KR102091456B1

KR102091456B1 - CXC4 길항제로서의 β-헤어핀 펩타이드 모방체

Info

Publication number: KR102091456B1
Application number: KR1020147000330A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 오브레흐트; 프랭크 오토 검벌트; 요한 짐머만
Original assignee: 폴리포 리미티드
Priority date: 2011-06-07
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2020-03-23
Also published as: WO2012168336A1; NZ618110A; MX2013014229A; AU2012266355B2; JP2014516999A; AU2012266355A1; US20150266924A1; US9556231B2; CN103703018B; IL229535A0; CA2838037A1; BR112013031575A2; BR112013031575B1; ES2552944T3; SG195055A1; JP5957521B2; US20140213509A1; IL229535B; CA2838037C; KR20140041689A

Abstract

Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합이 있으며, Xaa³, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa¹³ 및 Xaa¹⁴이 상세한 설명 및 청구항에 정의된 정해진 타입의 아미노산 잔기인, 일반식 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)의 β-헤어핀 펩타이드 모방체, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 유익한 약리학적 특성을 가지고 있으며, 건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하거나, 감염된 환자에서 바이러스성 진행을 서행 또는 정지시키는데; 또는 암이 CXCR4 수용체 활성에 의해 매개 또는 기인하는 경우에; 면역 질환이 CXCR4 수용체 활성에 의해 매개 또는 기인하는 경우에; 면역 억제를 치료하기 위해; 또는 말초혈 줄기 세포의 성분채집 콜렉션을 수행하는 동안에; 및/또는 조직 회복을 조절하기 위해 줄기 세포의 동원을 유도하기 위한 제제로서 사용할 수 있다. 이러한 펩타이드 모방체는 혼성 고상 및 액상 합성 전략에 기반한 방법으로 제조할 수 있다.

Description

CXC4 길항제로서의 β-헤어핀 펩타이드 모방체{BETA - HAIRPIN PEPTIDOMIMETICS AS CXC4 ANTAGONISTS}

본 발명은 CXCR4 길항 활성을 가지며, WO2004/096840 A1에 일반적으로 포괄되지만 구체적으로 언급되지 않은 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 제공하다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는, Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로서, Xaa³는 후술하는 바와 같이 Ala, Tyr 또는 Tyr(Me)이며, Xaa⁷은 후술하는 바와 같이 ^DTyr, ^DTyr(Me) 또는 ^DPro이며, Xaa⁸은 후술하는 바와 같이 Dab 또는 Orn(iPr)이며, Xaa¹³은 Gln 또는 Glu이고, Xaa¹⁴은 후술하는 바와 같이 Lys(iPr)이다.

아울러, 본 발명은, 적절한 경우, 병렬식 라이브러리 포멧으로 화합물을 제조할 수 있는 효율적인 합성 공정을 제공한다. 이들 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 유익한 약리학적 특성을 가지며, 아울러 적절한 혈장 단백질 결합성과 적절한 소거율을 보인다. 따라서, 이들 화합물은 모든 타입의 약물 제형에, 특히 장기 방출형 약물 제형에 활성 성분으로서 소량 사용될 수 있다.

의학적으로 의미있는 다수의 생물학적 과정들은 일반적으로 케모카인과 이의 수용체, 특히 기질 유래 인자 1 (SDF-1/ CXCL12)과 이의 수용체 CXCR4가 참여하는 신호 전달에 의해 매개된다.

CXCR4 및 이의 리간드 SDF-1은 B 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC) 및 조혈 전구 세포 (HPC)의 이동에 관여한다. 예를 들면, CXCR4는 CD34+ 세포 상에 발현되며, CD34+ 세포의 이동과 회귀 과정에 연루되어 있다 (S.M. Watt, S.P. Forde, Vox sanguinis 2008, 94, 18-32). 또한, CXCR4 수용체는 줄기 세포와 전구 세포가 골수에서 말초혈로 방출되는데 중요한 역할을 수행하는 것으로 입증되었다 (L.M. Pelus, S. Fukuda, Leukemia 2008, 22, 466-473). 이러한 CXCR4 활성은 말초혈 줄기 세포를 효율적으로 성분채집 (apheresis)하는데 매우 중요할 수 있다. 자가 말초혈 세포는, 악성 혈액 종양을 앓고 있는 환자와 고형 종양을 앓고 있는 환자에게 고-용량 화학치료나 방사선 치료를 실시한 다음, 자가-이식되었을 때, 조혈의 신속하고 지속적인 회복을 제공해준다 (W.C. Liles et al., Blood 2003, 102, 2728-2730).

최근, SDF-1이 국소 허혈성 뇌졸증, 전뇌 허혈증, 심근 경색 및 하지 허혈증 등의 동물 손상 모델에서 국소적으로 상향 조절될 뿐만 아니라, 간, 신장 및 폐가 손상되거나 말초 허혈증이 발병하였을 때, 회복에 관여하는 것으로 확인되었다 (A.E. Ting, R.W. Mays, M.R. Frey, W. Van't Hof, S. Medicetty, R. Deans, Critical Reviews in Oncology/Hematology 2008, 65, 81-93 및 참조 문헌; F. Lin, K. Cordes, L. Li, L. Hood, W.G. Couser, S.J. Shankland et al., J. Am. Soc. Nephrol. 2003, 14, 1188-1199; C.C. Dos Santos, Intensive Care Med. 2008, 34, 619-630). 이들 결과는, SDF-1이 조직 및 장기의 회복/재생에 있어 CXCR4-양성 줄기 세포의 주화성 물질일 수 있음을 시사해준다 (M.Z. Ratajczak, M. Kucia, R. Reca, M. Majka, A. Janowska-Wieczorek, J. Ratajczak, Leukemia 2004, 18, 29-40). 즉, CXCR4 저해제에 의한 SDF-1/CXCR4 축 조절은, 방출된 줄기 세포가 조직 회복을 조절하는데 사용되게 함으로써, 유의한 치료학적 효과를 달성할 수 있을 것이다.

최근 들어, CXCR4 저해제에 의한 CXCR4/SDF-1 축 교란이 골수로부터 HPC, 내피 세포 (EPC) 및 기질 전구 세포 (SPC)와 같은 전구 세포의 차별적인 동원 (differential mobilization)에 주된 역할을 하는 것으로 입증되었다 (S.C. Pitchford, R.C. Furze, C.P. Jones, A.M. Wegner, S.M. Rankin, Cell Stem Cell 2009, 4, 62). 아울러, 골수 유래 CXCR4⁺ 초소형 배아 유사 줄기 세포 (VSEL: Very Small Embryonic-Like Stem Cell)가 급성 심근 경색 환자에서 수집되어, 회복 기전 가설이 시사되었다 (W. Wojakowski, M. Tendra, M. Kucia, E. Zuba-Surma, E. Paczkowska, J. Ciosek, M. Halasa, M. Krol, M. Kazmierski, P. Buszman, A. Ochala, J. Ratajczak, B. Machalinski, M.Z. Ratajczak, J. Am. Coll. Cardiol. 2009, 53, 1). 이런 결과들은 조직 재생에 유효한 줄기 세포를 제공하는데 활용될 수 있다.

간엽 줄기 세포 (MSC)는 뼈와 연골 등의 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 비-조혈계 전구 세포이다 (D.J. Prockop, Science 1997, 276, 71). MSC 중 소규모 집단은 활성형 CXCR4를 기능적으로 발현하므로, CXCR4/SDF-1 축을 조절함으로써 이들 세포의 특이적인 이동과 회귀를 매개할 수 있다 (R.F. Wynn, C.A. Hart, C. Corradi-Perini, L. O'Neill, C.A. Evans, J.E. Wraith, L.J. Fairbaim, I. Bellantuono, Blood 2004, 104, 2643).

일반적으로, 케모카인, 특히 SDF-1/CXCR4 상호작용이 혈관신생에 중추적인 역할을 수행한다는 것을 시사해주는 증거들이 많아지고 있다. 케모카인은, 내피 세포 상의 이의 동족 수용체에 결합함으로써 직접적으로, 또는 다른 혈관신생 자극을 전달하는 염증성 세포의 침윤을 조장함으로써 간접적으로, 혈관신생을 유도한다. 인터루킨 8 (IL-8), 성장-조절 온코진, 기질 세포 유래 인자 (SDF-1), 단핵구 주화성 단백질 1 (MCP-1), 에오탁신 1 및 I-309를 비롯한 다수의 전-염증성 케모카인들이 혈관신생의 직접적인 유도인자로서 기능하는 것으로 입증되었다 (X. Chen, J.A. Beutler, T.G. McCloud, A. Loehfelm, L. Yang, H.F. Dong, O.Y. Chertov, R. Salcedo, J.J. Oppenheim, O.M. Howard. Clin. Cancer Res. 2003, 9(8), 3115-3123; R. Salcedo, J.J. Oppenheim, Microcirculation 2003, (3-4), 359-370).

최근 수득한 결과들에 따르면, CXCR4 수용체는 유방암 전이나 난소암 (A. Muller, B. Homey, H. Soto, N. Ge, D. Catron, M.E. Buchanan, T. Mc Clanahan, E. Murphey, W. Yuan, S.N. Wagner, J.L. Barrera, A. Mohar, E. Verastegui, A. Zlotnik, Nature 2001, 50, 410; J.M. Hall, K.S. Korach, Molecular Endocrinology 2003, 17, 792-803), 비-호지킨 림프종 (F. Bertolini, C. Dell'Agnola, P. Manusco, C. Rabascio, A. Burlini, S. Monestiroli, A. Gobbi, G. Pruneri, G. Martinelli, Cancer Research 2002, 62, 3106-3112), 또는 폐암 (T. Kijima, G. Maulik, P.C. Ma, E.V. Tibaldi, R.E. Turner, B. Rollins, M. Sattler, B.E. Johnson, R. Salgia, Cancer Research 2002, 62, 6304-6311), 흑색종, 전립선암, 신장암, 신경모세포종, 췌장암, 다발성 골수증, 만성 림프구성 백혈병, 간세포성 암종, 결장직장암, 자궁내막암 및 배아세포종의 전이와 같은 암 세포의 주화 활성 (chemotactic activity)에 관여한다 (H. Tamamura et al., FEBS Letters 2003, 550, 79-83, cited ref.; Z. Wang, Q. Ma, Q. Liu, H.Yu, L. Zhao, S. Shen, J. Yao, British Journal of Cancer 2008, 99, 1695; B. Sung, S. Jhurani, K.S. Ahn, Y. Mastuo, T. Yi, S. Guha, M. Liu, B. Aggarwal, Cancer Res. 2008, 68, 8938; H. Liu, Z. Pan, A. Li, S. Fu, Y. Lei, H. Sun, M. Wu, W. Zhou, Cellular and Molecular Immunology, 2008, 5, 373; C. Rubie, O. Kollmar, V.O. Frick, M. Wagner, B. Brittner, S. Graber, M.K. Schilling, Scandinavian Journal of Immunology 2008, 68, 635; S. Gelmini, M. Mangoni, F. Castiglioe, C. Beltrami, A. Pieralli, K.L. Andersson, M. Fambrini, G.l. Taddie, M. Serio, C. Orlando, Clin. Exp. Metastasis 2009, 26, 261; D.C. Gilbert, I. Chandler, A. McIntyre, N.C. Goddard, R. Gabe, R.A. Huddart, J. Shipley, J. Pathol. 2009, 217, 94). CXCR4 저해제를 이용하여 주화 활성을 차단하면 암 세포의 이동이 정지되어 전이가 중단될 것이다.

또한, CXCR4는 고형 종양과 백혈병/림프종의 생장과 증식에 연루되어 있다. CXCR4 수용체의 활성화가 악성 신경종과 신경교종 모두의 생장에 중요한 것으로 입증되었다. 더욱이, CXCR4 길항제인 AMD3100을 전신 투여하면, 종양 세포의 세포자살이 증가하고 종양 세포의 증식이 줄어듬으로써, 두개내 교아종과 수아종 이식편의 생장이 저해된다 (J.B. Rubin, A.L Kung, R.S Klein, J.A. Chan, Y. Sun, K. Schmidt, M.W. Kieran, A.D. Luster, R.A. Segal, Proc Natl Acad Sci U S A. 2003, 100(23),13513-13518; S. Barbero, R. Bonavia, A. Bajetto, C. Porcile, P. Pirani, J.L. Ravetti, G.L. Zona, R. Spaziante, T. Florio, G. Schettini, Cancer Res. 2003, 63(8), 1969-1974; T. Kijima, G. Maulik, P.C. Ma, E.V. Tibaldi, R.E. Turner, B. Rollins, M. Sattler, B.E. Johnson, R. Salgia. Cancer Res. 2002, 62(21), 6304-6311). CXCR4 저해제는, 또한, 유방암, 소세포성 폐암, 췌장암, 위암, 결장직장암, 악성 흑색종, 난소암, 횡문근 육종, 전립선암 뿐만 아니라 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 경화증 및 비-호지킨 림프종에 대해 기대되는 시험관내 효능과 생체내 효과를 나타내었다 (J.A. Burger, A. Peled, Leukemia 2009, 23, 43-52 및 인용된 참조문헌들).

케모카인은 다수의 염증성 병태에 관여하며, 이들 중 일부가 파골세포 분화를 조절하는데 결정적인 역할을 한다는 것은 충분히 확립된 사실이다. 류마티스 관절염 (RA)과 골 관절염 (OA) 샘플로부터 유래된 활액과 골 조직의 생검에 대해 SDF-1 (CXCL12)을 면역염색한 바, 염증성 병태에서 케모카인의 발현 수준이 강하게 증가하는 것으로 확인되었다 (F. Grassi, S. Cristino, S. Toneguzzi, A. Piacentini, A. Facchini, G. Lisignoli, J. Cell Physiol. 2004; 199(2), 244-251). CXCR4 수용체는 류마티스 관절염, 천식, 다발성 경화증, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 죽상동맥경화증 또는 당뇨병성 망막증 및 노화성 황반 변성 등의 눈 질환과 같은 염증성 질환에서 주된 역할을 하는 것으로 생각된다 (K.R. Shadidi et al., Scandinavian Journal of Immunology 2003, 57, 192-198; J.A. Gonzalo, J. Immunol. 2000, 165, 499-508; S. Hatse et al., FEBS Letters 2002, 527, 255-262 및 인용된 참조문헌들, A.T. Weeraratna, A. Kalehua, I. DeLeon, D. Bertak, G. Maher, M.S. Wade, A. Lustig, K.G. Becker, W. Wood, D.G. Walker, T.G. Beach, D.D. Taub, Exp. Cell Res. 2007, 313, 450; M. Shimoji, F. Pagan, E.B. Healton, I. Mocchetti, Neurotox. Res. 2009, 16, 318; A. Zernecke, E. Shagdarsuren, C. Weber, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 1897; R. Lima e Silva, J. Shen, S.F. Hackett, S. Kachi, H. Akiyama et al., FASEB 2007, 21, 3219). 면역 세포를 염증 부위로 동원하는 매개 작용은 CXCR4 저해제에 의해 중단될 것이다.

지금까지, 사용가능한 HIV 감염의 치료법은 감염된 사람에게서 현저한 증상 개선을 가능하게 하고 질병으로부터 회복시켜 주었다. 비록 역전사효소/단백질분해효소 저해제의 조합을 포함하는 HAART (highly active anti retroviral therapy) 치료법이 AIDS 환자나 HIV 감염 환자에서 임상적인 치료를 현저하게 향상시켰지만, 다중 약물 내성, 심각한 부작용 및 고 비용을 비롯하여, 해결되지 않은 심각한 문제들이 여전히 남아있다. 바이러스의 진입 (entry)과 같은, 감염의 초기 단계에 HIV 감염을 차단시키는 항-HIV 제제를 개발하는 것이 특히 바람직하다. 최근에, 인간 면역결핍 바이러스는 표적 세포에 효과적으로 진입하기 위해 케모카인 수용체 CCR5 및 CXCR4, 뿐만 아니라 일차 수용체 CD4를 필요로 하는 것으로 밝혀졌다 (N. Levy, Engl. J. Med. 1996, 335 , 1528-1530). 따라서, CXCR4 케모카인 수용체를 차단할 수 있는 제제는, 건강한 개체로부터 감염을 방지하고, 감염된 환자에서 바이러스 증식을 늦추거나 정지시킬 것이다 (J. Cohen, Science 1997, 275, 1261-1264).

여러가지 타입의 CXCR4 저해제 (M. Schwarz, T.N.C. Wells, A.E.I. Proudfoot, Receptors and Channels 2001, 7, 417-428; Y. Lavrovsky, Y.A. Ivanenkov, K.V. Balakin, D.A. Medvedewa, P.V. Ivachtchenko, Mini Rev. Med. Chem. 2008, 11, 1075-1087)들 중에서, 부각되고 있는 한가지 유형은 역평행의 β-시트 구조, 및 두 개의 이황화 결합으로 유지되는 β-헤어핀을 가진, 폴리페뮤신 II 유래의 천연 양이온성 펩타이드 유사체를 기본으로 한다 (H. Nakashima, M. Masuda, T. Murakami, Y. Koyanagi, A. Matsumoto, N. Fujii, N. Yamamoto, Antimicrobial Agents and Chemoth. 1992, 36, 1249-1255; H. Tamamura, M. Kuroda, M. Masuda, A. Otaka, S. Funakoshi, H. Nakashima, N. Yamamoto, M. Waki, A. Matsumotu, J.M. Lancelin, D. Kohda, S. Tate, F. Inagaki, N. Fujii, Biochim. Biophys. Acta 1993, 209, 1163; WO 95/10534 A1).

구조 유사체의 합성과 핵자기공명 (NMR) 분광학을 이용한 구조 연구를 통해, 양이온성 펩타이드가 하나 또는 두 개의 이황화 결합의 구속 작용으로, 명확하게 규정되는 β-헤어핀 구조를 취하고 있다는 것이 밝혀졌다 (H. Tamamura, M. Sugioka, Y. Odagaki, A. Omagari, Y. Kahn, S. Oishi, H. Nakashima, N. Yamamoto, S.C. Peiper, N. Hamanaka, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 359-362). 이러한 결과는 β-헤어핀 구조가 CXCR4의 길항 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

추가적인 구조 연구를 통해, 또한 양친매성 구조와 약물작용단 (pharmacophore)을 조절함으로써, 길항 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 제시되었다 (H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, K. Gotoh, T. Kanamoto, Y. Xu, E. Kodama, M. Matsuoka, T. Hattori, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1897-1902; H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, S. Oishi, H. Habashita, T. Kanamoto, K. Gotoh, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 1417-1426; H. Tamamura, K. Hiramatsu, K. Miyamoto, A. Omagari, S. Oishi, H. Nakashima, N. Yamamoto, Y. Kuroda, T. Nakagawa, A. Otaki, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Letters 2002, 12, 923-928).

본 발명의, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합이 있는 화합물, 즉, 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)은, 고리형의 β-헤어핀 펩타이드 모방체로서, 높은 CXCR4 길항 활성, 수집한 말초혈 줄기 세포의 효과적인 성분채집 콜렉션 (apheresis collection)에서의 유용성 및/또는 이들 수집한 세포의 조직 회복에 있어서의 유용성, 및/또는 항암 활성, 항염증 활성 및/또는 항-HIV 활성을 가진다.

고리형 β-헤어핀 구조는 D-아미노산 잔기 Xaa⁷와 D-아미노산 잔기 ^DPro¹⁵에 의해 유도된다. 헤어핀 구조의 추가적인 안정화는, 이황화 결합을 형성하는 4번 및 11번 위치의 Cys 아미노산 잔기들에 의해 달성된다.

놀랍게도, 본 발명자들은, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)에서, 8번 위치에 Orn(iPr)의 선택적인 도입에 의해 뒷받침되는, 14번 위치에 염기성 아미노산 잔기인 Lys(iPr)을 도입하면, 약리학적 특성에 유익한 β-헤어핀 펩타이드 모방체가 형성된다는 것을 발견하였다. 이러한 특성은, 적합한 혈장 단백질 결합성 및 적합한 소거율과 조합하여, 모든 종류의 약물 제형, 특히 서방형 약물 제형에 활성 성분으로서 소량 사용을 가능하게 하는, 약리학적 프로파일을 구현한다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는, 일반식 (I)의 화합물: 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴- ^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로서,

상기 식에서,

Xaa³는 Ala, Tyr 또는 Tyr(Me)이고, Tyr(Me)는 (2S)-2-아미노-(4-메톡시페닐)-3-프로피온산이며,

Xaa⁷은 ^DTyr, ^DTyr(Me), 즉 (2R)-2-아미노-(4-메톡시페닐)-3-프로피온산, 또는 ^DPro이며,

Xaa⁸은 Dab, 즉, (2S)-2,4-다이아미노부티르산, 또는 Orn(iPr), 즉, (2S)-Nω-이소프로필-2,5-다이아미노펜탄산이며,

Xaa¹³은 Gln 또는 Glu이며,

Xaa¹⁴은 Lys(iPr), 즉, (2S)-N^ω-이소프로필-2,6-다이아미노헥산이다.

본 발명의 특정 구현예에서, β-헤어핀 펩타이드 모방체는 Xaa¹³이 Gln인 일반식 I의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명의 다른 특정 구현예에서, β-헤어핀 펩타이드 모방체는 Xaa³가 Tyr 또는 Tyr(Me)이고; Xaa⁷이 ^DPro이고; Xaa⁸이 Orn(iPr)이고; Xaa¹³이 Gln인, 일반식 I의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 화합물은, Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Ala³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DTyr⁷-Dab⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³-Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 화합물은, Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Tyr³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DPro⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³- Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 화합물은, Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Tyr(Me)³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DPro⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³- Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 화합물은, Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Ala³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DTyr(Me)⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³- Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 화합물은, Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Tyr³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DTyr⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³-Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 화합물은, Cys⁴와 Cys¹¹사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Tyr(Me)³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DTyr(Me)⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²- Gln¹³-Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명에 있어서, 이들 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 아래 단계를 포함하는 공정으로 제조할 수 있다:

(a) 적절하게 관능화된 고상 지지체에, 소정의 원하는 최종 산물의 16번 위치에 존재하는 Pro에 대한 적절하게 N-보호된 유도체를 커플링하는 단계;

(b) 수득한 산물로부터 N-보호기를 제거하는 단계;

(c) 수득한 산물에, 소정의 원하는 최종 산물의 15번 위치에 존재하는 ^DPro에 대한 적절하게 N-보호된 유도체를 커플링하는 단계;

(d) 단계 (c)에서 수득한 산물로부터 N-보호기를 제거하는 단계;

(e) 소정의 원하는 최종 산물의 14번 위치에서 1번 위치에 존재하는 아미노산들에 대한 적절하게 N-보호된 유도체들을 이용하여, 실질적으로 단계 (c)와 단계 (d)에 상응하는 단계들을 수행하는 단계로서, 상기 N-보호된 아미노산 유도체에 존재할 수 있는 임의의 관능기(들)는 마찬가지로 적절하게 보호되는 단계;

(f) 필요에 따라, 4번 위치와 11번 위치에 존재하는 Cys 잔기들의 측쇄 간에 이황화 결합을 형성하거나; 또는 다른 예로, 아래에 기술된 바와 같이, 단계 (i) 이후에 이러한 결합을 형성하는 단계;

(g) 수득한 산물을 고상 지지체로부터 분리하는 단계;

(h) 고상 지지체로부터 분리한 산물을 고리화하는 단계;

(i) 아미노산 잔기 체인의 임의 잔기의 관능기에 존재하는 임의의 보호기를 제거하는 단계; 및

(j) 필요에 따라, 하나 또는 수개의 이소프로필기를 부착하는 단계;

(k) 필요에 따라, 아미노산 체인의 임의 잔기의 관능기 상에 존재하는 임의의 보호기를 제거하는 단계; 및

(l) 필요에 따라, 수득한 산물을 약제학적으로 허용가능한 염으로 변환하거나, 또는 수득한 약제학적으로 허용가능한 또는 허용불가한 염을 대응되는 유리 화합물 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 염으로 변환하는 단계.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는, 예를 들어, 수지 상에서 선형 펩타이드로 합성되지만, 이소프로필기를 보유한 아미노산 잔기(들) Orn(iPr) 또는 Lys(iPr)은 상업적으로 구입가능한 또는 미리 합성한 아미노산 빌딩 블럭(들)으로서 조립하는 것을 포함하는 공정으로 제조하거나; 또는 직교 보호기 전략 (orthogonal protecting group strategy)을 적용함으로써 수지 상에서 선형 펩타이드를 합성하되, 예를 들어, 변형이 고려되지 않은 아미노산 잔기에서 아미노기를 보유한 측쇄는 모두 ivDde 등으로 보호하고, Fmoc-기반의 고상 펩타이드 합성 전략에 적합한 산 취약성 보호기로 보호된 아미노산 잔기의 아미노기를 가진 측쇄들을, 합성 케스케이트의 최후 단계에서 용액 중에서 이소프로필기와 커플링하여 유도체화하는 것을 포함하는 공정으로 제조하거나; 또는 앞서 기술한 공정들의 적절한 조합을 포함하는 공정으로 제조할 수 있다.

관능화된 고상 지지체 (즉, 고상 지지체 + 링커 분자)와 고리화 부위에 대한 적절한 선택이 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 합성하는 공정에 중요하다.

