

СИ

РКе

Аг®

Аге

Аге

2-Ν31

РИе

Туг

СИ

Еуя

°Рго1-Рго

78

1040 4

4

Туг

Аг®

си

Уа1

Аге

Аге

Аге

2-ΝηΙ

РКе

Туг

СИ

Еу$

“Рго’-Рго

83

1016.7

5

5ЕР 1В N0:5

Туг

АГ£

СИ

РИе

Аге

Аге

Аге

2-ΝηΙ

Уа1

Туг

СИ

Ьуз

Чгс+рго

69

1016.2

6

ЗЕО ТВ N0:6

Туг

Аге

СИ

Уа1

Аге

Аге

Аге

2-ΝβΙ

Уа1

ТУГ

СП

Ьуз

“РпЕРго

юо

992Л

7

5Е91В N0:7

Туг

Аг®

СИ

Суз

Аге

Аг®

Аге

2·Να1

Суз

Туг

СИ

Суз

“РггЕРго

92

994.8

3

5Ер Ιϋ N0:8

Туг

аге

СИ

С1у

Аге

Аге

Аг§

2-Яа!

<31у

Туг

СИ

Суз

“Рго'Рго

100

1119-3

9

5Ер ТВ N0:9

Туг

Аге

СИ

Не

Аг£

аге

Аге

2-№1

Не

ТУГ

СП

Суз

°Рго1'Рго

100

4.98

10

5Ер ТВ N0:10

Туг

Αη>

СИ

Пгт

Аге

Аге

Аг£

2-Ыа1

ТЬг

Туг

СП

Суз

иРгоьРго

100

993.8

11

5Ер ΙΒ N0:11

Туг

Аге

СИ

С1п

Аге

Аг®

Аге

2-ΝϊΙ

С1п

Туг

СИ

Суз

“Рго1Рго

100

1162.0

12

8Ер ТВ N0:12

Туг

Аге

СИ

Суз

Аге

°Агв

Аге

2-№1

Суз

Туг

СП

Суз

“Рго'Рго

100

995.1

13

3ΕρΐΒΝΟ:13

Туг

С1у

СИ

Суз

Аге

Аге

Аге

2-ΝϊΙ

Суз

Туг

С1у

Суз

“Рго'Рго

64

895.2

14

8Е9 ΙΒΝΟ:14

Туг

Аге

СИ

Суз

Аге

Аге

Аге

Ττρ

Суз

Тут

СИ

Ьуз

“Рго'-Рго

87

989 6

а) %-чистота соединений после препаративной ВЭЖХ

Суя в положении 4 и 9 в Примерах 7, 12-14 образуют дисульфидный мостик

- 19010163

Таблица 2

Примеры и=14

[Гример

Послед.

ΡΙ

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

РЯ

Р9

РЮ

РН

Р12

Р13

Р14 МатрииаЧнстстз°/(г

[М+ 2Н]/2

15

8Ер1ОМО:15

Туг

Аге

СИ

Уа1

Аге

Уа1

иРго

Аге

Аге

1 -N11

ν$1

Туг

Сй

Ъуз

“Рго'Рго

100

1090,2

16

5ΕρΐΟΝ0:16

Туг

Аг£

Сй

Уа1

Аге

Уа1

Рго

Агд

Аге

2-Ν11

Уа1

Туг

СИ

Ъуз

Рго'Рго

100

1090.4

17

5Ε(31ΟΝΟ 17

Туг

Аг§

СЙ

Уа1

Аге

РЬе

11Рго

ΑΓβ

Агд

2-Νβ!

Уа1

Туг

Сй

Ъуз

“Рго'Рго

100

1114.8

16

8Ε0ΙΟΝΟ 13

Туг

Аг^

Сй

Уа1

Аге

РЬе

Рго

Аге

Аге

2-Ν3Ϊ

Уа1

Туг

Ск

Ьуз

“Рго'Рго

100

1114.9

19

5ΕζΗΙ3Ν0:19

Туг

Аг§

Сй

РЬе

Аг£

Сй

“рго

Аге

Аге

2-Ν11

Уа1

Туг

Сй

Ъуз

Рго'Рго

100

1143.6

20

5Ε(}1ΟΝΟ:20

Туг

Аг§

СЙ

Рке

Аге

Сй

Рго

Аге

Аге

2-Ν11

Уа1

Туг

СЙ

Ьуз

“Рго'Рго

100

1143,3

21

5Ер1ОИО;21

Туг

Аг§

сй

Рйе

Аге

Уа1

“Рго

Аге

Аге

2-Ν11

Уа1

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

99

1114.3

22

5Ηξ) ΙϋΝΟ:22

Туг

Агв

Сй

РНе

Аге

Уа1

Рго

Аге

Аге

2-Иа!

Уа1

Тут

Сй

Ъуз

Рго'Рго

100

1114.3

23

5ΕρΐΟΝΟ:23

Туг

Аг£

СЙ

Рке

Аге

РК&

“Рго

Аге

Агц

2-Ν1Ι

Уа!

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1138,1

24

3ΕρΐΟΝΟ:24

Туг

ЛГ£

Ск

РЬе

Аге

РЬе

Рго

Аге

Аге

2-Ν1Ι

Уа1

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1138.3

25

5ΕςΐΟΝΟ:25

Туг

Аге

Ск

Уа1

Аге

Сй

“Рго

Аге

Аге

2-Ν31

Уэ1

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1119.3

26

ЗЕС} (ΟΝΟ:2ό

Туг

Аг&

Сй

Уа1

Аге

Сй

Рго

Аге

Аге

2-Ν11

Уа1

Туг

Сй

Ьу$

“Рго'Рго

100

1119.3

27

5Ε91ϋΝΟ:27

Туг

Аге

сц

Рйе

Аге

Уд|

“Рго

Агд

Аге

2-Ν3Ι

РЬе

Туг

Ск

Ьуз

Рго'Рго

100

1138.7

28

8Ер1ЭМЗ:28

Туг

Аге

Ск

РЬе

Аге

Уа1

Рго

Аге

Аге

2-ΝβΙ

РЬе

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1138.3

29

5Ε(?1ΟΝΟ:29

Туг

Аге

Ск

Рйе

Аге

РЬе

“Рго

Аге

Аге

2-Иа1

РЬе

Туг

Ск

Ьуз

“Рго'Рго

100

1162.3

30

£ΕρΐΟΝΟ:3ΰ

Туг

Аг£

Сй

РЬе

Аге

РЬе

Рго

Аг®

Аге

2-№й

РЬе

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1219.3

31

3Ε01ϋΝΟ;31

Туг

Аг^

Сй

Уа1

Аг§

Сй

Рго

Аге

Аге

2-ΝβΙ

РЬе

Тут

Ск

Ьуз

“Рго'Рго

100

1143.3

32

5Ε(}1ΟΝΟ:32

Туг

Аге

Ск

Уа1

Аге

Уа1

“Рго

Агд

Аге

2-Иа1

РЬе

Тут

Ск

Ьуз

“Рго “Рго

100

1Н4.2

33

5Ε0 Ю N0:33

Туг

Аг§

Сй

Уа1

Аге

Уа1

Рго

Аге

Аге

2-Иа1

РЬе

Тут

СЙ

Ьуз

“Рго'Рго

100

1114.3

34

5Ер ΙΟ N0:34

Туг

Аге

Сй

Уа1

Аге

РЬе

“Рго

Аге

Аге

2-Ν31

РЬе

Туг

Сй

Ьуз

Рго'Рго

юо

11389

35

5Ε9ΙΟΝΟ;35

Туг

Аге

Сй

Уа1

Аге

РЬе

Рго

Аге

Аге

2-№1

РЬе

Туг

Сй

Ьуз

Рго'Рго

100

1138.3

36

5Ερΐ0Ν0:36

Туг

Аге

Сй

РЬе

Аге

Сй

“Рго

Аге

Аге

2-Ν3Ι

РЬе

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1167,6

37

5Ε(}10Ν0:37

Туг

Аге

Сй

РЬе

Аге

Сй

Рго

Аге

Аге

2-Ца1

РЬе

Туг

СЙ

Ьуз

Рго'Рго

100

1168.2

38

8ΕρΐϋΝΟ:38

Туг

Аге

Ск

Рйе

Аге

01у

“Рго

Аге

Аг§

2-Ν31

РЬе

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1116.8

39

5Ε(?10ΝΟ;39

Туг

Аге

Ск

РЬе

Аге

01у

С1у

Аге

Аге

2-Ν31

РЬе

Туг

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

100

1096.7

40

5Εφ1ΟΝΟ;40

Туг

Аг§

Сй

РЬе

Аге

Уа1

С1у

Аге

Аге

2-Ν31

РЬе

Тут

Сй

Ьуз

“Рго'Рго

92

1117.6

41

5Ер 1ϋΝΟ:41

Туг

Аге

Сй

Туг

Аге

Рго

Уа1

Аге

Аге

2-Ν31

Туг

Туг

Сй

Ьуз

Рго'Рго

96

1153.8

42

5Ε01ϋΝΟ;42

Туг

Аге

Сй

Туг

Аге

Рго

Уа1

Аге

Аге

2-Ν1Ι

Туг

Туг

Сй

Ьуз

Рго'Рго

100

1133,3

43

δΕψϋ N0:43

Туг

АГ£

Сй

Туг

Аг@

Уа1

С1у

Аге

Аге

2-Иа1

Туг

Туг

СЙ

Ьуз

“Рго'Рго

99

1134.0

44

5ΕΟ ΙΡΝΟ:44

Туг

Аге

Сй

Уа!

Аге

Рго

ναΐ

Аге

ЛГ£

2-Ма1

Уа1

Туг

Сй

Ьуз

“ГгокГго

93

! 089,7

45

$Ε(3 Ιϋ N0:45

Туг

Аге

Сй

Уа1

Ага

С1у

“Рго

Аге

Аге

2-Ν31

Уа1

Туг

Сй

Ьуз

“Рго1 Рго

100

1068.5

46

5Ε9 ΙΟ N0:46

Туг

Аге

Ск

Уа1

Аге

С1у

С1у

Аге

Аге

2-Ν3Ι

Уа1

Тут

Ск

Ьуз

Рго'Рго

95

1048 8

Пример

Послед.

