JP6047231B2

JP6047231B2 - β−ヘアピンペプチド模倣薬

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Publication number: JP6047231B2
Application number: JP2015515399A
Authority: JP
Inventors: フランク・オットー・ゴンベルト; ダニエル・オブレヒト; アレクサンダー・レデラー; ヨハン・ツィンマーマン; クリスティアン・エフナー
Original assignee: Polyphor AG
Current assignee: Spexis AG
Priority date: 2012-06-06
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2032-06-06
Also published as: EP2859012B1; MX355396B; WO2013182240A1; AU2012381808A1; IL235946B; US20150218219A1; HK1207867A1; MX2014014840A; IN2014KN02752A; AU2012381808B2; US9617308B2; CN104603145B; NZ702470A; JP2015521204A; CA2875733C; IL235946A0; CN104603145A; US20170165319A1; CA2875733A1; ES2647076T3

Description

本発明は、CXCR4拮抗活性を有するβ−ヘアピンペプチド模倣薬を提供する。

本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬は、シクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）およびその医薬的に許容される塩［式中、Xaa³は、Tyr、本明細書の下記に記載のTyr(Me)、または本明細書の下記に記載のTyr(CF₃)であり、Xaa⁶は、Alaまたは本明細書の下記に記載のAccであり、Xaa⁸は、本明細書の下記に記載のOrn(iPr)であり、Xaa¹³は、GlnまたはGluであり、Xaa¹⁴は本明細書の以下に記載のLys(iPr)であり、Xaa¹⁵は、^DProまたは本明細書の下記に記載の^DLys(iPr)である。ただし、Xaa⁶がAlaである場合は、Xaa¹⁵は本明細書の以下に記載の^DLys(iPr)である。］である。

さらに、本発明は、所望により該化合物をパラレルライブラリーフォーマットで製造することができる効率的合成方法を提供する。該β−ヘアピンペプチド模倣薬は、好ましい医薬特性を有し、さらに、適切な血漿タンパク質結合速度および適切なクリアランス速度を示す。したがって、該模倣薬は、すべての種類の製剤、特に持続放出製剤の活性成分として少量で用いることができる。

多くの医学的に重要な生物学的プロセスは、ケモカインおよび一般的にはそのレセプター、およびストローマ細胞由来因子1(SDF-1/CXCL12)、特にそのレセプターCXCR4により仲介される。

CXCR4およびそのリガンドSDF-1は、B細胞、造血幹細胞(HSC)、および造血前駆細胞(HPC)の輸送（trafficking）に関与する。例えば、CXCR4は、CD34+細胞に発現し、CD34+細胞の遊走やホーミングのプロセスに関与している(S.M. Watt、S.P. Forde、Vox sanguinis 2008、94、18-32)。CXCR4レセプターは幹細胞および前駆細胞の骨髄から末梢血への放出に重要な役割を果たすことも知られている(L.M. Pelus、S. Fukuda、Leukemia 2008、22、466-473)。CXCR4のこの活性は、末梢血幹細胞の効率的なアフェレーシス収集に極めて重要かもしれない。自己末梢血細胞は、血液悪性疾患および固形腫瘍の患者の高用量化学療法または高線量放射線療法の実施後の自己移植後に急速で持続的な造血修復をもたらす(W.C. Liles et al.、Blood 2003、102、2728-2730)。

最近、SDF-1が、限局性虚血性脳卒中、全脳虚血、心筋梗塞、および後肢虚血を含む損傷の動物モデルにおいて局所的に上方調節され、肝臓、腎臓、または肺の末梢虚血後または損傷後の回復に関与していることが示された(A.E. Ting、R.W. Mays、M.R. Frey、W. Van't Hof、S. Medicetty、R. Deans、Critical Reviews in Oncology/Hematology 2008、65、81-93およびこの中に記載の文献；F. Lin、K. Cordes、L. Li、L. Hood、W.G. Couser、 S.J. Shankland et al.、J. Am. Soc. Nephrol. 2003、14、1188-1199；C.C. Dos Santos、Intensive Care Med. 2008、34、619-630)。これらの結果は、SDF-1が組織および器官修復/再生のためのCXCR4陽性幹細胞の走化性因子（chemoattractant）かもしれないことを示唆する(M.Z. Ratajczak、M. Kucia、R. Reca、M. Majka、A. Janowska-Wieczorek、J. Ratajczak、Leukemia 2004、18、29-40)。したがって、CXCR4阻害因子によるSDF-1/CXCR4軸の調節は、放出された幹細胞を用いる組織修復の調節に顕著な治療的有用性をもたらすはずである。

より最近、CXCR4阻害因子によるCXCR4/SDF-1軸の破壊は、前駆細胞、例えばHPC、内皮細胞(EPC)および間質前駆細胞(SPC)の骨髄からの分化的遊走に重要な役割を果たすことが示された(S.C. Pitchford、R.C. Furze、C.P. Jones、A.M. Wegner、S.M. Rankin,細胞 Stem細胞 2009、4、62)。さらに、骨髄由来のCXCR4+の非常に小さい胚性幹細胞(VSEL)は、急性心筋梗塞の患者に遊走し、仮想的レパラトリー（reparatory）メカニズムを示唆した(W. Wojakowski、M. Tendra、M. Kucia、E. Zuba-Surma、E. Paczkowska、J. Ciosek、M. Halasa、M. Kroel、M. Kazmierski、P. Buszman、A. Ochala、J. Ratajczak、B. Machalinski、M.Z. Ratajczak、J. Am. Coll. Cardiol. 2009、53、1)。これらの知見は、組織再生のための有効な幹細胞療法を提供するために用いることができる。

間葉幹細胞(MSC)は、骨および軟骨などの組織に分化する能力を有する非造血前駆細胞である(D.J. Prockop、Science 1997、276、71)。ごく一部のMSCが機能的に活性なCXCR4を強く発現するので、CXCR4/SDF-1軸の調節は、該細胞の特異的遊走およびホーミングを仲介するかもしれない(R.F. Wynn、C.A. Hart、C. Corradi-Perini、L. O'Neill、C.A. Evans、J.E. Wraith、L.J. Fairbaim、I. Bellantuono、Blood 2004、104、2643)。

一般的にケモカイン、特にSDF-1/CXCR4相互作用が血管新生に極めて重要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えてきている。ケモカインは、内皮細胞上のその同種レセプターと結合することにより直接、または他の血管新生刺激をもたらす炎症細胞浸潤物を促進することにより間接的に血管新生を誘導する。インターロイキン8(IL-8)、増殖調節癌遺伝子、間質細胞由来因子1(SDF-1)、単球走化性タンパク質1(MCP-1)、エオタキシン1、およびI-309を含む多くの炎症誘発性ケモカインが血管新生の直接誘導因子として働くことが示されている(X. Chen、J.A. Beutler、T.G. McCloud、A. Loehfelm、L. Yang、H.F. Dong、O.Y. Chertov、R. Salcedo、J.J. Oppenheim、O.M. Howard. Clin. Cancer Res. 2003、9(8)、3115-3123；R. Salcedo、J.J. Oppenheim、Microcirculation 2003、(3-4)、359-370)。

最近得られた結果は、CXCR4 レセプターが癌細胞の遊走能、例えば乳癌転移、または卵巣癌(A. Muller、B. Homey、H. Soto、N. Ge、D. Catron、M.E. Buchanan、T. Mc Clanahan、E. Murphey、W. Yuan、S.N. Wagner、J.L. Barrera、A. Mohar、E. Verastegui、A. Zlotnik、Nature 2001、50、410；J.M. Hall、K.S. Korach、Molecular Endocrinology 2003、17、792-803)、非ホジキンリンパ腫(F. Bertolini、C. Dell'Agnola、P. Manusco、C. Rabascio、A. Burlini、S. Monestiroli、A. Gobbi、G. Pruneri、G. Martinelli、Cancer Research 2002、62、3106-3112)、または肺癌(T. Kijima、G. Maulik、P.C. Ma、E.V. Tibaldi、R.E. Turner、B. Rollins、M. Sattler、B.E. Johnson、R. Salgia、Cancer Research 2002、62、6304-6311)、メラノーマ、前立腺癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、肝細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、および胚細胞癌(H. Tamamura et al.、FEBS Letters 2003、550、79-83、引用文献；Z. Wang、Q. Ma、Q. Liu、H.Yu、L. Zhao、S. Shen、J. Yao、British Journal of Cancer 2008、99、1695；B. Sung、S. Jhurani、K.S. Ahn、Y. Mastuo、T. Yi、S. Guha、M. Liu、B. Aggarwal、Cancer Res. 2008、68、8938；H. Liu、Z. Pan、A. Li、S. Fu、 Y. Lei、H. Sun、M. Wu、W. Zhou、Cellular and Molecular Immunology、2008、5、373；C. Rubie、O. Kollmar、V.O. Frick、M. Wagner、B. Brittner、S. Graeber、M.K. Schilling、Scandinavian Journal of Immunology 2008、68、635；S. Gelmini、M. Mangoni、F. Castiglioe、C. Beltrami、A. Pieralli、K.L. Andersson、M. Fambrini、G.l. Taddie、M. Serio、C. Orlando、Clin. Exp. Metastasis 2009、26、261；D.C. Gilbert、I. Chandler、A. McIntyre、N.C. Goddard、R. Gabe、R.A. Huddart、J. Shipley、J. Pathol. 2009、217、94)の転移に関与することを示す。CXCR4阻害物質による遊走能の阻害は、癌細胞の遊走、すなわち転移を止めるはずである。

