CN103703018B - 作为CXC4拮抗剂的β-发夹肽模拟物 - Google Patents

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Abstract

二硫键在Cys4和Cys11之间的通式为环(‑Tyr1‑His2‑Xaa3‑Cys4‑Ser5‑Ala6‑Xaa7‑Xaa8‑Arg9‑Tyr10‑Cys11‑Tyr12‑Xaa13‑Xaa14‑DPro15‑Pro16‑)的β‑发夹肽模拟物及其可药用盐，其中Xaa3、Xaa7、Xaa8、Xaa13和Xaa14是说明书和权利要求书中定义的某些类型的氨基酸残基，这些β‑发夹肽模拟物具备有利的药理学特性并且可以用于预防健康个体中的HIV感染或用于延缓并制止感染患者中的病毒进展；或用于其中癌症由CXCR4受体活性介导或因其产生的情况；或用于其中免疫学疾病由CXCR4受体活性介导或因其产生的情况；或用于治疗免疫抑制；或用于外周血干细胞的血浆分离置换采集期间和/或用作诱导干细胞动员以调节组织修复的物质。这些肽模拟物可以通过基于混合固相和溶液相合成策略的方法制备。

Description

作为CXC4拮抗剂的β-发夹肽模拟物
本发明提供了具有CXCR4拮抗活性并且由WO2004/096840A1中的一般公开涵盖，但是没有在其中具体公开的β-发夹肽模拟物。
本发明的β-发夹肽模拟物是二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)及其可药用盐，Xaa3是如下文所述的Ala、Tyr或Tyr(Me)，Xaa7是如下文所述的DTyr、DTyr(Me)或DPro，Xaa8是如下文所述的Dab或Orn(iPr)，Xaa13是Gln或Glu，并且Xaa14是如下文所述的Lys(iPr)。
此外，本发明提供高效的合成方法，其中如果需要，这些化合物可以通过所述合成方法以平行文库模式产生。这些β-发夹肽模拟物具有有利的药理学特性，并且此外，显示合适的血浆蛋白结合作用和适宜的清除率。因此可以将它们以微少量作为有效成分用于全部种类的药物制剂，尤其延长释放的药物制剂。
许多医学意义的生物学过程由总体上涉及趋化因子及其受体并且尤其涉及间质衍生因子1(SDF-1/CXCL12)及其受体CXCR4的信号转导介导。
CXCR4及其配体SDF-1参与B细胞、造血干细胞(HSC)和造血祖先细胞(HPC)的运输。例如，CXCR4在CD34+细胞上表达并且已经涉及CD34+细胞移行和归巢过程(S.M.Watt,S.P.Forde,Vox sanguinis2008,94,18-32)。还已经显示CXCR4受体在干细胞和祖先细胞从骨髓释放至外周血中发挥重要作用(L.M.Pelus,S.Fukuda,Leukemia2008,22,466-473)。CXCR4的这种活性可能对于外周血干细胞的高效血浆分离置换采集是非常重要的。在血液恶性肿瘤和实体瘤患者中施用大剂量化疗或放疗法后，自体外周血细胞提供自体移植后快速和持久的造血恢复 (W.C.Liles等人,Blood2003,102,2728-2730)。
最近，已经展示SDF-1在损伤的动物模型中局部上调，所述损伤包括局部缺血发作、全脑性缺血、心肌梗死和后肢局部缺血，以及参与外周局部缺血后或肝、肾或肺损伤后的恢复(A.E.Ting,R.W.Mays,M.R.Frey,W.Van't Hof,S.Medicetty,R.Deans,CriticalReviews in Oncology/Hematology2008,65,81-93and literature cited herein;F.Lin,K.Cordes,L.Li,L.Hood,W.G.Couser,S.J.Shankland等人,J.Am.Soc.Nephrol.2003,14,1188-1199;C.C.Dos Santos,Intensive Care Med.2008,34,619-630)。这些结果表明对于组织和器官修复/再生而言，SDF-1可能是CXCR4阳性干细胞的趋化剂(M.Z.Ratajczak,M.Kucia,R.Reca,M.Majka,A.Janowska-Wieczorek,J.Ratajczak,Leukemia2004,18,29-40)。因此，通过CXCR4抑制剂调节SDF-1/CXCR4轴应当通过利用释放的干细胞来调节组织修复而产生显著的治疗益处。
最近，已经显示，通过CXCR4抑制剂破坏CXCR4/SDF-1轴在从骨髓差异性动员祖先细胞如HPC、内皮祖先细胞(EPC)和间质祖先细胞(SPC)方面发挥关键作用(S.C.Pitchford,R.C.Furze,C.P.Jones,A.M.Wegner,S.M.Rankin,Cell Stem Cell2009,4,62)。此外，源自的骨髓CXCR4+极小胚样干细胞(VSEL)在急性心肌梗死患者中动员，提示一种假定性代偿机制(W.Wojakowski,M.Tendra,M.Kucia,E.Zuba-Surma,E.Paczkowska,J.Ciosek,M.Halasa,M.Krol,M.Kazmierski,P.Buszman,A.Ochala,J.Ratajczak,B.Machalinski,M.Z.Ratajczak,J.Am.Coll.Cardiol.2009,53。
1).可以利用这些研究结果为组织再生提供有效的干细胞治疗。
间充质干细胞(MSC)是具有分化成多种组织如骨和软骨的能力的非造血性祖先细胞(D.J.Prockop,Science1997,276,71)。由于小比例的MSC强烈地表达功能上有活性的CXCR4，因此调节CXCR4/SDF-1轴可以介导这些细胞的特异性移行和归巢(R.F.Wynn,C.A.Hart,C.Corradi-Perini,L.O'Neill,C.A.Evans,J.E.Wraith,L.J.Fairbaim,I.Bellantuono,Blood2004,104,2643)。
存在日益增加的以下证据，这些证据显示总体上趋化因子并且尤其SDF-1/CXCR4相互作用在血管生成中发挥关键作用。趋化因子通过结合其内皮细胞上的同族受体直接诱导血管生成或通过促进输送其他生血管刺激的炎性细胞浸润，间接地诱导血管生成。已经显示许多促炎趋化因子(包括白介素8(IL-8)、调节生长的癌基因、间质细胞衍生因子1(SDF-1)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、嗜酸性粒细胞趋化因子1和1-309)充当血管生成的直接诱导物(X.Chen,J.A.Beutler,T.G.McCloud,A.Loehfelm,L.Yang,H.F.Dong,O.Y.Chertov,R.Salcedo,J.J.Oppenheim,O.M.Howard.Clin.Cancer Res.2003,9(8),3115-3123;R.Salcedo,J.J.Oppenheim,Microcirculation2003,(3-4),359-370)。
最近获得的结果显示，CXCR4受体参与癌细胞趋化活动，如乳腺癌转移或参与以下癌的转移：卵巢癌(A.Muller,B.Homey,H.Soto,N.Ge,D.Catron,M.E.Buchanan,T.McClanahan,E.Murphey,W.Yuan,S.N.Wagner,J.L.Barrera,A.Mohar,E.Verastegui,A.Zlotnik,Nature2001,50,410；J.M.Hall,K.S.Korach,Molecular Endocrinology2003,17,792-803)、非霍奇金淋巴瘤(F.Bertolini,C.Dell'Agnola,P.Manusco,C.Rabascio,A.Burlini,S.Monestiroli,A.Gobbi,G.Pruneri,G.Martinelli,Cancer Research2002,62,3106-3112)、或肺癌(T.Kijima,G.Maulik,P.C.Ma,E.V.Tibaldi,R.E.Turner,B.Rollins,M.Sattler,B.E.Johnson,R.Salgia,Cancer Research2002,62,6304-6311)、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、肝细胞癌、结直肠癌、子宫内膜癌和生殖细胞肿瘤(H.Tamamura等人,FEBS Letters2003,550,79-83,援引才参考文献；Z.Wang,Q.Ma,Q.Liu,H.Yu,L.Zhao,S.Shen,J.Yao,BritishJournal of Cancer2008,99,1695；B.Sung,S.Jhurani,K.S.Ahn,Y.Mastuo,T.Yi,S.Guha,M.Liu,B.Aggarwal,Cancer Res.2008,68,8938；H.Liu,Z.Pan,A.Li,S.Fu,Y.Lei,H.Sun,M.Wu,W.Zhou,Cellular and Molecular Immunology,2008,5,373；C.Rubie,O.Kollmar,V.O.Frick, M.Wagner,B.Brittner,S.M.K.Schilling,Scandinavian Journalof Immunology2008,68,635；S.Gelmini,M.Mangoni,F.Castiglioe,C.Beltrami,A.Pieralli,K.L.Andersson,M.Fambrini,G.I.Taddie,M.Serio,C.Orlando,Clin.Exp.Metastasis2009,26,261；D.C.Gilbert,I.Chandler,A.Mclntyre,N.C.Goddard,R.Gabe,R.A.Huddart,J.Shipley,J.Pathol.2009,217,94)。用CXCR4抑制剂阻断趋化活动应终止癌细胞移行和因此终止转移。
CXCR4也已经涉及实体瘤和白血病/淋巴瘤的生长和增殖。显示CXCR4受体的激活对恶性神经元肿瘤和神经胶质肿瘤的生长均至关重要。另外，全身性施用CXCR4拮抗剂AMD3100抑制颅内胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤异体移植物的生长，原因在于增加凋亡并减少肿瘤细胞的增殖(J.B.Rubin,A.L Kung,R.S Klein,J.A.Chan,Y.Sun,K.Schmidt,M.W.Kieran,A.D.Luster,R.A.Segal,Proc Natl Acad Sci USA.2003,100(23),13513-13518；S.Barbero,R.Bonavia,A.Bajetto,C.Porcile,P.Pirani,J.L.Ravetti,G.L.Zona,R.Spaziante,T.Florio,G.Schettini,Cancer Res.2003,63(8),1969-1974；T.Kijima,G.Maulik,P.C.Ma,E.V.Tibaldi,R.E.Turner,B.Rollins,M.Sattler,B.E.Johnson,R.Salgia.Cancer Res.2002,62(21),6304-6311)。CXCR4抑制剂也在以下癌中显示有前景的体外和体内功效：乳腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、前列腺癌以及慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤(J.A.Burger,A.Peled,Leukemia2009,23,43-52及其中援引的文献)。
充分确立了趋化因子参与许多炎性疾病并且它们中的一些在破骨细胞发育调节中显示关键作用。在来自类风湿性关节炎(RA)样品和骨关节炎(OA)样品的滑膜和骨组织活组织检查样品上针对SDF-1(CXCL12)的免疫染色已经揭示出炎性病症下趋化因子的表达水平强烈增加(F.Grassi,S.Cristino,S.Toneguzzi,A.Piacentini,A.Facchini,G.Lisignoli,J.Cell Physiol.2004;199(2),244-251)。CXCR4 受体似乎可能在炎性疾病如类风湿性关节炎，哮喘，多发性硬化，阿尔茨海默病，帕金森病，动脉粥样硬化或眼病如糖尿病性肾病和年龄相关性黄斑变性中发挥重要作用(K.R.Shadidi等人,ScandinavianJournal of Immunology2003,57,192-198；J.A.Gonzalo,J.Immunol.2000,165,499-508；S.Hatse等人,FEBS Letters2002,527,255-262及援引的文献,A.T.Weeraratna,A.Kalehua,I.DeLeon,D.Bertak,G.Maher,M.S.Wade,A.Lustig,K.G.Becker,W.Wood,D.G.Walker,T.G.Beach,D.D.Taub,Exp.Cell Res.2007,313,450；M.Shimoji,F.Pagan,E.B.Healton,I.Mocchetti,Neurotox.Res.2009,16,318；A.Zernecke,E.Shagdarsuren,C.Weber,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2008,28,1897；R.Lima e Silva,J.Shen,S.F.Hackett,S.Kachi,H.Akiyama等人,FASEB2007,21,3219)。应当通过CXCR4抑制剂终止介导免疫细胞召集至炎症部位。
迄今治疗HIV感染的可用疗法已经在感染人群中引起症状的明显改善和从疾病中恢复。虽然涉及逆转录酶/蛋白酶抑制剂组合的高度活性的抗转录病毒疗法(HAART)已经大幅度改进AIDS或HIV感染个体的临床治疗，但是依旧存在几个严重问题，包含多重耐药、副作用明显和成本高。特别需要在感染早期阶段如病毒进入时阻断HIV感染的抗HIV剂。近来已经认识到，为了高效进入靶细胞中，人免疫缺陷病毒需要趋化因子受体CCR5和CXCR4以及主要受体CD4(N.Levy,Engl.J.Med.1996,335,1528-1530)。因此，可以阻断CXCR4趋化因子受体的物质应当在健康个体中防止感染并且在感染患者中减缓或制止病毒进展(J.Cohen,Science1997,275,1261-1264)。
在不同类型的CXCR4抑制剂当中(M.Schwarz,T.N.C.Wells,A.E.I.Proudfoot,Receptors and Channels2001,7,417-428;Y.Lavrovsky,Y.A.Ivanenkov,K.V.Balakin,D.A.Medvedewa,P.V.Ivachtchenko,Mini Rev.Med.Chem.2008,11,1075-1087)，一种新出现的类型基于源自鲎肽II的天然存在的阳离子肽类似物，所述阳离子肽类似物具有反平行β-折叠结构和由两个二硫键维持的β-发夹(H.Nakashima,M.Masuda,T. Murakami,Y.Koyanagi,A.Matsumoto,N.Fujii,N.Yamamoto,Antimicrobial Agents andChemoth.1992,36,1249-1255;H.Tamamura,M.Kuroda,M.Masuda,A.Otaka,S.Funakoshi,H.Nakashima,N.Yamamoto,M.Waki,A.Matsumotu,J.M.Lancelin,D.Kohda,S.Tate,F.Inagaki,N.Fujii,Biochim.Biophys.Acta1993,209,1163;WO95/10534A1)。
结构类似物的合成和借助核磁共振(NMR)谱的结构研究已经显示这些阳离子肽采取充分限定的β-发夹构象，原因在于1个或2个二硫键的约束效应(H.Tamamura,M.Sugioka,Y.Odagaki,A.Omagari,Y.Kahn,S.Oishi,H.Nakashima,N.Yamamoto,S.C.Peiper,N.Hamanaka,A.Otaka,N.Fujii,Bioorg.Med.Chem.Lett.2001,359-362)。这些结果显示β-发夹结构在CXCR4拮抗活性中发挥重要作用。
其它的结构研究已经显示这种拮抗活性也可能通过调节两性结构和药效团加以影响(H.Tamamura,A.Omagari,K.Hiramatsu,K.Gotoh,T.Kanamoto,Y.Xu,E.Kodama,M.Matsuoka,T.Hattori,N.Yamamoto,H.Nakashima,A.Otaka,N.Fujii,Bioorg.Med.Chem.Lett.2001,11,1897-1902；H.Tamamura,A.Omagari,K.Hiramatsu,S.Oishi,H.Habashita,T.Kanamoto,K.Gotoh,N.Yamamoto,H.Nakashima,A.OtakaN.Fujii,Bioorg.Med.Chem.2002,10,1417-1426；H.Tamamura,K.Hiramatsu,K.Miyamoto,A.Omagari,S.Oishi,H.Nakashima,N.Yamamoto,Y.Kuroda,T.Nakagawa,A.Otaki,N.Fujii,Bioorg.Med.Chem.Letters2002,12,923-928)。
二硫键在Cys4和Cys11之间的本发明化合物环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)，是环状β-发夹肽模拟物，其显示高的CXCR4拮抗活性，可用于动员的外周血干细胞的高效血浆分离置换采集和/或使用这些动员的细胞来调节组织修复，和/或具有抗癌活性、抗炎活性和/或抗HIV活性。
环状β-发夹构象由D-氨基酸残基Xaa7和D-氨基酸残基DPro15引起。该发夹构象的进一步稳定由位置4和位置11处共同形成二硫键的氨基酸残基Cys实现。
令人惊讶地，我们已经发现在二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)的位置14处导入碱性氨基酸残基Lys(iPr)，受可选在位置8导入Orn(iPr)支持，产生具备有利药理学特性的β-发夹肽模拟物。这些特性，联合合适的血浆蛋白结合作用和适宜的清除率，形成这样的药理学谱，其允许这些化合物以低量作为有效成分用于全部种类的药物制剂，尤其延长释放的药物制剂。
本发明的β-发夹肽模拟物是二硫键在Cys4和Cys11之间的通式环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)(I)的化合物及其可药用盐，
其中
Xaa3是Ala、Tyr或Tyr(Me)，后者是(2S)-2-氨基-(4-甲氧苯基)-3-丙酸，
Xaa7是DTyr、DTyr(Me)，即(2R)-2-氨基-(4-甲氧苯基)-3-丙酸，或 DPro，
Xaa8是Dab，即(2S)-2,4-二氨基丁酸，或Orn(iPr)，即(2S)-Nω-异丙基-2,5-二氨基戊酸，
Xaa13是Gln或Glu，
Xaa14是Lys(iPr)，即(2S)-Nω-异丙基-2,6-二氨基己酸。
在本发明的一个特定实施方案中，β-发夹肽模拟物是通式I的化合物及其可药用盐，其中Xaa13是Gln。
在本发明的另一个特定实施方案中，β-发夹肽模拟物是通式I的化合物及其可药用盐，其中其中Xaa3是Tyr或Tyr(Me)，Xaa7是DPro，Xaa8是Orn(iPr)并且Xaa13是Gln。
在本发明的一个优选实施方案中，该化合物是二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Ala3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr7-Dab8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可药用盐。
在本发明的另一个优选实施方案中，该化合物是二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Tyr3-Cys4-Ser5-Ala6-DPro7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可药用盐。
在本发明的另一个优选实施方案中，该化合物是二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Tyr(Me)3-Cys4-Ser5-Ala6-DPro7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可药用盐。
