CN110431141A - 异构体纯的18f-标记的四氢叶酸盐/酯 - Google Patents

异构体纯的18f-标记的四氢叶酸盐/酯 Download PDF

Info

Publication number
CN110431141A
CN110431141A CN201880018678.9A CN201880018678A CN110431141A CN 110431141 A CN110431141 A CN 110431141A CN 201880018678 A CN201880018678 A CN 201880018678A CN 110431141 A CN110431141 A CN 110431141A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
compound
label
diagnosing image
minutes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880018678.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110431141B (zh
Inventor
R·莫泽
V·格伦
C·米勒
R·席布利
S·阿梅塔迈
S·博斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of CN110431141A publication Critical patent/CN110431141A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110431141B publication Critical patent/CN110431141B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
    • C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/041—Heterocyclic compounds
    • A61K51/044—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins
    • A61K51/0459—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins having six-membered rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, e.g. piperazine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及异构体纯的18F‑标记的(6S)‑或(6R)‑5‑甲基四氢叶酸放射药剂，其中叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F‑标记的N‑杂环替换，用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗。

Description

异构体纯的18F-标记的四氢叶酸盐/酯
发明领域
本发明涉及异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂，其中叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的用途，其用于诊断表达叶酸受体的细胞或细胞群体和监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗。
背景技术
用于递送效应物部分比如诊断或治疗试剂的受体特异性靶向是广泛研究的领域并且引起非侵入性诊断和/或治疗的医学应用的发展。尤其是，在应用发射电磁辐射的放射性物质比如γ射线或发出辐射的粒子的核医学过程和治疗领域中，需要将这些放射性物质选择性地区域化在靶向细胞或组织中以实现用于造影特定组织的高信号强度，用其评价疾病和/或监测治疗效果，或者实现用于递送适当剂量的离子化辐射至指定患病场所的高辐射剂量，而不在其它组织例如健康的组织中构成辐射伤害/辐射毒性风险。因此，关键是测定和评价细胞特异性结构，尤其是在癌症(也即肿瘤)或炎性疾病和自身免疫病情况下的结构，比如受体、抗原、半抗原等，其能够通过各自的生物学媒介物特定靶向。
在过去二十年，已研究了许多基于叶酸的放射药剂使叶酸受体(FR)阳性肿瘤组织成像的能力(Low,P.S.,Henne,W.,and Doorneweerd,D.(2008)Discovery anddevelopment of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy ofcancer and inflammatory diseases.Acc.Chem.Res.41,120-129；Philip Stewart Low,S.A.K.(2009)Folate-targeted therapeutic and imaging agents forcancer.Curr.Opin.Chem.Biol.13,256-262；Müller,C.(2013)Folate-BasedRadiotracers for PET Imaging-Update and Perspectives.Molecules 18,5005-5031,和Müller,Folate based radiopharmaceuticals for imaging and therapy of cancerand inflammation.,C.Curr Pharm Des.2012；18(8):1058-83)。FR-α代表肿瘤成像的最佳靶标，原因是其在各种上皮癌类型比如卵巢、子宫、肾、乳腺、肺和结肠-直肠癌上过表达，但是在健康组织包括肾、脉络丛，唾腺、肺和胎盘中仅有限表达(Parker,N.,Turk,M.J.,Westrick,E.,Lewis,J.D.,Low,P.S.,and Leamon,C.P.(2005)Folate receptorexpression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitativeradioligand binding assay.Anal.Biochem.338,284-293).基于叶酸的放射性示踪剂具有的缺点是它们在肾和其它FR-阳性组织中蓄积至较高程度，这是由于它们与FR-α的高结合亲和力(IC50＝～1nM)(Müller,C.(2013)Folate-Based Radiotracers for PETImaging-Update and Perspectives.Molecules 18,5005-5031)。另外，这些基于叶酸的放射性示踪剂也结合在牵涉于炎症中的活化巨噬细胞上上调的FR-β同种型，具有相似的高亲和力(Nakashima-Matsushita,N.,Homma,T.,Yu,S.,Matsuda,T.,Sunahara,N.,Nakamura,T.,Tsukano,M.,Ratnam,M.,and Matsuyama,T.(1999)Selective expression of folatereceptor β and its possible role in methotrexate transport in synovialmacrophages from patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum.42,1609-1616；Paulos,C.M.,Turk,M.J.,Breur,G.J.,and Low,P.S.(2004)Folate receptor-mediated targeting of therapeutic and imaging agents to activated macrophagesin rheumatoid arthritis.Adv.Drug Deliv.Rev.56,1205-1217)。这种非选择性可以引起癌症诊断或随访研究的假阳性结果。因此，为了降低或甚至避免误导性的结果，选择性的基于叶酸的放射药剂会是高度重要且有意义的。
然而，目前仅有限数量的还原叶酸盐/酯已被放射性标记用于成像研究。Vaitilingam等人报告99mTc标记的5,10-二甲基四氢叶酸衍生物(DMTHF)，然而并未提供关于DMTHF衍生物非对映体比率的信息(Vaitilingam,B.,Chelvam,V.,Kularatne,S.a.,Poh,S.,Ayala-Lopez,W.,and Low,P.S.(2012)A Folate Receptor-α-Specific Ligand ThatTargets Cancer Tissue and Not Sites of Inflammation.J.Nucl.Med.53,1127-1134)。作者报告KD值为38nM，其是相应氧化形式(EC20，KD＝12nM)的四倍高。与FR-β相比对FR-α的选择性在体外和体内实验中用FR-α-阳性肿瘤和炎症动物模型展示。除该DMTHF衍生物之外，Saeed等人在Nuclear Medicine and Biology 39(5):697-701 January 2012中报告又一碳-11标记的还原叶酸放射性示踪剂，然而并未公开体外或体内实验结果。类似Vaitlingam等人，并未提供关于该放射性标记产品的非对映体比率。在含有FR-β的炎性位点选择性靶向肿瘤相关的FR-α而非FR-β的氟-18标记的叶酸盐/酯PET示踪剂对于提供显著灵敏度和特异性高度有意义。
Wang等人在Biochemical Pharmacology.Vol.44.No.9.pp.1898-1901,1992中报告还原的5-甲基-(6R)-THF结合亲和力相对5-甲基-(6S)-THF的4倍差异。
Betzel等人最近报告名为3′-氮杂-2′-[18F]氟叶酸的有希望的氟-18标记的叶酸衍生物，用于成像FR-阳性癌症组织(Betzel,T.,Müller,C.,Groehn,V.,Müller,A.,Reber,J.,Fischer,C.R.,S.D.,Schibli,R.,and Ametamey,S.M.(2013)Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3′-Aza-2′-[18F]fluorofolic Acid:ANovel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting.Bioconjug.Chem.24,205-214)。
但是，虽然已知的18F叶酸放射药剂显示有希望的结果，仍然需要化合物，其显示高FR-alpha-特异性和适于一般临床应用并且能以有效和多样的方式获得，具有高放射化学收率。
申请人现在发现用异构体纯的18F-标记的四氢叶酸衍生物比如3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-甲基四氢叶酸盐/酯的生理学(6R)-形式能够实现对FR-α-阳性组织的高特异性。
异构体纯的18F-标记的四氢叶酸衍生物比如3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-甲基四氢叶酸盐/酯(其是还原的生理学叶酸形式的衍生物)以高亲和力结合至FR并且展示是各自氧化的叶酸衍生物50-倍的FR-α高选择性。在含FR-β的炎性位点选择性靶向与肿瘤有关的FR-α而非FR-β的PET示踪剂提供显著的灵敏度和特异性。从非特异性PET示踪剂的图片推导选择性靶向与肿瘤相关的FR-α的PET示踪剂的效果，人们能够获得含FR-β的炎性位点的信息。
从而，本发明涉及异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂的用途，其用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或者监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗。
发明概要
本发明在第一方面涉及异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂的用途，其中叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换，其用于在体外或体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗。
优选，叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的18F-标记的四氢叶酸放射药是其异构体纯的(6S)-或(6R)-形式。
甚至更优选，叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂是异构体纯的18F-标记的5-甲基-(6S)-四氢叶酸放射药剂或异构体纯的18F-标记的5-甲基-(6R)-四氢叶酸放射药剂，其中叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换。
在特定实施方式中，叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂是异构体纯的3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-甲基-(6S)-四氢叶酸盐/酯或异构体纯的3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-甲基-(6R)-四氢叶酸盐/酯。
在一种特定实施方式中，提供式Ia或Ib化合物，其用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗
其中
R1、R2相互独立地是H或直链或支化的C1-C6烷基，和
R3、R4相互独立地是H，甲酰基或甲基，
或其药学上可接受的盐。
在优选实施方式中，R1、R2相互独立地是H或直链或支化的C1-C6烷基，和R3是甲基，和R4是H，或其药学上可接受的盐。
更特别地，本发明涉及具有式IIa或IIb的化合物，用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗
其中
R1、R2相互独立地是H，或C1-C12烷基，
或其药学上可接受的盐。
在优选实施方式中，本发明涉及具有式IIIa或IIIb的化合物，用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗
或其药学上可接受的盐。
在特定实施方式中，叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂涉及碱金属盐或碱土金属盐，优选钠、钾、镁或钙盐。
在又一方面，本发明涉及叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂(或其药物组合物)的用途，其用于诊断或治疗、优选诊断或治疗癌症或炎性和自身免疫性疾病。
在特定实施方式中，本发明涉及叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂(或其药物组合物)的用途，其用于在受试者中监测癌症或炎性和自身免疫性疾病治疗，包括下述步骤：(i)向有需要的受试者以诊断成像量给予叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂和与之组合的治疗活性剂，和(ii)通过检测来自所述至少一种化合物的信号用PET进行诊断成像，从而跟踪癌症或炎性和自身免疫性疾病治疗的过程。
在甚至又一方面，本发明涉及叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的(6S)-或(6R)-四氢叶酸放射药剂(或其药物组合物)的用途，其用于表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像。
附图说明
图1：前体N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氯-5-甲基四氢叶酸二叔丁基酯6S-3和6R-3(A)和保护的参照物N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氟-5-甲基四氢叶酸二叔丁基酯6S-2和6R-2(B)的手性HPLC色谱图。
图2：6S-和6R-5-MTHF(A)和6R-1和6S-1(B)的CD谱图，从400nm至200nm测量。
图3：6S-5-MTHF和6S-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF(A)以及6R-5-MTHF和6R-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF(B)的CD谱图的重叠图。
图4：在注射6S/6R-[18F]1之后60分钟，参照放射性示踪剂6S/6R-[18F]1(A)、肝样品(B)、血浆(C)和尿样品(D)的放射性-UPLC色谱图。保留时间在峰上方指出。
图5：6R-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(A)和6S-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(B)在某些所选组织中于30、60和90分钟p.i.的放射性蓄积。
图6：肿瘤与肾(A)，肿瘤与血液(B)和肿瘤与肝(C)中6R-[18F]1和6S-[18F]1比率的比较。
图7：在注射18F-6R-5Me-AzaTHF之后于30、60和90分钟的组织分布特征。
图8：在注射18F-6S-5Me-AzaTHF之后于30、60和90分钟的组织分布特征。
图9：18F-6R-5Me-AzaTHF(6R-形式)和18F-6S-5Me-AzaTHF(6S-形式)组织分布特征的比较。
图10：18F-6R-5Me-AzaTHF(6R-形式)和18F-6S-5Me-AzaTHF(6S-形式)肿瘤与血液比率的比较。
图11：18F-6R-5Me-AzaTHF(6R-形式)和18F-6S-5Me-AzaTHF(6S-形式)肿瘤与肝比率的比较。
图12：18F-6R-5Me-AzaTHF(6R-形式)和18F-6S-5Me-AzaTHF(6S-形式)肿瘤与肾比率的比较。
图13：携带KB肿瘤的小鼠在注射18F-6R-氮杂-5MeTHF之后1小时、2小时和3小时的PET/CT扫描。(Tu＝肿瘤异种移植物，Li＝肝，Ki＝肾，白色箭头＝胆囊)。
图14：携带KB肿瘤的小鼠在注射18F-6R-氮杂-5MeTHF之后1小时、2小时和3小时的PET/CT扫描。(Tu＝肿瘤异种移植物，Li＝肝，Ki＝肾，白色箭头＝胆囊)。
图15：携带KB肿瘤的小鼠在注射过量叶酸随后18F-6R-氮杂-5MeTHF之后1小时、2小时和3小时的PET/CT扫描。(Li＝肝，白色箭头＝胆囊)。
图16：携带KB肿瘤的小鼠在注射18F-6S-氮杂-5MeTHF之后1小时、2小时和3小时的PET/CT扫描。(Tu＝肿瘤异种移植物，Ki＝肾，SG＝唾腺，白色箭头＝胆囊，绿色箭头＝脉络丛)。
图17：携带KB肿瘤的小鼠在注射18F-6S-氮杂-5MeTHF之后1小时、2小时和3小时的PET/CT扫描。(Tu＝肿瘤异种移植物，Ki＝肾，SG＝唾腺，白色箭头＝胆囊，绿色箭头＝脉络丛)。
图18：携带KB肿瘤的小鼠在注射过量叶酸随后18F-6S-氮杂-5MeTHF之后1小时、2小时和3小时的PET/CT扫描。(Bl＝膀胱，白色箭头＝胆囊)。
图19：携带IGROV-1(人卵巢癌细胞系)肿瘤的小鼠在注射18F-氮杂Fol、18F-5Me-6S-氮杂-THF和18F-5Me-6R-氮杂-THF(Tu＝肿瘤异种移植物，Ki＝肾，SG＝唾腺，白色箭头＝胆囊，绿色箭头＝脉络丛)之后1小时的PET/CT扫描。
图20：携带IGROV-1(人卵巢癌细胞系)肿瘤的小鼠在注射18F-氮杂Fol、18F-5Me-6S-氮杂-THF和18F-5Me-6R-氮杂-THF之后2小时的PET/CT扫描(Tu＝肿瘤异种移植物，Ki＝肾，SG＝唾腺，白色箭头＝胆囊，绿色箭头＝脉络丛)。
图21：携带IGROV-1(人卵巢癌细胞系)肿瘤的小鼠在注射18F-氮杂Fol、18F-5Me-6S-氮杂-THF和18F-5Me-6R-氮杂-THF之后3小时的PET/CT扫描(Tu＝肿瘤异种移植物，Ki＝肾，SG＝唾腺，白色箭头＝胆囊，绿色箭头＝脉络丛)。
图22：FR-阳性KB细胞在37℃温育1、2或3小时的6R-[18F]1(A)或6S-[18F]1(B)摄取和内化。用过量叶酸进行阻断研究。
图23：18F-氮杂Fol的总摄取和内化，使用RT16(FR-α)和D4(FR-β)细胞系。
图24：6R-3-氮杂-2-18F-5-MTHF的总摄取和内化，使用RT16(FR-α)和D4(FR-β)细胞系。
图25：6S-3-氮杂-2-18F-5-MTHF的总摄取和内化，使用RT16(FR-α)和D4(FR-β)细胞系。
图26：还原的18F-叶酸盐和未氟化的异构体的结构和立体化学命名。
发明详述
本发明在第一方面涉及叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂的用途，其用于在体外或体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或者用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗。
术语"四氢叶酸"或"四氢叶酸盐/酯"如本文所用包含基于5,6,7,8-四氢叶酸结构的化合物。四氢叶酸盐/酯(缩写THF)作为5-甲基-THF本身与其氧化形式比如叶酸的区别是在C6额外手性中心，其导致异构(6S)-和(6R)-形式。在叶酸和如本文所定义的四氢叶酸盐/酯中的谷氨酸部分的α-碳呈天然构型。根据本发明使用的化合物优选呈异构体纯形式。
四氢叶酸盐/酯如本文所用包含四氢叶酸的酸形式以及各自的酯形式。
术语"异构体纯"和"立体异构体纯"如本文所用意指本发明化合物具有的一种形式相对另一种形式[(6R)-形式相对(6S)-形式或(6S)-形式相对(6R)-形式]异构体过量大于约80％，优选大于约90％，优选大于约95％，更优选大于约97％，甚至更优选大于约99％或更多，和最优选多至100％，其中剩余的量可以是一种或多种其它异构体。
在一种特定实施方式中，提供通式Ia或Ib的18F-标记的四氢叶酸放射药剂或其药学上可接受的盐，用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗
其中R1、R2相互独立地是H或直链或支化的C1-C6烷基，和R3、R4相互独立地是H，甲酰基或甲基。
术语"烷基"在单独或组合使用是指直链或支化的含有所指数量C原子、一般含有1至6个、优选1至4个碳原子的烷基，比如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基等。
药学上可接受的盐能够是碱金属盐或碱土金属盐，优选钠、钾、镁或钙盐，或者还能够是酸的盐比如硫酸盐或磺酸盐、优选硫酸盐。
从而，在特定实施方式中，本发明涉及式IIa或IIb化合物或其药学上可接受的盐,用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗，
其中R1、R2相互独立地是H或C1-C12烷基。
甚至更特别本发明涉及式IIIa或IIIb化合物或其药学上可接受的盐，用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗
根据发现，叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂令人惊讶地显示可比拟的与FR的结合亲和力。
甚至更令人惊讶的是，发现叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂显示不同的生物分布。由于体外数据确实显示对两种异构体相似的FR-亲和力，这是高度出人意料的。
叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂在肿瘤摄取、生物分布和体内稳定性方面优于相应的基于氧化叶酸的衍生物。
总的来说，叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂很特异性地蓄积在FR阳性组织中。这种蓄积是无法预期的，原因是18F-标记的四氢叶酸放射药剂实际上经由载体系统运输至组织中。特别是(6S)-形式在这方面确实显示氧化形式所展示的行为。
所公开的显著改善的肿瘤与肾比率，特别是对于叶酸盐/酯结构中的苯基已用18F-标记的N-杂环替换的18F-标记的四氢叶酸放射药剂的(6R)-形式，是高度出人意料且无法预期的。
在又一方面，本发明涉及表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像方法，所述方法包括以诊断成像量给予至少一种根据式Ia、Ib、IIa、IIb、IIIa或IIIb的化合物和获得所述细胞或细胞群体的诊断图像的步骤。
在又一方面本发明提供异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂的用途，其用于向需要诊断成像的受试者方便且有效地给药。
因此，本发明提供表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像的方法，所述方法包括以诊断成像量给予至少一种本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂，并获得所述细胞或细胞群体的诊断图像的步骤。
所述成像可以对表达叶酸受体的细胞或细胞群体在体外或离体(活体检查)或体内的情况下进行。典型的细胞或细胞群体过表达叶酸受体-α是上皮癌类型比如卵巢，子宫，肾，乳腺，肺和结直肠癌。
因此，本发明提供体外检测组织样品中的表达叶酸受体的细胞的方法，其包括在足以允许结合发生的时间和条件下将所述组织样品与有效量的至少一种本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂接触，并通过PET成像检测该结合。
在又一方面本发明提供本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂用于方便且有效地给药至有需要的受试者以进行诊断成像或监测癌症治疗和炎性疾病和自身免疫病的治疗的用途。
在又一方面本发明提供同时诊断和治疗的方法，包括以诊断有效量向有此需要的受试者给予与治疗活性剂组合的至少一种本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂，并获得所述组织的诊断图像以跟踪治疗步骤的过程。
本发明方法的受试者优选是哺乳动物，比如动物或人类，优选人类。
剂量取决于所希望效果的性质，比如诊断或治疗的形式，治疗的类型和频率，诊断仪器设备，制剂应用形式，和接受者的年龄、体重、营养和病况，同时治疗的类型(如果存在)。
然而，最优选的剂量能够根据单独受试者定制，对此本领域技术人员可以理解并且不加过度试验即可确定。这一般牵涉标准剂量的调整，例如，如果患者具有低体重则降低剂量。
治疗能够以在最佳量以下的较小量开始，可以将其增加以便实现最佳效果。PET扫描仪中的成像程序在给药放射性示踪剂之后数分种至2-4小时发生。该程序的制定取决于成像靶标和放射性示踪剂的动力学以及所希望的信息。
本发明异构体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂的优选的给药途径是经肠胃外例如静脉内注射。
用于注射的适宜形式包括本发明的上述对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂的无菌水溶液或分散液。一般地，将放射药剂配制在生理学缓冲剂溶液中。
对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂通过本领域承认的任意技术进行灭菌，包括但不限于，加入抗真菌药例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等的抗菌制剂。优选它们在给药之前进行无菌过滤，从而不需要额外的灭菌试剂。
对于待注射的溶液，优选的单元剂量是约0.01ml至约10ml。在肠胃外给药之后，可以进行器官或肿瘤的体内成像，如果希望，在已将放射标记试剂给予至受试者以使得足量的经给予剂量在特定靶标区域聚集之后的数分钟至2-4小时内进行。
本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂还可以用于体外检测取自受试者的组织活检中的表达叶酸受体的细胞。因此，在又一实施方式中本发明提供体外检测组织样品中的表达叶酸受体的细胞例如肿瘤细胞的方法，其包括在足以允许结合发生的时间和条件下将所述组织样品与有效量的本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂接触，并通过成像技术检测上述结合。
样品能够通过技术人员已知的程序来收集，例如通过收集组织活检或体液，通过抽吸气管或肺样品等。
待测试的组织样品包括怀疑含有表达叶酸受体的细胞的任意组织比如肿瘤细胞、上皮细胞、肾、胃肠道或肝胆管系统等。样品能够例如用切片机进行切片以使得便于进行微观检查和观察。还能够在与本发明的18F-标记的四氢叶酸放射药剂之一温育之前或在其之后用适当固定剂固定样品以改善样品组织的组织学品质。
足以将本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂结合至细胞上的叶酸受体的时间和条件包括标准组织培养条件，也即能够在体外培养样品并与本发明复合物或组合物之一在生理学培养基中进行温育。该条件是技术人员所熟知的。另选地，能够固定样品，然后在等渗缓冲剂或生理学缓冲剂中与本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂温育。
对于全部应用方便的是，在将要使用它们的场所或其附近制备本发明的对映体纯的18F-标记的四氢叶酸放射药剂。
本文公开和要求保护的全部化合物和/或方法在本发明公开的前提下能够不加过度实验地制备和进行。本领域技术人员所明了的是在不背离本发明范围的前提下可以对本发明进行变化。本文提供实施例的目的是示例而非穷举；因此说明的实施例不应视为以任何方式限制本发明。
实施例
物质和方法
一般条件：
试剂和溶剂购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Acros Organis且不加纯化地使用。构造单元购自ABCR-Chemicals,Apollo Scientific,Fluka-Chemie and Merck&Cie(Schaffhausen,Switzerland)。6R-10-甲酰基-5-甲基四氢蝶酸(6R-10-甲酰基-5-MTHP)提供自Merck&Cie(Schaffhausen,Switzerland)。这些构造单元的质量控制用1H-NMR，13C-NMR，cosygp和HR-MS进行。
进行快速色谱法、转移反应混合物、萃取和洗涤过程的溶剂直接购自ETH的燃料贮库。
分析方法：
核磁共振谱在Bruker 400或500MHz光谱仪上记录，用相应溶剂信号作为内标。相对四甲基硅烷(0.00ppm)以百万分之一(ppm)报告化学位移。耦合常数值(J)以赫兹(Hz)提供；下述缩写在该部分用于描述1H NMR：单峰(s)，二重峰(d)，三重峰(t)，四重峰(q)，多重峰(m)，双二重峰(dd)，双重双二重峰(ddd)和宽信号(bs)。复杂多重峰的化学位移以其出现范围提供。
高分辨率质谱图(HR-MS)由the Laboratorium für Organische Chemie at ETHZürich的MS服务在Varian IonSpec Ultima MALDI-FT-ICR或Bruker Daltonics Ultra-Flex II MALDI-TOF上记录。反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-丙烯基亚基]丙二腈(DCTB)和3-羟基吡啶-2-羧酸(3-HPA)充当MALDI质谱基质。ESI质谱图用Bruker FTMS 4.7T BioAPEXII(ESI)记录。
制备型HPLC用Merck-Hitachi系统进行，配有D7000界面、L-7400UV检测器和L-7150泵，用Ultimate XB-C18柱(150x 21.2mm，5μm)(Ultisil，Welch Materials)，流速15mL/min(280nm)。
分析型HPLC用Merck-Hitachi系统进行，配有D-7000界面、L-7400UV检测器和L-7100泵，用sunfire C18柱(4.6x 150mm，5μm)。如果没有另外描述，反应控制经由分析型HPLC进行，使用10mM NH4HCO3溶液(溶剂A)和MeCN(溶剂B)和下述梯度：0-30分钟：100-60％A，30-35分钟：60％A，35-36分钟：60-100％A，36-40分钟：100％A，流速1mL/min，于280nm。
半制备型HPLC用Merck-Hitachi系统进行，配有D-7000界面、L-7400UV检测器和L-7100泵，用sunfire C18柱(10x 150mm，5μm)，用10mM NH4HCO3缓冲剂(溶剂A)和MeCN(溶剂B)作为溶剂系统，流速4mL/min，于280nm。
分析型放射性-HPLC在Agilent 1100系列HPLC系统上进行，配有100μL-lop和GabiStar放射性探测器(Raytest)。使用分析型Phenomenex Gemini C18柱(4.6x 250mm，5μm，无前置柱)，流速1mL/min，于280nm。分析型HPLC用10mM NH4HCO3(溶剂A)和MeCN(溶剂B)作为溶剂系统进行，梯度如下：0-20分钟：95-60％A，20-25分钟：60％A，25-26分钟：60-95％A，26-30分钟：95％A。
反应控制用放射性超效液体色谱法进行(放射性-UPLC，Waters)，使用AcquityUPLC BEH C18柱(2.1x 50mm，1.7μm，Waters)和所附的重合检测器(FlowStar LB513，Berthold)和用10mM NH4HCO3溶液(溶剂A)和MeCN(溶剂B)作为溶剂系统，梯度如下：0-0.3分钟90％A，0.3-3.0分钟90％-50％A，3.0-3.1分钟：50-20％A，3.1-3.5分钟：20％A，3.5-3.6分钟：20-90％A，3.6-4.0分钟：90％A，流速0.6mL/min，于280nm。
放射化学：制备干燥的[18F]氟化物：
无-载体-加入的[18F]氟化物通过在18/9回旋加速器(IBA，比利时)上通过18MeV质子束辐射充入了同位素富集的[18O]H2O(930μL，97％，Cambridge同位素实验室)的液体靶标获得。放射性物(36-45GBq)通过连续氦流转移至合成热室。[18F]氟化物水溶液捕集在Sep-Pak Light Accell Plus carb QMA柱(Waters)上，不加预调理。洗脱用下述进行：K2CO3(1.2mg，8.7μmol)和Kryptofix(10mg，26.6μmol)或者Cs2CO3(2.8mg，8.6μmol)和Kryptofix(5mg，13.3μmol)在H2O(0.6mL)和MeCN(1.4mL)混合物中的溶液。洗脱物收集于密封的Wheaton反应器(5mL)和在95℃和温和氮气流下减压蒸发溶剂10分钟。随后，三次加入MeCN(1mL)和在95℃在3分钟内蒸发至干。最终，在95℃施加5分钟无氮气流的完全真空。
生物分布研究：
生物分布研究在细胞接种之后2周进行。18F-叶酸放射性示踪剂(～5MBq/小鼠)以体积100μL注射入尾部侧静脉。在给药放射性示踪剂之后，动物于30分钟、60分钟和90分钟处死。收集、称量所选组织和器官，用γ-计数器测量放射性。结果列为所注射的放射性/克组织质量的百分比(％IA/g)，用同时测量的定义体积的最初注射溶液计数，获得衰减校正值。
PET/CT成像研究：
小鼠以与生物分布研究相同的方式制备。工作台型的临床前PET扫描仪(Genisys8,Sofie Biosciences,U.S.and Perkin Elmer,U.S.)用于小鼠的PET/CT扫描。能量窗设为150-650keV。小鼠经静脉内注射18F-放射性示踪剂(～5MBq，100μL)。在持续10分钟的扫描期间，小鼠用异氟烷和氧的混合物麻醉。在注射18F-放射性示踪剂之后于1小时、2小时和3小时用G8采集软件(版本2.0.0.10)进行扫描。图像用最大似然期望最大化法(MLEM)重建。为了展示PET/CT图像，调节图像比例以允许肿瘤组织和肾的最佳造影。(切割大约10％的较低比例)。
实施例1：6S-和6R-N2-乙酰基-3′-氮杂-2’-氟/2′-氯-5-甲基四氢叶酸二叔丁基酯的合成和分离(手性HPLC)
6S-和6R-N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氯-5-MTHF-二叔丁酯和6S-和6R-N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF-二叔丁酯1:1非对映体混合物的合成实现如下：与描述于文献("Reactions of Sodium Borohydride in Acidic Media.I.Reduction of Indoles andAlkylation of Aromatic Amines with Carboxylic Acids",G.W.Gribble,P.D.Lord,J.Skotnicki,S.E.Dietz,J.T.Eaton,J.L.Johnson,J.Am.Chem.Soc.1974,96,p.7812)的一般方法类似用甲基叔丁基醚和四氢呋喃作为溶剂，将N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氯-叶酸-二叔丁酯和N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氟-叶酸-二叔丁酯还原性甲基化(方案1a)。产品用LC-MS，1H-NMR和HPLC表征。N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氯-叶酸-二叔丁酯和N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氟-叶酸-二叔丁酯的合成根据WO 2013/167653实现。将两种混合物的两种非对映异构体手性分离为方案1b公开的化合物实现如下：使用Reprosil 100手性-NR HPLC柱，正相运行(等度，己烷/异丙醇1:1，图1)。6R-N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氟-5-甲基四氢叶酸二叔丁基酯(6R-2)是指于14.0分钟首先洗脱的非对映异构体，而6S-N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氟-5-甲基四氢叶酸二叔丁基酯(6S-2)是指于17.5分钟第二洗脱的异构体。
实施例2：合成6R-3′-氮杂-2′-氟-5-甲基四氢叶酸
纯的非对映体6R-2和6S-2在手性分离之后获得(图1)和用作合成6R-1和6S-1的原料。在丙酮中将6R-2和6S-2酸性脱保护，在纯化之后提供6R-和6S-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF6R-1和6S-1，化学收率分别81％和87％(方案1c)。
a(i)4M HCl，丙酮，70℃，1小时。
方案1c
将6R-2(7.00mg，11.1μmoL)溶于丙酮(200μL)和4M HCl(500μL)，在70℃搅拌1小时(方案1b)。在反应完成之后，用4M NaOH中和反应完成，产品通过半制备型HPLC纯化。冻干产品级分提供6R-γ-1，是白色固体，87％收率(4.62mg)，高化学和非对映体纯度>95％。
实施例3：合成6S-3′-氮杂-2′-氟-5-甲基四氢叶酸
将6S-2(8.00mg，12.6μmoL)溶于丙酮(200μL)和4M HCl(500μL)，在70℃搅拌1小时(方案1b)。在反应完成之后，用4M NaOH中和溶液，产品通过半制备型HPLC纯化。冻干产品级分提供6S-γ-1，是白色固体，81％收率(4.96mg)，高化学和非对映体纯度>95％。
实施例4：通过圆二色性(CD)确定两种参照非对映异构体(6R-1和6S-1)的绝对构型
记录6S-和6R-5-MTHF和两种参照化合物6R-和6S-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF(6R-1和6S-1)的CD谱图(图2A和2B)。对于两对叶酸各自的两种相应的6R-和6S-非对映异构体获得相反的谱图。6S-和6R-5-MTHF的谱图充当参照谱图，原因是这两种物质的立体化学是已知的。文献中报告，蝶呤显示345nm周围的典型吸收带和于280nm的第二带。这两个典型吸收带也在全部四种记录的CD谱图中可视。能够进行6S-和6R-5-MTHF的参照谱图与两种参照非对映异构体6R-和6S-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF的谱图的相关对比(图3)。由于6R-5-MTHF和6R-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF于310nm的峰都是负值而于280nm的峰都是正值，能够假定6R-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF是6R-异构体(图3A)，原因是这些吸收源自携带立构中心的蝶呤。能够进行6S-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF和6S-5-MTHF的相同相关对比(图3B)，其中于310nm的峰是正值而于280nm的峰均是负值。基于这些结果能够得出结论，6S-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF在6位是S-构型。
实施例5：制备6S-和6R-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(6S-和6R-[18F]1)a
a(i)[18F]CsF-K2.2.2，DMSO，160℃，10分钟；(ii)4M HCl，70℃，10分钟。
6S-和6R-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF的放化合成与3′-氮杂-2′-[18F]氟叶酸的放化合成类似地进行，后者预先描述于文献(Betzel et al,(2013)Radiosynthesis andPreclinical Evaluation of 3′-Aza-2′-[18F]fluorofolic Acid:A Novel PETRadiotracer for Folate Receptor Targeting.Bioconjug.Chem.24,205-214)。将前体6R-或6S-N2-乙酰基-3′-氮杂-2′-氯-5-MTHF二叔丁酯(6R-或6S-2，2.50mg，3.85μmol)溶于无水DMSO(300μL)并加至共沸干燥的[18F]氟化物-穴状复合物(30-35GBq)。反应混合物在160℃加热10分钟。然后，让溶液冷却5分钟并加H2O(5mL)。将溶液通过Sep-Pak Plus tC18柱(Waters，用5mL MeOH、随后10mL H2O预调理)从而捕集中间体6R-或6S-[18F]2。未反应的[18F]氟化物通过用H2O(8mL)冲洗柱体除去。通过使MeCN(2.5mL)流经柱体将标记的中间体6R-或6S-[18F]2洗脱至又一密封的Wheaton反应器(5mL)中。在90℃减压和氮气流下将MeCN蒸发至接近干燥。保护基团的裂解通过将4M HCl溶液(1.25mL)加入反应小瓶和在70℃加热10分钟进行，提供6R-或6S-[18F]1。让反应混合物冷却2分钟和加入含有50mg/mL Na-(+)-L-抗坏血酸盐(2.5mL)和4M NaOH(1.0mL)的10mM磷酸钠缓冲剂pH 7.4从而分别稳定化产品和中和酸性溶液。产品的纯化通过半制备型放射性-HPLC实现。收集产品级分和通过无菌滤器进入无菌和无热原小瓶。6R-或6S-[18F]1的质量控制在分析型放射性-HPLC上进行。在合成终点，获得350-1600MBq的最终放射性示踪剂(1-5％d.c.收率)。SA的范围是46-250GBq/μmol而放射化学纯度大于95％。
半制备型放射性-HPLC纯化进行如下：使用0.1％EtOH/10mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH7.4)和50mg/mL的Na-(+)-L-抗坏血酸盐(溶剂A)和40％EtOH/10mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH7.4)和50mg/mL的Na-(+)-L-抗坏血酸盐(溶剂B)作为溶剂系统，梯度为0-15分钟：100-85％A，15-40分钟：85％A，和流速4mL/min(280nm)。分析型放射性-HPLC进行如下：使用50mMNaH2PO4(pH 6.5)(溶剂A)和30％MeCN/50mM NaH2PO4(pH 8.0)(溶剂B)作为溶剂系统，梯度为0-14分钟：100-45％A，14-17分钟：45-0％A，17-25分钟：0％A，25-26分钟：0-100％A，26-32分钟：100％A，和流速1mL/min(280nm)。
实施例6：分布系数的确定
6S-[18F]1和6R-[18F]1的分布系数(logD7.4)用文献(表1)报告的振摇烧瓶方法确定(Boss et al,(2015)Comparative Studies of Three Pairs of α-and γ-ConjugatedFolic Acid Derivatives Labeled with Fluorine-18.Bioconjug.Chem.acs.bioconjchem.5b00644；Wilsonet al,(2001)An admonition when measuring the lipophilicityof radiotracers using counting techniques.Appl.Radiat.Isot.54,203-208)。简言之，在室温下将放射性示踪剂加入磷酸缓冲剂(500μL，pH 7.4)和n-辛醇(500μL)的混合物。在高架摇动器中将样品振摇15分钟和于5000rpm离心3分钟分开两相。将两相的等分试样(50μL)加入离心管，然后在γ-计数器(Wizard，PerkinElmer)中分析。分配系数表示为在n-辛醇相与磷酸缓冲剂相之间放射性浓度(cpm/mL)的比例。数值代表两个独立实验六次重复的平均值±标准偏差。
表1：叶酸和碟酸(pteroates)的LogD7.4值概览。
化合物 logD<sub>7.4</sub>
6S-[<sup>18</sup>F]1 -4.6±0.1
6R-[<sup>18</sup>F]1 -4.6±0.1
实施例7：体外表征
非放射性的参照化合物6R-1和6S-1的结合亲和力用KB细胞在[3H]叶酸替代测试中确定。结果(表2)显示，两种参照非对映异构体6R-1和6S-1对FR-α具有相似的高亲和力并且类似6S-和6R-5-MTHF的值。叶酸在相同实验条件下的IC50值是0.6±0.1nM，而3′-氮杂-2′-[18F]氟叶酸展示IC50值1.4±0.5nM。与氧化形式相比，相应还原的氮杂-叶酸衍生物6R-1和6S-1显示低约17-倍的FR-α亲和力。
表2：6R-和6S-3′-氮杂-2′-氟-5-MTHF(6R-1和6S-1)与6R-和6S-5-MTHF和叶酸的FR-α体外结合亲和力数据比较。(n＝3)。
实施例8：细胞摄取和内化
为了研究FR-特异性细胞摄取和内化，6R-[18F]1和6S-[18F]1的细胞摄取和内化用FR-阳性KB细胞进行。对于两种非对映异构体的细胞摄取随时间恒定增加，在37℃温育3小时之后引起约60％(按0.3mg蛋白质计算)总添加放射性的摄取(图22)。发现内化的活性对6R-[18F]1为约8％和对6S-[18F]1高约两倍(16％)。6R-[18F]1和6S-[18F]1显示高体内稳定性。在放射性示踪剂30分钟p.i.的样品中仅发现未变化的母体化合物。6R-和6S-[18F]1甚至比在肝中检测到放射性代谢物的氧化的叶酸示踪剂更稳定。通过将放射性示踪剂和过量叶酸共同温育的FR-α阻断引起小于0.2％的放射性叶酸摄取的抑制。
实施例9：代谢物研究
将叶酸放射性示踪剂6S/6R-[18F]5(1:1比率，53.7-52.3MBq；□0.62-1.15nmol)经静脉内注射入小鼠以便确定示踪剂的体内稳定性。注射示踪剂后60分钟处死小鼠，收集并分析血液、尿和肝。将含有10mg/mL 2-巯基乙醇和0.025％(v/v)氢氧化铵的冰冷甲醇加至血浆、匀化的肝和尿以便沉淀蛋白质。6在离心之后，血浆、肝和尿样品的上清液通过放射性-UPLC分析(图4)。样品分析仅揭示在放射性示踪剂注射之后60分钟的未变化的母体示踪剂6S/6R-[18F]1。
实施例10：基于18F的还原叶酸：6R-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(6R-[18F]1)和6R-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(6S-[18F]1)的体内研究
用15只携带KB肿瘤的小鼠在各自注射6R-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(6R-[18F]1)和6S-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(6S-[18F]1)之后进行生物分布研究。三个时间点(在注射放射性示踪剂之后30分钟、60分钟和90分钟)的值提供于表1和表2。对于阻断实验，小鼠在示踪剂之前10分钟接受100μg叶酸，并在60分钟p.i.处死。
表1.
6R-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(6R-[18F]1)在携带KB肿瘤的小鼠中在注射后不同时间点的生物分布。
所显示的数值代表来自3到4只动物的数据的平均值±S.D.。
表2.
6S-3′-氮杂-2′-[18F]氟-5-MTHF(6S-[18F]1)在携带KB肿瘤的小鼠中在注射后不同时间点的生物分布。
所显示的数值代表来自3到4只动物的数据的平均值±S.D.。
生物分布研究揭示6R-和6S-非对映异构体两者的高肿瘤摄取。在30分钟p.i.就已经观察到6R-[18F]1的13.3±1.80％IA/g和6S-[18F]1的11.13±0.90％IA/g的高肿瘤摄取(图5)。肿瘤摄取于90分钟p.i.随时间进一步增加至6R-异构体的23.9±2.74％IA/g和6S-异构体的19.2±4.16％IA/g。该值是得自氧化示踪剂3′-氮杂-2′-[18F]氟叶酸的放射性蓄积量(12.59±1.77％IA/g)的大约两倍。通过预注射叶酸有效阻断肿瘤摄取。肿瘤结合的特异性对R-和6S-异构体分别是85％和89％。在30分钟p.i.，在肝中发现6R-示踪剂(14.3±1.36％IA/g)与6S-示踪剂(8.10±1.16％IA/g)相比显著更高量的放射性。在90分钟p.i.，肝中的6R-异构体放射性摄取稍微增加(16.8±3.58％IA/g)，而S-异构体放射性水平降低(5.86±1.11％IA/g)。6R-异构体的脾摄取于30分钟p.i.就已经显著增加，并且于90分钟p.i.观察到6R-异构体(13.0±4.14％IA/g)与6S-异构体(1.82±0.49％IA/g)相比高7倍的摄取。与之相对，6S-[18F]1与6R-[18F]1相比于30分钟p.i.肾摄取显著更高(6R-形式：34.5±2.45％IA/g，6S-形式：42.5±2.73％IA/g)，并且对两种非对映异构体来说均随时间几乎保持不变(90分钟p.i.：6R-形式：29.8±7.46％IA/g，6S-形式：42.3±7.05％IA/g)。然而，与3′-氮杂-2′-[18F]氟叶酸(57.3±8.40％IA/g)相比两个值均显著更低。还观察到两种非对映异构体的唾腺摄取的显著差异，其中90分钟p.i.在唾腺中发现6S-异构体的量高3倍(6R-形式：7.31±1.17％IA/g，6S-形式：21.4±4.59％IA/g)。
6S-[18F]1的肿瘤/肾比率显著更低(30分钟p.i.：0.26±0.01％IA/g)并于90分钟p.i.增加至1.7倍的0.45±0.07％IA/g(图6)。与之相对，6R-[18F]1的肿瘤/肾比率于30分钟p.i.就已经0.39±0.05％IA/g并于90分钟p.i.增加至2.1倍的0.83±0.17％IA/g。因此6R-[18F]1的肿瘤/肾比率与6S-[18F]1和3′-氮杂-2′-[18F]氟叶酸相比分别高大约2倍和4倍。在全部研究时间点6S-异构体与6R-异构体相比的肿瘤/肝比率更高，原因是6S-[18F]1更低的肝摄取。因此，于90分钟p.i.观察到在肝中6R-[18F]1与6S-异构体相比高3倍的蓄积(6R-形式：16.8±3.58％IA/g，6S-形式：5.86±1.11％IA/g)。S-异构体在肝中更低的摄取从成像角度来看是有利的，原因是其会允许界定位置接近肝的FR-阳性肿瘤。对两种异构体来说肿瘤/血液比率随时间恒定增加，而6S-异构体的比率与6R-异构体相比显著更高。
在大多数有关的器官和组织中时间依赖性的组织分布示于图7和8。
两种18F-叶酸示踪剂在不同的器官和组织中的蓄积活性示于图9。
在注射各放射性示踪剂之后30分钟、60分钟和90分钟的肿瘤/背景比率示于图10-12。
实施例11：PET/CT成像研究
实验计划提供于表3中。
于注射放射性示踪剂后1h、2小时和3小时扫描的各小鼠的PET/CT图像(最大密度投影(MIPs))示于图13-18。
在1小时p.i.就已经观察对于两种放射性示踪剂的高KB肿瘤异种移植物摄取，对两种化合物来说于3h p.i.肿瘤以高强度非常好地可视化。对于6R-异构体主要观察到肝中的放射性蓄积，然而在3小时p.i.之后肝摄取几乎不可视。FR-阳性的肾在1小时p.i.用6R-[18F]1清楚地可视化，但是于3h p.i.几乎不可视。与之相对，在全部研究时间点观察到6S-[18F]1的高肾蓄积。另外，高放射性摄取在唾腺中明显。阻断研究通过在给予放射性示踪剂之前10分钟注射叶酸来进行，引起6R-[18F]1和6S-[18F]1在全部FR-阳性组织(KB肿瘤异种移植物、肾、唾腺和脉络丛)中显著降低的摄取(图15和图17)。
基于生物分布和PET成像结果能够得出结论，6S-异构体优选经由肾途径排泄，而6R-异构体显得主要经由肝胆管途径排泄。
实施例12：用FR-α和FR-β转染的CHO细胞(称为RT16和D4细胞)进行细胞摄取和内化研究
分别研究氧化的(18F-氮杂Fol)和还原的18F-叶酸(18F-5-Me-氮杂-THF的6S-异构体和6R-异构体)在表达FR-α和FR-β的D4和RT16细胞中的摄取和内化。两种细胞系均由Larry Matherly Wayne State University,Detroit,U.S.；Golani et al.,J Med Chem,2016,59,7856帮助提供。
在使用表达FR-α的RT16肿瘤细胞的情况下，全部3种18F-叶酸示踪剂(氧化和还原形式)显示相似的摄取，其范围是温育1小时之后的43-50％至温育3小时之后的56-66％。放射性示踪剂的内化级分在1小时之后达到8-10％和在温育3小时之后稍微增加多至9-12％。
在使用表达FR-β的D4细胞的情况下，18F-氮杂Fol和还原放射性示踪剂的6S-异构体的摄取在温育1小时之后达到大约70％和在温育3小时之后80％。18F-氮杂Fol和还原形式的6S-异构体的内化级分在温育1小时之后分别是20％和12％。在温育时间延长至3h的情况下这些数值稍微增加。然而，使用这种D4细胞揭示仅3％的还原叶酸放射性示踪剂(6R-异构体)被摄取而约1％被内化。在温育额外2小时之后未观察到变化。
在使用RT16(FR-α)细胞的情况下以及在使用D4细胞(FR-β)细胞的情况下观察到18F-氮杂Fol和放射性示踪剂的还原形式(6S-异构体)的显著摄取(图23)。还原叶酸的6R-异构体显示向RT16细胞中更高的摄取，而向D4细胞中的摄取很低，这意味着FR-α-选择性(图24和图25)。这些结果符合6R-异构体(相应于还原叶酸的天然形式，称为6S-5Me-THF)选择性结合FR-α的假设。

Claims (13)

1.式Ia或Ib化合物用于在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像或用于监测癌症或炎性和自身免疫性疾病及其治疗
其中
R1、R2相互独立地是H或直链或支化的C1-C6烷基，和
R3、R4相互独立地是H，甲酰基或甲基，
或其药学上可接受的盐。
2.用于根据权利要求1的用途的化合物，其中
R1、R2相互独立地是H或直链或支化的C1-C6烷基，
R3是甲基，和
R4是H，
或其药学上可接受的盐。
3.用于根据权利要求1的用途的权利要求1的化合物，具有式IIa或IIb
其中
R1、R2相互独立地是H，或C1-C12烷基，
或其药学上可接受的盐。
4.用于根据任一前述权利要求的用途的化合物，具有式IIIa或IIIb
或其药学上可接受的盐。
5.用于根据任一前述权利要求的用途的化合物，具有大于99％的立体异构纯度；优选具有大于99.5％的立体异构纯度。
6.用于根据任一前述权利要求的用途的化合物，其中药学上可接受的盐是碱金属盐或碱土金属盐，优选钠、钾、镁或钙盐。
7.用于表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像的方法，所述方法包括以诊断成像量给予至少一种根据权利要求1至6的化合物，并且获得所述细胞或细胞群体的诊断图像的步骤。
8.根据权利要求7的方法，其中对在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体进行所述诊断成像。
9.根据权利要求7或8的方法，其中诊断成像是对人卵巢癌细胞进行的。
10.体外检测在组织样品中表达叶酸受体的细胞的方法，其包括在足够的时间和条件下将所述组织样品与有效量的根据权利要求1至6的化合物接触以允许结合发生，并通过比如放射自显影术等的技术来检测上述结合。
11.诊断成像或检测受试者的方法，其包括以下步骤：(i)以诊断成像量给予至少一种根据权利要求1至6的化合物，和(ii)通过检测来自所述至少一种化合物的信号用PET进行诊断成像。
12.在受试者中监测癌症和炎性疾病和自身免疫病的治疗的方法，其包括以下步骤：(i)向有此需要的受试者给予与治疗活性剂组合的诊断成像量的至少一种根据权利要求1至6的化合物，和(ii)通过检测来自所述至少一种化合物的信号用PET进行诊断成像以跟踪癌症和炎性疾病和自身免疫病的治疗过程。
13.权利要求1至6的方法与诊断或治疗癌症或者炎性疾病和自身免疫病的任何其它方法的组合应用。
CN201880018678.9A 2017-03-20 2018-03-19 异构体纯的18f-标记的四氢叶酸盐/酯 Active CN110431141B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17161884.6 2017-03-20
EP17161884 2017-03-20
PCT/EP2018/056806 WO2018172243A1 (en) 2017-03-20 2018-03-19 Isomerically pure 18f-labelled tetrahydrofolates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110431141A true CN110431141A (zh) 2019-11-08
CN110431141B CN110431141B (zh) 2022-12-30

Family

ID=58387756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880018678.9A Active CN110431141B (zh) 2017-03-20 2018-03-19 异构体纯的18f-标记的四氢叶酸盐/酯

Country Status (16)

Country Link
US (1) US12023390B2 (zh)
EP (1) EP3601288B1 (zh)
JP (1) JP7204662B2 (zh)
KR (1) KR102648945B1 (zh)
CN (1) CN110431141B (zh)
AU (1) AU2018237784B2 (zh)
CA (1) CA3057042A1 (zh)
DK (1) DK3601288T3 (zh)
EA (1) EA201992180A1 (zh)
ES (1) ES2893303T3 (zh)
IL (1) IL269059B (zh)
PL (1) PL3601288T3 (zh)
PT (1) PT3601288T (zh)
SG (1) SG11201908679QA (zh)
WO (1) WO2018172243A1 (zh)
ZA (1) ZA201906877B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009103333A1 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Gnosis S.P.A. Process for the diastereoisomeric resolution of 5-methyltetrahydrofolic acid
US20130034496A1 (en) * 2011-08-04 2013-02-07 University Of Iowa Research Foundation Positron emission tomography tracer
CN104379585A (zh) * 2012-05-08 2015-02-25 默克及其合伙人公司 18f-标记的叶酸/抗叶酸剂类似物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5693950B2 (ja) 2007-04-11 2015-04-01 メルク エ カンパニー １８ｆ標識葉酸

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009103333A1 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Gnosis S.P.A. Process for the diastereoisomeric resolution of 5-methyltetrahydrofolic acid
US20130034496A1 (en) * 2011-08-04 2013-02-07 University Of Iowa Research Foundation Positron emission tomography tracer
CN104379585A (zh) * 2012-05-08 2015-02-25 默克及其合伙人公司 18f-标记的叶酸/抗叶酸剂类似物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THOMAS BETZEL等: "Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3′-Aza-2′‑[18F]fluorofolic Acid: A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2893303T3 (es) 2022-02-08
WO2018172243A1 (en) 2018-09-27
CN110431141B (zh) 2022-12-30
AU2018237784B2 (en) 2022-04-21
JP2020511477A (ja) 2020-04-16
CA3057042A1 (en) 2018-09-27
PL3601288T3 (pl) 2021-11-08
EP3601288A1 (en) 2020-02-05
IL269059A (en) 2019-11-28
EP3601288B1 (en) 2021-04-21
US12023390B2 (en) 2024-07-02
KR20190130607A (ko) 2019-11-22
EA201992180A1 (ru) 2020-04-23
ZA201906877B (en) 2021-06-30
PT3601288T (pt) 2021-07-20
US20200306390A1 (en) 2020-10-01
IL269059B (en) 2021-12-01
AU2018237784A1 (en) 2019-11-07
KR102648945B1 (ko) 2024-03-18
SG11201908679QA (en) 2019-10-30
JP7204662B2 (ja) 2023-01-16
DK3601288T3 (da) 2021-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6953444B2 (ja) Ｐｅｔイメージング用免疫修飾因子
JP6152104B2 (ja) アルブミン結合実体のホラートコンジュゲート
IL201251A (en) Polates marked f18
WO2005087275A2 (en) Metal radiolabeled pet imaging agents
CN102177160B (zh) 作为pet放射性示踪剂的18f-标记叶酸
CN112043839A (zh) 靶向转铁蛋白受体的放射性同位素标记多肽显像剂及其应用
Brandau et al. Structure distribution relationship of iodine-123-iodobenzamides as tracers for the detection of melanotic melanoma
US10322195B2 (en) 18F-saccharide-folates
CN110431141A (zh) 异构体纯的18f-标记的四氢叶酸盐/酯
CN113368264B (zh) 放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途
CN115572299B (zh) 一种肺癌c-Met靶向小分子类PET显像剂及应用
EP3339309A1 (en) Radioactive halogen-labeled pyrido[1,2-a]benzimidazole derivative compound
Tang et al. 68Ga-pAKTi PET/CT imaging as a non-invasive method to assess tumor response to PI3Kα Inhibitor in breast cancer
ES2956105T3 (es) Sustrato de beta-galactosidasa radiomarcado para imagenología PET de senescencia
US20130034496A1 (en) Positron emission tomography tracer
CN117653755A (zh) 一种基于氨基酸代谢通路的肿瘤诊断分子影像探针及其制备方法和用途
Schibli et al. 18 F-saccharide-folates

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40012008

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant