ES2864091T3

ES2864091T3 - Inmunomoduladores de producción de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET)

Info

Publication number: ES2864091T3
Application number: ES17728696T
Authority: ES
Inventors: David J Donnelly; Kenneth M Boy; Yunhui Zhang; Joonyoung Kim; Adrienne Pena
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2017-05-17
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2037-05-17
Also published as: HUE054306T2; KR20190009330A; IL262962B; HRP20210644T8; JP6953444B2; CN109414514A; WO2017201111A1; LT3458111T; PL3458111T3; CY1124241T1; MX2018014028A; CN109414514B; EP3458111B1; JP2019520328A; EP3458111A1; EP3827849A1; BR112018073642A2; EA201892635A1; AU2017268291A1; SG11201810177VA

Abstract

Un compuesto de fórmula (1): **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde x es un número entero de 1 a 8 y R es un grupo alquilo C1-C6.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunomoduladores de producción de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET)

La presente descripción se refiere en general a inmunomoduladores que contienen grupos prostéticos 18F y a la síntesis y al uso de inmunomoduladores marcados con 18F para diversos procesos de producción de imágenes dentro del cuerpo, para detectar la ubicación de moléculas asociadas a la patología de enfermedades y para vigilar la progresión de enfermedades.

La tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) es una técnica de producción de imágenes no invasiva que se ha convertido en uno de los métodos más utilizados en la medicina de diagnóstico y desarrollo de fármacos, con alta sensibilidad (fmoles), alta resolución (4-10 mm) y acreción de tejido que se puede cuantificar. La valiosa información funcional in vivo sobre los procesos biológicos en sujetos vivos proporcionada por la producción de imágenes por PET también proporciona una ventaja médica traslacional única en el sentido de que la misma herramienta se puede usar tanto preclínicamente como clínicamente.

La PET depende del diseño y síntesis de moléculas marcadas con radioisótopos emisores de positrones que incluyen 18F, 64Cu, 11C, 15O, 13N, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr, 94mTc, 86Y y 124I. In vivo, estos radioindicadores o radioligandos emiten positrones desde el núcleo del isótopo con diferentes energías que dependen del isótopo utilizado. La energía del positrón eyectado controla la distancia promedio que se desplaza antes de colisionar con un electrón, lo que da como resultado la emisión de dos rayos gamma de 511 keV en direcciones opuestas. Los rayos gamma producidos por este evento de aniquilación de positrones son detectados por el escáner de imágenes PET para producir imágenes planas y tomográficas que revelan la distribución de los radioindicadores en función del tiempo. Por consiguiente, los isótopos que son emisores de positrones puros con isótopos de baja energía de eyección se prefieren para la producción de imágenes PET para minimizar la distancia recorrida por el positrón antes de la aniquilación y los problemas de dosimetría causados por otras emisiones, tales como rayos gamma, partículas alfa o partículas beta.

Además, la semivida del isótopo utilizado en la producción de imágenes por PET debe ser lo suficientemente larga para permitir la síntesis y el análisis de la molécula radioindicadora, la inyección en el paciente, la localización in vivo, el aclaramiento de tejidos no diana y la producción de una imagen clara. 18F (p+ 635 keV 97 %, t i ^/2110 min) es uno de los isótopos emisores de PET más ampliamente utilizados debido a su baja energía de emisión de positrones, falta de emisiones laterales y semivida adecuada.

La presente descripción se refiere a una millamolécula sustituida con un grupo prostético marcado con 18F que contiene una nitropiridina unida a un resto de polietilenglicol (PEG) y una azida terminal. En ciertas realizaciones, las millamoléculas que contienen restos de conjugación bifuncionales (por ejemplo, con grupos alquinos restringidos a anillo) forman enlaces covalentes con la azida terminal del grupo prostético marcado con 18F mediante una reacción bioortogonal “clic” para producir sondas radiomarcadas que son estables en condiciones fisiológicas. La absorbancia UV del producto resultante además proporciona un método analítico práctico, sensible y rápido para determinar la pureza radioquímica del producto. Estas millamoléculas marcadas con 18F son útiles para detectar la presencia de PD-L1 en células y tejidos, tales como tumores, que pueden proporcionar información valiosa sobre del tratamiento. Los documentos WO 2014/151634 y WO 2016/077518 describen péptidos macrocíclicos que inhiben interacción proteína/proteína PD-1/PD-L1 y PD-L1/CD80. Además, el documento WO 2016/086021 describe adnectinas anti-PD-Ll que son adecuadas para su uso como agentes de diagnóstico y producción de imágenes. El documento WO 2013/010573 describe compuestos con actividad inhibidora de la metaloproteinasa de la matriz como agentes terapéuticos y de diagnóstico. Maute et al., PNAS, vol.l 12, N.°47, (Noviembre de 2015) págs. E6506-E6514, describe variantes de PD-1 de alta afinidad para la inmunoterapia optimizada y la producción de imágenes por inmuno-PET.

Otras características y ventajas de la presente descripción serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y los ejemplos.

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o métodos de diagnóstico realizados in vivo se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para su uso en un método de diagnóstico puesto en práctica en el cuerpo humano o animal.

Breve Descripción de las Figuras

La Figura 1 es una representación de imágenes de PET/CT representativa del péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F] en ratones que portan tumores de xenoinjerto PD-L1(+)L2987 y ^pD-L1(-) bilaterales.

La Figura 2 muestra las curvas promedio de tiempo-actividad para los radioindicadores de péptido PD-L1 macrocíclicos marcados con [18F].

La Figura 3 es una representación de imágenes de PET de radioindicadores de péptido PD-L1 macrocíclicos marcados con [18F] en primates no humanos.

La Figura 4 muestra imágenes de autorradiogramas del radioindicador de péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F] en xenoinjerto (Fig. A y B) y tejidos de biopsia de cáncer de pulmón no microcítico humano (Fig. C y D). En su primer aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (I)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde x es un número entero desde 1 hasta 8 y R es un grupo alquilo C¹-C⁶.

En un segundo aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (II)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde x es un número entero desde 1 a 8 y R es un grupo alquilo C¹-C⁶.

En un tercer aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (III)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un cuarto aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (IV)

En un quinto aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (V)

En un sexto aspecto, la presente descripción proporciona un método para obtener una imagen de un compuesto de fórmula (I)-(V), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, comprendiendo el método,

a) administrar el compuesto a un sujeto; y

b) producir imágenes in vivo de la distribución de compuestos mediante escaneo por tomografía por emisión de positrones (PET).

En una primera realización del sexto aspecto, la distribución de la que se produjeron imágenes del compuesto de fórmula (I)-(V), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es indicativa de la presencia o ausencia de una enfermedad.

En un séptimo aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de formula (I)-(V) para su uso en la vigilancia del progreso de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo dicho uso

(a) administrar a un sujeto que lo necesite el compuesto de fórmula (I)-(V), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que se una a una molécula diana asociada a la presencia de la enfermedad en un primer punto temporal y obtener una imagen de por lo menos una porción del sujeto para determinar la cantidad de las células o tejido enfermos; y

(b) administrar al sujeto el compuesto en uno o más puntos temporales posteriores y obtener una imagen de por lo menos una porción del sujeto en cada punto temporal; en donde la dimensión y la ubicación de las células o tejidos enfermos en cada punto temporal es indicativo del progreso de la enfermedad.

En un octavo aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (I)-(V) para su uso en la cuantificación de células o tejidos enfermos en un sujeto, comprendiendo dicho uso

(a) administrar a un sujeto que tiene células o tejidos enfermos el compuesto de fórmula (I)-(V) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que se unen a una molécula diana localizada con las células o tejidos enfermos; y

(b) detectar las emisiones radiactivas del 18F en las células o tejidos enfermos, en donde el nivel y distribución de las emisiones radiactivas en las células o tejidos enfermos es una medida cuantitativa de las células o tejidos enfermos.

En una primera realización del octavo aspecto, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cánceres sólidos, cánceres hematopoyéticos, cánceres hemáticos, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares e infecciones patógenas.

En un noveno aspecto, la presente descripción proporciona un método para obtener una imagen cuantitativa de tejidos o células que expresan PD-L1, comprendiendo el método poner en contacto las células o el tejido con un compuesto de fórmula (I)-(V) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que se une a PD-L1 y detectar o cuantificar el tejido que expresa PD-L1 usando tomografía por emisión de positrones (PET).

En un décimo aspecto, la presente descripción proporciona un agente de diagnóstico o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de acuerdo con la fórmula (I)-(V) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como agente de producción de imágenes.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de acuerdo con la fórmula (I)-(V) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el diagnóstico de una enfermedad en un sujeto. Normalmente, el diagnóstico incluye la detección o vigilancia del progreso de una enfermedad en un sujeto. De acuerdo con una realización, el compuesto de acuerdo con la fórmula (I)-(V) se administra al sujeto que requiere que el diagnóstico y la visualización directa de las células y tejidos enfermos se lleve a cabo usando tomografía por emisión de positrones.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (I)-(V) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el diagnóstico ex vivo de una enfermedad en un sujeto que se refiere a el nivel y distribución en tejidos y células de expresión de PD-Ll.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (I)-(V) para su uso en la vigilancia in vitro del progreso de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo dicho uso:

(a) en un primer punto temporal; poner en contacto una muestra de células o tejidos de un sujeto con el compuesto de fórmula (I)-(V) en donde el compuesto se une a una molécula diana asociada a la presencia de la enfermedad y obtener una imagen usando tomografía por emisión de positrones; y

(b) en uno o más puntos temporales posteriores, poner en contacto otra muestra de células o tejidos con el compuesto de fórmula (I)-(V) y obtener una imagen en cada punto temporal;

en donde la dimensión y la ubicación de las células o tejidos enfermos en cada punto temporal es indicativo del progreso de la enfermedad.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (I)-(V) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en la cuantificación de células o tejidos enfermos in vitro en un sujeto, comprendiendo dicho uso:

(a) poner en contacto una muestra de células o tejidos de un sujeto con el compuesto de fórmula (I)-(V) en donde el compuesto se une a una molécula diana asociada a la presencia de la enfermedad y obtener una imagen usando tomografía por emisión de positrones; y

(b) detectar emisiones radiactivas del 18F en las células o tejidos enfermos, en donde el nivel y distribución de las emisiones radiactivas en las células o tejidos enfermos es una medida cuantitativa de las células o tejidos enfermos.

De acuerdo con una realización de cualquiera de los aspectos de la presente descripción, la enfermedad está relacionada con el nivel y distribución en tejidos y células que expresan PD-L1. Normalmente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cánceres sólidos, cánceres hematopoyéticos, cánceres hemáticos, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares y enfermedades patógenas. En otra realización, la enfermedad es cánceres sólidos.

Se describen en el presente documento grupos prostéticos 18F y métodos para producir los grupos prostéticos 18F. También se describen en el presente documento composiciones radiomarcadas que contienen los grupos prostéticos 18F y el uso de estas composiciones radiomarcadas para diagnosticar, localizar, vigilar y/o evaluar células y/o tejidos enfermos y afecciones biológicas relacionadas.

Con el propósito de que la presente descripción se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Las definiciones adicionales se exponen a lo largo de la descripción detallada. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado como el que entiende comúnmente un experto en la materia y se emplean métodos convencionales de espectroscopia de masas, RMN, HPLC, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología.

Como se utilizan en el presente documento, las formas del singular “un”, “uno” y “el” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El uso de “o” o “y” significa “y/o” a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término “que incluye” así como otras formas, tales como “que incluye”, “incluye” e “incluido”, no es limitante.