在本发明的另一个优选实施方案中，该化合物是二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Ala3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr(Me)7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可药用盐。
在本发明的另一个优选实施方案中，该化合物是二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Tyr3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可药用盐。
在本发明的仍另一个优选实施方案中，该化合物是二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Tyr(Me)3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr(Me)7-Orn(iPr)8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys(iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可药用盐。
根据本发明，这些β-发夹肽模拟物可以通过以下方法制备，所述方法包括
(a)用处于所需终产物中的位置16的Pro的适当N保护衍生物偶联适当官能化的固相支持物；
(b)从如此获得的产物移除N保护基；
(c)用处于所需终产物中的位置15的DPro的适当N保护衍生物偶联如此获得的产物；
(d)从步骤(c)获得的产物移除N保护基；
(e)使用其中在所需终产物中处于位置14至1位置的适当N保护的氨基酸衍生物实施基本上与步骤(c)和(d)相对应的步骤，可能存在于所述N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样适当地受到保护；
(f)如果需要，在位置4和位置11处的Cys残基的侧链之间形成二硫键；或可选地，如下文所述，在步骤(i)之后形成前述键；
(g)使如此获得的产物从固相支持物脱离；
(h)环化从固相支持物切下的产物；
(i)移除在氨基酸残基链的任何组件的官能团上存在的任何保护基；以及
(j)如果需要，连接一个或多个异丙基
(k)如果需要，移除在氨基酸残基的任何组件的官能团上存在的任何保护基；和
(l)如果需要，将如此获得的产物转化成可药用盐或将如此获得的药学上可接受或不可接受的盐转化成相应的游离化合物或转化成不同的可药用盐。
本发明的β-发夹肽模拟物可以例如通过遵循以下方法产生，所述方法包括在树脂上合成线性肽，其中用携带异丙基的氨基酸残基Orn(iPr)或Lys(iPr)将作为市售或事先合成的氨基酸结构单元掺入；或通过遵循以下方法产生，所述方法包括通过采用正交保护基策略在树脂上合成线性肽，其中例如认为不进行修饰的携带氨基的全部氨基酸残基侧链应当由ivDde等保护，从而可以通过在合成级联的极晚阶段偶联异丙基在溶液中衍生化受酸不稳定性保护基保护的携带氨基的氨基酸残基侧链，其中所述易酸解保护基适用于基于Fmoc的固相肽合成策略；或遵循包括前述方法之合适组合的方法产生。
恰当选择官能化固相支持物(即固相支持物外加接头分子)和环化位点在本发明的β-发夹肽模拟物的合成过程中发挥关键作用。
官能化的固相支持物便利地衍生自与优选1-5%二乙烯基苯交联的聚苯乙烯；用聚乙烯间隔基包被的聚苯乙烯；和聚丙烯酰胺树脂(D.Obrecht,J.-M.Villalgordo,"Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries",Tetrahedron Organic Chemistry Series,Vol.17,Pergamon,Elsevier Science,1998)。
固相支持物通过接头来官能化，即，在一个末端上含有用于接合至固相支持物的锚定基团并且在另一个末端上含有选择性可切割的用于后续化学转化和裂解过程的官能团的双官能间隔分子。出于本发明目的，使用两种类型的接头：
1型接头设计成在酸性条件下释放酰胺基(H.Rink,Tetrahedron Lett.1987,28,3783-3790)。这种类型的接头形成氨基酸羧基的酰胺；由这类接头结构官能化的树脂的例子包括4-[(((2,4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)氨基甲基]PS树脂、4-[(((2,4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)氨基甲基]-4-甲基-二苯甲基胺PS树脂(Rink酰胺MBHA PS树脂)和4-[(((2,4-二甲氧基-苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)氨基甲基]二苯甲基胺PS-树脂(Rink酰胺BHA PS树脂)。优选地，支持物衍生自与最优选地1-5%二乙烯基苯交联并借助4-(((2,4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)接头官能化的聚苯乙烯。
2型接头设计成在酸性条件下最终释放羧基。这种类型的接头与氨基酸的羧基形成酸不稳定性酯，通常是酸不稳定性苄酯、二苯甲基酯和三苯甲基酯；这类接头结构的例子包括2-甲氧基-4-羟甲基苯氧基(SasrinR接头)、4-(2,4-二甲氧基-羟甲基))-苯氧基(Rink接头)、4-(4-(羟甲基)-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB接头)、三苯甲基和2-氯三苯甲基。优选地，支持物衍生自与最优选地1-5%二乙烯基苯交联并借助2-氯三苯甲基接头官能化的聚苯乙烯。
当作为平行阵列合成实施时，本发明的方法可以有利地如下文所述那样实施，但是本领域技术人员将立即清楚在需要合成本发明的一种单一化合物的情况下，将必需如何调整这些方法。
与待通过平行方法合成的化合物的总数相等的许多反应容器充以25至1000mg，优选地60mg适宜的官能化固相支持物，优选地1至 3%交联聚苯乙烯或Tentagel树脂。
待使用的溶剂必须能够溶胀该树脂并且包括但不限于二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二噁烷、甲苯、四氢呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、三氟乙醇(TFE)、异丙醇等。含有极性溶剂作为至少一种组分的溶剂混合物(例如20%TFE/DCM、35%THF/NMP)有益于确保结合树脂的肽链的高度反应性和溶剂化(G.B.Fields,C.G.Fields,J.Am.Chem.Soc.1991,113,4202-4207)。
随着开发出在温和酸性条件下释放C端羧酸基，不影响酸不稳定性基团保护侧链中官能团的多种接头，已经在合成受保护的肽片段方面取得巨大进展。2-甲氧基-4-羟基苄醇衍生的接头(接头，Mergler等人,Tetrahedron Lett.1988,294005-4008)是用稀释的三氟乙酸(DCM中的0.5-1%TFA)可切割的并且对肽合成期间的Fmoc去保护条件稳定，基于Boc/tBu的额外保护基与这种保护方案相容。适于本发明方法的其他接头包括过于酸不稳定性4-(2,4-二甲氧基-羟甲基)-苯氧基接头(Rink接头，H.Rink,TetrahedronLett.1987,28,3787-3790)，其中肽的移除需要DCM中的10%乙酸或DCM中的0.2%三氟乙酸；4-(4-羟甲基-3-甲氧基酚)丁酸衍生的接头(HMPB-接头，Florsheimer和Riniker,Peptides1991,1990131)，该接头也用1%TFA/DCM切割以产生含有全部酸不稳定性侧链保护基的肽片段；和，此外，2-氯三苯甲基氯接头(Barlos等人,Tetrahedron Lett.1989,30,3943-3946)，该接头允许使用冰醋酸/三氟乙醇/DCM(1:2:7)混合物30分钟使肽脱离。
氨基酸的适合保护基及其残基的适合保护基例如分别是
-对于氨基(如存在，例如也存在于赖氨酸或鸟氨酸的侧链中)
Cbz 苄氧羰基
Boc 叔丁氧羰基
Fmoc 9-芴基甲氧羰基
Alloc 烯丙氧羰基
Teoc 三甲基甲硅烷基乙氧羰基
Tcc 三氯乙氧羰基
Nps 邻-硝基苯基磺酰；
Trt 三苯甲基(triphenymethyl)或三苯甲基(trityl)
ivDde (4,4-二甲基-2,6-二氧杂环己-1-亚基)-3-甲基丁基
-对于用醇组分转化成酯的羧基(如存在，例如也存在于谷氨酸的侧链中)
tBu叔丁基
Bn苄基
Me甲基
Ph苯基
Pac苯甲酰甲基
烯丙基
Tse三甲基甲硅烷基乙基
Tce三氯乙基；
ivDde(4,4-二甲基-2,6-氧杂环己-1-亚基)-3-甲基丁基
-对于胍基(如存在，例如存在于精氨酸的侧链中)
Pmc2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基
Ts甲苯磺酰基(即，对甲苯磺酰基)
Cbz苄氧羰基
Pbf五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
-对于羟基(如存在，例如存在于丝氨酸的侧链中)
tBu 叔丁基
Bn 苄基
Trt 三苯甲基
Alloc 烯丙氧羰基
-并且对于巯基(如存在，例如存在于半胱氨酸的侧链中)
Acm 乙酰氨基甲基
tBu 叔丁基
Bn 苄基
Trt 三苯甲基
Mtr 4-甲氧三苯甲基。
优选地使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸衍生物作为构建本发明β-发夹环模拟物的结构单元。对于去保护，即，切去Fmoc基团，可以使用DMF中的20%哌啶或DMF中的2%DBU/2%哌啶。
本领域已知异丙基与9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸衍生物的携带氨基的侧链连接，以形成(Fmoc)保护的氨基酸衍生物的异丙基化的携带氨基的侧链。用于引入异丙基的过程可以例如通过还原性烷基化，例如在合适的还原剂如三乙酰氧基硼氢化钠存在下用丙酮处理氨基酸结构单元(例如Orn)的携氨基侧链的氨基来完成。可以通过随后在碱如碳酸氢钠存在下与二碳酸二叔丁酯反应引入适用于(Fmoc)保护的氨基酸衍生物的异丙基化带氨基的侧链的保护基，例如Boc。