Ρ1

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9

РЮ

РН

Р12

ΡΙ3

Р14 МатрнцаЧистетаУо1*

(М+2НУ2

47

5Е9 ТО N0:47

туг

Аге

Сй

ν&|

Аге

Уа1

О1у

Аге

Аге

2-Ν31

Уа1

Туг

СЙ

Ьуз

Рго1Рго

ЮО

1070.3

48

8Е91О N0:48

Тут

Аге

Сй

1-ВиО

Аге

Рго

Уа1

аг§

Аге

2-ΝλΙ

(-ВиО Туг

СЙ

Ьуз

“Рго1Рго

98

1Ю3.6

49

8Е9 10 N0:49

Туг

Аге

Ск

1’ВиС

Аге

С1у

О1у

Аге

Аге

2’ΝηΙ

ί-ВиС Туг

Ск

Ьуз

“РгокРго

93

1062.4

50

3Εζ>1ΟΝΟ:50

Тут

Аге

Сй

(-ВиС

Аге

Уа|

СНу

Аге

Ате

2-Ν31

[-ВиО Туг

Ск

Ьуз

“РгокРго

93

Ю84.3

51

5ερΐΠΝΟ:51

Туг

Аге

Сй

Суз

Аге

61у

“Рго

Аге

Аге

2-Иа1

Суз

Туг

СЙ

Ьуз

РгокРго

100

107 Ъ7

52

5ΕρΐΟΝθ;52

Туг

Аге

Ск

Суз

Аге

С1у

О1у

Ате

Аге

2-ΝαΙ

Суз

Туг

Ск

Ьуз

“РгокРго

юо

1051.6

53

8Ε(}10ΝΟ:53

Туг

Ате

Ск

Суз

Аге

Уа1

СНу

Ате

Аге

2-Ν31

Суз

Туг

Ск

Ьуз

“Рго'Рго

100

1073.2

54

5ΕΡ1ΟΝΟ 54

Туг

Ате

Сй

Суз

Аге

О1у

“Рго

Тут

Аге

2-№Ι

Суз

Туг

61п

Ьуз

“РгокРго

95

1061.4

55

5Ε910ΝΟ55

Туг

Ате

Сй

Суз

Аге

С1у

“Рго

Тгр

Ате

2-ΝϊΙ

Суз

Туг

61п

Ъуз

Рго'-Рго

95

1072.9

56

5Ε0ΙΟΝΟ 56

Туг

Аге

Ск

Суз

Ате

С1у

Рго

ТЬг

Ате

2’Νλ|

Суз

Тут

С1п

Ьуз

“Рго'Рго

95

1030.3

57

$ΕΟ_ ΙΟΝΟ 57

Тут

Аге

Сй

Су*

Аге

О1у

₽го

Аге

Аф

2-ΝλΙ

Суе

Туг

ΑΓβ

Ьуз

“Рго'Рго

95

1071.8

58

5Ες ΙΟΝΟ 58

Туг

Ате

Ск

Суз

Аге

СИу

“Рго

Аге

Ате

2-Ν3Ι

Суз

Туг

ΗΪ8

Ьуз

Рго'-Рго

95

106Ъ9

59

5Ер, ΙΟ N0 59

Туг

Аге

Ск

Суз

Аге

С1у

РФ

Аг®

Аге

2-Ν3ί

Суз

Туг

Туг

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1075.3

60

5Ε0. ΙΟΝΟ60

Тут

Аге

Сй

Су*

Аге

О1у

рго

АГ£

Аге

2-Ν&Ι

Суз

Туг

С1п

61п

“Рго'-Рго

95

1057.8

61

8Ε(}, ΤϋΝΟ61

Туг

Аге

СЙ

Суз

Аге

С1у

Рго

Аге

Аге

2-ΝλΙ

Суз

Туг

О1п

О1и

“Рго'-Рго

95

1058.3

62

ЗЕС). 10ΝΟ62

С1п

Аге

СЙ

Суз

Аге

С1у

Рго

Аге

Аге

2-ΝλΙ

Суз

Туг

61п

Ьуз

“Рго'Рго

95

1040.3

63

Ж}. ΙΟ N0 63

Аге

Ате

Сй

Суз

Аге

С1у

“Рго

Аге

Аге

2^а1

Суз

Туг

С1п

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1054.1

64

5Ε0, ΙΟ N0 64

ΗΪ3

Аге

Ск

Суз

Аге

О1у

Рго

Аге

Аге

2-ΝλΙ

Суз

Туг

С1п

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1044.8

65

5Ер. ΙΟ N0 65

Не

Аге

СЙ

Суз

Ате

С1у

“Рго

Аге

Аге

2-Ν&Ι

Суз

Туг

О1а

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1032.9

66

8Ер. ΙΟ.ΝΟ 66

Тгр

Ате

Сй

Суз

Аге

С1у

“Рго

Аге

Аге

2-Ма!

Суз

Туг

О1п

Ьуз

Рго'Рго

95

1069.2

67

5Ε0. ΙΟΝΟ67

ΤΙ1Γ

Аге

Сй

Суз

Аге

С]у

“Рго

Лте

Аге

2-Ма1

Суз

Туг

С1п

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1026.7

66

5Ε<?. ΙϋΝΟ 68

С1и

Аге

Сй

Суз

Аге

О1у

Рго

Аге

Аге

2^а1

Суз

Туг

αΐη

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1040.8

69

8Ер. ΙΟΝΟ69

Туг

Аге

Аг§

Суз

Аге

С1у

Рго

Аге

Агд

2-№1

Суз

Туг

С1п

Ьуз

“РгокРго

95

Ю57.3

70

5ΕΡ.ΙΟΝΟ 70

Тут

Аге

ΗΪ5

Суз

Аге

С1у

“Рго

Аге

аге

Су5

Туг

αΐη

Ьуз

°РгокРго

95

1047.5

71

Ж}. ΙΟ N0 71

Туг

Аге

Не

Суз

Аге

О1у

“Рго

Аге

Аге

2’№Ι

Су5

Туг

αΐη

Ьуз

“РгокРго

95

1035.9

72

ЗЕр. ΙΟΝΟ 72

Туг

Аге

Туг

Суз

Аге

С1у

Рго

Аге

Аге

2-Ма)

Суз

Туг

ϋΐη

Ьуз

“Рго'Рго

95

1060.9

73

$Ер. ΙΟΝΟ 73

Туг

Аге

Тгр

Суз

Аге

С1у

“Рго

Ате

Аге

2-Ν31

Суз

Туг

С1п

Ьуз

Рго'Рго

95

1072,3

74

5Ер. ΙΟΝΟ 74

Тут

Аге

Рго

Суз

Аге

СНу

“Рго

Аге

Ате

2-Νλ1

Суз

Туг

С1п

Ьуз

“Рго'Рго

95

1027.9

75

$Ερ. ΙϋΝΟ 75

Туг

Аге

61и

Суз

Аге

С1у

“Рго

Аге

Аге

2-Ыа1

Суз

Туг

О1п

Ьуз

“Рго'Рго

95

1043.7

76

£Ер. ΙΟΝΟ 76

Туг

Аге

Сй

Суз

Аге

СНу

иРго4Р-РЬе

Аге

2-№1

Суз

Туг

С1п

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1052.9

77

5Ер. ΤΟΝΟ 77

Ттг

Аге

Сй

Суз

Аге

С1у

“Рго

Ате

Аге

2-Ν31

Суз

Туг

Азп

Ьуз

“Рго'Рго

95

!05Ы

78

5Ер. ΙϋΝΟ 78

Туг

Аге

Сй

Суз

Аге

С(у

“Рго

Аге

Аге

2-Ν&1

Суз

Туг

Азр

Ьуз

“Рго'-Рго

95

1051.4

79

5Ер. ΙΟΝΟ 79

Туг

Аге

Сй

Суз

Аге

СНу

“Рго

Аге

Аге

2-Ν&1

Суз

Туг

Ьуз

Ъуз

Рго'Рго

95

1057.8

60

5Ер ΙΟ N0 80

Туг

Аге

Сй

Суз

Аге

С1у

“Рго

Аге

Аге

2-Ν3Ι

Суз

Туг

А1а

Ьуз

“Рго'Рго

95

1029.4

-20010163

Таблица 2, продолжение

Примеры и=14

Пример

Послед,

ρι

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

РЗ

Р9

РЮ

Ρ11

Р12

РВ

Р14 Матрица Чистота%^

(Μ+2Η]Ζ2

31

ЗЕр. 10 N0 81

Туг

Аг£

СП

Суз

Агв

01у

“Рго

Агв

Агв

2-Ν3Ι

Суз

Туг

Зег

Ьуз г>РгоьРго

95

Ю37.1

82

5Е(?. ΙΟΝΟ 82

Туг

Аге

СИ

Суз

Агв

01у

“Рго

Аг£

Агв

2-ΝβΙ

Суз

Туг

Ьеи

Ьуз с*РгоьРго

95

Ю5О.5

83

8ЕО. ΙΟ ΝΟ 83

Туг

Аге

СИ

Суз

Агв

01у

“Рго

Ατβ

Аге

2-Ν11

Суз

Тут-

Ме!