CXCR4は、固形腫瘍および白血病/リンパ腫の成長および増殖にも関与する。CXCR4レセプターの活性化は、悪性神経細胞腫瘍および神経膠腫細胞腫瘍の両方の増殖に重要であることがわかった。さらに、CXCR4アンタゴニストAMD3100の全身投与は、腫瘍細胞のアポトーシスを増加し、増殖を減少させることにより頭蓋内膠芽細胞腫および髄芽腫の異種移植の増殖を阻害する(J.B. Rubin、A.L Kung、R.S Klein、J.A. Chan、Y. Sun、K. Schmidt、M.W. Kieran、A.D. Luster、R.A. Segal、Proc Natl Acad Sci U S A. 2003、100(23)、13513-13518；S. Barbero、R. Bonavia、 A. Bajetto、C. Porcile、P. Pirani、J.L. Ravetti、G.L. Zona、R. Spaziante、T. Florio、G. Schettini、Cancer Res. 2003、63(8)、1969-1974；T. Kijima、G. Maulik、P.C. Ma、E.V. Tibaldi、R.E. Turner、B. Rollins、M. Sattler、B.E. Johnson、R. Salgia. Cancer Res. 2002、62(21)、6304-6311)。CXCR4阻害因子は、乳癌、小細胞肺癌、膵臓癌、胃癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、悪性黒色腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、前立腺癌および慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫における有望なin vitroおよびin vivo効果も示した(J.A. Burger、A. Peled、Leukemia 2009、23、43-52およびここに記載の文献)。

ケモカインは、多くの炎症病状に関与し、そのいくつかは破骨細胞の発生の調節に極めて重要な役割を果たすことが確立されている。関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)の両試料由来の滑液および骨組織生検のSDF-1(CXCL12)に対する免疫染色は、炎症条件下のケモカインの発現レベルの強い増加を明らかにした(F. Grassi、S. Cristino、S. Toneguzzi、A. Piacentini、A. Facchini、G. Lisignoli、J. Cell Physiol. 2004；199(2)、244-251)。CXCR4 レセプターは、炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症、または眼疾患、例えば糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性症に重要な役割を果たすようである(K.R. Shadidi et al.、Scandinavian Journal of Immunology 2003、57、192-198；J.A. Gonzalo、J. Immunol. 2000、165、499-508；S. Hatse et al.、FEBS Letters 2002、527、255-262 and cited references、A.T. Weeraratna、A. Kalehua、I. DeLeon、D. Bertak、G. Maher、M.S. Wade、A. Lustig、K.G. Becker、W. Wood、D.G. Walker、T.G. Beach、D.D. Taub、Exp. Cell Res. 2007、313、450；M. Shimoji、F. Pagan、E.B. Healton、I. Mocchetti、Neurotox. Res. 2009、16、318；A. Zernecke、E. Shagdarsuren、C. Weber、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008、28、1897；R. Lima e Silva、J. Shen、S.F. Hackett、S. Kachi、H. Akiyama et al.、FASEB 2007、21、3219)。炎症部位への免疫細胞の遊走の仲介はCXCR4阻害因子により停止するはずである。

今日まで、HIV感染を治療するのに利用可能な療法は、感染した人々の症状の顕著な改善と疾患からの回復をもたらした。逆転写酵素/プロテアーゼ阻害剤の組み合わせを含む高活性抗レトロウイルス療法(HAART)はAIDSまたはHIV感染個体の臨床治療を顕著に改善したが、多薬剤耐性、顕著な副作用、および高コストを含む種々の重大な問題が依然として残る。ウイルス侵入などの感染初期でHIV感染を阻害する抗HIV剤が特に望ましい。最近、ヒト免疫不全ウイルスは、標的細胞に効率的に侵入するためにケモカインレセプターCCR5およびCXCR4、および一次レセプターCD4を必要とすることが認められた(N. Levy、Engl. J. Med. 1996、335、1528-1530)。したがって、CXCR4ケモカインレセプターを阻害する薬剤は、健康な個体の感染を予防し、感染した患者のウイルスの進行を遅延または停止させるはずである(J. Cohen、Science 1997、275、1261-1264)。

種々の種類のCXCR4阻害因子の中で(M. Schwarz、T.N.C. Wells、A.E.I. Proudfoot、Receptors and Channels 2001、7、417-428；Y. Lavrovsky、Y.A. Ivanenkov、K.V. Balakin、D.A. Medvedewa、P.V. Ivachtchenko、Mini Rev. Med. Chem. 2008、11、1075-1087)、ある新たなクラスは、逆平行β-シート構造および2つのジスルフィド架橋により維持されるβ−ヘアピンを有するポリフェムシンII由来の天然の陽イオンペプチド類似体に基づく(H. Nakashima、M. Masuda、T. Murakami、Y. Koyanagi、A. Matsumoto、N. Fujii、N. Yamamoto、Antimicrobial Agents and Chemoth. 1992、36、1249-1255；H. Tamamura、M. Kuroda、M. Masuda、A. Otaka、S. Funakoshi、H. Nakashima、N. Yamamoto、M. Waki、A. Matsumotu、J.M. Lancelin、D. Kohda、S. Tate、F. Inagaki、N. Fujii、Biochim. Biophys. Acta 1993、209、1163；WO 95/10534 A1)。

構造類似体の合成および核磁気共鳴(NMR)分光法による構造研究は、該陽イオンペプチドが1または2個のジスルフィド架橋の束縛作用により明確なβ−ヘアピン構造をとることを示した(H. Tamamura、M. Sugioka、Y. Odagaki、A. Omagari、Y. Kahn、S. Oishi、H. Nakashima、N. Yamamoto、S.C. Peiper、N. Hamanaka、A. Otaka、N. Fujii、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001、359-362)。これらの結果は、β−ヘアピン構造がCXCR4拮抗活性に重要な役割を果たすことを示す。

さらなる構造研究は、該拮抗活性が両親媒性構造および活性基を調節することにより影響を及ぼすことができることを示した(H. Tamamura、A. Omagari、K. Hiramatsu、K. Gotoh、T. Kanamoto、Y. Xu、E. Kodama、M. Matsuoka、T. Hattori、N. Yamamoto、H. Nakashima、A. Otaka、N. Fujii、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001、11、1897-1902；H. Tamamura、A. Omagari、K. Hiramatsu、S. Oishi、H. Habashita、T. Kanamoto、K. Gotoh、N. Yamamoto、H. Nakashima、A. Otaka N. Fujii、Bioorg. Med. Chem. 2002、10、1417-1426；H. Tamamura、K. Hiramatsu、K. Miyamoto、A. Omagari、S. Oishi、H. Nakashima、N. Yamamoto、Y. Kuroda、T. Nakagawa、A. Otaki、N. Fujii、Bioorg. Med. Chem. Letters 2002、12、923-928)。

本発明の化合物、シクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合がある）は、高CXCR4拮抗活性を示し、遊走した末梢血幹細胞の効率的アフェレーシス収集に有用でありおよび/または該遊走した細胞を用いて組織修復を調節し、および/または抗癌活性、抗炎症活性および/または抗HIV活性を有する、環状β−ヘアピンペプチド模倣薬である。

環状β−ヘアピン構造は、D-アミノ酸残基^DPro⁷とD-アミノ酸残基Xaa¹⁵により誘導される。該ヘアピン構造のさらなる安定化は、4位と11位のアミノ酸残基Cysが一緒になってジスルフィド架橋を形成することにより達成される。

驚くべきことに、本発明者らは、シクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）の8位に塩基性アミノ酸残基、14位にLys(iPr)を導入すると（所望により15位への^DLys(iPr)の導入により支持される）が好ましい医薬特性を有するβ−ヘアピンペプチド模倣薬をもたらすことをみいだした。適切な血漿タンパク質結合速度および適切なクリアランス速度と組み合わせたこれらの特性は、これら化合物をすべての種類の製剤、特に持続放出製剤に少量で活性生物として用いることを可能にする薬理学的プロフィールを形成する。

本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬は下記一般式で示される化合物：
シクロ(Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）およびその医薬的に許容される塩である：
［式中、Xaa³は、Tyr、Tyr(Me)、すなわち(2S)-2-アミノ-(4-メトキシフェニル)-3-プロピオン酸、またはTyr(CF₃)、すなわち(2S)-2-アミノ-(4-トリフルオロメトキシフェニル)-3-プロピオン酸である。
Xaa⁶はAlaまたはAccであり、後者は1-アミノシクロプロパン-カルボン酸である。
Xaa⁸はOrn(iPr)、すなわち(2S)-Nω-イソプロピル-2,5-ジアミノペンタン酸である。
Xaa¹³はGlnまたはGluである。
Xaa¹⁴はLys(iPr)、すなわち(2S)-Nω-イソプロピル-2,6-ジアミノヘキサン酸である。
Xaa¹⁵は^DProまたは^DLys(iPr)、すなわち(2R)-Nω-イソプロピル-2,6-ジアミノヘキサン酸である。
ただし、Xaa⁶がAlaである場合は、Xaa¹⁵は^DLys(iPr)である。］。