Como se utiliza en el presente documento, “aproximadamente” significa dentro más o menos el diez por ciento de un número. Por ejemplo, “aproximadamente 100” se referiría a cualquier número entre 90 y 110. Como se utiliza en el presente documento, “producción de imágenes médicas” se refiere a las técnicas y procesos utilizados para crear imágenes del cuerpo del sujeto (o partes del mismo) con propósitos clínicos (procedimientos médicos que buscan revelar, diagnosticar o vigilar enfermedades) o ciencias médicas (que incluye el estudio de anatomía y fisiología normales).

Como se utiliza en el presente documento, “tomografía por emisión de positrones” o “PET” se refiere a una técnica de medicina nuclear no invasiva que produce una imagen tridimensional de la ubicación del indicador en el cuerpo. El método detecta pares de rayos gamma emitidos indirectamente por un radionúclido (indicador) que emite positrones, el cual se introduce en el cuerpo en una molécula biológicamente activa. Las herramientas de producción de imágenes PET tienen una amplia diversidad de usos y ayudan en el desarrollo de fármacos tanto preclínicamente como clínicamente. Las aplicaciones de ejemplo incluyen la visualización directa de saturación in vivo de dianas; la vigilancia de la absorción en tejidos normales para anticipar la toxicidad o variación de paciente a paciente; cuantificación de tejido enfermo; metástasis tumoral; y vigilar la eficacia de fármacos en el transcurso de tiempo, o la resistencia en el transcurso de tiempo.

La expresión “química bioortogonal” se refiere a cualquier reacción química que pueda producirse dentro de los sistemas vivos sin interferir con los procesos bioquímicos naturales. La expresión incluye las reacciones químicas que son reacciones químicas que se producen in vitro en un pH fisiológico, o en presencia de agua. Para ser consideradas bioortogonales, las reacciones son selectivas y evitan reacciones secundarias con otros grupos funcionales encontrados en los compuestos de partida. Además, el enlace covalente resultante entre los compañeros de reacción debe ser fuerte y químicamente inerte a reacciones biológicas y no debe afectar a la actividad biológica de la molécula deseada.

La expresión “química clic” se refiere a un conjunto de reacciones bioortogonales confiables y selectivas para la síntesis rápida de nuevos compuestos y bibliotecas combinatorias. Las propiedades de las reacciones de clic incluyen modularidad, amplitud en el alcance, alto rendimiento, estereoespecificidad y aislamiento simple de producto (separación de subproductos inertes mediante métodos no cromatográficos) para producir compuestos que son estables en condiciones fisiológicas. En radioquímica y radiofarmacia, la química clic es un término genérico para un conjunto de reacciones de marcado que utilizan componentes básicos selectivos y modulares y permiten las ligaduras quimioselectivas con compuestos biológicamente relevantes radiomarcados en ausencia de catalizadores. Una “reacción clic” puede ser con cobre, o puede ser una reacción clic libre de cobre.

La expresión “grupo prostético” o “agente de marcado bifuncional” se refiere a una molécula orgánica pequeña que contiene un radionúclido (por ejemplo, 18F) que tiene la capacidad de unirse a una millamolécula.

Como se utiliza en el presente documento, “diana” como una referencia general a una “diana biológica” se refiere a una célula, tejido (por ejemplo, cáncer o tumor), un microorganismo patógeno (por ejemplo, bacterias, virus, hongos, plantas, priones, protozoos o porciones de los mismos) u otra molécula asociada a un mecanismo biológico, o un fenómeno biológico, tal como inflamación de tejido, formación de placa, etc.

Las expresiones “ligando de direccionamiento”, “agente de direccionamiento” o “molécula de direccionamiento” se utilizan indistintamente para referirse a una molécula, tal como un péptido, millamolécula, etc., que se une a otra molécula. En ciertas realizaciones, un agente de direccionamiento está unido al grupo prostético 18F con el fin de “dirigir” una molécula asociada a una célula, tejido, patógeno o mecanismo biológico particular.

Las expresiones “se une específicamente”, “unión específica”, “unión selectiva” y “se une selectivamente”, como se utilizan en el presente documento indistintamente se refieren a un péptido o polipéptido que presenta afinidad para una diana biológica, pero no se une de manera significativa (por ejemplo, menos de aproximadamente el 10% de unión) a otras moléculas, conforme lo medido mediante una técnica disponible en la técnica anterior tal como, pero sin limitación, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (por ejemplo, ELISA de competencia, ensayo BIACORE).

El término “CI⁵⁰”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la concentración de una sonda a base de millamoléculas radiomarcadas con 18F que inhibe una respuesta, ya sea en un ensayo in vitro o in vivo, a un nivel que es el 50 % de la respuesta inhibidora máxima, en este caso, la mitad entre la respuesta inhibitoria máxima y la respuesta sin tratamiento.

Como se utiliza en el presente documento, el término “unido” se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El enlace puede ser covalente o no covalente.

Los términos “diagnóstico” o “detección” se pueden usar indistintamente. Mientras que el diagnóstico generalmente se refiere a la definición del estado histológico específico del tejido, la detección reconoce y localiza un tejido, lesión u organismo que contiene una diana detectable particular.

El término “detectable” se refiere a la capacidad de detectar una señal sobre la señal de fondo. El término “señal detectable”, como se utiliza en el presente documento en el contexto de los agentes de producción de imágenes y diagnósticos, es una señal derivada de técnicas de imágenes no invasivas tales como, pero sin limitación, la tomografía por emisión de positrones (PET). La señal detectable es detectable y se puede distinguir de otras señales de fondo que se pueden generar desde el sujeto. En otras palabras, existe una diferencia que se puede medir y es estadísticamente significativa entre la señal detectable y la de fondo (por ejemplo, una diferencia estadísticamente significativa es una diferencia suficiente para distinguir entre la señal detectable y la de fondo, tal como aproximadamente el 0,1 %, 1 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, o 40 % o una diferencia mayor entre la señal detectable y la de fondo). Se pueden usar patrones y/o curvas de calibración para determinar la intensidad relativa de la señal detectable y/o la de fondo.

Una “cantidad detectablemente eficaz” de una composición que comprende un agente de producción de imágenes descrito en el presente documento se define como una cantidad suficiente para producir una imagen aceptable usando equipo que está disponible para su uso clínico. Una cantidad detectablemente eficaz de un agente de producción de imágenes proporcionado en el presente documento se puede administrar en más de una inyección. La cantidad detectablemente eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como el grado de susceptibilidad del individuo, la edad, el sexo y el peso del individuo, las respuestas idiosincrásicas del individuo y similares. Las cantidades detectablemente eficaces de composiciones para producir imágenes también pueden variar de acuerdo con el instrumento y las metodologías utilizadas. La optimización de tales factores es suficientemente conocida dentro del nivel de habilidad en la técnica.

Como se utiliza en el presente documento, “administrar”, como se usa en el contexto de los agentes de producción de imágenes se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agente de producción de imágenes a un sujeto, usando cualquiera de los diferentes métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la materia. Las vías de administración preferidas para los agentes de producción de imágenes descritos en el presente documento incluyen las vías de administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión “administración parenteral” como se utiliza en el presente documento significa modos de administración diferentes a la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluye, pero sin limitación, la inyección e infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, así como la electroporación in vivo. Como alternativa, un agente de producción de imágenes descrito en el presente documento se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también se puede realizar en, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.

Los términos “coadministración” o similares, como se utilizan en el presente documento, tienen la intención de abarcar la administración de los agentes farmacéuticos seleccionados a un solo paciente y tienen la intención de incluir pautas en las que los agentes se administran por la misma vía de administración o una diferente, o al mismo tiempo o en otro diferente.

Los términos “paciente” y “sujeto” se refieren a cualquier animal humano o no humano que recibe una composición que comprende un agente de producción de imágenes descrito en el presente documento. Para aplicaciones in vitro, tal como las aplicaciones de diagnóstico e investigación in vitro, los fluidos corporales y muestras celulares de los sujetos anteriores serán adecuados para su uso, tal como muestras de sangre, orina o tejidos.

El término “muestra” se puede referir a una muestra de tejido, muestra de célula, muestra de fluido y similares. La muestra puede ser tomada de un sujeto. La muestra de tejido puede incluir pelo (incluidas las raíces), frotis bucales, sangre, saliva, semen, músculo o cualquier órgano interno. El líquido puede ser, pero sin limitación, orina, sangre, ascitis, líquido pleural, líquido espinal y similares. El tejido corporal puede incluir, pero sin limitación, el tejido cutáneo, muscular, endometrial, uterino y cervical.

El término “isotópicamente puro” significa que el elemento, compuesto o composición contiene una mayor proporción de un isótopo en relación con otros isótopos. En ciertas realizaciones, el elemento, compuesto o composición es isotópicamente puro en más de aproximadamente el 40 %, 50 % o 60 %.

Como se utiliza en el presente documento, una molécula marcada se “purifica” cuando la molécula marcada se separa parcialmente o totalmente de moléculas no marcadas, de manera que la fracción de las moléculas marcadas está enriquecida en comparación con la mezcla de partida. Una molécula marcada “purificada” puede comprender una mezcla de moléculas marcadas y no marcadas en casi cualquier relación, incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 5:95; 10:90; 15:85; 20:80; 25:75; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 75:25; 80:20; 85:15; 90:10; 95:5; 97:3; 98:2; 99:1 o 100:0.

El grupo “OTf” se refiere al triflato que tiene la fórmula CF³SO³o trifluorometanosulfato.

El término “halo” o, como alternativa, “halógeno” o “haluro” significa flúor, cloro, bromo o yodo.

A lo largo de la memoria descriptiva, los grupos y sustituyentes de los mismos pueden ser seleccionados por un experto en la materia para proporcionar restos y compuestos estables útiles como compuestos farmacéuticamente aceptables y/o compuestos intermedios útiles en la preparación de compuestos farmacéuticamente aceptables. Diversos aspectos descritos en el presente documento se describen con más detalle en las siguientes subsecciones. Grupos Prostéticos Radiomarcados con 18F

En un aspecto, se proporciona en el presente documento una 18F-piridina PEGilada unida covalentemente a una azida con la siguiente estructura,

o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en donde x es un número entero desde 1 a 8. En algunas realizaciones, x es un número entero desde 2 a 6. En algunas realizaciones x es un número entero desde 3 a 5. En algunas realizaciones, x es 4. En realizaciones relacionadas, 18F está unido a la piridina orto al átomo de N. En algunas realizaciones, el resto [O(CH²)²]x está presente en la configuración 1-3 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina. En algunas realizaciones, el resto [O(CH²)²]x está presente en la configuración 1-2 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina. En otras realizaciones, el resto [O(CH²)²]x está presente en la configuración 1-4 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina.

En algunas realizaciones, el compuesto radiomarcado con 18F tiene la estructura

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde x es un número entero desde 1 a 8. En algunas realizaciones, x es un número entero desde 2 a 6. En algunas realizaciones x es un número entero desde 3 a 5. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, el resto [O(CH²)²]x está presente en la configuración 1-3 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina. En algunas realizaciones, el resto [O(CH²)²]x está presente en la configuración 1-2 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina. En otras realizaciones, el resto [O(CH²)²]x está presente en la configuración 1-4 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina.

En algunas realizaciones, el compuesto radiomarcado con 18F tiene la estructura

en donde x es un número entero desde 1 a 8. En algunas realizaciones, x es un número entero desde 2 a 6. En algunas realizaciones x es un número entero desde 3 a 5. En algunas realizaciones, x es 4.

En algunas realizaciones, el compuesto radiomarcado con 18F es [18F]-3-(2-(2-(2-(2(azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (18F-FPPEGA) y tiene la estructura

En realizaciones alternativas, el grupo prostético radiomarcado con 18F puede contener grupos adicionales en el anillo de piridina que no interfieren con la reacción de fluoración. En ciertas realizaciones, las adiciones al anillo de piridina incluyen grupos alquilo C¹-⁶, por ejemplo, metilo, etilo y propilo.

