ES2893303T3 - Tetrahidrofolatos marcados con 18F isoméricamente puros - Google Patents

Abstract

Un compuesto de formula Ia o Ib para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento **(Ver fórmula)** donde R1, R2 son independientemente entre sí H o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, y R3, R4 son independientemente entre sí H, formilo o metilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Tetrahidrofolatos marcados con 18F isoméricamente puros

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de radiofármacos de (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, en el diagnóstico de una célula o población de células que expresan un receptor de folato y el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y su tratamiento.

Antecedentes de la técnica

El reconocimiento específico de receptores para la administración de restos efectores como agentes diagnósticos o terapéuticos es un campo en el que se ha investigado ampliamente, lo que ha llevado al desarrollo de aplicaciones médicas diagnósticas y/o terapéuticas no invasivas. En especial, en el campo de los procedimientos y tratamientos de medicina nuclear, en los que se emplean materiales radiactivos que emiten radiaciones electromagnéticas como rayos y o radiación de emisión de partículas, es necesaria la localización selectiva de estos materiales radiactivos en células o tejidos diana para conseguir bien una alta intensidad de señal para la visualización de tejidos específicos, evaluar una enfermedad y/o controlar los efectos de los tratamientos, o bien una dosis de radiación elevada, para administrar dosis adecuadas de radiación ionizante a una localización específica de la enfermedad, sin el riesgo de lesiones por radiación/radiotoxicidad en otros tejidos, por ejemplo, tejidos sanos. Por tanto, es de crucial interés determinar y evaluar las estructuras específicas de células y, en particular, las estructuras que están presentes en caso de cáncer (es decir, tumores) o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, como receptores, antígenos, haptenos y similares que pueden ser dianas específicas de los respectivos vehículos biológicos.

En las últimas dos décadas, se ha investigado la capacidad de un gran número de radiofármacos a base de ácido fólico para la adquisición de imágenes de tejidos tumorales positivos para el receptor de folato (FR) (Low, P. S., Henne, W. y Doorneweerd, D. [2008] Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Acc. Chem. Res. 41, 120-129; Philip Stewart Low, S. A. K. [2009] Folate-targeted therapeutic and imaging agents for cancer. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 256-262; Müller, C. [2013] Folate-Based Radiotracers for PET Imaging - Update and Perspectives. Molecules 18, 5005-5031, y Müller, Folate based radiopharmaceuticals for imaging and therapy of cancer and inflammation., C. Curr Pharm Des. 2012;18(8):1058-83). El receptor FR-a representa una diana óptima para la adquisición de imágenes tumorales, puesto que se sobreexpresa en diferentes tipos de cáncer epitelial, como el cáncer de ovario, útero, riñón, mama, pulmón y colorrectal, pero su expresión es solo limitada en tejidos sanos, como el riñón, plexo coroideo, glándulas salivales, pulmón y placenta (Parker, N., Turk, M. J., Westrick, E., Lewis, J. D., Low, P. S. y Leamon, C. P. [2005] Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Anal. Biochem. 338, 284-293.) Los radiotrazadores a base de ácido fólico tienen el inconveniente de que se acumulan en los riñones y otros tejidos positivos para FR debido a su elevada afinidad de unión a FR-a (IC⁵⁰ = ~1 nM) (Müller, C. [2013] Folate-Based Radiotracers for PET Imaging - Update and Perspectives. Molecules 18, 5005-5031.) Asimismo, estos radiotrazadores a base de ácido fólico también se unen a la isoforma FR-p, que está regulada por incremento en macrófagos activados implicados en la inflamación, con una afinidad alta similar (Nakashima-Matsushita, N., Homma, T., Yu, S., Matsuda, T., Sunahara, N., Nakamura, T., Tsukano, M., Ratnam, M. y Matsuyama, T. [1999] Selective expression of folate receptor p and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 42, 1609-1616; Paulos, C. M., Turk, M. J., Breur, G. J. y Low, P. S. [2004] Folate receptormediated targeting of therapeutic and imaging agents to activated macrophages in rheumatoid arthritis. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 1205-1217). Esta falta de selectividad puede dar lugar a resultados falso positivos de diagnóstico de cáncer o estudios de seguimiento. Por tanto, un radiofármaco selectivo a base de folato sería de gran importancia e interés para reducir o incluso evitar resultados erróneos.

No obstante, hasta ahora, se ha marcado con radioactividad un número limitado de folatos reducidos para estudios de imagen. Vaitilingam y cols. describieron un derivado 5,10-dimetiltetrahidrofolato (DMTHF) que se marcó con 99mTc, aunque no se proporcionó información sobre la relación diastereomérica del derivado DMTHF (Vaitilingam, B., Chelvam, V., Kularatne, S. a., Poh, S., Ayala-Lopez, W. y Low, P. S. [2012] A Folate Receptor-a-Specific Ligand That Targets Cancer Tissue and Not Sites of Inflammation. J. Nucl. Med. 53, 1127-1134.) Los autores publicaron un valor de K^d de 38 nM, que era cuatro veces superior en comparación con la correspondiente forma oxidada (EC20, K^d = 12 nM). La selectividad por FR-a sobre FR-p se demostró en experimentos in vitro e in vivo en un modelo animal de inflamación y en un tumor positivo para FR-a. Aparte del derivado DMTHF, Saaed y cols. publicaron en Nuclear Medicine and Biology 39(5):697-701, enero 2012 otro radiotrazador de folato reducido marcado con carbono 11, aunque no se han publicado resultados de experimentos in vitro o in vivo. Al igual que Vaitlingam y colaboradores, no se proporcionó ninguna información sobre la relación diastereomérica del producto radiomarcado. Un trazador para PET a base de folato marcado con flúor 18 que reconozca selectivamente el FR-a asociado a tumor y no FR-p en zonas inflamatorias que contienen FR-p sería de gran interés para proporcionar sensibilidad y especificidad significativas.

Wang y cois. publicaron en Biochemical Pharmacology, Vol. 44. N.° 9, pág. 1898-1901, 1992, una diferencia de 4 veces en las afinidades de unión del 5-metil-(6R)- con respecto a -(6S)-THF.

Betzel y cols. publicaron recientemente un prometedor derivado del ácido fólico marcado con flúor 18 denominado ácido 3'-aza-2'-[18F]fluorofólico para la adquisición de imágenes de tejido tumoral positivo para FR (Betzel, T., Müller, C., Groehn, V., Müller, A., Reber, J., Fischer, C. R., Kramer, S. D., Schibli, R. y Ametamey, S. M. [2013] Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3'-Aza-2'-[18F]fluorofolic Acid: A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting. Bioconjug. Chem. 24, 205-214.)

Aún más, aunque los radiofármacos de folato 18F conocidos muestran resultados prometedores, siguen siendo necesarios compuestos que muestren alta especificidad por FR y sean adecuados para aplicaciones clínicas de rutina y aún pueden obtenerse de manera eficaz y versátil con altos rendimientos radioquímicos.

Los solicitantes han encontrado que se puede logar una alta especificidad por tejido positivo para FR-alfa con derivados de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, como la forma (6R) del 3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-metiltetrahidrofolato.

Los derivados de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro como 3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-metiltetrahidrofolato, que es un derivado del folato fisiológico reducido, se unen al FR con alta afinidad y muestran una selectividad 50 veces mayor por FR-alfa que el correspondiente derivado de ácido fólico oxidado. Un trazador para PET que reconozca selectivamente el FR-a asociado a tumor y no FR-p en zonas inflamatorias que contienen FR-p proporcionaría sensibilidad y especificidad significativas. Habiendo deducido de la imagen de un trazador para PET inespecífico lo que corresponde a un trazador para PET que reconoce específicamente FR-alfa, se podría obtener información sobre zonas inflamatorias que contengan FR-beta.

Por tanto, la presente invención se refiere al uso de radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere en un primer aspecto al uso de radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y su tratamiento.

Preferiblemente, los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, están en su forma (6S) o (6R) isoméricamente pura.

Incluso más preferiblemente, los radiofármacos (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcados con 18F isoméricamente puros, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, son un 5-metil-(6S)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro o un 5-metil-(6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F.

En realizaciones específicas, el radiofármaco de (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en el que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, es un 3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-metil-(6S)-tetrahidrofolato isoméricamente puro o un 3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-metil-(6R)-tetrahidrofolato isoméricamente puro.

