MX2013014229A - Peptidomimeticos de horquilla beta como antagonistas de cxc4. - Google Patents

Abstract

Los peptidomiméticos de ß-horquilla del ciclo fórmula general (Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-X aa13-Xaa14-DPro15-Pro16-), disulfuro de enlace entre Cys4 y Cys11 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, Xaa3, Xaa7, Xaa8, Xaa13 y Xaa14 siendo residuos de aminoácidos de ciertos tipos que se definen en la descripción y las reivindicaciones, tienen propiedades farmacológicas favorables y pueden usarse para la prevención de infecciones por VIH en individuos saludables o para desacelerar y detener la progresión viral en pacientes infectados o en lugares en donde está mediada por el cáncer o como resultado de la actividad del receptor CXCR4 o en lugares en donde es mediada por enfermedades inmunológicas o como resultado de la actividad del receptor CXCP4, o para el tratamiento de inmunosupresión, o durante las recolecciones de aféresis de células madre de sangre periférica y/o como agentes para inducir la movilización de las células madre para regular la reparación de tejidos. Estos peptidomiméticos pueden ser fabricados por un proceso que se basa en una estrategia sintética mezclada en fase sólida y en solución.

Description

PEPTIDOMIMÉTICOS DE HORQUILLA BETA COMO ANTAGONISTAS DE CXC4 La presente invención proporciona peptidomiméticos de horquilla-ß que están teniendo actividad antagonista de CXC 4 y son incluidos por la descripción general de, pero no se describen específicamente en, WO2004/096840 Al.

Los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención son ciclo (-Tyr^His^Xaa^Cys^Ser^Ala^Xaa^Xaa^Arg^Tyr10-Cysn-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) , enlace de disulfuro · entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, con Xaa3 siendo Ala, Tyr o Tyr (Me) como se describe en el presente documento a continuación, Xaa7 siendo DTyr, DTyr (Me) como se describe en el presente documento a continuación o DPro, Xaa8 siendo Dab u Orn (iPr) como se describe en el presente documento a continuación, Xaa13 siendo Gln o Glu, y Xaa14 es Lys (iPr), como se describe en el presente documento a continuación.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento de síntesis eficiente mediante el cual estos compuestos pueden, si se desea, formarse en formato de libro paralelo. Estos peptidomiméticos de horquilla-ß tienen propiedades farmacológicas favorables y, además, muestran la proteína plasmática adecuada vinculante y regímenes de eliminación adecuados. Por lo tanto se pueden utilizar como ingredientes activos en cantidades bajas para todo tipo de formulaciones de fármacos, en particular, formulaciones de fármacos de liberación prolongada.

Muchos procesos biológicos médicamente significativos están mediados por la transducción de señales que implica quimioquinas y sus receptores en factor derivado del estroma general y 1 (SDF-1/CXCL12 ) y su receptor CXCR4 en particular .

CXCR4 y su ligando SDF-1 están implicados en el tráfico de las células B, células madre hematopoyéticas (HSC) y las células progenitoras hematopoyéticas (HPC). Por ejemplo, el CXCR4 se expresa en células CD34+ y se ha implicado en el proceso de migración de células CD34+ y migración (SM vatios, SP Forde, Vox sanguinis 2008, 94, 18-32). También se ha demostrado que el receptor CXCR4 juega un papel importante en la liberación de células madre y progenitoras de la médula ósea a la sangre periférica (L.M. Pelus, S. Fukuda, Leucemia 2008, 22, 466-473) . Esta actividad de CXCR4 podría ser muy importante para las colecciones de aféresis eficientes de células madre de sangre periférica. Las células de sangre periférica autólogas proporcionan una rápida y sostenida recuperación hematopoyética después de auto-trasplante después de la administración de altas dosis de quimioterapia o radioterapia en pacientes con neoplasias hematológicas y tumores sólidos (WC Liles et al., Blood 2003, 102, 2728-2730) .

Recientemente, se ha demostrado que SDF-1 es localmente regulado en modelos animales de lesión incluyendo accidente cerebrovascular isquémico focal, isquemia cerebral global, infarto de miocardio e isquemia de las extremidades posteriores, asi como está implicado en la recuperación después de la isquemia periférica o después de una lesión a la hígado, riñon o pulmón (AE Ting, RW Mays, MR Frey, W. Van't Hof, S. Medicetty, R. Deans, Critical Reviews in Oncología/Hematología 2008, 65, 81-93 y bibliografía citada en el presente documento; F. Lin, K. Cordes, L. Li, L. Hood, W.G. Couser, S.J. Shankland et al., J. Am. Soc. Nephrol. 2003, 14, 1188-1199; C.C. Dos Santos, Intensive Care Med. 2008, 34, 619-630). Estos resultados sugieren que SDF-1 puede ser un quimioatrayente para células madre CXCR -positivos para la reparación/regeneración de tejidos y de órganos (MZ Ratajczak, M. Kucia, R. Reca, M. Majka, ?. Janowska-Wieczorek, J. Ratajczak, Leucemia 2004, 18, 29-40). Por lo tanto, la modulación de la eje SDF-1/CXCR4 por los inhibidores de CXCR4 debería dar como resultado un beneficio terapéutico significativo mediante el uso de células madre liberadas para regular la reparación de tejidos.

Más recientemente, se ha demostrado que la interrupción de las eje CXCR4/SDF-1 por los inhibidores de CXCR4 juega un papel crucial en la movilización de diferencial de células progenitoras como HPC, endoteliales (EPCs) y células progenitoras estromales (RCP) de la médula ósea (SC Pitchford, RC Furze, CP. Jones, AM Wegner, SM Rankin, Ce.11 Stem Cell 2009, 4, 62). Además, CXCR4 derivada de la médula ósea + Muy pequeñas células madre similares a las embrionarias (VSELs) se movilizaron en pacientes con infarto agudo de miocardio que indica un hipotético mecanismo reparatorio (W. Wojakowski, M. Tendrá, M. Kucia, E. Zuba-Surma, E. Paczkowska, J. Ciosek, M. Halasa, M . Krol, M. Kazmierski, P. Buszman, A. Ochala, J. Ratajczak, B. Machalinski, MZ Ratajczak, J. Am. Coll. Cardiol. 2009, de 53, 1) . Estos hallazgos pueden ser explotados para proporcionar una terapia de células madre efectiva para la regeneración de tej idos .

Las células madre mesenquimales (MSC) son células no hematopoyéticas progenitoras que tienen la capacidad de diferenciarse en tejidos tales como hueso y cartílago (Prockop D.J., Ciencia 1997, 276, 71) . Como una pequeña proporción de las MSC expresa fuertemente CXCR4 funcionalmente activo, la modulación de los eje CXCR4/SDF-1 puede mediar la migración específica y migración de estas células (R.F. ynn, C.A. Hart, C. Corradi-Perini , L. O'Neill, C.A. Evans, J.E. Wraith, L.J. Fairbairn, I. Bellantuono, Blood 2004, 104, 2643) .

Cada vez hay más evidencia que sugiere que las quimioquinas en general y la interacción SDF-1/CXCR4 en particular, desempeñan un papel fundamental en la angiogénesis . Las quimioquinas inducen la angiogénesis directamente por la unión de sus receptores afines en las células endoteliales o indirectamente mediante la promoción de infiltrados de células inflamatorias, que ofrecen otros estímulos angiogénicos . Un número de quimioquinas proinflamatorias , incluyendo la interleucina 8 (IL-8) , oncogén crecimiento regulado, el factor derivado de células estromales 1 (SDF-1), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), eotaxina 1, y 1 a 309 han sido se muestra para actuar como inductores directos de la angiogénesis (X. Chen, JA Beutler, TG McCloud, A. Loehfelm, L. Yang, HF Dong, OY Chertov, R. Salcedo, J.J. Oppenheim, O.M. Howard. Clin. Cáncer Res. 2003, 9 (8), 3.115-3.123; R. Salcedo, JJ Oppenheim, Microcirculation 2003, (3-4), 359-370).

Recientemente los resultados obtenidos muestran que el receptor CXCR4 está implicado en la actividad quimiotáctica de las células de cáncer, tales como metástasis de cáncer de mama o en la metástasis de cáncer de ovario (A. Muller, B. Homey, H. Soto, N. Ge, D. Catron, M.E. Buchanan, T. Me Clanahan, E. Murphey, W. Yuan, S.N. agner, J.L. Barrera, A. Mohar, E. Verastegui, A. Zlotnik, Naturaleza 2001, 50, 410; J.M. Hall, K.S. Kora , Molecular Endocrinology 2003, 17, 792-803), Non-Hodgin linfoma (F. Bertolini, C. Dell'Agnola, P. Manusco, C. Rabascio, A. Burlini, S. Monestiroli, A. Gobbi, G. Pruneri, G. Martinelli, Cáncer Research 2002, 62, 3106 hasta 3112), o el cáncer de pulmón (T. Kijiraa, G. Maulik, P.C. Ma, E.V. Tibaldi, R. E. Turner, B. Rollins, M. Sattler, B.E. Johnson, R. Salgia, Cáncer Research 2002, 62, 6.304-6311), el melanoma, cáncer de próstata, cáncer de riñon, neuroblastomia, cáncer de páncreas, mieloma múltiple, leucemia linfocitica crónica, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, cáncer de endometrio y de tumores de células germinales (H. Tamamura et al., FEBS Letters 2003, 550, 79-83, citado ref.; Z. Wang, Q. Ma, Liu, H.Yu, L. Zhao, S. Shen, J. Yao, British Journal of Cáncer 2008, 99, 1695; B. Sung, S. Jhurani, KS Ahn, Y. Mastuo, T. Yi, S. Guha, M. Liu, B. Aggarwal, Cáncer Res. 2008, 68, 8938, H. Liu, Z. Pan, A. Li, S. Fu, Y. Lei, H: Sun, M. Wu, W. Zhou, Cellular and Molecular Immunology, 2008, 5, 373; C. Rubie, O. Kollmar, V.O. Frick, M. agner, B. Brittner, S. Graber, M.K. Schilling, Scandinavian Journal of Immunology 2008, 68, 635; S. Gelmini, M. Mangoni, F. Castiglioe, C. Beltrami, A. Pieralli, K.L. Andersson, M . Fambrini, G.I. Taddie, M. Serio, C. Orlando, Clin. Exp. Metástasis 2009, 26, 261; D.C. Gilbert, I. Chandler, A. Mclntyre, N.C. Goddard, R. Gabe, R.A. Huddart, J. Shipley, J. Pathol. 2009, 217, 94). El bloqueo de la actividad quimiotáctica con un inhibidor de CXCR4 debería detener la migración de las células cancerosas y por lo tanto la metástasis.

* CXCR4 también ha sido implicado en el crecimiento y la proliferación de los tumores sólidos y leucemia/linforna . Se demostró que la activación del receptor CXCR4 fue crítico para el crecimiento de ambos tumores neuronal y gliales malignos. Por otra parte, la administración sistémica del antagonista de CXCR4 AMD3100 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de glioblastoma y de meduloblastoma intracraneales mediante el aumento de la apoptosis y disminuir la proliferación de células tumorales (J.B. Rubín, A.L. Kung, R.S. Klein, J.A. Chan, Y. Sun, K. Schmidt, M.W. Rieran, A.D. Luster, R.A. Segal, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 2003, 100 (23), 13513 a 13518; S. Barbero, R. Bonavia, A. Bajetto, C. Porcile, P. Pirani, J.L. Ravetti, G.L. Zona, R. Spaziante, T. Florio, G. Schettini, Cáncer Res. 2003, 63 (8), 1969-1974; T. Kijima, G. Maulik, P.C. Ma, E.V. Tibaldi, R.E. Turner, B. Rollins, M . Sattler, B.E. Johnson, R. Salgia. Cáncer Res. 2002, 62 (21), 6304-6311). Los inhibidores de CXCR4 también mostraron eficacias in vitro e in vivo prometedoras en el cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, melanoma maligno, cáncer de ovario, rabdomio-sarcoma, cáncer de próstata, así como leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin (JA Burger, A. Peled, Leucemia 2009, 23, 43-52 y bibliografía citada en este documento) .