관능화된 고상 지지체는 일반적으로는 바람직하게는 1-% 다이비닐벤젠이 가교된 폴리스티렌으로부터 유래되며; 폴리에틸렌글리콜 스페이서로 코팅된 폴리스티렌 (Tentagel^®); 및 폴리아크릴아미드 수지이다 (D. Obrecht, J.-M. Villalgordo, "Solid- Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries", Tetrahedron Organic Chemistry Series, Vol. 17, Pergamon, Elsevier Science, 1998).

고상 지지체는 링커를 이용함으로써 관능화되며, 즉, 한쪽 말단에 고상 지지체에 부착하기 위한 고정기를 가지고 다른 말단에는 후속적인 화학적 변형 및 절단 공정에서 사용되는 선택적으로 절단가능한 관능기를 가진, 2관능성 스페이서 분자에 의해, 관능화된다. 본 발명에서는, 2가지 타입의 링커들이 사용된다.

제1 타입의 링커는 산성 조건에서 아미드기를 해리하도록 설계된다 (H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3783-3790). 이런 타입의 링커는 아미노산의 카르복실기에 아미드를 형성하는데; 이런 링커 구조체로 관능화된 수지의 예로는, 4-[(((2,4-다이메톡시-페닐)Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도)아미노메틸] PS 수지, 4-[(((2,4-다이메톡시페닐)Fmoc-아미노메틸)페녹시-아세트아미도) 아미노메틸]-4-메틸-벤즈하이드릴아민 PS 수지 (Rink amide MBHA PS Resin), 및 4-[(((2,4-다이메톡시-페닐)Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도)아미노메틸]벤즈하이드릴아민 PS-수지 (Rink amide BHA PS resin)를 포함한다. 바람직하게는, 지지체는, 가장 바람직하게는 1-5% 다이비닐벤젠과 가교된 폴리스티렌으로부터 유래되며, 4-(((2,4-다이메톡시페닐) Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도) 링커로 관능화된다.

제2 타입의 링커는 산성 조건에서 카르복실기가 궁극적으로 해리되도록 설계된다. 이런 타입의 링커는 아미노산의 카르복시기와 산-취약성 에스테르, 일반적으로 산-취약성 벤질, 벤즈하이드릴 및 트리틸 에스테르를 형성하게 되며; 이러한 링커 구조체의 예로는, 2-메톡시-4-하이드록시메틸페녹시 (Sasrin^R linker), 4-(2,4-다이메톡시페닐-하이드록시메틸)-페녹시 (Rink linker), 4-(4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시)부티르산 (HMPB linker), 트리틸 및 2-클로로트리틸을 포함한다. 바람직하게는, 지지체는, 가장 바람직하게는, 1-5% 다이비닐벤젠과 가교된 폴리스티렌으로부터 유래되며, 2-클로로트리틸 링커로 관능화된다.

본 발명의 공정은, 병렬식 어레이 합성법으로서 수행하는 경우에, 본원에서 후술된 바와 같이 유익하게 구현될 수 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 이러한 공정이 본 발명의 하나의 단일 화합물을 합성하고자 하는 경우 어떤 방식으로 변형하여야 하는지를 즉각적으로 알 것이다.

병렬식 방법으로 합성할 화합물의 총 수와 동일한 갯수의 반응 바셀에, 적절하게 관능화된 고상 지지체, 바람직하게는 1 - 3% 가교된 폴리스티렌 또는 Tentagel 수지를 25 내지 1000 mg으로, 바람직하게는 60 mg으로 주입한다.

사용되는 용매는 수지를 팽윤시킬 수 있어야 하며, 비제한적인 예로서, 다이클로로메탄 (DCM), 다이메틸포름아미드 (DMF), N-메틸피롤리돈 (NMP), 다이옥산, 톨루엔, 테트라하이드로퓨란 (THF), 에탄올 (EtOH), 트리플루오로에탄올 (TFE), 이소프로필알코올 등을 포함한다. 극성 용매를 적어도 하나 이상의 성분으로서 포함하는 용매 혼합물 (예, 20% TFE/DCM, 35% THF/NMP)이 수지-결합된 펩타이드 체인의 높은 반응성과 용매화를 확보하는데 유리하다 (G.B. Fields, C.G. Fields, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4202-4207).

측쇄에서 관능기를 보호하는 산-취약성 기에는 영향을 미치지 않으면서, 약 산성 조건에서 C-말단 카르복시산기가 노출되게 하는 다양한 링커들이 개발됨에 따라, 보호된 펩타이드 단편 합성에 상당한 진전이 이루어졌다. 2-메톡시-4-하이드록시벤질알코올 유래 링커 (Sasrin^® linker, Mergler et al., Tetrahedron Lett. 1988, 29 4005-4008)는 희석한 트리플루오로아세트산 (DCM 중의 0.5-1% TFA)으로 절단가능하고, 펩타이드 합성 중에 구현되는 Fmoc 탈보호 조건에 안정적이며, Boc/tBu-계의 부가적인 보호기들이 이들 보호 계획에 사용가능하다. 그 외에도, 본 발명의 공정에 적합한 링커로는, 펩타이드의 절단시, DCM 중의 10% 아세트산 또는 DCM 중의 0.2% 트리플루오로아세트산이 요구되는, 슈퍼 산-취약성 4-(2,4-다이메톡시페닐-하이드록시메틸)-페녹시 링커 (Rink linker, H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3787-3790); 모든 산-취약성 측쇄 보호기를 가진 펩타이드 단편을 수득하기 위해 1% TFA/DCM으로 절단하는, 4-(4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시)부티르산-유래 링커 (HMPB-linker, Florsheimer & Riniker, Peptides 1991, 1990 131); 및, 추가적으로, 빙초산/트리플루오로에탄올/DCM (1:2:7) 혼합물을 이용하여 30분간 펩타이드를 분리시킬 수 있는 2-클로로트리틸클로라이드 링커 (Barlos et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946)를 포함한다.

아미노산과 이들의 잔기 각각에 대한 적절합 보호기는, 예를 들어, 다읍과 같다:

- 아미노기의 경우 (예를 들어 라이신 또는 오르니틴의 측쇄에 존재하는 바와 같이)

Cbz 벤질옥시카르보닐

Boc tert-부틱옥시카르보닐

Fmoc 9-플루오레닐메톡시카르보닐

Alloc 알릴옥시카르보닐

Teoc 트리메틸실릴에톡시카르보닐

Tcc 트리클로로에톡시카르보닐

Nps o-니트로페닐설포닐;

Trt 트리페닐메틸 또는 트리틸

ivDde (4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸

- 알코올 성분을 이용한 에스테르로의 변환에 의한 카르복시기의 경우 (예를 들어, 글루탐산의 측쇄에 존재하는 바와 같이)

tBu tert-부틸

Bn 벤질

Me 메틸

Ph 페닐

Pac 펜아실

알릴

Tse 트리메틸실릴에틸

Tce 트리클로로에틸;

- 구아니디노기의 경우 (예를 들어 아르기닌의 측쇄에 존재하는 바와 같이)

Pmc 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐

Ts 토실 (즉, p-톨루엔설포닐)

Cbz 벤질옥시카르보닐

Pbf 펜타메틸다이하이드로벤조퓨란-5-설포닐

- 하이드록시기의 경우 (예를 들어 세린의 측쇄에 존재하는 바와 같이)

tBu tert-부틸

Bn 벤질

Trt 트리틸

Alloc 알릴옥시카르보닐

- 머캅토기의 경우 (예를 들어 시스테인의 측쇄에 존재하는 바와 같이)

Acm 아세트아미도메틸

tBu tert-부틸

Bn 벤질

Trt 트리틸

Mtr 4-메톡시트리틸.

9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)-보호된 아미노산 유도체가, 바람직하게는, 본 발명의 β-헤어핀 루프 모방체를 구축하기 위한 빌딩 블럭으로서 사용된다. 탈보호를 위해, 즉, Fmoc 기를 제거하기 위해, DMF 중의 20% 피페리딘 또는 DMF 중의 2% DBU/2% 피페리딘이 사용될 수 있다.

이소프로필기를 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)로 보호된 아미노산 유도체의 아미노기를 가진 측쇄에 연결하여, Fmoc로 보호된 아미노산 유도체의 이소프로필화되고 아미노기를 가진 측쇄를 형성하는 것은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이소프로필기의 도입 공정은, 예를 들어, Orn과 같은 아미노 빌딩 블럭의 아미노기를 가진 측쇄의 아미노기를, 예를 들어, 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드와 같은 적정 환원제의 존재 하에, 아세톤으로 처리하는, 환원성 알킬화에 의해, 달성될 수 있다. 예를 들어, Boc와 같이, Fmoc로 보호된 아미노산 유도체의 이소프로필화된 아미노기-보유 측쇄에 적합한 보호기는, 소듐 바이카보네이트 등의 염기의 존재 하에, 다이-tert-부틸 다이카보네이트와의 후속적인 반응에 의해 도입될 수 있다.

반응물질, 즉 아미노산 유도체의 양은, 통상적으로, 반응 시험관에서 처음 칭량한 관능화된 고상 지지체의 투입 (load) 양 gram (meq/g) 당 밀리당량 (milliequivalent)으로, 1 내지 20 당량 (전형적으로 폴리스티렌 수지의 경우 0.1 - 2.85 meq/g)이다. 추가적인 당량의 반응물질을 필요에 따라 사용하여, 합리적인 시간 내에 반응을 종결시킬 수 있다. 바람직한 워크스테이션 (그러나, 이로 제한되지 않음)은 Labsource의 콤비-켐 스테이션, Protein Technologies의 Symphony 및 MultiSyn Tech의 Syro synthesizer가 있으며, 후자에는, 완전히 보호된 선형 펩타이드를 고상 지지체로부터 탈착하는 공정시, 운송 유닛과 저장소 박스가 추가적으로 장착된다. 모든 합성 장치들은 통제된 환경을 제공할 수 있으며, 예를 들어, 반응은 실온이 아닌 온도에서, 그리고 필요에 따라 불활성 분위기 하에 달성될 수 있다.

아미드 결합을 형성함에 있어 아실화 공정을 위한 알파-카르복시기의 활성화가 요구된다. 이런 활성화가 다이사이클로헥실카르보다이이미드 (DCC, Sheehan & Hess, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 1067-1068) 또는 다이이소프로필카르보다이이미드 (DIC, Sarantakis et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976, 73, 336-342) 등의 통상적으로 사용되는 카르보다이이미드를 이용함으로써 수행되는 경우, 수득되는 다이사이클로헥실우레아와 다이이소프로필우레아 각각은 일반적으로 사용되는 용매에 각각 불용성 및 용해성이다. 카르보다이이미드 방법의 변형 방법에서는, 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt, Konig & Geiger, Chem. Ber. 1970, 103, 788-798)이 첨가제로서 커플링 혼합물에 투입된다. HOBt는, 탈수를 방지하고, 활성화된 아미노산의 라세믹화를 억제하며, 부진한 커플링 반응을 개선시키기 위한, 촉매로서 기능한다. 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(다이메틸-아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castro et al., Tetrahedron Lett. 1975, 14, 1219-1222; Synthesis 1976, 751-752), 또는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (Py-BOP, Coste et al., Tetrahedron Lett. 1990, 31, 205-208), 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일-)1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라-플루오로보레이트 (TBTU), 또는 헥사플루오로포스페이트 (HBTU, Knorr et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930) 등의 일부 포스포늄 시약들이 직접 커플링 시약으로 사용되고 있으며; 이들 포스포늄 시약은 보호된 아미노산 유도체와 HoBt 에스테르를 인 시츄로 형성하는데에도 적합하다. 최근 들어, 다이페녹시포스포릴 아지드 (DPPA) 또는 O-(7-아자-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라-메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TATU) 또는 O-(7-아자-벤조트리아졸-1-일)- N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU)/7-아자-1-하이드록시 벤조-트리아졸 (HOAt, Carpino et al., Tetrahedron Lett. 1994 , 35, 2279-2281) 또는 -(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일-)-N,N,N',N'-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 테트라플루오로-보레이트 (TCTU), 또는 헥사플루오로포스페이트 (HCTU, Marder, Shivo and Albericio: HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications, Poster Presentation, Gordon Conference February 2002) 뿐만 아니라 1,1,3,3-비스(테트라메틸렌)클로로우로늄 헥사플루오로-포스페이트 (PyClU, 특히 N-메틸화된 아미노산을 커플링하기 위함, J. Coste, E. Frerot, P. Jouin, B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 1967) 또는 펜타플루오로페닐 다이페닐-포스피네이트 (S. Chen, J. Xu, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6711)도 커플링 시약으로서 사용되고 있다.

거의 정량적인 (near-quantitative) 커플링 반응이 필연적이라는 점에서, 반응 종결에 대해 실험적인 증거를 가지는 것이 바람직하다. 수지-결합된 펩타이드 분액에 대한 양성적인 색도계 반응으로 1차 아민의 존재를 정량적으로 표시하는, 닌하이드린 검사 (Kaiser et al., Anal. Biochemistry 1970, 34, 595)가, 각각의 커플링 단계 다음에 쉽고 신속하게 수행될 수 있다. Fmoc 화학 반응은 염기와 함께 해리되는 Fmoc 발색단을 분광광도로 검출할 수 있다 (Meienhofer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1979, 13, 35-42).