En una realización específica, se proporciona un compuesto de formula la o Ib para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento

Ib

donde

Ri, R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, y

R³ , R⁴ son independientemente entre sí H, formilo o metilo,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización preferida R¹ y R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, y R³ es metilo, y R⁴ es H.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto que tiene la formula IIa o 11 b para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento

IIa

11 b

donde

Ri, R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C12,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto que tiene la formula IIIa o IIIb para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento

IIIb

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En realizaciones específicas, el radiofármaco de (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en el que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, se dirige a sales alcalinas o de metales alcalinotérreos, preferiblemente, sales de sodio, potasio, magnesio o calcio. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de radiofármacos de (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F (o composiciones farmacéuticas de los mismos) en el diagnóstico o tratamiento, preferiblemente del cáncer o enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias.

En realizaciones específicas, la presente invención se refiere al uso de radiofármacos de (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F (o composiciones farmacéuticas de los mismos) en el seguimiento del tratamiento del cáncer o enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias en un sujeto que comprende los pasos de (i) administrar a un sujeto que lo necesita radiofármacos de (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F en una cantidad para el diagnóstico por imagen en combinación con un principio terapéuticamente activo, y (ii) realizar el diagnóstico por imagen con PET mediante la detección de una señal procedente de dicho al menos un compuesto para seguir el curso del tratamiento para el cáncer o enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias.

Incluso en un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de radiofármacos de (6S) o (6R)-tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F (o composiciones farmacéuticas de los mismos) en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato.

Figuras

Figura 1: Cromatogramas de HPLC quiral del precursor W2-acetil-3'-aza-2'-cloro-5-metiltetrahidrofolato-di-fercbutiléster 6S-2 y 6R-2 (A) y del compuesto de referencia protegido W2-acetil-3'-aza-2'-fluoro-5-metiltetrahidrofolatodi-ferc-butiléster 6S-2 y 6R-2 (B).

Figura 2: Espectros de DC de 6S- y 6R-5-MTHF (A) y 6R-1 y 6S-1 (B) midiendo desde 400 nm a 200 nm.

Figura 3: Solapamiento de los espectros de DC de 6S-5-MTHF y 6S-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHF (A) y 6R-5-MTHF y 6R-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHF (B).

Figura 4: Cromatogramas de radio-UPLC del radiotrazador de referencia 6S/6R-[18F]1 (A), muestra de hígado (B), plasma sanguíneo (C) y muestra de orina (D) 60 min después de la inyección de 6S/6R-[18F]1. El tiempo de retención se indica sobre del pico.

Figura 5: Acumulación de radioactividad de 6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (A) y 6S-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (B) en algunos tejidos seleccionados a los 30, 60 y 90 min p.i.

Figura 6: Comparación de las relaciones tumor-riñón (A), tumor-sangre (B) y tumor-hígado (C) de 6R-[18F]1 y 6S-[18F]1.

Figura 7: Perfil de distribución tisular 30, 60 y 90 min después de la inyección de 18F-6R-5Me-AzaTHF.

Figura 8: Perfil de distribución tisular 30, 60 y 90 min después de la inyección de 18F-6S-5Me-AzaTHF.

Figura 9: Comparación de los perfiles de distribución tisular de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

Figura 10: Comparación de las relaciones tumor-sangre de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

Figura 11: Comparación de las relaciones tumor-hígado de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

Figura 12: Comparación de las relaciones tumor-riñón de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

Figura 13: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1,2 y 3 h después de la inyección de 18F-6R-Aza-5MeTHF. (Tu = xenoinjertos de tumor, Hi = hígado, Ri = riñón, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 14: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1,2 y 3 h después de la inyección de 18F-6R-Aza-5MeTHF. (Tu = xenoinjertos de tumor, Hi = hígado, Ri = riñón, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 15: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1,2 y 3 h después de la inyección de ácido fólico en exceso antes de 18F-6R-Aza-5MeTHF. (Hi = hígado, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 16: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1,2 y 3 h después de la inyección de 18F-6S-Aza-5MeTHF. (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

Figura 17: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1,2 y 3 h después de la inyección de 18F-6S-Aza-5MeTHF. (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

Figura 18: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1,2 y 3 h después de la inyección de ácido fólico en exceso antes de 18F-6S-Aza-5MeTHF. (Vj = vejiga, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 19: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor IGROV-1 (línea celular de carcinoma de ovario humano) 1 h después de la inyección de 18F-AzaFol, 18F-5Me-6S-Aza-THF y 18F-5Me-6R-Aza-THF (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

Figura 20: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor IGROV-1 (línea celular de carcinoma de ovario humano) 2 h después de la inyección de 18F-AzaFol, 18F-5Me-6S-Aza-THF y 18F-5Me-6R-Aza-THF (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

Figura 21: Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor IGROV-1 (línea celular de carcinoma de ovario humano) 3 h después de la inyección de 18F-AzaFol, 18F-5Me-6S-Aza-THF y 18F-5Me-6R-Aza-THF (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

Figura 22: Captación e internalización de 6R-[18F]1 (A) o 6S-[18F]1 (B) con células KB positivas para FR incubando a 37 °C durante 1,2 o 3 h. Los estudios de bloqueo se realizaron usando un exceso de ácido fólico.

Figura 23: Captación e internalización total de 18F-AzaFol utilizando las líneas celulares RT16 (FR-a) y D4 (FR-p).

Figura 24: Captación e internalización total de 6R-3-aza-2-18F-5-MTHF utilizando las líneas celulares RT16 (FR-a) y D4 (FR-p).

Figura 25: Captación e internalización total de 6S-3-aza-2-18F-5-MTHF utilizando las líneas celulares RT16 (FR-a) y D4 (FR-p).

Figura 26: Estructura y denominación estereoquímica de 18F-folatos reducidos e isómeros no fluorinados.

Descripción detallada

La presente invención se refiere en un primer aspecto al uso de radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y su tratamiento.

El término «tetrahidrofolato» o «tetrahidrofolatos» como se usan en este documento, comprende compuestos basados en la estructura del ácido 5,6,7,8-tetrahidrofólico. Los tetrahidrofolatos (abreviado THF) como 5-metil-THF se distinguen de sus formas oxidadas, como el ácido fólico, por el centro quiral adicional en C6, lo que conduce a las formas isoméricas (6S) y (6R). El carbono □ del resto ácido glutámico está tanto en el ácido fólico como en los tetra­ hidrofolatos como se define en este documento en la configuración natural. Los compuestos para su uso según la presente invención están preferiblemente en una forma isoméricamente pura.

Los tetrahidrofolatos como se usan en este documento comprenden la forma ácida del tetrahidrofolato y también las correspondientes formas éster.

Los términos «isoméricamente puro» o «estereoisoméricamente puro», como se usan en este documento, significan que el compuesto de la invención tiene un exceso isomérico de una forma respecto a la otra forma [forma (6R) respecto a la forma (6S) o forma (6S) respecto a la forma (6R)] superior a aproximadamente el 80 %, preferiblemente superior a aproximadamente el 90 %, preferiblemente superior a aproximadamente el 95 %, más preferiblemente superior a aproximadamente el 97 %, incluso más preferiblemente superior a aproximadamente el 99 % o más, y lo más preferiblemente hasta el 100 %, en donde el resto puede ser uno o más de los otros isómeros.

En una realización específica, se proporcionan radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F de fórmula general la o Ib, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento

Ib

Donde Ri, R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, y R³ , R⁴ son independientemente entre sí H, formilo o metilo.

El término «alquilo», cuando se utiliza de manera individual o en combinación, se refiere a grupos alquilo lineales o ramificados que contienen el número indicado de átomos de C, conteniendo típicamente de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono, como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser sales alcalinas o de metales alcalinotérreos, preferiblemente sales de sodio, potasio, magnesio o calcio, o pueden ser también sales ácidas, como sales de sulfato o sulfonato, preferiblemente sales de sulfato.

Por tanto, en realizaciones específicas, la presente invención se refiere a compuestos de formula IIa o IIb, o a una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento,

IIa

11 b

donde Ri, R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C12.

Incluso más específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto de formula IIIa o IIIb, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo, o para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento

IIIb

Se encontró que los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, muestran sorprendentemente afinidades de unión comparables al FR.

Incluso más sorprendentemente, se encontró que los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, muestran una biodistribución diferente. Esto es muy sorprendente, ya que los datos in vitro mostraron una afinidad por FR similar para ambos isómeros.

Los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, superaban al correspondiente derivado oxidado a base de ácido fólico en términos de captación por el tumor, biodistribución y estabilidad in vivo.

En general, los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, se acumulan muy específicamente en el tejido positivo para FR. No cabía esperar dicha acumulación, ya que los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F de hecho son transportados al tejido por sistemas de transporte. Especialmente la forma (6S) muestra, a este respecto, un comportamiento similar al de la forma oxidada.

El cociente tumor/riñón descrito considerablemente mejorado, en especial para la forma (6R) de los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F, en los que el grupo fenilo dentro de la estructura del folato se ha sustituido por un N-heterociclo marcado con 18F, es muy sorprendente y no cabía esperarlo.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato, comprendiendo dicho método los pasos de administrar al menos un compuesto según la fórmula Ia, Ib, IIa, 11 b, IIIa o IIIb en una cantidad para diagnóstico por imagen, y obtener una imagen diagnóstica de dicha célula o población de células.

Aun en un aspecto adicional, la presente invención proporciona usos de radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro para su administración conveniente y eficaz a un sujeto que necesita un diagnóstico por imagen.

Por tanto, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato, comprendiendo dicho método los pasos de administrar al menos un radiofármaco de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la invención en una cantidad para diagnóstico por imagen, y obtener una imagen diagnóstica de dicha célula o población de células.

Dicho estudio por imagen puede realizarse sobre una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro, ex vivo (biopsias) o in vivo. Las células o poblaciones de células típicas que sobreexpresan el receptor a de folato son tipos de cáncer epitelial, como cáncer de ovario, útero, riñón, mama, pulmón y colorrectal.

Por tanto, la presente invención proporciona un método para la detección in vitro de una célula que expresa el receptor de folato en una muestra de tejido que incluye poner en contacto dicha muestra de tejido con al menos un radiofármaco de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la invención en cantidades eficaces y durante tiempo suficiente y condiciones que permitan que se produzca la unión y detectar dicha unión mediante estudio por imagen con PET.

En un aspecto adicional la presente invención proporciona usos de radiofármacos tetrahidrofolatos marcados con 18F isoméricamente puros de la presente invención para su administración conveniente y eficaz a un sujeto que necesita un diagnóstico por imagen o seguimiento del tratamiento del cáncer o tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico y tratamiento simultáneos que comprende los pasos de administrar a un sujeto que lo necesita al menos un radiofármaco de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la presente invención en una cantidad eficaz para el diagnóstico en combinación con un compuesto terapéuticamente activo, y obtener una imagen diagnóstica de dichos tejidos para seguir la evolución del tratamiento.

El sujeto de los métodos de la presente invención es preferiblemente un mamífero, como un animal o un humano, preferiblemente un humano.

La dosis depende de la naturaleza del efecto deseado, tal como la forma de diagnóstico o tratamiento, de la clase y frecuencia del tratamiento, de la instrumentación diagnóstica, de la forma de aplicación de la preparación y de la edad, peso, nutrición y estado del paciente receptor y tipo de tratamiento concomitante, si lo hubiera.

No obstante, la dosis más preferida puede adaptarse al sujeto individual, según entienda y puede determinar un experto en la materia, sin necesidad de experimentación. Normalmente, esto supone el ajuste de una dosis estándar, por ejemplo, reducción de la dosis si el paciente tiene bajo peso corporal.

El tratamiento puede iniciarse con una cantidad más pequeña, por debajo de la cantidad óptima, la cual puede aumentarse para conseguir el efecto óptimo. El procedimiento de estudio por imagen en el escáner PET se produce en cuestión de minutos hasta 2-4 horas tras la administración del radiotrazador. La programación depende de la diana del estudio por imagen y de la cinética del radiotrazador, así como de la información deseada.

La vía de administración preferida de los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la presente invención es la vía parenteral, por ejemplo, inyección intravenosa.

Entre las formas adecuadas para la inyección se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles de los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la presente invención mencionados anteriormente. Típicamente, el radiofármaco se formulará en soluciones tampón fisiológicas.

Los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro pueden someterse a esterilización por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitaciones, la adición de agentes antibacterianos o antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. Preferiblemente, se someten a filtración estéril antes de la administración, eliminando la necesidad de agentes de esterilización adicionales.

En el caso de una solución inyectable, la dosis unitaria preferida es de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml. Tras la administración parenteral, el estudio por imagen del órgano o tumor in vivo puede realizarse, si se desea, desde unos minutos a 2-4 horas después de la administración del reactivo radiomarcado a un sujeto para permitir que una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumule en el área diana de elección.

Los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la invención pueden también utilizarse para la detección in vitro de una célula que expresa el receptor de folato en una biopsia de tejido obtenida de un sujeto. Por tanto, en una realización adicional, la presente invención proporciona un método para la detección in vitro de una célula que expresa el receptor de folato, por ejemplo, una célula tumoral, en una muestra de tejido que incluye poner en contacto dicha muestra de tejido con radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la presente invención en cantidades eficaces y durante tiempo suficiente y condiciones que permitan que se produzca la unión y detectar dicha unión mediante técnicas de estudio por imagen.

Las muestras pueden recogerse mediante procedimientos conocidos por un experto, por ejemplo, realizando una biopsia de tejido, recogiendo un líquido corporal o aspirando muestras de tráquea o pulmonares y similares.

Entre las muestras de tejido que se analizan se incluyen aquellas de cualquier tejido sospechoso de contener una célula que expresa un receptor de folato, como células tumorales, células epiteliales, riñones, sistema gastrointestinal o sistema hepatobiliar y otros. Las muestras pueden cortarse, por ejemplo, con un microtomo, para facilitar su examen y observación microscópica. Las muestras también pueden fijarse con un medio de fijación adecuado antes o después de la incubación con uno de los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F de la presente invención para mejorar la calidad histológica de los tejidos de la muestra.

El tiempo y condiciones suficientes para la unión del radiofármaco de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la presente invención a un receptor de folato en la célula incluyen condiciones de cultivo tisular estándar, es decir, las muestras pueden cultivarse in vitro e incubarse con uno de los complejos o composiciones de la presente invención en medios fisiológicos. Estas condiciones son bien conocidas por el experto. Alternativamente, las muestras pueden fijarse y, a continuación, incubarse con radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la presente invención en un tampón isotónico o fisiológico.

Para todas las aplicaciones es conveniente preparar los radiofármacos de tetrahidrofolato marcado con 18F isoméricamente puro de la presente invención en el lugar, o cerca de donde se van a utilizar.

Todos los compuestos y/o métodos descritos y reivindicados en este documento pueden hacerse y ejecutarse sin excesiva experimentación a la luz de la presente memoria descriptiva. Será aparente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a la presente invención sin alejarse del alcance de la misma. Los ejemplos proporcionados en este documento pretenden ser ilustrativos y no exhaustivos; por tanto, los ejemplos mostrados no deben considerarse una limitación de la invención en ningún sentido.

Ejemplos

Material y métodos

General:

Los reactivos y solventes se adquirieron en Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Acros Organis y se utilizaron sin purificación. Los elementos estructurales se adquirieron en ABCR-Chemicals, Apollo Scientific, Fluka-Chemie y Merck & Cie (Schaffhausen, Suiza). El ácido 6R-10-formil-5-metiltetrahidropteroico (6R-10-formil-5-MTHP) lo proporcionó Merck & Cie (Schaffhausen, Suiza). El control de calidad de estos elementos estructurales se realizó con RMN 1H, RMN 13C, cosygp y HR-MS.

Los solventes para realizar la cromatografía ultrarrápida, las mezclas de la reacción de transferencia y los procesos de extracción y lavado se adquirieron directamente del almacén de ETH.

Métodos analíticos:

Los espectros de resonancia magnética nuclear se registraron en un espectrómetro Bruker de 400 o 500 MHz con las correspondientes señales del solvente como patrón interno. Los desplazamientos químicos se notifican en partes por millón (ppm) en relación con tetrametilsilano (0,00 ppm). Los valores de la constante de acoplamiento (J) se proporcionan en hercios (Hz); las abreviaturas siguientes se utilizan en esta sección para la descripción de los espectros de RMN 1H: singlete (s), doblete (d), triplete (t), cuadruplete (c), multiplete (m), doblete de dobletes (dd), doblete de dobletes de dobletes (ddd) y señal ancha (sa). Los desplazamientos químicos de los multipletes complejos se proporcionan según el rango de su aparición.