Está bien establecido que las quimioquinas están implicadas en un número de patologías inflamatorias y algunos de ellos muestran un papel fundamental en la modulación del desarrollo de los os Leoclastos . La inmunotinción para SDF- 1 (CXCL12) en las biopsias sinoviales y de tejido óseo tanto las muestras de artritis reumatoide (AR) como deosteoartritis (OA) han revelado fuertes aumentos en los niveles de expresión de las quimioquinas en condiciones inflamatorias (F. Grassi, S. Cristino, S. Toneguzzi, A. Piacentini, A. Facchini, G. Lisignoli, J. Cell Physiol. 2004; 199 (2), 244-251) . Parece probable que el receptor CXCR4 juega un papel importante en las enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide, asma, esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, aterosclerosis , o enfermedades oculares tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada (K.R- Shadidi y col., Scandinavian Journal of Immunology 2003, 57, 192-198; J.A. Gonzalo, J. Immunol 2000, 165, 499-508 ; S. Hatse et al., FEBS Letters 2002, 527, 255-262 y referencias citadas, A.T. Weeraratna, A. Kalehua, I. De León, D. Bertak, G. Ma er, MS Wade, A. Lustig, K.G. Becker, W. ood, D.G. Walker, T.G.

Beach, D.D. Taub, Exp. Cell. Res. 2.007, 313, 450; M. Shimoji, F. Pagan, E.B. Healton, I. Mocchetti, Neurotox Res. 2009, 16, 318; A. .Zernecke, E. Shagdarsuren, C. Weber, Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 2008, 28, 1897; R. Lima e Silva, J. Shen, S.F. Hackett, S. Kachi, H. Akiyama y otros, FASEB 2007, 21, 3219). La mediación del reclutamiento de células inmunes a sitios de inflamación debería ser detenida por un inhibidor de CXCR .

Hasta la fecha, las terapias disponibles para el tratamiento de las infecciones por el VIH se han llevado a una notable mejoría en los síntomas y la recuperación de la enfermedad en las personas infectadas. Aunque la terapia antirretroviral de gran actividad (HAART) , que consiste en una combinación de transcriptasa inversa/inhibidor de proteasa ha mejorado dramáticamente el tratamiento clínico de las personas con SIDA o infección por VIH, todavía se han mantenido varios problemas graves, como la resistencia a múltiples fármacos, efectos adversos significativos y costos elevados. Particularmente deseables son agentes anti-VIH que bloquean la infección por VIH en un paso temprana de la infección, tales como la entrada viral. Recientemente se ha reconocido que para la entrada eficiente en las células diana, los virus de la inmunodeficiencia humana requieren los receptores de quimioquinas CCR5 y CXCR4, así como el receptor primario CD4 (N . Levy, Engl. J. Med. 1996, 335, 1528-1530).

Por consiguiente, un agente que pueda bloquear los receptores de quimioquinas CXCR4 debería prevenir infecciones en los individuos sanos y desacelerar o detener la progresión viral en pacientes infectados (J. Cohén, Science 1997, 275, 1261-1264) .

Entre los diferentes tipos de inhibidores de CXCR4 (M . Schwarz, T.N.C. Wells, A.E.I. Proudfoot, Receptores y Canales 2001, 7, 417-428; Y. Lavrovsky, Y. A. Ivanenkov, .V. Balakin, D.A. Medvedewa, P.V. I achtchenko, Mini Rev. Med. Chem. 2008, 11, 1075-1087), una clase emergente se basa en análogos de origen natural de péptidos catiónicos derivados de Polifemusina II, que tienen una estructura de hoja-ß antiparalela, y una horquilla-ß que se mantiene por dos puentes disulfuro (H. Nakashima, M. Masuda, T. Murakami, Y. Koyanagi, A. Matsumoto, N. Fujii, N. Yamamoto, Agentes Antimicrobianos y Chemoth 1992, 36, 1249-1255; H. Tamamura, M . Kuroda, M. Masuda, A. Otaka, S. Funakoshi, H. Nakashima, N. Yamamoto, M . Waki, A. Matsumotu, J.M. Lancelin, D. Kohda, S. Tate, F. Inagaki, N. Fujii, Biochim. Biophys. Acta .1993, 209, 1163, WO 95/10534 Al).

La síntesis de análogos estructurales y estudios estructurales por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) han demostrado que los péptidos catiónicos adoptan conformaciones en horquilla-ß bien definidos, debido al efecto de restricción de uno o dos puentes de disulfuro (H. Tamamura, M. Sugioka, Y. Odagaki, A. Omagari, Y. Kahn, S. Oishi, H. Nakashima, N. Yamamoto, S.C. Peiper, N. Hamanaka, A . Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett 2001, 359-362). Estos resultados muestran que la estructura de horquilla-ß juega un papel importante en la actividad antagonista de CXCR .

Los estudios estructurales adicionales han indicado que la actividad antagonista también puede ser influenciada por la modulación de la estructura anfifilica y el farmacóforo (H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, K. Gotoh, T. Kanamoto, Y. Xu, E. Kodama, M. Matsuoka, T . Hattori, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1897-1902; H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, S. Oishi, H. Habashita, T. Kanamoto, K. Gotoh, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 1417-1426; H. Tamamura, K. Hiramatsu, . Miyamoto, A. Omagari, S. Oishi, H. Nakashima, N. Yamamoto, Y. uroda, T. Nakagawa, A. Otaki, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Letters 2002, 12, 923-928) .

El ciclo de compuestos (-Tyr^His^Xaa^Cys^Ser5- Ala^Xaa^Xaa^Arg^Tyr^-Cys^-Tyr^-Xaa^-Xaa^^-Pro^-Pro16-) , el enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, de la invención son peptidomiméticos de horquilla-ß cíclicos que presentan alta actividad antagonista de CXCR4, que son útiles para las colecciones de aféresis eficientes de las células madre de la sangre periférica movilizadas y/o el uso de estas células movilizadas para regular la reparación de tejidos, y/o que tienen actividad anti-cáncer, actividad anti-inflamatoria y/o actividad anti-VIH.

La conformación de horquilla-ß cíclica es inducida por el residuo de D-aminoácido Xaa7 y el residuo DPro15 de D-aminoácido. Además la estabilización de la conformación de horquilla se consigue mediante los residuos de aminoácidos Cys en las posiciones 4 y 11, que, tomados juntos, forman un puente de disulfuro.

Sorprendentemente, se ha encontrado que la introducción del residuo aminoácido básico Lys (iPr) en la posición 14, soportado por la introducción opcional de Orn (iPr) en la posición 8 del ciclo ( -Tyr1-His2-Xaa3-Cys -Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cysn-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) , el enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, da como resultado peptidomiméticos de horquilla-ß que tienen propiedades farmacológicas favorables. Estas propiedades, junto con los regímenes de eliminación de unión apropiados y proteínas de plasma adecuados forman un perfil farmacológico gue permite a estos compuestos ser utilizados como ingredientes activos en bajas cantidades para todo tipo de formulaciones de fármacos, en particular, formulaciones de fármacos de liberación prolongada .

Los peptidomiméticos de horquilla-ß de la presente invención son compuestos de la fórmula general Ciclo (-Tyr^His^Xaa^Cys^Ser^Ala^Xaa^Xaa8- Arg9, Tyr10-Cysu-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) (I), el enlace de disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde Xaa3 es Ala, Tyr o Tyr (Me) , siendo este último (2S) -2-amino- ( -metoxifenil ) -3-propiónico , Xaa7 es DTyr, DTyr (Me), es decir, (2R) -2-amino- (4-metoxifenil) -3-propiónico, o Pro, Xaa8 es Dab, es decir ácido (2S)-2,4-diaminobutirico, u Orn (iPr), es decir, ácido (2S)-NW-isopropil-2, 5-diaminopentanoico Xaa13 es Gln o Glu, Xaa14 es Lys (iPr), es decir, ácido (2S)- Nw-isopropil- 2,6- diaminohexanoico .

En una modalidad particular de la presente invención, los peptidomiméticos de horquilla-ß son compuestos de la fórmula general I, en la que Xaa13 es Gln, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra modalidad particular de la presente invención, los peptidomiméticos de horquilla-ß son compuestos de la fórmula general I, en la que Xaa3 es Tyr; o Tyr (Me) , Xaa7 es DPro, Xaa8 es Orn (iPr) y Xaa13 es Gln, y farmacéuticamente sales aceptables de los mismos.

En una modalidad preferida de la presente invención, el compuesto es ciclo ( -Tyr1-His2-Ala3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr7-Dab8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys (iPr) 14-DPro15- Pro16-), enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra modalidad preferida de la presente invención, el compuesto es ciclo ( -Tyr1-His2-Tyr3-Cys4-Ser5-Ala6-DPro7-Orn (iPr) 8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys (iPr) 14- DPro15-Pro16-) , enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra modalidad preferida de la presente invención, el compuesto es ciclo ( -Tyr1-His2-Tyr (Me) 3-Cys4-Ser5-Ala6-DPro7-Orn (iPr) 8-Arg9-Tyr10-Cysn-Tyr12-Gln13-Lys (iPr) 14-DPro15-Pro16-) , enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra modalidad preferida de la presente invención, el compuesto es ciclo ( -Tyrx-His2-Ala3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr (Me ) 7-Orn ( iPr ) 8-Arg9-Tyr10-Cysu-Ty.r12-Gln13-Lys (iPr) 14-DPro15-Pro16-) , el enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra modalidad preferida de la presente invención, el compuesto es ciclo (-Tyr1-His2-Tyr3-Cys4-Ser5-Ala6-DTyr7-Orn (iPr) 8-Arg9-Tyr10-Cysn-Tyr1 -Gln13-Lys (iPr) 14- DPro15-Pro16-) , el enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En todavía otra modalidad preferida de la presente invención, el compuesto es ciclo ( -Tyr1-His2-Tyr (Me ) 3-Cys4-Ser5 -Ala6-DTyr (Me) 7-Orn (iPr) 8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Gln13-Lys (iPr) 1 -DPro15-Pro16-) , el enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

De acuerdo con la presente invención, estos peptidomiméticos de horquilla-ß se pueden preparar por un procedimiento que comprende: (a) acoplar un soporte sólido apropiadamente funcionalizado con un derivado de Pro apropiadamente N-protegido que es en el producto final deseado en la posición 16; (b) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo; (c) acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado de DPro apropiadamente N-protegido que es en el producto final deseado en la posición 15; (d) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido en el paso (c) ; (e) efectuar pasos que corresponden sustancialmente los pasos (c) y (d) mediante el uso de derivados apropiadamente N-protegidos de los aminoácidos que en el producto final deseado se encuentran en las posiciones 14 a 1, cualquier grupo funcional que puede estar presente en dichos derivados de aminoácidos N-protegidos igualmente protegidos adecuadamente; (f) si se desea, la formación de un puente disulfuro entre las cadenas laterales de los residuos de Cys en la posición 4 y la posición 11, o como alternativa, que forma el enlace antes mencionado después del paso (i), como se describe en el presente documento a continuación ; (g) separar el producto obtenido de este modo del soporte sólido; (h) ciclizar el producto separado del soporte sólido ; (i) eliminar cualesquiera grupos protectores presentes en los grupos funcionales de los miembros de la cadena de residuo de aminoácido; y (j) si se desea, se conectan uno o varios grupos isopropilo (k) si es necesario, eliminar cualquier grupo protector presente en los grupos funcionales de los miembros de la cadena de aminoácidos y (1) si se desea, convertir el producto obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable, la sal obtenida de este modo en el correspondiente compuesto libre o en una sal farmacéuticamente aceptable, diferente.

Los peptidomiméticos de horquilla-ß de esta invención pueden ser produca.dos, por ejemplo, siguiendo un procedimiento que comprende la síntesis del péptido lineal en la resina mientras que el residuo de aminoácido grupo de soporte de isopropil Orn (iPr) o Lys (iPr) serán incorporados como bloques de construcción de aminoácidos que están disponible comercialmente o sintetizados con anterioridad, o un procedimiento que comprende la síntesis de un péptido lineal en la resina mediante la aplicación de una estrategia de grupo de protección ortogonal, mientras que, por ejemplo, todas las cadenas laterales que contienen el grupo amino de residuos de aminoácidos que no se consideran modificados deberán ser protegidos por ivDde o similares de manera que las cadenas laterales que contienen el grupo aino de residuos de aminoácidos protegidos por grupos protectores lábiles de ácidos adecuados para la estrategia de síntesis de péptidos de fase sólida basados en Fmoc pueden derivatizarse por acoplamiento de grupos isopropilo en solución a una etapa muy tardía de la cascada de síntesis; o siguiendo un procedimiento que comprende una combinación adecuada de los procedimientos descritos antes.

La elección adecuada del soporte sólido funcionalizado (es decir, soporte sólido más la molécula de unión) y el sitio de ciclización desempeñan un papel clave en el proceso de síntesis de los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención.

El soporte sólido funcionali zado se deriva convenientemente de poliestireno entrelazado con, preferiblemente 1-5%, divinilbenceno ; poliestireno revestido con separadores de polietilenglicol (TentaGel ®) , y resinas de poliacrilamida (D. Obrecht, J.-M. Villalgordo, "Síntesis de combinación y paralela en soporte sólido y de las bibliotecas compuestos de peso molecular pequeño", Tetrahedron Serie Organic Chemistry, vol. 17, Pergamon, Elsevier Science, 1998) .

El soporte sólido se funcionaliza por medio de un enlazador, es decir, una molécula de separación bifuncional que contiene en un extremo un grupo de anclaje para la fijación al soporte sólido y en el otro extremo un grupo funcional selecti amente disociable utilizado para las subsiguientes transformaciones químicas y procedimientos de separación. Para los propósitos de la presente invención se utilizan dos tipos de enlazadores: Los enlazadores Tipo 1 están diseñados para liberar el grupo amida en condiciones ácidas (H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3783-3790). Los enlazadores de esta forma tipo amidas del grupo carboxilo de los aminoácidos ; ejemplos de resinas funcionalizadas mediante este tipo de estructuras de unión incluyen resina de PS 4- [ ( fenoxiacetamido ((2,4- dimetoxi-fenil ) - Fmoc-aminometil ) ) aminometilo] , resina de PS 4 - [ ( ( ( 2 , -dimetoxifenil ) Fmoc-aminometil ) fenoxi-acetamido) aminometil ] -4 -metil-bencidrilamina (amida de Rink ???? de la resina de PS), y resina de PS -[((( 2 , -dimetoxi-fenil ) -Fmoc aminometil) fenoxiacetamido) aminometil] benzhidrilamina (resina de PS amida BHA Rink) . Preferiblemente, el soporte se deriva de poliestireno entrelazado con, más preferiblemente 1-5 %, divinilbenceno y funcionalizado por medio del enlazador 4- ( ( (2, -dimetoxifenil) -Fmoc-aminometil) fenoxiacetamido ) .

Los enlazadores Tipo 2 están diseñados para liberar finalmente el grupo carboxilo en condiciones ácidas. Los enlazadores de esta forma tipo ésteres lábiles en medio ácido con el grupo carboxilo de los aminoácidos, por lo general bencílico del ácido-lábil, benzhidrilo y trifilo; ejemplos de ésteres de tales estructuras de unión incluyen 2-metoxi-4-hidroximetilfenoxi (enlazador SasrinR) , 4- (2, 4-dimetoxifenil-hidroximetil ) -fenoxi (enlazador Rink), 4- ( 4 -hidroximetil-3-metoxifenoxi ) butírico (enlazador HMPB) , trifilo y 2-clorotritilo . Preferiblemente, el soporte se deriva de poliestireno entrelazado con, más preferiblemente 1-5 %, divinil-benceno y funcionalizado mediante el enlazador 2-clorotritilo .

Cuando se lleva a cabo como síntesis de disposición paralela los procesos de la invención pueden llevarse a cabo ventajosamente tal como se describe en la presente a continuación, pero será inmediatamente evidente para los expertos en la técnica que estos procedimientos sean modificados en caso de que se desee sintetizar un único compuesto de la invención.

Un número de recipientes de reacción igual al número total de compuestos que se sintetizan por el método paralelo, se cargan con 25 a 1000 mg, preferiblemente 60 mg, del soporte sólido funcionalizado apropiado, preferiblemente de 1 a 3% de poliestireno o resina Tentagel entrelazada.

El disolvente a utilizar debe ser capaz de hinchar la resina e incluye, pero no está limitado a, diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona (NMP) , dioxano, tolueno, tetrahidrofurano (THF) , etanol (ÉtOH) , trifluoroetanol (TFE) , alcohol isopropilico y similares. Las mezclas de disolventes que contienen como por lo menos un componente un disolvente polar (por ejemplo, 20 % TFE/DCM, 35 % THF/NMP) son beneficiosas para asegurar la alta reactividad y la solvatacion de las cadenas de péptido unido a resina (GB Fields, C.G. Fields, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4202-4207).

Con el desarrollo de varios enlazadores que liberan el grupo de ácido carboxilico C-terminal en condiciones ácidas suaves, no afectan a los grupos lábiles en medio ácido que protegen los grupos funcionales en la cadena lateral, se han realizado progresos importantes en la síntesis de fragmentos de péptido protegidos. El enlazador derivado de alcohol 2-metoxi-4-hidroxibencilico (enlazador Sasrin ®, Mergler et al., Tetrahedron Lett. 1988, 29 4005-4008) se puede separar con ácido trifluoroacético diluido (0.5-1 % de TFA en DCM) y es estable a condiciones de desprotección Fmoc durante la síntesis de péptidos, los grupos protectores basados en Boc/tBu adicionales que sean compatibles con este esquema de protección. Otros enlazadores que son adecuados para el proceso de la invención incluyen el enlazador lábil super ácido 4- (2, 4-dimetoxifenil-hidroximetil) -fenoxi (enlazador Rink, H. Rink, Tetrahedron Lett 1987, 28, 3787-3790) , en donde la eliminación del péptido requiere ácido acético al 10 % en DCM o ácido trifluoroacético 0.2 % en DCM; el enlazador derivado del ácido 4 - ( 4 -hidroximetil-3-metoxifenoxi ) butírico (enlazador HMPB, Flórsheimer y Riniker, péptidos 1991, 1990 131) que también se separó con TFA al 1%/DCM para dar un fragmento de péptido que contiene todos los grupos protectores de cadena lateral lábil en medio ácido; y, además, el enlazador 2-clorotritilo (Barios y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946), que permite la separación de péptidos usando una mezcla de ácido acético glacial/trifluoroetanol/DCM (1:2:7) durante 30 min.

Los grupos protectores adecuados para los aminoácidos y, respectivamente, para sus residuos son, por ejemplo, para el grupo amino (por ejemplo, como está presente también en la cadena lateral de la lisina u ornitina ) Cbz benciloxicarbonilo Boc ter-butiloxicarbonilo Fmoc 9- fluoreniImetoxicarbonilo Alloc aliloxicarbonil Teoc trimetilsililetoxicarbonilo Tec tricloroetoxicarbonilo Nps o- nitrofenilsulfonilo; Trt Trifenimeilo o tritilo ivDde (4,4 - dimetil-2, 6-dioxociclohex-l-iliden) -3-metilbutilo para el grupo carboxilo (como por ejemplo, está presente también en la cadena lateral de ácido glutámico) por conversión en ésteres con los componentes de alcohol tBu ter-butilo Bn bencilo Me metilo Ph fenilo Pac fenacil alilo Tse trimetilsililetilo Tce tricloroetilo; ivDde (4,4 - dimetil-2 , ß-dioxociclohex-l-iliden ) -3-metilbutilo para el grupo guanidino (tal como está presente por ejemplo, en la cadena lateral de la arginina) Pmc 2 , 2 , 5 , 7 , 8-pentametilcroman-6-sulfonilo Ts tosilo (es decir, p-toluenosulfonilo ) Cbz benciloxicarbonilo Pbf pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo para el grupo hidroxi (tal como está presente por ejemplo, en la cadena lateral de serina) tBu ter-butilo Bn bencilo Trt tritilo Alloc aliloxicarbonil y para el grupo mercapto (tal como está presente por ejemplo, en la cadena lateral de cisteina) Acm acetamidometilo tBu ter-butilo Bn bencilo Trt tritilo MTR 4 metoxitritilo .

Los derivados de aminoácido (Fmoc) protegidos 9-fluorenilmetoxicarbonilo se utilizan preferiblemente como los bloques de construcción para la construcción del imitador de bucle de horquilla-ß de la invención. Para la desprotección, es decir, separación del grupo Fmoc, se puede utilizar 20 % de piperidina en DM F o 2 % DBU/2 % piperidina en DMF.

La unión de grupos isopropilo a cadenas laterales que contienen derivados de aminoácidos protegidos con 9-fluorenilmetoxicarbonilo para formar cadenas laterales que contienen grupo amino isopropilo de derivados de aminoácidos protegidos por (Fmoc) es conocida en la técnica. El procedimiento para la introducción de un grupo isopropilo se puede lograr v.gr., por tratamiento de v.gr., alquilación reductiva del grupo amino de la cadena lateral que contiene el grupo amino de un bloque de construcción de aminoácido como, v.gr., Orn con acetona en presencia de un agente reductor adecuado como por ejemplo, triacetoxiborohidruro de sodio. Los grupos protectores, como por ejemplo, Boc adecuado para grupo amino propilado de soporte de cadenas laterales de derivados de aminoácidos protegidas con (Fmoc) se pueden introducir por la reacción posterior con dicarbonato de di-ter-butilo en presencia de una base tal como bicarbonato de sodio .

La cantidad de la sustancia reaccionante, es decir, del derivado de aminoácido, es normalmente de 1 a 20 equivalentes basados en la carga de miliequivalentes por gramo (meq/g) del soporte sólido funcionalizado (típicamente de 0.1 a 2.85 meq/g para resinas de poliestireno) originalmente pesadas en el tubo de reacción. Los equivalentes adicionales de los reactivos se pueden utilizar, si es necesario, para llevar la reacción hasta completarse en un tiempo razonable. Las estaciones de trabajo preferidas (sin embargo, siendo limitadas a lo mismo) son la estación de Combi-chem de Labsource, Protein Technologies' Symphony y sintetizador MultiSyn Tech's- Syro, este último, además, equipado con una unidad de transferencia y una caja de depósito durante el proceso de separación de la plena péptido lineal protegido del soporte sólido. Todos los sintetizadores son capaces de proporcionar un entorno controlado, por ejemplo, las reacciones pueden llevarse a cabo a temperaturas diferentes de la temperatura ambiente, asi como en atmósfera de gas inerte, si se desea.