각 반응 바셀 안에 존재하는 수지에 결합된 중간산물로부터, 아래 2가지 방법들 중 한가지 방법으로, 순수 용매(들)에 반복적으로 노출시켜, 과잉의 잔류 시약, 용매 및 부산물을 세척 제거한다:

1) 반응 바셀에 용매를 (바람직하게는 5 mL) 넣고, 5 - 300분, 바람직하게는 15분간 교반한 다음, 용매를 배출 제거한다;

2) 반응 바셀에 용매를 (바람직하게는 5 mL) 넣고, 시험관 또는 바이얼 등의 수납 바셀로 배액시킨다.

상기한 2가지 세척 공정은 약 50회 이하 (바람직하게는 약 10회)로 반복하며, TLC, GC 또는 세척물 검사 등의 방법으로 시약, 용매 및 부산물의 제거율을 모니터링한다.

반응관 안에서 수지-결합된 화합물을 시약과 반응시킨 후, 과량의 시약, 부산물 및 용매를 제거하는 전술한 공정들은, 최종적인 수지-결합된 완전히 보호된 선형 펩타이드가 수득될 때까지, 각각의 연속적인 변환과 더불어 반복된다.

이러한 완전히 보호된 선형 펩타이드를 고상 지지체에서 탈착시키기 전에, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합을 형성시킬 수 있다.

이황화 결합을 형성하기 위해, 바람직하게는, 10 당량의 요오드 용액을, DMF 또는 CH₂Cl₂/MeOH 혼합물 중에서 1.5시간 동안 적용하고, 요오드 용액을 여과한 신선한 요오드 용액으로 다시 3시간 반복하거나, 또는 5% NaHCO₃로 pH 5-6으로 완충화한 DMSO 및 아세트산 용액의 혼합물 중에서 4시간 적용하거나, 또는 암모늄 하이드록사이드 용액으로 pH 8로 적정한 수중에서 교반하면서 24시간 적용하거나, 또는 NMP 및 트리-n-부틸포스핀 (바람직하게는 50 eq.) 용액 중에서 적용한다.

다른 예로, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이의 이황화 결합 형성은, 본원에 후술된 바와 같이, 워크-업 방법 2) 이후에, 완전히 탈보호되고 고리화된 펩타이드 조산물을, 5% NaHCO₃로 pH 5-6으로 또는 암모늄 아세테이트로 pH 7-8로 완충화되거나 또는 암모늄 하이드록사이드로 pH 8로 적정된, DMSO가 최대 15 부피%로 포함된 수중에서 교반함으로써, 수행할 수 있다. 이를 증발시켜 건조하여, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합이 있는 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸- Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)를 최종 산물로서 수득한다.

로딩한 수지를 절단에 사용되는 시약의 용액 (바람직하게는 3 내지 5 mL)에 노출시켜, 고상 지지체로부터 완전히 보호된 선형 펩타이드를 탈착시킨다. 온도 조절, 교반 및 반응 모니터링은 전술한 바와 같이 수행한다. 반응 바셀을, 절단된 산물 용액을 효율적으로 수집하기 위해, 수송 유닛을 통해, 저장소 튜브가 들어있는 저장소 박스와 연결시킨다. 반응 바셀에 남아있는 수지를, 그 후, 적정 용매 3 - 5 mL로 상기와 같이 2 - 5번 세척하여, 가능한 탈착된 산물들을 많이 추출 (세척 제거)한다. 이렇게 수득한 산물 용액들을 크로스-믹싱을 방지하도록 주의하면서 합친다. 그 후, 개개 용액/추출물들을 필요에 따라 조작하여, 최종 화합물을 분리한다. 전형적인 조작으로는, 비제한적인 예로서, 증발, 농축, 액체/액체 추출, 산성화, 염기성화, 중화 또는 용액 중의 부가적인 반응을 포함한다.

고상 지지체로부터 분리하여 염기로 중화시킨, 완전히 보호된 선형 펩타이드 유도체를 함유한 용액을 증발시킨다. 그 후, DCM, DMF, 다이옥산, THF 등의 용매를 이용하여 용매 중에서 고리화를 달성한다. 앞서 언급한 다양한 커플링 시약이 고리화에 사용될 수 있다. 고리화 시간은 약 6-48 h, 바람직하게는 약 16 h이다. 반응의 진행은, 예를 들어, RP-HPLC (역상 고성능 액체 크로마토그래피)로 추적한다. 그런 후, 증발시켜 용매를 제거하고, 완전히 보호된 사이클릭 펩타이드 유도체를 DCM 등의 물에 혼화되지 않는 용매에 용해시키고, 이 용액을 물 또는 수-혼화성 용매 혼합물로 추출하여, 임의의 과량의 커플링 시약을 제거한다.

마지막으로, 완전히 보호된 펩타이드 유도체를 95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% TIS 또는 보호기를 절단할 수 있는 다른 스카벤저들의 조합으로 처리한다. 상기 절단 반응 시간은 통상적으로 30분 내지 12 시간, 바람직하게는 약 2.5 시간이다.

다른 예로, 고상 지지체에서 완전히 보호된 펩타이드를 탈착하고 완전히 탈보호하는 과정은 유리 바셀에서 수동으로 수행할 수 있다.

완전한 탈보호화 후, 예를 들어, 다음과 같은 방법들을 추가적인 워크-업에 사용할 수 있다:

1) 휘발성 물질을 증발시켜 건조하고, 펩타이드 조상물을 수중 20% AcOH에 용해하여, 이소프로필 에테르 또는 적합한 다른 용매로 추출한다. 수층을 수집하여 증발시켜 건조함으로써, 완전히 탈보호되고, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합이 있는 펩타이드, 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)를 최종 산물로 수득한다;

2) 탈보호 혼합물을 진공 농축한다. 완전히 탈보호된 펩타이드를, 바람직하게는, 0℃에서, 다이에틸에테르에서 석출시킨 후, 고형물을 약 10회 이하, 바람직하게는 3회 세척하고, 건조하여, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이의 이황화 결합이 전술한 바와 같이 고상 지지체 상에 형성되었다면, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합이 있는, 완전히 탈보호화된 펩타이드, 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹- Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)를 최종 산물로 수득한다.

용액 중에 하나 이상의 이소프로필기를 도입하기 위한 전술한 직교 보호기 전략을 수행한다면, 아미노산 잔기 측쇄의 모든 아미노기들은 여전히 산 비-취약성 보호기로 보호되어있지만, 반면 산-취약성 보호기로 사전에 보호된 아미노산 잔기의 아미노기들은 이러한 합성 케스케이드 단계에서 자유롭게된다. 즉, 필요에 따라서는, 이소프로필기의 커플링도 가능하다. 바람직하게는, ivDde 등은, 이소프로필기가 자유롭게 된 아미노기와 커플링되는 동안에, 비-변형된 상태로 유지되는 아미노기를 보유한 측쇄에 대한, 산 안정적인 보호기이다. 이러한 커플링은, 예를 들어, 소듐 시아노 보르하이드라이드와 같은 적정 환원제의 존재 하에 아세톤을 이용하여, 예를 들어, 환원적 알킬화를 적용함으로써, 달성할 수 있다. 즉, 예를 들어, 펩타이드를 아세트산 (0.2 M)이 포함된 MeOH (4.4 mM)에 용해한다. 아세톤을 과량 (780 eq) 첨가한 후, MeOH 중의 소듐 시아노 보르하이드라이드 용액 (0.6 M; 1.3 eq/도입하길 원하는 이소프로필기)을 첨가하여 실온에서 활발하게 교반하여, 반응 혼합물을 완성시킨다. LC-MS 모니터링에 따라 변환이 완료되면, 물을 첨가하고, 용매를 증발시킨다. 펩타이드가 함유된 잔류 고형물을 DMF (0.01 M)에 용해하고, DMF 중의 5% 하이드라진 용액을 사용하여, 마지막으로 ivDde-보호기를 제거한다.

전술한 바와 같이, 그러므로, 필요에 따라, 그에 따라 수득한 완전히 탈보호된 사이클릭 산물을 약제학적으로 허용가능한 염으로 전환시키거나, 또는 이렇게 수득한 약제학적으로 허용가능한 또는 허용불가한 염을 상응하는 유리 화합물 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 염으로 전환하는 것도 가능하다. 임의의 이러한 작업은 당업계의 주지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는, 건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하기 위해, 감염된 환자에서 바이러스성 진행을 서행 또는 중지시키기 위해, 또는 암이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개 또는 기인하거나, 또는 면역 질환이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개 또는 기인하는 경우에, 다양한 용도로 사용할 수 있거나; 또는 이들 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 사용하여 면역억제를 치료하거나, 또는 이를 말초혈 줄기 세포의 혈액성분 채집시에 활용하거나, 및/또는 줄기 세포의 동원을 유도하여 조직을 회복시키기 위한 제제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 그대로 투여하거나, 또는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 적정 제형으로 사용할 수 있다.

HIV 감염 또는 암, 예컨대, 유방암, 뇌암, 전립선암, 간세포암, 결장직장암, 폐암, 신장암, 신경모세포종, 난소암, 자궁내막암, 배아세포종, 안암, 다발골수종, 췌장암, 위암, 횡문근 육종, 흑색종, 만성림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종 및 비-호지킨 림프종; 전이, 혈관신생 및 조혈 조직; 또는 염증성 장애, 예를 들어, 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐질환, 과민성 폐렴, 호산구성 폐렴, 지연형 과민반응, 간질성폐질환 (interstitial lung diseas (ILD)), 특발성 폐섬유증, ILD와 연관된 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 강직척추염, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 아나필락시스 또는 과민성 반응, 약물 알레르기, 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 다발성 경화증, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 죽상경화증, 중증근육무력증, 소아기 발생 당뇨병, 사구체신염, 자가면역성 갑상선염, 동종이식거부 또는 이식 편대 숙주 질환 등의 이식 거부, 염증성 장 빌환 및 염증성 피부질환을 치료 또는 예방하거나; 또는 녹내장, 당뇨병성 망막증 및 노인성 황반 변성과 같은 안 질환을 치료하거나; 국소 허혈성 뇌졸증, 전뇌 허혈증, 심근 경색, 하지 허혈증 또는 말초 허혈증을 치료하기 위해; 또는 간, 신장 및 폐 손상을 치료하기 위해; 화학요법, 방사선 치료 또는 이식 (graft/transplantation) 거부에 의해 유발되는 면역억제 등의 면역억제를 치료하기 위해, 사용되는 경우, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 단독으로, 수종의 β-헤어핀 펩타이드 모방체들의 혼합물로, 다른 항-HIV 제제, 항균제, 항암제 또는 항염증제들과 조합하여, 또는 그외 약제학적으로 활성인 제제와 조합하여, 투여할 수 있다. 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 그 자체로 또는 약학 조성물로서 투여할 수 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 포함하는 약학 조성물은, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 코팅 정제 제조, 동질혼합물화 (levigating), 유화, 캡슐화, 인트랩핑 (entrapping) 또는 동결건조화 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 약학 조성물은, 활성 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 약학적으로 사용할 수 제제로 만드는 것을 용이하게 하는, 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적 방법으로 제형화할 수 있다. 적절한 제형은 선택한 투여 방법에 따라 달라진다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 국소 투여하는 경우, 당업계의 주지된 방법을 사용하여, 용액, 젤, 연고, 크림, 좌제, 산제 등으로 제형화할 수 있다.

전신 투여용 제형은, 주사, 예를 들면, 피하, 정맥내, 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하도록 설계된 제형, 뿐만 아니라 경피, 경점막, 경구 또는 폐 투여용 제형을 포함한다.

주사제의 경우, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 적절한 용액, 바람직하게는 생리적으로 사용가능한 완충제, 예컨대 Hink 용액, Ringer 용액, 또는 생리적 식염완충제 중에 제형화할 수 있다. 용액은 제형화 제제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 적정 비히클 (vehicle), 예를 들면, 사용 전에 발열원이 없는 물과 조합하기 위한 분말 형태일 수 있다.

경점막 투여의 경우, 통과할 장벽에 적절한 침투제가 당업계의 공지된 바와 같이 제형에 사용된다.

경구 투여의 경우, 화합물은, 본 발명의 활성 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 당업계의 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 용이하게 제형화할 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 젤제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제, 산제 등과 같이 치료할 환자의 경구 섭취용으로 제형화 가능하게 한다. 경구 제형, 예컨대, 산제, 캡슐제 및 정제의 경우, 적절한 부형제로는 충진재, 예컨대 슈가, 예컨대 락토스, 슈크로스, 만니톨 및 소르비톨; 셀룰로스성 제제, 예컨대 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP); 과립화제 ; 및 결합제를 포함한다. 필요에 따라, 붕해제, 예컨대, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 소듐 알기네이트를 첨가할 수 있다. 필요에 따라, 고형의 투약 형태는 표준 기술을 사용하여 당-코팅되거나 또는 장용-코팅될 수 있다.