Los espectros de masas de alta resolución (HR-MS) fueron registrados por el servicio de espectrometría de masas del Laboratorium für Organische Chemie del ETH Zürich en un Varian IonSpec Ultima MALDI-FT-ICR o en un Bruker Daltonics Ultra-Flex II MALDI-TOF. El trans-2-[3-(4-terc-butilfenil)-2-metil-2-propeniliden]malononitrilo (DCTB) y el ácido 3-hidroxipiridin-2-carboxílico (3-HPA) sirvieron como matrices para la espectrometría de masas MALDI. Los espectros de masas ESI se registraron con un Bruker FTMS 4.7 T BioAPEXII (ESI).

La HPLC preparativa se realizó con un sistema Merck-Hitachi equipado con una interfaz D7000, detector UV L-7400 y una bomba L-7150, usando una columna Ultimate XB-C18 (150 * 21,2 mm, 5 |jm) (Ultisil, Welch Materials) a un flujo de 15 ml/min (280 nm).

La HPLC analítica se realizó con un sistema Merck-Hitachi equipado con una interfaz D-7000, detector UV L-7400 y una bomba L-7100, usando una columna SunFire C18 (4,6 * 150 mm, 5 jm ). Si no se describe de otra forma, el control de la reacción se realizó mediante HPLC analítica usando una solución de NH⁴HCO³ 10 mM (solvente A) y MeCN (solvente B) y el siguiente gradiente: 0-30 min: 100-60 % de A; 30-35 min: 60 % de A; 35-36 min: 60-100 % de A; 36­ 40 min: 100 % de A a un caudal de 1 ml/min y a 280 nm.

La HPLC semipreparativa se realizó con un sistema de Merck-Hitachi equipado con una interfaz D-7000, un detector UV L-7400 y una bomba L-7100, con una columna SunFire C18 (10 * 150 mm, 5 jm ) usando tampón NH⁴HCO³ 10 mM (solvente A) y MeCN (solvente B) como sistema de solventes a un caudal de 4 ml/min a 280 nm.

La radio-HPLC analítica se realizó en un sistema de HPLC de la serie 1100 de Agilent, equipado con un volumen de loop de 100 j l y un radiodetector GabiStar (Raytest). La columna C18 Phenomenex Gemini analítica (4,6 * 250 mm, 5 |jm, 110 A, sin precolumna) se utilizó a un caudal de 1 ml/min a 280 nm. La HPLC analítica se realizó con NH⁴HCO³ 10 mM (solvente A) y MeCN (solvente B) como sistema de solventes con el siguiente gradiente: 0-20 min: 95-60 % de A; 20-25 min: 60 % de A; 25-26 min: 60-95 % de A; 26-30 min: 95 % de A.

El control de la reacción se realizó con una cromatografía líquida de ultraalto rendimiento con radioactividad (radio-UPLC, Waters) utilizando una columna Acquity UPLC BEH C18 (2,1 * 50 mm; 1,7 jm , Waters) y un detector de coincidencia acoplado (FlowStar LB513, Berthold) y con una solución de NH⁴HCO³ 10 mM (solvente A) y MeCN (solvente B) como sistema de solventes con el siguiente gradiente: 0-0,3 min: 90 % de A; 0,3-3,0 min: 90-50 % de A; 3,0-3,1 min: 50-20 % de A; 3,1-3,5 min: 20% de A; 3,5-3,6 min: 20-90 % de A; 3,6-4,0 min: 90 % de A a un caudal de 0,6 ml/min y a 280 nm.

Radioquímica. Producción de [18F]fluoruro seco:

Se obtuvo [18F]fluoruro sin vehículo añadido mediante irradiación de una diana líquida llena de [18O]H²O enriquecida isotópicamente (930 jl, 97 %, Cambridge Isotope Laboratories) mediante un haz de protones de 18 MeV en un ciclotrón 18/9 (IBA, Bélgica). La radioactividad (36-45 GBq) se transfirió a una cubeta caliente de síntesis mediante un flujo continuo de helio. La solución acuosa de [18F]fluoruro se atrapó en un cartucho Sep-Pak Light Accell Plus carb q Ma (Waters) sin preacondicionamiento. La elución se realizó usando una solución de K²CO³ (1,2 mg; 8,7 jmol) y Kryptofix (10 mg; 26,6 jmol) o Cs2CO3 (2,8 mg; 8,6 jm ol) y Kryptofix (5 mg; 13,3 jmol) en una mezcla de H²O (0,6 ml) y MeCN (1,4 ml). El eluido se recogió en un reactor Wheatin sellado (5 ml) y el solvente se evaporó a 95 °C a presión reducida y un flujo suave de nitrógeno durante 10 min. Posteriormente, se añadió MeCN (1 ml) tres veces y se evaporo hasta sequedad en el plazo de 3 min a 95 °C. Finalmente, se aplicó vacío total sin flujo de nitrógeno durante 5 min a 95 °C.

Estudios de biodistribución:

Los estudios de biodistribución se realizaron 2 semanas después de la inoculación celular. Se inyectó un volumen de 100 j l de radiotrazadores 18F-folato (~5 MBq/ratón) en una vena lateral de la cola. Los animales se sacrificaron 30, 60 y 90 min después de la administración de los radiotrazadores. Se extrajeron tejidos y órganos seleccionados, se pesaron y se midió la radiactividad mediante un contador y. Los resultados se notifican como porcentaje de la radioactividad inyectada por gramo de masa de tejido (% AI/g), usando recuentos de un volumen definido de la solución de inyección original medido en el mismo momento, obteniéndose corregidos por desintegración.

Estudios por imagen con PET/TC:

Los ratones se prepararon de la misma forma que para los estudios de biodistribución. Se empleó un escáner PET preclínico de sobremesa (Genisys8, Sofie Biosciences, U.S. y Perkin Elmer, U.S.) para las exploraciones de PET/TC de los ratones. La ventana de energía se estableció en 150-650 keV. Se inyectó a los ratones los 18F-radiotrazadores (~5 MBq en 100 |jl) por vía intravenosa. Durante las exploraciones, que duraron 10 min, los ratones se anestesiaron con una mezcla de isoflurano y oxígeno. Las exploraciones se realizaron 1,2 y 3 h después de la inyección de los 18F-radiotrazadores utilizando el software de adquisición G8 (versión 2.0.0.10). Las imágenes se reconstruyeron con el algoritmo de maximización de la esperanza para el cálculo de la máxima verosimilitud (MLEM, por sus siglas en inglés). Para la presentación de las imágenes de PET/TC, se ajustó la escala de las imágenes permitiendo la visualización óptima del tejido tumoral y de los riñones. (Se cortó aproximadamente el 10 % de la escala inferior).

Ejemplo 1: Síntesis y separación (mediante HPLC quiral) de di-íerc-butiléster de 6S y 6R-N2-acetil-3'-aza-2'-fluoro/2'-cloro-5-metiltetrahidrofolato

reoisomérica)

mezca as ereolsomérica)

Esquema 1a

Esquema 1b

La síntesis de las mezclas diastereoisoméricas 1:1 de 6S y 6R-W2-acetil-3’-aza-2’-cloro-5-MTHF-di-ferc-butiléster y 6S y 6R-N2-acetil-3’-aza-2’-fluoro-5-MTHF-di-ferc-butiléster se logró mediante la metilación reductora de di-ferc-butiléster del ácido W2-acetil-3’-aza-2’-cloro-fólico y de di-ferc-butiléster del ácido W2-acetil-3’-aza-2’-fluoro-fólico (esquema 1a) en analogía a un método general descrito en la bibliografía (“Reactions of Sodium Borohydride in Acidic Media. I. Reduction of Indoles and Alkylation of Aromatic Amines with Carboxylic Acids”, G.W. Gribble, P. D. Lord, J. Skotnicki, S. E. Dietz, J.T. Eaton, J. L. Johnson, J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, p. 7812) usando metil-ferc-butil éter y tetrahidrofurano como solventes. Los productos se caracterizaron mediante CL-EM, RMN 1H y HPLC. La síntesis de di-ferc-butiléster del ácido W2-acetil-3’-aza-2’-cloro-fólico y di-ferc-butiléster del ácido W2-acetil-3’-aza-2’-fluoro-fólico se logró según el documento WO 2013/167653. La separación quiral de los dos diastereoisómeros de ambas mezclas en los compuestos como se describe en el esquema 1 b se logró usando la columna de HPLC Reprosil 100 Chiral-NR procesada en fase normal (isocrática, hexano/isopropanol 1:1, figura 1). Di-ferc-butiléster de 6R-N2-acetil-3’-aza-2’-fluoro-5-metiltetrahidrofolato-(6R-2) se refiere al diastereoisómero, que eluyó primero a los 14,0 min, mientras que diferc-butiléster de 6S-N2-acetil-3’-aza-2’-fluoro-5-metiltetrahidrofolato (6S-2) se refiere al isómero que eluyó segundo a los 17,5 min.

Ejemplo 2: Síntesis de 6R-3'-aza-2'-fluoro-5-metiltetrahidrofolato

Los compuestos 6R-2 y 6S-2 diastereoméricos puros se obtuvieron tras la separación quiral (figura 1) y se usaron como materiales de partida para la síntesis de 6R-1 y 6S-1. La desprotección ácida de 6R-2 y 6S-2 en acetona permitió obtener tras la purificación de 6R y 6S-3’-aza-2’-fluoro-5-MTHF 6R-1 y 6S-1 con rendimientos químicos del 81 % y del 87 %, respectivamente (esquema 1c).

Esquema 1c

Se disolvió 6R-2 (7,00 mg; 11,1 |jmol) en acetona (200 |jl) y HCl 4 M (500 |jl) y se agitó durante 1 h a 70 °C (esquema 1b). Tras completarse la reacción, la solución se neutralizó con NaOH 4 M y el producto se purificó mediante HPLC semipreparativa. La liofilización de las fracciones del producto permitió obtener 6R-Y-1 como un sólido de color blanco con un rendimiento del 87 % (4,62 mg) y alta pureza química y diastereomérica de >95 %.

Ejemplo 3: Síntesis de 6S-3'-aza-2'-fluoro-5-metiltetrahidrofolato

Se disolvió 6S-2 (8,00 mg; 12,6 jimol) en acetona (200 jil) y HCl 4 M (500 jil) y se agitó durante 1 h a 70 °C (esquema 1b). Tras completarse la reacción, la solución se neutralizó con NaOH 4 M y el producto se purificó mediante HPLC semipreparativa. La liofilización de las fracciones del producto permitió obtener 6S-Y-1 como un sólido de color blanco con un rendimiento del 81 % (4,96 mg) y alta pureza química y diastereomérica de >95 %.

Ejemplo 4: Determinación de la configuración absoluta de los dos diastereoisómeros de referencia (6R-1 y 6S-1) mediante dicroísmo circular (DC)

Se registraron los espectros de DC de 6S y 6R-5-MTHF y de los dos compuestos de referencia 6R y 6S-3’-aza-2’-fluoro-5-MTHF (6R-1 y 6S-1) (figuras 2A y 2B). Se obtuvieron los espectros opuestos de los dos diastereoisómeros 6R y 6S correspondientes de cada una de las dos parejas de folatos. Los espectros de 6S y 6R-5-MTHF sirvieron como espectros de referencia, puesto que se conocía la estereoquímica de estas dos sustancias. Se ha publicado en la bibliografía que la pterina muestra una banda de absorción típica en torno a 345 nm y una segunda banda a 280 nm. Estas dos bandas de absorción típicas también son visibles en los cuatro espectros de DC registrados. Se pudo realizar la correlación de los espectros de referencia de 6S y 6R-5-MTHF con los espectros de los dos diastereoisómeros de referencia 6R y 6S-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHFs (figura 3). Puesto que los picos a 310 nm de 6R-5-MTHF y 6R-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHF son ambos negativos y los picos a 280 nm son ambos positivos, se puede asumir que 6R-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHF es el isómero 6R (figura 3A), ya que estas absorciones se originan a partir de la pterina que porta el estereocentro. Se pudo hacer la misma correlación con 6S-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHF y 6S-5-MTHF (figura 3B), donde los picos a 310 nm son positivos y ambos picos a 280 nm son negativos. En función de estos resultados, se puede concluir que 6S-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHF está S-configurado en la posición 6.

Ejemplo 5: Preparación de 6S y 6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6S y 6R-[18F]1)a

La radiosíntesis de 6S y 6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF se realizó de forma similar a la radiosíntesis del ácido 3’-aza-2'-[18F]fluorofólico descrito previamente en la bibliografía (Betzel y cols., (2013) Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3'-Aza-2'-[18F]fluorofolic Acid: A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting. Bioconjug. Chem.

24, 205-214.) El precursor 6R o 6S-N2-acetil-3’-aza-2’-cloro-5-MTHF di-ferc-butiléster (6R o 6S-2; 2,50 mg; 3,85 |jmol) se disolvió en DMSO anhidro (300 j l) y se añadió al complejo [18F]fluoruro-criptato azeotrópicamente seco (30-35 GBq). La mezcla de reacción se calentó a 160 °C durante 10 min. A continuación, se dejó enfriar la solución durante 5 min y se añadió H²O (5 ml). La solución se pasó a través de un cartucho Sep-Pak Plus tC18 (Waters, preacondicionado con 5 ml de MeOH, seguido de 10 ml de H²O) para atrapar el compuesto intermedio 6R o 6S-[18F]2. El [18F]fluoruro que no había reaccionado se eliminó lavando el cartucho con H²O (8 ml). El compuesto intermedio 6r o 6S-[18F]2 marcado se eluyó pasando por el cartucho MeCN (2,5 ml) dentro de otro reactor Wheaton sellado (5 ml). La evaporación de MeCN hasta casi sequedad se realizó a presión reducida y un flujo de nitrógeno a 90 °C. La escisión de los grupos protectores se llevó a cabo mediante la adición de solución de Hcl 4 M (1,25 ml) a la reacción y calentando durante 10 min a 70 °C para obtener 6R o 6S-[18F]1. La mezcla de reacción se dejó enfriar durante 2 min y se añadió tampón de fosfato sódico 10 mM pH 7,4 con 50 mg/ml de Na-(+)-L-ascorbato (2,5 ml) y NaOH 4 M (1,0 ml) para estabilizar el producto y neutralizar la solución ácida, respectivamente. La purificación del producto se consiguió mediante radio-HPLC semipreparativa. Se recogió la fracción de producto y se pasó por un filtro estéril a un vial apirógeno esterilizado. El control de calidad de 6R o 6S-[18F]1 se realizó mediante una radio-HPLC analítica. Al final de la síntesis se obtuvieron 350-1600 MBq (rendimiento corregido por desintegración: 1-5 %) de los radiotrazadores finales. SA oscilaba de 46 a 250 GBq/^mol y la pureza radioquímica era superior al 95 %.

La purificación mediante radio-HPLC semipreparativa se realizó utilizando EtOH al 0,1 % en NaH2PO4/Na2HPO4 10 mM (pH 7,4) y 50 mg/ml de Na-(+)-L-ascorbato (solvente A) y EtOH al 40 % en NaH2PO4/Na2HPO410 mM (pH 7,4) y 50 mg/ml de Na-(+)-L-ascorbato (solvente B) como sistema de solventes con un gradiente de 0-15 min: 100-85 % de A; 15-40 min: 85 % de A a un caudal de 4 ml/min (280 nm). La radio-HPLC analítica se realizó usando NaH2PO450 mM (pH 6,5) (solvente A) y MeCN al 30 % en NaH2PO450 mM (pH 8,0) (solvente B) como sistema de solventes con un gradiente de 0-14 min: 100-45 % de A; 14-17 min: 45-0 % de A; 17-25 min: 0 % de A; 25-26 min: 0-100 % de A; 26-32 min: 100 % de A a un caudal de 1 ml/min (280 nm).

Ejemplo 6: Determinación del coeficiente de distribución

Los coeficientes de distribución (logD7,4) de 6S-[18F]1 y 6R-[18F]1 se determinaron usando el método de agitación de matraces publicado en la bibliografía (tabla 1) (Boss y cols., (2015) Comparative Studies of Three Pairs of a- and y-Conjugated Folic Acid Derivatives Labeled with Fluorine-18. Bioconjug. Chem. acs.bioconjchem.5b00644; Wilson y cols., (2001) An admonition when measuring the lipophilicity of radiotracers using counting techniques. Appl. Radial Isot. 54, 203-208.) En resumen, el radiotrazador se añadió a una mezcla de tampón de fosfato (500 pl, pH 7,4) y noctanol (500 pl) a temperatura ambiente. Las muestras se agitaron durante 15 min en un agitador rotatorio y se centrifugaron durante 3 min a 5000 rpm para separar las dos fases. Se añadieron alícuotas (50 pl) de ambas fases a tubos Eppendorf y, a continuación, se analizaron en un contador y (Wizard, PerkinElmer). El coeficiente de partición se expresa como el cociente entre las concentraciones de radioactividad (cpm/ml) del n-octanol y de la fase de tampón de fosfato. Los valores representan la media ± desviación estándar de 6 determinaciones de dos experimentos independientes.