La formación de enlace de amida requiere la activación del grupo ot-carboxilo para el paso de acilación. Cuando esta activación se lleva a cabo por medio de las carbodiimidas de uso común tales como diciclohexilcarbodiimida (DCC, Sheehan y Hess, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 1067-1068) o diisopropilcarbodiimida (DIC, Sarantakis et al. Biochem. Biophys. Res. Coramun. 1976, 73, 336-342), la diciclohexilurea resultante y, respectivamente, la diisopropilurea es insoluble y, respectivamente, soluble en los disolventes utilizados generalmente. En una variación del método de la carbodiimida 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, Konig y Geiger, Chem. Ber. 1970, 103, 788-798) se incluye como aditivo a la mezcla de acoplamiento. HOBt impide la deshidratación, inhibe la racemización de los aminoácidos activados y actúa como catalizador para mejorar las lentas reacciones de acoplamiento. Algunos reactivos de fosfonio han sido utilizados como reactivos de acoplamiento directo, tal como hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-(dimetil-amino) -fosfonio (BOP, Castro et al., Tetrahedron Lett. 1975, 14, 1219-1222; Síntesis 1976, 751-752}, o hexafluorofosfato benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (Py -BOP, Coste et al, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 205-208), o tetra-fluoroborato de 2- ( lH-benzotriazol-l-il ) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (TBTU) , o hexafluorofosfato (HBTU, Knorr y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930); estos reactivos de fosfonio también son adecuados para formación in situ de ésteres HOBt con los derivados de aminoácidos protegidos. Más recientemente difenoxifosfor.il azida (DPPA) o 0- ( 7-aza-benzotriazol-l-il ) -N, N, ' , N ' -tetra-metiluronio (TATU) o hexafluorofosfato de 0- (7-aza-benzotriazol-l-il) -N, , ' , ' -tetrametiluronio (HATU) /7-aza-l-hidroxi-benzo triazol (HOAt, Carpino y col., Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281) o tetrafluoroborato de ( 6-cloro-lH-benzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -1, 1, 3, 3-tetrametil-uronio (TCTU), o hexafluorofosfato de (HCTU, Marder, Shivo y Albericio: HCTU y TCTU: Nuevos reactivos de acoplamiento: Desarrollo y Aplicaciones Industriales, Presentación Poster, Conferencia de Gordon febrero de 2002) también se han utilizado como reactivos de acoplamiento, asi como hexafluoro-fosfato 1, 1, 3, 3-bis ( tetrametileno) cloronio (PyCIU, especialmente para el acoplamiento de aminoácidos N-metilado, J. Coste, E. Frerot, P. Jouin, B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 1967) o difenil-fosfinato de pentafluorofenilo (S. Chen, J. Xu, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6711).

Debido al hecho de que las reacciones de acoplamiento casi cuantitativas son esenciales, es conveniente tener evidencia experimental para finalizar las reacciones. La prueba de ninhidrina (Kaiser et al., Anal. Bioquímica 1970, 34, 595), en donde una respuesta colorimétrica positiva a una alícuota de péptido unido a resina indica cualitativamente la presencia de la amina primaria, fácilmente y rápidamente se puede realizar después de cada paso de acoplamiento. La química de Fmoc permite la detección espectrofotométrica del cromóforo de Fmoc cuando se libera con la base (Meienhofer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1979, 13, 35-42).

Se lava el intermedio de resina unido dentro de cada recipiente de reacción libre de exceso de reactivos retenidos, de disolventes y de los subproductos de la exposición repetitiva al disolvente puro por uno de los dos métodos siguientes: 1) Los recipientes de reacción se llenan con disolvente (preferiblemente 5 mi), se agitan durante 5 a 300 minutos, preferiblemente 15 minutos y se drenan para expulsar el disolvente; 2) Los recipientes de reacción se llenan con disolvente (preferiblemente 5 mi) y se vierten luego en un recipiente receptor tal como un tubo de ensayo o frasco vial.

Ambos de los procedimientos de lavado anteriores se repiten hasta aproximadamente 50 veces (preferiblemente alrededor de 10 veces), el seguimiento de la eficiencia de reactivo, disolvente, y la eliminación de subproductos por métodos tales como TLC, GC o inspección de las aguas de lavado .

El procedimiento descrito anteriormente de hacer reaccionar el compuesto unido a resina con reactivos dentro de los tubos de reacción seguida de la eliminación de los reactivos en exceso, los subproductos y disolventes, se repite con cada transformación sucesiva hasta que ha sido obtenido el péptido lineal completamente protegido unido a la resina final.

Antes de este péptido lineal completamente protegido se separa del soporte sólido, se puede formar un puente disulfuro entre Cys4 y Cys11.

Para la formación de un puente disulfuro preferiblemente una solución de 10 equivalentes de solución de yodo se aplica en DMF o en una mezcla de CH2Cl2/MeOH durante 1.5 h que se repite para la otra 3h con una solución de yodo fresco después de la filtración de la solución de yodo, o en una mezcla de DMSO y solución de ácido acético, regulada con 5 % NaHC03 a pH 5-6 durante 4 h, o en el agua después de ajustar a pH 8 con solución de hidróxido de amonio por agitación durante 24 h, o en una solución de NMP y tri-n-butilfosfina (preferiblemente 50 eq.).

Alternativamente, la formación del puente disulfuro entre Cys4 y Cys11 puede llevarse a cabo después del método de trabajo 2), como se describe en el presente documento a continuación, mediante agitación del péptido crudo totalmente desprotegido y ciclizado durante 24 horas en agua que contiene DMSO hasta 15 % en volumen, regulada con 5 % NaHC03 a pH 5-6, o regulada con acetato de amonio a pH 7-8, o ajustado con hidróxido de amonio a pH 8. Después de la evaporación a sequedad de ciclo ( -Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa -Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro15-) , el enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11 se obtiene como producto final.

El desprendimiento del péptido lineal completamente protegido del soporte sólido se consigue mediante la exposición de la resina cargada con una solución del reactivo utilizado para la separación (preferiblemente de 3 a 5 mi) . El control de temperatura, agitación y seguimiento de reacción se implementan como se ha descrito anteriormente. A través de una unidad de transferencia de los recipientes de reacción están conectados con una caja de depósito que contiene tubos de depósito para recolectar eficientemente las soluciones de producto separado. Las resinas que quedan en los recipientes de reacción se lavan a continuación de 2 a 5 veces como anteriormente, con 3 a 5 mi de un disolvente apropiado para extraer (lavar) como gran parte de los productos independientes como sea posible. Las soluciones de producto obtenidas de este modo se combinan, procurando evitar la mezcla cruzada. Las soluciones/extractos individuales son entonces manipuladas según sea necesario para aislar los compuestos finales. Las manipulaciones típicas incluyen, pero no se limitan a, evaporación, concentración, extracción líquido/líquido, acidificación, basificación, neutralización o reacciones adicionales en solución.

Se evaporan las soluciones que contienen derivados de péptidos lineales completamente protegidas que han sido separados del soporte sólido y neutralizados con una base. La ciclización se efectúa a continuación en solución usando disolventes tales como DCM, DMF, dioxano, THF y similares. Anteriormente se han mencionado varios reactivos de acoplamiento que se pueden usar para la ciclización. La duración de la ciclización es de aproximadamente 6-48 horas, preferiblemente de aproximadamente 16 h. El progreso de la reacción se sigue, v.gr., por RP-HPLC (Cromatografía de Líquidos de Alto Desempeño de Fase inversa). A continuación, el disolvente se elimina por evaporación, el derivado de péptido cíclico completamente protegido se disuelve en un disolvente que no es miscible con agua, tal como DCM, y la solución se extrae con agua o una mezcla de disolventes miscibles en agua, con el fin de eliminar cualquier exceso del reactivo de acoplamiento.

Finalmente, el derivado de péptido totalmente protegido se trata con 95 % de TFA, 2.5 % H20, 2.5 % de TIS u otra combinación de barredores para efectuar la separación de los grupos protectores. El tiempo de reacción de separación es comúnmente de 30 minutos a 12 horas, preferiblemente alrededor de 2.5 h.

Alternativamente, el desprendimiento y la desprotección completa del péptido completamente protegido del soporte sólido se puede lograr manualmente en recipientes de vidrio.

Después de completa desprotección, por ejemplo, los siguientes métodos pueden ser usados para su posterior elaboración : 1) Los compuestos volátiles se evaporan a sequedad y el péptido bruto se disuelve en 20 % AcOH en agua y se extrajeron con éter isopropílico u otros disolventes que son adecuados para ello. La capa acuosa se recogió y se evaporó hasta seguedad, y el péptido totalmente desprotegido, ciclo (-Tyr^His^Xaa^Cys^-Ser^Ala^Xaa^Xaa^Arg^Tyr^-Cys^-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro15-) , enlace de disulfuro entre Cys4 y Cys11, se obtiene como producto final; 2) La mezcla de desprotección se concentró a vacio. Después de la precipitación del péptido totalmente desprotegido en dietiléter a preferiblemente 0°C, el sólido se lava hasta aproximadamente 10 veces, preferiblemente 3 veces, se secó, y el péptido totalmente desprotegido, ciclo (-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) , enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, se obtiene como producto final, si un enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11 se ha formado en soporte sólido como se describe anteriormente en este documento.

Si se ha seguido la estrategia del grupo protector ortogonal mencionado anteriormente para la introducción de uno o más grupos isopropilo en solución, a continuación, todos los grupos amino de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos siguen estando protegidos por grupos lábiles no ácido de protección mientras gue los grupos amino de residuos de aminoácidos anteriormente protegidos por grupos protectores lábiles en medio ácido se han liberado en esta paso de la cascada de la síntesis. Por lo tanto, es posible, si se desea, para acoplar un grupo isopropilo.

Preferiblemente, ivDde o similares son grupos protectores estables de ácido para el grupo amino cadenas laterales de soporte que se mantienen sin modificar durante el acoplamiento de grupos isopropilo a grupos amino liberados. Este acoplamiento se puede lograr mediante la aplicación de por ejemplo una alquilación reductora usando acetona en presencia de un agente reductor adecuado como por ejemplo, ciano borohidruro de sodio. De esta manera, por ejemplo, el péptido se disolvió en MeOH (4.4 mM) que contenia ácido acético (0.2 M) . Después de la adición de un exceso de acetona (780 eq.) la mezcla de reacción se completa con una solución de borohidruro de ciano sódico en MeOH (0.6 M; 1.3 eq. por grupo isopropilo deseado para ser introducido) y sacudido vigorosamente a temperatura ambiente. Tras la finalización de la conversión controlada por LC-MS, se añade agua y se evaporan los disolventes. El sólido residual que contiene el péptido se disuelve en DMF (0.01 M) y una solución de 5 % de hidrazina en DMF se utiliza para eliminar finalmente los grupos protectores de ivDde .

Como se mencionó anteriormente, es posible a partir de entonces, si se desea, convertir el producto cíclico totalmente desprotegido obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable, la sal obtenida de este modo en el correspondiente compuesto libre o en una sal diferente, farmacéuticamente aceptable. Cualquiera de estas operaciones puede llevarse a cabo por métodos bien conocidos en la técnica.

Los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones con el fin de prevenir las infecciones por VIH en individuos sanos y lenta o detener la progresión viral en pacientes infectados, o donde el cáncer está mediado o como resultado de la actividad del receptor CXCR4, o donde las enfermedades inmunológicas están mediadas o como resultado de la actividad del receptor CXCR4, o estos peptidomiméticos de horquilla-ß se pueden usar para tratar la inmunosupresión, o pueden ser utilizados durante colecciones de aféresis de células madre de sangre periférica y/o como agentes para inducir la movilización de células madre al regular la reparación de los tej idos .

Los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se pueden administrar per se o se pueden aplicar como una formulación apropiada junto con portadores, diluyentes o excipientes bien conocidos en la técnica.