基于最初称入反应管中的官能化固相支持物的毫当量/克(meq/g)载量，反应物(即氨基酸衍生物)的量通常1至20当量(通常，对于聚苯乙烯树脂是0.1至2.85meq/g)。如果需要，可以使用额外当量的反应物，以驱动反应以合理时间完成。优选的工作站(然而，不限于此)是Labsource's Combi-chem工作站、Protein Technologies'Symphony和MultiSynTech's-Syro合成仪，后者在从固相支持物脱下完全保护的线性肽的过程期间额外地配备转移单元和储盒。全部合成仪均能够提供受控环境，例如，反应可以在与室温不同的温度以及如果需要在惰性气氛下完成。
酰胺键形成需要活化α-羧基用于酰化步骤。当这种活化借助常使用的碳二亚胺如二环己基碳二亚胺(DCC，Sheehan和Hess,J.Am.Chem.Soc.1955,77,1067-1068)或二异丙基碳二亚胺(DIC，Sarantakis等人Biochem.Biophys.Res.Commun.1976,73,336-342)实施时，所产生的二环己基脲和相应产生的二异丙基脲是不可溶的，并且分别可溶解于通常使用的溶剂中。在碳二亚胺方法的变例中，包含1-羟基苯并三唑(HOBt，和Geiger,Chem.Ber.1970,103,788-798)作为偶联混合物的添加剂。HOBt阻止脱水、抑制活化氨基酸的外消旋化并充当改善缓慢偶联反应的催化剂。已经使用某些磷鎓试剂作为直接偶联试剂，如苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP，Castro等人,TetrahedronLett.1975,14,1219-1222;Synthesis1976,751-752)，或苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基-磷鎓六氟磷酸盐(Py-BOP，Coste等人,Tetrahedron Lett.1990,31,205-208)，或2-(1H-苯并三唑-1-基)1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)，或六氟磷酸盐(HBTU，Knorr等人,Tetrahedron Lett.1989,30,1927-1930)；这些磷鎓试剂也适合于用保护的氨基酸衍生物原位形成HOBt酯。最近，也已经使用酸二苯酯(DPPA)或O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟硼酸盐(TATU)或O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)/7-氮杂-1-羟基苯并三唑(HOAt，Carpino等人,TetrahedronLett.1994,35,2279-2281)或-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基-)-N,N,N',N'-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟硼酸盐(TCTU)或六氟磷酸盐(HCTU，Marder,Shivo和Albericio:HCTU and TCTU:NewCoupling Reagents:Development and Industrial Applications,PosterPresentation,Gordon Conference February2002)作为偶联试剂，以及1,1,3,3-双(亚甲基)氯脲鎓六氟磷酸盐(PyCIU，尤其用于偶联N-甲基化氨基酸，J.Coste,E.Frérot,P.Jouin,B.Castro,Tetrahedron Lett.1991,32,1967)或五氟苯基双苯基-次膦酸盐(S.Chen,J.Xu,Tetrahedron Lett.1991,32,6711)。
归因于近乎定量性偶联反应是重要的事实，需要具有反应结束的 实验证据。可以在每个偶联步骤后容易地和迅速进行茚三酮试验(Kaiser等人,Anal.Biochemistry1970,34,595)，其中针对树脂结合肽的等分试样的阳性比色反应定性表示伯胺存在。当用碱释放Fmoc发色团时，Fmoc化学允许Fmoc发色团的分光光度检测(Meienhofer等人,Int.J.Peptide Protein Res.1979,13,35-42)。
通过采用以下两种方法之一反复暴露于纯溶剂，将每个反应容器内部树脂结合的中间体洗涤至不含过量的遗留试剂、溶剂和副产物：
1)将反应容器填充以溶剂(优选地5mL)，搅拌5至300分钟，优选地15分钟，并排干以驱出溶剂；
2)将反应容器填充以溶剂(优选地5mL)并排入接收器皿如试管或小瓶中。
上述两种洗涤过程均重复至多到约50次(优选地约10次)，通过多种方法，如TLC、GC或视检洗出液，监测移除试剂、溶剂和副产物的效率。
随移除过量试剂、副产物和溶剂后，重复树脂结合的化合物与试剂在反应管内部反应的上述过程，伴以连续转化，直至已经获得树脂结合的充分保护的最终线性肽。
在这种充分保护的线性肽从固相支持物脱离之前的，在Cys4和Cys11之间的二硫键可能形成。
为了形成二硫键，优选地，将10当量的碘溶液施加于DMF中或在CH2Cl2/MeOH混合物中1.5小时，其中在滤去碘溶液后采用新鲜的碘溶液，将前述过程重复另外3小时，或施加于DMSO和乙酸溶液的混合物中，其中所述混合物用5%NaHCO3缓冲至pH5-6持续4小时，或通过搅拌施加于用氢氧化铵溶液调节至pH8后的水中持续24小时，或施加于NMP和三正丁基膦(优选地50当量)的溶液中。
可选地，在Cys4和Cys11之间形成二硫键可以在如下文所述的工序方法2)之后通过下方式实施：在按体积计含有至多到15%DMSO的水中搅拌充分去保护并环化的粗制肽24小时，所述的水用5%NaHCO3 缓冲至pH5-6，或用乙酸铵缓冲至pH7-8或用氢氧化铵调节至pH8。在蒸发环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-5Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)至干燥后，获得Cys4和Cys11之间的二硫键作为终产物。
通过使加载的树脂暴露用于裂解的试剂溶液(优选地3至5mL)实现从固相支持物脱离充分保护的线性肽。如上文所述实施温度控制、搅拌和反应监测。借助转移装置，反应容器与含有储管以高效收集已切割产物溶液的储盒连接。留在反应容器中的树脂随后如上所述用3至5mL适宜溶剂洗涤2至5次以提取(洗脱)尽可能多的脱离产物。将如此获得的产物溶液合并，小心避免交叉混合。随后根据需要操作各份溶液/提取物以分离最终化合物。常见的操作包括但不限于蒸发、浓缩、液体/液体提取、酸化、碱化、中和或溶液中的额外反应。
将含有充分保护的线性肽衍生物的溶液蒸发，其中所述线性肽衍生物已经从固相支持物切下并用碱中和。随后在溶液中使用溶剂如DCM、DMF、二噁烷、THF等实现环化。前文提到的多种偶联试剂可以用于环化。环化的持续时间是约6-48小时，优选地约16小时。跟踪反应进程，例如通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)。随后通过蒸发除去溶剂，充分保护的环状肽衍生物溶解于不可溶混于水的溶剂(如DCM)中，并且该溶液用水或水-可溶混溶剂的混合物提取，以便除去任何过量的偶联试剂。
最后，将充分保护的肽衍生物用95%TFA、2.5%H2O、2.5%TIS或用于实现裂解保护基的另一种清除剂组合处理。裂解反应时间常见地是30分钟至12小时，优选地约2.5小时。
可选地，可以在玻璃容器中手工地实现充分保护的肽从固相支持物的脱离和彻底去保护。
在完全去保护后，例如，以下方法可以用于进一步工序：
1)将挥发性物质蒸发至干燥，并且将粗制肽溶解于水中的20%AcOH内并用异丙基醚或适用的其他溶剂提取。将水层收集并蒸发 s至干燥，并且获得充分去保护的肽，二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)，作为终产物；
2)在真空下浓缩去保护混合物。在二乙醚中、优选地在0℃沉淀充分去保护的肽后，将固体洗涤至多约10次，优选地3次，干燥，并且如果已经如本文以上所述在固相支持物上在Cys4和Cys11之间形成二硫键，则获得充分去保护的肽，即二硫键在Cys4和Cys11之间的环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)，作为终产物。
如果已经遵循上文提到在溶液中引入一个或多个异丙基的正交保护基策略，则氨基酸残基侧链的全部氨基仍受非酸不稳定性保护基保护，而以前受酸不稳定性保护基保护的氨基氨基酸残基已经在合成级联的这个阶段释放。因此，如果需要，可以偶联异丙基。优选地，ivDde等是携带氨基的侧链的酸稳定性保护基，所述侧链在异丙基与释放的氨基偶联期间保持未修饰。这种偶联可以使用丙酮在适合的还原剂例如氰基硼氢化钠存在下，利用例如还原性烷基化完成。因而，例如，将肽溶解于含有乙酸(0.2M)的MeOH(4.4mM)中。在添加过量丙酮(780当量)后，将反应混合物用氰基硼氢化钠在MeOH中的溶液(0.6M；1.3当量/需要引入的异丙基)完成并且在室温剧烈振摇。在LC-MS监测的转化完成后，添加水并蒸发溶剂。将含有肽的残余固体溶解于DMF(0.01M)中并且将5%肼在DMF中的溶液用来最终除去ivDde保护基。
如稍早提到，如果需要，此后可以是将如此获得的充分去保护的环状产物转化成可药用盐或将如此获得的药学上可接受或不可接受的盐转化成相应的游离化合物或转化成不同的可药用盐。这些操作的任一者可以通过本领域熟知的方法实施。
本发明的β-发夹肽模拟物可以在广泛类型的应用中使用，以便预防健康个体中的HIV感染或延缓并制止感染患者中的病毒进展；或用于其中癌症由CXCR4受体活性介导或因其产生的情况；或用于其中免 疫学疾病由CXCR4受体活性介导或因其产生的情况；或这些β-发夹肽模拟物可以用来治疗免疫抑制；或它们可以在外周血干细胞的血浆分离置换采集期间使用和/或用作诱导干细胞动员以调节组织修复的物质。
本发明的β-发夹肽模拟物可以原样施用或可以作为适宜制剂连同本领域熟知的载体、稀释剂或赋形剂一起施用。