Ьуз °Рго1Рго

95

1058.9

84

5Ер. 10ΝΟ 84

Туг

Аге

СИ

Суз

Агв

01у

“Рго

Агв

Агв

2-ΝβΙ

Суз

Тут

01п

Азп °Рго,'Рго

95

1051.0

85

Ж?. ΙΟΝΟ 85

Туг

Аге

СИ

Суз

Аге

<31у

“Рго

Агв

Агв

2-Ν3Ι

Суз

Туг

С1п

Азр с>Рго1Рг0

95

Ю51.4

88

ЗЕр.Ю N0 86

Туг

Аге

СИ

Суз

Агв

<Иу

“Рго

Агв

Агв

2-Ν&1

Суз

Туг

01п

А1а Рго'Рго

95

1028.9

87

5Ер. ΙϋΝΟ 87

Туг

Аге

СН

Суз

Агд

01у

“Рго

Ατβ

Агв

2-Ν&Ι

Суз

Туг

01п

бег °РгокРго

95

1037.3

88

8ЕО-10 N0 88

Азр

Аге

СИ

Суз

АГ£

СИу

“Рго

Агв

Агв

2-ΝβΙ

Суз

Туг

61п

Ьуз рРго]Рго

95

1034,1

89

3Ε<Ζ 10ΝΟ 89

Зег

Аге

СИ

Суз

Агв

<Яу

“Рго

Ατβ

Ατβ

2-Ν&Ι

Суз

Туг

61п

Ьуз сРгоьРго

95

1019.8

90

5ЕС}. 10 N0 90

Уа1

Агд

СН

Суз

Агв

СИу

“Рго

Агв

Агв

2-Ν&Ι

Суз

Туг

С1л

Ьуз °Рго1Рго

95

1025 8

91

5Ер. ΙΏΝ0 91

Ме1

Аге

СИ

Суз

Агв

СНу

“Рго

Агв

Агв

2-ΝαΙ

Суз

Туг

С1л

Ьуз пРго'Рго

95

1041.3

92

5Ер. Ю N0 92

Туг

Аге

Аал

Суз

Аге

01у

“Рго

Агв

Агв

2-ΝηΙ

Суз

Тут

С1п

Ьуз рРго1Рго

95

1036.2

93

5Е<2. ΙΟ N0 93

Туг

Аге

Аар

Суз

Агв

СИу

“Рго

Агв

Агв

2-ΝβΙ

Суз

Тут-

ΟΙώ

Ьуз ^РгсЛРго

95

Ю36.8

94

5Е<?ЛО ΝΟ 94

Туг

Аге

Ьуз

Суз

Агв

СИу

“Рго

Агв

Агв

2-Ν&Ι

Суз

Тут

оь

Ьуз °РгсЛРго

95

1043.3

95

5ЕР, Ю N0 95

Туг

Аге

А1а

Суз

Агв

01у

Рго

Агв

Агв

2-ΝηΙ

Суз

Туг

01п

Ьуз ^Рго'Рго

95

1014.8

96

Ж2,1О ΝΟ 96

Туг

Аге

Зег

Суз

Агв

СИу

°Рго

Агв

Аге

2-ΝηΙ

Суз

Туг

01п

Ьуз ^Рго^Рго

95

1022.8

97

5ЕР< 10 N0 97

Туг

АГ£

Ьеи

Суз

Агв

01у

“Рго

Агв

Агв

2-№Ι

Суз

Туг

01п

Ьуз ^Рго'Тго

95

1035.9

98

5ЕР, ГО N0 98

Туг

Аге

Уа1

Су5

Агв

01у

“Рго

Ατβ

Ατβ

2-Ν»Ι

Суз

Туг

С1п

Ьуз ^РгсЛРто

95

1028.9

99

5ЕР. 10 N0 99

Туг

Аге

4Р-РНе Су$

Агв

О1у

“Рго

Аге

Аге

2ТЫ

Суз

Туг

О1п

Ьуз ^РгсЛРго

95

1052.9

100

ЗЕр. ΙΟ N0 100

Туг

Аге

Ме!

Суз

Аге

С1у

“Рго

Агв

Агв

2-№1

Сув

Туг

С1п

Ьуз ^РгоРго

95

1044.9

101

ЗЕР- Ю N0 101

Туг

Аге

СН

Суз

Бег

01у

°Рго

Агв

Агв

2-Νβ1

Суз

Туг

01л

Ьуз иРго1Рго

95

1023.3

102

5ЕР, ΙΟ ΝΟ 102

Туг

Аге

Зег

Суз

Агв

СИу

“Рго

Агв

Аге

Τψ

Суз

Туг

си

Азр °РгосРго

95

1025 3

103

ЗЕО. ΓΟΝΟ 103

Туг

Аге

Ск

Суз

Агв

01у

Рго

Аге

Аге

244а1

Суз

Туг

СИ

01и °РгоьРго

95

1072.7

104

ЗЕО, 10 N0 104

Туг

Аге

ТЬг

Суз

Агв

01у

“Рго

ОаЪ

Аг£

2-ΝβΙ

Суз

Туг

С1п

Ьуз иРго1’Рго

95

ЮОЫ

105

5ΕΡ-10Ν0 105

Туг

Й15

СН

Суз

Ατβ

01у

“Рго

Агв

Аг£

Τφ

Суз

Туг

СИ

Ьуз сРго1Рго

95

1056.4

106

ЗЕО. ГО N0 106

Туг

Ьу5

СИ

Суз

Агв

С1у

“Рго

Агв

Аге

Тгр

Суз

Туг

СН

Ьуз ^РгсЛРго

95

1051.5

107

ЗЕр. 10 N0 107

РЬе

Аге

СП

Суз

Аге

С1у

“Рго

Агв

Агв

Ггр

Суз

Тут

СН

Ьуз пРгоьРго

95

1057.5

108

ЗЕр. ГОМО 108

Туг

Аге

СН

Суз

Агв

С1у

“Рго

Аге

АГ£

Тгр

Суз

Туг

С1п

Ьуз пРго1Рго

95

Ю51.0

109

ЗЕО. ΙΟΝΟ 109

Тут

Аге

СИ

Суз

Агв

С1у

“Рго

ЦаЬ

Аг§

Тф

Суз

Туг

01п

Ьуз πΡΓϋ'ΡΓθ

95

1023.0

110

ЗЕр. ГО ΝΟ 110

туг

Аге

ТЬг

Суз

Аге

С1у

“Рго

ИаЬ

Агв

Τιρ

Суз

Туг

С1п

Ьуз ^Рго^Рго

95

995.0

111

ЗЕр, 10 N0 111

Тиг

Аге

СИ

Суз

ОаЬ

С1у

“Рго

ЛГ£

ЛГ£

Тф

Суз

Туг

О'п

Ьуз °Гго1Гго

95

1016.9

112

5ЕС?. ΙΟΝΟ 112

Туг

Аге

си

Суз

ЛГ£

01у

“Рго

Аге

АГ£

Туг

Суз

Туг

СП

Ьуз Е>Рго|’Рго

95

1046.0

113

ЗЕр. 1ΠΝ0 113

Туг

Аге

СП

Суз

АГ£

С1у

“Рго

Аге

Агв

туг

Суа

СЙ

Туг

Ьуз ^Рго^Рго

83

1054.0

114

ЗЕр. ГО N0 114

С1у

Аге

СП

Суз

Аг§

С1у

“Рго

Агв

Агв

2-Ν&Ι

Суз

Туг

СП

Ьуз Врго’Тго

95

1018.0

Пример

Послед.