本発明のある態様において、該化合物は、シクロ(-Tyr¹-His²-Tyr³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DPro⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³-Lys(iPr)¹⁴-^DLys(iPr)¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）およびその医薬的に許容される塩である。

本発明の別のある態様において、該化合物は、シクロ(-Tyr¹-His²-Tyr³-Cys⁴-Ser⁵-Acc⁶-^DPro⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³-Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）およびその医薬的に許容される塩である。

本発明によれば、これらβ−ヘアピンペプチド模倣薬は下記工程を含む方法により製造することができる：
(a)適切に官能化され固体支持体を、目的とする最終生成物において16位のProの適切にN保護された誘導体とカップリングさせ、
(b)得られた該生成物からN保護基を除去し、
(c)得られた該生成物を、目的とする最終生成物において15位のアミノ酸の適切にN保護された誘導体とカップリングさせ、ここで、該N保護されたアミノ酸に存在しうるあらゆる官能基が同様に適切に保護される、
(d)工程(c)で得られる該生成物からN保護基を除去し、
(e)目的とする最終生成物の14〜１位のアミノ酸の適切にN保護された誘導体を用いて工程(c)および(d)に実質的に対応する工程を実施し、ここで、該N保護されたアミノ酸誘導体に存在しうるあらゆる官能基が同様に適切に保護される、
(f)所望により、4位および11位のCys残基の側鎖間にジスルフィド架橋を形成するか、または下記のごとく工程(i)に次いで前記結合を形成し、
(g)得られた該生成物を固体支持体から分離し、
(h)該固体支持体から解離した該生成物を環化し、
(i)アミノ酸残基の鎖のあらゆるメンバーの官能基上に存在するあらゆる保護基を除去し、そして
(j)所望により、１または数個のイソプロピル基を付加し、
(k) 所望により、得られた該生成物を医薬的に許容される塩に変換するか、または得られた医薬的に許容されるかまたは許容されない塩を対応する遊離化合物または異なる医薬的に許容される塩に変換する。

本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬は、例えばイソプロピル基保持アミノ酸残基 Orn(iPr)、Lys(iPr)または^DLys(iPr)が、前記の市販または合成アミノ酸構成単位として組み込まれる、樹脂上での直鎖ペプチドの合成を含む方法、または樹脂上での直鎖ペプチドの合成、および合成カスケードのきわめて後期に溶液中のイソプロピル基をカップリングさせることによりFmocベースの固相ペプチド合成戦略に適した酸に不安定な（酸不安定性）保護基により保護されたアミノ酸残基のアミノ基保持側鎖の誘導体化を含む方法に従って、または前記方法の適切な組み合わせを含む方法に従って製造することができる。

官能化固体支持体（すなわち、支持体＋リンカー分子）および環化部位の適切な選択は、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬の合成方法に重要な役割を果たす。

該官能化固体支持体は、好ましくは1〜5％のジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン、ポリエチレングリコールスペーサー(Tentagel（登録商標）)でコートしたポリスチレン、およびポリアクリルアミド樹脂から好都合に誘導することができる(D. Obrecht、J. M. Villalgordo、「Solid- Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries」、Tetrahedron Organic Chemistry Series、Vol. 17、Pergamon、Elsevier Science、1998も参照のこと)。

該固体支持体は、リンカー、すなわち、一方の末端に該固体支持体と結合するためのアンカー基を含み、他方の末端に次の化学変換および開裂手順に用いる選択的に開裂可能な官能基を含む二機能性スペーサー分子により官能化される。本発明のために2種類のリンカーを用いる。

タイプ1リンカーは産生条件下でアミド基を放出するように設計されている(H. Rink、Tetrahedron Lett. 1987、28、3783 3790)。この種のリンカーは、アミノ酸のカルボキシル基のアミドを形成し、そのようなリンカー構造により官能化される樹脂の例には、4-[(((2,4-ジメトキシ-フェニル)Fmoc-アミノメチル)フェノキシアセトアミド)アミノメチル] PS樹脂、4-[(((2,4-ジメトキシフェニル)Fmoc-アミノメチル) フェノキシ-アセトアミド) アミノメチル]-4-メチル-ベンズヒドリルアミンPS樹脂(リンクアミドMBHA PS樹脂)、および4-[(((2,4-ジメトキシフェニル)Fmoc-アミノメチル) フェノキシアセトアミド) アミノメチル] ベンズヒドリルアミンPS樹脂(リンクアミドBHA PS樹脂)が含まれる。好ましくは、該支持体は、最も好ましくは1〜5％のジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンから誘導され、4-(((2,4-ジメトキシ-フェニル)Fmoc-アミノメチル)フェノキシアセトアミド)リンカーにより官能化される。

タイプ2リンカーは、最終的に、酸性条件下でカルボキシル基を放出するように設計される。この種のリンカーは、アミノ酸のカルボキシル基を有する酸不安定性エステル、通常、酸不安定性ベンジル、ベンズヒドリル、およびトリチルエステルを形成し、そのようなリンカーの例には、2-メトキシ-4-ヒドロキシメチルフェノキシ(Sasrin（登録商標）リンカー)、4-(2,4-ジメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)-フェノキシ(Rinkリンカー)、4-(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)酪酸(HMPBリンカー)、トリチル、および2-クロロトリチルが含まれる。好ましくは、該支持体は、最も好ましくは1〜5％のジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンから誘導され、2-クロロトリチルリンカーにより官能化される。

パラレルアレイ合成法として行うと、本発明の方法を本明細書に記載のごとく好都合に実施することができるが、本発明のある１つの化合物を合成することが望ましい場合にこの手順をどのように修飾すべきかは当業者にすぐに解るであろう。

該パラレル法により合成される化合物の総数に等しい多くの反応容器に、25〜1000mg、好ましくは60mgの適切な官能化固体支持体、好ましくは1〜3％の架橋ポリスチレンまたはTentagel剤樹脂を充填する。用いる溶媒は、該樹脂を膨潤させることができる必要があり、これには、限定されるものではないが、ジクロロメタン(DCM)、ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチルピロリドン(NMP)、ジオキサン、トルエン、テトラヒドロフラン(THF)、エタノール(EtOH)、トリフルオロエタノール(TFE)、イソプロピルアルコールなどが含まれる。少なくとも１成分として極性溶媒を含む溶媒混合物（例えば、20％TFE/DCM、35％THF/NMP)は、樹脂と結合したペプチド鎖の高い反応性および溶媒和を保証するのに好都合である(G.B. Fields、C.G. Fields、J. Am. Chem. Soc. 1991、113、4202 4207)。

該側鎖の官能基を保護する酸不安定性基に影響を及ぼさない弱酸性条件下でC末端カルボン酸基を放出する種々のリンカーの進歩に伴って、保護ペプチド断片の合成において顕著な進歩がみられた。2-メトキシ-4-ヒドロキシベンジルアルコール由来リンカー(Sasrin（登録商標）リンカー、Mergler et al.、Tetrahedron Lett. 1988、29 4005-4008)は、希トリフルオロ酢酸(DCM中の0.5〜1％TFA)で開裂することができ、該ペプチド合成中のFmoc脱保護条件に安定であり、Boc/tBuベースのさらなる保護基はこの保護スキームと適合性である。本発明の方法に適した他のリンカーには、超酸不安定性4-(2,4-ジメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)-フェノキシリンカー(Rinkリンカー、H. Rink、Tetrahedron Lett. 1987、28、3787-3790)（該ペプチドの除去には、DCM中10％酢酸またはDCM中0.2％トリフルオロ酢酸が必要である）、4-(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)酪酸由来リンカー(HMPBリンカー、Floersheimer & Riniker、Peptides 1991、1990 131)（1％TFA/DCMで開裂し、すべて酸不安定性側鎖保護基を含むペプチド断片を生成する）、および、さらに2-クロロトリチルクロリドリンカー(Barlos et al.、Tetrahedron Lett. 1989、30、3943-3946)（30分間、氷酢酸/トリフルオロエタノール/DCM(1：2：7)の混合物を用いて該ペプチドを分離することができる）が含まれる。

アミノ酸およびそれぞれその残基の適切な保護基は、例えば、
アミノ酸基（例えばリジンまたはオルニチンの側鎖中にも存在する）については、
Cbz ベンジルオキシカルボニル
Boc tert-ブチルオキシカルボニル
Fmoc 9-フルオレニルメトキシカルボニル
Alloc アリルオキシカルボニル
Teoc トリメチルシリルエトキシカルボニル
Tcc トリクロロエトキシカルボニル
Nps o-ニトロフェニルスルホニル;
Trt トリフェニメチルまたはトリチル
ivDde (4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシ-1-イルイデン)-3-メチルブチル；
カルボキシル基(例えばグルタミン酸の側鎖にも存在する)（アルコール成分を有するエステルに変換することによる）については、
tBu tert-ブチル
Bn ベンジル
Me メチル
Ph フェニル
Pac フェナシル
アリル
Tse トリメチルシリルエチル
Tce トリクロロエチル;
ivDde (4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシ-1-イルイデン)-3-メチルブチル；
グアニジノ基(例えばアルギニンの側鎖に存在する)については、
Pmc 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル
Ts トシル(すなわち、p-トルエンスルホニル)
Cbz ベンジルオキシカルボニル
Pbf ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル；
ヒドロキシ基(例えばセリンの側鎖に存在する)については、
tBu tert-ブチル
Bn ベンジル
Trt トリチル
Alloc アリルオキシカルボニル；および
メルカプト基（例えばシステインの側鎖に存在する）については、
Acm アセトアミドメチル
tBu tert-ブチル
Bn ベンジル
Trt トリチル
Mtr 4-メトキシトリチル。

9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護アミノ酸誘導体は、好ましくは、本発明のβ−ヘアピンループ模倣物を構築するための構成単位として用いられる。脱保護、例えばFmoc基の開裂には、DMF中20％ピペラジンまたはDMF中2％DBU/2％ピペラジンを用いることができる。

イソプロピル基と9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護アミノ酸誘導体とのアミノ基保持側鎖の結合による(Fmoc)保護アミノ酸誘導体のイソプロピル化アミノ基保持側鎖の形成は当該分野で知られている。イソプロピル基の導入法は、例えば還元的アルキル化、例えばアミノ酸構成単位のアミノ基保持側鎖のアミノ基（例えばOrn）をナトリウムトリアセトキシボロヒドリドなどの適切な還元剤の存在下、アセトンで処理することにより達成することができる。(Fmoc)保護アミノ酸誘導体のイソプロピル化アミノ基保持側鎖に適したBocなどの保護基を、次に、重炭酸ナトリウムなどの塩基の存在下、ジ-tert-ブチルジカーボネートと反応させることにより導入することができる。

反応物質、すなわちアミノ酸誘導体の量は、通常、反応チューブ内で最初に計量した官能化固体支持体のミリ当量/グラム(meq/g)に基づいて1〜20当量である(典型的には0.1〜2.85meq/gポリスチレン樹脂)。所望により、反応物質のさらなる当量を用いて妥当な時間に反応が完結するよう操作することができる。好ましいワークステーション（限定されるものではないが）は、Labsource's Combi-chem station、Protein Technologies'Symphony、およびMultiSyn Tech's-Syro合成装置であり、後者には、固体支持体から完全に保護された直鎖ペプチドを分離する工程中、さらに供給装置およびリザーバーボックスを装着した。すべての合成装置は、制御された環境をもたらすことができ、例えば、所望により不活性ガス雰囲気下、室温と異なる温度で反応を達成することができる。

アミド結合の形成は、アシル化工程でα−カルボキシル基の活性化を必要とする。この活性化を通常用いるカルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、Sheehan & Hess、J. Am. Chem. Soc. 1955、77、1067-1068)またはジイソプロピルカルボジイミド(DIC、Sarantakis et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976、73、336-342)により実施する場合は、得られるジシクロヘキシルウレアおよびジイソプロピルウレアは一般的に用いられる溶媒にそれぞれ不溶性および可溶性である。カルボジイミド法のバリエーションでは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt、Koenig & Geiger、Chem. Ber. 1970、103、788-798)がカップリング混合物に対する添加物として含まれる。HOBtは、脱水を防ぎ、活性化アミノ酸のラセミ化を抑制し、遅いカップリング反応を改善する触媒として作用する。ある種のホスホニウム試薬を、直接カップリング試薬、例えばベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジメチル-アミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP、Castro et al.、Tetrahedron Lett. 1975、14、1219-1222；Synthesis 1976、751-752)、またはベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(Py BOP、Coste et al.、Tetrahedron Lett. 1990、31、205-208)、または2-(1H-ベンゾトリアゾール1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボーレート(TBTU)、またはヘキサフルオロホスフェート(HBTU、Knorr et al.、Tetrahedron Lett. 1989、30、1927-1930)として用いられ；これらホスホニウム試薬も、保護アミノ酸誘導体を用いるHOBtエステルのin situ形成に適している。より最近では、ジフェノキシホスホリルアジド(DPPA)またはO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボーレート(TATU)、またはO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)/7-アザ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOAt、Carpino et al.、Tetrahedron Lett. 1994、35、2279 2281)または(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-N,N,N',N'-1,1,3,3-テトラメチル-ウロニウムテトラフルオロボーレート(TCTU)、またはヘキサフルオロホスフェート(HCTU、Marder、Shivo and Albericio：HCTU and TCTU：New Coupling Reagents：Development and Industrial Applications、Poster Presentation、Gordon Conference February 2002)もカップリング試薬として用いられ、1,1,3,3-ビス(テトラメチレン)クロロウロニウムヘキサフルオロ-ホスフェート(PyClU)（特にN-メチル化アミノ酸のカップリング用に）(J. Coste、E. Frerot、P. Jouin、B. Castro、Tetrahedron Lett. 1991、32、1967)またはペンタフルオロフェニルジフェニル-ホスフィネート(S. Chen、J. Xu、Tetrahedron Lett. 1991、32、6711)も用いられる。

ほぼ定量的なカップリング反応が必要不可欠であるということから、該反応が完結した実験的証拠を示すことが望ましい。樹脂結合ペプチドのアリコートに対する陽性比色反応が定量的に第1級アミンの存在を示すニンヒドリン試験(Kaiser et al.、Anal. Biochemistry 1970、34、595)は、各カップリング工程後に容易に速やかに実施することができる。Fmoc化学は、Fmoc発色団が塩基で放出されると、その分光光度的検出を可能にする(Meienhofer et al.、Int. J. Peptide Protein Res. 1979、13、35-42)。

下記の２つの方法の１つにより純粋な溶媒に反復的に暴露することにより、各反応容器内の樹脂に結合した中間体を洗浄して過剰の残存試薬、溶媒、および副生成物を除去する。
1) 反応容器を溶媒（好ましくは5ｍL）で満たし、5〜300分間、好ましくは15分間攪拌し、次いで排液して溶媒を除去する、
2) 反応容器を溶媒（好ましくは5ｍL）で満たし、試験チューブまたはバイアルなどの受取容器に排液する。

上記の両洗浄手順を最高約50回（好ましくは約10回）繰り返し、洗浄物のTLC、GC、または検査などの方法により試薬、溶媒、および副生成物の除去効率をモニターする。

反応チューブ内で樹脂結合化合物と試薬を反応させ、次いで過剰の試薬、副生成物、および溶媒を除去する上記手順を、最終的に樹脂に結合した完全に保護された直鎖ペプチドが得られるまでそれぞれ連続的変換して繰り返す。

この完全に保護された直鎖ペプチドを固体支持体から分離し、次いでCys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド架橋を形成することができる。ジスルフィド架橋を形成するには、好ましくはヨウ素溶液の10当量の溶液を、DMFまたはCH₂Cl₂/MeOH混合物に1.5時間適用し、ヨウ素溶液をろ過後に新鮮ヨウ素溶液でさらに3時間繰り返すか、または4時間、5％NaHCO₃でpH5〜6に緩衝した後にDMSOおよび酢酸溶液の混合物に適用するか、または24時間攪拌して水酸化アンモニウム溶液でpH8に調整した後に水に適用するか、またはNMPおよびトリ-n-ブチルホスフィンの溶液(好ましくは50eq.)に適用する。

あるいはまた、Cys⁴とCys¹¹の間のジスルフィド架橋の形成は、下記に記載の後処理方法2)に次いで、5％NaHCO₃でpH5〜6に緩衝し、または酢酸アンモニウムでpH7〜8に緩衝し、または水酸化アンモニウムでpH8に調整した15容量％以下のDMSOを含む水中で24時間、粗な完全に脱保護された環化ペプチドを攪拌することにより実施することができる。蒸発乾固後に、シクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）を最終生成物として得る。

固体支持体からの完全に保護された直鎖ペプチドの分離は、ロードした樹脂を開裂に用いる試薬の溶液(好ましくは3〜5mL)に暴露することにより達成される。温度調節、攪拌、および反応のモニタリングは上記のごとく実施する。供給装置（transfer unit）を介して反応容器をリザーバーチューブを含むリザーバーボックスと接続し、開裂した生成物の溶液を効率的に回収する。次に、反応容器中に残る樹脂を上記のごとく3〜5mLの適切な溶媒で2〜5回洗浄し、分離した生成物をできる限り抽出する（洗い流す）。得られた生成物溶液を混入を避けるよう注意しながら混合する。次に、個々の溶液/抽出物を必要に応じて操作して最終化合物を単離する。典型的操作には、限定されるものではないが、蒸発、濃縮、液体/液体抽出、酸性化、塩基性化、中和、または溶液中でのさらなる反応が含まれる。

固体支持体から開裂し、塩基で中和した完全に保護された直鎖ペプチド誘導体を含む溶液を蒸発させる。次に、環化をDCM、DMF、ジオキサン、THFなどの溶媒を用いて溶液中で行う。先に記載の種々のカップリング試薬を環化に用いることができる。環化の継続時間は約6〜48h、好ましくは約16hである。反応を進行させ、次いで、例えばRP-HPLC(逆相高性能液体クロマトグラフィ)を行う。次に、溶媒を蒸発させて除去し、完全に保護された環状ペプチド誘導体を、水と混和しない溶媒、例えばDCMに溶解し、該溶液を水または水混和性溶媒で抽出し、あらゆる過剰のカップリング試薬を除去する。

最終的に、完全に保護されたペプチド誘導体を、95％TFA、2.5％H₂O、2.5％TIS、または別のスカベンジャー混合物で処理し、保護基の開裂を行う。開裂反応時間は通常30分間〜12時間、好ましくは約2.5時間である。