当用来治疗或预防HIV感染或癌症如乳腺癌、脑癌、前列腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、生殖细胞肿瘤、眼部癌症、多发性骨髓瘤、胰腺癌、胃癌、横纹肌肉瘤、黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤；转移、血管生成和造血组织；或炎性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、超敏反应肺病、过敏性肺炎、嗜酸性粒细胞性肺炎、迟发型超敏反应、间质性肺病(ILD)、特发性肺纤维化、与类风湿性关节炎相关的ILD、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、全身性硬化症、Sjogren综合征、全身过敏或超敏反应应答、药物变态反应、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、动脉粥样硬化、重症肌无力、青少年发作糖尿病、肾小球肾炎、自身免疫甲状腺炎、移植排斥，包括同种异体移植排斥或移植物抗宿主病、炎性肠病和炎性皮肤病；或用来治疗眼病如青光眼、糖尿病性视网膜病变和年龄相关黄斑变性；或用来治疗治疗局部缺血性发作、全脑性缺血、心肌梗死、后肢局部缺血或外周局部缺血；或用来治疗肝、肾或肺的损伤；或用来治疗免疫抑制，包括由化疗、放疗或移植物/移植排异引起的免疫抑制时，本发明的β-发夹肽模拟物可以单独施用、作为几种β-发夹肽模拟物的混合物、与其他抗HIV剂或抗微生物剂或抗癌药或抗炎药组合、或与其他药物活性物质组合施用。本发明的β-发夹肽模拟物可以其本身或作为药物组合物施用。
包含本发明的β-发夹肽模拟物的药物组合物可以通过常规混合、溶解、造粒、衣片剂制造、粉碎、乳化、封胶、夹持(entrapping)或冻 干方法制造。药物组合物可以使用一种或多种促进活性β-发夹肽模拟物加工成制品的生理可接受载体、稀释剂、赋形剂或赋形剂以常规方式配制，其中可以药学地使用所述制品。正确的制剂取决于所选的施用方法。
对于局部施用，本发明的β-发夹肽模拟物可以配制为溶液、凝胶剂、油膏剂、乳膏剂、混悬剂、散剂等，如本领域公知。
全身性制剂包括设计成通过注射例如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些，以及设计成透皮、透粘膜、口服或肺施用的那些。
对于注射剂，本发明的β-发夹肽模拟物可以在充足的溶液中、优选地在生理相容性缓冲液如Hink溶液、Ringer溶液或生理盐水中配制。所述溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，本发明的β-发夹肽模拟物可以处于粉末状形式，以便在使用前与合适的溶媒(例如无菌无热原的水)组合。
对于透黏膜施用，在制剂中使用适合待渗透的屏障的渗透剂，如本领域已知。
对于口服施用，该化合物可以通过将本发明的活性β-发夹肽模拟物与本领域熟知的可药用载体组合来轻易地配制。这类载体使本发明的β-发夹肽模拟物可能配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂、散剂等，以便由待治疗的患者口服摄入。对于口服制剂，例如散剂、胶囊剂和片剂，合适的赋形剂包括填料如糖，如乳糖、蔗糖、甘露糖和山梨糖；纤维素制品如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶，甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；造粒剂和粘合剂。如果需要，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。如果需要，可以使用标准技术将固体剂型进行糖包衣或肠溶包衣。
对于口服液体制品例如混悬剂、酏剂和溶液剂，合适的载体、赋 形剂或稀释剂包括水、乙二醇、油、醇等。另外，可以添加矫味剂、防腐剂、着色剂等。
对于颊部施用，组合物可以采取如常规那样配制的片剂、锭剂等形式。
化合物也可以与适宜的栓剂基料如可可脂或其他甘油酯一起配制于直肠或阴道组合物如栓剂中。
除上文描述的制剂之外，本发明的β-发夹肽模拟物也可以配制为长效制剂。这种长效制剂可以通过(例如皮下或肌内)埋植或通过肌内注射施用。为制造这类长效制剂，本发明的β-发夹肽模拟物可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性盐。
此外，可以使用其他药物递送系统，如本领域熟知的脂质体和乳液。也可以使用某些有机溶剂如二甲基亚砜。额外地，本发明的β-发夹肽模拟物可以使用持续释放系统(如含有治疗剂的固体聚合物的半透性基质(例如用于涂覆的支架))递送。各种持续释放材料已经是确立的并且是本领域技术人员熟知的。取决于它们的化学本质，持续释放胶囊剂可以释放所述化合物持续几周直至超过100天。根据治疗剂的化学本质和生物学稳定性，可以使用额外的蛋白质稳定化策略。
由于本发明的β-发夹肽模拟物含有带电荷残基，因此它们可以原样或作为可药用盐包括于前述任一种制剂中。可药用盐倾向于比相应的游离形式更多可溶于含水溶剂和其他质子溶剂中。特别合适的可药用盐包括与以下酸的盐：羧酸、膦酸、磺酸和氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、乙醇酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、氨基酸、如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己烷羧酸、金刚烷羧酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、酞酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲磺酸或乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、苯磺酸、2-苯磺酸、1,5-萘二磺酸、2-、3-或4-甲基苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基或N-丙基氨基磺酸 和其他有机质子酸，如抗坏血酸。合适的无机酸是例如氢卤酸(如氢氯酸)、硫酸和磷酸。
本发明的β-发夹肽模拟物或其组合物通常将以有效实现预期目的量使用。应当理解所用的量将取决于具体的应用。
对于局部施用以治疗或预防HIV感染，治疗性有效剂量可以使用例如实施例中提供的体外测定法确定。治疗可以在HIV感染明显时施加，或甚至当它不明显时也可以施加。普通技术人员将能够在无需过多实验的情况下确定治疗局部HIV感染的治疗有效量。
对于全身性施用，可以最初从体外测定法初步估计治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制某个剂量以实现包括如细胞培养物中所测定的IC50的循环β-发夹肽模拟物浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。
也可以使用本领域熟知的技术，从体内数据(如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据容易地优化向人类的施用。可以调节单独作为抗HIV剂应用的剂量数量以提供足以维持治疗效果的本发明β-发夹肽模拟物的血浆水平。治疗性有效的血清水平可以通过每日施用多个剂量实现。
在局部施用或选择性摄入的情况下，本发明β-发夹肽模拟物的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。本领域普通技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
当然，施用的β-发夹肽模拟物的量将取决于正在治疗的受试者、该受试者的体重、疾患的严重性、施用方式和处方医师的判断。
在感染可检测或甚至当它们不可检测时，可以间断地重复抗HIV疗法。该疗法可以单独地或与其他药物(如例如其他抗HIV剂或抗癌药或其他抗微生物剂)组合时提供。
正常情况下，本文所述的β-发夹肽模拟物的治疗有效剂量将在不造成明显毒性的情况下提供治疗益处。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法确定本发明β-发夹肽模拟物的毒性，例如，通过确 定LD50(对50%群体致死的剂量)和LD100(对100%群体致死的剂量)。毒性效果和治疗效果之间的剂量比是治疗指数。优选显示高治疗指数的化合物。从这些细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可以用于形成在人类中使用时无毒的剂量范围。本发明的β-发夹肽模拟物的剂量优选地处于在毒性低或无毒情况下包括有效剂量的一系列循环浓度内。该剂量可以根据所用的剂型和所用的施用途径在这个范围内变动。确切制剂、施用途径和剂量可以由各位医师就患者状况来选择(见，例如Fingl等人.1975,In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,第1章,第1页)。
本发明也可以包括化合物，其与二硫键在Cys4和Cys11之间的以下通式的化合物-环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)相同，差异在于一个或多个原子由具有与自然界中通常存在的原子质量或质量数不同的原子质量数或质量的原子替换，例如2H(D)、3H、11C、14C、129I等富集的化合物。将这些同位素类似物和它们药用盐和制剂视为在治疗和/或诊断中可用的物质，例如，但不限于，其中精细调节体内半寿期可能导致优化剂量方案的情况。
以下实施例说明本发明，但是无论如何将不得解释为限制其范围。
实施例
1.肽合成
第一保护的氨基酸残基与树脂的偶联
将1g(1.4mMol)2-氯三苯甲基氯树脂(1.4mMol/g；100-200目，共聚(苯乙烯-1%DVB)聚合物母体；Barlos等人,Tetrahedron Lett.1989,30,3943-3946)填充至干燥的烧瓶中。使树脂悬浮于CH2Cl2(5mL)中并且允许在室温在恒定振摇下溶胀30分钟。添加与960μl(4当量)二异丙 基乙胺(DIEA)混合的第一适当保护的氨基酸残基在CH2Cl2(5mL)中的0.98mMol(0.7当量)溶液(见下文)。在25℃将反应混合物振摇4小时后，将树脂滤出并且用CH2Cl2(1x)、DMF(1x)和CH2Cl2(1x)依次洗涤。将CH2Cl2/MeOH/DIEA(17/2/1，10 mL)的溶液添加至树脂并且将悬液振摇30分钟。在过滤后、将树脂按以下顺序用CH2Cl2(1x)、DMF(1x)、CH2Cl2(1x)、MeOH(1x)、CH2Cl2(1x)、MeOH(1x)、CH2Cl2(2x)、Et2O(2x)洗涤并且在真空下干燥6小时。
载量通常地是0.6-0.7 mMol/g。
制备以下预加载的树脂：Fmoc-Pro-2-氯三苯甲基树脂。
使用Syro-肽合成仪(MultiSynTech)使用24-96个反应容器实施合成。在每个容器中，安置0.04 mMol以上树脂并且使得树脂在CH2Cl2和DMF中分别溶胀15分钟。将以下反应循环编程并实施：
将步骤4重复1次。
除非另外指出，否则氨基酸的最终偶联之后是通过采用上述反应循环的步骤1-3进行Fmoc去保护。
氨基酸结构单元合成
Fmoc-Orn(iPr,Boc)-OH的合成
通过在150mL THF(0.26M)中悬浮15.2g Fmoc-Orn-OH*HCl随后添加375mL丙酮(132当量)和20.6g三乙酰氧基硼氢化钠(2.5当量)，完成(2S)-Nα-芴基甲氧羰基-Nω,Nω-叔丁氧羰基-异丙基-2,5-二氨基戊酸的合成。将反应混合物搅拌2小时并且随后完成反应(通过LC-MS监测)。添加120mL饱和Na2CO3-溶液和10.2g Boc2O(1.2当量)。在搅拌过夜后，根据剩余的原料，将饱和Na2CO3溶液和Boc2O再次以两部分添加。在完成Boc引入后，添加己烷2次，分离，并且将水层用5NHClaq(pH=1)酸化并且此后用乙酸乙酯提取3次。最后，将合并的有机层用Na2SO4干燥并蒸发以获得作为白色泡沫的产物。
氨基酸结构单元Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH可以据此合成或可商业获得。
氨基酸结构单元Fmoc-Tyr(Me)-OH和Fmoc-DTyr(Me)-OH也是可商业获得的。
主链环化肽的环化和制备
充分保护的肽片段的裂解
在完成合成后，将树脂(0.04mMol)悬浮于1mL(0.13mMol，3.4当量)在CH2Cl2中的1%TFA(v/v)中3分钟，过滤，并且将滤液用1mL(0.58mMol，14.6当量)在CH2Cl2中的10%DIEA(v/v)中和。这个过程重复3次以确保裂解的完成。将滤液蒸发至干燥，并且通过使用含有95%三氟乙酸(TFA)、2.5%水和2.5%三异丙基硅烷(TIS)的裂解混合物，使产物的样品充分去保护，由反相-HPLC(C18柱)和ESI-MS分析以监测线性肽合成的效率。
线性肽的环化
将充分保护的线性肽(0.04mMol)溶解于DMF(4μMol/mL)中。随后添加30.4mg(0.08mMol，2当量)的HATU、10.9mg(0.08mMol，2 当量)的HOAt和28μl(0.16mMol，4当量)的DIEA，并将混合物在25℃涡旋混合16小时并且随后在高真空下浓缩。残余物在CH2Cl2和H2O/CH3CN(90/10:v/v)之间分配。将CH2Cl2相蒸发以产生充分保护的环状肽。
环状肽的充分去保护
将获得的环状肽溶解于3mL含有82.5%三氟乙酸(TFA)、5%水、5%茴香硫醚、5%苯酚和2.5%乙二硫醇(EDT)的裂解混合物中。允许混合物在25℃静置2.5小时并且随后在真空下浓缩。在0℃于二乙醚(Et2O)中沉淀充分去保护的环状肽后，将固体用Et2O洗涤两次并干燥。
二硫化物/β链键的形成和纯化
在充分去保护后，将粗制肽溶解于0.1M乙酸铵缓冲液中(1mg/1mL，pH=7-8)。添加DMSO(按体积计至多到5%)并且将该溶液振摇过夜。在蒸发后，通过制备性反相HPLC.纯化残余物。
在冻干后，产物作为白色粉末获得并且借助以下分析方法分析：使用AscentisExpress C18柱，50x3.0mm，(编号53811-U-Supelco)，采用以下溶剂A(H2O+0.1%TFA)和B(CH3CN+0.1%TFA)和梯度：0-0.05分钟：97%A，3%B；3.4分钟：33%A，67%B；3.41-3.65分钟：3%A，97%B；3.66-3.7分钟：97%A，3%B；流速(气体)=1.3ml/分钟；UV_Vis=220nm确定分析性HPLC停留时间(RT，以分钟计)。
实施例1：
起始树脂是如上文所述制备的Fmoc-Pro-O-2-氯三苯甲基树脂。最终在位置15向该树脂接枝DPro。在固相支持物上根据上文描述的程序按以下顺序合成线性肽：树脂-Pro16-DPro15-Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DPro7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr3-His2-Tyr1。在如上文所述最终使Fmoc去保护后，将肽从树脂切下，环化，去保护并且在如上文所述形成二硫化物β-链键 后，如上文所示那样纯化。
使用如上文描述的分析方法确定HPLC停留时间(分钟)(UV-纯度[制备性HPLC后]：95%；RT：1.56；[M+3H]/3=685.7)。
实施例2：
起始树脂时是上文所述制备的Fmoc-Pro-O-2-氯三苯甲基树脂。最终在位置15向该树脂接枝DPro。在固相支持物上根据上文描述的程序按以下顺序合成线性肽：树脂-Pro16-DPro15-Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DPro7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr(Me)3-His2-Tyr1。在如上文所述最终使Fmoc去保护后，将肽从树脂切下，环化，去保护并且在如上文所述形成二硫化物β-链键后，如上文所示那样纯化。
使用如上文描述的分析方法确定HPLC停留时间(分钟)(UV-纯度[制备性HPLC后]：95%；RT：1.7；[M+3H]/3=690.4)。
实施例3：
起始树脂是如上文所述制备的Fmoc-Pro-O-2-氯三苯甲基树脂。最终在位置15向该树脂接枝DPro。在固相支持物上根据上文描述的程序按以下顺序合成线性肽：
树脂-Pro16-DPro15-Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Dab8-DTyr7-Ala6-Ser5-Cys4-Ala3-His2-Tyr1。在如上文所述最终使Fmoc去保护后，将肽从树脂切下，环化，去保护并且在如上文所述形成二硫化物β-链键后，如上文所示那样纯化。
使用如上文描述的分析方法确定HPLC停留时间(分钟)(UV-纯度[制备性HPLC后]：95%；RT：1.57；[M+3H]/3=658.3)。
实施例4：
起始树脂时是上文所述制备的Fmoc-Pro-O-2-氯三苯甲基树脂。最终在位置15向该树脂接枝DPro。在固相支持物上根据上文描述的程序按以下顺序合成线性肽：树脂-Pro16-DPro15-Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DTyr(Me)7-Ala6-Ser5-Cys4-Ala3-His2-Tyr1。在如上文所述最终使Fmoc去保护后，将肽从树脂切下，环化，去保护并且在如上文所述形成二硫化物β-链键后，如上文所示那样纯化。
使用如上文描述的分析方法确定HPLC停留时间(分钟)(UV-纯度[制备性HPLC后]：95%；RT：1.70；[M+3H]/3=681.7)。
实施例5：
起始树脂是如上文所述制备的Fmoc-Pro-O-2-氯三苯甲基树脂。最终在位置15向该树脂接枝DPro。在固相支持物上根据上文描述的程序按以下顺序合成线性肽：树脂-Pro16-DPro15-Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DTyr7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr3-His2-Tyr1。在如上文所述最终使Fmoc去保护后，将肽从树脂切下，环化，去保护并且在如上文所述形成二硫化物β-链键后，如上文所示那样纯化。
使用如上文描述的分析方法确定HPLC停留时间(分钟)(UV-纯度[制备性HPLC后]：95%；RT：1.60；[M+3H]/3=707.4)。
实施例6：
起始树脂是如上文所述制备的Fmoc-Pro-O-2-氯三苯甲基树脂。最终在位置15向该树脂接枝DPro。在固相支持物上根据上文描述的程序按以下顺序合成线性肽：树脂-Pro16-DPro15-Lys(iPr)14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn(iPr)8-DTyr(Me)7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr(Me)3-His2-Tyr1。在如上文所述最终使Fmoc去保护后，将肽从树脂切下，环化，去保护并且在如上文所述形成二硫 化物β-链键后，如上文所示那样纯化。
使用如上文描述的分析方法确定HPLC停留时间(分钟)(UV-纯度[制备性HPLC后]：95%；RT：1.83；[M+3H]/3=717.0)。
2.生物学方法
2.1肽的制备
将冻干的肽在微天平(Mettler MT5)上称重并溶解于DMSO中至终浓度10mM。母液保存在+4℃，避光。除非另外说明，否则生物学测定法在具有小于1%DMSO的分析条件下实施。
2.2细胞培养
在外加10%FBS和青霉素/链霉素的RPMI1640中培养Namalwa细胞(天然表达CXCR4的非贴壁细胞，ATCC CRL-1432)。在外加10%FBS、青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640中维持HELA细胞。在含有4500mg/ml葡萄糖的DMEM培养基中培育Cos-7细胞，所述DMEM培养基补充有10%FCS、青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺。全部细胞系均在37℃在5%CO2培育。细胞培养基、培养基补充物、PBS-缓冲液、Hepes、抗生素/抗真菌剂、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和血清购自Gibco(Pailsey，UK)。全部精细化学品由MERCK(Darmstadt，德国)供应。
2.3趋化测定(细胞移行测定)
使用改良Boyden室趋化系统(ChemoTx；Neuroprobe)测量Namalwa细胞(ATCC CRL-1432)对间质细胞衍生因子1α(SDF-1)梯度的趋化反应。在这个系统中，每个孔的上室由聚碳酸酯膜(5μm孔径)与含有趋化剂SDF-1的下室分隔。该膜在充分覆盖每个下部孔的区域内的圆形区域由疏水罩围绕以保留细胞悬液处于该区域内部。通过以下方式准备该系统：用等分30μl趋化培养基(无酚红+0.5%BSA的RPMI1640)填充底部孔，所述趋化培养基包含肽的适宜连续稀释物或根本无 肽，与SDF-1(0.9nM)组合或不与该趋化剂组合。将膜安置在底部孔上方，并且将趋化培养基中的等分试样的50μl Namalwa细胞悬液(3.6x106个细胞/ml)递送到膜上表面的每个疏水限制区域上，其中所述趋化培养基与包含肽的适宜连续稀释物或根本无肽的趋化培养基预混合。允许细胞在37℃在5%CO2下移行至底部室持续5小时。在这个时间后，取出膜并且将其顶侧小心地擦拭并用PBS洗涤以消除未移行的细胞。使用“漏斗”适配器，将移行的细胞转移至96孔接收板，并且基于借助荧光染料结合作用而测量细胞DNA含量，通过使用CyQuantTMNF细胞增殖测定法(Invitrogen)确定细胞数目。遵循制造商的说明，将50μlCyQuantTM染料试剂/HBSS缓冲液(1/500[v/v])添加至上文提到的96孔接收板的每个孔。在室温孵育0.5小时后，密封平板并且通过使用Wallac1420VICTOR2TM平板读数仪(PerkinElmer)以485nm处激发和535nm处发射检测，测量每份样品的荧光强度。最后，通过使用对照将数据归一化，并且使用GraphPad PrismTM(GraphPad)，通过对平均化的数据点拟合对数曲线，确定IC50值。
2.4.细胞毒性测定
使用MTT还原测定法确定肽对HELA细胞(Acc57)和COS-7细胞(CRL-1651)的细胞毒性(T.Mossman,J.Immunol.Meth.1983,65,55-63；M.V.Berridge,A.S.Tan,Arch.Biochem.Biophys.1993,303,474-482)。简而言之，方法如下进行：将4000个HELA细胞/孔和3400个COS-7细胞/孔在96孔微量滴定平板中接种并在37℃在5%CO2培育24小时。此后，通过MTT还原确定时间零(Tz)(见下文)。弃去剩余孔的上清液，并且将新鲜培养基和连续稀释物中的化合物(12.5、25和50μM，三次重复；0μM，空白)吸入孔内。在37℃在5%CO2孵育细胞48小时后，再次抛弃上清液，并且添加100μl MTT试剂(分别是RPMI1640和DMEM中的0.5mg/ml)/孔。在37℃孵育2-4小时后，吸出培养基并对细胞加内标(100μl异丙醇/孔)。在595nm测量溶解的甲臜的吸光度(OD595肽)。对于每个浓度，从三次重复计算出平均数。生长百分比计算如下：(OD595肽-OD595Tz)/(OD595空白-OD595Tz) x100%。通过使用各浓度(50、25、12.5和0μM)、浓度、相应百分比和值50的趋势线函数(=趋势(C50:C0,%50:%0，50)，计算出每种肽的GI50(生长抑制)。
2.5.溶血
测试肽对人红细胞(hRBC)的溶血活性。将新鲜hRBC用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤4次并且以3000x g离心10分钟。将化合物(100μM)在37℃与20%hRBC(v/v)孵育1小时并且以300转/分钟振摇。红细胞终浓度是大约0.9x109个细胞/ml。通过在分别含有H2O中0.001%乙酸和2.5%Triton X-100的PBS存在下孵育hRBC，分别确定0%和100%细胞裂解的值。将样品离心，在PBS缓冲液中稀释上清液8倍并且在540nm测量光密度(OD)。100%溶解值(OD540H2O)产生大约0.5-1.0的OD540。溶血百分比计算如下：(OD540肽/OD540H2O)x100%。
2.6血浆稳定性
通过实施以下方法确定肽在人血和小鼠血浆中的稳定性：将346.5μL/深孔的融化的新鲜人血浆(Basler Blutspende-dienst)和小鼠血浆(Harlan Sera-Lab,UK)分别地用3.5μL/孔的溶解于DMSO/H2O(90/10[v/v]，1mM，三次重复)中的化合物内标并且在37℃温育。在t=0、15、30、60、120、240和1440分钟，将50μL等分试样转移至含有在乙腈中150μL/孔的2%甲酸的滤板孔内。在振摇2分钟后，通过真空过滤出现的悬液。将100μl每种滤液转移至丙烯微量滴定平板并且在N2下干燥。添加100μL/孔的水/乙腈、95/5(v/v)+0.2%甲酸使残留固体复水并且通过LC/MS分析如下：柱：Waters，XBridge C18，流动相：(A)水+0.1%甲酸和(B)乙腈/水，95/5(v/v)+0.1%甲酸，梯度：5%-100%；(B)在1.8分钟内，电喷雾电离，MRM检测(三充四极)。确定峰面积并且将三次重复值平均化。稳定性以t=0时初始值的百分比(tx/t0x100)表述。通过使用EXCEL(Microsoft Office2003)的趋势功能，确定T1/2。
2.7血浆蛋白结合作用
将495μL等分试样的人血浆(Basler Blutspendedienst)以及495μl等分试样的PBS置于聚丙烯平板(Greiner)的各个深孔中并各自用5μl1mM肽在90%DMSO中的溶液内标。以600转/分钟振摇平板2分钟后，将150μl等分试样的血浆/肽混合物一式三份转移至聚丙烯过滤平板(10kDa，Millipore)，而将150μL等分试样的PBS/肽混合物转移或至该过滤平板的各个孔(过滤的对照)或直接转移至中接收平板(Greiner)的各个孔(未过滤的对照)。由过滤平板和接收平板组成的平板叠层在37℃孵育1小时并且随后以3220g在15℃离心2小时。通过LC/MS如下分析接收平板中的滤液：柱：Waters，XBridge C18，流动相：(A)水+0.1%甲酸和(B)乙腈/水，95/5(v/v)+0.1%甲酸，梯度：5%-100%；(B)处于1.8分钟内，电喷雾电离，MRM检测(三充四极)。确定峰面积并且将三次重复值平均化。结合作用以过滤对照和未过滤对照的百分比由下式表述：100-(100xT1h/Tctr)。最后，计算这些值的平均数。
在2.3-2.7下描述的实验的结果在下表1、2、3和4中显示。
2.8.药物代谢动力学研究(PK)
对于实验1、实验2、实验3、实验4、实验5和实验6的化合物，在静脉内(i.v.)施用后进行药物代谢动力学研究。
使用从Charles River Laboratories Deutschland GmbH获得30克(±20%)体重的雄性CD-1小鼠。添加溶媒(磷酸盐缓冲盐水)以形成化合物的终浓度0.5mg/ml。体积是2mL/kg并且注射化合物以产生最终静脉内剂量1mg/kg。在轻度异氟烷麻醉下通过心脏穿刺以预定时间间距(5、15、30分钟和1、2、3、4小时)取出大约300-400μL血液并且添加至肝素化管。使血浆在离心时与沉淀的细胞分离并且在HPLC-MS分析之前冷冻在-80℃。
血浆校正样品和血浆研究样品的制备
将未处理动物的50μl等分试样的小鼠血浆(“空白”小鼠血浆)各自 用已知量的化合物实验1、实验2、实验3、实验4、实验5和实验6内标，以便获得针对范围1-4000ng/ml的每种化合物的10个血浆校正样品。使用50μl等分试样的来自未处理动物的每份小鼠血浆作为血浆研究样品。
血浆校正样品和血浆研究样品的提取
全部血浆样品均用适宜的内标物内标并用含有2%甲酸的乙腈提取。将上清液在氮气下蒸发至干燥并且将剩余的固体在水/乙腈95/5(v/v)+0.2%甲酸中复水。
LC-MS/MS-分析
随后使用以下条件，通过反相色谱法分析提取物(Acquity BEHC18，100x2.1mm，1.7μm柱，Waters用于实验1和Acquity HSS C18SB，100x2.1mm，1.8μm柱，Waters用于实验2、实验3、实验4、实验5和实验6)：实验1，流动相：(A)水/乙腈95/5(v/v)+0.1%甲酸，(B)乙腈/水95/5(v/v)+0.1%甲酸，梯度：对于实验11%(B)0-0.1分钟，15%(B)0.1-2.5分钟，并且对于实验2、实验3、实验4、实验5和实验6，1%(B)0-0.1分钟，40%(B)0.1-2.5分钟。通过质谱法进行检测和定量，电喷雾界面处于正离子模式并使分析物选择性片段化(4000QTrap质谱仪，AB Sciex)。
药物代谢动力学评价
使用单室模型分析，通过WinNonLinTM软件第5.3版(Pharsight-ACertaraTM公司，Moutain View，CA94041USA)计算PK参数。通过该模型对实验数据的最小二乘拟合确定PK参数。
在2.8中描述的实验的结果在下表5a和5b中显示。
2.9.借助维持剂量速率(输注速率)计算载药量
遵循药物代谢动力学中的基本原理，计算包含本发明肽的植入物的载药量(还见J.Gabrielsson,D.Weiner,"Pharmacokinetics and Pharmaco-dynamics Data Analysis:Concepts and Applications",第4版,Swedish Pharmaceutical Press,Stockholm,Sweden,2006)，从而维 持剂量速率(输注速率，Rin)可以定义为下述速率，其中药物将以所述速率施用以达到某剂量在血浆中的稳态。维持剂量速率可以表述使用相关性Rin[g/(h*kg)]=CLiv[L/(h*kg)]x Css,eff[g/l]，其中CLiv是清除率(静脉内施用)并且Css,eff是考虑功效余量A时血浆中处于稳态的药物的有效浓度：Css,eff[g/L]=A x(IC50/fu)x MW[(mol/L)*(g/mol)]。
因此，载入植入物中的某药物的总量(其提供具有某个体重的受试者中该药物在血浆中持续某段时间的恒定有效浓度)可以通过采用以下相关性来计算：
药物载量[g/受试者]=Rin[g/(h*kg)]x持续期[h]x BW[kg/受试者]。
在2.9中描述的计算的结果在下表6中显示并且基于表1、4和5b中给出的数据。其他前提条件是功效余量A=3、研究持续期为672小时(28日)和人类受试者体重为70kg。主要影响肽清除率的肾小球过滤率(GFR)高度依赖于物种。通常而言，与840mL/(h*kg)的小鼠GFR相比，人类GFR平均是107mL/(h*kg)。因此，在上述的相关性中使用之前，将表5b中所示的CLiv-小鼠值以异速增长方式定标（allometrically scaled）至107mL/(h*kg)/840mL/(h*kg)=0.127。
3.0.小鼠中的HSC动员
对于实验1和实验2的化合物，进行HSC动员研究，其由评估给药后最大动员时间的成时间-反应研究和后续剂量-反应研究组成。
时间-反应研究
雄性C57BI/6小鼠(Janvier，法国；对于实验1，n=5；对于实验2，n=3)分别接受实验1和实验2的腹膜内快速浓注注射剂(5mg/kg)，其溶解于含有0.9%NaCl的10μl水/克小鼠体重中。在施用后的时间点0、0.5、1、2、4、6和8小时，从颊囊抽取血液至EDTA涂覆的管中。通过进行如下文描述的CFU-C测定法，确定培养计数中的集落形成单位(CFU-C计数)。在表7a和7b中显示实验1和实验2的时间-反应研究的结果。
剂量-反应研究
雄性C57BI/6小鼠(Janvier，法国；对于实验1，每个剂量组n=5；对于实验2，每个剂量组n=3)分别以0.5、1.5、5和15mg/kg的剂量接受实验1和实验2的腹膜内快速浓注注射剂(化合物溶解于含有0.9%NaCl的10μl水/克小鼠体重中)。如上文所述，分别在实验1(4小时)和实验2(2小时)的最大动员时采集血液。在表8a和8b中显示实验1和实验2的剂量-反应研究的结果。
CFU-C测定
通过在标准半固体祖先细胞培养基中培养裂解的外周血的等分试样，确定CFU-C计数。简言之，将限定量的血液用含有0.5%牛血清白蛋白的PBS缓冲液洗涤，随后是在低渗性NH4Cl缓冲液(Sigma)中裂解红细胞和第二个洗涤步骤。将细胞沉淀物重悬于含有10%FCS的DMEM中，悬浮于2mL市售的充满细胞因子的用于鼠细胞的甲基纤维培养基(Cell Systems,美国)中，并且一式三份铺种于35mm细胞培养皿中。在标准条件下(20%O2，饱和湿度，5%CO2，37℃)孵育7-8日，评定CFU-C。使用自动化血液计数仪(DrewScientific)分析外周血细胞性质。
Log10剂量-反应曲线和ED50
分别地在图1中显示如表8a和8b中所示，基于剂量1.5、5和15mg/kg的CFU/mL值的实验1和实验2的log10剂量-反应曲线，并且使用GraphPad Prism第5.03版中的S型剂量-反应拟合功能拟合所述曲线。考虑两种化合物的曲线推进，剂量-反应限于4000CFU/mL的最大反应。表9中所示的ED50值因此对应于2000CFU/mL的反应。 表1
实验 IC50[nM]±SD，CXCR4受体
1 0.42±0.1
2 0.69±0.43
3 0.11±0.01
4 0.18±0.09
5 0.43±0.24
6 0.09±0.09
表2
表3
表4
实验 血浆蛋白结合[%] 未结合的部分，fu
1 30 0.7
2 48 0.52
3 48 0.52
4 56 0.44
5 54 0.46
6 63 0.37
表5a
表5b
静脉内途径 实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6
剂量[mg/kg] 1 1 1 1 1 1
Vdis[mL/kg] 547 635 762 607 1039 2975
CL[mL/h/kg] 868 659 1113 744 836 2446
AUC0-∞[ng*h/mL] 1151 1518 898 1345 1196 409
Cmax[ng/ml] 1829 1575 1313 1615 1313 686
半寿期[小时] 0.4 0.7 0.5 0.6 0.9 0.8
表6
表7a
表7b
表8a
表8b
表9
ED50[mg/kg] 95％置信区间
实验1 1.76 0.57-5.39
实验2 2.38 1.15-4.89

Claims (17)

1.一种处于游离形式或处于可药用盐形式的具有下式的由16个氨基酸残基产生的主链环化肽化合物，
环(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) (I)，
其中
Xaa3是Ala；Tyr或Tyr(Me)，
Tyr(Me)是(2S)-2-氨基-(4-甲氧苯基)-3-丙酸，
Xaa7是DTyr；DTyr(Me)；或DPro，
DTyr(Me)是(2R)-2-氨基-(4-甲氧苯基)-3-丙酸，或，
Xaa8是Dab或Orn(iPr)，
Dab是(2S)-2,4-二氨基丁酸，
Orn(iPr)是(2S)-Nω-异丙基-2,5-二氨基戊酸，
Xaa13是Gln或Glu，
Xaa14是Lys(iPr)，
Lys(iPr)是(2S)-Nω-异丙基-2,6-二氨基己酸，
没有明确指明为D-氨基酸残基的全部氨基酸残基均为L-氨基酸残基，并且
两个L-半胱氨酸残基Cys4和Cys11中的两个-SH基由1个-S-S-基替换。
2.根据权利要求1所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa13是Gln。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa3是Tyr或Tyr(Me)，Xaa7是DPro，Xaa8是Orn(iPr)并且Xaa13是Gln。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa3是Ala，Xaa7是DTyr，Xaa8是Dab，并且Xaa13是Gln。
5.根据权利要求1或2所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa3是Tyr，Xaa7是DPro，Xaa8是Orn(iPr)并且Xaa13是Gln。
6.根据权利要求1或2所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa3是Tyr(Me)，Xaa7是DPro，Xaa8是Orn(iPr)并且Xaa13是Gln。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa3是Ala，Xaa7是DTyr(Me)，Xaa8是Orn(iPr)，并且Xaa13是Gln。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa3是Tyr，Xaa7是DTyr，Xaa8是Orn(iPr)，并且Xaa13是Gln。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，其中Xaa3是Tyr(Me)，Xaa7是DTyr(Me)，Xaa8是Orn(iPr)，并且Xaa13是Gln。
10.根据权利要求1或2所限定的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，用作药物活性物质。
11.根据权利要求1或2所限定的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物，用作具有CXCR4拮抗、抗癌活性和/或抗炎活性和/或干细胞动员活性的物质。
12.药物组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的处于游离形式或处于可药用盐形式的式I化合物和药学惰性载体。
13.权利要求12的药物组合物，其中所述药物组合物是处于合适口服、局部、经皮、注射、经颊或透粘膜施用的形式。
14.权利要求12的药物组合物，其中所述药物组合物是处于片剂、锭剂、胶囊剂、溶液剂、液体剂、凝胶剂、糊剂、乳膏剂、油膏剂、糖浆剂、浆液剂、混悬剂、散剂或栓剂的形式。
15.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物用于制造药物的用途，所述药物具有CXCR4拮抗、抗癌活性和/或抗炎活性和/或干细胞动员活性。
16.根据权利要求15的用途，其中所述药物用于预防健康个体中的HIV感染；用于延缓或停顿HIV感染患者中的病毒进展；用于治疗或预防由CXCR4受体活性介导或因其产生的癌症或免疫病；用于治疗免疫抑制；用于伴随外周血干细胞的血浆分离置换采集；或用于诱导干细胞的动员以调节组织修复。
17.用于制造如权利要求1至11中任一项所述的式I化合物的方法，包括步骤
(a)用N保护的氨基酸Pro偶联官能化的固相支持物，所述Pro在式I化合物的位置16中形成氨基酸残基的基础；
(b)从步骤(a)的产物移除N保护基；
(c)用N保护的氨基酸DPro偶联步骤(b)的产物，所述DPro在式I化合物的位置15中形成氨基酸残基的基础；
(d)从步骤(c)的产物移除N保护基；
(e)以类似于步骤(c)和(d)中所述的方式，在式I化合物的位置14至1中一个接一个添加每种所需的氨基酸残基至每种情况下于正在增长的肽链游离末端处的氨基酸残基的游离氨基，所述肽链与固相支持物偶联，在类似于步骤(c)的偶联步骤中使用的所需氨基酸在每种情况下是N保护的，并且除α氨基部分的羧基之外，在所述所需氨基酸中存在的任何官能团也均受保护；
(f)将步骤(e)的产物中的两个Cys残基中的两个-SH基团替换为1个-S-S-基团，除非这个-S-S-基团在步骤(j)中形成；
(g)使所述十六肽从固相支持物脱离；
(h)使所述十六肽的位置1中的氨基酸残基与所述十六肽的位置16中的氨基酸残基偶联；
(i)使步骤(h)的产物中存在的任何保护的官能团去保护；
(j)将步骤(i)的产物中的两个Cys残基中的两个-SH基团替换为1个-S-S-基团，除非这个-S-S-基团在步骤(f)中形成；
(k)如果需要，使一个或几个异丙基取代基与步骤(j)的产物连接；
(l)使步骤(k)的产物中存在的任何保护的官能团去保护；并且
(m)如果所述方法的所需产物是可药用盐形式的式I化合物，则将游离形式的式I化合物转化成相应的可药用盐形式的式I化合物，或者如果所述方法的所需产物是游离形式的式I化合物，则将可药用盐形式的式I化合物转化成相应的游离形式的式I化合物，或者如果所述方法的所需产物是不同可药用盐形式的式I化合物，则将可药用盐形式的式I化合物转化成相应的不同可药用盐形式的式I化合物。
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