Р1

Р2

РЗ

Р4

Р5

Рб

Р7

РЗ

Р9

РЮ

Ρ11

Р12

РВ

Р14 МатрнцаЧистота’/о^

[М+2Н]/2

115

ЗЕр. 10ΝΟ 115

Туг

Агв

СН

Суз

Агв

01у

“Рго

Агв

Аге

2-Ν31

Суз

Туг

01п

Ьуз ^РиЛРго

95

1057.8

116

ЗЕр. ΙΟ ΝΟ 116

Туг

ЛГ£

СП

Суз

Аге

С1у

“Рго

Агв

ΑΓβ

Тф

Суз

Тут

СИ

Ьуз °РгоАЗ-42

68

1153.1

117

ЗЕО, ΙΟΝΟ 117

Туг

Агв

СП

Суз

Аге

С1у

“Рго

Агв

От

Тгр

Суз

Туг

СН

Ьуз 0РгоъРго

90

1044.5

118

ЗЕр. 10 Νο 118

Туг

Агд

ТЬг

Суз

АГ£

01у

Рго 4-РугА 1аАг§

Тф

Суз

Туг

01л

Ьуз ύΡτθΓΡΓθ

95

1019.0

119

8Е0, ΙΟΝΟ 119

Туг 4-РугА 1а ТЬг

Суз

Агв

С1у

“Рго

Агв

Агв

Тгр

Су5

Туг

С1п

Ьу5 °Рго1Рго

90

1019,0

120

ЗЕр. ΓΟΝΟ 120

Туг

Н15

ТЬг

Суз

Аг£

С1у

“Рго

Агв

Н|3

Тгр

Суз

Туг

сь

Ьуз |>РгоьРго

95

1013.5

121

ЗЕр. Γϋ N0 121

Туг

Агв

СИ

Суз

Агв

01у

“Рго

Агв

Агв

Тгр

Суз

Туг

СИ

С 1л иРго£Рго

95

1065.5

122

ЗЕр. ГО ΝΟ 122

Туг

Агв

СП

Суз

Аге

С1у

иРго 4Е-РЬе

Агв

Тгр

Суз

Тут

си

Ьуз сРго1,Рго

95

1070.0

123

ЗЕр ΙΟΝΟ 123

Туг

Аге

СН

Суз

Агв

01у

“Рго

Дг£

Агв

Тф

Суз

Туг

СИ

Ьуз °Рго1’Рго

95

1065 5

124

ЗЕр. 10 N0 124

Туг

Агв

СИ

Суз

Агв

СИу

“Рго

1з0т

Агв

2-Ν&Ι

Суз

Туг

СИ

Ьуз иРгокРго

95

1106.1

125

8ΕΡ.ΙΟΝΟ125

Туг

Аге

СН

Суз

Агв

СИу

“Рго

(Гт)О Аг6

2-Ν1Ι

Суз

Туг

СН

Ьуз °Рго|Тга

95

1075.5

126

ЗЕр. 10 N0126

Туг

Аге

Ск

Суз

Аге

СИу

“Рго

Агв

(Ρίρ)Ο

2-Ν3Ι

Суз

Туг

СИ

Ьуз °Рго1'Рго

95

1091.6

127

ЗЕр, ΓΟΝΟ 127

Туг

Аге

СН

Суз

Аге

СИу

“Рго

Агв

Аге

2-ΝαΙ

Суз

Туг

СН

ΝΜεΚ ^го'Рго

85

1078.1

128

ЗЕр. ГО N0128

Туг

Аге

С И

Суз

Аге

СИу

“Рго

Ατβ

ЛГ£

1 гр

Суз

Туг

СИ

Ьуз рРго'Рго

93

1066-6

129

ЗЕр. ГО N0129

Туг

АГ£

СИ

Суз

Агв

С1у

“Рго

Агв

Агв

2-Ν&Ι

Суз

Туг ΝΜβΟίγΕγ® “РгсгРго

89

1029.1

130

ЗЕр. ΓΟΝΟ 130

ТУг

Агв

01л

Суз

Агв

О1у

“Рго

Ατβ

Агв

2-Ν&Ι

Суз

Туг

СН

Ьуз кРгокРго

79

1057.5

131

ЗЕр. ΙΟΝΟ 131

Туг

Аге

ТЬг

Суз

Аге

СИу

“Рго

Агв

Агв

2-Ν3Ι

Суз

Туг

СИ

Ьуз °Рго|'Рго

98

1043.9

132

ЗЕр, 1ΟΝΟ 132

Туг

Аге

СП

Суз

Аг£

01у

“Рго

Аге

Агв

2-Ν31

Суз

Туг

ТЬг

Ьуз ^Рн/Рго

89

1057.4

133

5ЕР, ΙϋΝΟ 133

Туг

Агв

СИ

Суз

Аг£

С1у

“Рго

Аге

Агв

2-№1

Суз

Туг

ТЬг

Ьуз ьРго11Рго

90

1044.0

134

ЗЕр. ΙΟΝΟ 134

Туг

Агв

СН

Суз

Агв

01у

“Рго

ИаЬ

АГ£

2-№1

Суз

Туг

си

Ьуз °Рго[Рго

88

1044.0

135

ЗЕр, 10 N0 135

Туг

Аге

си

Суз

Агв

С1у

“Рго

ЦаЬ

ΑΓβ

2-Ν31

Суз

Туг

СП

Ьуз сРго[,Рго

95

1037.0

136

ЗЕр. 10 ΝΟ 136

Туг

Аге

СИ

Суз

Агв

01у

“Рго

СЙ

Агв

Тф

Суз

Тут

СН

Ьуз иРг<ЛРго

95

1066.0

137

ЗЕр. 10 N0 137

Туг

Аге

СИ

Суз

Ατβ

01у

“Рго

НЬ

Ατβ

Тф

Суз

Туг

СИ

Ьуз пРго'Рго

95

1056.0

138

ЗЕр. ΙϋΝΟ 138

туг

Аге

СИ

Суз (ЕА)О

01у

“Рго

Агв

ΑΓβ

2-Ν31

Суз

Туг

СИ

Ьуз °РгоЕ'Рго

76

1043.9

139

ЗЕр, ΙϋΝΟ 139

Туг

Аг£

СН

Суз

Агв

С1у

Рго

АГ£

(ЕА)О

2-Ν31

Суз

Туг

СН

Ьуз °РгсЛрго

90

1044.0

140

ЗЕр. 10 N0140

Туг

Агв

СИ

Суз

Агв

01у

“Рго

Аге

АГ£

2-№1

Суз

Туг

СН

Ьуз £1РтокРго

88

1043.9

141

ЗЕр. ΙϋΝΟ 141

Туг

Агв

СН

Суз

Агв

01у

“Рго

Ατβ

Ατβ

2-Ν&Ι

Суз

Туг

СН

Ьуз °РгоьРго

95

1077.1

142

ЗЕр. ΙϋΝΟ 142

Туг

Аге

СН

Суз

Аге

01у

иРго [РееОаЬ Аг§

Тф

Суз

Туг

СН

Ьуз |)РгоьРго

95

1117.6

-21 010163

Таблица 2, продолжение

Примеры п=14

Пример

Послед.

Ρ1

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9

РЮ

Р11

Р12

Р13

Р14 МатрицаЧистота%а)

[М+ 2Н]/2

143

8Е<У ГО ΝΟ 143

Туг

Аг§

Сй

Суз

Аг§

А1а

вРго

Аге

Аг§

Тгр

Суз

Туг

Сй

Ьуз

вРгоЕРго

95

1072.5

144

8Е0. ΙϋΝΟ 144

Ьеи

Аг§

Сй

Суз

Аг§

О1у

вРго

Аг§

Аг§

2-Иа1

Суз

Туг

О1п

Ьуз

вРгоЕРго

87

1032.9

145

8Е(У ΙϋΝΟ 145

Туг

Аг§

ТЬг

Суз

Аг§

О1у

°Рго

Аг§

Аг§

Туг

Суз

Туг

О1п

Ьуз

вРгоЕРго

95

1012.6

146

8Е0. ГО ΝΟ 146

Туг

Аг§

ТЬг

Суз

Аг§

О1у

вРго

Аг§

Аг§

Туг

Суз

Туг

Сй

Ьуз

вРгоЕРго

95

1026.6

147

8Е0. ГО ΝΟ 147

Туг

Ат§

Не

Суз

Аг§

61у

вРго

Аг§

Аг§

Туг

Суз

Туг

О1п

Ьуз

иРго‘Рго

92

1043.8

148

8ЕО. ГО ΝΟ 148

Туг

Аг§

Туг

Суз

Аг§

61у

°Рго

Аг§

Аг§

Туг

Суз

Туг

О1п

Ьуз

вРгоЕРго

91

1043.8

149

8Е0. ГО ΝΟ 149

Туг

Αγ^

Сй

Суз

Аг§

О1у

°Рго

Аг§

Аг§

Туг

Суз

Туг

С1п

Ьуз

в61пЕРго

91

1025.7

150

8Ες. ΙϋΝΟ 150

Ρΐρ

Аг§

Туг

Суз

Туг

С1п

Ьуз

вРго

Рго

Туг

Аг§

Сй

Суз

Агё

О1у°Рго

95

704.2

151

8Εζ). ΙϋΝΟ 151

Туг

Аг§

Сй

8ег

Аг§

С1у

вРго

Аг£

Аг§

Тгр

Азп

Туг

Сй

Ьуз

вРгоЕРго

67

1065.0

152

8Е(Д ГО ΝΟ 152

Туг

Аг§

Сй

ОаЬ

Аг§

О1у

вРго

Аг§

Аг§

Тгр

О1и

Туг

Сй

Ьуз

вРгоЕРго

92

1070.3

153

8Е0. ΙΟ ΝΟ 153

Туг

Аге

СЙ

С1и

Аг§

О1у

°Рго

Аг§

Аг§

Тгр

ОаЬ

Туг

Сй

Ьуз

вРгоЕРго

72

1070.4

Суз в положении 4 и 11 в Примерах 51-149 образуют дисульфидный мостик, ОаЬ соот. О1и в положении 4 и С1и соот. ОаЬ в положении 11 в Примере 152 соот. 153 образуют лактамовый мостик

а) %-чистота соединений после препаративной ВЭЖХ

Таблица 3

Примеры п=18

Пример Послед.

Р1 Аге

Р2 Аге

РЗ 2-Ца1

Р4 Суз

Р5 Туг

Р6 Сй

Р7 Ьуз

Р8 Суз

Р9 Туг

РЮ Ьуз

РН СИу

Р12 Туг

Р13 Суз

РМ Туг

ΡΙ5 Аге

ΡΙ6 Сй

ΡΙ7 Суз

Р18 Аге

Матрица СЛу^Рга

154

8Ες. ΙΟ ΝΟ 154

155

8Ε0-1ΟΝΟ 155

Ат£

Аге

Ттр

Суз

Туг

61»

Ьуз

Суз

Туг

Ьуз

С1у

Туг

С1у

Тут

Аге

Сй

Суз

Аге

ΟΙ/’Ργο

156

8Е0. ΙΟ ΝΟ 156

Аг®

Аге

Тф

Суз

Туг

О1п

Ьуз

О1у

Туг

Ьуз

О1у

Туг

О1у

Туг

Аге

Сй

Суз

Аге

СИу°Рго

157

ЗЕО. ЮМО 157

Аге

Аге

Тф

Суз

Туг

ЕУ*

О1у

Тут

%уз

С1у

Туг

Ст1у

Туг

Аге

Сй

Су*

Аге

О1у°Рго

158

8ЕС}. Ю МО 158

Аге

Аге

Тф

Суз

Туг

О1л

Ьуз

С1у

Тут

°Рго

Рго

Туг

Шу

Туг

Аге

Сй

Суз

Лге

С1уЕРго

159

5Е0, ГОМО 159

Аге

Аге

Туг

Суз

Туг

О1л

Ьуз

О1у

Туг

вРго

Рго

Туг

О1у

Туг

Аге

ТЬг

Суз

Ате

О1уЕРго

160

5Е0. Ю МО 160

Аге

АгВ

Тф

Суз

Туг

Аге

Ьуз

Суз

Туг

Ьуз

О1у

Туг

Суз

Туг

Аге

Ьуз

Суз

Ате

С1у°Рго

Суз в положении 4 н 17 и положении 8 и 13 н Примерах 154-155 и 160 образуют дисульфидный мостик, Суз в положении 4 и 17 в Примерах 156-159 образуют днсул ьфипнмй мостик

2. Биологические методы.

Подготовка пептидов.

Лиофилизированные пептиды взвешивают на весах М1сгоЬа1апсе (МеШег МТ5) и растворяют в стерильной воде до конечной концентрации 1 мМ, если не указано иначе. Стоковые растворы хранят при +4°С, защищенными от света.

Исследование Са²⁺: активность пептидов как антагонистов СХСК-4.

Метод 1. 3-4 Μΐο СХСК4 трансфицированных пре-В клеток [см. ссылки 1, 2 и 3 ниже] на измерение ресуспендируют в 200 мкл М8В (20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1 -этансульфоновой кислоты (НЕРЕ8), 136 мМ ИаС1, 4,8 мМ КС1 и 1 мМ СаС1₂), содержащего 5 мМ ϋ-глюкозы, и загружают 0,75 мкл 1 мМ фура-2-ацетоксиметилэфира (Еша-2-ΑΜ) на 17 мин при 37°С. Клетки отмывают от Еига-2-ΑΜ осаждением центрифугированием и ресуспендируют в 800 мкл М8В, содержащего 5 мМ ϋ-глюкозы. Вводимые пептиды разбавляют до 100-кратной конечной концентрации в М8В/0,2% РРБ, и вводят 8 мкл. [Са²⁺]1-зависимое изменение флуоресценции в ответ на однократное или последовательное стимулирование пептидом записывают при помощи флуориметра при длине волны возбуждения 340 нм и конечной длине волны эмиссии 510 нм [см. ссылку 4 ниже]. Измерения проводят при постоянном перемешивании при 37°С. Интенсивность сигнала калибруют при использовании 3 мМ СаС12/1 мМ иономицина (максимальное насыщение фура-2-ацетоксиметилэфиром) и 10 мкМ МпС12 (минимальное насыщение фура-2ацетоксиметилэфиром), и [Са²⁺]1-изменения представлены в % насыщения фура-2-ацетоксиметилэфиром. Уровень [Са^-изменений вычисляли на основании начальных [Са^-изменений и наносили на график в зависимости от концентрации хемокина для получения сигмоидальной кривой и для определения величин 1С₅₀.

М8В: 20 мМ НЕРЕ8, 136 мМ Νπ(21, 4,8 мМ КС1, 1 мМ СаС1₂-2Н₂О, рН 7,4;

Осмолярность: 310 мОсм доводится №ОН или НС1, доводится Н₂О или РВ8.

М8В р1и§: 5 мМ ϋ-глюкозы в М8В (50 мг/50 мл).

Фура-2-ацетоксиметилэфир: 1 мМ стоковый раствор в диметил сульфоксиде.

Метод 2. Е1овышение уровней внутриклеточного кальция отслеживают при помощи Е1ех81а1юп 384 (Мо1еси1аг ϋενίοβδ, 8иппууа1е, СА) для оценки активности пептидов как антагонистов СХСК4 в линии пре-В клеток мыши 300-19, стабильно трансфицированных СХСК4 человека [см. ссылки 1, 2 и 3, ниже]. Клетки загружают набором для исследования Са1сшт 3 Аззау кй (Мо1еси1аг ϋενίοβδ) в буфере для исследования (сбалансированный солевой раствор Хенкса, Напкз Ва1апсес1 зай δοϊιιΐΐοη, НВ88, 20 мМ НЕРЕ8, рН7,4, 0 ,1% В8А) на 1 ч при комнатной температуре и затем 200000 меченых клеток вносят в черные 96луночные планшеты для исследования (Со81аг № 3603). К клеткам добавляют 20-кратный концентрированный раствор пептида в буфере для исследования и весь планшет центрифугируют для осаждения клеток на дно лунок. Мобилизацию кальция, индуцированную 10 нМ фактора 1 стромального происхождения (8ϋΕ-1), измеряют в приборе Е1ех81а1юп 384 (возбуждение, 485 нм; эмиссия, 525 нм) в течение 90 с.

-22010163

Максимальное изменение в ответной флуоресценции по сравнению с базовой линией используют для вычисления активности антагониста. Данные кривых ответа в зависимости от дозы (концентрация антагониста против % максимального ответа) вносят в логистическое уравнение с 4 параметрами при использовании δойтаxΡ^о 4.6 (Μо1еси1а^ Эеу1сех). по которому вычисляют значения 1С₅₀о_/о.

Исследование ЕЮ8™.

Исследование проводят согласно ссылке 5, приведенной ниже. Стоковые разведения пептидов (10 мМ) готовят растворением в 10 мМ трис-НС1 при комнатной температуре. Стоковые растворы хранят при +4°С, защищенными от света. Рабочие разведения готовят непосредственно перед применением последовательным разведением в фосфатном солевом буфере (ΓΒδ) и добавляют в конечном объеме 10 мкл непосредственно в культуры клеток. После 48 ч совместного культивирования культуры промывают ΡΒδ и затем подвергают воздействию глутарового альдегида/формальдегида (0,2%/2%) в ΡΒδ в течение 5 мин. Для фотометрического количественного определения фиксированные культуры далее инкубируют с орто-нитро-фенил-галактопиранозидом (ОК’РС) в качестве β-галактозидазного субстрата, который ферментативным путем превращается в хромофор орто-нитрофенол (ОNΡ). Результат получают непосредственным измерением оптической плотности лунок при 405 нм в считывателе для 96-луночного планшета ΕΜδ.

Исследование цитотоксичности.

Цитотоксичность пептидов по отношению к клеткам НЕЬА (Асс57) и С0δ-7 (СКЬ-1651) определяют при использовании исследования восстановления ΜΈΓ (см. ссылки 6 и 7 ниже).

Коротко о методе. Клетки НЕЬА и С0δ-7 сеют с плотностью 7,0х10³ и, соответственно, 4,5х10³ клеток на лунку и растят в 96-луночных планшетах для титрования в течение 24 ч при 37°С при 5% СО2. Β этот момент определяют показание «времени ноль» (Тх) по восстановлению ΜΊΓ (см. ниже). Удаляют супернатант из оставшихся лунок, и вносят в лунки свежую среду и пептиды в последовательных разведениях 12,5, 25 и 50 мкМ. Каждую концентрацию пептида исследуют в трех параллелях. Продолжают инкубацию клеток в течение 48 ч при 37°С при 5% СО₂. Затем лунки промывают один раз ΡΒδ и затем добавляют в лунки 100 мкл реагента ΜΠ (0,5 мг/мл в среде ^ΜΙΚΑΙ) и, соответственно, ΩΜΒΜ). Инкубируют 2 ч при 37°С и затем аспирируют среду и в каждую лунку добавляют 100 мкл изопропанола. Измеряют поглощение солюбилизированного продукта при 595 нм (ОО₅₉₅пептида). Для каждой концентрации вычисляют среднее из трех значений. Процент роста вычисляют следующим образом: (ОО₅₉₉пептида-ОО₉₉₉Тх-ОО₉₉₉пустой лунки)/(ОО₅₉₉Тх-ОО₉₉₉пустой лунки)х 100% и наносят на график для каждой концентрации пептида.

Для каждого пептида определяют значение БЕ (50 летальная концентрация, определяемая как концентрация, убивающая 50% клеток) при использовании функции экстраполяции ЕХСЕЬ (Μ^с^оχоГ! ОГПсс 2000) для концентраций (50, 25, 12,5 и 0 мкМ), соответствующих процентов роста и величины -50, (ТКЕ\В(С, :С .%,:%., )).

Для каждого пептида вычисляют концентрации ΟΙ 50 (ингибирование роста) при использовании функции экстраполяции для концентраций (50, 25, 12,5 и 0 мкг/мл), соответствующих процентов и величины 50, (ТКЕ\В(С, :С .%,:%, )).

Культура клеток.

Клетки ССК5 культивируют в среде ^ΜΕΜ с 4500 мг/мл глюкозы, 10% бычьей эмбриональной сыворотки (БЭС, ΡΒδ), с добавлением 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Реп^йер!). Клетки НШ/4-3 поддерживают в среде №ΜΙ тебшт, 10% ΡΒδ, с добавлением Реп^йер!. и 10 мМ ΗΕΡΕδ. Клетки НЕЬА ί’ί'ΈΡ-ίΈΜ поддерживают в среде ЯΡΜI1640 плюс 5% ΡΒδ, Реп^йер! и 2 мМ Ьглутамина. Клетки Сох-7 растят в среде ΩΜΞΜ с 4500 мг/мл глюкозы с добавлением 10% ΡСδ, Реп^йер!. и 2 мМ Ь-глутамина. Все линии клеток растят при 37°С при 5% СО₂. Клеточную среду, добавки, буфер ΡΒδ, ΗΕΡΕδ, Реп^йер!., Ь-глутамин и сыворотки приобретают в С1Ьсо (Райхеу, иК). Все химикаты приобретают в Μе^ск (ΌαηηχΙαάΙ. Сегтапу).

Гемолиз. Пептиды тестируют на гемолитическую активность по отношению к эритроцитам человека (ИКБС). Свежие ИКБС три раза промывают фосфатным солевым буфером (ΤΒδ) центрифугированием 10 мин при 2000хд. Пептиды в концентрации 100 мкМ инкубируют с 20% (об./об.) ИКБС в течение 1 ч при 37°С. Конечная концентрация эритроцитов составляет приблизительно 0,9х10⁹ клеток в мл. Величину 0% относительно 100% лизиса клеток определяют инкубированием ИКЕС в присутствии ΡΒδ и, соответственно, 0,1% Тгйоп Х-100 в Н₂О. Образцы центрифугируют, а супернатант разбавляют в 20 раз в буфере ΡΒδ и измеряют оптическую плотность (ОЭ) образца при 540 нм. Величина 100% лизиса (ОО₅₄₀Н₂О) дает оптическую плотность ОО₅₄₀ приблизительно 1,3-1,8. Процент гемолиза определяют следующим образом: (ОП₅₄₀пептида/ОП₅₄₀Н₂О)х100%.

Хемотаксический анализ (исследование миграции клеток).

Хемотаксический ответ клеток ССКΡ-СΕΜ на градиент фактора 1α, полученного из стромальных клеток (δΌΡ-1), измеряют при использовании одноразовых планшетов для исследования №игоргоЬе (размер пор 5 мкм) (СаййегхЬигд, ΜΌ), согласно инструкции изготовителя и указаниям, приведенным в ссылках [особенно ссылка 8, приведенная ниже]. Коротко, один флакон площадью 175 см² промывают

- 23 010163 один раз солевым буферным раствором Дальбекко (ΌΡΒ8) и трипсинизируют в течение 10 мин или до открепления клеток. Трипсин нейтрализуют добавлением свежей среды, содержащей сыворотку, клетки осаждают, промывают один раз в ΌΡΒ8 и ресуспендируют в концентрации 1-0,5х10⁷ клеток/мл в ΚΡΜΙ+0,5% бычьего сывороточного альбумина (Β8Α). 45 мкл суспензии клеток смешивают с 5 мкл 10кратного концентрированного пептида РЕМ, разбавленного в такой же среде исследования. 35 мкл этой смеси наносят на верхнюю сторону фильтра для исследования. Клетки оставляют мигрировать (при 37°С) в нижнюю камеру планшета для исследования, содержащую 1 нМ 8ΌΕ-1. Через 4 ч фильтр удаляют и к мигрировавшим клеткам добавляют ΜΤΤ до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубируют в течение еще 4 ч. После мечения ΜΤΤ всю среду удаляют и к клеткам добавляют 100 мкл изопропанола+10 мМ НС1. Считывают оптическое поглощение при 595 нм (ΑΒ8₅₉₅) при помощи считывателя для планшетов Τοοαη Сешо5 р1а!е геайег с программным обеспечением ΜαβοΠαη. Количество мигрировавших клеток определяют сравнением значений ΑΒ8₅₉₅ со стандартной кривой, полученной с известным количеством клеток в планшете для исследования, и наносят на график зависимости от концентрации 8ΌΕ-1, получают сигмоидальную кривую и определяют значения Ι0₅ο. Значения Ιί.'₅₀ определяют при использовании функции экстраполяции в ΜίοϊΌδοΠ Εxсе1 построением логарифмической кривой на усредненных значениях.

Стабильность в плазме.

405 мкл раствора плазма/альбумин помещают в полипропиленовую (ΡΡ) пробирку и вносят в нее 45 мкл соединения из 100 мкМ раствора В, полученного из 135 мкл ΡΒ8 и 15 мкл 1 мМ пептида в ΡΒ8, рН 7,4. 150 мкл аликвоты переносят в отдельные лунки 10 кДа фильтрующего планшета ^ПИроге ΜΑΡΡΒ 1010 мембрана Βίοιηαχ). Для контроля 0 минуты: 270 мкл ΡΒ8 помещают в ΡΡ пробирку, добавляют 30 мкл стокового раствора В и перемешивают. 150 мкл контрольного раствора помещают в одну лунку фильтрующего планшета, она служит фильтрованным контролем.

Следующие 150 мкл помещают прямо в приемную лунку (зарезервированную для фильтрата), она служит нефильтрованным контролем. Весь планшет вместе с крышкой для упаривания инкубируют 60 мин при 37°С. Образцы плазмы (плазма крыс: Наг1ап 8ега 1аЬ ИК, плазма человека: Β1ιιΐ^ηώ^ηΐπ.ιιη Ζϋποίι) центрифугируют в течение по крайней мере 2 ч при 4300 об/мин (3500 д) и 15°С, получают 100 мкл фильтрата. Для образцов сывороточного альбумина (свежеприготовленный человеческий альбумин: 81дта Α-4327, альбумин крыс: 81дта Α-6272, все в концентрации 40 мг/мл в ΡΒ8) достаточно приблизительно 1 ч центрифугирования. Фильтраты в приемном ΡΡ планшете анализируют жидкостной хроматографией/масс-спектроскопией (^^8) следующим образом. Колонка: 1ирйег С18 ^^штепех), подвижные фазы: (А) 0,1% муравьиной кислоты в воде и (В) ацетонитрил, градиент: 5-100% (В) в течение 2 мин, ионизация электрораспылением, детекция ΜΚΜ (ти1Ир1е геасйоп топйогшд, мониторинг нескольких реакций) (тройной квадруполь). Определяют площади пиков и усредняют тройные значения. Связывание выражают в процентах (фильтрованного и нефильтрованного в минуту 0) контроля 1 и 2 следующим образом: 100-(100-^(/1/). Затем вычисляют среднее из этих значений (см. ссылку 9 ниже).

Исследование фармакокинетики (ΡΚ).

Для соединения примера 51 (пример 51) проводят исследование фармакокинетики после одного внутривенного (ί.ν.) и внутрибрюшинного (1.р.) введения. Для исследования используют самцов мышей СИ-1 массой 30 г (±20%), полученных из Сйаг1е8 Ккег ЬаЬога!ог1е8 ИеиксЫапй СтЬН. Для получения раствора соединений с конечной концентрацией 1 мг/мл используют носитель, физраствор. Объем составляет 2 мл/кг ί.ν. и 10 мл/кг 1.р., и пептид примера 51 вводят до конечной внутрибрюшинной дозы 10 мг/кг и внутривенной дозы 2 мг/кг. Приблизительно 250-300 мкл крови отбирают под легкой изофлурановой анестезией из ретроорбитального сплетения в определенные интервалы времени (0, 5, 15, 30 мин и 1, 2 и 3 ч для ί.ν. исследования и 0, 15, 30 мин и 1, 2, 4 и 8 ч для 1.р. исследования) и помещают в пробирки с гепарином. Плазму отбирают из осажденных клеток после центрифугирования и замораживают при -80°С перед исследованием методом ВЭЖХ-МС.

Получение калибровочных образцов плазмы.

Используют нулевую плазму мышей от необработанных животных. К аликвотам плазмы по 0,2 мл добавляют 50 нг пропранолола (внутренний стандарт, !п1егпа1 8!апйагй, Ι8), (приготовление образцов твердофазной экстракцией на картриджах ΟΑ8Ι8® НЕЗ (^а!ег§)) и известные количества соединения примера 51, получают 9 калибровочных образцов плазмы в пределах от 10-5000 нМ. Картриджи ΟΑ8Ι8® НЕЕ обрабатывают 1 мл метанола, а затем 1 мл 1% ΝΉ₃ в воде. Затем образцы разбавляют 700 мкл 1% ΝΉ₃ в воде и загружают. Планшет промывают 1 мл метанола/1% ΝΉ₃ в воде в соотношении 5/95. Элюирование проводят при использовании 1 мл 0,1% ТФУ в метаноле.

Планшет с элюатами помещают в концентрирующую систему и высушивают досуха. Остатки растворяют в 100 мкл 0,1% муравьиной кислоты/ацетонитрила, 95/5 (об./об.), и анализируют методом ВЭЖХ/МС на обращенно-фазовой аналитической колонке (1ирйег С18, 50x2,0 мм, 5 мкм, Ρ11еηοтеηеx). при использовании градиента элюата (подвижные фазы А: 0,1% муравьиная кислота в воде, В: ацетонитрил, от 5% В до 100% В в течение 2 мин).

- 24 010163

Получение образцов плазмы.

Образцы, полученные от обработанных животных, объединяют для получения подходящего объема для экстрагирования. Если общий полученный объем меньше 0,2 мл, то добавляют подходящий объем нулевой плазмы, чтобы матрикс был идентичен калибровочной кривой. Затем к образцам добавляют 18 и обрабатывают их, как описано для получения калибровочной кривой.

Оценка фармакокинетики.

Проводят фармакокинетический анализ (РК) обобщенных данных (обычно п=2 или 3) при использовании программного обеспечения РК 8о1ийоп8 2.0™ (8ишшй Везеагсй 8егу1се, Моп1гозе, СО 81401 И8Л). Площадь области под кривой ЛИС вычисляют по линейному правилу трапеции. ЛИС(_1-да) оценивают как С1/Ъ (Ъ: константа скорости элиминации). ЛИС(_1-да) представляет собой сумму ЛИС(_0-1) и ЛиС(_1-ю). Время полуэлиминации вычисляют методом линейной регрессии по меньшей мере по трем точкам во время фазы элиминации. Временные интервалы, выбранные для определения времени полуэлиминации, оценивают по коэффициенту корреляции (г²), который должен быть по меньшей мере выше 0,85, а наиболее оптимально - 0,96. В случае ΐ.ν. введения начальную концентрацию в нулевой момент времени Ι^ιό определяют экстраполяцией кривой через две первых временных точки. Наконец, биодоступность после ΐ.ρ. введения вычисляют по нормализованному соотношению ЛИС(_0-да) после ΐ.ρ. против ΐ.ν. введения.

3.0. Результаты.

Результаты экспериментов, описанных выше в пп.2.2-2.7, приведены в табл. 4 ниже.

Таблица 4

- 25 010163

Прим.	1С50(нМ) исследование Са2+	ΡΙΟ8™	Цитотоксичность ЬС50/С150 Клетки Не1а	Гемолиз при 100 мкМ	1С50 (мкМ) Исследование миграции клеток
% ингибирования при 200 нМ	Ст. отклонение при 200 нМ
58	10.5	η.ά.	η.ά.	18	0.0	η.ά.
59	7.8	η.ά.	η.ά.	33	0.1	η.ά.
60	0.18	η.ά.	η.ά.	62	0.1	η.ά.
61	4.1	η.ά.	η.ά.	>100	0.3	η.ά.
62	1.8	η.ά.	η.ά.	65	0.1	η.ά.
63	2.0	η.ά.	η.ά.	58	0.2	η.ά.
64	3.3	η.ά.	η.ά.	66	0.3	η.ά.
65	3.9	η.ά.	η.ά.	65	0.2	η.ά.
66	3.8	η.ά.	η.ά.	46	0.0	η.ά.
67	2.4	η.ά.	η.ά.	49	0.2	η.ά.
68	1.1	η.ά.	η.ά.	>100	0.1	η.ά.
69	1.8	η.ά.	η.ά.	49	0.1	η.ά.
70	19.5	η.ά.	η.ά.	40	0.2	η.ά.
71	2.7	η.ά.	η.ά.	34	0.1	η.ά.
72	3.9	η.ά.	η.ά.	36	0.5	η.ά.
73	8.8	η.ά.	η.ά.	20	0.3	η.ά.
74	19.5	η.ά.	η.ά.	40	0.4	η.ά.
75	3.5	η.ά.	η.ά.	>100	0.0	η.ά.
76	5.6	η.ά.	η.ά.	>100	0.1	η.ά.
77	7	η.ά.	η.ά.	>100	0.2	η.ά.
78	11	η.ά.	η.ά.	69	0.1	η.ά.
79	2.4	η.ά.	η.ά.	94	0.0	η.ά.
80	2.9	η.ά.	η.ά.	44	0.1	η.ά.
81	4.9	η.ά.	η.ά.	45	0.0	η.ά.
Прим.	1С50(нМ)	ΡΙΟ81Μ		Цитоток-	Гемолиз	1С5о (мкМ)
	исследование			сичность	при 100	Исследо-
	Са2+	% ингиби-	Ст. от-		мкМ	вание ми-
		рования при	клонение	Клетки		грации
		200 нМ	при 200	Не1а		клеток
			нМ
82	4.8	η.ά.	η.ά.	40	0.0	η.ά.
83	3.7	η.ά.	η.ά.	48	0.1	η.ά.
84	3.9	η.ά.	η.ά.	62	0.0	η.ά.
85	2.7	η.ά.	η.ά.	94	0.0	η.ά.
86	0.69	η.ά.	η.ά.	62	0.0	η.ά.
87	3.5	η.ά.	η.ά.	64	0.0	η.ά.
88	2.5	η.ά.	η.ά.	44	0.0	η.ά.
89	0.5	η.ά.	η.ά.	50	0.0	η.ά.
90	19.5	η.ά.	η.ά.	57	0.1	η.ά.
91	2.1	η.ά.	η.ά.	48	0.2	η.ά.
92	1.1	η.ά.	η.ά.	53	0.5	η.ά.
93	4.3	η.ά.	η.ά.	>100	0.2	η.ά.

п.й.: не определено

- 26 010163

Определение значений 1С₅₀ (нМ) в исследовании Са²⁺ для примеров 1-53 проводили при использовании метода 1, для примеров 54-155 использовали метод 2. Для определения значений цитотоксичности в примерах 1-53 использовали вычисления ЬС₅₀, для примеров 52-160 использовали вычисления ΟΙ₅₀.

Таблица 4 (продолжение)

- 27 010163

Прим.	1С50(нМ) исследование Са2+	ИС8™	Цитотоксичность £С5(/ ΟΙ50 Клетки Не1а	Г емолиз при 100 мкМ	1С50 (мкМ) Исследование миграции клеток
% ингибирования при 200 нМ	Ст. откло- нение при 200 нМ
116	14.5	η.ά.	η.ά.	20	0.0	η.ά.
117	3.4	η.ά.	η.ά.	44	0.0	η.ά.
118	7.6	η.ά.	η.ά.	52	0.0	η.ά.
119	9.4	η.ά.	η.ά.	63	0.0	η.ά.
120	8.1	η.ά.	η.ά.	78	0.0	η.ά.
121	6.5	η.ά.	η.ά.	79	0.0	η.ά.
122	8.8	η.ά.	η.ά.	60	0.0	η.ά.
123	10.0	η.ά.	η.ά.	80	0.0	η.ά.
124	5.9	η.ά.	η.ά.	21	0.0	η.ά.
125	330.0	η.ά.	η.ά.	>100	0.0	η.ά.
126	19.5	η.ά.	η.ά.	85	0.0	η.ά.
127	52.2	η.ά.	η.ά.	62	0.0	η.ά.
128	4.5	η.ά.	η.ά.	43	0.0	η.ά.
129	10.9	η.ά.	η.ά.	23	0.0	η.ά.
130	4.1	η.ά.	η.ά.	62	0.0	η.ά.
131	2.4	η.ά.	η.ά.	53	0.0	η.ά.
132	1.9	η.ά.	η.ά.	76	0.0	η.ά.
133	5.3	η.ά.	η.ά.	45	0.1	η.ά.
134	1.7	η.ά.	η.ά.	21	0.0	η.ά.
135	4.7	η.ά.	η.ά.	30	0.1	η.ά.
136	4.1	η.ά.	η.ά.	>100	0.0	η.ά.
137	1.28	η.ά.	η.ά.	79	0.5	η.ά.
138	63.0	η.ά.	η.ά.	18	0.0	η.ά.
140	19.6	η.ά.	η.ά.	35	0.0	η.ά.