경구용 액제, 예컨대, 예를 들면, 현탁제, 엘릭서제 및 용액제의 경우, 적합한 담체, 부형제 또는 희석제는 물, 글리콜, 오일, 알코올 등을 포함한다. 부가적으로, 풍미제, 방부제, 색소 등이 첨가될 수 있다.

볼 투여의 경우, 조성물은 통상적으로 제형화된 정제, 로젠제 등의 형태를 취할 수 있다.

화합물은 또한 적절한 좌약용 베이스, 예컨대, 코코아 버터 또는 기타 글리세린과 함께, 직장 또는 질 조성물, 예컨대, 좌제로서 제형화할 수 있다.

앞서 기술한 제형 외에도, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는, 또한, 데포 제제 (depot preparation)로도 제형화할 수 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 이식 (예, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 이러한 데포 제제에 있어, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 적절한 폴리머성 또는 소수성 물질 (예, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로서), 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화하거나, 또는 난용성 염으로서 제형화할 수 있다.

아울러, 기타 약제학적 전달 시스템, 예를 들어 당업계에 주지된 리포솜제 및 에멀젼제로서 사용할 수 있다. 다이메틸설폭사이드와 같은 특정 유기용매도 사용할 수 있다. 부가하여, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 서방성 시스템 (sustained-release system), 예컨대 (예를 들어, 코팅된 스텐트의 경우) 치료학적 물질을 함유한 반투과성 고형 폴리머 메트릭스를 사용하여 전달할 수 있다. 다양한 서방성 물질들이 확립되어 있으며, 이것은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 서방성 캡슐제는, 그것의 화학적 성질에 따라, 수주 내지 100일이 넘는 기간 동안 화합물을 방출할 수 있다. 치료학적 물질의 화학적 성질과 생물학적 안정성에 따라, 추가적인 단백질 안정화 전략을 적용할 수도 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 하전된 잔기를 포함하므로, 이는 전술한 임의의 제형에 그대로 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로서 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 상응하는 유리 형태의 화합물보다 수계 용매 및 그외 양성자성 용매 (protic solvent)에 대해 용해성이 더 높은 경향을 보인다. 특히 적합한 약제학적으로 허용가능한 염으로는, 카르복시산, 포스폰산, 설폰산 및 설팜산과의 염, 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 글리콜산, 락트산, 퓨마르산, 숙신산, 아디프산, 피멜산, 서베르산, 아젤라인산 (azelaic acid), 말산, 타르타르산, 시트르산, 아미노산, 예컨대 글루탐산 또는 아스파르트산, 말레산, 하이드록시말레산, 메틸말레산, 사이클로헥산카르복시산, 아다만탄카르복시산, 벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 만델산, 신남산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 에탄-1,2-다이설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 1,5-나프탈렌다이설폰산, 2-, 3- 또는 4-메틸-벤젠설폰산, 메틸설푸르산, 에틸설푸르산, 도데실설푸르산, N-사이클로헥실설팜산, N-메틸-, N-에틸- 또는 N-프로필-설팜산, 및 그외 유기 프로톤산 (protonic acid), 예를 들어, 아스코르브산과의 염을 포함한다. 적합한 무기 산은, 예를 들어, 염산, 황산 및 인산 등의 할로겐화 수소산이다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체 또는 이의 조성물은, 일반적으로, 의도한 목적 달성에 유효한 양으로 사용될 것이다. 사용 양은 특정 용도에 따라 달라질 것으로 이해된다.

HIV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 국소 투여의 경우, 치료학적인 유효량은, 예를 들면, 실시예에 제공된 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 치료는 HIV 감염이 가시적인 경우, 또는 가시적이지 않은 경우에도 적용할 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 거치지 않고도 국소적인 HIV 감염을 치료하기 위한 치료학적 유효량을 결정할 수 있을 것이다.

전신 투여의 경우, 치료학적 유효량은 처음에는 시험관내 분석을 통해 추정할 수 있다. 예를 들면, 세포 배양에서 결정된 IC₅₀을 포함하는 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 순환성 농도 범위가 달성되도록, 동물 모델에서 투여량을 정할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.

처음 투여량은 또한 당업계의 주지된 기술을 사용하여, 생체내 데이타로부터, 예를 들면, 동물 모델에서 결정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 동물 실험 데이타를 토대로 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있을 것이다.

항-HIV 제제로서 적용하기 위한 투여량은 개별적으로 조정하여 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 혈장 농도가 치료 효과를 유지하는데 충분한 농도가 되도록 제공될 수 있다. 치료학적으로 유효한 혈청 농도는 매일 수회 투여에 의해 달성할 수 있다.

국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 유효한 국소 농도는 혈장 농도와는 관련이 없을 수도 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 과도한 실험을 거치지 않고도 치료학적으로 유효한 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.

투여되는 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 양은, 물론, 치료 대상, 대상의 체중, 질환의 중증도, 투여 방식 및 처방의의 판단에 따라 달라질 것이다.

항-HIV 치료는 감염이 검출되는 동안에 또는 검출되지 않는 동안에도 간헐적으로 반복될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 다른 약물, 예를 들면 다른 항-HIV 제제 또는 항암제, 또는 기타 항미생물제와 조합하여 제공될 수 있다.

통상적으로, 본 명세서에 기술된 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 치료학적 유효량은 치료 효과를 제공하지만, 실질적인 독성을 야기하지 않을 것이다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 독성은 배양 세포 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 공정, 예를 들면, LD₅₀ (집단의 50%를 치사시키는 양) 또는 LD₁₀₀(집단의 100%를 치사시키는 양)을 측정하여 결정할 수 있다. 독성과 치료학적 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 실험을 통해 수득되는 데이타는 인간에 사용시 독성이 없는 용량 범위를 결정하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 투여량은 독성이 아주 미미하거나 독성이 없는 유효량을 포함한 순환성 농도 범위내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 채택된 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라, 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 보고 의사 각자가 선택할 수 있다 (예, Fingl et al. 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1).

또한, 본 발명은, Cys⁴와 Cys¹¹ 사이에 이황화 결합이 있는, 일반식: 사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)의 화합물과 동일하되, 단, 하나 이상의 원자가 통상적으로 자연에서 발견되는 원자 질량수 또는 질량과는 상이한 원자 질량수 또는 질량을 가진 원자로 치환된 화합물, 예를 들어, ²H (D), ³H, ¹¹C, ¹⁴C, ¹²⁹I 등이 농화된 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 동위원소 유사체 및 이의 약제학적인 염 및 제형은, 비제한적인 예로서, 생체내 반감기를 미세 조정하여 최적화된 투약 용법을 도출할 수 있는 경우, 치료 및/또는 진단에 있어 유용한 제제로 간주된다.

도 1은 실시예 1 및 실시예 2의 log₁₀ 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다.

아래 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되진 않는다.

실시예

1. 펩타이드 합성

수지에 보호된 제1 아미노산 잔기의 커플링

1 g (1.4 mMol)의 2-클로로트리틸클로라이드 수지 (1.4 mMol/g; 100 - 200 mesh, 코폴리(스티렌-1% DVB) 폴리머 매트릭스; Barlos et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946)를 건조시킨 플라스크에 넣었다. 수지를 CH₂Cl₂ (5 ml)에 현탁하고, 실온에서 30분간 일정하게 교반하면서 팽윤되게 두었다. 960 ㎕ (4 eq)의 다이이소프로필에틸아민 (DIEA)과 혼합한, CH₂Cl₂ (5 ml) 중의 적절하게 보호된 첫 번째 아미노산 잔기 (하기 참조) 0.98 mMol (0.7 eq) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반한 후, 수지의 색은 보라색으로 변하였으며, 용액은 황색빛을 유지되었다. 상기 수지를 여과하고, CH₂Cl₂(1x), DMF (1x) 및 CH₂Cl₂(1x)로 순차적으로 세척하였다. 수지에, CH₂Cl₂/MeOH/DIEA (17/2/1, 10 mL) 용액을 첨가하여, 현탁물을 30분간 교반하였다. 수지를 여과한 후, CH₂Cl₂(1x), DMF (1x), CH₂Cl₂(1x), MeOH (1x), CH₂Cl₂ (1x),MeOH (1x), CH₂Cl₂ (2x), Et₂O (2x)의 순서로 세척하고, 6시간 동안 진공하에서 건조하였다.

투입량은 전형적으로 0.6-0.7 mMol/g이었다.

다음과 같은 프리로딩된 수지가 제조되었다: Fmoc-Pro-2-클로로트리틸 수지.

합성은, 24 - 96개의 반응 용기를 사용하는 Syro-펩타이드 합성기 (Multisyntech)를 사용하여 수행하였다. 각각의 반응 용기에 상기 수지 0.04 mMol을 넣고, 수지를 각각 15분간 CH₂Cl₂ 및 DMF에서 팽윤시켰다. 아래 반응 사이클을 프로그래밍하여, 수행하였다:

단계 시약 시간

1 DMF, 세척 2x1분

2 20% 피페리딘/DMF 1x5분, 1x15분

3 DMF, 세척 5x1분

4 5 eq Fmoc 아미노산/DMF

+5 eq Py-BOP/DMF, 10 eq DIEA/DMF 1x60분

5 DMF, 세척 3x1분

단계 4를 한번 반복하였다.

달리 언급되지 않은 한, 아미노산의 마지막 커플링 다음에, 전술한 반응 사이클의 단계 1-3을 이용하여 Fmoc 탈보호를 수행하였다.

아미노산 빌딩 블럭 합성

Fmoc-Orn(iPr,Boc)-OH의 합성

(2S)-N^α-플루오레닐메톡실카르보닐-N^ω,N^ω-tert-부틸옥시카르보닐-이소프로필-2,5-다이아미노펜탄산의 합성은, Fmoc-Orn-OH*HCl 15.2 g을 150 mL THF (0.26 M)에 현탁한 다음, 아세톤 (132 eq) 375 mL과 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 20.6 g (2.5 eq)을 첨가함으로써, 수행하였다. 반응 혼합물을 2시간 교반한 다음, 반응 종결 후 (LC-MS로 모니터링함) Na₂CO₃ 포화 용액 120 mL 및 10.2 g의 Boc₂O (1.2 eq)를 첨가하였다. 이를 밤새 교반한 후, Na₂CO₃ 포화 용액과 Boc₂O를 잔류 출발 물질에 따라 2번에 나누어 다시 첨가하였다. Boc 투입을 완료한 후, 헥산을 2번 첨가하고, 층 분리하여, 수층을 5 N HCl 수용액으로 (pH = 1) 산성화하고, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 마지막으로, 유기층을 조합하여 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 증발시켜 백색 폼 (white foam)으로서 산물을 수득하였다.

아미노산 빌딩 블럭 Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH는 이와 같이 합성하거나 시판되는 것을 구입한다.

아미노산 빌딩 블럭 Fmoc-Tyr(Me)-OH와 Fmoc-^DTyr(Me)-OH 역시 시판되는 것을 구입한다.

고리화 및 벡본 고리화된 펩타이드의 워크 업

완전히 보호된 펩타이드 단편의 절단

합성을 종료한 후, 수지 (0.04 mMol)를 CH₂Cl₂ 중의 1% TFA(v/v) 용액 1 mL (0.13 mMol, 3.4 eq)에 3분간 현탁하고, 여과하여, 여액을 CH₂Cl₂ (v/v) 중의 20% DIEA 용액 1 mL (0.58 mMol, 14.6 eq)로 중화하였다. 이러한 방법을 3번 반복하여 절단이 완결되도록 하였다. 여액을 증발하여 건조시키고, 95% 트리플루오르아세트산 (TFA), 2.5% 물 및 2.5% 트리이소프로필실란 (TIS)을 포함하는 절단용 혼합물을 이용하여 산물을 완전히 탈보호시켜, 역상-HPLC (컬럼 C₁₈) 및 ESI-MS로 분석하여 선형 펩티드의 합성 효율을 모니터링하였다.

선형 펩타이드의 고리화

완전히 보호된 선형 펩타이드 (0.04 mMol)를 DMF (4 mMol/mL)에 용해하였다. 이어서, 30.4 mg (0.08 mMol, 2 eq)의 HATU, 10.9 mg (0.08 mMol, 2 eq)의 HOAt 및 28 ㎕ (0.16 mMol, 4 eq)의 DIEA를 첨가한 다음, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 볼텍싱한 후, 강략한 진공 하에 농축하였다. 잔류물을 CH₂Cl₂및H₂O/CH₃CN (90/10: v/v)으로 분별하였다. CH₂Cl₂ 층을 증발시켜, 완전히 보호된 고리형 펩타이드를 수득하였다.