Cuando se usa para tratar o prevenir infecciones por VIH o cáncer, tales como cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de próstata, el carcinoma hepatocelular , cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de riñon, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, tumor de células germinales, cáncer de ojo, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, rabdomio-sarcoma, melanoma, leucemia linfocitica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple y linforna de no Hodgkin; metástasis, la angiogénesis y tejidos hematopoyéticos ; o trastornos inflamatorios tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades de hipersensibilidad pulmonar, neumonitis por hipersensibilidad, neumonías eosinofílicas , hipersensibilidad de tipo retardado, enfermedad pulmonar intersticial (ILD), fibrosis pulmonar idiopática, ILD asociada con artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, anafilaxis sistémica o hipersensibilidad respuestas, alergias a fármacos, artritis reumatoide, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la aterosclerosis, la miastenia grave, diabetes de inicio juvenil, glomerulonefritis , tiroiditis autoinmune, rechazo de injertos, incluyendo rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped, inflamatoria intestinal enfermedades y dermatosis inflamatorias, o para el tratamiento de enfermedades oculares como el glaucoma, la retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad, o para tratar el accidente cerebrovascular isquémico focal, isquemia cerebral global, infarto de miocardio, la isquemia de las extremidades posteriores o isquemia periférica, o para tratar la lesión del hígado, riñon o pulmón, o para tratar la inmunosupresión , incluyendo inducida por la quimioterapia, la radioterapia o el rechazo del injerto/trasplante de la inmunosupresión, los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se pueden administrar solos, como mezclas de varios peptidomiméticos de horquilla-ß, en combinación con otros agentes anti-VIH, o agentes antimicrobianos o agentes anticáncer o agentes anti-inflamatorios, o en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos. Los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se pueden administrar per se o como composiciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención pueden ser fabricadas por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, la tableta de decisiones revestidos, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización . Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables, diluyentes, excipientes o Auxiliares que facilitan el procesamiento de los peptidomiméticos de horquilla-ß activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende del método de administración elegida.

Para la administración tópica los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se pueden formular como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones, polvos, etc. como son bien conocidos en la técnica.

Las formulaciones sistémicas incluyen las diseñadas para la administración por inyección, por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal , asi como las diseñadas para la administración transdérmica, transmucosa, oral o pulmonar.

Para las inyecciones, los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se pueden formular en soluciones adecuadas, preferiblemente en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hink, la solución de Ringer, o solución reguladora de solución salina fisiológica. Las soluciones pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención pueden tener forma de polvo para la combinación con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Para la administración transmucosa, los penetrantes apropiados para la barrera a ser permeada se utilizan en la formulación como se conoce en la técnica.

Para la administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando los peptidomiméticos activos de horquilla-ß de la invención con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se formulen como comprimidos, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones, polvos, etc., para la ingestión oral por un paciente a ser tratado. Para las formulaciones orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen cargas tales como azúcares, tales como lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol, preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa , hidroxipropilmetilcelulosa , carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación y agentes aglutinantes. Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidonas entrelazadas, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación sólidas pueden ser revestidas de azúcar o con recubrimiento entérico usando técnicas estándar.

Para las preparaciones líquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, los vehículos adecuados, excipientes o diluyentes incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Además, se pueden añadir agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares .

Para la administración bucal, la composición puede tomar la forma de comprimidos, pastillas, etc. formulado como de costumbre.

Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios, junto con bases de supositorio adecuadas, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención también se pueden formular como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Para la fabricación de tales preparaciones de depósito los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se pueden formular con materiales adecuados poliméricos o hidrófobos (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como sales poco solubles.

Además, otros sistemas de administración farmacéuticas se pueden emplear tales como liposomas y emulsiones bien conocidas en la técnica. Ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido también pueden emplearse. Adicionalmente , los peptidomiméticos de horquilla- ß de la invención se pueden suministrar usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico (por ejemplo, para los stents revestidos) . Varios materiales de liberación sostenida se han establecido y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del agente terapéutico, estrategias adicionales para la estabilización de proteínas pueden ser empleados .

Como los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención contienen residuos cargados, que pueden ser incluidos en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como tales o como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables tienden a ser más solubles en disolventes próticos acuosos y otros que son las formas libres correspondientes. Par icularmente las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales con ácidos carboxílico, fosfónico, sulfónico y sulfámico, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, ácido mélico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tales como ácido glutámico o ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido metano- o etano-sulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, etano-1 , 2-disulfónico, ácido bencenosulfónico , ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 1,5-naftalenodisulfónico, ácido 2 -, 3-o 4-metil-bencenosulfónico, ácido metilsulfúrico , ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclohexilsulfámico, N-metil-, N-etil- o N-propil-sulfámico, y otros ácidos protónicos orgánicos, tales como ácido ascórbico. Los ácidos inorgánicos adecuados son, por ejemplo ácidos hidrácidos halogenados, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico .

Los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención, o composiciones de los mismos, se usarán generalmente en una cantidad efectiva para conseguir el objetivo pretendido. Es de entenderse que la cantidad utilizada dependerá de la aplicación particular.

Para la administración tópica para tratar o prevenir infecciones por el VIH de una dosis terapéuticamente efectiva se puede determinar usando, por ejemplo, los ensayos in vitro proporcionados en los ejemplos. El tratamiento se puede aplicar mientras que la infección por VIH es visible, o incluso cuando no es visible. Un experto ordinario experto será capaz de determinar cantidades terapéuticamente eficaces para tratar infecciones tópicas sin experimentación indebida de VIH.

Para la administración sistémica, una dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante de peptidomimético de horquilla-ß que incluye la IC50 como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

Las dosis iniciales también se pueden determinar a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.

Las cantidades de dosificación para aplicaciones como agentes anti-VIH se pueden ajusfar individualmente para proporcionar niveles en plasma de los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención que son suficientes para mantener el efecto terapéutico. Los niveles en suero terapéuticamente eficaces se pueden alcanzar mediante la administración de dosis múltiples cada día.

En los casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva de los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Uno que tiene la habilidad ordinaria en la técnica será capaz de optimizar las dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin excesiva experimentación.

La cantidad de peptidomiméticos de horquilla-ß administrada, por supuesto, dependerá del sujeto a tratar, del peso del sujeto, la gravedad de la aflicción, la manera de administración y del juicio del médico que prescribe.

La terapia anti-VIH se puede repetir intermitentemente mientras las infecciones son detectables o incluso cuando no son detectables. La terapia se puede proporcionar sola o en combinación con otros fármacos, tales como por ejemplo otros agentes anti-VIH o agentes contra el cáncer, u otros agentes antimicrobianos.

Normalmente, una dosis terapéuticamente efectiva de los peptidomiméticos de horquilla-ß descritos en el presente documento proporcionará un beneficio terapéutico sin causar toxicidad sustancial.

La toxicidad de los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se puede determinar mediante procedimientos estándar farmacéuticos en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, mediante la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100 % de la población) . La relación de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación que no es tóxico para su uso en seres humanos. La dosificación de los peptidomiméticos de horquilla-ß de la invención se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis efectiva con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro del intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y dosis puede elegirse por el médico individual en vista de la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingí et al 1975, En: The Pharmacological Basis of Therapeutics , Ch.l, p.l).

La presente invención también puede incluir compuestos, que son idénticos a los compuestos de la fórmula general de ciclo ( -Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cysu-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) , enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, excepto que uno o más átomos se reemplazan por ur. átomo que tiene una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número de masa encontrado habitualmente en la naturaleza, por ejemplo, compuestos enriquecidos en 2H(D), 3H, nC, 14C, 129I etc. Estos análogos isotópicas y sus sales farmacéuticas y formulaciones se consideran agentes útiles en la terapia y/o diagnóstico, por ejemplo, pero no limitados a, donde una sintonización fina de tiempo de vida media in vivo podría conducir a un régimen de dosificación optimizada.

Los siguientes Ejemplos ilustran la presente invención pero no deben interpretarse como limitativos de su alcance en modo alguno.

EJEMPLOS 1. Síntesis de Péptidos Acoplamiento del primer residuo aminoácido protegido a la resina 1 g (1.4 mmol) de resina de 2-clorotritilo- (1.4 mmol/g; 100-200 de malla, matriz de polímero de copoli (estireno-1 % DVB) ; Barios et al. Tetrahedron Lett . 1989, 30, 3943-3946) se introdujo en un matraz secado. La resina se suspendió en CH2CI2 (5 mi) y se dejó hinchar a temperatura ambiente bajo agitación constante durante 30 min. Se añadió una solución de 0.98 mmol (0.7 eq) del primer residuo aminoácido adecuadamente protegido (véase a continuación) en CH2C12 (5 mi) se mezcla con 960 µ? (4 eq) de diisopropiletilamina (DIEA) . Después de agitar la mezcla de reacción durante 4 horas a 25°C, la resina se separó por filtración y se lavó sucesivamente con CH2C12 (lx), DMF (IX) y CH2C12 (IX). Una solución de CH2Cl2/MeOH/DIEA (17/2/1, 10 mi) se añadió a la resina y la suspensión se agitó durante 30 min. Después de la filtración se lavó la resina en el siguiente orden con CH2C12 (lx), DMF (lx), CH2C12 (lx), MeOH (lx), CH2C12 (lx), MeOH (lx), CH2C12 (2x) , ET20 (2x) y se secó bajo vacio durante 6 horas.

La carga era típicamente 0.6-0.7 mmol/g.

Se prepararon las siguientes resinas precargadas: Resina Fmoc -Pro- 2-clorotritilo .

La síntesis se llevó a cabo empleando un sintetizador de siro-péptido (MultiSynTech) usando 24-96 recipientes de reacción. En cada buque 0.04 mmol de la resina anterior se colocó y la resina se hinchó en CH2C12 y DMF durante 15 min, respectivamente. Se programan y llevan a cabo los siguientes ciclos de reacción: Paso Reactivo Tiempo 1 DMF, lavado 2x1 min 2 20 % de piperidina/DMF 1x5 min, 1x15 min 3 DMF, lavado 5x1 min 4 5 eq de aminoácidos Fmoc/ DMF +5 eq Py-BOP/DMF, 10 eq de DIEA/DMF 1x60 min 5 DMF, lavado 3x1 min Paso 4 se repitió una vez.

A menos que se indique lo contrario, el acoplamiento final de un aminoácido fue seguido por desprotección de Fmoc mediante la aplicación de los pasos 1-3 del ciclo de reacción descrito anteriormente.

Síntesis de bloques de construcción de Aminoácidos Síntesis de Fmoc -Orn (iPr, Boc) -OH La síntesis de ácido (2S)-Na-fluorenilmetoxilcarbonil -Nw, Nw-ter-butiloxicarbonil-isopropil- 2 , 5-diaminopentanoico se llevó a cabo mediante la suspensión de 15.2 g de Fmoc-Orn-OH * HC1 en 150 mi de THF (0.26 M) seguido de la adición de 375 mi de acetona (132 eq) y 20.6 g triacetoxiborohidruro de sodio (2.5 eq) . La mezcla de reacción se agitó durante 2 h y después de terminar la reacción (monitorizada por LC-MS) 120 mi de solución sat. Se añadió solución de Na2C03 y 10.2 g Boc20 (1,2 eq) . Después de agitar durante la noche se sentó. La solución de Na2C03 y Boc20 se añadieron de nuevo dos veces en porciones de acuerdo con el material de partida restante. Tras el término de introducción de Boc-hexano se añadió dos veces, se separó, y la capa acuosa se acidificó con 5 N HCIaq (pH = 1) y se extrajo tres veces con acetato de etilo a partir de entonces. Finalmente, las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2S04 y se evaporaron para obtener el producto como espuma blanca.

El bloque de construcción de aminoácidos Fmoc-Lys (iPr, Boc)-OH se puede sintetizar en consecuencia o se encuentra disponible comercialmente.

Los bloques de construcción de aminoácidos Fmoc-Tyr (Me) -OH y Fmoc-DTyr (Me) -OH también están disponibles comercialmente .

Ciclización y trabajo de péptidos ciclizados de la estructura de la base Separación del fragmento de péptido totalmente protegido Después de la terminación de la síntesis, la resina (0.04 mmol) se suspendió en 1 mi (0.13 mmol, 3.4 eq) de 1 % TFA en CH2C12 (v/v) durante 3 minutos, se filtró, y el filtrado se neutralizó con 1 mi (0.58 mmol, 14.6 eq) de 10 % DIEA en CH2C12 (v/v) . Este procedimiento se repitió tres veces para asegurar la finalización de la separación. El filtrado se evaporó a sequedad y una muestra del producto se desprotegió completamente mediante el uso de una mezcla de separación que contiene ácido 95 % trifluoroacético (TFA) , 2.5 % de agua y 2.5 % de triisopropilsilano (TIS) para ser analizado por HPLC de fase (columna inversa Ci8) y ESI- S para monitorear la eficiencia de la síntesis del péptido lineal.

Ciclización del péptido lineal El péptido lineal completamente protegido (0.04 mmol) se disolvió en DMF (4 µ???/ml). Luego 30.4 mg (0.08 mmol, 2 eq) de HATU, 10.9 mg (0.08 mmol, 2 eq) de HOAt y 28 µ? (0.16 mmol, 4 eq) se añadieron DIEA, y la mezcla se agitó con vórtice a 25°C durante 16 horas y posteriormente se concentró a alto vacío. El residuo se repartió entre CH2C12 y H20/CH3CN (90/10: v/v). La fase de CH2C12 se evaporó para producir el péptido cíclico completamente protegido.

Desprotección completa del péptido cíclico El péptido cíclico obtenido se disolvió en 3 mi de la mezcla de separación que contiene ácido 82.5 % trifluoroacético (TFA), 5 % de agua, 5 % tioanisol, 5 % de fenol y 2.5 % etanditiol (EDT) . La mezcla se dejó en reposo a 25°C durante 2.5 horas y después se concentró bajo vacío.

Después de la precipitación del péptido cíclico totalmente desprotegido en éter dietilico (ET20) a 0°C, el sólido se lavó dos veces con ET20 y se secó.

Formación de enlace de disulfuro y la purificación de hebra-p Después de la desprotección completa, el péptido bruto se disolvió en solución reguladora de acetato de amonio 0.1 M (1 mg/1 mi, pH = 7-8). Se añadió DMSO (hasta 5 % en volumen) y la solución se agitó durante la noche. Después de la evaporación el residuo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa.

Después de la liofilización de los productos se obtuvieron como polvos blancos y se analizaron por el siguiente método analítico: tiempos de retención de HPLC analítica (RT, en minutos) se determinaron utilizando una columna Ascentis Express C18, 50 x 3.0 mm, (cod. 53811 -U-Supelco) con los siguientes disolventes A (H20 + 0.1 % TFA) y B (CH3CN + 0.1 % de TFA) y el gradiente: 0-0.05 min: 97 % A, 3 % B; 3,4 min: 33 % A, 67 % B; 3.41-3.65 min: 3 % A, 97 % B; 3.66-3.7 min: 97 % A, 3% B. Régimen de flujo = 1.3 ml/min; UV Vis = 220 nm.

Ejemplo 1: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O- 2-clorotritilo, que se preparó como se ha descrito anteriormente. Para que la resina DPro, finalmente en la posición 15, se injertó. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15-Lys (iPr) 14-Gln13-Tyr12-Cysu-Tyr10-Arg9-Orn ( iPr) 8-DPro7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr3-His2-Tyr1. Después de una desprotección de Fmoc final como se describe anteriormente, el péptido se separó de la resina, se ciclizó, se desprotegió y, después de la formación del enlace disulfuro de hebra-ß como se describió anteriormente, se purificó como se indica más arriba.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico como se describe anteriormente (UV-pureza [después de HPLC preparativa]: 95 %; RT: 1.56; [M+3H] /3 = 685.7) .

E emplo 2 : La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó como se ha descrito anteriormente. Para que la resina DPro, finalmente en la posición 15, se injertó. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15- Lys (iPr) "-Gln13-Tyr12-Cysn-Tyr10-Arg9-Orn (iPr) 8-DPro7-Ala6-Ser5-Cys4-Tyr (Me ) 3-His2-Tyr1. Después de una desprotección de Fmoc final como se describe anteriormente, el péptido se separó de la resina, se ciclizó, se desprotegió y, después de la formación del enlace hebra-ß disulfuro como se describió anteriormente, se purificó como se indica más arriba.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico como se describió anteriormente (UV-pureza [después de HPLC preparativa]: 95 % ; RT: 1.7; [ +3H] /3 = 690.4) .

Ejemplo 3: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó como se ha descrito anteriormente. Para que la resina DPro, finalmente en la posición 15, se injertó. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15-Lys (iPr) 14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-DAB8-D yr7-Ala6-Ser5-Cys4-Ala3-His2-Tyrx . Después de una desprotección de Fmoc final como se describe anteriormente, el péptido se separó de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace de hebra-ß disulfuro como se describió anteriormente, se purificó como se indica más arriba.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico como se describe anteriormente (UV-pureza [después de HPLC preparativa]: 95 % ; RT: 1.57; [M+3H] /3 = 658.3) .

Ejemplo 4: La resina de partida fue resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritilo, que se preparó como se ha descrito anteriormente. Para que la resina DPro, finalmente en la posición 15, se injertó. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15-Lys (iPr) 14-Gln13-Tyr12-Cysu-Tyr10-Arg9-Orn (iPr) 8-DTyr (Me) 7-Ala6-Ser5-Cys4-Ala3-His2-Tyrx . Después de una desprotección de Fmoc final como se describe anteriormente, el péptido se separó de la resina, se ciclizó, se desprotegió y, después de la formación del enlace hebra-ß disulfuro como se describió anteriormente, se purificó como se indica anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC (minutos) se determinó utilizando el método analítico como se describe anteriormente (UV-pureza [después de HPLC preparativa]: 95 % ; RT: 1.70; [M+3H] /3 = 681.7) .

Ejemplo 5: La resina de partida era resina Fmoc-Pro-0-2-clorotritilo, que se preparó como se ha descrito anteriormente. Para que la resina DPro, finalmente en la posición 15, se injertó. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15-Lys (iPr) 14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg -Orn ( iPr ) 8-DTyr7-Ala6-Ser5-Cys4-Ala3-His2-Tyr1. Después de una desprotección de Fmoc final como se describe anteriormente, el péptido se separó de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace hebra-ß disulfuro como se describió anteriormente, se purificó como se indica anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC- (minutos ) se determinó utilizando el método analítico como se describe anteriormente (UV-pureza [después de HPLC preparativa]: 95 % ; RT: 1.60; [M+3H] /3 = 707.4).

Ejemplo 6: La resina de partida era resina Fmoc-Pro-O- 2-clorotritilo, que se preparó como se ha descrito anteriormente. Para que la resina DPro, finalmente en la posición 15, se injertó. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro16-DPro15- Lys (iPr) 14-Gln13-Tyr12-Cys11-Tyr10-Arg9-Orn ( iPr ) 8-DTyr ( e) 7-Ala6-Ser5-Cys4- Tyr ( e) 3-His2-Tyr1. Después de una desprotección de Fmoc final como se describe anteriormente, el péptido se separó de la resina, se cicló, se desprotegió y, después de la formación del enlace hebra-ß disulfuro como se describió anteriormente, se purificó como se indica anteriormente.

El tiempo de retención de HPLC- (minutos ) se determinó utilizando el método analítico como se describe anteriormente (UV-pureza [después de HPLC preparativa]: 95 % ; RT: 1.83; [M+3H] /3 = 717.0). 2. Métodos biológicos 2.1. Preparación de péptidos Los péptidos liofilizados se pesaron en una microbalanza (Mettler MT5) y se disolvieron en DIVISO a una concentración final de 10 mM. Las soluciones madre se mantuvieron a 4°C, protegido de luz. Los ensayos biológicos se llevaron a cabo bajo condiciones de ensayo que tienen menos de 1 % de DIVISO a diferencia se indique lo contrario. 2.2. Cultivo celular Las células de Namalwa (CXCR4 que expresan de forma nativa las células no adherentes, ATCC CRL- 1432) se cultivaron en RPMI 1640 más un 10 % de SFB, y las células HeLa de penincilina/estreptococo se mantuvieron en RPMI1640 más un 10 % de FBS, penicilina/estreptococos y 2 mM de L-glutamina. Las células de Cos-7 se cultivaron en medio DMEM con 4500 mg/ml de glucosa suplementado con 10 % de FCS, penicilina/estreptococo y 2 mM de L-glutamina. Todas las lineas celulares se cultivaron a 37°C en 5 % de C02. Los medios celulares, los suplementos de medios, solución reguladora PBS, HEPES, antibiótico/antimicótico, penincilina/estreptococo, aminoácido no esencial, L-glutamina, ß-mercaptoetanol y los sueros fueron adquiridos de Gibco (Pailsey, Reino Unido). Todos los productos de química fina fueron suministrados por Merck (Darmstadt, Alemania). 2.3. Prueba Quimiotáctica (prueba de migración celular) La respuesta quimiotáctica de las células Namalwa (ATCC CRL-1432) a un gradiente de factor de células del estroma derivadas de la (SDF-1) se midió utilizando un sistema de cámara de Boyden modificada de quimiotaxis (ChemoTx; Neurosonda) . En este sistema, la cámara superior de cada pozo está separado de la cámara inferior que contiene el quimioatrayente SDF-1 por una membrana de policarbonato (tamaño de poro 5 µp?) . Un área circular de la membrana en la región que cubre cada pozo inferior está cerrada por una máscara hidrófoba para mantener la suspensión de células dentro de esta área. El sistema ha sido elaborado por la carga de los pozos de fondo con alícuotas de 30 µ? de medio quimiotaxis (RPMI 1640 sin rojo fenol + 0.5 % BSA) que comprende cualquiera de las diluciones en serie apropiadas de péptidos o no péptidos en absoluto en combinación con SDF- 1 (0.9 nM) o sin el quimioatrayente . La membrana se coloca sobre los pozos de fondo, y alícuotas de 50 µ? de una suspensión de células de Namalwa (3.6 x 106 células/ml) en medio de quimiotaxis, premezclada con medio de quimiotaxis que comprende cualquiera de diluciones en serie apropiadas de péptidos o ningún péptido en absoluto, fue entregado ert cada una de las regiones hidrofobicamente limitada de la superficie superior de la membrana. Las células se dejaron migrar en la cámara inferior durante 5 horas a 37°C en 5 % de C02. Después de este período, la membrana se eliminó y su parte superior se limpió cuidadosamente y se lavó con PBS para eliminar las células no migradas. Las células migradas se transfieren por medio de un adaptador de "embudo" a una placa de 96 pozos de recepción y el número de células se determinó utilizando la prueba de proliferación celular CyQuant™ NF ( Invitrogen) , basado en la medición del contenido de ADN celular a través de colorante fluorescente de unión. Siguiendo las instrucciones del fabricante, 50 µ? de solución reguladora CyQuant™ colorante reactivo/HBSS (1/500 [v/v] ) se añadieron a cada pozo de la antes mencionada placa de recepción de 96 pozos. Después de incubación durante 0,5 h a temperatura ambiente, la placa se selló y la intensidad de fluorescencia de cada muestra se midió mediante el uso de un lector de placas allac 1420 VICTOR2™ (Perkin Elmer) con excitación a 485 nm y emisión a 535 nm de detección. Por último, los datos se normalizaron mediante el uso de los controles y valores de IC50 se determinaron utilizando GraphPad Prism™ (GraphPad) ajustando una curva logarítmica a los puntos de datos promediados. 2.4. Prueba de citotoxicidad La citotoxicidad de los péptidos a células HELA (Acc57) y células COS-7 (CRL-1651) se determinó utilizando la prueba de reducción de MTT (Mossman T., J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63; Berridge MV, A.S. Tan, Arch. Biochem. Biophys 1993, 303, 474-482) . Brevemente, el método fue el siguiente: 4000 células HeLa/pozo y 3400 COS-7 células/pozo fueron sembradas y cultivadas en placas de microtitulación de 96 pozos durante 24 horas a 37 °C en 5 % de C02. A partir de entonces, el tiempo cero (Tz) se determinó por reducción de MTT (véase a continuación) . El sobrenadante de los pozos restantes se descartó, y medio y compuestos en diluciones en serie (12.5, 25 y 50 yM, triplica; 0 µ?, en blanco) se pipetearon en los pozos. Después de la incubación de las células durante 48 h a 37 °C en 5 % de C02 el sobrenadante se descartó de nuevo y 100 µ? MTT reactivo (0.5 mg/ml en RPMI 1640 y DMEM, respectivamente) /se añadió también. Después de la incubación a 37 °C durante 2-4 h, los medios se aspiraron y las células se enriquecieron (100 µ? isopropanol/pozo) . La absorbancia del formazán solubilizado se midió a 595 nm (péptido OD595) . Para cada uno se calcularon los promedios de concentración de los triplicados. El porcentaje de crecimiento se calculó como sigue: (péptido OD595-OD595 Tz)/(OD595 blanco-OD595Tz) x 100 %. Se calcularon los (inhibición del crecimiento) concentraciones GI50 para cada péptido utilizando una función de linea de tendencia para las concentraciones (50, 25, 12.5 y 0 µ?) , los porcentajes correspondientes y el valor 50, (= TENDENCIA (C50 : CD, % 50 : 50 ) . 2.5. Hemolisis Los péptidos se ensayaron para determinar su actividad hemolitica contra glóbulos rojos humanos (hRBC) . Los HRBC frescos se lavaron cuatro veces con solución reguladora fosfato salino (PBS) y se centrifugó durante 10 min a 3000 x g. Los compuestos (100 uM) se incubaron con 20 % hRBC (v/v) durante 1 hora a 37°C y agitación a 300 rpm. La concentración de eritrocitos final fue de aproximadamente 0.9 x 109 células/ml. Un valor de 0 % y 100 % de lisis celular, respectivamente, se determinó mediante la incubación de hRBC en presencia de PBS que contenia 0.001 % de ácido acético y 2.5 % de Tritón X-100 en H20, respectivamente. Las muestras se centrifugaron, los sobrenadantes fueron 8 veces diluido en solución reguladora PBS y las densidades ópticas (OD) se midieron a 540 nm . El valor 100 % lisis (OD540H2O) dio una OD540 de aproximadamente 0.5 a 1.0. El porcentaje de hemolisis se calculó como sigue: (péptido OD540 OD54oH20) x 100 %. 2.6. Estabilidad del plasma La estabilidad de los péptidos en plasma humano y de ratón se determinó aplicando el método siguiente: '346.5 µ?/???? profundo de plasma humano recién descongelado (Basler Blutspende-Dienst ) y plasma de ratón (Harían Sera- Lab, Reino Unido), respectivamente, fueron de pinchos con 3.5 µ?/???? de compuesto disuelto en DMSO/H20 (90/10 [v/v] , 1 mM de, por triplicado) y se incubaron a 37°C. a t = 0, 15, 30, 60, 120, 240 y 1440 min alícuotas de 50 µ? se transfirieron a pozos de la placa de filtración que contienen 150 µ?/???? de ácido fórmico al 2 % en acetonitrilo . Después de agitar durante 2 min de las suspensiones ocurrido se filtraron al vacío. 100 µ? de cada filtrado se transfirieron a una placa de microtitulación de prppileno y se secaron en atmósfera de N2. Los sólidos residuales se reconstituyeron mediante la adición de 100 µ?/???? de agua/acetonitrilo, 95/5 (v/v) + 0.2 % de ácido fórmico y se analizaron por LC/MS como sigue: Columna: Waters, XBridge C18, fases móviles: (A) agua + 0.1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo/agua, 95/5 (v/v) de ácido fórmico + 0.1 %, gradiente: 5 % -100 % (B) en 1.8 minutos, ionización por electrorociado, detección de MRM (de triple cuadruplo) . Las áreas de los picos se determinaron valores por triplicado y se promedian. La estabilidad se expresa en porcentaje del valor inicial en t = 0. (tx/tO X 100). Al utilizar la función TENDENCIA de Excel (Microsoft Office 2003) se determinaron Tl /2 · 2.7. Unión a proteínas plasmáticas Las alícuotas de 495 µ? de plasma humano (Basler Blutspendedienst) , asi como alícuotas de 495 µ? de PBS se colocaron en pozos profundos individuales de una placa de polipropileno (Greiner) y se trataron cada uno con 5 µ? de soluciones de péptidos 1 mM en 90 % de DMSO. Después de agitar la placa durante 2 min a 600 rpm las alícuotas 150 µ? de las mezclas de plasma/péptido se transfirieron por triplicado a la placa de filtro de polipropileno (10 kDa, Millipore) mientras que alícuotas de 150 µ? de las mezclas de PBS/péptido se transfirieron o bien a la pozos individuales de la placa de filtro (controles filtrados) o directamente en los pozos individuales de la placa receptora (Greiner) (controles no filtrada) . El emparedado de placa que consta de filtro y la chapa de recepción se incubó durante 1 h a 37°C y posteriormente se centrifugó a 3220 g durante 2 horas a 15°C.

Los filtrados en la placa receptora se analizaron por LC/MS como sigue: Columna: aters, XBridge C18, fases móviles: (A) agua + 0.1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo/agua, 95/5 (v/v) ácido + 0.1 % ácido fórmico, gradiente: 5 % -100 % (B) en 1.8 minutos, ionización por electrorociado, detección de MRM (triple cuadrupolo) . Las áreas de los picos se determinaron valores por triplicado y se promedian. La unión se expresa en porcentaje de los controles filtrados y no filtrados por 100-(100x Tih/Tctr) . Finalmente se calcula la media de estos valores.

Los resultados de los experimentos descritos en 2.3 a 2.7 se indican en las Tablas 1, 2, 3 y 4 en el presente documento a continuación. 2.8. Estudio farmacocinético (PK) Para los compuestos de Ej . 1, Ej . 2, Ej . 3, Ej . 4, Ej . 5 y Ej . 6 se llevaron a cabo estudios farmacocinéticos después la administración por via intravenosa (iv) . 30 gramos (± 20 %) se utilizaron ratones machos CD-I obtenidos de Charles River Laboratories Deutschland GmbH. El vehículo, solución reguladora fosfato salino, se añadió para dar una concentración final de 0.5 mg/ml del compuesto. El volumen fue 2 ml/kg y el compuesto se inyectó para dar una dosis intravenosa final de 1 mg/kg. Aproximadamente 300-400 µ? de sangre se eliminó bajo ligera anestesia con isoflurano por CA punción cardiaca intervalos de tiempo predeterminado (5, 15, 30 min a 1, 2, 3, 4 horas) y se añadieron a tubos heparinizados . El plasma se retira de las células sedimentadas sobre centrifugación y se congeló a -80°C antes de su análisis por HPLC-MS.

Preparación de plasma de calibración y de muestras de estudio de plasma Las alícuotas de 50 µ? cada uno de plasma de ratón de animales sin tratar (plasma de ratón " blanco") se enriquecieron con cantidades conocidas de los compuestos Ej . 1, Ej . 2, Ej . 3, Ej . 4, Ej . 5 y Ej . 6 con el fin de obtener 10 muestras de plasma de calibración para cada compuesto en el rango de 1 a 4000 ng/ml. Las alícuotas de 50 µ? cada uno de plasma de ratón de los animales tratados fueron utilizados como muestras de estudio de plasma.

Extracción de plasma de calibración y de muestras de estudio de plasma Todas las muestras de plasma fueron sobrecargadas con un patrón interno adecuado y se extrajeron con acetonitrilo que contiene ácido fórmico al 2 %. Los sobrenadantes se evaporaron a sequedad en atmósfera de nitrógeno y los sólidos restantes reconstituidas en agua/acetonitrilo 95/5 (v/v) de ácido fórmico + 0.2 % .

Análisis LC-MS/MS Los extractos se analizaron a continuación por cromatografía de fase inversa (Acquity BEH C18, columna 100 x 2.1 i i , 1.7 µp?, Waters por Ej . 1 y Acquity HSS C18 SB, columna 100 x 2.1 mm, 1.8 ym, Waters por ej . 2, Ej . 3, Ej . 4, Ej . 5 y Ej . 6), usando las siguientes condiciones: Ej . 1, fases móviles: (A) agua/acetonitrilo 95/5 (v/v) + ácido fórmico al 0.1 %, (B) acetonitrilo/agua 95/5 (v/v) de ácido fórmico + 0.1 %, gradiente: 1 % (B) 0-0.1 min, 15 % (B) 0.1-2.5 min para Ex. 1 y 1 % (B) 0-0.1 min, 40 % (B) 0.1-2.5 min para Ej . 2, Ej . 3, Ej . 4, Ej . 5 y Ej . 6. La detección y cuantificación se realizó por espectrometría de masas, con interfaz de electropulverizacion en modo positivo y la fragmentación selectiva de analitos (4000 espectrómetro de masas de trampa de Q, AB Sciex) .

Evaluación farmacocinética Los parámetros farmacocinéticos fueron calculados por la versión de software WinNonLin™ 5.3 (Pharsight -A Certara™ Company, Moutain View, CA 94041 USA) utilizando un solo análisis compartimental del modelo. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron por ajuste de mínimos cuadrados del modelo a los datos experimentales.

Los resultados de los experimentos descritos en 2.8 se indican en las Tablas 5a y 5b en el presente documento a continuación . 2.9. Cálculos de carga de fármaco a través de mantenimiento de tasa de dosis (régimen de infusión) La carga de fármaco para un implante que comprende un péptido de la invención se ha calculado siquiendo los principios básicos de farmacocinética (ver también J. Gabrielsson, D. Weiner, " Farmacocinética y farmacodinamia y la de análisis de datos: Conceptos y Aplicaciones", cuarta edición, farmacéutica sueca Prensa, Estocolmo, Suecia, 2006) mediante el cual el régimen de dosis de mantenimiento (velocidad de infusión, RIN) se puede definir como la velocidad a la que un medicamento es para ser administrado para alcanzar un estado de equilibrio de una cierta dosis en el plasma. La tasa de dosis mantenimiento se puede expresar mediante la correlación Rin [g/ (h * kg ) ] = CLiv [L/ (h * kg) ] x CSs,eff [g/1] r en donde CLiv es la separación (iv-admin.) y Css,eff la concentración efectiva del fármaco en el plasma en estado estable teniendo en cuenta un margen de eficacia a: Css,eff [g/L] = A x (ICso/fu) x MW [ (mol/L) * (g/mol)]. Por lo tanto, la cantidad total de un fármaco cargado en un implante para proporcionar una concentración efectiva constante de ese fármaco en el plasma durante un cierto periodo de tiempo en un sujeto de un determinado peso corporal se puede calcular mediante la aplicación de la siguiente correlación: Medicamentoscarga [g/asunto] = Rin [g/ (h * kg) ] x duración [h] x B [ kg/sujeto] .

Los resultados de los cálculos descritos en 2.9 se indican en la Tabla 6 a continuación en el presente documento y en base a los datos dados en las Tablas 1, 4 y 5b. Otras condiciones previas son un margen de eficacia de ? = 3, una duración del estudio de 672 h (28 días) y un peso corporal de un sujeto humano de 70 kg. La tasa de filtración glomerular (TFG) , que principalmente influye la eliminación de los péptidos es altamente dependiente de la especie. En general, la TFG de los seres humanos se promedia para ser 107 ml/(h * kg) en comparación con el FG de ser ratón 840 mi/ (h * kg) . Por lo tanto, los valores CLiv-ratón indicados en la Tabla 5b se alométricamente escaladas por 107 mi/ (h * kg)/840 mi/ (h * kg ) = 0.127 antes empleado en las correlaciones antes descritas. 3.0. Movilización de HSC en el ratón Para los compuestos del Ej . 1 y Ej . 2 un estudio de movilización de HSC se llevó a cabo consiste en un estudio de tiempo de respuesta para evaluar el tiempo de la movilización máxima después de la dosificación y un estudio de respuesta de dosis posterior.

Estudio de tiempos de respuesta Los ratones macho C57BI/6 (Janvier, Francia; n = 5 para Ej . 1, n = 3 para Ej . 2) recibieron inyecciones ip de bolo de E . 1 y Ej . 2, respectivamente, (5 mg/kg) disuelto en 10 µ? de agua por g de peso de ratón que contiene 0.9 % de NaCl. La sangre se retira de la bolsa de la mejilla en tubos de EDTA revestidos para los puntos de tiempo 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 y 8 horas después de la administración . La unidad de formación de colonias en los recuentos de cultivo (CFU-C cuenta) se determinó mediante la modalidad de un ensayo de CFU -C como se describe a continuación. Los resultados del estudio de tiempo de respuesta para el Ej . 1 y Ej . 2 se indican en las Tablas 7a y 7b.

Estudio respuesta de dosis Los ratones macho C57BL/6 (Janvier, Francia; n= 5 por grupo de dosis para Ej . 1, n = 3 por grupo de dosis para Ej . 2) recibieron bolo IP inyecciones de Ej . 1 y Ej . 2, respectivamente, a dosis de 0.5, 1.5, 5 y 15 mg/kg (compuesto disuelto en 10 µ? de agua por g de peso de ratón que contiene 0.9 % de NaCl) . La sangre se recogió como se describió anteriormente en el momento de máxima movilización para Ej . 1 (4 h) y Ej . 2 (2 h) , respectivamente. Los resultados del estudio de dosis -respuesta para Ej . 1 y Ej . 2 se indican en las Tablas 8a y 8b.

Prueba de CFU-C Los recuentos de CFU-C se determinaron mediante el cultivo de alícuotas de sangre periférica se lisaron en medio de cultivo de células progeni toras semi-sólidas estándar. En breve, una cantidad definida de sangre se lavó con solución reguladora PBS (Gibco ®) que contiene 0.5 % de albúmina de suero bovino, seguido de lisis de glóbulos rojos en solución reguladora hipotónico NH4C1 (Sigma) y una segunda paso de lavado. El sedimento celular se resuspendió en DMEM (Gibco ®) que contiene 10 % de FCS, se suspendió en 2 mi de disponible comercialmente, medio de metilcelulosa-citoquina repleta de células de murino (sistemas de células, EUA) , y se sembraron por duplicado en 35 mm placas de cultivo celular. CFU- C fue evaluado luego de 7-8 días de incubación en condiciones estándar (20 % C02, humedad saturada, 5 % C02, 37°C). Se analizaron las células en la sangre periférica usando una máquina de conteo sanguíneo automatizado (Drew Scientific) .

Curva de respuesta de dosis Logio y ED50 Las curvas de respuesta de dosis LoglO de Ej . 1 y Ej . 2 sobre la base de las/ml- valores de UFC para las dosis de 1.5, 5 y 15 mg/kg, como se indica en las Tablas 8a y 8b, respectivamente, se muestran en la Figura 1 y provis.to de utilizar la función de ajuste de respuesta de dosis sigmoidal en GraphPad Prism, versión 5.03. Teniendo en cuenta las progresiones de la curva de ambos compuestos los de respuesta de dosis están limitados a una respuesta máxima de 4000 UFC/ml. Por lo tanto, los valores DE50 indicados en la Tabla 9 se corresponden a una respuesta de 2000 UFC/ml.

Tabla 1 Tabla 2 Tabla 4 Tabla 5a Tabla 5b Tabla 6 Tabla 7a Tabla 7b Tabla 8a Tabla 8b Tabla 9

Claims (14)

» 76 REIVI DICACIONES

1.- Un compuesto peptidico ciclizado de la estructura de la base, construido de 16 residuos de aminoácidos, de la fórmula: Ciclo (-Tyr^His^Xaa^Cys^Ser^Ala^Xaa^Xaa8- Arg9, Tyr10-Cysn-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro1 -Pro16-) (I), en donde Xaa3 es Ala, Tyr o Tyr (Me), Tyr(Me) es (2S) -2-amino- ( 4 -metoxifenil) -3-propiónico , Xaa7 es DTyr, DTyr (Me), o DPro, DTyr(Me) es ( 2R) -2 -amino- ( 4 -metoxi fenil ) -3-propiónico, o Xaa8 es Dab, u Orn (iPr) , Dab es ácido (2S) -2 , 4-diaminobutírico Orn(iPr) es ácido (2S)-NW- isopropil-2 , 5-diaminope tañoico, Xaa13 es Gln o Glu, Xaa14 es Lys ( iPr ) , Lys(iPr) es ácido (2S)- Nw- isopropil- 2,6-diaminohexanoico, todos los residuos de aminoácidos, que no se designan explícitamente como residuos de D-aminoácido, son residuos de L-aminoácido, y los dos grupos -SH en los dos residuos de L-cisteína Cys" y Cys11 se reemplazan por un grupo -S-S, en la forma libre o en una forma de sal farmacéuticamente aceptable.

2. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, de la fórmula I, en el cual Zaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

3. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de la fórmula I en donde Xaa3 es Tyr; o Tyr (Me), Xaa7 es DPro, Xaa8 es Orn(iPr) y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

4. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de la fórmula I, en donde Xaa3 es Ala, Xaa7 es DTyr, Xaa8 es Dab, y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

5. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, de la fórmula I, en donde Xaa3 es Tyr, Xaa7 es DPro., Xaa8 es Orn (iPr) , y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

6.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 de la fórmula I, en donde Xaa3 es Tyr (Me), Xaa7 es DPro, Xaa8 es Orn (iPr), y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

7.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de la fórmula I, en donde Xaa3 es Ala, Xaa7 es DTyr (Me), Xaa8 es Orn (iPr) , y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

8. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de la fórmula I, en donde Xaa3 es Tyr, Xaa7 es DTyr, Xaa8 es Orn (iPr), y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

9. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de la fórmula I, en donde Xaa3 es Tyr (Me), Xaa7 es DTyr (Me), Xaa8 es Orn(iPr), y Xaa13 es Gln, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

10. - Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 de la fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, para su uso como una sustancia farmacéuticamente activa, en particular como sustancias que tienen antagonista de CXCR , actividad anticáncer y/o actividad anti-inflamatoria y/o actividad de movilización de células madre.

11. - Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 de la fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y un vehículo farmacéuticamente inerte, en particular en una forma adecuada para administración oral, tópica, transdérmica , por inyección, la administración bucal o transmucosa tal como un comprimido, gragea, cápsula, solución, líquido, gel, yeso, crema, ungüento, jarabe, suspensión, suspensión, polvo o un supositorio .

12. - El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 de la fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, como un medicamento que tiene antagonista de CXCR4 , actividad anti-cancerigena y/o actividad anti-inflamatoria y/o la actividad de movilización de células madre, en particular para la prevención de infecciones por VIH en individuos sanos; para retardar, o detener, la progresión viral en un paciente infectado por el VIH; para tratar o prevenir, un cáncer, o una enfermedad inmunológica, que está mediada por, o resultados de, la actividad del receptor CXCR4; para el tratamiento de la inmunosupresión; para acompañar la colección de aféresis de células madre de sangre periférica, o para inducir la movilización de las células madre para regular la reparación de tejidos.

13. - El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 de la fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento que tiene antagonista de CXCR4, actividad anti-cáncer y/o actividad antiinflamatoria y/o detener la actividad de movilización de células, en particular para la prevención de infecciones por VIH en individuos sanos; para retardar, o detener, la progresión viral en un paciente infectado por el VIH; para tratar o prevenir, un cáncer, o una enfermedad inmunológica , que está mediada por, o resultados de, la actividad del receptor CXCR ; para el tratamiento de la inmunosupresión ; para acompañar la colección de aféresis de células madre de sangre periférica, o para inducir la movilización de las células madre para regular la reparación de tejidos.

14.- Un proceso para la fabricación de un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 de la fórmula I que comprende los pasos de: (a) acoplamiento de un soporte sólido funcionalizado con un Pro aminoácido N-protegido, el cual Pro forma la base del residuo de aminoácido en la posición 16 del compuesto de la fórmula I ; (b) eliminar el grupo N-protector del producto del paso (a ) ; (c) acoplar el producto del paso (b) con un aminoácido N-protegido-DPro, el cual DP.ro forma la base del residuo aminoácido en la posición 15 del compuesto de la fórmula I; (d) eliminar el grupo N-protector del producto del paso (c) ; (e) añadir, de una manera análoga a la descrita en los pasos (c) y (d) , cada uno de los residuos de aminoácidos deseados en las posiciones 14 a 1 del compuesto de la fórmula I, uno después del otro, con el grupo amino libre del residuo de aminoácido siendo, en cada caso, en el extremo libre de la cadena peptidica en crecimiento acoplado al soporte sólido, el aminoácido deseado utilizado, en cada caso, en el paso de acoplamiento análogo al del paso (c) se N-protegido y cualquier grupo funcional presente en dicho aminoácido deseado, diferente al grupo carboxi del radical alfa-amino, también protegida; (f) sustituir los grupos-SH de dos en los dos residuos de Cys en el producto del paso (e) por un grupo -S- S, a menos que esta-SS-grupo se forma en el paso (j); (g) separar el péptido hexadeca del soporte sólido; (h) acoplar el residuo de aminoácido en la posición 1 del hexadecapéptido con el residuo de aminoácido en la posición 16 del hexadecapéptido; (i) desprotección de cualquier grupo protegido presente funcional en el producto del paso (h) ; (j) reemplazar los grupos -SH de dos en los dos residuos de Cys en el producto del paso (i) por un grupo -S-S-, a menos que este grupo -S-S- se forme en el paso (f).; (k) adherir al producto del paso (j) uno o varios sustituyentes isopropilo, si se desea; (1) desproteger cualquiera de los grupos funcionales protegidos presentes en el producto del paso (k) ; y (m) convertir un compuesto de la fórmula I en forma libre en el compuesto correspondiente de la fórmula I en forma de sal farmacéuticamente aceptable, si el producto deseado del proceso es un compuesto de la fórmula I en forma de sal farmacéuticamente aceptable, o convertir un compuesto de la fórmula en la que la forma de sal farmacéuticamente aceptable en el correspondiente compuesto de la fórmula I en forma libre, si el producto deseado del proceso es un compuesto de la fórmula I en forma libre, o en el correspondiente compuesto de la fórmula I en un vehículo farmacéuticamente diferente forma de sal aceptable, si el producto deseado del proceso es un compuesto de la fórmula I en una forma de sal farmacéuticamente aceptable diferente. RESUMEN Los peptidomiméticos de ß-horquilla del ciclo fórmula general (Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa1 -DPro15-Pro16-) , disulfuro de enlace entre Cys4 y Cys11 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, Xaa3, Xaa7, Xaa8, Xaa13 y Xaa14 siendo residuos de aminoácidos de ciertos tipos que se definen en la descripción y las reivindicaciones, tienen propiedades farmacológicas favorables y pueden usarse para la prevención de infecciones por VIH en individuos saludables o para desacelerar y detener la progresión viral en pacientes infectados o en lugares en donde está mediada por el cáncer o como resultado de la actividad del receptor CXCR4 o en lugares en donde es mediada por enfermedades inmunológicas o como resultado de la actividad del receptor CXCR4, o para el tratamiento de inmunosupresión, o durante las recolecciones de aféresis de células madre de sangre periférica y/o como agentes para inducir la movilización de las células madre para regular la reparación de tejidos. Estos peptidomiméticos pueden ser fabricados por un proceso que se basa en una estrategia sintética mezclada en fase sólida y en solución.