En aún otras realizaciones, el grupo prostético radiomarcado con 18F es un sistema anular condensado con la siguiente estructura:

en donde “OPEG” es [O(CH²)²]x y x es un número entero desde 1 a 8. En algunas realizaciones, x es un número entero desde 2 a 6. En algunas realizaciones, x es un número entero desde 3 a 5. En Algunas realizaciones, x es 4. En un aspecto relacionado, se proporciona en el presente documento un método para preparar una 18F-piridina PEGilada unida covalentemente a una azida con la siguiente estructura,

en donde x es un número entero desde 1 a 8, comprendiendo el método los pasos de

(a) Proporcionar una solución de un compuesto a con la siguiente estructura:

en donde x es un número entero de 1 a 8 y R es NO², Br, F o

y está en orto con respecto al átomo de N del anillo de piridina;

(b) proporcionar una mezcla de 18F en 18Oagua, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano y una base débil;

(c) secar la mezcla del paso (b) para formar un sólido; y

(d) hacer reaccionar la solución del paso (a) con el sólido del paso (c) para formar el compuesto marcado con En ciertas realizaciones, el método produce un grupo prostético de ¹⁸F-piridina con la siguiente estructura b

(donde 18F está en orto con respecto al átomo de N), e incluye los pasos de

(a) proporcionar una solución del compuesto de la estructura

(donde X está en orto con respecto al átomo de N) donde X es NO², Br o

(b) proporcionar una mezcla de 18F en ¹⁸Oagua, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano y una base débil, como K²CO³;

(c) secar la mezcla del paso (b) para formar un sólido; y

(d) hacer reaccionar la solución del paso (a) con el sólido del paso (c) para formar el compuesto marcado con ¹⁸F.

En ciertas realizaciones, el método además comprende el paso de producir un compuesto con la siguiente estructura a

de acuerdo con el Esquema 1 que se muestra a continuación:

En ciertas realizaciones, el método comprende producir el grupo prostético de 18F-piridina [18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (18F-FPPEGA), e, de_d, de acuerdo con las siguientes condiciones de reacción:

Formulaciones

Además se proporcionan composiciones, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de agentes de direccionamiento marcados con 18F, descritos en el presente documento, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) agentes descritos en el presente documento. Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender una combinación de un agente de direccionamiento marcado con 18F y un fármaco.

Como se utiliza en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para una administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el agente de direccionamiento marcado con 18F puede recubrirse en un material para proteger el compuesto contra la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos descritos en el presente documento pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no transmite ningún efecto toxicológico indeseable (véase, por ejemplo, Berge, SM, et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen las sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fósforo y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y di-carboxílicos alifáticos, alcanoicos sustituidos con fenilo. ácidos, ácidos hidroxialcananoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica descrita en el presente documento también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tal como el oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar mediante ambos procedimientos de esterilización, citado anteriormente y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenólico sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tal como el monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica anterior. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Normalmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, una microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como el manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr por la inclusión en la composición de un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el agente de direccionamiento marcado con 18F en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno, o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, conforme se requiera, seguido de una microfiltración de esterilización. En general, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución esterilizada y filtrada previamente del mismo.

La cantidad de agente de direccionamiento marcado con 18F que se puede combinar con un material vehículo para producir una forma de dosificación única, variará dependiendo del sujeto a ser tratando y del modo particular de administración. La cantidad de agente de direccionamiento marcado con 18F que se puede combinar con un material vehículo para producir una forma de dosificación única generalmente será aquella cantidad de la composición que produce un efecto detectable. En general, fuera del cien por ciento, esta cantidad se encontrará en el intervalo desde aproximadamente el 0,01 por ciento hasta aproximadamente el noventa y nueve por ciento del principio activo, preferentemente desde aproximadamente el 0,1 por ciento hasta aproximadamente el 70 por ciento, mucho más preferentemente desde aproximadamente el 1 por ciento hasta aproximadamente el 30 por ciento del principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Administración y Producción de imágenes

Los agentes de direccionamiento marcados con 18F descritos en el presente documento son útiles en diversas aplicaciones de imágenes in vivo (por ejemplo, para producir imágenes de tejidos o de todo el cuerpo). En ciertas realizaciones, el agente de direccionamiento marcado con 18F se puede usar para producir imágenes de células o tejidos diana positivos, por ejemplo, tumores que expresan dianas. Por ejemplo, el agente de direccionamiento marcado con 18F se administra a un sujeto en una cantidad suficiente para absorber el agente de direccionamiento marcado con 18F dentro del tejido de interés. El sujeto después toma para producir imágenes usando un sistema de producción de imágenes tal como el PET durante una cantidad de tiempo adecuada para el radionúclido 18F. Las uniones de agente de direccionamiento marcado con 18F a las células o tejidos que expresan el agente de direccionamiento después son detectadas por el sistema de producción de imágenes.

Normalmente, para fines de producción de imágenes, es deseable proporcionar al receptor una dosis de millamolécula que se encuentre en el intervalo desde aproximadamente 1 mg a 200 mg como una sola infusión intravenosa, aunque también se puede administrar una dosis más baja o más alta de acuerdo como lo dicten las circunstancias. Normalmente, es deseable proporcionar al receptor una dosis que se encuentre en el intervalo desde aproximadamente 1 mg a 10 mg por metro cuadrado de área de superficie corporal de la proteína o péptido para el adulto típico, aunque una dosis más baja o más alta también se puede administrar de acuerdo como lo dicten las circunstancias. Los ejemplos de dosis de proteínas o péptidos que se pueden administrar a un sujeto humano con fines de producción de imágenes son de aproximadamente 1 a 200 mg, aproximadamente de 1 a 70 mg, aproximadamente de 1 a 20 mg y aproximadamente de 1 a 10 mg, aunque se pueden usar dosis más altas o más bajas.

En ciertas realizaciones, la administración se produce en una cantidad de millamolécula radiomarcada con 18F de entre aproximadamente 0,005 pg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal por día, generalmente entre 0,02 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 3 pg/kg de peso corporal. La masa asociada a un indicador de PET se encuentra en la forma del isótopo natural, es decir, 19F para el indicador de PET 18F. Una dosis analítica particular para la presente composición incluye desde aproximadamente 0,5 pg hasta aproximadamente 100 pg de una millamolécula radiomarcada con 18F. La dosis generalmente será desde aproximadamente 1 pg a aproximadamente 50 pg de una millamolécula radiomarcada con 18F.

Las pautas de dosificación se ajustan para proporcionar la cantidad detectable óptima para obtener una imagen clara del tejido o células las cuales absorben el agente de direccionamiento marcado con 18F. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a que se debe administrar el agente de direccionamiento marcado con 18F. La memoria descriptiva para las formas de dosificación unitarias descritas en el presente documento están dictadas por y son directamente dependientes de (a) las características únicas de la porción de direccionamiento del agente de direccionamiento marcado con 18F; (b) el tejido o células a ser dirigidos; (c) las limitaciones inherentes en la tecnología de producción de imágenes utilizada. Para la administración del agente de direccionamiento marcado con 18F, la dosis utilizada dependerá del tipo de enfermedad, el compuesto diana utilizado, la edad, la condición física y el género del sujeto, el grado de la enfermedad, el sitio que se examinará y otros. En particular, se debe tener suficiente cuidado con las dosis expuestas a un sujeto. Preferentemente, se administra al paciente una dosis de saturación de 18F. Por ejemplo, la cantidad de radioactividad del agente de direccionamiento marcado con 18F generalmente se encuentra en el intervalo desde 3,7 megabecquerel a 3,7 gigabecquerel y Preferentemente desde 18 megabecquerel a 740 megabecquerel. Como alternativa, la dosis se puede medir por milicurios, por ejemplo. En algunas realizaciones, la cantidad de productor de imágenes 18F administradas para estudios de imágenes es de 5 a 10mCi. En otras realizaciones, una cantidad eficaz será la cantidad del compuesto suficiente para producir emisiones en el intervalo desde aproximadamente de 1-5 mCi.

Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la absorción deseada del agente de direccionamiento marcado con 18F en las células o tejidos de un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxica para el paciente. Sin embargo, se deberá entender que el uso diario total del agente de direccionamiento marcado con 18F de la presente descripción será decidido por el médico especialista u otro profesional especialista dentro del alcance del buen criterio médico. El nivel de dosis eficaz específico para cualquier sujeto en particular dependerá de diversos factores, que incluyen, por ejemplo, la actividad de la composición específica empleada; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del hospedador; el tiempo de administración; la vía de administración; la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y el historial médico previo del paciente que es tratado y factores similares suficientemente conocidos en la técnica médica. En ciertas realizaciones, la cantidad de la sonda radiomarcada con 18F administrada en un sujeto humano requerida para la producción de imágenes será determinada por el médico que prescribe, quien varía la dosis generalmente de acuerdo con la cantidad de emisión del radionúclido 18F.

Una composición descrita en el presente documento se puede administrar a través de una o más vías de administración usando una o más de diversos métodos conocidos en la técnica. Como será apreciado por los expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para el agente de direccionamiento marcado con 18F descritas en el presente documento incluyen las vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo, mediante una inyección o infusión. La expresión “administración parenteral” como se utiliza en el presente documento significa modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluye, pero sin limitación, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. En ciertas realizaciones, el compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F se administra por vía intravenosa.

Como alternativa, un agente de direccionamiento marcado con 18F descrito en el presente documento se puede administrar mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

En ciertas realizaciones, el agente de dirección marcado con 18F descrito en el presente documento se puede formular en el presente documento para garantizar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Los agentes pueden cruzar la BHE al formularlos, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan selectivamente dentro de células u órganos específicos, potenciando de este modo el suministro de fármaco dirigido (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los restos de diana de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense 5.416.016 de Low et al; los manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína tensioactivo A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); ver también K. Keinanen; ML Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994).

El siguiente procedimiento ilustrativo se puede usar cuando se realizan estudios de imágenes PET en pacientes en la clínica. El paciente es premedicado con millamolécula no marcada en algún momento previo al día del experimento y se mantiene en ayunas durante por lo menos 12 horas que permite la ingesta de agua a voluntad. Se inserta un catéter venoso 20 g de 5,08 cm (dos pulgadas) dentro de la vena cubital contralateral para la administración de la concentración del radioindicador en la sangre.

El paciente se coloca en la cámara PET y se le administra una dosis de indicador del indicador de PET de la millamolécula radiomarcada con 18F (<20 mCi) por vía de catéter i.v. Se toman muestras de sangre arterial o venosa en intervalos de tiempo adecuados a lo largo de la exploración PET para analizar y cuantificar la fracción de indicador de PET no metabolizado del compuesto [18F] de Ejemplo 2 en plasma. Las imágenes se adquieren por hasta 120 min. En los diez minutos después de la inyección del radioindicador y al final de la sesión de imágenes, se obtienen muestras de sangre de 1 ml para determinar la concentración de plasma de cualquier millamolécula no marcada que se haya administrado antes del indicador de PET.

Las imágenes tomográficas se obtienen a través de la reconstrucción de la imagen. Para determinar la distribución del radioindicador, se trazan regiones de interés (ROI, por sus siglas en inglés) en la imagen reconstruida, incluyendo, pero sin limitación, los pulmones, el hígado, corazón, riñones, la piel u otros órganos y tejidos. Las absorciones de radioindicadores en el transcurso de tiempo en estas regiones se utilizan para generar curvas de actividad de tiempo (TAC, por sus siglas en inglés) obtenidas en ausencia de cualquier intervención o en la presencia de la millamolécula no marcada en los diferentes paradigmas de dosificación examinados. Los datos se expresan como la radioactividad por unidad de tiempo por unidad de volumen (dosis inyectada pCi/cc/mCi). Los datos de TAC se procesan con diversos métodos suficientemente conocidos en el campo de producir parámetros cuantitativos, tal como el Potencial de Unión (BP) o el Volumen de Distribución (Vt), que son proporcionales a la densidad del tejido positivo diana no ocupado.

Usos

Se proporcionan en el presente documento los métodos de producción de imágenes usando agentes de direccionamiento marcados con 18F. Los indicadores de tomografía por emisión de positrones (PET), tal como las presentes sondas PET basadas en millamoléculas radiomarcadas con 18F, se pueden usar con la tecnología de PET actualmente disponible para su uso en aplicaciones de imágenes exploratorias y de diagnóstico in vitro e in vivo. Las técnicas y el equipo de producción de imágenes para la producción de imágenes de 18F mediante el escaneo PET son suficientemente conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses N. 6.358.489; 6.953.567; Page et al., Nuclear Medicine And Biology, 21:911-919, 1994; Choi et al., Cáncer Research 55:5323-5329, 1995; Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582, 1992) y cualquier técnica o aparato conocido de producción de imágenes de PET.

Las aplicaciones in vivo de los métodos de producción de imágenes proporcionados en el presente documento incluyen el diagnóstico de la enfermedad, la vigilancia de la progresión de la enfermedad, el pronóstico, la determinación de la probabilidad de que un sujeto responda a un tratamiento, la determinación de la elegibilidad hacia un tratamiento, la vigilancia de la respuesta clínica al tratamiento, la evaluación clínica y la selección de dosis de compuestos terapéuticos, los estudios preclínicos de posibles fármacos candidatos en modelos animales y el estudio de la distribución regional y la concentración de moléculas diana en tejidos y órganos. Las aplicaciones in vitro incluyen la selección de fármacos candidatos en ensayos celulares (por ejemplo, ensayos de competición, ensayos de afinidad, etc.).

En algunas realizaciones, los agentes de direccionamiento marcados con 18F se pueden usar para determinar la relación entre el nivel de ocupación de tejido por los compuestos terapéuticos candidatos y la eficacia clínica en pacientes; para determinar la selección de dosis para ensayos clínicos de fármacos candidatos antes del inicio de estudios clínicos a largo plazo; y comparar las potencias de los diferentes fármacos candidatos.

En algunas realizaciones, el compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F se utiliza en un método de producir imágenes in vivo de tejidos y/u órganos normales o enfermos (por ejemplo, pulmones, corazón, riñones, hígado y piel). Por ejemplo, el compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F se administra a un sujeto en una cantidad eficaz para proporcionar como resultado la absorción del compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F dentro de las células o tejido de interés. Entonces el sujeto se introduce en un sistema de producción de imágenes adecuado (por ejemplo, el sistema de PET) durante un tiempo suficiente para permitir la detección del compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F. La ubicación de la señal detectada del compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F se puede correlacionar con la ubicación de las células o tejido de interés. En algunas realizaciones, también se pueden determinar las dimensiones de la ubicación. La producción de imágenes in vivo se describe en el presente documento. Véanse también las Patentes Estadounidenses N.° 6.126.916; 6.077.499; 6.010.680; 5.776.095; 5.776.094; 5.776.093; 5.772.981; 5.753.206; 5.746.996; 5.697.902; 5.328.679; 5.128.119; 5.101.827; y 4.735.210, cada una incorporada en el presente documento como referencia. Por consiguiente, en ciertos aspectos, se proporciona un método para obtener una imagen de una sonda basada en millamoléculas radiomarcadas con 18F, comprendiendo el método administrar la sonda basada en millamoléculas radiomarcadas con 18F a un sujeto y producir imágenes in vivo de la distribución de la sonda basada en millamoléculas radiomarcadas con 18F por PET.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano, un perro, un gato, un mono, un simio, una rata o un ratón.

En ciertos aspectos, se proporciona una sonda basada en una millamolécula radiomarcada con 18F que se une a una molécula diana asociada a la presencia de la enfermedad para su uso en el diagnóstico de la presencia de una enfermedad en un sujeto y la obtención de una radioimagen de por lo menos una porción del sujeto para detectar la presencia o ausencia de la sonda basada en millamolécula radiomarcada con 18F.

En algunas realizaciones, la enfermedad es un cáncer sólido, un cáncer hematopoyético, cáncer hemático, enfermedad autoinmune, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad cardiovascular o infección patógena.

Las imágenes PET con un compuesto de direccionamiento radiomarcado con 8F se pueden usar para detectar cualitativamente o cuantitativamente el compuesto de direccionamiento. Se puede usar un agente de producción de imágenes del compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F como biomarcador y la presencia o ausencia de una señal positiva en un sujeto puede ser indicativa de que, por ejemplo, el sujeto respondería a una terapia dada, por ejemplo, una terapia contra el cáncer o que el sujeto está respondiendo o no a una terapia.

En algunas realizaciones, los pasos de este método se pueden repetir en intervalos determinados de manera que la ubicación y/o el tamaño de la enfermedad se puedan vigilar en función del tiempo y/o el tratamiento. En ciertas realizaciones, el compuesto de diana radiomarcado con 18F se puede usar en un sujeto que se está sometiendo a tratamiento (por ejemplo, quimioterapia, etc.), para ayudar a visualizar la respuesta al tratamiento. Por ejemplo, el compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F normalmente se visualiza y se dimensiona antes del tratamiento y periódicamente (por ejemplo, en intervalos diarios, semanales, mensuales, en entre los mismos y similares) durante el tratamiento para vigilar la progresión o regresión de la enfermedad en el paciente.

Por consiguiente, en ciertos aspectos, se proporciona una sonda basada en una millamolécula radiomarcada con 18F que se une a una molécula diana asociada a la presencia de una enfermedad para su uso en la vigilancia del progreso de la enfermedad en un sujeto que lo necesite en un primer punto temporal y la obtención de una imagen de por lo menos una porción del sujeto para determinar la cantidad de células o tejido enfermos y la administración al sujeto una sonda basada en millamoléculas radiomarcadas con 18F en uno o más puntos temporales posteriores y la obtención de una imagen de por lo menos una porción del sujeto en cada punto temporal posterior (por ejemplo, la misma porción igual que el primer punto temporal).

En ciertas realizaciones, el tamaño de un tumor se puede vigilar en un sujeto sometido a una terapia contra el cáncer (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia) y se puede vigilar el grado de regresión del tumor en tiempo real con base en la detección del direccionamiento tumoral radiomarcado con 18F.

En algunas realizaciones, en el presente documento la presente invención se usa para evaluar la respuesta del paciente hacia la terapia. En algunas realizaciones, la presente invención se usa para seleccionar o modificar la dosificación de compuestos terapéuticos. En algunas realizaciones, la presente invención se usa para vigilar la absorción del compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F en tejidos normales para analizar la toxicidad o la variación de paciente a paciente. En algunas realizaciones, la presente invención se usa para vigilar la eficacia de fármaco o para detectar la resistencia de fármaco.

En algunas realizaciones, los compuestos radiomarcados se administran a mamíferos, preferentemente a seres humanos, en una composición farmacéutica, ya sea solos o en combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional. Dichas composiciones se pueden administrar por vía oral o parenteral, incluyendo las vías de administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, rectal y tópica. En ciertas realizaciones, la administración es intravenosa. En ciertas realizaciones, el compuesto radiomarcado se administra mediante una inyección intravenosa en menos de una hora de la síntesis.

En algunas realizaciones, la actividad biológica del agente de direccionamiento radiomarcado con 18F in vivo se puede medir en términos de la absorción específica de órgano mediante estudios de biodistribución y estudios de imágenes de PET de animales pequeños dinámicos en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, para estudios de biodistribución, un grupo de animales se inyecta con el agente de direccionamiento radiomarcado con 18F y los subconjuntos de animales se sacrifican en uno o más intervalos de tiempo (por ejemplo, 5 min., 10 min., 30 min., 60 min. 2 h). Los órganos y tejidos de interés se extirpan y pesan rápidamente y se determina la radiactividad. La radiactividad acumulada en órganos y tejidos seleccionados se calcula como el porcentaje de la dosis inyectada (% de DI).

En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento radiomarcado con 18F proporcionado en el presente documento se utiliza in vitro como una herramienta de selección para seleccionar compuestos para su uso en el tratamiento de tejidos o células. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células enfermas se incuban con el compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F durante o después de la exposición a uno o más fármacos candidatos. Se pueden producir imágenes de la capacidad del fármaco candidato para afectar en la enfermedad en el transcurso del tiempo usando el compuesto de direccionamiento radiomarcado con 18F.

Por ejemplo, se evalúa la integridad de la actividad biológica del agente de direccionamiento radiomarcado con 18F in vitro en términos de la unión específica a la molécula diana seleccionada y la absorción de la composición radiomarcada en una estirpe celular que expresa la molécula diana. Para los ensayos de unión y asociación celular, las células se incuban a 4 °C o 37 °C por un tiempo adecuado con la composición de direccionamiento radiomarcada con 18F. La unión no específica se determina mediante la adición de un exceso de agente de direccionamiento no marcado. El grado de unión específica se calcula al restar la unión no específica de la unión total. La absorción se expresa como un porcentaje de la dosis añadida total de agente de direccionamiento a las células por microgramo de proteína (% de DI/pg proteína celular).

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un diagnóstico o composición radiofarmacéutica para in vivo o in vitro, que incluye una sonda basada en millamoléculas radiomarcadas con 18F y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La descripción ahora se describirá con referencia a los siguientes ejemplos, que son solamente ilustrativos y no tienen la intención limitar la presente descripción.

Condición de Análisis A:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase Móvil A: 5:95 acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 50 °C; gradiente: 0 % de B, 0-100 % de B en el transcurso de 3 minutos, después una retención de 0,5 minutos en 100 % de B; Flujo: 1 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condición de análisis B:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase Móvil A: 5:95 metanol:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 metanol:agua con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 50 °C; gradiente: 0 % de B, 0-100% de B en el transcurso de 3 minutos, después una retención de 0,5 minutos en 100% de B; Flujo: 0,5 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Procedimiento de acoplamiento simple:

Al recipiente de reacción que contenía resina del paso anterior se le añadió piperidina: DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 o 5 min. y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se le añadió piperidina: DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 o 5 min. y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces como se indica a continuación: para cada lavado, se añadió DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución se drenase a través de la frita. Al recipiente de reacción se le añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.), después HATU o HCTU (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 60 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se añadió DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se le añadió una solución de anhídrido acético: DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se añadió DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se utilizó directamente en el siguiente paso.

Procedimiento de doble acoplamiento:

Al recipiente de reacción que contenía la resina del paso previo, se le añadió una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 min. y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se le añadió una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 min. y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior, seguido del lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente un lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se le añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), Ha TU (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.) y DIPEA (2M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante un burbujeo de N²durante 5 min. a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cis(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior, seguido de un lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con un lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se le añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), HAt U (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.) y DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante un burbujeo de N²por 5 min. a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cis(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior, seguido de un lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con un lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se le añadió una solución de anhídrido acético: DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se burbujeó periódicamente durante 2 min. a 65 °C, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior, seguido de un Lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con un lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. La resina resultante se utilizó directamente en el siguiente paso.