あるいはまた、固体支持体からの完全に保護されたペプチドの分離および完全な脱保護はガラス容器中で手作業で達成することができる。

完全に脱保護した後、例えば以下の方法をさらなる後処理に用いることができる：
1) 揮発性物質を蒸発乾固し、粗ペプチドを水中20％AcOHに溶解し、イソプロピルエーテルまたは適切な他の溶媒で抽出する。水性層を回収し、次いで蒸発乾固し、完全に脱保護された環状ペプチドのシクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）を最終生成物として得る；
2) 脱保護混合物を真空下で濃縮する。好ましくは0℃のジエチルエーテル中で完全に脱保護されたペプチドを沈殿させた後、該固体を最高約10回、好ましくは3回洗浄し、次いで乾燥して、上記のごとく固体支持体上でCys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合が形成されると完全に脱保護された環状ペプチドのシクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）を最終生成物として得る。

溶液中の１またはそれ以上のイソプロピル基を導入するための上記直交保護基戦略に従うと、酸不安定性保護基により先に保護されたアミノ酸残基のすべてのアミノ基が合成カスケードのこの段階で放出される。したがって、所望によりイソプロピル基をカップリングすることができる。このカップリングは、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの適切な還元基の存在下、アセトンを用いる還元的アルキル化により達成することができる。したがって、例えば該ペプチドを酢酸(0.2M)を含むMeOH(4.4mM)に溶解する。過剰のアセトン(780eq)を添加後、反応混合物をMeOH中のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.6 M；導入するのが望ましいイソプロピル基当たり1.3eq)で完結し、室温で勢いよく振盪させる。LC-MSによりモニターして変換が完結した後、水を加え、溶媒を蒸発させる。

先に記載のごとく、所望により、次いで、得られた完全に脱保護された環状生成物を医薬的に許容される塩に変換するか、または得られた医薬的に許容されるかまたは許容されない塩を対応する遊離化合物または異なる医薬的に許容される塩に変換することができる。これら操作はいずれも当該分野でよく知られた方法により実施することができる。

本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、健康な個体のHIV感染を抑制し、感染患者のウイルスの進行を遅延または停止させるためにか、または癌がCXCR4レセプター活性に仲介されるかまたは起因し、または免疫疾患がCXCR4レセプター活性に仲介されるかまたは起因する場合に広範囲の適用に用いることができ、またはこれらβ-ヘアピンペプチド模倣薬は免疫抑制を治療するために用いるかまたは末梢血幹細胞のアェレーシス収集および/または組織修復を調節する幹細胞の遊走を誘導するための薬剤として用いることができる。

本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、それ自体を投与するか、または当該分野でよく知られた担体、希釈剤、または賦形剤とともに適切な製剤として適用することができる。

HIV感染、または癌、例えば乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓、神経芽細胞腫、卵巣癌、子宮内膜癌、胚細胞腫瘍、眼癌、多発性骨髄腫、膵臓癌、胃癌、横紋筋肉腫、メラノーマ、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫；転移、血管新生、および造血組織；または炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患(ILD)、特発性肺線維症、関節リウマチ関連ILD、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬剤アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症、重症筋無力症、若年型糖尿病、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、移植片拒絶反応（同種移植拒絶反応もしくは移植片対宿主疾患を含む）、炎症性腸疾患、および炎症性皮膚疾患の治療または予防；または眼疾患、例えば緑内障、糖尿病性網膜症、および加齢性黄斑変性症の治療；または限局性虚血性脳卒中、全脳虚血、心筋梗塞、後肢虚血、または末梢虚血の治療；肝臓、腎臓、または肺損傷の治療；または免疫抑制（化学療法、放射線療法により誘導される免疫抑制を含む）または移植片/移植拒絶反応の治療に用いる場合は、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、単独で、種々のβ-ヘアピンペプチド模倣薬の混合物として、他の抗HIV剤または抗菌剤または抗癌剤または抗炎症剤と組み合わせて、または他の医薬活性物質と組み合わせて投与することができる。本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、それ自体でかまたは医薬組成物として投与することができる。

本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬を含む医薬組成物は、常套的混合、溶解、顆粒化、コーティング錠製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、活性β-ヘアピンペプチド模倣薬の医薬的に用いることができる製剤への加工を促進する、１またはそれ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を用いて常套的方法で製剤化することができる。適切な製剤は選択した投与方法に依存する。

局所投与用の本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、当該分野でよく知られた溶液剤、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、サスペンジョン剤、粉末剤などとして製剤化することができる。

全身用製剤には、注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下、または腹腔内注射により投与するために設計されたもの、および経皮、経粘膜、経口、または肺投与のために設計されたものが含まれる。

注射用の本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、適切な溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液を用いて製剤化することができる。該溶液は、製剤用薬剤、例えば懸濁化剤、安定化剤、および/または分散剤を含むことができる。あるいはまた、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、使用前は適切なビークル、例えば無菌発熱性物質除去水と混合するために粉末の形でありうる。

経粘膜投与では、透過する障壁に適した浸透剤を当該分野で知られた製剤に用いる。

経口投与では、該化合物は、本発明の活性β-ヘアピンペプチド模倣薬を当該分野で知られた医薬的に許容される担体と混合することにより容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬を、治療する患者が経口摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、サスペンジョン剤、粉末剤などとして製剤化するのを可能にする。例えば粉末剤、カプセル剤、および錠剤などの経口用製剤に適した賦形剤には、充填剤、例えば糖、例えばラクトース、ショ糖、マンニトール、およびソルビトール；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ガムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)；顆粒化剤；および結合剤が含まれる。所望により、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）を加えることができる。所望により、固体剤形は、標準的技術を用いて糖コートまたは腸溶コートすることができる。

例えばサスペンジョン剤、エリキシル剤、および溶液剤などの経口用液体製剤に適した担体、賦形剤、または希釈剤には、水、グリコール、油、アルコールなどが含まれる。さらに香味料、保存料、着色料などを加えることができる。

口腔投与用の組成物は、通常通りに製剤化される錠剤、ローゼンジー剤などの形をとりうる。

該化合物は、適切な坐薬用基剤、例えばココアバターまたは他のグリセリドと共に坐薬などの直腸または膣用組成物に製剤化することもできる。

上記製剤に加えて、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、デポー製剤として製剤化することもできる。そのような長時間作用する製剤は、埋め込み(例えば皮下または筋肉内)および筋肉内注射により投与することができる。そのようなデポー製剤を製造するには、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬を、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性塩として製剤化することができる。

さらに、他の医薬的デリバリーシステム、例えば当該分野でよく知られたリポソームおよびエマルジョンを用いることができる。ある種の有機溶媒（例えばジメチルスルホキシド）も用いることができる。さらに、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は、持続放出系、例えば、治療薬を含む固体ポリマーの半透過マトリックス（例えばコートしたステント）を用いて送達することができる。種々の持続放出物質が確立され、当業者によく知られている。持続放出カプセル剤は、その化学的性質に応じて該化合物を数週間〜100日間以上放出することができる。治療薬の化学的性質と生物学的安定性に応じて、タンパク質安定性のためのさらなる戦略を用いることができる。

本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬は荷電残基を含むので、上記のあらゆる製剤中にまたは医薬的に許容される塩として含まれうる。医薬的に許容される塩は、対応する遊離型より水性および他のプロトン性溶媒に可溶性が高い傾向がある。特に適切な医薬的に許容される塩には、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸、およびスルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、桂皮酸、メタン-もしくはエタン-スルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、1,5-ナフタレンジスルホン酸、2-、3-、または4-メチル-ベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、N-シクロヘキシルスルファミン酸、N-メチル-、N-エチル-もしくはN-プロピル-スルファミン酸、および他の有機プロトン酸、例えばアスコルビン酸の塩が含まれる。適切な無機酸は、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩化水素酸、硫酸、およびリン酸である。

本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬またはその組成物は、一般的には意図した目的を達成するのに有効な量で用いる。用いる量は特定の適用に依存すると理解される。

HIV感染を治療または予防するための局所投与の治療的有効用量は、例えば実施例に記載のin vitroアッセイを用いて決定することができる。HIV感染が顕在化している間、または顕在化していない場合でも治療を適用することができる。当業者は、過度な実験を行うことなく局所HIV感染を治療するための治療的有効量を決定することができるだろう。

全身投与の治療的有効用量は、in vitroアッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、細胞培養で決定したIC₅₀を含む循環β−ヘアピンペプチド模倣物濃度範囲を達成するように動物モデルを用いて処方することができる。そのような情報を用いてヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。

初期用量も、当該分野でよく知られた技術を用いてin vivoデータ（例えば動物モデル）から決定することができる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができるだろう。

抗HIV剤としての適用用量は、治療効果を維持するのに充分な本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬の血漿濃度をもたらすために個々に調整することができる。治療的有効血清濃度は、毎日多用量を投与することにより達成することができる。

局所投与または選択的摂取の場合は、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬の有効局所濃度は血漿濃度と関連がないかもしれない。当業者は、過度な実験を行うことなく治療的有効局所濃度を最適化することができるだろう。

もちろん、投与するβ-ヘアピンペプチド模倣薬の量は、治療する対象、対象の体重、障害の重症度、投与方法、および処方する医師の判断に依存するだろう。

抗HIV療法は、感染が検出可能である間、または検出不能の場合でも間欠的に反復することができる。該療法は、単独で、または他の薬剤、例えば他の抗HIV薬または抗癌剤、または他の抗菌剤と組み合わせて提供することができる。

通常、本明細書に記載のβ-ヘアピンペプチド模倣薬の治療的有効量は、実質的な毒性を生じることなく治療効果をもたらすだろう。本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬の毒性は、LD₅₀(ポピュレーションの50％に対する致死用量)またはLD₁₀₀(ポピュレーションの50％に対する致死用量)を決定するなどの細胞培養または実験動物を用いる標準的医薬的手順により決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数である。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これら細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトに用いて毒性がない用量範囲を処方するのに用いることができる。本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣薬の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がない有効用量を含む一定の循環濃度範囲内にある。該用量は、用いる剤形と用いる投与経路に応じてその範囲内で変化しうる。正確な製剤、投与経路、および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選ぶことができる(例えば。Fingl et al. 1975、The Pharmacological Basis of Therapeutic、Ch.1、p.1参照)。

本発明は、通常天然にみられる質量数または質量と異なる質量数または質量を有する原子により置換されることを除き、一般式：シクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）の化合物と同一の化合物、例えば²H(D)、³H、¹¹C、¹⁴C、¹²⁹Iなどで豊富化された化合物も含みうる。これらの同位体類似体およびその医薬的塩、および製剤は、該療法および/または診断において、例えば限定されるものではないが、in vivo半減期の微調整によって最適化した投薬計画がもたらされる場合に有用な物質であると考えられる。

以下の実施例で本発明を説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。

1. ペプチド合成
最初に保護されたアミノ酸残基と樹脂のカップリング

1g(1.4mMol)の2-クロロトリチルクロリド樹脂(1.4mMol/g；100〜200メッシュ、コポリ(スチレン-1％DVB)ポリマーマトリックス；Barlos et al. Tetrahedron Lett. 1989、30、3943-3946)を乾燥フラスコに充填した。該樹脂をCH₂Cl₂(5mL)に懸濁し、持続的振盪下、室温で30分間膨潤させた。960μl(4eq)のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)と混合したCH₂Cl₂(5mL)中の0.98mMol(0.7eq)の最初に適切に保護されたアミノ酸残基の溶液を加えた。反応混合物を25℃で4時間振盪させた後、該樹脂をろ過し、CH₂Cl₂(1x)、DMF(1x)、およびCH₂Cl₂(1x)で連続的に洗浄した。CH₂Cl₂/MeOH/DIEA(17/2/1、10mL)の溶液を該樹脂に加え、懸濁液を30分間振盪させた。ろ過後、該樹脂をCH₂Cl₂(1x)、DMF(1x)、CH₂Cl₂(1x)、MeOH(1x)、CH₂Cl₂(1x)、MeOH(1x)、CH₂Cl₂(2x)、Et2O(2x)で順番に洗浄し、次いで真空下で6時間乾燥した。

充填は典型的には0.6〜0.7mMol/gであった。

下記の予め充填した樹脂を調製した：
Fmoc-Pro-O-2-クロロトリチル樹脂。
合成を、24〜96反応容器を用い、Syroペプチド合成装置(MultiSynTech)を用いて行った。各容器に、0.04mMolの上記樹脂を入れ、該樹脂をCH₂Cl₂およびDMFでそれぞれ15分間膨潤させた。下記反応サイクルをプログラムし、実施した。

工程4を１回反復した。

特記しない限り、アミノ酸の最終カップリングに次いで上記反応サイクルの工程1〜3を適用することによりFmoc脱保護を行った。
アミノ酸構成単位の合成
Fmoc-Orn(iPr,Boc)-OHの合成

(2S)-N^α-フルオレニルメトキシルカルボニル-Nω,Nω-tert-ブチルオキシカルボニル-イソプロピル-2,5-ジアミノペンタン酸の合成を、15.2gのFmoc-Orn-OH^*HClを150mLのTHF(0.26M)に懸濁し、次いで375mLのアセトン(132eq)および20.6gのナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(2.5eq)を加えることにより達成した。反応混合物を2時間攪拌し、次いで反応を完結させるために（LC-MSでモニターした）120mLの飽和Na₂CO₃-溶液剤および10.2gのBoc₂O(1.2eq)を加えた。一夜攪拌した後、飽和Na₂CO₃-溶液およびBoc₂Oを、残存する出発物質に従って部分に分けて再度2回加えた。Boc導入の完結後、ヘキサンを2回加え、分離し、次いで水性層を5N HCl_aq(pH＝1)で酸性化し、次いで酢酸エチルで3回抽出した。最後に、混合有機層をNa₂SO₄で乾燥し、白色泡状の生成物を得た。これによりアミノ酸構成単位 Fmoc-^DLys(iPr,Boc)-OHおよびFmoc-Lys(iPr,Boc)-OHを合成する。後者は市販もされている。
環化および骨格環化ペプチドの後処理
完全に保護されたペプチド断片の開裂

合成が完結した後、該樹脂(0.04mMol)をCH₂Cl₂(v/v)中の1％TFA、1mL(0.13mMol、3.4eq)に3分間懸濁し、ろ過し、次いで濾液をCH₂Cl₂(v/v)中の10％DIEA、1mL(0.58mMol、14.6eq)で中和した。開裂を確実に完結させるためこの手順を3回反復した。濾液を蒸発乾固し、該生成物の試料を95％トリフルオロ酢酸(TFA)、2.5％水、および2.5％トリイソプロピルシラン(TIS)を含む開裂混合物を用いて完全に脱保護し、逆相HPLC(C₁₈カラム)およびESI MSによる分析により直鎖ペプチド合成の効率をモニターした。
完全に保護された直鎖ペプチドの環化

該完全に保護された直鎖ペプチド(0.04mMol)をDMF(4μMol/mL)に溶解した。次に、30.4mg(0.08mMol、2eq)のHATU、10.9mg(0.08mMol、2eq)のHOAtおよび28μl(0.16mMol、4eq)のDIEAを加え、該混合物を25℃で16時間ボルテックスし、次いで高真空下で濃縮した。該残渣をCH₂Cl₂とH₂O/CH₃CN(90/10：v/v)に分配した。CH₂Cl₂相を蒸発させ、完全に保護された環状ペプチドを得た。
該環状ペプチドの完全脱保護

得られた完全に保護された環状ペプチドを、82.5％トリフルオロ酢酸(TFA)、5％水、5％チオアニソール、5％フェノール、および2.5％エタンジチオール(EDT)を含む開裂混合物、3mLに溶解した。該混合物を25℃で2.5時間放置し、次いで真空下で濃縮した。完全に脱保護された環状ペプチドを0℃のジエチルエーテル(Et₂O)で沈殿させた後、固体をEt₂Oで2回洗浄し、次いで乾燥させた。
ジスルフィドβ-鎖結合の形成および精製

完全に脱保護した後、粗ペプチドを0.1M酢酸アンモニウム緩衝液(1mg/1mL、pH＝7〜8)に溶解した。DMSO(5容量％以下)を加え、該溶液を一夜振盪させた。蒸発後、残渣をプレパラティブ逆相HPLCで精製した。

凍結乾燥後、白色粉末の生成物を得、下記分析法により分析した。分析的HPLC保持時間（RT（分間））をAscentis Express C18カラム、50 x 3.0 mm、(cod. 53811-U-Supelco)を用い、下記溶媒A(H₂O＋0.1％TFA)およびB(CH₃CN＋0.1％TFA)および下記勾配を用いて測定した：0〜0.05 min：97％A、3％B；3.4 min：33％A、67％B；3.41〜3.65 min：3％A、97％B；3.66〜3.7 min：97％A、3％B。流速＝1.3mL/min；UV Vis＝220nm。
実施例１：

出発樹脂は、上記のごとく製造したFmoc-Pro-O-2-クロロトリチル樹脂であった。該樹脂に、最終的に15位に^DLys(iPr)をグラフトした。以下の配列の該直鎖ペプチドを上記手順に従って固体支持体上に合成した：樹脂-Pro¹⁶-^DLys(iPr)¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Orn(iPr)⁸-^DPro⁷-Ala⁶-Ser⁵-Cys⁴-Tyr³-His²-Tyr¹。上記のごとく最終Fmoc 脱保護後、該ペプチドを樹脂から開裂し、環化し、次いで脱保護し、上記のごとくジスルフィドβ-鎖結合を形成した後、上記のごとく精製した。HPLC保持時間（分間）を上記の分析方法を用いて測定した(UV-純度[プレパラティブHPLC後]：95％；RT：1.54；[M+3H]/3＝709.9)。
実施例２：

出発樹脂は、上記のごとく製造したFmoc-Pro-O-2-クロロトリチル樹脂であった。該樹脂に、最終的に15位に^DProをグラフトした。以下の配列の該直鎖ペプチドを上記手順に従って固体支持体上に合成した：
樹脂-Pro¹⁶-^DPro¹⁵-Lys(iPr)¹⁴-Gln¹³-Tyr¹²-Cys¹¹-Tyr¹⁰-Arg⁹-Orn(iPr)⁸-^DPro⁷-Acc⁶-Ser⁵-Cys⁴-Tyr³-His²-Tyr¹。上記のごとく最終Fmoc脱保護後、該ペプチドを樹脂から開裂し、環化し、次いで脱保護し、上記のごとくジスルフィドβ-鎖結合を形成した後、上記のごとく精製した。
HPLC保持時間（分間）を上記の分析方法を用いて測定した(UV-純度[プレパラティブHPLC後]：95％；RT：1.58；[M+3H]/3＝689.3)。
2. 生物学的方法
2.1. ペプチドの合成

凍結乾燥ペプチドをMicrobalance(Mettler MT5)で計量し、DMSOに溶解して最終濃度10mMとした。ストック溶液を遮光して＋4℃に保存した。生物学的分析は、特記しない限り1％以下のDMSO分析条件下で行った。
2.2. 細胞培養

Namalwa細胞(CXCR4を天然に発現する非接着性細胞、ATCC CRL-1432)を10％FBSおよびpen/strept含有RPMI1640で培養した。HELA細胞を、10％FB、pen/strept、および2mM L-グルタミン含有RPMI1640中で維持した。Cos-7細胞を、10％FC、pen/strept、および2mM L-グルタミン添加4500mg/mLグルコース含有DMEM培地中で増殖させた。すべての細胞株を37℃、5％CO₂にて増殖させた。細胞培地、培地添加物、PBS緩衝剤、HEPES、抗生物質/抗真菌剤、pen/strept、非必須アミノ酸、L-グルタミン、β-メルカプトエタノール、および血清は、Gibco(Pailsey、UK)から購入した。すべての精製化学製品はMerck(Darmstadt、Germany)から提供された。
2.3. 走化性アッセイ（細胞遊走アッセイ)

間質細胞由来因子1α(SDF-1)の勾配に対するNamalwa細胞(ATCC CRL-1432)の遊走反応を、修飾Boydenチャンバー遊走システム(ChemoTx；Neuroprobe)を用いて測定した。このシステムでは、各ウェルの上側チャンバーをポリカーボネート膜（5μmポアサイズ）により走化性物質SDF-1を含む下側チャンバーと分離する。各下側ウェルを覆う領域の該膜の円形領域をこの領域内に細胞浮遊液が保持されるように疎水性マスクで囲む。該システムは、SDF-1(0.9nM)と組み合わせるかまたは該走化性物質を含まず、ペプチドの適切な段階希釈を含むかペプチドを全く含まない走化性培地(0.5％BSA＋フェノールレッド不含＋RPMI 1640)30μLのアリコートを底面ウェルに充填して調製した。該膜を底面ウェル上に置き、ペプチドの適切な段階希釈を含むかまたはペプチドを全く含まない走化性培地と予め混合した走化性培地中のNamalwa細胞浮遊液(3.6 x 10⁶細胞/mL)50μLのアリコートを、該膜の上側表面の各疎水性限定領域上に供給した。該細胞を5％CO₂中37℃で5時間、底面チャンバー中に遊走させた。その後、該膜を除去し、その上側を注意深く軽く擦り、PBSで洗浄して、遊走しなかった細胞を除去した。遊走した細胞を「漏斗」アダプターを用いて受取96ウェルプレートに移し、細胞数を蛍光染料の結合による細胞DNA含有量の測定に基づくCyQuant（登録商標）NF細胞増殖アッセイ(Invitrogen)を用いて測定した。使用説明書に従って、50μLのCyQuant（登録商標）染料試薬/HBSS緩衝液(1/500 [v/v])を上記受取96ウェルプレートの各ウェルに加えた。室温で0.5時間インキュベーションした後、プレートを密封し、各試料の蛍光強度を、485nmで励起し、535nmで放射を検出するWallac 1420 VICTOR2（登録商標）プレートリーダー(PerkinElmer)を用いて測定した。最後に、データをコントロールを用いて正規化し、IC₅₀値を、対数曲線を平均データポイントに適合させることによりGraphPad Prism（登録商標）(GraphPad)を用いて決定した。
2.4. 細胞毒性アッセイ

HELA細胞(Acc57)およびCOS-7細胞(CRL-1651)に対する該ペプチドの細胞毒性を、MTT還元アッセイを用いて測定した(T. Mossman、J. Immunol. Meth. 1983、65、55-63；M.V. Berridge、A.S. Tan、Arch. Biochem. Biophys. 1993、303、474-482)。簡単には、該方法は以下の通りである。4000 HELA細胞/ウェルおよび3400 COS-7細胞/ウェルを96ウェルマイクロタイタープレートに播き、5％CO₂中37℃で24時間増殖させた。次に、0時(Tz)をMTT還元により決定した(下記参照)。残りのウェルの上清を捨て、新鮮培地および段階希釈した化合物(12.5、25、および50μM、トリプリケート；0μM、ブランク)をピペットでウェルに入れた。5％CO₂中37℃で48時間インキュベーションした後、再度上清を捨て、100μL MTT試薬(それぞれRPMI1640およびDMEM中0.5mg/mL)/ウェルを加えた。37℃で2〜4時間インキュベーションした後、培地を吸引し、細胞をスパイクさせた(100μLイソプロパノール/ウェル)。可溶化ホルマザンの吸光度を595nmで測定した(OD₅₉₅ペプチド)。各濃度の平均値をトリプリケートから計算した。増殖率を以下のごとく計算した：(OD₅₉₅ペプチドOD₅₉₅Tz)/(OD₅₉₅ブランク−OD₅₉₅Tz) x 100％。GI₅₀(増殖阻害)濃度を各ペプチドについて濃度(50、25、12.5、および0μM)、対応するパーセンテージ、および値50(＝TREND(C₅₀：C₀,％50：％₀,50)に対するトレンドライン関数を用いて計算した。
2.5. 溶血反応

該ペプチドのヒト赤血球(hRBC)に対する溶血活性を試験した。新鮮hRBCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4回洗浄し、3000ｘｇで10分間遠心分離した。化合物(100μM)を37℃で1時間、300 rpmで振盪させながら20％hRBC(v/v)とインキュベーションした。最終赤血球濃度は約0.9 x 10⁹細胞/mLであった。それぞれ0％および100％細胞溶解値を、それぞれH₂O中、0.001％酢酸および2.5％Triton X 100を含むPBSの存在下でhRBCをインキュベーションすることにより決定した。試料を遠心分離し、上清をPBS緩衝液で8倍に希釈し、次いで吸光度(OD)を540nmで測定した。100％溶解値(OD₅₄₀H₂O)はOD₅₄₀が約0.5〜1.0であった。溶血パーセントは以下のごとく計算した：(OD₅₄₀ペプチド/OD₅₄₀H₂O) x 100％。
2.6. 血漿安定性

ヒトおよびマウス血漿中の該ペプチドの安定性を下記方法を適用して測定した。それぞれ346.5μL/深ウェルの新鮮解凍ヒト血漿(Basler Blutspende-dienst)およびマウス血漿(Harlan Sera Lab、UK)を、DMSO/H₂O(90/10 [v/v]、1mM、トリプリケート)に溶解した化合物3.5μL/ウェルでスパイクし、37℃でインキュベーションした。t＝0、15、30、60、120、240、および1440minの50μLアリコートを、アセトニトリル中の2％ギ酸150μL/ウェルを含むろ過プレートウェルに移した。2分間振盪させた後、生じたサスペンジョンを減圧ろ過した。100μLの各濾液をプロピレンマイクロタイタープレートに移し、N₂下で乾燥した。残った固体を、以下のごとく100μL/ウェルの水/アセトニトリル、95/5(v/v)＋0.2％ギ酸を加えて再構成し、LC/MSにより分析した：カラム：Waters、XBridge C18、移動相：(A)水＋0.1％ギ酸および(B)アセトニトリル/水、95/5(v/v)＋0.1％ギ酸、勾配：5％〜100％(B)（1.8分間）、エレクトロスプレーイオン化、MRM検出(三連四重極)。ピーク面積を測定し、トリプリケート値を平均した。安定性はt＝0の初期値のパーセントで表す(tx/t0 x 100)。EXCEL(Microsoft Office 2003)のTREND関数を用いてT1/2を決定した。
2.7. 血漿タンパク質の結合

495μLアリコートのヒト血漿(Basler Blutspendedienst)および495μLアリコートのPBSをポリプロピレンプレート(Greiner)の個々の深ウェル中に入れ、90％DMSO中の1mMペプチド溶液5μLでそれぞれスパイクした。600rpmで2分間プレートを振盪させた後、血漿/ペプチド混合物の150μLアリコートを、トリプリケートでポリプロピレンフィルタープレート(10 kDa、Millipore)に移し、PBS/ペプチド混合物の150μLアリコートを該フィルタープレートの個々のウェルに（ろ過コントロール）または受取プレート(Greiner)の個々のウェルに直接（非ろ過コントロール）移した。フィルターおよび受取プレートからなるプレートサンドイッチを37℃で1時間インキュベーションし、次いで15℃で2時間、3220 gで遠心分離した。受取プレート中の濾液を以下のごとくLC/MSにより分析した：カラム：Waters、XBridge C18、移動相：(A)水＋0.1％ギ酸および(B)アセトニトリル/水、95/5(v/v)＋0.1％ギ酸、勾配：5％〜100％(B)（1.8分間）、エレクトロスプレイイオン化、MRM検出(三連四重極)。ピーク面積を測定し、トリプリケート値を平均する。結合を、100-(100x T_1h/T_ctr)によりろ過コントロールおよび非ろ過コントロールのパーセントで表す。最後にこれら値の平均値を計算する。
2.3〜2.7項に記載の実験結果を下記表1、2、3、および4に示す。
2.8. 薬物動態試験(PK)

実施例１および２の化合物について静脈内(i.v.)投与後の薬物動態試験を行った。
Charles River Laboratories Deutschland GmbHから得た30グラム(±20％)の雄CD-1マウスを用いた。ビークル、リン酸緩衝生理食塩水を、化合物の最終濃度が0.5mg/mLとなるように加えた。容量は2mL/kgであり、該化合物を最終静脈内用量が1mg/kgとなるよう注射した。約300〜400μLの血液を、予め決定した時間間隔(5、15、30分間、および1、2、3、4時間)で軽イソフルラン麻酔下、心臓穿刺により採取し、ヘパリン化チューブに加えた。血漿を、遠心分離によりペレットにした細胞から除去し、-80℃で凍結し、次いでHPLC-MS分析した。
血漿較正試料および血漿試験試料の調製

非処置動物のマウス血漿（「ブランク」マウス血漿）の各50μLアリコートを、既知量の実施例1および2の化合物でスパイクし、各化合物につき1〜4000ng/mLの範囲の10血漿較正試料を得た。処置動物由来のマウス血漿の各50μLアリコートを血漿試験試料として用いた。
血漿較正試料および血漿試験試料の抽出

すべての血漿試料を適切な内部標準でスパイクし、次いで2％ギ酸を含むアセトニトリルで抽出した。上清を、窒素化で蒸発乾固し、残った固体を水＋0.2％ギ酸/アセトニトリル 95/5(v/v)で再構成した。
LC-MS/MS分析

次に、抽出物を、下記条件を用いる逆相クロマトグラフィ(Acquity HSS C18 SB、100 x 2.1 mm、1.8μmカラム、Waters)により分析した：移動相：(A)水＋0.1％ギ酸/アセトニトリル 95/5(v/v)、(B)アセトニトリル/水＋0.1％ギ酸95/5(v/v)、勾配：1％(B) 0〜0.1min、40％(B)0.1〜2.5。検出および定量は、陽性モードのエレクトロスプーインターフェースおよび検体の選択的断片化を含む質量分析法(4000 Q Trap質量分析計、AB Sciex)により行った。
薬物動態評価

PKパラメータを、１コンパートメントモデル分析を用いるWinNonLin（登録商標）ソフトウエアバージョン5.3(Pharsight-A Certara（登録商標）Company、Moutain View、CA 94041 USA)により計算した。PKパラメータは、実験データに対する該モデルの最小二乗フィッティングにより決定した。
2.8項に記載の実験結果を下記表5aおよび5bに示す。
2.9. 維持投与速度（注入速度）による薬剤ローディング計算値

本発明のペプチドを含む埋込剤のための薬剤充填量を、薬物動態学の基本原理に従って計算し(J. Gabrielsson、D. Weiner、「Pharmacokinetics and Pharmaco-dynamics Data Analysis：Concepts and Applications」、第4版、Swedish Pharmaceutical Press、Stockholm、Sweden、2006も参照のこと)、維持投与速度（注入速度、R_in)は、血漿中で一定用量の定常期に達するように薬剤を投与する速度と定義することができる。維持投与速度は、相関、R_in[g/(h^*kg)]＝CL_iv[L/(h^*kg)] x C_ss,eff[g/L]を用いて表現することができる［式中、CL_ivはクリアランス(i.v.投与)であり、C_ss,effは、有効性限界Aを考慮した定常期の血漿中薬剤有効濃度である：C_ss,eff[g/L]＝A x (IC₅₀/f_u) x MW [(Mol/L)^*(g/Mol)]］。したがって、ある体重の対象に一定期間、一定の血漿中薬剤有効濃度をもたらす埋込剤中に充填される薬剤の総量は、下記相関を適用して計算することができる：
Drug_load[g/対象]＝R_in[g/(h^*kg)] x 持続時間[h] x BW [kg/対象]。

2.9項に記載の計算結果を下記表6ｂに示すが、これは表1、4、および5bに記載のデータに基づく。さらなる前提条件は、有効性限界A＝3、試験継続期間672時間(28日間)、およびヒト対象の体重70kgである。主として該ペプチドのクリアランスに影響する糸球体ろ過速度(GFR)は種に大きく依存する。一般的には、ヒトのGFRは平均107mL/(h^*kg)であり、マウスのGFRは840mL/(h^*kg)である。したがって、表5bに示すCL_iv-マウス値は、上記相関に用いる前の107mL/(h^*kg)/840mL/(h^*kg)＝0.127による相対的尺度であった。

Claims

一般式：
シクロ(-Tyr¹-His²-Xaa³-Cys⁴-Ser⁵-Xaa⁶-^DPro⁷-Xaa⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Xaa¹³-Xaa¹⁴-Xaa¹⁵-Pro¹⁶-)、
ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する、
で示される化合物、およびその医薬的に許容される塩
［式中、
Xaa³は、Tyr、Tyr(Me)、またはTyr(CF₃)である；
Tyr(Me)は(2S)-2-アミノ-(4-メトキシフェニル)-3-プロピオン酸である；
Tyr(CF₃)は(2S)-2-アミノ-(4-トリフルオロメトキシフェニル)-3-プロピオン酸である；
Xaa⁶はAlaまたはAccである；
Accは1-アミノシクロプロパン-カルボン酸である；
Xaa⁸はOrn(iPr)である；
Orn(iPr)は(2S)-Nω-イソプロピル-2,5-ジアミノペンタン酸である；
Xaa¹³はGlnまたはGluである；
Xaa¹⁴はLys(iPr)である；
Lys(iPr)は(2S)-Nω-イソプロピル-2,6-ジアミノヘキサン酸である；
Xaa¹⁵は^DProまたは^DLys(iPr)である；
^DLys(iPr)は(2R)-Nω-イソプロピル-2,6-ジアミノヘキサン酸である；
ただし、Xaa⁶がAlaである場合は、Xaa¹⁵は^DLys(iPr)である。］。
シクロ(-Tyr¹-His²-Tyr³-Cys⁴-Ser⁵-Ala⁶-^DPro⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³-Lys(iPr)¹⁴-^DLys(iPr)¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）およびその医薬的に許容される塩。
シクロ(-Tyr¹-His²-Tyr³-Cys⁴-Ser⁵-Acc⁶-^DPro⁷-Orn(iPr)⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Cys¹¹-Tyr¹²-Gln¹³-Lys(iPr)¹⁴-^DPro¹⁵-Pro¹⁶-)（ここで、Cys⁴とCys¹¹の間にジスルフィド結合を有する）およびその医薬的に許容される塩。
医薬活性物質、具体的には、CXCR4との拮抗作用、抗癌活性および/または抗炎症活性および/または幹細胞遊走活性を有する物質として用いるための請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、溶液剤、液剤、ゲル剤、湿布薬、クリーム剤、軟膏、シロップ剤、スラリー剤、サスペンジョン剤、粉末剤、および坐薬から選ばれる、経口、局所、経皮、注射、バッカル、または経粘膜投与に適した形の、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物および医薬的不活性担体を含む医薬組成物。
CXCR4との拮抗作用、抗癌活性および/または抗炎症活性および/または幹細胞遊走活性を有する医薬を製造するための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の使用であって、健康な個体のHIV感染を予防し、HIV感染患者のウイルスの進行を遅延または停止させ、CXCR4レセプター活性に介在されるかまたは起因する癌または免疫疾患を治療または予防し、免疫抑制を治療し、末梢血幹細胞のアフェレーシス収集を伴い、または組織修復を調節するための幹細胞の遊走を誘導するための使用。
以下の工程を含む請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の製造方法：
(a)適切に官能化された固体支持体を、目的とする最終生成物において16位のProの適切にN保護された誘導体とカップリングさせ、
(b)得られた該生成物からN保護基を除去し、
(c)得られた該生成物を、目的とする最終生成物において15位のアミノ酸の適切にN保護された誘導体とカップリングさせ、ここで、該N保護されたアミノ酸に存在しうるあらゆる官能基が同様に適切に保護される、
(d)工程(c)で得られる該生成物からN保護基を除去し、
(e)目的とする最終生成物のn-2〜１位のアミノ酸の適切にN保護された誘導体を用いて工程(c)および(d)に実質的に対応する工程を実施し、ここで、該N保護されたアミノ酸誘導体に存在しうるあらゆる官能基が同様に適切に保護される、
(f)所望により、P4およびP11のCys残基の側鎖間にジスルフィド架橋を形成するか、または下記のごとく工程(i)に次いで前記結合を形成し、
(g)得られた該生成物を固体支持体から分離し、
(h)該固体支持体から解離した該生成物を環化し、
(i)アミノ酸残基の鎖のあらゆるメンバーの官能基上に存在するあらゆる保護基を除去し、そして
(j)所望により、１または数個のイソプロピル基を付加し、
(k) 所望により、得られた該生成物を医薬的に許容される塩に変換するか、または得られた医薬的に許容されるかまたは許容されない塩を対応する遊離化合物または異なる医薬的に許容される塩に変換する。