Tabla 1: Resumen de los valores de LogD7,4 de los folatos y pteroatos.

Ejemplo 7: Caracterización in vitro

Las afinidades de unión de los compuestos de referencia no radioactivos 6R-1 y 6S-1 se determinaron usando células KB en un ensayo de desplazamiento con [3H]-ácido fólico. Los resultados (tabla 2) revelaron que los dos diastereoisómeros de referencia 6R-1 y 6S-1 tienen afinidades altas similares por FR-a y son similares a los valores de 6S y 6R-5-MTHF. El valor de IC⁵⁰ del ácido fólico en las mismas condiciones experimentales se encontró que era de 0,6 ± 0,1 nM, mientras que el ácido 3'-aza-2'-[18F]fluorofólico tenía un valor de IC⁵⁰ de 1,4 ±0,5 nM. En comparación con la forma oxidada, los correspondientes derivados aza-folato reducidos, 6R-1 y 6S-1, muestran aproximadamente una afinidad 17 veces menor por FR-a.

Tabla 2 : Comparación de los datos de afinidad de unión in vitro de 6R y 6S-3'-aza-2'-fluoro-5-MTHF (6R-1 y 6S-1) con 6R y 6S-5-MTHF y ácido fólico por FR-a. (n = 3).

Ejemplo 8: Captación e internalización celular

Para investigar la captación e internalización celular específica de FR, la captación e internalización celular de 6R-[18F]1 y 6S-[18F]1 se realizaron usando células KB positivas para FR. La captación celular aumentaba de forma constante con el tiempo para ambos diastereoisómeros, dando lugar a una captación de aproximadamente el 60 % (calculado por 0,3 mg de proteína) de la radioactividad total añadida después de 3 h de incubación a 37 °C (figura 22). Se encontró que la actividad de intemalización era de aproximadamente el 8 % para 6R-[18F]1 y aproximadamente el doble para 6S-[18F]1 (16 %). Tanto 6R-[18F]1 como 6S-[18F]1 mostraron una elevada estabilidad in vivo. Solo se encontraron compuestos originales intactos en muestras tomadas 30 min después de la inyección de los radiotrazadores. Tanto 6R como 6S-[18F]1 eran incluso más estables que el trazador de ácido fólico oxidado, detectándose en el hígado los radiometabolitos. El bloqueo de FR-a incubando conjuntamente los radiotrazadores con un exceso de ácido fólico dio lugar a la inhibición de la captación de radiofolato a menos del 0,2 %.

Ejemplo 9: Estudios de metabolitos

Los radiotrazadores de folato 6S/6R-[18F]5 (relación 1:1; 53,7-52,3 MBq; ~0,62-1,15 nmol) se inyectaron por vía intravenosa a ratones para determinar la estabilidad in vivo de los trazadores. Los ratones se sacrificaron 60 min después de la inyección del trazador, se recogieron muestras de sangre, orina e hígado y se analizaron. Se añadió metanol enfriado en hielo que contenía 10 mg/ml de 2-mercaptoetanol e hidróxido de amonio al 0,025 % (v/v) al plasma sanguíneo, al hígado homogeneizado y a la orina para precipitar las proteínas6. Tras la centrifugación, los sobrenadantes de las muestras de plasma sanguíneo, hígado y orina se analizaron mediante radio-UPLC (figura 4). El análisis de las muestras reveló únicamente el trazador original 6S/6R-[18F]160 min después de la inyección del radiotrazador.

Ejemplo 10: Investigaciones in vivo de los folatos con 18F reducidos 6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6R-[18F]1) y 6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6S-[18F]1)

Los estudios de biodistribución se realizaron con 15 ratones portadores del tumor KB tras la inyección de 6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6R-[18F]1) y 6S-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6S-[18F]1). En la tabla 1 y la tabla 2 se proporcionan los valores de tres puntos temporales (30, 60 y 90 min después de la inyección del radiotrazador). Para los experimentos de bloqueo, los ratones recibieron 100 |jg de ácido fólico 10 min antes del trazador y se sacrificaron 60 min p.i.

Tabla 1.

Biodistribución de 6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6R-[18F]1) en ratones portadores del tumor KB en diferentes puntos temporales después de la inyección.

6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6R-[18F]1) [% Al/g]

30 min p.i. 60 min p.i. 90 min p.i. 60 min p.i.

y ácido fólico n = 4 n = 4 n = 4 n = 3 Sangre 3,13 ± 0,31 2,16 ± 0,25 1,92 ± 0,19 1,52 ± 0,43 Corazón 2,75 ± 0,33 2,38 ± 0,18 2,39 ± 0,47 1,60 ± 0,46 Pulmón 3,37 ± 0,32 2,80 ± 0,29 2,92 ± 0,53 1,73 ± 0,43

Bazo 8,25 ± 0,96 8,25 ± 0,88 13,0 ± 4,14 3,89 ± 0,40 Hígado 14,3 ± 1,36 14,1 ± 0,80 16,8 ± 3,58 9,64 ± 1,55 Vesícula biliar 37,5 ± 11,7 39,0 ± 22,17 56,7 ± 13,2 26,5 ± 16,6 Riñones 34,5 ± 2,45 27,3 ± 3,07 29,8 ± 7,46 4,80 ± 1,94 Estómago 2,20 ± 0,23 2,35 ± 0,49 2,51 ± 0,42 2,02 ± 0,52 Intestino 7,68 ± 1,28 6,93 ± 1,06 8,01 ± 2,72 5,23 ± 0,73 Heces 12,2 ± 3,54 17,8 ± 5,09 13,1 ± 6,07 15,2 ± 1,75

_________________________ (continuación)_______

6R-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6R-[18F]1) [% Al/g]

Glándulas 7,16 ± 0,51 6,49 ± 0,93 7,31 ± 1,17 2,61 ± 0,70 salivales

Músculo 1,54 ± 0,13 1,36 ± 0,15 1,48 ± 0,31 1,05 ± 0,42 Hueso 2,73 ± 0,14 2,43 ± 0,10 3,53 ± 0,90 1,51 ± 0,34 Tumor KB 13,3 ± 1,80 18,1 ± 2,86 23,9 ± 2,74 3,41 ± 0,88 Tumor-sangre 4,27 ± 0,61 8,47 ± 1,62 12,5 ± 1,46

Tumor-hígado 0,94 ± 0,14 1,29 ± 0,18 1,46 ± 0,26

Tumor-riñón 0,39 ± 0,05 0,67 ± 0,14 0,83 ± 0,17

Los valores mostrados representan la media ± DE de los datos de tres o cuatro animales.

Tabla 2.

Biodistribución de 6S-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6S-[18F]1) en ratones portadores del tumor KB en diferentes puntos temporales después de la inyección.

6S-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6S-[18F]1) [% AI/g]

30 min p.i. 60 min p.i. 90 min p.i. 60 min p.i.

y ácido fólico n = 4 n = 4 n = 4 n = 3

Sangre 1,52 ± 0,31 1,26 ± 0,08 1,16 ± 0,20 1,09 ± 0,28 Corazón 2,02 ± 0,22 1,53 ± 0,15 1,48 ± 0,17 0,50 ± 0,13 Pulmón 2,31 ± 0,42 2,04 ± 0,09 2,08 ± 0,35 0,84 ± 0,20

Bazo 1,90 ± 0,34 1,57 ± 0,16 1,82 ± 0,49 0,90 ± 0,24 Hígado 8,10 ± 1,16 6,28 ± 0,66 5,86 ± 1,11 4,76 ± 0,87 Vesícula biliar 20,0 ± 9,00 16,6 ± 8,91 11,4 ± 7,18 5,87 ± 0,45 Riñones 42,5 ± 2,73 37,5 ± 3,61 42,3 ± 7,05 2,28 ± 0,95 Estómago 2,54 ± 0,56 1,84 ± 0,33 1,69 ± 0,33 0,73 ± 0,32 Intestino 2,61 ± 0,65 2,58 ± 0,42 2,34 ± 0,39 4,34 ± 0,93 Heces 3,71 ± 2,34 4,85 ± 1,95 4,57 ± 1,98 8,42 ± 2,10 Glándulas 13,8 ± 2,06 13,8 ± 1,28 21,4 ± 4,59 0,89 ± 0,26 salivales

Músculo 1,36 ± 0,25 1,29 ± 0,14 1,24 ± 0,14 0,26 ± 0,06 Hueso 1,70 ± 0,13 1,38 ± 0,14 1,49 ± 0,30 0,49 ± 0,12

(continuación)

6S-3'-aza-2'-[18F]fluoro-5-MTHF (6S-[18F]1) [% AI/g]

Tumor KB 11,1 ± 0,90 14,2 ± 1,91 19,2 ± 4,16 2,11 ± 0,38

Tumor-sangre 7,41 ± 0,96 11,3 ± 1,13 16,5 ± 0,59

Tumor-hígado 1,38 ± 0,16 1,87 ± 0,96 3,30 ± 0,59

Tumor-riñón 0,26 ± 0,01 0,38 ± 0,04 0,45 ± 0,07

Los valores mostrados representan la media ± DE de los datos de tres o cuatro animales.