El siguiente péptido se sintetizó en un 1 mmol. Los pasos subrayados emplearon el procedimiento de doble acoplamiento y los residuos en cursiva se acoplaron con un único acoplamiento de 30 min. ClAc-Tir-[N-Me\Ala-Asn-Pro-Dap-Leu-Hip-Trp-Dab-Ác/cfo (S)-2-amino-3-(1-(carboximetil)-1H-indol-3-il)propanoico\--[N-Me\Nle-[N-Me\Nle-Leu-Cis-Gli-[(S)-propargilglicina]; en donde la (S)propargilglicina se incorporó sobre la resina de 2-clorotritilo. Después de la desprotección y ciclación de acuerdo con los procedimientos anteriores, el compuesto se purificó como sigue: El material en bruto se purificó por medio de CL/EM preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase Móvil A: 5:95 metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase Móvil B: 95:5 metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; gradiente: 45-85% de B durante 30 minutos, después una retención de 5 minutos a 100% de B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 16,4 mg y su pureza estimada por análisis CLEM fue del 96 %. Condición de análisis A: Tiempo de retención = 1,49 min; IEN-EM(+) m/z 992,3 (M 2H), ion más abundante. Condición de análisis B: Tiempo de retención = 3,02 min; IEN-EM (+) m/z 992,3 (M 2H), ion más abundante; IEN-EMAR(+) m/z: Calculado: 991,9953 (M 2H) Encontrado: 991,9926 (M 2H).

Reactivos y condiciones: a) NaN³, etanol 90 °C 17 horas; b) NaH, 2-nitropiridin-3-ol 0-60 °C, 4 horas; c) K.2.2.2 K[18F], DMSO 120 °C 10 minutos;

Ejemplo 1: Preparación de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo

Una mezcla de ((oxibis(etano-2,1-diil))bis(oxi))bis(etano-2,1-diil)bis(4-metilbencenosulfonato) (5 g, 9,95 mmol) y azida de sodio (0,647 g), 9,95 mmol) se disolvió en etanol (50 ml) y la reacción se sometió a reflujo a 90 °C en el transcurso de un período de 17 horas. El disolvente se retiró usando vacío parcial y después se cargó en un cartucho de sílice de 40 gramos y se purificó usando cromatografía ultrarrápida (IscoCombiFlash - se eluyó usando un método de gradiente lineal que parte del 10 % de acetato de etilo en hexanos alcanzando el 90 % de acetato de etilo en hexanos en el transcurso de un período de 45 minutos). Las fracciones agrupadas se verificaron mediante CCF y se combinaron para proporcionar 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo en forma de un aceite incoloro. Debido a la naturaleza reactiva del producto de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo, este material se utilizó "como es” sin ninguna caracterización adicional.

Ejemplo 2: Preparación de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina

A una suspensión de hidruro de sodio (0,129 g, 3,21 mmol) en DMF (10 ml) a 0 °C se añadió gota a gota a una solución en agitación de 2-fluoropiridin-3-ol (0,363 g, 3,21 mmol) en DMF (5 ml), después seguido de la adición gota a gota de la solución de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (1,00 g, 2,68 mmol) en DMF (5 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C durante 10 min, después se llevó a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de un calentamiento adicional a 60 °C durante 4 horas. El disolvente se retiró al vacío. Se añadieron 100 ml de acetato de etilo seguido de 3 extracciones por lavado separadas con solución de salmuera concentrada. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material en bruto se purificó usando cromatografía ultrarrápida (IscoCombiFlash - eluido con 10-50% de EtOAc en Hex) para proporcionar un aceite incoloro. Se aisló 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina en forma de un aceite transparente (702 mg, 2,233 mmol, 83% de rendimiento) en forma de un aceite transparente. RMN-1H (400 MHZ, CLOROFORMO-d)57,75 (dt, J= 4,9, 1,6 Hz, 1H), 7,33 (ddd, J = 10,0, 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,10 ddd, J=7.9, 4,9, 0,7 Hz, 1H), 4,30 - 4,16 (m, 2H), 3,95 - 3,83 (m, 2H), 3,80 - 3,61 (m, 10H), 3,38 (t, J= 5,1 Hz, 2H) RMN-13C (101 MHz, CLOROFORMO-d) d 142,3 , 137,7, 137,5, 123,4, 123,4, 121,7, 121,6, 77,3, 76,7, 70,9, 70,7, 70,6, 70,0, 69,4, 69,0, 50,619F RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5-83,55. EMAR (IEN) Teoría: C13H20FN4O4 m/z 315,464; 315,1463 encontrado.

Ejemplo 3: Preparación de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina

Se disolvió hidruro de sodio (0,121 g, 3,01 mmol) (60 % de suspensión en aceite) en DMF (7,0 ml) y la suspensión resultante se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente una solución de 2-nitropiridin-3-ol (0,384 g, 2,74 mmol) en DMF (1,5 ml), seguida de la adición gota a gota de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2(azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (1,023 g, 2,74 mmol) en DMF (1,5 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C durante 10 minutos, después se llevó a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de calentamiento a 60 °C durante un período de 72 horas. La reacción se detuvo con 10 ml de agua DI, seguido de extracción con acetato de etilo (3 x 10 ml). Los extractos de EtOAc reunidos se lavaron con una solución de salmuera concentrada (10 ml), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para proporcionar un aceite de color amarillo claro. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida con un cartucho de sílice de 24 g, 25 ml/min, a partir de acetato de etilo al 10 % en hexanos, seguido de un cambio lineal al acetato de etilo al 50 % en hexanos durante un período de 25 minutos. Después de este tiempo, el gradiente se mantuvo en esta composición de disolvente durante 10 minutos y después se cambió a acetato de etilo al 100% durante un período de 10 minutos. La 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina se eluyó entre la porción de 30-40 minutos del cromatograma y las fracciones reunidas se evaporaron a presión reducida, después al vacío durante 2 horas para proporcionar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina (687 mg, 1,973 mmol, 72,0 % de rendimiento) en forma de un aceite de color amarillo claro. RMN-1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 58,11 (dt, J = 4,9, 1,6 Hz, 1H), 7,60 (ddd, J = 10,0, 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,52 (ddd, J = 7,9, 4,9, 0,7 Hz, 1H), 4,30 - 4,16 (m, 2H), 3,95 - 3,83 (m, 2H), 3,80 - 3,61 (m, 10H), 3,38 (t, J = 5,1 Hz, 2H) RMN-13C (101 MHz, CLOROFORMO -d) d 147,3, 139,5, 128,4, 124,4, 71,1, 70,7, 70,6,70,0, 69,9, 69,3, 50,7. EMAR (IEN) Teoría: C13H20N506 m/z 342,1408; encontrado 342,1409.

Ejemplo 4: Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-bromopiridina

A la suspensión de hidruro de sodio (NaH, 25,7 mg, 0,643 mmol) en dimetilformamida (DMF, 5 ml) a 0 °C se le añadió gota a gota una solución de 2-bromopiridin-3-ol (112 mg, 0,643 mmol) en DMF (1 ml), seguida de la adición gota a gota de la solución de 4-(metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (200 mg, 0,536 mmol) en DMF (1 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C durante 10 minutos, después se llevó a temperatura ambiente y se mantuvo durante 1 hora, seguido de calentamiento a 60 °C durante 4 horas. Una vez completado el calentamiento, el disolvente de la mezcla de reacción en bruto se retiró al vacío. La reacción en bruto se reconstituyó en 50 ml de acetato de etilo, se lavó con 2 x 50 ml de una solución acuosa de salmuera y la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. La reacción en bruto se purificó usando HPLC de fase inversa para proporcionar 3-(2-(2-(2-(2(azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-bromopiridina, TFA (112 mg, 0,229 mmol, 42,7 % de rendimiento) en forma de un aceite de color amarillo claro. EMAR IEN m/z (M H), teoría C13H20BrN4O4 375,0664 encontrado 375,0662; RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) 57,97 (dd, J = 4,6, 1,5 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 8,2, 1,6 Hz, 1H), 7,40 (dd, J = 8,1, 4,6 Hz, 1H), 4,24 (dd, J = 5,3, 3,9 Hz, 2H), 3,85 - 3,78 (m, 2H), 3,68 - 3,62 (m, 2H), 3,62 - 3,52 (m, 8H), 3,42 - 3,34 (m, 2H).

Síntesis del compuesto de trimetilanilio

Una mezcla de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (160 mg, 0,509 mmol), carbonato de potasio (K²CO³, 84 mg, 0,611 mmol) y dimetilamina (40% en agua, 0,097 ml, 0,764 mmol) en dimetilsulfóxido (DMSO, 2,5 ml) se calentó en un recipiente sellado a prueba de presión a 110 °C durante 14 horas. Una vez completado el calentamiento, el disolvente de la mezcla de reacción en bruto se retiró al vacío. La reacción en bruto se reconstituyó en 50 ml de acetato de etilo, se lavó con 2 x 50 ml de una solución acuosa de salmuera y la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. La reacción en bruto se purificó usando cromatografía de fase normal para proporcionar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina (140 mg, 0,413 mmol), 81 % de rendimiento) en forma de un aceite incoloro. RMN-1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 57,86 (dd, J = 4,9, 1,5 Hz, 1H), 7,02 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1H), 6,73 (dd, J = 7,8, 4,9 Hz, 1H), 4,20 - 4,07 (m, 2H), 3,98 - 3,86 (m, 2H), 3,81 - 3,61 (m, 9H), 3,38 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,13 - 2,94 (m, 6H), 1,69 (s, 2H). EMAR (IEN) Teoría: C15H26N504 m/z 340,1980; encontrado 340,1979.

Ejemplo 6: Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-2-aminio

Se añadió trifluorometanosulfonato de metilo (0,065 ml, 0,589 mmol) a la solución de 3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina (40 mg, 0,118 mmol) en tolueno (1,5 ml) en un recipiente sellado en una corriente constante de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante un período de 14 horas. El disolvente se retiró y el residuo resultante se lavó con 2 x 10 ml de éter, se secó azeotrópicamente con 2 x 1 ml de diclorometano y se secó al vacío de alta presión durante la noche para proporcionar 3-(2-(2-(2-(2)-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, sal de trifluorometanosulfonato en rendimiento cuantitativo en forma de un aceite espeso incoloro.

CLEM m/z 354,33; RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) 58,24 - 8,17 (m, 1H), 7,98 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,75 (ddd, J = 8,2, 4,6, 3,2 Hz, 1H), 4,44 (s. a., 2H), 3,88 (d, J = 3,9 Hz, 2H), 3,69 - 3,45 (m, 21H).