고리형 펩타이드의 완전한 탈보호

수득한 고리형 펩타이드를 82.5% 트리플루오르아세트산 (TFA), 5% 물. 5% 티오아니솔, 5% 페놀 및 2.5% 에탄다이티올 (EDT)을 포함하는 3 mL의 절단 혼합물에 용해하였다. 이 혼합물을 25℃에서 2.5시간 동안 정치한 후, 진공 하에 농축하였다. 고리형의 완전히 탈보호된 펩타이드를 다이에틸에테르 (Et₂O) 중에서 0℃에서 석출시킨 후, 고형물을 Et₂O로 2번 세척하고, 건조하였다.

이황화 β-가닥 결합 형성 및 정제

완전히 탈보호한 후, 펩타이드 조산물을 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충액 (1 mg/ 1 mL, pH = 7-8)에 용해하였다. 여기에 DMSO (최대 5 부피%)를 첨가하고, 용액을 밤새 교반하였다. 증발시킨 후, 잔류물을 분취용 역상 HPLC로 정제하였다.

동결건조한 후, 산물을 백색 분말로 수득하여, 이를 다음과 같은 분석 방법으로 분석하였다: 분석용 HPLC 체류 시간 (RT, 분)은 용매 A (H₂O + 0.1% TFA) 및 용매 B (CH₃CN + 0.1% TFA)에 의한 농도 구배: 0-0.05 min: 97% A, 3% B; 3.4 min: 33% A 67% B; 3.41-3.65 min: 3% A, 97% B; 3.66-3.7 min: 97% A, 3% B를 이용하여, Ascentis Express C18 컬럼, 50 x 3.0 mm, (cod. 53811-U- Supelco)에서 측정하였다. 유속 = 1.3 mL/min; UV_Vis = 220 nm.

실시예 1:

출발 수지는 전술한 바와 같이 준비한 Fmoc-Pro-O-2-클로로트리틸 수지이다. 이 수지에, 마지막으로 15번 위치에 ^DPro를 그래프팅하였다. 전술한 방법에 따라, 다음과 같은 서열로, 고상 지지체에서 선형 펩타이드를 합성하였다: 수지-Pro¹⁶-^DPro¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Orn(iPr)⁸-^DPro⁷-Ala⁶-Ser⁵-Cys⁴-Tyr³-His²-Tyr¹. 전술한 마지막 Fmoc 탈보호화를 수행한 후, 펩타이드를 수지에서 탈착하여, 고리화, 탈보호 및 이황화 β-가닥 연결을 상기와 같이 형성시킨 후, 상기에 기술된 바와 같이 정제하였다.

HPLC 체류 시간 (분)을 상기와 같은 분석 방법으로 측정하였다 (UV-순도 [분취용 HPLC로 분석 후]: 95%; RT: 1.56; [M+3H]/3 = 685.7).

실시예 2: 출발 수지는 전술한 바와 같이 준비한 Fmoc-Pro-O-2-클로로트리틸 수지이다. 이 수지에, 마지막으로 15번 위치에 ^DPro를 그래프팅하였다. 전술한 방법에 따라, 다음과 같은 서열로, 고상 지지체에서 선형 펩타이드를 합성하였다: 수지-Pro¹⁶-^DPro¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Orn(iPr)⁸-^DPro⁷-Ala⁶-Ser⁵-Cys⁴-Tyr(Me)³-His²-Tyr¹. 전술한 마지막 Fmoc 탈보호화를 수행한 후, 펩타이드를 수지에서 절단하여, 고리화, 탈보호 및 이황화 β-가닥 연결을 상기와 같이 형성시킨 후, 상기에 기술된 바와 같이 정제하였다.

HPLC 체류 시간 (분)을 상기와 같은 분석 방법으로 측정하였다 (UV-순도 [분취용 HPLC로 분석 후]: 95%; RT: 1.7; [M+3H]/3 = 690.4).

실시예 3: 출발 수지는 전술한 바와 같이 준비한 Fmoc-Pro-O-2-클로로트리틸 수지이다. 이 수지에 ^DPro를 마지막으로 15번 위치에 그래프팅하였다. 전술한 방법에 따라, 다음과 같은 서열로, 고상 지지체에서 선형 펩타이드를 합성하였다: 수지-Pro¹⁶-^DPro¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Dab⁸-^DTyr⁷-Ala⁶-Ser⁵-Cys⁴-Ala³-His²-Tyr¹. 전술한 마지막 Fmoc 탈보호화를 수행한 후, 펩타이드를 수지에서 절단하여, 고리화, 탈보호 및 이황화 β-가닥 연결을 상기와 같이 형성시킨 후, 상기에 기술된 바와 같이 정제하였다.

HPLC 체류 시간 (분)을 상기와 같은 분석 방법으로 측정하였다 (UV-순도 [분취용 HPLC로 분석 후]: 95%; RT: 1.57; [M+3H]/3 = 658.3).

실시예 4: 출발 수지는 전술한 바와 같이 준비한 Fmoc-Pro-O-2-클로로트리틸 수지이다. 이 수지에 ^DPro를 마지막으로 15번 위치에 그래프팅하였다. 전술한 방법에 따라, 다음과 같은 서열로, 고상 지지체에서 선형 펩타이드를 합성하였다: 수지-Pro¹⁶-^DPro¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Orn(iPr)⁸-^DTyr(Me)⁷-Ala⁶-Ser⁵-Cys⁴-Ala³-His²-Tyr¹. 전술한 마지막 Fmoc 탈보호화를 수행한 후, 펩타이드를 수지에서 절단하여, 고리화, 탈보호 및 이황화 β-가닥 연결을 상기와 같이 형성시킨 후, 상기에 기술된 바와 같이 정제하였다.

HPLC 체류 시간 (분)을 상기와 같은 분석 방법으로 측정하였다 (UV-순도 [분취용 HPLC로 분석 후]: 95%; RT: 1.70; [M+3H]/3 = 681.7).

실시예 5: 출발 수지는 전술한 바와 같이 준비한 Fmoc-Pro-O-2-클로로트리틸 수지이다. 이 수지에 ^DPro를 마지막으로 15번 위치에 그래프팅하였다. 전술한 방법에 따라, 다음과 같은 서열로, 고상 지지체에서 선형 펩타이드를 합성하였다: 수지-Pro¹⁶-^DPro¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Orn(iPr)⁸-^DTyr⁷-Ala⁶-Ser⁵-Cys⁴-Tyr³-His²-Tyr¹. 전술한 마지막 Fmoc 탈보호화를 수행한 후, 펩타이드를 수지에서 절단하여, 고리화, 탈보호 및 이황화 β-가닥 연결을 상기와 같이 형성시킨 후, 상기에 기술된 바와 같이 정제하였다.

HPLC 체류 시간 (분)을 상기와 같은 분석 방법으로 측정하였다 (UV-순도 [분취용 HPLC로 분석 후]: 95%; RT: 1.60; [M+3H]/3 = 707.4).

실시예 6: 출발 수지는 전술한 바와 같이 준비한 Fmoc-Pro-O-2-클로로트리틸 수지이다. 이 수지에 ^DPro를 마지막으로 15번 위치에 그래프팅하였다. 전술한 방법에 따라, 다음과 같은 서열로, 고상 지지체에서 선형 펩타이드를 합성하였다: 수지-Pro¹⁶-^DPro¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Orn(iPr)⁸-^DTyr(Me)⁷-Ala⁶-Ser⁵-Cys⁴-Tyr(Me)³-His²-Tyr¹. 전술한 마지막 Fmoc 탈보호화를 수행한 후, 펩타이드를 수지에서 절단하여, 고리화, 탈보호 및 이황화 β-가닥 연결을 상기와 같이 형성시킨 후, 상기에 기술된 바와 같이 정제하였다.

HPLC 체류 시간 (분)을 상기와 같은 분석 방법으로 측정하였다 (UV-순도 [분취용 HPLC로 분석 후]: 95%; RT: 1.83; [M+3H]/3 = 717.0).

2. 생물학적 방법

2.1. 펩타이드의 준비

동결건조한 펩타이드를 Microbalance (Mettler MT5)에서 무게를 측정하여, DMSO에 최종 농도 10 mM로 용해하였다. 원액을 빛이 차단된 상태에서 4℃에서 보관하였다. 생물학적 분석은 다른 언급이 없는 한 DMSO가 1% 미만인 분석 조건에서 수행하였다.

2.2. 세포 배양

Namalwa 세포 (CXCR4를 천연적으로 발현하는 비-부착성 세포, ATCC CRL-1432)는 RPMI1640 + 10% FBS 및 pen/strept에서 배양하였다. HELA 세포는 RPMI1640 + 10% FBS, pen/strept 및 2 mM L-글루타민에서 유지시켰다. Cos-7 세포는 10% FCS, pen/strept 및 2 mM L-글루타민이 첨가된 DMEM 배지 + 4500 mg/mL 글루코스에서 배양하였다. 모든 세포주들은 37 ℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 세포 배지, 배지 첨가물, PBS-완충액, HEPES, 항생제/항진균제, pen/strept, 비-필수 아미노산, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올 및 혈청은 Gibco (Pailsey, UK)에서 구입하였다. 모든 순도가 높은 화학제들은 Merck (Darmstadt, Germany)로부터 제공받았다.

2.3. 주화성 분석 (세포 이동 분석)

기질 세포 유래 인자 1 (SDF-1) 농도 구배에 대한 Namalwa 세포 (ATCC CRL-1432)의 주화성 반응은 변형된 보이덴 챔버 주화성 시스템 (ChemoTx; Neuroprobe)으로 측정하였다. 이 시스템에서, 각 웰의 상부 챔버는 주화성 물질인 SDF-1이 담겨있는 하부 챔버와 (기공 크기 5 ㎛) 폴리카보네이트 막에 의해 분리되어 있다. 각 하부 웰을 덮고 있는 구역의 막의 원 영역 (circular area)은 이 영역 안에 세포 현탁물을 체류시키도록 소수성 마스크로 싸여 있다. 이 시스템은, 바닥 웰에, 펩타이드 적정 연속 희석물이 포함되거나 또는 펩타이드가 전혀 포함되지 않으며, SDF-1 (0.9 nM)이 첨가되거나 주화성 물질이 첨가되지 않은, 주화성 배지 (RPMI 1640, 페놀 레드 무첨가 + 0.5% BSA) 30 ㎕을 로딩하였다. 바닥 웰 위에 막을 놓고, 적정 연속 페바이드 희석물을 포함하거나 펩타이드를 전혀 포함하지 않는 주화성 배지로 미리 혼합한, 주화성 배지 중의 Namalwa 세포 현탁물 (3.6 x 10⁶ cells/mL) 50 ㎕를, 상기 막의 윗쪽 제한된 소수성 구역 표면 각각에 두었다. 세포는 37 ℃ 및 5% CO₂에서 5시간 동안 바닥 챔버로 이동하게 두었다. 이 기간이 경과한 후, 막을 분리하여, 이의 최상층을 조심스럽게 닦아내 PBS로 헹궈, 이동하지 않은 세포를 제거하였다. 이동한 세포는 "퍼넬" 어댑터를 이용하여 96웰 수용 플레이트로 이동시키고, 형광 염료 결합을 통한 세포내 DNA 함량 측정을 토대로 하는 CyQuant^TM NF 증식 분석 (Invitrogen)을 이용하여, 세포 수를 측정하였다. 제조사의 지침에 따라, CyQuant^TM 염료 시약/HBSS 완충액 (1/500 [v/v]) 50 ㎕를 전술한 96웰 수용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이를 실온에서 0.5시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 밀봉하여, 각 샘플의 형광 강도를 485 nm에서의 여기와 535 nm에서의 방출을 검출하여 Wallac 1420 VICTOR^2TM 플레이트 리더 (PerkinElmer)로 측정하였다. 마지막으로, 데이타를 대조군에 대해 정규화하고, 로그 곡선을 평균 데이타 값에 대입함으로써 GraphPad Prism^TM (GraphPad)으로 IC₅₀-값을 결정하였다.