Los estudios de biodistribución revelaron una elevada captación por el tumor de los diastereoisómeros 6R y 6S. Ya a los 30 min p.i. se observó una elevada captación por el tumor de 13,3 ± 1,80 % AI/g para 6R-[18F]1 y 11,13 ± 0,90 % AI/g para 6S-[18F]1 (figura 5). La captación por el tumor aumentó aún más con el tiempo hasta 23,9 ± 2,74 % AI/g para el isómero 6R y hasta 19,2 ± 4,16 % AI/g para el isómero 6S 90 min p.i. Este valor es aproximadamente el doble de la cantidad de acumulación de radioactividad obtenido a partir de trazador oxidado del ácido 3'-aza-2'-[18F]fluorofólico (12,59 ± 1,77 % AI/g). La captación por el tumor se bloqueó de forma eficaz mediante la inyección previa de ácido fólico. La especificidad de la unión al tumor era del 85 % y el 89 % para los isómeros R y 6S, respectivamente. Se encontró una cantidad significativamente mayor de radioactividad en el hígado para el trazador 6R (14,3 ± 1,36 % AI/g) en comparación con el trazador 6S (8,10 ± 1,16 % AI/g) 30 min p.i. La captación de radioactividad 90 min p.i. en el hígado aumentó ligeramente para el isómero 6R (16,8 ± 3,58 % AI/g), mientras que los niveles de radioactividad disminuyeron para el isómero S (5,86 ± 1,11 % AI/g). La captación por el bazo aumentó sensiblemente para el isómero 6R ya a los 30 min p.i. y a los 90 min p.i. se observó una captación siete veces mayor para el isómero 6R (13,0 ± 4,14 % AI/g) en comparación con el isómero 6S (1,82 ± 0,49 % AI/g). Por el contrario, a los 30 min p.i., la captación por el riñón era considerablemente superior para 6S-[18F]1 que para 6R-[18F]1 (forma 6R: 34,5 ± 2,45 % AI/g; forma 6S: 42,5 ± 2,73 % AI/g) y siguió prácticamente constante con el tiempo para ambos diastereoisómeros (90 min p.i.: forma 6R: 29,8 ± 7,46 % AI/g; forma 6S: 42,3 ± 7,05 % AI/g). Sin embargo, ambos valores eran considerablemente inferiores al del ácido 3'-aza-2'-[18F]fluorofólico (57,3 ± 8,40 % AI/g). También se observó una diferencia significativa en la captación por las glándulas salivales para los dos diastereoisómeros, en las que se encontró una cantidad tres veces mayor de isómero 6S a los 90 min p.i. (forma 6R: 7,31 ± 1,17% AI/g; forma 6S: 21,4 ± 4,59% AI/g).

La relación tumor-riñón era significativamente inferior para 6S-[18F]1 (30 min p.i.: 0,26 ± 0,01 % AI/g) y aumentaba en un factor de 1,7 hasta un valor de 0,45 ± 0,07 % AI/g a los 90 min p.i. (figura 6). Por el contrario, la relación tumorriñón de 6R-[18F]1 era ya de 0,39 ± 0,05 % AI/g a los 30 min p.i. y aumentaba en un factor de 2,1 hasta 0,83 ± 0,17 % AI/g a los 90 min p.i. Por tanto, la relación tumor-riñón de 6R-[18F]1 es aproximadamente dos y cuatro veces mayor que la de 6S-[18F]1 y el ácido 3'-aza-2'-[18F]fluorofólico, respectivamente. La relación tumor-hígado era superior para el isómero 6S que para el isómero 6R en todos los puntos temporales investigados debido a la captación más baja por el hígado de 6S-[18F]1. Por tanto, a los 90 min p.i., en el hígado se observó una acumulación tres veces mayor de 6R-[18F]1 que del isómero 6S (forma 6R: 16,8 ± 3,58 % AI/g; forma 6S: 5,86 ± 1,11 % AI/g). La menor captación del isómero S en el hígado es ventajosa desde un punto de vista de estudios por imagen, ya que permitiría delimitar tumores positivos para FR que estén localizados cerca del hígado. Las relaciones tumor-sangre aumentaron de forma constante con el tiempo para ambos isómeros, siendo las relaciones del isómero 6S significativamente superiores a las del isómero 6R.

La distribución tisular dependiente del tiempo en los órganos y tejidos más relevantes se muestra en las figuras 7 y 8.

La actividad acumulada de dos trazadores de 18F-folato en diferentes órganos y tejidos se muestra en la figura 9.

Las relaciones tumor-fondo 30, 60 y 90 min después de la inyección de cada radiotrazador se muestran en las figuras 10 a 12.

Ejemplo 11: Estudios por imagen con PET/TC

El plan experimental se muestra en la tabla 3.

(continuación)

Ratón 31 Ratón 32 Ratón 33 Ratón 34 Ratón 35 Ratón 36

Exploración: 1 Exploración: 1 h Exploración: 1 h Exploración: 1 h Exploración: 1 h Exploración: 1 h h p.i. p.i. p.i. p.i. p.i. p.i.

Exploración: 2 Exploración: 2 h Exploración: 2 h Exploración: 2 h Exploración: 2 h Exploración: 2 h h p.i. p.i. p.i. p.i. p.i. p.i.

Exploración: 3 Exploración: 3 h Exploración: 3 h Exploración: 3 h Exploración: 3 h Exploración: 3 h h p.i. p.i. p.i. p.i. p.i. p.i.

En las figuras 13 a 18 se muestran las imágenes de PET/TC (proyecciones de máxima intensidad [PMI]) de cada ratón correspondientes a las exploraciones 1, 2 y 3 h después de la inyección del radiotrazador.

Se observó una alta captación por los xenoinjertos de tumor KB para ambos radiotrazadores ya tras 1 h p.i. y los tumores se visualizaban muy bien con alta intensidad tras 3 h p.i. para ambos compuestos. La acumulación de radioactividad en el hígado se observó principalmente para el isómero 6R, aunque 3 h p.i. la captación por el hígado era apenas visible. Los riñones positivos para FR se visualizan claramente 1 h p.i. con 6r -[18F]1, pero eran prácticamente invisibles a las 3 h p.i. Por el contrario, se observó una alta acumulación en riñón de 6S-[18F]1 en todos los puntos temporales estudiados. Asimismo, la elevada captación de radioactividad era evidente en las glándulas salivales. Se realizaron estudios de bloqueo inyectando ácido fólico 10 minutos antes de la administración de los radiotrazadores y el resultado fue una captación considerablemente reducida de 6R-[18F]1 y de 6S-[18F]1 en todos los tejidos positivos para FR (xenoinjertos de tumor KB, riñones, glándulas salivales y plexo coroideo) (figuras 15 y 17).

Según la biodistribución y los resultados de los estudios de imagen por PET, se puede concluir que el isómero 6S se excreta preferiblemente por la vía renal, mientras que el isómero 6R parece excretarse principalmente por la vía hepatobiliar.

Ejemplo 12: Estudios de captación e intemalización celular realizados con células CHO transfectadas con FR-a y FR-p denominadas células RT16 y D4

Se estudió la captación e internalización de los 18F-folatos oxidado (18F-AzaFol) y reducidos (isómero 6S e isómero 6R de 18F-5-Me-Aza-THF) en células D4 y RT16 que expresan FR-a y FR-p, respectivamente. Ambas líneas celulares fueron cedidas amablemente por la Larry Matherly Wayne State University, Detroit, EE. UU.; Golani y cols., J Med. Chem., 2016, 59, 7856.

Cuando se utilizaron células tumorales RT16 que expresaban el FR-a, los tres trazadores 18F-folato (versiones oxidadas y reducidas) mostraron una captación similar, con intervalos de entre el 43-50 % tras 1 h de incubación y del 56-66 % tras 3 h de incubación. La fracción de internalización de los radiotrazadores alcanzó el 8-10 % después de 1 h y aumento ligeramente hasta el 9-12 % después de 3 h de incubación.