- 28 010163

Прим.	1С50(нМ) исследование Са2+	ΓΙΟ8™	Цитотоксичность РСц/ ΟΙ50 Клетки Не1а	Гемолиз при 100 мкМ	1С-50 (μκΜ) Исследование миграции клеток
% ингибирования при 200 нМ	Ст. откло- нение при 200 нМ
141	>10	η.ά.	η.ά.	18	η.ά.	η.ά.
142	96.9	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
143	0.9	η.ά.	η.ά.	46	η.ά.	η.ά.
144	0.18	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
145	0.38	η.ά.	η.ά.	97	0.0	η.ά.
146	0.24	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
147	0.17	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
148	0.65	η.ά.	η.ά.	46	71	η.ά.
149	1.0	η.ά.	η.ά.	>100	0.0	η.ά.
150	1.4	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
151	4.2	η.ά.	η.ά.	83	0.9	η.ά.
152	4.2	η.ά.	η.ά.	46	0.0	η.ά.
153	21.9	η.ά.	η.ά.	43	1.7	η.ά.
154	9.3	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
155	0.46	η.ά	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
156	49	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
157	11.3	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
158	250	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
159	118	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.
160	0.38	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.	η.ά.

п.д. не определено

Определение значений 1С₅₀ (нМ) в исследовании Са²⁺ для примеров 1-53 проводили методом 1, для примеров 54-160 использовали метод 2.

Результаты эксперимента, описанного выше в п.2.8, приведены в табл. 5.

Таблица 5

Результаты эксперимента, описанного выше в п.2.9 (РК), приведены в табл. 6-8.

- 29 010163

Таблица 6

Способ введения	ΐ.ν.
Доза	2 мг/кг
Время (ч)	Выч. конц-я (нг/мл)	Число объединенных животных
0.083	1461	3
0.25	328	2
0.5	300	3
1	80	3
2	68	3
3	49	3

Таблица7

Способ введения	ΐ.ρ.
Доза	10 мг/кг
Время (ч)	Выч. конц-я (нг/мл)	Число объединенных животных
0.25	673	3
0.5	1568	2
1	2009	2
2	3160	2
4	1024	3
8	519	3

Таблица 8

После внутривенного введения примера 51 в дозе 2 мг/кг массы тела определяли кинетические характеристики для внутривенного введения примера 51. После исследования фармакокинетики (РК) для примера 51 определили экстраполированное значение С1_п£_!1_а1 28594 нг/мл и наблюдали значение С_тах 1461 нг/мл в момент времени 5 мин. Уровни в плазме быстро снизились до 328 и 80 нг/мл в моменты времени 15 мин и 1 ч соответственно. С 1 до 3 ч уровни плазмы снизились с временем полуэлиминации 2,8 ч до 49 нг/мл в 3 ч. Значения АИС(_0-!) и АИС(_0-да) составляли 1704 и 1905 нг-ч/мл соответственно.

После внутрибрюшинного введения примера 51 в дозе 10 мг/кг массы тела уровни примера 51 в плазме возрастали почти линейно в течение первых 2 ч, и значение С_тах составляло 3160 нг/мл в момент времени 2 ч. С 2 до 8 ч уровни в плазме снизились с временем полуэлиминации 2,5 ч до 519 нг/мл в 8 ч. Значения АИС(_0-!) и АИС(_0-да) составляли 11112 и 12948 нг-ч/мл соответственно. По сравнению с нормализованной величиной АИС после ΐ.ν. введения (100% абсорбция, 953 нг-ч/мл) количество примера 51, абсорбированного после ί.ρ. введения, составляло 136% (1295 нг-ч/мл) при в 45 раз более низкой нормализованной С_тах после ί.ρ. введения (316 против 1497 нг/мл). Величина выше 100% может частично отра жать не очень хорошую надежность, вызванную ограниченным количеством точек.

Claims (2)

1. Соединения общей формулы где

Матрица

Матрица представляет собой группу, характеризуемую одной из формул а1 а2

А-СО означает ^ϋΡτο, ^ϋΟ1η, 4-{2-[2-(метоксиэтокси)этокси]ацетиламино}-^ϋΡτο или 61у;

В-СО означает ^ьРто, ^ьС1и, 4-{2-[2-(метоксиэтокси)этокси]ацетиламино}-¹'Рго или 61у; но А-СО и В-СО не могут оба быть 61у;

Ζ означает цепь из η α-аминокислотных остатков, причем η означает целое число 12, 14 или 18, а положения указанных аминокислотных остатков в цепи считают, начиная с Ν-концевой аминокислоты, причем эти аминокислотные остатки представляют собой, в зависимости от их положения в цепи, следующие:

если и означает 12, α-аминокислотные остатки в положениях с 1 по 12 цепи Ζ представляют собой Р1: Туг;

Р2: Аг₈, 61у;

РЗ: С11;

Р4: Уа1, РЬе, О1у, Не, ТЬг, О1п, Сук;

Р5: Агв;

Р6: Агд, °Аг§;

Р7: Агд;

Р8: Тгр, 2-ΝβΙ;

Р9: Уа1, РЬе, С1у, Не, ТЬг, 61п, Суз;

РЮ: Туг;

Р11: Сй, О1у; и

Р12: Ьуз; или

Суб в положении Р4 и Р9 образует дисульфидный мостик;

-31 010163 если и означает 14, α-аминокислотные остатки в положениях с 1 по 14 представляют собой

Р1: Туг, С1п, Агд, ΗΪ5, Ме, Тгр, ТЬг, 61и, Зег, Уа1, Ме{, РЬе, С1у, Азр,

Ьеи, Ρίρ;

Р2: Агд, ΗΪ3, Ьуз, 4-РугА 1а;

РЗ: СП; Агд, Юз, Не, Туг, Тгр, Рго, С1и, Азп, Азр, Ьуз, А1а, Ьеи, Уа1, 4ЕРЬе, Мег, Зег, ТЬг, О1п, Туг;

Р4: Уа1, РЬе, Туг, г-ВиС, Суя, Зег, РаЬ, С1и;

Р5: Агд, ОаЬ, Зег, (ЕА)О;

Р6: Рго, С1у, РЬе, Уа1, СИ, А1а;

Р7: °Рго, Рго, СИу, Уа1;

Р8: Агд, Туг, Тгр, ТЬг, 4Р-РЬе, ОаЬ, 4-РугА1а, 1зогп, (1т)С, СИ, Н1з,

1редОаЬ, °Рго;

Р9: Агд, (Ρίρ)Ο, (ЕА)6, От, Рго;

РЮ: 2-Ν31, Тгр, Туг;

Р] 1: РЬе, Туг, Уа1, Г-ВиС, Суз, Азл, О1и, ОаЬ, Агд;

Р12: Туг, СИ;

Р13; СИ, С1п, Агд, Юз, Туг, Азп, Азр, Ьуз, А1а, Зег, Ьеи, МеГ, КМе(31у,

ТЬг, Суз; и

Р14: Ьуз, <31и, (31п, Азп, Азр, А1а, Зег, ΝΜεΚ;

при условии, что аминокислотный остаток в положении Р1 представляет собой Ρίρ или СИу: и/или аминокислотный остаток в положении РЗ представляет собой С1и. Аки, Акр, Т1п или С1п: и/или аминокислотный остаток в положении Р4 представляет собой Сук, 8ег или С1и; и/или аминокислотный остаток в положении Р5 представляет собой 8ег или (ЕА)С; и/или аминокислотный остаток в положении Р6 представляет собой РЬе, Уа1 или А1а; и/или аминокислотный остаток в положении Р7 представляет собой Уа1, Рго или 'Рго: и/или аминокислотный остаток в положении Р8 представляет собой Туг, Тгр, 4Е-Р11е, 4-РугА1а, (1ш)С, Ηίκ или 'Его: и/или аминокислотный остаток в положении Р9 представляет собой (ЕА)С; и/или аминокислотный остаток в положении Р11 представляет собой Уа1 или 1-ВиС; и/или аминокислотный остаток в положении Р12 представляет собой Туг или СИ: и/или аминокислотный остаток в положении Р13 представляет собой С1и. С1п. Акр, Аки, 8ег, Т1п. Сук или ΝΜοΟΙν: и/или

Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик; и/или

С1и в положении Р4 и ОаЬ в положении Р11 образуют лактамовый мостик; и/или

ОаЬ в положении Р4 и С1и в положении Р11 образуют лактамовый мостик;

если и означает 18, α-аминокислотные остатки в положениях с 1 по 18 представляют собой

-32010163

Р1: Агд; Р2: Агд; РЗ: 2-Иа1, Тгр, Туг; Р4: Су в; Р5; Туг; Р6: Сй, О1п, Агд; Р7: Буз; Р8: Суз, С1у; Р9; Туг; РЮ: Буз, °Буз, °Рго; РИ; <31 у, Рго, ^рРго; Р12: Туг; Р13: Суз, С1у; Р14: Туг; Р15: Аг^; РЮ: СИ, ТИг, Буе; Р17: Суз; и Р18: Агд; или

Сук в положении Р4 и Р17 и/или в положении Р8 и Р13 образует дисульфидный мостик; и их фармацевтически приемлемые соли.

2. Соединение формулы I по π. 1, где матрица представляет собой 'Рго-'Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: СИ; Р4: РЬе; Р5: Агд; Рб: Уа1; Р7: ^ЕРго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: 2-ΝηΙ; Р11: Уа1; Р12: Туг; Р13: СИ; и Р14: Бук. 3. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой °Рго-Рго, η означает 14, а амино-

кислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

-33 010163

ΡΙ: Туг; Ρ2: Аге; РЗ: Сй; Ρ4: РНе; Ρ5: Аге; Ρ6: Уа1; Ρ7: Рго; Ρ8: Агд; Ρ9: Аг§; Ρ10: 2-Νβ1; Ρ11: Уа|; Ρ12: Туг; Ρ13: Сй; и Ρ14: Ьуз. 4. Соединение формулы I по π. 1, где матрица представляет собой 'Рго-'Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой Р1: Туг; Р2: Аге; РЗ: Сй; Р4: РЬе; Р5: Агд; Р6: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: 2-1Ча1; РН: Рйе; Р12: Туг; Р13: С«1; и Р14: Ьуз. 5. Соединение формулы I по и. 1, где матрица представляет собой 'Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: С11; Р4: Уа1; Р5: Агд; Р6: О1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: 2-Ν81; РН: Уа1; Р12: Туг; Р13: Сй; и Р14: Ьуз.