2.4. 세포독성 분석

HELA 세포 (Acc57) 및 COS-7 세포 (CRL-1651)에 대한 펩타이드의 세포독성을 MTT 환원 분석을 이용하여 측정하였다 (T. Mossman, J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63; M.V. Berridge, A.S. Tan, Arch. Biochem. Biophys. 1993, 303, 474-482). 간략하게는, 방법은 다음과 같다: 96웰 마이크로타이터 플레이트에 웰 당 HELA 세포 4000개, COS-7 세포 3400개를 접종하여, 24시간 동안 37 ℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 그 후, 0시간 (Tz)에 MTT 환원 (하기 참조)으로 측정하였다. 나머지 웰들의 상층액을 버리고, 새로운 배지와 연속 희석 화합물 (12.5, 25 및 50 μM, 3세트; 0 μM, 블랭크)을 웰에 파이펫으로 첨가하였다. 세포를 48시간 동안 37 ℃ 및 5% CO₂에서 배양한 후, 상층액을 다시 버리고, 웰 당 100 ㎕ MTT 시약 (RPMI1640 및 DMEM 중의 각각 0.5 mg/mL)을 첨가하였다. 이를 37℃에서 2-4시간 배양한 후, 배지를 흡입 제거하고, 세포에 (100 ㎕ 이소프로판올/웰) 첨가하였다. 용해된 포르마잔의 흡광도를 595 nm (OD₅₉₅펩타이드)에서 측정하였다. 각 농도에서 3세트의 평균을 계산하였다. 증식율은 다음과 같이 계산하였다: (OD₅₉₅펩타이드 - OD₅₉₅Tz)/(OD₅₉₅블랭크 - OD₅₉₅Tz) x 100%. 농도 (50, 25, 12.5 및 0 μM), 해당 퍼센트 및 값 50에 대한 추세선 함수(=TREND (C₅₀:C₀,%₅₀:%₀,50)를 이용하여, 각 펩타이드에 대해 GI₅₀ (증식 저해) 농도를 계산하였다.

2.5. 용혈

펩타이드를 인간 적혈구 (hRBC)에 대한 용혈 활성에 대하여 테스트하였다. 신선한 hRBC를 인산완충식염수(PBS)로 4번 헹구고, 3000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. (100 μM) 화합물을 20% v/v hRBC와 37℃에서 1시간 동안 30 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 최종 적혈구 농도는 대략 0.9 x 10⁹ cells/mL이었다. PBS + 0.001% 아세트산 및 H₂O 중의 2.5% 트리톤 X-100 각각의 존재 하에 hRBC를 배양하여, 세포 용혈 0% 및 100% 값을 측정하였다. 샘플을 원심분리하고, 상층액을 PBS 완충액에 8배로 희석한 다음, 540 nM에서 광학 밀도 (OD)를 측정하였다. 100% 용혈값 (OD₅₄₀H₂0)의 OD₅₄₀는 대략 0.5 - 1.0이었다. 용혈 %는 다음과 같이 계산하였다: (OD_{540 펩타이드}/OD₅₄₀H₂0) x100%.

2.6. 혈장 안정성

인간 혈장 및 마우스 혈장에서의 펩타이드 안정성을 다음과 같은 방법을 이용하여 측정하였다: 막 해동시킨 인간 혈장 (Basler Blutspende-dienst)과 마우스 혈장 (Harlan Sera-Lab, UK) 각각을 딥 웰 당 346.5 ㎕로 넣고, 여기에, DMSO/H₂O (90/10 [v/v], 1 mM, 3세트)에 용해시킨 화합물을 웰 당 3.5 ㎕로 첨가한 다음, 37℃에서 배양하였다. t = 0, 15, 30, 60, 120, 240 및 1440분에, 50 ㎕를 취하여, 아세토니트릴 중의 2% 포름산이 웰 당 150 ㎕ 씩 든 필터 플레이트 웰로 이동시켰다. 이를 2분간 교반한 후, 형성된 상층액을 진공에 의해 여과하였다. 각 여과물 100 ㎕를 프로필렌 마이크로타이터 플레이트로 이동시켜, N₂하에 건조하였다. 남겨진 고형물에 물/아세토니트릴 95/5 (v/v) + 0.2% 포름산을 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하여 재구성한 후, 다음과 같이 LC/MS로 분석하였다: 컬럼: Waters, XBridge C18, 이동상: (A) 물 + 0.1% 포름산 및 (B) 아세토니트릴/물, 95/5 (v/v) + 0.1% 포름산, 농도 구배: 1.8분간 5% - 100% (B), 전자분무 이온화, MRM 검출 (트리플 쿼드루풀). 피크 면적을 측정하여 3세트의 값을 평균하였다. 안정성은 t = 0의 처음 값에 대한 퍼센트로 (tx/t0 x 100) 나타낸다. 엑셀 (마이크로소프트 오피스 2003)의 TREND 기능을 사용하여, T_1/2 값을 구하였다.

2.7. 혈장 단백질 결합성

인간 혈장 (Basler Blutspendedienst) 495 ㎕과 PBS 495 ㎕를 폴리프로필렌 플레이트 (Greiner)의 각각의 딥 웰에 넣고, 90% DMSO 중의 1 mM 펩타이드 용액을 각각 5 ㎕ 씩 첨가하였다. 플레이트를 600 rpm으로 2분간 교반한 후, 혈장/펩타이드 혼합물 중 150 ㎕ 분액을 3세트로 폴리프로필렌 필터 플레이트 (10 kDa, Millipore)로 옮기고, PBS/펩타이드 혼합물 중 150 ㎕ 분액을 필터 플레이트 (여과한 대조군)의 각 웰에 넣거나 또는 수용 플레이트 (Greiner) (비-여과 대조군)의 각 웰에 직접 넣었다. 필터와 수용 플레이트로 구성된 플레이트 샌드위치를 37℃에서 1시간 배양한 다음, 15℃에서 2시간 동안 322 g로 원심분리하였다. 수용 플레이트내 여과물을 다음과 같이 LC/MS로 분석하였다: 컬럼: Waters, XBridge C18, 이동상: (A) 물 + 0.1% 포름산 및 (B) 아세토니트릴/물, 95/5 (v/v) + 0.1% 포름산, 농도 구배: 1.8분간 5% - 100% (B), 전자분무 이온화, MRM 검출(트리플 쿼드루풀). 피크 면적을 측정하여 3세트의 값들을 평균하였다. 결합성은 100-(100x T_1h/T_ctr) 식에 의해 여과 대조군 및 비-여과 대조군에 대한 퍼센트로 표시한다. 마지막으로, 이들 값의 평균을 구하였다.

아래 2.3 - 2.7에 기술된 실험의 결과들은 아래 첨부된 표 1, 2, 3 및 4에 기술한다.

2.8. 약동학적 연구 (PK)

정맥 (i.v.) 투여 후 약동학적 연구를 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6의 화합물에 대하여 수행하였다.

Charles River Laboratories Deutschland GmbH에서 구입한 30 g (±20%)의 수컷 CD-1 마우스를 사용하였다. 비히클, 인산 완충 식염수를 첨가하여 최종 농도 0.5 mg/ml의 화합물을 수득하였다. 부피는 2 ml/kg이며, 화합물은 최종 정맥내 투여량 1 mg/kg이 되도록 주사하였다.

경미한 이소플루란 마취제로 마취하고, 미리 정해진 시간 (5, 15, 30분 및 1, 2, 3 및 4 시간) 간격으로 심장 천공에 의해 대략 300 - 400 ㎕의 혈액을 채혈하여, 헤파린 처리된 시험관에 넣었다. 이를 원심분리하여 펠렛에서 혈장을 취한 후, HPLC-MS로 분석할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.

혈장 보정 - 및 혈장 실험- 샘플의 준비

무처리 동물 유래의 마우스 혈장 ("블랭크(Blank)" 마우스 혈장) 각각 50 ㎕에, 기지량의 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6의 화합물을 첨가하여, 1 - 4000 ng/mL 범위의 10개의 혈장 보정 샘플을 각 화합물에 대해 수득하였다. 처리 동물 유래 마우스 혈장도 각각 50 ㎕ 씩 혈장 실험 샘플로 사용하였다.

혈장 보정 - 및 혈장 실험 - 샘플의 추출

모든 혈장 샘플에 적절한 내부 표준 물질을 첨가하고, 2% 포름산이 첨가된 아세토니트릴로 추출하였다. 상층액을 증발하여 질소 하에 건조시키고, 남겨진 고형물을 물/아세토니트닌 95/5 (v/v) + 0.2% 포름산으로 재구성하였다.

LC-MS/MS-분석

추출물을 다음과 같은 조건을 이용하여 역상 크로마토그래피 (실시예 1: Acquity BEH C18, 100 x 2.1 mm, 1.7 ㎛ 컬럼, Waters, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6: Acquity HSS C18 SB, 100 x 2.1 mm, 1.8 ㎛ 컬럼, Waters)로 분석하였다: 실시예 1, 이동상: (A) 물/아세토니트릴 95/5 (v/v) + 0.1% 포름산, (B) 아세토니트릴/물 95/5 (v/v) + 0.1% 포름산, 농도 구배: 실시예 1은 1% (B) 0-0.1 min, 15% (B) 0.1-2.5 min, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6은 1% (B) 0-0.1 min, 40% (B) 0.1-2.5 min. 검출과 정량은 질량 분광측정 및 전자분무 인터페이스를 이용하여 파지티브 모드 및 분석물의 선별 단편화 (selective fragmentation) 하에 수행하였다 (4000 Q Trap mass spectrometer, AB Sciex).

약동학적 평가

WinNonLin^TM 소프트웨어 버전 5.3 (Pharsight- A Certara^TM Company, Moutain View, CA 94041 USA)을 사용하여, 1-구획 모델 분석으로 PK 파라미터들을 계산하였다. PK 파라미터들은 모델의 최소 제곱법을 실험 데이타에 적용하여, 구하였다.

2.8에 기술된 실험의 결과는 아래 표 5a 및 5b에 나타낸다.

2.9. 유지 투약 속도 (주입 속도)를 통한 약물 로딩 계산

본 발명의 펩타이드를 포함하는 임플란트의 약물 로드 (drug load)를, 약동학의 기본 원칙에 따라 계산하고 (J. Gabrielsson, D. Weiner, "Pharmacokinetics and Pharmaco-dynamics Data Analysis: Concepts and Applications", 4^th edition, Swedish Pharmaceutical Press, Stockholm, Sweden, 2006), 그에 따라 유지 투약 속도 (maintainance dose rate) (주입 속도, R_in)는, 혈장내 특정 용량의 안정기 (steady state)에 도달하도록 약물이 투여되는 속도로 정의할 수 있다. 유지 투약 속도는 관계식 R_in [g/(h*kg)] = CL_iv [L/(h*kg)] x C_ss,eff [g/L]으로 표현할 수 있으며, 이때 CL_iv는 소거 (clearance)(i.v. - 투여)이고, C_ss,eff는 안정기의 혈장내 약물 유효 농도로, 효능 범위 (efficacy margin) A로 간주된다: C_ss,eff [g/L] = A x (IC₅₀/f_u) x MW [(mol/L)*(g/mol)]. 따라서, 특정 체중의 개체에서 특정 기간 동안 혈장내 일정한 약물 유효 농도를 제공하도록, 임플란트에 로딩되는 약물의 총량은 하기 식으로 계산할 수 있다:

약물_로드 [g/개체] = R_in [g/(h*kg)] x 기간 [h] x BW [kg/개체].

2.9에 기술된 계산 결과는 아래 표 6에 제시되며, 표 1, 4 및 5b에 제시된 데이타를 기반으로 한다. 추가적인 전제-조건은, 효능 범위 A = 3, 실험 기간 672 h (28일), 사람의 체중 70 kg이다. 주로 펩타이드의 소거에 영향을 주는 사구체 여과율 (GFR)은 종에 따라 크게 달라진다. 일반적으로, 인간의 GFR은 평균적으로 107 mL/(h*kg)이며, 마우스의 GFR은 840 mL/(h*kg)이다. 즉, 표 5b에 나타낸 CL_iv-마우스 결과는 상기 식을 적용하기 전에 107 mL/(h*kg)/840 mL/(h*kg) = 0.127로 상대적으로 계산되었다.

3.0. 마우스에서 HSC 이동성

실시예 1 및 실시예 2의 화합물에 대해, 투약 후 최대 이동 시간을 분석하기 위한 시간-반응 실험과 후속적인 용량-반응 실험으로 구성된 HSC 이동성 실험을 수행하였다.

시간-반응 실험

수컷 C57Bl/6 마우스 (Janvier, France; 실시예 1은 n = 5, 실시예 2는 n = 3)에게, 마우스 체중 g 당 0.9% NaCl가 포함된 물 10 ㎕에 용해하여 실시예 1 및 실시예 2를 각각 (5 mg/kg) 볼루스 i.p. 주사하였다. 투여 후 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 및 8시간 후에, 볼주머니에서 채혈하여, EDTA로 코팅된 시험관에 채집하였다. 배양 카운트로 콜로니 형성 단위 (CFU-C 카운트)를 후술된 바와 같이 CFU-C 분석을 수행하여 구하였다. 실시예 1 및 실시예 2에 대한 시간-반응 실험의 결과를 표 7a와 7b에 나타낸다.

용량-반응 실험

수컷 C57Bl/6 마우스 (Janvier, France; 실시예 1은 n = 5, 실시예 2는 n = 3)에게, 실시예 1 및 실시예 2 (마우스 체중 g 당 0.9% NaCl가 포함된 물 10 ㎕에 용해한 화합물)를 0.5, 1.5, 5 및 15 mg/kg의 용량으로 각각 볼루스 i.p. 주사하였다. 투여 후 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 및 8시간 후에, 볼주머니에서 채혈하여, EDTA로 코팅된 시험관에 채집하였다. 배양 카운트로 콜로니 형성 단위 (CFU-C 카운트)를 후술된 바와 같이 CFU-C 분석을 수행하여 구하였다. 실시예 1 및 실시예 2에 대한 시간-반응 실험의 결과를 표 7a와 7b에 나타낸다. 실시예 1 (4 h) 및 실시예 2 (2 h)의 최대 이동 시간대에 전술한 바와 같이 각각 혈액을 채혈하였다. 실시예 1 및 실시예 2의 용량-반응 실험 결과는 표 8a와 8b에 나타낸다.

CFU-C 분석

CFU-C 카운트는 세포 용혈시킨 말초혈을 표준 반-고형 전구 세포 배양 배지에서 배양하여 측정하였다. 간략하게는, 정해진 양의 혈액을 0.5% 소 혈청 알부민이 포함된 PBS 완충액 (Gibco^®)으로 세척한 다음, 저삼투성 NH₄Cl 완충액 (Sigma) 중에서 적혈구 세포를 용혈시켜, 2차 세척을 수행하였다. 세포 펠렛을 10% FCS가 포함된 DMEM (Gibco^®)에 재현탁하고, 뮤라인 세포용의 시판 사이토카인이 풍부한 메틸 셀룰로스 배지 (Cell Systems, USA) 2 mL에 현탁한 다음, 35 mm 세포 배양 디쉬에 2세트로 접종하였다. 표준 조건 (20% O₂, 포화 습도, 5% CO₂, 37 ℃)으로 7-8일간 배양한 후 CFU-C를 계측하였다. 말초혈의 세포성 (peripheral blood cellularity)을 자동 혈액 계수 장치 (Drew Scientific)로 분석하였다.

Log ₁₀ 용량-반응 곡선 및 ED ₅₀

표 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 용량 1.5, 5 및 15 mg/kg에서의 CFU/mL-값을 토대로 실시예 1 및 실시예 2의 log₁₀ 용량 반응 곡선을 각각 도 1에 나타내며, GraphPad Prism, 버전 5.03으로 시그모이드형 용량-반응 피팅 기능으로 피팅하였다. 이들 2가지 화합물의 곡선 진행을 고려하여, 용량-반응은 최대 반응 4000 CFU/mL로 제한된다. 표 9에 나타낸 ED₅₀-값은 따라서 2000 CFU/mL의 반응에 해당된다.

표 1

표 2

표 3

표 4

표 5a

표 5b

표 6

표 7a

표 7b

표 8a

표 8b

표 9

Claims

아미노산 잔기 16개로 구성된, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 백본 고리형 펩타이드 화합물 (backbone cyclized peptidic compound):
[식 (I)]
사이클로(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-Xaa⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴- ^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)
상기 식 (I)에서,
Xaa³는 Ala; Tyr; 또는 Tyr(Me)이고, Tyr(Me)은 (2S)-2-아미노-(4-메톡시페닐)-3-프로피온산이고,
Xaa⁷은 ^DTyr; ^DTyr(Me); 또는 ^DPro이고, ^DTyr(Me)은 (2R)-2-아미노-(4-메톡시페닐)-3-프로피온산이고,
Xaa⁸은 Dab; 또는 Orn(iPr)이고, Dab는 (2S)-2,4-다이아미노부티르산이고, Orn(iPr)은 (2S)-N^ω-이소프로필-2,5-다이아미노펜탄산이고,
Xaa¹³은 Gln; 또는 Glu이고,
Xaa¹⁴은 Lys(iPr)이고,
Lys(iPr)은 (2S)-N^ω-이소프로필-2,6-다이아미노헥산이고,
D-아미노산 잔기로 명시적으로 표시되지 않은 아미노산 잔기들은 모두 L-아미노산 잔기이고,
Cys⁴ 및 Cys¹¹인 2개의 L-시스테인 잔기들의 2개의 -SH 기는 하나의 -S-S기로 치환된다.
제1항에 있어서, Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
Xaa³가 Tyr; 또는 Tyr(Me)이고,
Xaa⁷이 ^DPro이고,
Xaa⁸이 Orn(iPr)이고,
Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
Xaa³가 Ala이고,
Xaa⁷이 ^DTyr이고,
Xaa⁸이 Dab이고,
Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
Xaa³가 Tyr이고,
Xaa⁷이 ^DPro이고,
Xaa⁸이 Orn(iPr)이고,
Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
Xaa³가 Tyr(Me)이고,
Xaa⁷이 ^DPro이고,
Xaa⁸이 Orn(iPr)이고,
Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
Xaa³가 Ala이고,
Xaa⁷이 ^DTyr(Me)이고,
Xaa⁸이 Orn(iPr)이고,
Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
Xaa³가 Tyr이고,
Xaa⁷이 ^DTyr이고,
Xaa⁸이 Orn(iPr)이고,
Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
Xaa³가 Tyr(Me)이고,
Xaa⁷이 ^DTyr(Me)이고,
Xaa⁸이 Orn(iPr)이고,
Xaa¹³이 Gln인 것을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항에 있어서,
약제학적 활성 물질로서 사용하기 위한, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제10항에 있어서,
CXCR4 길항 활성, 항암 활성 및/또는 항-염증 활성 및/또는 줄기 세포 동원 활성 (stem cell mobilizing activity)을 가진 물질로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물, 및 약제학적으로 불활성인 담체를 포함하는,
건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하기 위한; 또는 HIV 감염 환자에서 바이러스성 진행을 서행 또는 중지시키기 위한 약학 조성물.
제12항에 있어서, 경구 투여 형태, 국소 투여 형태, 경피 투여 형태, 주사 투여 형태, 볼 투여 형태 또는 경점막 투여 형태인, 약학 조성물.
제13항에 있어서,
정제, 당의정제 (dragee), 캡슐제, 용액제, 액제, 젤제, 고제 (plaster), 크림제, 연고제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제, 산제 또는 좌제 형태인, 약학 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물, 및 약제학적으로 불활성인 담체를 포함하는,
CXCR4 수용체 활성으로부터 매개 또는 기인하는, 암 또는 면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한; 또는 면역억제를 치료하기 위한, 약학 조성물.
제15항에 있어서, 경구 투여 형태, 국소 투여 형태, 경피 투여 형태, 주사 투여 형태, 볼 투여 형태 또는 경점막 투여 형태인, 약학 조성물.
제16항에 있어서,
정제, 당의정제 (dragee), 캡슐제, 용액제, 액제, 젤제, 고제 (plaster), 크림제, 연고제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제, 산제 또는 좌제 형태인, 약학 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물, 및 약제학적으로 불활성인 담체를 포함하는,
손상된 임의의 조직에 줄기세포의 동원을 유도하여 손상된 조직을 회복시키는, 조직 회복용 약학 조성물.
제18항에 있어서, 경구 투여 형태, 국소 투여 형태, 경피 투여 형태, 주사 투여 형태, 볼 투여 형태 또는 경점막 투여 형태인, 약학 조성물.
제19항에 있어서,
정제, 당의정제 (dragee), 캡슐제, 용액제, 액제, 젤제, 고제 (plaster), 크림제, 연고제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제, 산제 또는 좌제 형태인, 약학 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조 방법으로서,
(a) 관능화된 고상 지지체에, Pro이 식 I의 화합물에서 16번 위치의 기본 아미노산이 되도록, N-보호된 아미노산 Pro을 커플링하는 단계;
(b) 단계 (a)의 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;
(c) 단계 (b)의 산물을, ^DPro이 식 I의 화합물에서 15번 위치의 기본 아미노산이 되도록, N-보호된 아미노산 ^DPro와 커플링하는 단계;
(d) 단계 (c)의 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;
(e) 단계 (c)와 단계 (d)에 기술된 바와 유사한 방식으로, 상기 고상 지지체에 커플링되어 성장하는 펩타이드의 유리 (free) 말단에 있는 아미노산 잔기의 유리 아미노기에, 식 I의 화합물의 14번에서 1번 위치에 해당하는 각각의 아미노산 잔기를, 하나씩 순차적으로 추가하는 단계로서, 단계 (c)와 유사한 커플링 단계에서 각 경우에 사용되는 상기 각 위치의 아미노산은 N-보호되며, 알파-아미노 모이어티의 카르복시기 이외의 상기 각 위치의 아미노산에 존재하는 관능기 역시 보호되는, 단계;
(f) 단계 (j)에서 -S-S 기를 형성하지 않는 경우, 단계 (e)의 산물에서 2개의 Cys 잔기의 -SH 기 2개를 하나의 -S-S 기로 치환하는 단계;
(g) 상기 고상 지지체에서 헥사데카펩타이드를 탈착하는 단계;
(h) 상기 헥사데카펩타이드의 1번 위치의 아미노산 잔기를 상기 헥사데카펩타이드의 16번 위치의 아미노산 잔기와 커플링하는 단계;
(i) 단계 (h)의 산물에 존재하는 모든 보호된 관능기를 제거하는 단계;
(j) 단계 (f)에서 -S-S 기가 형성되지 않는 경우, 단계 (i)의 산물에서 2개의 Cys 잔기의 -SH 기 2개를 하나의 -S-S 기로 치환하는 단계;
(k) 단계 (j)의 산물에서, 하나 또는 수개의 이소프로필 치환기를 결합시키는 단계;
(l) 단계 (k)의 산물에 존재하는 모든 보호된 관능기를 탈보호하는 단계; 및
(m) 상기 방법의 원하는 산물이 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 화합물인 경우, 유리 형태의 식 I의 화합물을 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 상응하는 화합물로 변환하거나, 또는 상기 방법의 원하는 산물이 유리 형태의 식 I의 화합물인 경우, 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 화합물을 유리 형태의 식 I의 상응하는 화합물로 변환하거나, 또는 상기 방법의 원하는 산물이 다른 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 화합물인 경우, 다른 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 상응하는 화합물로 변환하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조 방법으로서,
(a) 관능화된 고상 지지체에, Pro이 식 I의 화합물에서 16번 위치의 기본 아미노산이 되도록, N-보호된 아미노산 Pro을 커플링하는 단계;
(b) 단계 (a)의 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;
(c) 단계 (b)의 산물을, ^DPro이 식 I의 화합물에서 15번 위치의 기본 아미노산이 되도록, N-보호된 아미노산 ^DPro와 커플링하는 단계;
(d) 단계 (c)의 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;
(e) 단계 (c)와 단계 (d)에 기술된 바와 유사한 방식으로, 상기 고상 지지체에 커플링되어 성장하는 펩타이드의 유리 (free) 말단에 있는 아미노산 잔기의 유리 아미노기에, 식 I의 화합물의 14번에서 1번 위치에 해당하는 각각의 아미노산 잔기를, 하나씩 순차적으로 추가하는 단계로서, 단계 (c)와 유사한 커플링 단계에서 각 경우에 사용되는 상기 각 위치의 아미노산은 N-보호되며, 알파-아미노 모이어티의 카르복시기 이외의 상기 각 위치의 아미노산에 존재하는 관능기 역시 보호되는, 단계;
(f) 단계 (j)에서 -S-S 기를 형성하지 않는 경우, 단계 (e)의 산물에서 2개의 Cys 잔기의 -SH 기 2개를 하나의 -S-S 기로 치환하는 단계;
(g) 상기 고상 지지체에서 헥사데카펩타이드를 탈착하는 단계;
(h) 상기 헥사데카펩타이드의 1번 위치의 아미노산 잔기를 상기 헥사데카펩타이드의 16번 위치의 아미노산 잔기와 커플링하는 단계;
(i) 단계 (h)의 산물에 존재하는 모든 보호된 관능기를 제거하는 단계;
(j) 단계 (f)에서 -S-S 기가 형성되지 않는 경우, 단계 (i)의 산물에서 2개의 Cys 잔기의 -SH 기 2개를 하나의 -S-S 기로 치환하는 단계;
(k) 단계 (j)의 산물에 존재하는 모든 보호된 관능기를 탈보호하는 단계; 및
(l) 상기 방법의 원하는 산물이 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 화합물인 경우, 유리 형태의 식 I의 화합물을 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 상응하는 화합물로 변환하거나, 또는 상기 방법의 원하는 산물이 유리 형태의 식 I의 화합물인 경우, 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 화합물을 유리 형태의 식 I의 상응하는 화합물로 변환하거나, 또는 상기 방법의 원하는 산물이 다른 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 화합물인 경우, 다른 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 식 I의 상응하는 화합물로 변환하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른, 식 (I)의, 유리형 (free form) 또는 약제학적으로 허용가능한 염 형태의 화합물, 및 약제학적으로 불활성인 담체를 포함하는,
줄기세포가 농축된 말초 혈액 수집용 조성물.