Ejemplo 7: Síntesis de [ 18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina usando 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, sal de trifluorometanosulfonato

Se adquirió una solución acuosa de [18F]-Fluoruro (2,0 ml, 33,3 GBq/900 mCi) de P.E.T. Net® Pharmaceuticals en West Point PA y se transfirió directamente a un Sep-Pak light QMA [El cartucho Sep-Pak light QMA se acondicionó de forma secuencial con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada y 5 ml de MeCN antes de su uso]. Una vez completada esta transferencia, se liberó el fluoruro acuoso [18F] del QMA Sep-Pak mediante la adición secuencial de carbonato de potasio (15mg/ml; 0,1 ml) seguido de una mezcla de carbonato de potasio (30 mg/ml, 0,1 ml), 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano (15 mg, 0,04 mmol) y 1,2 ml de MeCN. El disolvente se evaporó en una suave corriente de nitrógeno a 90 °C y vacío. El secado azeotrópico se repitió dos veces con porciones de 1 ml de acetonitrilo para generar el complejo K.2.2.2/K[18F]F anhidro. 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, sal de trifluorometanosulfonato (2 mg, 5,6 ^mol) se disolvió en 500 microlitros de DMSO y se añadió al criptando seco. Esta solución se calentó a 120°C durante 10 minutos. Después de este tiempo, la mezcla de reacción en bruto se diluyó con 3 ml de agua DI. La totalidad del contenido de la mezcla de reacción en bruto se transfirió, se cargó y se purificó después usando HPLC de fase inversa en las siguientes condiciones: HPLC Columna: Luna C18250 x 10 disolvente A: 0,1 % de TFA en agua DI; disolvente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo a un caudal de 4,6 ml/minuto usando un método isocrático con un 32 % de B, mientras que la UV se controló a 280 nm. La [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se aisló en la marca de 24 minutos del cromatograma y se recolectó durante un período de 2 minutos. Este producto se recolectó en un matraz de 100 ml que contenía 10 ml de agua DI y todo el contenido se liberó a un paquete Sep-Pak Vac tC18 6 cc lg sep de Waters. 6,1 GBq/164 mCi de [18F]-3-(2-(2-(2-(2(azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se aisló de esta reacción. Esto se liberó del sep-pak usando 3 ml de etanol y esta solución se redujo con una fuente de calor de 98 °C, una corriente suave de nitrógeno y vacío durante un período de 15 minutos hasta que solo quedó una película en el vial. El producto final se reconstituyó en 100 % de tampón PBS 1x y fue estable en este medio durante más de 1 hora a 37 °C.

La [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se puede usar para generar productos marcados con 18F (por ejemplo, Péptidos macrocíclicos anti-PD-L1 marcado con 18F, como se describe a continuación) aprovechando la reacción de azida-alquino “clic” con los péptidos adecuados que contienen un alquino.

Ejemplo 8: Producción de péptido macrocíclico radiomarcado con 18F usando “Química Clic”

A. Fluoración del precursor de 4-PEG-tosil-azida para formar [18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina

Se adquirió una solución acuosa de [18F]-Fluoruro (2,0 ml, 29,6 GBq/800 mCi) de IBA en Towada y se envió al sitio de BMS Princeton NJ y esta muestra se transfirió dentro de nuestra síntesis a control remoto personalizada. Esta solución se administró a un Sep-Pak light QMA [El cartucho Sep-Pak light QMA se acondicionó de forma secuencial con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada y 5 ml de MeCN antes de su uso.] Una vez completada esta transferencia, el fluoruro acuoso [18F] se liberó del QMA Sep-Pak mediante la adición de una mezcla de carbonato de potasio (30 mg/ml en agua destilada (DI) (0,1 ml), 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-l,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano (15 mg, 0,04 mmol) y 1,4 ml de acetonitrilo. El disolvente se evaporó en una suave corriente de nitrógeno a 90 °C y vacío. El secado azeotrópico se repitió dos veces con porciones de 1 ml de acetonitrilo para generar el complejo K.2.2.2/K[18F]F anhidro. Una vez completado este proceso, el criptando se secó adicionalmente al vacío completo durante un período de 15 minutos. El proceso completo tomó 35 minutos para completarse.

A este [18F]/criptando sólido seco se le añadieron 0,5 ml de 2 mg de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina en DMSO y esta mezcla se calentó a 120 °C durante 10 minutos. Después de este tiempo, la mezcla de reacción en bruto se diluyó con 3 ml de agua destilada y todos los contenidos se transfirieron y cargaron en la siguiente columna de HPLC y condiciones: Columna de HPLC: Luna C18 250 x 10 mm; disolvente A: ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % en agua DI; disolvente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo; caudal de 4,6 ml/min; presión 12,55 MPa (1820 PSI); método isocrático 32% de B; UV - 280 nm. El producto [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina ([18F]-FPPEGA) se aisló en la marca de 24 minutos del cromatograma y se recogió durante un período de 2 minutos. Este producto se recogió en un matraz de 100 ml que contenía 15 ml de agua DI y todo el contenido se administró en un paquete Sep PakVac tC186 cc 1g sep (PN WAT036795). La [18F]-FPPEGA se administró del Sep Pak usando 2,5 ml de etanol y esta solución se redujo con N²a 98 °C y vacío durante un período de 15 minutos hasta que se secó. Este compuesto se disolvió en 0,1 ml de agua DI. Este producto se analizó usando una columna de HPLC, HPLC Varian Luna C18 (2) 4,6 x 150 mm. Disolvente A: TFA al 0,1 % en agua DI; disolvente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo; caudal 1,0 ml/min; método de gradiente 0 min 90 % de A 10 % de B; 15 minutos 30 % de A 70 % de B; 17 minutos 30 % de A 70 % de B; 18 minutos 90 % de A 10 % de B; 20 minutos 90 % de A 10 % de B; UV - 280 nm. Se aislaron 14,1 GBq (380 mCi) de [18F]-FPPEGA. Este producto se llevó a la siguiente reacción para completar la química “clic” con un alquino que contenía péptido macrocíclico de unión a PD-L1.

B. Acoplamiento de [18F]-FPPEGA a péptido macrocíclico

En la Figura (a) se muestra un esquema para sintetizar péptido macrocíclico radiomarcado con [18F]

Se disolvió ácido (S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44R,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oxoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(carboximetil))-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroxi-12-(4-hidroxibencil)-21,44-diisobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11, 14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradecaoxohexatetracontahidro-1H,5H-dipirrolo[2,1-g1:2',1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,31,34,37,40,43] tridecaazaciclopentatetracontina-18-carboxamido)acetamido)pent-4-inoico (0,75 mg, 0,378 mol) en 0,250 ml de agua DI y 0,25 ml de alcohol terc-butílico. A esta solución se le añadieron 0,250 ml de una solución de agua DI que contenía 1 mg de sulfato cúprico y 1 mg de ascorbato de sodio. Finalmente, se añadió la solución de 0,1 ml de 14,1 GBq (380 mCi) de [18f]-FPPEgA (preparada como se describe en la sección A) y la reacción se mezcló suavemente a temperatura ambiente durante 20 minutos. Al contenido de esta mezcla de reacción en bruto se le añadieron 0,5 ml de acetonitrilo seguido de 1,5 ml de agua DI y esta mezcla se purificó usando una columna de HPLC de fase inversa. Columna HPLC: Luna C18250 x 10 mm; disolvente A: ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % en agua DI; disolvente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo; caudal 4,6 ml/min; presión 12,55 MPa (1820 PSI); método isocrático 37 % de B; UV - 220 nm. El producto se aisló entre la marca de 27-31 minutos del cromatograma y se recogió durante un período de 4 minutos como se muestra en la figura (b). Se aislaron 2,5 GBq (67 mCi) de ácido [18F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oxoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(carboximetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroxi-12-(4-hidroxibencil)-21,44-diisobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradecaoxohexatetracontahidro-1H,5H-dipirrolo[2,1-g1:2'1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]tetradecaazaciclopentatetracontina-18-carboxamido)acetamido)-3-(l-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-l,2,3-triazol-4-il)propanoico. Esta solución se diluyó adicionalmente con 20 ml de agua DI y esta solución se transfirió a un sep-pak C-18 (Waters 50 mg, que se preactivó con 5 ml de etanol, seguido de 10 ml de agua DI) para retirar cualquier disolvente orgánico de la solución. Este sep-pak se lavó adicionalmente con 10 ml de agua estéril para inyección. Este producto se liberó del sep-pak con 0,5 ml de etanol, se filtró de forma estéril en un vial estéril y se diluyó a una solución de etanol al 5 % en volumen con solución salina para inyección. Este producto se analizó mediante HPLC de fase inversa como se muestra en la figura (b): identificación química con coinyección de patrón no radioactivo, pureza radioquímica y pureza química, actividad específica. El producto aislado coeluido con patrón de referencia no radiactivo, fue 100 % radioquímicamente y 95 % químicamente puro, con una actividad específica de 0,37 (10 mCi) GBq/nmol.

La HPLC de fase inversa analítica se realizó con los siguientes parámetros:

Zorbax SB-C18 columna de 250 x 4,6 mm; disolvente A: ácido fórmico al 0,05 % en agua DI; Disolvente B: 0,05 % en acetonitrilo; caudal de 1,0 ml/min; método de gradiente 30 % a 50 % de B durante 20 minutos; UV - 220 nm.

Figura (a)

Un esquema para sintetizar el péptido macrocíclico de unión a PD-L1 radiomarcado con [18F]

El ácido [18F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oxoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(carboximetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroxi-12-(4-hidroxibencil)-21,44-diisobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradecaoxohexatetracontahidro-1H,5H-dipirrolo[2,1-g1:2’1’-x][l]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43] tetradecaazaciclopentatetracontina-18-carboxamido)acetamido)-3-(l-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-l,2,3-triazol-4-il)propanoico puede usarse en diversas aplicaciones de imágenes in vitro y/o in vivo, incluyendo imágenes de diagnóstico, investigación básica y aplicaciones radioterapéuticas. Los ejemplos específicos de posibles aplicaciones diagnósticas y radioterapéuticas incluyen la determinación de la ubicación, la actividad relativa y/o la cuantificación de los tumores positivos para PD-L1, el radioinmunoensayo de los tumores positivos para PD-L1 y la autorradiografía para determinar la distribución de los tumores positivos para PD-L1 en un mamífero o un órgano o muestra de tejido del mismo.

En particular, el ácido [18F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oxoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(carboximetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroxi-12-(4-hidroxibencil)-21,44-diisobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradecaoxohexatetracontahidro-1H,5H-dipirrolo[2,1-g1:2’1’-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43] tetradecaazaciclopentatetracontina-18-carboxamido)acetamido)-3-(l-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-l,2,3-triazol-4-il)propanoico es útil para producir imágenes por tomografía por emisión de positrones (PET) de tumores positivos para PD-1L en el pulmón, el corazón, los riñones, el hígado y la piel y otros órganos humanos y animales experimentales. Las imágenes de PET utilizan el ácido [18F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS) -36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oxoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(carboximetil)1H-indol-3-il)metil)-40-hidroxi-12-(4-hidroxibencil)-21,44-diisobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradecaoxohexatetracontahidro-1H,5H-dipirrolo[2,1-g1:2’1’-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43] tetradecaazaciclopentatetracontina-18-carboxamido)acetamido)-3-(1-(2-(2-(2-(2(2-((2-fluoropiridin-3-il)oxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)propanoico puede usarse para obtener la siguiente información: relación entre el nivel de ocupación del tejido por los medicamentos candidatos para el tratamiento del tumor con PD-L1 y la eficacia clínica en los pacientes; selección de dosis para ensayos clínicos de medicamentos para el tratamiento del tumor con PD-L1 antes del inicio de estudios clínicos a largo plazo; potencias comparativas de medicamentos para el tratamiento del tumor con PD-L1 estructuralmente novedosos; investigar la influencia de los medicamentos para el tratamiento del tumor con PD-L1 en la afinidad y densidad del transportador in vivo durante el tratamiento de dianas clínicas con medicamentos para el tratamiento del tumor con PD-1; cambios en la densidad y distribución de los tumores positivos para PD-L1 durante el tratamiento eficaz e ineficaz.

Ejemplo 9: Preparación automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de acuerdo con el procedimiento general para la radiosíntesis de síntesis en la unidad de síntesis de GE TRACERlab FX2 N

Síntesis automatizada usando el módulo de síntesis comercial TRACERlab FX2 N (GE)

La síntesis automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se realizó usando un módulo de síntesis GE TRACERlab FX2 N de tipo no cassette. La configuración de la unidad de síntesis se resume en la Tabla (). La solución acuosa de [18F]-Fluoruro (2,0 ml, 29,6 GBq/800 mCi) se liberó a un Sep-Pak light QMA [El cartucho Sep-Pak light QMA se preacondicionó de forma secuencial con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada y 5 ml de acetonitrilo antes de su uso]. Una vez completada esta transferencia, el fluoruro acuoso [18F] se liberó del QMA Sep-Pak mediante la adición de la mezcla de elución (de “V1”) al reactor. El disolvente se evaporó en una corriente suave de nitrógeno y vacío. La solución de precursor (de “V3”) se añadió al residuo de criptando seco y esta mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 10 minutos. Después, se añadieron 4 ml de agua destilada (de “V4”) a la mezcla de reacción en bruto en el reactor y la mezcla se transfirió al circuito de inyección de muestra de 5 ml de la HPLC semipreparativa a través de un sensor de líquido que controla el final de la carga. La mezcla se carga en la columna de HPLC semipreparativa (Luna C18(2) 250x10 mm, Phenomenex). Una mezcla de acetonitrilo al 35 % en una solución acuosa de ácido trifioroacético al 0,1 % se vertió en la columna a una velocidad de 4,6 ml por minuto. El producto se recogió de esta columna de HPLC en el matraz de dilución que contenía 15 ml de agua destilada y todo su contenido se transfirió a un cartucho de extracción en fase sólida de 1 gramo C18. Se liberaron 352 mCi (13GBq) de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de este cartucho (de “V14”) con 3 ml de etanol y se puede usar para generar productos de péptido marcados con 18F aprovechando la reacción de azida-alquino “clic” con el péptido adecuado que contiene un alquino.

Tabla 1

Ejemplo 10: Preparación automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de acuerdo con el procedimiento general para la radiosíntesis de síntesis en la unidad de síntesis de IBA Synthera

Síntesis automatizada usando el módulo de síntesis comercial Synthera (IBA)

La síntesis automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se realizó usando un módulo de síntesis de Synthera IBA tipo casete y un kit procesador de fluidos integrador debidamente ensamblado. El kit del procesador de fluidos integrador (IFP, por sus siglas en inglés) se cargó con los precursores adecuados para esta síntesis y se resume en la Tabla (). La purificación se realizó en una unidad de HPLC Varian. El llenado del bucle de inyección de la HPLC se controló mediante una corriente constante de nitrógeno en la unidad de HPLC. La configuración de ambos automatismos se resume en la Tabla (). La solución acuosa de [18F]-Fluoruro (2,0 ml, 29,6 GBq/800 mCi) se suministró a un Sep-Pak light QMA [El cartucho Sep-Pak light QMA se acondicionó de forma secuencial con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada y 5 ml de acetonitrilo antes de su uso]. Una vez completada esta transferencia, el fluoruro [18F] acuoso se liberó del QMA Sep-Pak mediante la adición de la mezcla de elución (de “V1”) al reactor. El disolvente se evaporó en una suave corriente de nitrógeno y vacío. La solución de precursor (de “V2”) se añadió al residuo de criptando seco y esta mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 10 minutos. Después, se añadieron 3 ml de agua destilada (de “V4”) a la mezcla de reacción en bruto en el reactor y la mezcla se transfirió al circuito de inyección de muestra de 5 ml de la HPLC semipreparativa a través de un sensor de líquido que controla el final de la carga. La mezcla se carga en la columna de HPLC semipreparativa (Luna C18(2), 250x10 mm, Phenomenex). Una mezcla de acetonitrilo al 35% en una solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0,1 % se vertió en la columna a una velocidad de 4,6 ml por minuto. El producto se recogió de esta columna de HPLC en el matraz de dilución que contenía 15 ml de agua destilada y todo su contenido se transfirió a un cartucho de extracción en fase sólida de 1 gramo tC18. Se liberaron 325 mCi (12 GBq) de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de este cartucho con 3 ml de etanol y se pueden usar para generar productos de péptido marcados con 18F aprovechando la reacción de azida-alquino “clic” con el péptido adecuado que contiene un alquino.

Tabla 2

Ejemplo 11: Distinguir los tumores positivos para PD-L1 de los tumores negativos para PD-L1 con un agente de producción de imágenes péptido macrocíclico anti-PD-L1

Para la producción de imágenes por PET, las velocidades de depuración rápida de la sangre proporcionan una ventaja sobre los agentes de depuración más lenta, como los anticuerpos, minimizando la cantidad de tiempo necesario para que las señales de la sonda “de fondo” se agoten del tejido no relevante. En la clínica, los indicadores de ^pE^tbasados en anticuerpos de semivida larga en sangre pueden requerir varios días de inyección posterior a la espera antes de que se puedan recoger las imágenes. Las sondas de limpieza rápida abren la puerta a imágenes de alto contraste que se pueden recoger el mismo día en que se inyecta la sonda y, lo que es más importante, también pueden servir para reducir la exposición general a la radiación de los animales estudiados o los pacientes examinados.

En este experimento, el péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F] se produjo como se describe en los Ejemplos anteriores, se sometió a ensayo su capacidad para discriminar entre los tumores positivos para hPD-LI y los tumores negativos para hPD-L1 en ratones.

Se produjeron ratones con tumores de xenoinjerto bilaterales introduciendo 2xl06 células de carcinoma de pulmón humano hPD-L1(+)L2987 y 4xl06 de células de carcinoma de colon humano hPD-L1(-)HT-29 subcutáneamente en lados opuestos del ratón. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 300 mm3 (aproximadamente 2-3 semanas después del implante celular), se seleccionaron los animales para producir imágenes. El peso corporal y el tamaño del tumor de cada estudio se midieron y registraron el día de producción de imagen antes del procedimiento de producción de imagen. Los ratones se colocaron en una cámara de inducción anestésica y se administró anestesia por inhalación de isoflurano al 3 % en O²al 100 % a una velocidad de 1-1,5 l/min. Una vez sedados, los ratones se retiraron de la cámara de inducción y se colocaron en un alojamiento de plexiglás de 4 cámaras para ratones (personalizado por el grupo BMS-Applied Biotechnology), mientras seguían recibiendo 1-1,5 % de anestesia por inhalación de isoflurano y se suministraron en O²al 100 % a una velocidad de 2 l/min a través de la nariz-cono. Los animales se mantuvieron calientes usando una unidad de regulación de temperatura externa independiente (M2M Imaging Corp) para prevenir la hipotermia durante la producción de imágenes. La respiración del ratón se vigiló continuamente durante los procedimientos de producción de imagen y el isoflurano se puede ajustar dependiendo de la profundidad de la anestesia. Los ratones se colocaron en un soporte personalizado para animales con capacidad para 4 animales, en donde permanecieron bajo anestesia durante la duración del estudio. El soporte para animales se transfirió al escáner microPET® F120™ (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN). El campo de visión axial de este instrumento es de 7,6 cm. Con esta limitación, los animales se colocaron de tal manera que la región de exploración estaba desde inmediatamente delante de los ojos hasta aproximadamente la base de la cola. Se obtuvo una imagen de transmisión de 10 minutos por primera vez usando una fuente de punto 57Co con el fin de corregir la atenuación de las imágenes PET finales. Después del escaneo de la transmisión, se administraron soluciones de radioindicador a través de los catéteres de vena de la cola previamente instalados y se adquirió una imagen de emisión de 2 horas. Las soluciones de radioindicador inyectadas se inyectaron en un total de 8 ratones (peso corporal: 22,2 ± 2,0 gramos) con volúmenes tumorales 203,0 ± 51,4 mm3 para HT-29 y 422,9 ± 128,4 mm3 para L2987 se tomaron imágenes 16-17 días después de la implantación celular. Cada ratón recibió una inyección individual de una dosis SC de 60 mg/kg de péptido macrocíclico de unión a PD-L1 (N = 4) o solución salina (N = 4) 30 minutos antes del péptido macrocíclico PD-L1 marcado con [18F] (124,0 ± 8,4 pCi, masa de indicador: 1,0 ± 0,4 pg/kg) inyección IV. Las imágenes se reconstruyeron usando un algoritmo máximum a posteriori (MAP, por sus siglas en inglés) con corrección de atenuación usando las imágenes de transmisión recogidas y corregidas para la desintegración del radioisótopo. En las imágenes finales, las regiones de interés (ROI) se trazaron alrededor del límite del tumor usando el software ASIPro (Siemens Preclinical Solutions). Se calcularon curvas de tiempo-actividad para cada ROI para obtener una vista cuantitativa del radioindicador dentro del volumen del tumor en el transcurso de la imagen de emisión de 2 horas. Para la comparación final, las curvas de tiempo-actividad individuales se normalizaron en función de la dosis de radioindicador inyectada para cada animal específico. La absorción de radioindicadores se comparó entre los tumores usando los 10 minutos finales de cada curva de tiempo-actividad (90 100 minutos después de la inyección del radioindicador). Usando esta metodología, la absorción del radioindicador en los xenoinjertos hPD-L1(+)L2987 fue de 8,1 x aquellos xenoinjertos de hPD-L1(-)HT-29 en animales que reciben solo el radioindicador de péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F]. En animales que recibieron dosis SC de 60 mg/kg de péptido macrocíclico de unión a PD-L1 30 minutos antes de la inyección del radioindicador. La absorción en los xenoinjertos hPD-L1(+)L2987 fue solo de 0,7 x aquellos observados en los xenoinjertos hPD-L1(-)HT-(Figura 1, Figura 2 y Tabla 3).

Tabla 3: Los valores de absorción estándar (SUV) en los tumores HT-29 y L2987 derivados de las Imágenes PET n l E m l 11

(continuación)

Estos resultados proporcionan una visualización directa de la diferenciación de los tumores de xenoinjerto hPD-L1(+) frente a hPD-L1(-) in vivo. La especificidad se demostró además predisponiendo 60 mg/kg de péptido macrocíclico de unión a PD-L1 30 minutos antes de la inyección del radioindicador, lo que dio como resultado una reducción de la absorción del radioindicador en los tumores con hPD-L1(+) al nivel de los xenoinjertos de hPD-L1(-). Esto valida además el uso de péptidos macrocíclicos PD-L1 para la visualización de la expresión del tejido PD-L1 usando imágenes de PET.

Ejemplo 12: Producción de imágenes de PET en primates no humanos con un agente de producción de imágenes de péptidos macrocíclicos anti-PD-L1

Los agentes de producción de imágenes basados en millamoléculas anti-PD-L1 también mostraron resultados similares cuando se realizaron en macacos cangrejeros. En estos estudios, el péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F], producido como se describe en los Ejemplos anteriores, se probó por su capacidad para producir imágenes de alto contraste en macacos cangrejeros. Los péptidos macrocíclicos anti-PD-L1 descritos en el presente documento mantienen una alta afinidad por el PD-L1 de macaco cangrejero (pero tienen una baja afinidad por el PD-L1 de roedor). Además, como los macacos cangrejeros no contienen tumores con PD-L1(+) como en los modelos de ratón, el rendimiento de la imagen se evaluó principalmente en los niveles de origen medidos en las imágenes en el contexto de la expresión de PD-L1 endógena (con un origen bajo que permite el potencial de detección de alta sensibilidad de tejidos PD-L1(+). En estos estudios, los niveles de origen en las imágenes de PET resultantes fueron muy bajos, con una notable acumulación de radioindicadores que se observó principalmente en los riñones, el bazo y la vejiga.

Se anestesiaron macacos cangrejeros machos con un puerto de acceso vascular (VAP, por sus siglas en inglés) previamente instalado con 0,02 mg/kg de atropina, 5 mg/kg de telazol y 0,01 mg/kg de buprenorfina I.M. (todo ellos en una sola jeringa). Un catéter i.v. después se coloca en el vaso cefálico para la administración de líquidos durante el procedimiento de producción de imagen para mantener la hidratación. Los animales se intubaron con un tubo endotraqueal, generalmente de 3,0 mm y se transfirieron al lecho de imágenes de un instrumento de PET microPET® F220™ (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN). La anestesia se mantuvo con isoflurano y oxígeno y fluidos I.V. (LRS) se administraron a una velocidad de 6 ml/kg/h durante el procedimiento de producción de imágenes. Como el campo de visión axial del instrumento microPET® F220™ es de solamente 7,6 cm, se obtuvieron imágenes en más de 5 posiciones distintas de lecho para crear una imagen compuesta de los animales desde arriba del corazón hasta aproximadamente la pelvis.

Para cada campo de visión, se adquirió por primera vez una imagen de transmisión de 10 minutos usando una fuente de punto de 57Co con el fin de corregir la atenuación de las imágenes PET finales. Una vez que se obtuvieron imágenes de transmisión para todas las posiciones del lecho, aproximadamente 1,7 mCi (aproximadamente 0,12 g/kg) del radioindicador de péptido macrocíclico de PD-L1 marcado con [18F] se administró a través del VAP instalado. Después se obtuvieron secuencialmente exploraciones de emisión de 5 minutos para cada posición del lecho, comenzando en la posición 1 centrada aproximadamente en el corazón y moviéndose hacia la pelvis del animal. Una vez que se obtuvieron las imágenes en cada posición (1 a 5), el lecho de imagen se volvió a colocar en la posición 1 y el proceso se repitió. Con este procedimiento, se obtuvieron un total de 5 imágenes distintas para cada posición del lecho durante la duración del estudio de imagen.

Las imágenes individuales se reconstruyeron usando un algoritmo de proyección de retroproyección filtrada (FBP, por sus siglas en inglés) con corrección de atenuación usando las imágenes de transmisión recogidas y corregidas para la desintegración del radioisótopo. Las imágenes compuestas finales se produjeron alineando imágenes de las 5 posiciones de lecho obtenidas de una sola pasada (es decir, se produjo una imagen compuesta única de cada conjunto de imágenes secuenciales de las posiciones de lecho 1 a 5) que cubren la duración del estudio de imagen. Las imágenes finales se inspeccionaron visualmente para observar áreas de absorción del radioindicador visibles (es decir, bazo, hígado, riñón) y tejido de origen (músculo) (Figura 3). La acumulación de origen del radioindicador de péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F] fue muy baja, con poca señal visible en los tejidos de origen, como el músculo. Además, se verificó la absorción en el bazo, que es PD-L1 (+) basada en la inmunohistoquímica y la expresión de ARNm. Por lo tanto, los estudios en macacos cangrejeros demuestran el potencial para la producción de imágenes de alta sensibilidad PD-L1 en el contexto de PD-L1 endógeno. Para determinar la naturaleza de la unión específica en el bazo del macaco cangrejero, se realizó un estudio de bloqueo de la siguiente manera.

El macaco cangrejero (4,4 kg, macho) recibió una única inyección IV de radioindicador de péptido PD-L1 marcado con [18F] con macrocíclico (~1,7 mCi, masa: 0,21 pg/kg) al inicio del estudio. Al día siguiente (después de la dosis), el mismo NHP recibió una única dosis SC de 2 mg/kg de péptido macrocíclico de unión a anti-PD-LI 2 horas antes de la inyección del radioindicador (~1,7 mCi, masa: 0,12 pg/kg). La absorción de indicador en diversos órganos se enumera en la Tabla 4. Las imágenes de PET representativas del inicio del estudio y después de la dosis se representan en la Figura 3. Las concentraciones de plasma del péptido macrocíclico de unión anti-PD-1 se midieron en 0, 10, 30, 60, 90 minutos después de la inyección del radioindicador en cada día de producción de imágenes (Tabla 4). Se observó una señal de unión específica dentro del bazo del primate no humano con el 93% de la absorción de indicador se bloqueó con 2 mg/kg de un péptido macrocíclico de unión a PD-L1 específico.

Los estudios de PET en roedores y macacos cangrejeros muestran que el péptido macrocíclico PD-L1 anti-humano marcado con 18F proporciona sondas fuertes y específicas para el marcado in vivo de tejidos positivos para PD-L1 con el potencial para la detección de tejidos de alta sensibilidad con expresión de PD-L1 de bajo nivel.

Los experimentos de producción de imágenes in vivo también se realizaron con un anticuerpo anti-PD-LI y las áreas que detectó este agente de producción de imágenes fueron las mismas áreas que se detectaron con el agente de producción de imágenes de PD-L1, lo que confirma que los agentes de producción de imágenes de millamoléculas anti-PD-L1 detectan con éxito células positivas para PD-L1 in vivo.

Tabla 4. Indicador SUV en cada órgano en el inicio del estudio y después de la dosis con 2 mg/kg de péptido macrocíclico de unión a PD-L1.

Ejemplo 13: Autorradiografía in vitro con radioindicador de péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F]

Se incluyeron tejidos de tumor de pulmón humano en OCT y se enfriaron en 2-metilbutano durante 2 a 5 minutos hasta que se congelaron. Las muestras se almacenaron en un congelador a -80 °C hasta su uso. También se incluyeron tejidos de xenoinjerto humano en el ensayo. Los ratones que portan xenoinjertos bilaterales se produjeron mediante la introducción de 2xl06 células de carcinoma de pulmón humano hPD-L1(+)L2987 y 4x106 células de carcinoma de colon humano hPD-Ll(-)HT-29 subcutáneamente en lados opuestos del ratón. Una vez que los tumores de xenoinjerto resultantes alcanzaron el tamaño adecuado (aprox. 200-300 mm3), los ratones se anestesiaron con isoflurano al 2 % y se sacrificaron mediante dislocación cervical. Se extirparon tejidos tumorales frescos, se sumergieron en OCT y se enfriaron en 2-metilbutano durante 2 a 5 minutos hasta que se congelaron. Los tejidos se envolvieron después en una bolsa de aluminio/ZIPLOC® y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para todos los tejidos (tumor de pulmón humano y xenoinjertos), se cortaron secciones de 5 pm de espesor (recogidas como 2 secciones/portaobjetos) usando un criostato, se montaron en descongelación en portaobjetos de microscopio y se dejaron secar al aire durante aproximadamente 30 minutos. Estudios de bloqueo con péptido frío (sin marcar) a 0,1 nM, 1 nM y 10 nM respectivamente. Los portaobjetos individuales, 1 portaobjetos por concentración, se transfirieron a cámaras de incubación de portaobjetos de vidrio para la incubación. Por separado, una solución concentrada de 0,25 nM de ácido [18F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-andno-2-oxoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(carboximetil)1H-indol-3-il)metil)-40-hidroxi-12-(4-hidroxibencil)-21,44-diisobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradecaoxohexatetracontahidro-1H,5H-dipirrolo[2,1-g1:2T-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43] tetradecaazaciclopentatetracontina-18-carboxamido)acetamido)-3-(1-(2-(2)(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)propanoico se produjo diluyendo 10,6 pl de la solución concentrada de radioligando original (7064 nM en el momento del experimento) con 300 ml de Tween 80. A partir de esta solución concentrada, se añadieron 40 ml a cada cámara de incubación. Una de estas cámaras contenía solo la solución tampón de radioligando, que se denomina la sección de unión total. Otras cámaras de incubación recibieron 40 ml de esta solución concentrada junto con la concentración relevante del compuesto de bloqueo (péptido no marcado en 0,1 nM, 1 nM o 10 nM). Los portaobjetos se incubaron en las soluciones amortiguadoras individuales durante 1 hora a temperatura ambiente para alcanzar la máxima unión. Después de la incubación, se retiraron los portaobjetos de cada grupo de tratamiento de las soluciones de incubación y se colocaron en un tampón de lavado helado (Tween 80) durante 3 minutos y se aclararon 4 veces por separado. Los portaobjetos se secaron después en una corriente de aire frío durante aproximadamente 30 minutos. Los portaobjetos secados al aire se expusieron colocando los portaobjetos en una placa de imagen (BAS-SR 3545S) durante la noche a temperatura ambiente. La placa de imágenes se escaneó usando el analizador de bioimagen (Fujifilm Fluorescent Image Analyzer, FLA-9000). El tamaño de píxel de las imágenes del autorradiograma fue de 100 pm. El análisis de la imagen se realizó usando el software Multi-Gauge. Las regiones de interés (ROI) se trazaron para rodear todo el tejido tumoral en todos los grupos de estudio. Las señales de autorradiografía de la radioactividad asociada al tejido se cuantificaron a partir de estas ROI. El desplazamiento aparente del radioindicador del péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F] cuando se comparó con las secciones de unión total se determinó para 3 concentraciones diferentes (0,1 nM, 1 nM y 10 nM) de péptido no marcado tanto en las secciones de tumores de pulmón humano como en las secciones de xenoinjerto humano. Se observó un desplazamiento dependiente de la dosis del radioindicador del péptido PD-L1 macrocíclico marcado con [18F] en todas las secciones de tejido con la adición de péptido no marcado (Figura 4). Se sometieron secciones de tejido en serie de 5 pm de cada tejido a un procedimiento inmunohistoquímico anti-Human-PD-L1 para verificar el nivel de expresión del antígeno PD-L1 en las muestras confirmaron la expresión de PD-L1 en muestras de pulmón humano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula (1):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde x es un número entero de 1 a 8 y R es un grupo alquilo C¹-C⁶.

2. Un compuesto de la reivindicación 1 de fórmula (II):

3. Un compuesto de fórmula (III):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4. Un compuesto de fórmula (IV):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde x es un número entero de 1 a 8.

5. Un compuesto de la reivindicación 4 de fórmula (V):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el diagnóstico de una enfermedad.

7. El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cánceres sólidos, cánceres hematopoyéticos, cánceres hemáticos, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares e infecciones patógenas.

8. Un método para obtener una imagen de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el método:

a) administrar el compuesto a un sujeto; y

b) producir imágenes in vivo de la distribución del compuesto mediante tomografía por emisión de positrones (PET).

9. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la obtención de una imagen, comprendiendo dicho uso:

a) administrar el compuesto a un sujeto; y

b) producir imágenes in vivo de la distribución del compuesto mediante tomografía por emisión de positrones (PET), en donde la distribución de la que se produjeron imágenes es indicativa de la presencia o la ausencia de una enfermedad.

10. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la vigilancia del progreso de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo dicho uso:

(a) administrar a un sujeto que lo necesite el compuesto que se une a una molécula diana asociada a la presencia de la enfermedad en un primer punto temporal y obtener una imagen de por lo menos una porción del sujeto para determinar la cantidad de las células o el tejido enfermos; y

(b) administrar al sujeto el compuesto en uno o más puntos temporales posteriores y obtener una imagen de por lo menos una porción del sujeto en cada punto temporal; en donde la dimensión y la localización de las células o del tejido enfermos en cada punto temporal es indicativa del progreso de la enfermedad.

11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 a 5 para su uso en la cuantificación de células o tejidos enfermos en un sujeto, comprendiendo dicho uso:

(a) administrar a un sujeto que tiene células o tejidos enfermos el compuesto que se une a una molécula diana localizada con las células o tejidos enfermos; y

(b) detectar emisiones radiactivas del 18F en las células o el tejido enfermos,

en donde el nivel y la distribución de las emisiones radiactivas en las células o los tejidos enfermos es una medida cuantitativa de las células o los tejidos enfermos.

12. Un método para obtener una imagen cuantitativa de tejidos o células que expresan PD-L1, comprendiendo el método poner en contacto las células o el tejido con un compuesto de la reivindicación 1 que se une a PD-L1, y detectar o cuantificar el tejido que expresa PD-L1 usando tomografía por emisión de positrones (PET).

13. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.