-34010163

6. Соединение формулы I по и. 1, где матрица представляет собой ^сРго-^ьРго, и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой ΡΪ: Туг; Р2: Агд; РЗ: Сй; Р4: Суз; Р5: Аг§; Р6: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Аге; РЮ: 2-№1; Р11: Суз; Р12: Туг; Р13: Сй; и Р14: Ьуз; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 7. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой Р1: Туг; Р2: Аг§; РЗ: Сй; Р4: Суз; Р5: Аг§; Р6: С1у; Р7: С1у; Р8: Аг§; Р9: Аг§; РЮ: 2-ΝαΙ; Р11: Суз; Р12: Туг; Р13: Сй; и Р14; Ьуз; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 8. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

-35 010163

Р1: Туг;

Р2: Агд;

РЗ: СИ;

Р4: Суя;

Р5: Агд;

Р6: Уа1;

Р7: О1у;

Р8: Агд;

Р9: Агд;

РЮ: 2-1Ча1;

РН: Суз;

Р12: Туг;

Р13: СИ; и

Р14: Буз;

Суз в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

9. Соединение формулы I по π. 1, где матрица представляет собой 'Рго-'Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

РН Туг;

Р2: Агд;

РЗ: СИ;

Р4: Суз;

Р5: Агд;

Р6: О1у;

Р7: °Рго;

Р8: Тгр;

Р9: Агд;

РЮ: 2-№1;

РН: Суз;

Р12: Туг;

Р13: С1п; и

Р14: Буз;

Суз в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

10. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

-36010163

Р1: Туг;

Р2: Агд;

РЗ: Сй;

Р4: Суз;

Р5: Агд;

Р6: О1у;

Р7: °Рго;

Р8: ТКг;

Р9: Агд;

РЮ: 2-Νη1;

Р11: Суз;

Р12: Туг;

Р13: О1п; и

Р14: Ьуз;

Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

11. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

Р1: Туг;

Р2: Агд;

РЗ: Сй;

Р4: Суз;

Р5: Агд;

Р6: О!у;

Р7: °Рго;

Р8: Агд;

Р9: Агд;

РЮ: 2-Ν31;

Ρ11: Суз;

Р12: Туг;

Р13: 61л; и

Р14: С1п;

Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

12. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

-37010163

Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: СИ; Р4: Сук; Р5: Агд; Р6: О1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд;

Р10: 2-ΝβΙ;

Р11: Сук; Р12: Туг; Р13: С1п; и Р14: С1и;

Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

13. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-'Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

ΡΪ: 61и; Р2: Агд; РЗ: Сй; Р4: Сук; Р5: Агд; Р6: О1у; Р7; °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: 2-Ν31; РН: Сук; Р12: Туг; Р13: С1п; и Р14: Бук;

Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

14. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: С1и; Р4: Сук; Р5: Агд; Р6: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд;

-38010163

РЮ: 2-№1; ΡΙ1: Сук; Р12: Туг; Р13: С1п; и Р14: Ьуз; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 15. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой 'Тго-'Рго. и означает нокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой Р1: Туг; 14, а ами- Р2: Аг§; РЗ: Сй; Р4: Сук; Р5: Агд; Р6: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ; 2-Ν3Ι; РН: Сук; Р12: Туг; Р13: 61п; и Р14: Акп; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 16. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой 'Рго-'Рго. и означает нокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой Р1: Туг; 14, а ами- Р2: Агд; РЗ: Сй; Р4: Р5: Сук; Аг§; Р6: О1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: 2-Ν31; РН: Сук; Р12: Туг; Р13; 6!п; и Р14: Акр; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 17. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой 'Рго-'Рго. и означает 14, а ами-

нокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

-39010163

Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: СИ; Р4: Суз; Р5: Агд; Р6: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд;

Р!0; 2-Ка!;

Р11: Сук; ΡΙ2: Туг; Р13: С1п; и Р14: Зег;

Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

18. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: СИ; Р4: Сук; Р5: 8ег; Р6: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: 2-ΝηΙ; РИ: Суз; ΡΪ2: Туг; Р13: С1п; и Р14: Буз;

Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

19. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

РБ Туг; Р2: Агд; РЗ: Бег; Р4: Сук; Р5: Агд; Р6: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: Тгр; РИ: Сук;

-40010163

Р12; Туг; Р13: Сй; и Р14: Акр; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 20. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой Рго- Рго, и означает 14, а ами- нокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой Р1: Туг; Р2: Ηΐκ; РЗ: Сй; Р4: Сук; Р5: Агд; Рб: С1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: Тгр; Р11: Сук; Р12: Туг; Р13; Сй; и Р14: Ьук; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 21. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой Рго- Рго, и означает 14, а ами- нокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: ТЬг; Р4: Сук; Р5: Агд; Рб: 61у; Р7: °Рго; Р8: ОаЬ; Р9: Агд; РЮ: Тгр; Р11: Сук; Р12: Туг; Р13: С1п; и Р14: Бук; Сук в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик. 22. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой Рго- Рго, и означает 14, а ами-

нокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

-41 010163

Р1: Туг;

Ρ2: Ηΐδ;

РЗ: ТЬг;

Ρ4: Суз;

Ρ5: Агд;

Ρ6: О1у;

Ρ7: °Рго;

Ρ8: Агд;

Ρ9: Н1з;

РЮ: Тгр;

РН: Суз;

Р12: Туг;

Р13: С1п; и

Р14: Ьуз;

Суз в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

23. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-'Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

Р1: Туг;

Р2: Агд;

РЗ: Сй;

Р4: Суз;

Р5: Агд;

Р6: С1у;

Р7: °Рго;

Р8: Агд;

Р9: Агд;

РЮ: 2-Ν31;

РН: Суз;

Р12: Туг;

Р13: Тйг; и

Р14: Ьуз;

Суз в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

24. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой 'Рго-'Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

-42010163

РБ Туг; Р2: Агд; РЗ: Не; Р4: Суз; Р5: Агд; Р6: О1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд; РЮ: Туг; Р11: Суз; Р12: Туг; Р13: С1п; и Р14: Буз;

Суз в положении Р4 и Р11 образует дисульфидный мостик.

25. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

РБ Туг; Р2: Агд; РЗ; СИ; Р4: Зег; Р5: Агд; Р6: С1у; Р7; °Рго; Р8; Агд; Р9: Агд; РЮ: Тгр; РН: Азп; Р12: Туг; Р13: СИ; и

Р14: Бун;

ОаЬ в положении Р4 и С1и в положении Р11 образуют лактамовый мостик.

26. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой ''Рго-' Рго. и означает 14, а аминокислотные остатки в положениях 1-14 представляют собой

Р1: Туг; Р2: Агд; РЗ: Сй; Р4: ЭаЬ; Р5: Агд; Р6: О1у; Р7: °Рго; Р8: Агд; Р9: Агд;

-43 010163

РЮ: Тгр;

Ρ11: С1и;

Р12: Туг;

Р13: Сй; и

Р14: Ьуз;

С1и в положении Ρ11 и ОаЬ в положении Р4 образуют лактамовый мостик.

27. Соединение формулы I по п.1, где матрица представляет собой СИу-' Рго. и означает 18, а аминокислотные остатки в положениях 1-18 представляют собой

Ρ1: Агд;

Р2: Агд;

РЗ: Тгр;

Р4: Суз;

Р5: Туг;

Р6: Агд;

Р7: Ьуз;

Р8 Суз;

Р9: Туг;

РЮ: Ьуз;

РН: С1у;

Р12: Туг;

Р13: Суз;

Р14: Туг;

Р15: Агд;

Р16: Ьуз;

Р17: Суз; и

Р18: Агд

Сук в положении Р4 и Р17 и в положении Р8 и Р13 образует дисульфидные мостики.

28. Соединения по любому из пи. 1-27 для применения в качестве терапевтически активных субстанций.

29. Соединения по п.28, обладающие активностью антагонистов СХСЯ4. и/или противораковой активностью, и/или противовоспалительной активностью.

30. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пи. 1-27 и фармацевтически инертный носитель.

31. Композиции по п.30 в форме, пригодной для орального, местного, трансдермального, инъекционного, защечного, пульмонарного, ингаляционного введения или введения через слизистые.

32. Композиции по п.30 или 31 в форме таблеток, драже, капсул, растворов, жидкостей, гелей, пластырей, кремов, мазей, сиропа, взвесей, суспензий, спрея, распылителя или суппозиториев.

33. Применение соединений по любому из пи. 1-27 для получения лекарства с активностью антагониста СХСК4.

34. Применение по п.ЗЗ, причем указанное лекарство с активностью антагониста СХСЯ4 предназначено для применения для предотвращения ВИЧ-инфекций у здоровых людей или для замедления или остановки развития вируса у инфицированных пациентов; или в случае, если рак опосредован или вызван активностью рецептора СХСЯ4; или в случае, если иммунологические заболевания опосредованы или вызваны активностью рецептора СХСЯ4; или для лечения иммуносупрессии; или при аферезном сборе стволовых клеток периферической крови.

35. Способ получения соединений по любому из пи. 1-27, включающий следующие этапы:

(а¹) связывание соответствующим образом функционализированной твердой подложки с соединением общей формулы

-44010163 где фрагмент соответствует приведенному выше определению, а X представляет собой Ν-защитную группу, или, аль тернативно, (а'а) связывание указанной соответствующим образом функционализированной подложки с соответствующим образом Ν-замещенным производным аминокислоты общей формулы

НООС-В-Н III или

НООС-А-Н IV где В и А соответствуют определениям выше, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(а'Ъ) удаление Ν-защитной группы с полученного таким образом продукта; и (а'с) связывание полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты вышеуказанной общей формулы IV и, соответственно, III, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(Ъ') удаление Ν-защитной группы с продукта, полученного на этапе (а') или (а'с);

(с') связывание полученного таким способом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится в положении 12, если η означает 12, или положении 14, если η означает 14, или положении 18, если η означает 18, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(ά') удаление Ν-защитной группы с полученного таким образом продукта;

(е') связывание полученного таким способом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится на одно положение дальше от положения 12, если η означает 12, или положения 14, если η означает 14, или положения 18, если η означает 18, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Νзащищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(ί¹) удаление Ν-защитной группы с полученного таким образом продукта;

(д') повторение этапов (е') и (ί’) до введения всех аминокислотных остатков;

(И') по желанию, селективное снятие защиты с одной или нескольких защищенных функциональных групп молекулы и соответствующее замещение освобожденной таким образом реакционноспособной группы (групп);

(1') по желанию, формирование одной, двух или трех межцепочечных связей между боковыми цепями соответствующих аминокислотных остатков в противоположных положениях области β-цепи;

0') отсоединение полученного таким способом продукта от твердой подложки;

(к') циклизация продукта, отщепленного от твердой подложки;

(1') удаление любых защитных групп на функциональных группах любых членов цепи аминокислотных остатков, и, по желанию, любых защитных групп, которые могут дополнительно присутствовать в молекуле; и (т') по желанию, превращение полученного таким способом продукта в фармацевтически приемлемую соль или превращение фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли, полученной таким способом, в соответствующее свободное соединение формулы I или в другую, фармацевтически приемлемую, соль.