Cuando se utilizaron las células D4 que expresaban FR-p, la captación de 18F-AzaFol y del isómero 6S del radiotrazador reducido alcanzó aproximadamente el 70 % tras 1 h de incubación y del 80 % tras 3 h de incubación. La fracción internalizada de 18F-AzaFol y del isómero 6S de la versión reducida fue del 20 % y del 12 %, respectivamente, después de 1 h de incubación. Estas cifras aumentaban ligeramente cuando el tiempo de incubación se prolongaba hasta 3 h. Sin embargo, con estas células D4 se observó que se captaba solo el 3 % del radiotrazador de folato reducido (isómero 6R) y se internalizaba aproximadamente el 1 %. No se observaron cambios tras dos horas adicionales de incubación.

Se observó una captación significativa de 18F-AzaFol y de la versión reducida del radiotrazador (isómero 6S) cuando se usaron las células RT16 (FR-a), así como cuando se usaron las células D4 (FR-p) (figura 23). El isómero 6R del folato reducido mostró mayor captación en las células RT16, lo que indicaba selectividad por FR-a, mientras que la captación en las células D4 era muy baja (figuras 24 y 25). Estos resultados concuerdan con la hipótesis de que el isómero 6R (correspondiente a la versión natural del folato reducido denominado 6S-5Me-THF) se une selectivamente a FR-a.

Sumario

La presente invención se dirige a productos radiofarmacéuticos de (6S)- o (6R)-5-metiltetrahidrofolato marcados con 18F isoméricamente puros, en donde el grupo fenilo dentro de la estructura folato, se ha reemplazado por un N heterociclo marcado con 18F, para su uso en la formación de imágenes de diagnóstico de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo o para su uso en la monitorización de cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y terapia de los mismos.

FIGURAS

Tiempo de retención (min) Tiempo de retención (min)

Figura 1. Cromatogramas de HPLC quiral del precursor AA-acetlI-S’-aza ^ ’-cloro-b-metilíetrahidrofolato-diíerc-butiléster 6S-2 y 6R-2 (A) y dei compuesto de referencia protegido ftí-acetil-S’-aza ^ ’-fluoro-S-metiltetrahidrofolato-di-ferc-butiléster 6S-2 y 6R-2 (B).

A ^{Espectros de DC de 6S/6R-5-MTHF}

Figura 2. Espectros de DC de 6S- y 6R-5-MTHF (A) y 6R-1 y 6S-1 (B) midiendo desde 400 nm a 200 nm.

Figura 3. Solapamiento de los espectros de DC de 6S-5-MTHF y 6S-3’-aza-2’-fluoro-5-MTHF (A) y 6R-5-MTHF y 6R-3'-aza-2’-fluoro-5-MTHF (B).

Minutos

Figura 4. Cromatogramas de radio-UPLC deí radiotrazador de referencia 6S/6R-[18F]1 (A), muestra de hígado (B), plasma sanguíneo (C) y muestra de orina (D) 60 min después de la inyección de 6S/6R-[18F]1. El tiempo de retención se indica sobre del pico.

Figura 9. Comparación de los perfiles de distribución tisular de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

relación tumor-sangre

Figura 10. Comparación de las relaciones tumor-sangre de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

relación tumor-hígado

Figura 11. Comparación de las relaciones tumor-hígado de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

1^,2 ^­

relación tumor-riñón

Figura 12. Comparación de las relaciones tumor-riñón de 18F-6R-5Me-AzaTHF (forma 6R) y 18F-6S-5Me-AzaTHF (forma 6S).

Figura 13. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1, 2 y 3 h después de la inyección de 1BF-6R-Aza-5MeTHF. (Tu = xenoinjertos de tumor, Hi = hígado, Ri = riñón, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 14. Exploraciones mediante PETFTC de un ratón portador de un tumor KB 1, 2 y 3 h después de la inyección de 18F-6R-Aza-5MeTHF. (Tu = xenoinjertos de tumor, H¡ = higado, Ri = riñón, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 15. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1 ,2 y 3 h después de la inyección de ácido fólico en exceso antes de 18F-6R-Aza-5MeTHF. (Hi = higado, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 16. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1 ,2 y 3 h después de la inyección de 1sF-6S-Aza-5MeTFIF. (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

Figura 17. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1,2 y 3 h después de la inyección de 1BF-6S-Aza-5MeTHF. (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

Figura 18. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor KB 1, 2 y 3 h después de la inyección de ácido fólico en exceso antes de 18F-6S-Aza-5MeTHF. (Vj = vejiga, flecha blanca = vesícula biliar).

Figura 19. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor IGROV-1 (linea celular de

carcinoma de ovario humano) 1 h después de la inyección de 18F-AzaFol, 18F-5Me-6S-Aza-THF y ,BF-5Me-6R-Aza-THF (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula

biliar, flecha verde = plexo coroideo).

18F-AzaFol 13F-5Me-(íS-Aza-THF 18F-5Me-6R-Aza-THF

Figura 20. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor IGROV-1 (línea celular de carcinoma de ovario humano) 2 h después de la inyección de 18F-AzaFol, 13F-5Me-6S-Aza-THF y 1BF-5Me-6R-Aza-TFIF (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

1ÉF-AzaFol 13F-5Me-6S-Aza-THF 1ÉF-5Me-6R-Aza-THF

Figura 21. Exploraciones mediante PET/TC de un ratón portador de un tumor IGROV-1 {linea celular de carcinoma de ovario humano) 3 h después de la inyección de 10F-AzaFol, 18F-5Me-6S-Aza-THF y ,0F-5Me-6R-Aza-THF (Tu = xenoinjertos de tumor, Ri = riñón, GS = glándulas salivales, flecha blanca = vesícula biliar, flecha verde = plexo coroideo).

no fisiológico fisiológico

misma conformación que

fisiológico no fisiológico

Figura 26. Estructura y denominación estereoquímica de 18F-folatos reducidos e isómeros no fluorinados

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de formula la o Ib para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo para su uso en el seguimiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y de su tratamiento

Ib

donde

R¹, R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, y

R³ , R⁴ son independientemente entre sí H, formilo o metilo,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que

R¹, R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada,

R³ es metilo, y

R4 es H,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. Un compuesto de la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1 que tiene la fórmula Ila o llb

IIa

II b

donde

Ri, R² son independientemente entre sí H o alquilo C1-C12,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene la fórmula IIIa o IIIb

IIIb

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene una pureza estereoisomérica de más del 99 %; preferiblemente con una pureza estereoisomérica de más del 99,5 %.

6. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la sal farmacéuticamente aceptable es una sal alcalina o de metal alcalinotérreo, preferiblemente una sal de sodio, potasio, magnesio o calcio.

7. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato, comprendiendo dicho método los pasos de administrar al menos un compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 en una cantidad para diagnóstico por imagen, y obtener una imagen diagnóstica de dicha célula o población de células.

8. Compuesto para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato según la reivindicación 7 en el que se realiza el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato in vitro o in vivo.

9. Compuesto para su uso en el diagnóstico por imagen de una célula o población de células que expresan un receptor de folato según la reivindicación 7 u 8, en el que se realiza el diagnóstico por imagen de células de carcinoma de ovario humano.

10. Método para la detección in vitro de una célula que expresa el receptor de folato en una muestra de tejido que incluye poner en contacto dicha muestra de tejido con un compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 en cantidades eficaces y durante tiempo suficiente y condiciones que permitan que se produzca la unión y detectar dicha unión mediante técnicas como autorradiografía y similares.

11. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el diagnóstico por imagen o seguimiento de un sujeto que comprende los pasos de (i) administrar al menos un compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 en una cantidad para diagnóstico por imagen y (ii) realizar un diagnóstico por imagen usando PET mediante la detección de una señal procedente de dicho al menos un compuesto.

12. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el seguimiento del tratamiento del cáncer o de enfermedades inflamatorias y autoinmunes en un sujeto que comprende los pasos de (i) administrar a un sujeto que lo necesita al menos un compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 en una cantidad para diagnóstico por imagen en combinación con un compuesto terapéuticamente activo y (ii) realizar un diagnóstico por imagen usando PET mediante la detección de una señal procedente de dicho al menos un compuesto para seguir la evolución del tratamiento del cáncer o de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

13. Compuesto para su uso según las reivindicaciones 1 a 6 en combinación con cualquier otro método de diagnóstico o tratamiento del cáncer o enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias.