KR102648945B1 - 이성질체적으로 순수한 18f-라벨링된 테트라히드로폴레이트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-5-메틸테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단 및 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서의, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 용도에 관한 것이다.
진단제 또는 치료제와 같은 이펙터 모이어티의 전달을 위한 수용체-특이적 표적화는 널리 연구된 분야이며, 비-침습적 진단 및/또는 치료용 의료 적용분야의 진전을 유도하였다. 특히, γ-선 또는 입자 방출 방사선과 같은 전자기 방사선을 방출하는 방사성 물질을 이용하는 핵의학 절차 및 치료 분야에서, 질환을 평가하고/하거나 치료적 처리의 효과를 모니터링하는 특정 조직의 시각화를 위한 높은 신호 강도, 또는 구체화된 감염된 부위에 이온화 방사선의 적절한 투여량을 전달하기 위한 높은 방사선 투여량을, 다른 것 (예를 들어, 건강한 조직) 에서 방사선 손상/방사선 독성의 위험 없이 달성하기 위해, 표적화된 세포 또는 조직에서의 이들 방사성 물질의 선택적 국소화가 요구된다. 따라서, 세포-특이적 구조, 특히 암 (즉, 종양) 또는 염증성 및 자가면역 질환의 경우 존재하는 구조, 예컨대 수용체, 항원, 합텐 등 (이는 각각의 생물학적 비히클에 의해 특이적으로 표적화될 수 있음) 을 결정 및 평가하는 것이 매우 중요하다.
지난 20 년에서, 다수의 엽산-기반 방사성의약품이, 이의 폴레이트 수용체 (FR) 양성 종양 조직을 영상화하는 능력으로 인해 연구되어 왔다 (Low, P. S., Henne, W., and Doorneweerd, D. (2008) Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Acc. Chem. Res. 41, 120-129; Philip Stewart Low, S. A. K. (2009) Folate-targeted therapeutic and imaging agents for cancer. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 256-262; Mueller, C. (2013) Folate-Based Radiotracers for PET Imaging - Update and Perspectives. Molecules 18, 5005-5031, and Mueller, Folate based radiopharmaceuticals for imaging and therapy of cancer and inflammation., C. Curr Pharm Des. 2012;18(8):1058-83). FR-α 는 종양 영상화를 위한 최적의 표적을 나타내는데, 이는 이것이 난소, 자궁, 신장, 유방, 폐 및 결장-직장 암과 같은 여러 상피암 유형에서 과발현되지만, 신장, 맥락총, 침샘, 폐 및 태반을 비롯한 건강한 조직에서는 발현이 제한되기 때문이다 (Parker, N., Turk, M. J., Westrick, E., Lewis, J. D., Low, P. S., and Leamon, C. P. (2005) Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Anal. Biochem. 338, 284-293.). 엽산-기반 방사성 트레이서 (radiotracer) 는 이의 FR-α 에 대한 높은 결합 친화도 (IC50 = ~ 1 nM) 로 인해 신장 및 다른 FR-양성 조직에 많이 축적된다는 단점을 갖는다 (Mueller, C. (2013) Folate-Based Radiotracers for PET Imaging - Update and Perspectives. Molecules 18, 5005-5031.). 추가로, 이러한 엽산 기반 방사성 트레이서는 또한 유사한 높은 친화도로, 염증에 관여하는 활성화된 마크로파지에 대해 상향조절되는 FR-β 이소형에 결합한다 (Nakashima-Matsushita, N., Homma, T., Yu, S., Matsuda, T., Sunahara, N., Nakamura, T., Tsukano, M., Ratnam, M., and Matsuyama, T. (1999) Selective expression of folate receptor β and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 42, 1609-1616; Paulos, C. M., Turk, M. J., Breur, G. J., and Low, P. S. (2004) Folate receptor-mediated targeting of therapeutic and imaging agents to activated macrophages in rheumatoid arthritis. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 1205-1217.). 이러한 비-선택성은 암 진단 또는 후속 연구의 위-양성 결과를 유발할 수 있다. 따라서, 선택적 폴레이트-기반 방사성의약품은 혼동을 주는 결과를 감소시키거나 심지어 회피하기 위해 매우 중요하며 관심이 높을 수 있다.
그러나, 현재까지, 단지 제한된 수의 환원된 폴레이트만이 영상화 연구를 위해 방사성 라벨링되어 왔다. Vaitilingam et al. 은 99mTc 로 라벨링된 5,10-디메틸테트라히드로폴레이트 유도체 (DMTHF) 에 대해 보고하였지만, DMTHF 유도체의 부분입체이성질체 비에 대한 정보는 제공하지 않았다 (Vaitilingam, B., Chelvam, V., Kularatne, S. a., Poh, S., Ayala-Lopez, W., and Low, P. S. (2012) A Folate Receptor-α-Specific Ligand That Targets Cancer Tissue and Not Sites of Inflammation. J. Nucl. Med. 53, 1127-1134.). 저자는 상응하는 산화 형태 (EC20, KD = 12 nM) 에 비해 4 배 더 높은 38 nM 의 KD 값을 보고하였다. FR-β 에 대한 FR-α 의 선택성은 염증의 동물 모델 및 FR-α-양성 종양을 사용하는, 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 실험에서 입증되었다. DMTHF 유도체 이외에, Saeed et al. 은 Nuclear Medicine and Biology 39(5):697-701 January 2012 에서, 또 다른 탄소-11 로 라벨링된 환원된 폴레이트 방사성 트레이서에 대해 보고하였지만, 시험관 내 또는 생체 내 실험의 결과는 공개하지 않았다. Vaitlingam 및 동료들과 유사하게, 방사성 라벨링된 생성물의 부분입체이성질체 비에 대한 정보는 제공되지 않았다. FR-β 를 함유하는 염증성 부위에서 선택적으로 FR-β 가 아닌 종양-관련 FR-α 를 표적화하는 플루오린-18 라벨링된 폴레이트 PET 트레이서가 상당한 감도 및 특이성을 제공하는 것으로 관심이 높을 수 있다.
Wang et al 은 Biochemical Pharmacology. Vol. 44. No. 9. pp. 1898-1901, 1992 에서, 환원된 5-메틸-(6R)- resp. -(6S)-THF 의 결합 친화도에서 4-배 차이를 보고하였다.
Betzel et al 은 최근에 FR-양성 암 조직을 영상화하기 위해 고안된 3'-아자-2'-[18F]플루오로엽산, 유망한 플루오린-18 라벨링된 엽산 유도체를 보고하였다 (Betzel, T., Mueller, C., Groehn, V., Mueller, A., Reber, J., Fischer, C. R., Kraemer, S. D., Schibli, R., and Ametamey, S. M. (2013) Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3'-Aza-2'-[18F]fluorofolic Acid: A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting. Bioconjug. Chem. 24, 205-214.)
그럼에도 불구하고, 알려진 18F 폴레이트 방사성의약품이 유망한 결과를 보이지만, 높은 FR-알파-특이성을 보이고, 일상적 임상 적용에 적합하고, 또한 높은 방사성화학 수율로 효율적이고 다양한 방식으로 수득될 수 있는 화합물에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 출원인은, FR-알파-양성 조직에 대한 높은 특이성이 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 유도체, 예컨대 생리적인 (6R)-형태의 3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-메틸테트라히드로폴레이트로 달성될 수 있다는 것을 발견하였다.
환원된 생리적 폴레이트의 유도체 형태인, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 유도체, 예컨대 3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-메틸테트라히드로폴레이트는 각각의 산화된 엽산 유도체에 비해 FR-알파에 대해 50-배 더 높은 선택성을 나타내고, 높은 친화도로 FR 에 결합한다. FR-베타를 함유하는 염증성 부위에서 FR-베타가 아닌 종양 관련 FR-알파를 선택적으로 표적화하는 PET 트레이서는 상당한 감도 및 특이성을 제공한다. 비특이적 PET 트레이서의 사진으로부터 종양 관련 FR-알파를 선택적으로 표적화하는 PET 트레이서로부터 나타나는 것을 추론한 결과, FR-베타를 함유하는 염증성 부위에 대한 정보를 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화에서 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 용도에 대한 제 1 양상에 관한 것으로서, 여기서 폴레이트 구조 내 페닐 기는 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체되었다.
바람직하게는, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 이의 이성질체적으로 순수한 (6S)- 또는 (6R)-형태이다.
보다 더욱 바람직하게는, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 5-메틸-(6S)-테트라히드로폴레이트 또는 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 5-메틸-(6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품이고, 여기서 폴레이트 구조 내의 페닐 기는 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체되었다.
특정 구현예에서, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 이성질체적으로 순수한 3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-메틸-(6S)-테트라히드로폴레이트 또는 이성질체적으로 순수한 3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-메틸-(6R)-테트라히드로폴레이트이다.
한 특정 구현예에서, 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화에서 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한, 식 Ia 또는 Ib 의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다:
[식 중,
R1, R2 는 서로 독립적으로 H 또는 직쇄 또는 분지형 C1-C6 알킬이고,
R3, R4 는 서로 독립적으로 H, 포르밀, 또는 메틸임].
바람직한 구현예에서, R1, R2 는 서로 독립적으로 H 또는 직쇄 또는 분지형 C1-C6 알킬이고, R3 은 메틸이고, R4 는 H 이다.
보다 특히, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화에서 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한 식 IIa 또는 IIb 를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
[식 중,
R1, R2 는 서로 독립적으로 H, 또는 C1-C12 알킬임].
바람직한 구현예에서, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한 식 IIIa 또는 IIIb 를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
.
특정 구현예에서, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 알칼리 또는 알칼리 토금속 염, 바람직하게는 소듐, 포타슘, 마그네슘 또는 칼슘 염에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클 (또는 이의 약학적 조성물) 로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품의, 바람직하게는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환의 진단 또는 치료에서의 용도에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클 (또는 이의 약학적 조성물) 로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품의, (i) 치료적 활성물질과 함께 진단적 영상화 양의, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것, 및 (ii) 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 치료의 과정을 따르기 위해 상기 적어도 하나의 화합물로부터 신호를 검출함으로써 PET 를 사용하여 진단적 영상화를 수행하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 치료의 모니터링에서의 용도에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클 (또는 이의 약학적 조성물) 로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 (6S)- 또는 (6R)-테트라히드로폴레이트 방사성의약품의, 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화에서의 용도에 관한 것이다.
도 1: 전구체 N 2-아세틸-3'-아자-2'-클로로-5-메틸테트라히드로폴레이트-디-tert-부틸에스테르 6S-2 및 6R-2 (A) 및 보호된 레퍼런스 N 2-아세틸-3'-아자-2'-플루오로-5-메틸테트라히드로폴레이트-디-tert-부틸에스테르 6S-2 및 6R-2 (B) 의 키랄 HPLC 크로마토그램.
도 2: 400 ㎚ 내지 200 ㎚ 에서 측정하는 6S- 및 6R-5-MTHF (A) 및 6R-1 및 6S-1 (B) 의 CD 스펙트럼.
도 3: 6S-5-MTHF 및 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF (A) 및 6R-5-MTHF 및 6R-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF (B) 의 CD 스펙트럼의 오버레이.
도 4: 6S/6R-[18F]1 주입 60 분 후, 레퍼런스 방사성 트레이서 6S/6R-[18F]1 (A), 간 샘플 (B), 혈장 (C) 및 소변 샘플 (D) 의 방사성-UPLC 크로마토그램. 체류 시간은 피크 위에 제시됨.
도 5: 30, 60 및 90 분 p.i. 에서 일부 선택된 조직 중 6R-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (A) 및 6S-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (B) 의 방사능 축적.
도 6: 6R-[18F]1 및 6S-[18F]1 의 종양-대-신장 (tumor-to-kidney) (A), 종양-대-혈액 (tumor-to-blood) (B) 및 종양-대-간 (tumor-to-liver) (C) 의 비교.
도 7: 18F-6R-5Me-아자THF 의 주입 30, 60 및 90 분 후 조직 분포 프로파일.
도 8: 18F-6S-5Me-아자THF 의 주입 30, 60 및 90 분 후 조직 분포 프로파일.
도 9: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 조직 분포 프로파일의 비교.
도 10: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 종양-대-혈액 비의 비교.
도 11: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 종양-대-간 비의 비교.
도 12: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 종양-대-신장 비의 비교.
도 13: 18F-6R-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Li = 간, Ki = 신장, 백색 화살표 = 담낭).
도 14: 18F-6R-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Li = 간, Ki = 신장, 백색 화살표 = 담낭).
도 15: 18F-6R-아자-5MeTHF 이전에 과량의 엽산 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Li = 간, 백색 화살표 = 담낭).
도 16: 18F-6S-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 17: 18F-6S-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 18: 18F-6S-아자-5MeTHF 이전에 과량의 엽산 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Bl = 방광, 백색 화살표 = 담낭).
도 19: 18F-아자Fol, 18F-5Me-6S-아자-THF 및 18F-5Me-6R-아자-THF 의 주입 1 h 후 IGROV-1 (인간 난소 암종 세포주) 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 20: 18F-아자Fol, 18F-5Me-6S-아자-THF 및 18F-5Me-6R-아자-THF 의 주입 2 h 후 IGROV-1 (인간 난소 암종 세포주) 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 21: 18F-아자Fol, 18F-5Me-6S-아자-THF 및 18F-5Me-6R-아자-THF 의 주입 3 h 후 IGROV-1 (인간 난소 암종 세포주) 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 22: 37℃ 에서 1, 2, 또는 3 h 동안 FR-양성 KB 세포의 인큐베이팅과 함께, 6R-[18F]1 (A) 또는 6S-[18F]1 (B) 의 내재화 및 흡수. 블로킹 연구는 과량의 엽산을 사용하여 수행되었다.
도 23: RT16 (FR-α) 및 D4 (FR-β) 세포주를 사용하는, 18F-아자Fol 의 총 흡수 및 내재화.
도 24: RT16 (FR-α) 및 D4 (FR-β) 세포주를 사용하는, 6R-3-아자-2-18F-5-MTHF 의 총 흡수 및 내재화.
도 25: RT16 (FR-α) 및 D4 (FR-β) 세포주를 사용하는, 6S-3-아자-2-18F-5-MTHF 의 총 흡수 및 내재화.
도 26: 환원된 18F-폴레이트 및 플루오린화되지 않은 이성질체의 구조 및 입체화학적 디노미네이션 (denomination).
도 2: 400 ㎚ 내지 200 ㎚ 에서 측정하는 6S- 및 6R-5-MTHF (A) 및 6R-1 및 6S-1 (B) 의 CD 스펙트럼.
도 3: 6S-5-MTHF 및 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF (A) 및 6R-5-MTHF 및 6R-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF (B) 의 CD 스펙트럼의 오버레이.
도 4: 6S/6R-[18F]1 주입 60 분 후, 레퍼런스 방사성 트레이서 6S/6R-[18F]1 (A), 간 샘플 (B), 혈장 (C) 및 소변 샘플 (D) 의 방사성-UPLC 크로마토그램. 체류 시간은 피크 위에 제시됨.
도 5: 30, 60 및 90 분 p.i. 에서 일부 선택된 조직 중 6R-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (A) 및 6S-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (B) 의 방사능 축적.
도 6: 6R-[18F]1 및 6S-[18F]1 의 종양-대-신장 (tumor-to-kidney) (A), 종양-대-혈액 (tumor-to-blood) (B) 및 종양-대-간 (tumor-to-liver) (C) 의 비교.
도 7: 18F-6R-5Me-아자THF 의 주입 30, 60 및 90 분 후 조직 분포 프로파일.
도 8: 18F-6S-5Me-아자THF 의 주입 30, 60 및 90 분 후 조직 분포 프로파일.
도 9: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 조직 분포 프로파일의 비교.
도 10: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 종양-대-혈액 비의 비교.
도 11: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 종양-대-간 비의 비교.
도 12: 18F-6R-5Me-아자THF (6R-형태) 및 18F-6S-5Me-아자THF (6S-형태) 의 종양-대-신장 비의 비교.
도 13: 18F-6R-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Li = 간, Ki = 신장, 백색 화살표 = 담낭).
도 14: 18F-6R-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Li = 간, Ki = 신장, 백색 화살표 = 담낭).
도 15: 18F-6R-아자-5MeTHF 이전에 과량의 엽산 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Li = 간, 백색 화살표 = 담낭).
도 16: 18F-6S-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 17: 18F-6S-아자-5MeTHF 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 18: 18F-6S-아자-5MeTHF 이전에 과량의 엽산 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후 KB 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Bl = 방광, 백색 화살표 = 담낭).
도 19: 18F-아자Fol, 18F-5Me-6S-아자-THF 및 18F-5Me-6R-아자-THF 의 주입 1 h 후 IGROV-1 (인간 난소 암종 세포주) 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 20: 18F-아자Fol, 18F-5Me-6S-아자-THF 및 18F-5Me-6R-아자-THF 의 주입 2 h 후 IGROV-1 (인간 난소 암종 세포주) 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 21: 18F-아자Fol, 18F-5Me-6S-아자-THF 및 18F-5Me-6R-아자-THF 의 주입 3 h 후 IGROV-1 (인간 난소 암종 세포주) 종양을 갖는 마우스의 PET/CT 스캔. (Tu = 종양 이종이식, Ki = 신장, SG = 침샘, 백색 화살표 = 담낭, 녹색 화살표 = 맥락총).
도 22: 37℃ 에서 1, 2, 또는 3 h 동안 FR-양성 KB 세포의 인큐베이팅과 함께, 6R-[18F]1 (A) 또는 6S-[18F]1 (B) 의 내재화 및 흡수. 블로킹 연구는 과량의 엽산을 사용하여 수행되었다.
도 23: RT16 (FR-α) 및 D4 (FR-β) 세포주를 사용하는, 18F-아자Fol 의 총 흡수 및 내재화.
도 24: RT16 (FR-α) 및 D4 (FR-β) 세포주를 사용하는, 6R-3-아자-2-18F-5-MTHF 의 총 흡수 및 내재화.
도 25: RT16 (FR-α) 및 D4 (FR-β) 세포주를 사용하는, 6S-3-아자-2-18F-5-MTHF 의 총 흡수 및 내재화.
도 26: 환원된 18F-폴레이트 및 플루오린화되지 않은 이성질체의 구조 및 입체화학적 디노미네이션 (denomination).
본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화에서 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한, 폴레이트 구조 내 페닐 기가, 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 용도에 대한 제 1 양상에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "테트라히드로폴레이트(들)" 은 5,6,7,8-테트라히드로엽산의 구조를 기반으로 하는 화합물을 포함한다. 5-메틸-THF 로서의 테트라히드로폴레이트 (약어 THF) 는 엽산과 같은 이의 산화 형태로부터, 이성질체 (6S)- 및 (6R)-형태를 유도하는 C6 에서의 부가적인 키랄 중심에 의해, 그들 자체를 구별한다. 글루탐산 모이어티의 α-탄소는 자연 발생 형태의 본원에 정의된 엽산 및 테트라히드로폴레이트 둘 모두에 존재한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 바람직하게는 이성질체적으로 순수한 형태이다.
본원에서 사용된 바, 테트라히드로폴레이트는 테트라히드로폴레이트의 산 형태 및 또한 해당 에스테르 형태를 포함한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "이성질체적으로 순수한", "입체이성질체적으로 순수한" 각각은 한 형태에 대해, 약 80% 초과, 바람직하게는 약 90% 초과, 바람직하게는 약 95% 초과, 보다 바람직하게는 약 97% 초과, 보다 더욱 바람직하게는 약 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이하의 이성질체 과량의 다른 형태 [(6R)-형태 대 (6S)-형태 또는 (6S)-형태 대 (6R)-형태] 를 갖는 본 발명의 화합물을 의미하고, 여기서 나머지는 하나 이상의 다른 이성질체일 수 있다.
한 특정 구현예에서, 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한, 일반식 Ia 또는 Ib 의 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다:
.
[식 중, R1, R2 는 서로 독립적으로 H 또는 직쇄 또는 분지형 C1-C6 알킬이고, R3, R4 는 서로 독립적으로 H, 포르밀, 또는 메틸임].
단독 또는 조합으로 사용된 경우, 용어 "알킬" 은 제시된 수의 C-원자, 전형적으로 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형 알킬 기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸, t-부틸 등을 지칭한다.
약학적으로 허용가능한 염은 알칼리 또는 알칼리 토금속 염, 바람직하게는 소듐, 포타슘, 마그네슘 또는 칼슘 염일 수 있거나, 또한 산성 염, 예컨대 술페이트 또는 술포네이트 염, 바람직하게는 술페이트 염일 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한, 식 IIa 또는 IIb 의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
[식 중, R1, R2 는 서로 독립적으로 H, 또는 C1-C12 알킬임].
보다 더욱 특히, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한, 식 IIIa 또는 IIIb 의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
.
놀랍게도, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 FR 에 대해 상당한 결합 친화도를 보인다는 것이 밝혀졌다.
보다 더욱 놀랍게도, 폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 상이한 생체내 분포 (biodistribution) 를 보인다는 것이 밝혀졌다. 이는 시험관 내 데이터가 두 이성질체에 대해 유사한 FR-친화도를 나타내지 않음에 따라 매우 놀랍다.
폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 종양 흡수 (tumor uptake), 생체내 분포 및 생체 내 안정성의 관점에서 상응하는 산화된 엽산-기반 유도체를 능가한다.
폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 전체 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 매우 특히 FR 양성 조직에서 축적된다. 실제로 상기 축적은, 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품이 조직으로 담체 시스템을 통해 이동하기 때문에 예측될 수 없었다. 특히, (6S)-형태는 이에 관해 산화 형태와 같은 거동을 보인다.
폴레이트 구조 내 페닐 기가 18F-라벨링된 N-헤테로사이클로 대체된, 특히 (6R)-형태의 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품에 대해 개시된 현저히 개선된 종양 대 신장 비는 매우 놀랍고 예측될 수 없었다.
추가의 양상에서, 본 발명은 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 진단적 영상화 양의 식 Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, 또는 IIIb 에 따른 적어도 하나의 화합물의 투여, 및 상기 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상의 수득 단계를 포함한다.
또한 추가의 양상에서, 본 발명은 진단적 영상화를 필요로 하는 대상체에 편리하고 효과적인 투여를 위한 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명은 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 방법을 제공하고, 상기 방법은 진단적 영상화 양의 본 발명의 적어도 하나의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 투여, 및 상기 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상의 수득 단계를 포함한다.
상기 영상화는 시험관 내 또는 생체 외 (ex vivo) (생체 검사) 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단에서 수행될 수 있다. 폴레이트 수용체-α 를 과발현하는 전형적인 세포 또는 세포 집단은 상피암 유형, 예컨대 난소, 자궁, 신장, 유방, 폐 및 결장-직장 암이다.
따라서, 본 발명은 조직 샘플에서 폴레이트 수용체를 발현하는 세포의 시험관 내 검출 방법을 제공하고, 이는 결합이 발생하고, PET 영상화에 의해 상기 결합을 검출하는 것을 허용하는, 충분한 시간 및 조건 동안 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품과 상기 조직 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 암 치료 또는 염증성 및 자가면역 질환의 치료의 모니터링 또는 진단적 영상화를 필요로 하는 대상체에, 편리하고 효과적인 투여를 위한 본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 용도를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 동시적 진단 및 치료 방법을 제공하고, 이는 치료 활성물질과 함께 진단적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계, 및 치료 과정을 따르기 위한 상기 조직의 진단적 영상을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 대상체는 바람직하게는 포유류, 예컨대 동물 또는 인간, 인간, 바람직하게는 인간이다.
투여량은 목적하는 효과의 성질, 예컨대 진단 또는 치료의 형태, 치료 유형 및 빈도, 진단 기구, 제제의 적용 형태, 수령자의 연령, 체중, 영양 및 상태, 동시 치료 (존재하는 경우) 의 유형에 따른다.
그러나, 가장 바람직한 투여량은 과도한 실험 없이, 당업자에 의해 이해되고 결정가능한 바에 따라, 개별 대상체에 맞춰질 수 있다. 이는 전형적으로 표준 투여량의 조정, 예를 들어 환자가 체중이 낮은 경우 투여량의 감소를 수반한다.
치료는 최적의 양 보다 낮은 적은 양으로 개시될 수 있고, 이는 최적의 효과를 달성하기 위해 증가될 수 있다. PET 스캐너에서의 영상화 절차는 방사성 트레이서의 투여 후 수 분 내지 2-4 시간 이내에 수행된다. 스케쥴은 목적하는 정보뿐 아니라 방사성 트레이서의 동역학 및 영상화 표적에 따른다.
본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 투여의 바람직한 경로는 비경구적, 예를 들어 정맥 주사에 의해서이다.
주사의 적합한 형태는 상기 언급된 본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 전형적으로, 방사성의약품은 생리적 완충 용액에서 제형화될 것이다.
이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 비제한적으로 항진균제의 항균물질, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 등의 첨가를 비롯한 임의의 업계에 인식된 기술에 의한 멸균화를 진행한다. 바람직하게는, 이는 멸균 여과 후 투여를 진행하여, 부가적인 멸균화제의 필요를 제거한다.
주사하기 위한 용액의 경우, 바람직한 단위 투여량은 약 0.01 ml 내지 약 10 ml 이다. 비경구 투여 후, 생체 내 장기 또는 종양의 영상화는, 목적하는 경우, 선택된 표적 영역에서 충분한 양의 투여된 용량이 축적되도록, 방사성 라벨링된 시약을 대상체에 투여한 후 수 분 내지 2 내지 4 시간 이내에 수행될 수 있다.
본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은 또한 대상체에서 취한 조직 생검에서 폴레이트 수용체를 발현하는 세포의 시험관 내 검출을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 구현예에서, 본 발명은 조직 샘플에서 폴레이트 수용체를 발현하는 세포, 예를 들어 종양 세포의 시험관 내 검출 방법을 제공하고, 이는 결합이 발생하고, 영상화 기술에 의해 상기 결합을 검출하는 것을 허용하는, 충분한 시간 및 조건 동안 유효량의 본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품과 상기 조직 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다.
샘플은 당업자에게 알려진 절차에 의해, 예를 들어 기관 또는 폐 샘플 등을 흡인함으로써, 조직 생검 또는 체액을 수집함으로써 수집될 수 있다.
시험되기 위한 조직 샘플은 종양 세포, 상피 세포, 신장, 위장관 또는 간 담즙 시스템 등과 같은 폴레이트 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 것으로 의심되는 임의의 조직을 포함한다. 샘플은, 예를 들어 마이크로톰 (microtome) 으로 구획화되어, 현미경 검사 및 관찰을 용이하게 할 수 있다. 샘플은 또한 샘플 조직의 조직학적 품질을 개선하기 위해, 본 발명의 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품 중 하나와, 인큐베이션 전후에, 적절한 고정체로 고정될 수 있다.
본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품의 세포 상의 폴레이트 수용체에 대한 결합에 충분한 시간 및 조건은 표준 조직 배양 조건을 포함하고, 즉 샘플은 생리적 매질에서 본 발명의 하나의 착물 또는 조성물과 인큐베이팅 및 시험관 내에서 배양될 수 있다. 상기 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 대안적으로, 샘플은 고정될 수 있고, 이후 본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품과, 등장성 또는 생리적 완충액에서 인큐베이팅될 수 있다.
모든 적용의 경우, 본 발명의 이성질체적으로 순수한 18F-라벨링된 테트라히드로폴레이트 방사성의약품은, 이들이 사용될 위치에서, 또는 주변에서 준비하는 것이 편리하다.
본원에 개시되고 주장된, 모든 화합물 및/또는 방법은, 본 개시물에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고, 수행될 수 있다. 당업자에게, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 변동이 적용될 수 있음은 명백할 것이다. 본원에 제공된 실시예는 예시적인 것이고, 완전하지 않고; 이에 따라 예시된 실시예는 어떠한 방식으로 본 발명을 제한하는 것으로 비추어져서는 안된다.
실시예
물질 및 방법
일반:
시약 및 용매는 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Acros Organis 로부터 구매하였고, 정제 없이 사용하였다. 빌딩 블록은 ABCR-Chemicals, Apollo Scientific, Fluka-Chemie 및 Merck & Cie (Schaffhausen, Switzerland) 로부터 구매하였고. 6R-10-포르밀-5-메틸테트라히드로프테로산 (6R-10-포르밀-5-MTHP) 은 Merck & Cie (Schaffhausen, Switzerland) 에 의해 제공되었다. 이들 빌딩 블록의 품질 컨트롤은 1H-NMR, 13C-NMR, cosygp 및 HR-MS 로 수행하였다.
플래쉬 크로마토그래피, 반응 혼합물 이동, 추출 및 세척 방법을 실시하기 위한 용매를 ETH 의 연료 저장고로부터 직접 구매하였다.
분석적 방법:
핵 자기 공명 스펙트럼을, 내부 표준으로서 상응하는 용매 신호와, Bruker 400 또는 500 MHz 분광기에서 기록하였다. 화학적 이동은 테트라메틸실란 (0.00 ppm) 에 대해 백만 당 부 (parts per million, ppm) 로 보고된다. 커플링 상수 (J) 값은 헤르츠 (Hz) 로 제시되고; 하기 약어가 1H NMR 의 설명을 위해 본 섹션에서 사용된다: 단일항 (s), 이중항 (d), 삼중항 (t), 사중항 (q), 다중항 (m), 이중항의 이중항 (dd), 이중항의 이중항의 이중항 (ddd) 및 브로드 신호 (bs). 복합 다중항의 화학적 이동은 이의 발생 범위로서 제시된다.
고-분해능 질량 분석 (HR-MS) 은, Varian IonSpec Ultima MALDI-FT-ICR 또는 Bruker Daltonics Ultra-Flex II MALDI-TOF 에서, ETH Zurich 에서의 Laboratorium fur Organische Chemie 의 MS 서비스에 의해 기록되었다. 트랜스-2-[3-(4-tert-부틸페닐)-2-메틸-2-프로페닐리덴]말로노니트릴 (DCTB) 및 3-히드록시피리딘-2-카르복실산 (3-HPA) 은 MALDI 질량 분석을 위한 매트릭스로서 작용하였다. ESI 질량 분석은 Bruker FTMS 4.7 T BioAPEXII (ESI) 로 기록되었다.
분취용 HPLC 는, 15 mL/min (280 ㎚) 의 유속에서 Ultimate XB-C18 컬럼 (150 × 21.2 ㎜, 5 ㎛) (Ultisil, Welch Materials) 을 사용하여, D7000 인터페이스, L-7400 UV 검출기, 및 L-7150 펌프가 장착된 Merck-Hitachi 시스템으로 수행되었다.
분석적 HPLC 는, sunfire C18 컬럼 (4.6 × 150 ㎜, 5 ㎛) 을 사용하여, D-7000 인터페이스, L-7400 UV 검출기, 및 L-7100 펌프가 장착된 Merck-Hitachi 시스템으로 수행되었다. 달리 기재되지 않는 경우, 반응 컨트롤은, 10 mM NH4HCO3 용액 (용매 A) 및 MeCN (용매 B) 및 하기 구배: 0-30 분: 100 - 60 % A, 30-35 분: 60% A, 35-36 분: 60 - 100% A, 36-40 분: 100% A (1 mL/min 의 유속 및 280 ㎚ 에서) 를 사용하는 분석적 HPLC 를 통해 수행되었다.
반-분취용 HPLC 는, 용매 시스템으로서 10 mM NH4HCO3 완충액 (용매 A) 및 MeCN (용매 B) (4 mL/min 의 유속 및 280 ㎚ 에서) 를 사용하여, sunfire C18 컬럼 (10 × 150 ㎜, 5 ㎛) 으로, D-7000 인터페이스, L-7400 UV 검출기, 및 L-7100 펌프가 장착된 Merck-Hitachi 시스템으로 수행되었다.
분석적 방사성-HPLC 는, 100 μL-lop 및 GabiStar 방사성검출기 (Raytest) 가 장착된, Agilent 1100 series HPLC 시스템에서 수행되었다. 분석 Phenomenx Gemini C18 컬럼 (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛, 110 Å, 예비컬럼 없음) 은, 1 mL/min 의 유속에서, 280 ㎚ 에서 사용되었다. 분석적 HPLC 는, 용매 시스템으로서 10 mM NH4HCO3 (용매 A) 및 MeCN (용매 B) 으로, 하기와 같은 구배로 수행되었다: 0-20 분: 95 - 60% A, 20-25 분: 60% A, 25-26 분: 60 - 95% A, 26-30 분: 95% A.
반응 컨트롤은, 부착된 코인시던스 (coincidence) 검출기 (FlowStar LB513, Berthold) 및 Acquity UPLC BEH C18 컬럼 (2.1 × 50 ㎜, 1.7 ㎛, Waters) 을 사용하여, 용매 시스템으로서 10 mM NH4HCO3 용액 (용매 A), 및 MeCN (용매 B) 과 하기 구배로, 방사성 초-성능 액체 크로마토그래피 (방사성-UPLC, Waters) 에 의해 수행되었다: 0-0.3 분 90% A, 0.3-3.0 분 90% - 50% A, 3.0-3.1 분: 50 - 20% A, 3.1-3.5 분: 20% A, 3.5-3.6 분: 20 - 90% A, 3.6-4.0 분: 90% A (0.6 mL/min 의 유속 및 280 ㎚ 에서).
방사화학
: 건조 [
18
F]플루오라이드의 제조:
18/9 사이클로트론 (IBA, Belgium) 에서, 18 MeV 프로톤 빔에 의해, 동위원소 농축된 [18O]H2O (930 μL, 97%, Cambridge Isotope Laboratories) 로 채워진, 액체 표적의 조사에 의해 무(無)-담체-첨가 [18F]플루오라이드를 수득하였다. 방사능 (36-45 GBq) 을 연속적인 헬륨 스트림에 의해 합성 핫 셀 (hot cell) 로 이동시켰다. [18F]플루오라이드 수용액을 사전컨디셔닝 없이 Sep-Pak Light Accell Plus carb QMA 카트리지 (Waters) 에서 트래핑하였다. 용리는, H2O (0.6 mL) 및 MeCN (1.4 mL) 의 혼합물 중 K2CO3 (1.2 mg, 8.7 μmol) 및 Kryptofix (10 mg, 26.6 μmol) 또는 Cs2CO3 (2.8 mg, 8.6 μmol) 및 Kryptofix (5 mg, 13.3 μmol) 의 용액을 사용하여 수행되었다. 용리액은, 밀봉된 Wheaton 반응기 (5 mL) 에서 수집되었고, 용매는 10 분 동안 질소의 온건한 스트림 및 감압 하에서 95℃ 에서 증발되었다. 이후, MeCN (1 mL) 을 3회 첨가하고, 95℃ 에서 3 분 내에 건조될 때까지 증발시켰다. 마지막으로, 질소 스트림 없이 완전 진공을 95℃ 에서 5 분 동안 적용하였다.
생체내 분포 연구:
생체내 분포 연구는, 세포 접종 2 주 후 수행되었다. 18F-폴레이트 방사성 트레이서 (~5 MBq/마우스) 를 측면 꼬리 정맥에 100 μL 의 부피로 주입하였다. 방사성 트레이서의 투여 30 분, 60 분 및 90 분 후 동물을 희생시켰다. 선택된 조직 및 장기를 수집하고, 칭량하고, γ-카운터를 사용하여 방사능을 측정하였다. 붕괴 보정 값을 유도하는 동시 측정된 원래의 주입 용액의 정의된 부피의 카운트를 사용하여, 조직 질량의 그램 당 주입된 방사능의 백분율 (% IA/g) 로서 결과를 나열하였다.
PET/CT 영상화 연구:
생체내 분포 연구와 같이 동일한 방식으로 마우스를 준비하였다. 벤치-탑 전임상 PET 스캐너 (Genisys8, Sofie Biosciences, U.S. 및 Perkin Elmer, U.S.) 가, 마우스의 PET/CT 스캔을 위해 이용되었다. 에너지 윈도우는, 150-650 keV 로 설정되었다. 마우스에 18F-방사성 트레이서 (100 μL 중 ~5 MBq) 로 정맥 주사하였다. 10 분 동안 지속된 스캔 동안, 마우스를 이소플루란 및 산소의 혼합물을 사용하여 마취시켰다. G8 획득 소프트웨어 (버젼 2.0.0.10) 를 사용하여, 18F-방사성 트레이서의 주입 1h, 2h, 및 3h 후 스캔을 수행하였다. 최대-가능성 기대값 최대화 (maximum-likelihood expectation maximization, MLEM) 로 영상을 재구성하였다. PET/CT 영상을 제시하기 위해, 영상의 스캐일을 조정하여 종양 조직 및 신장의 최적의 시각화를 허용하였다 (보다 낮은 스캐일에서 대략 10% 를 끊었다).
실시예 1:
6
S
- 및 6
R
-
N
2
-아세틸-3'-아자-2'-플루오로/2'-클로로-5-메틸테트라히드로폴레이트 디-
Tert
-부틸에스테르의 합성 및 분리 (
키랄 HPLC 에 의함)
6S- 및 6R-N 2-아세틸-3'-아자-2'-클로로-5-MTHF-디-tert-부틸에스테르 및 6S- 및 6R-N 2-아세틸-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF-디-tert-부틸에스테르의 1:1 부분입체이성질체 혼합물의 합성은, 용매로서 테트라히드로푸란 및 메틸 tert 부틸 에테르를 사용하여, 문헌 ("Reactions of Sodium Borohydride in Acidic Media. I. Reduction of Indoles and Alkylation of Aromatic Amines with Carboxylic Acids", G.W. Gribble, P. D. Lord, J. Skotnicki, S. E. Dietz, J.T. Eaton, J. L. Johnson, J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, p. 7812) 에 기재된 일반 방법과 유사하게, N 2-아세틸-3'-아자-2'-클로로-엽산-디-tert-부틸에스테르 및 N 2-아세틸-3'-아자-2'-플루오로-엽산-디-tert-부틸에스테르의 환원성 메틸화에 의해 달성되었다 (도식 1a). 생성물은 LC-MS, 1H-NMR 및 HPLC 로 특징규명되었다. N 2-아세틸-3'-아자-2'-클로로-엽산-디-tert-부틸에스테르 및 N 2-아세틸-3'-아자-2'-플루오로-엽산-디-tert-부틸에스테르의 합성은 WO 2013/167653 에 따라 달성되었다. 도식 1b 에 개시된 화합물로의 두 혼합물의 두 부분입체이성질체의 키랄 분리는, 순상 (등용매 (isocratic), 헥산/이소프로판올 1:1, 도 1) 에서 수행되는 Reprosil 100 키랄-NR HPLC 컬럼을 사용하여 달성되었다. 6R-N 2-아세틸-3'-아자-2'-플루오로-5-메틸테트라히드로폴레이트-디-tert-부틸에스테르 (6R-2) 는 14.0 분에서 먼저 용리되는 부분입체이성질체를 지칭하는 한편, 6S-N 2-아세틸-3'-아자-2'-플루오로-5-메틸테트라히드로폴레이트-디-tert-부틸에스테르 (6S-2) 는 17.5 분에서 두번째로 용리된 이성질체를 지칭한다.
실시예 2: 6
R
-3'-아자-2'-플루오로-5-메틸테트라히드로폴레이트의 합성
순수한 부분입체이성질체 6R-2 및 6S-2 는, 키랄 분리 후 수득되고 (도 1), 6R-1 및 6S-1 의 합성을 위한 개시 물질로서 사용되었다. 아세톤 중 6R-2 및 6S-2 의 산성 탈보호는 정제 후 6R- 및 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF 6R-1 및 6S-1 을 각각 81% 및 87% 의 화학적 수율로 수득하였다 (도식 1c).
a(i) 4M HCl, 아세톤, 70℃, 1 h.
도식 1c
아세톤 (200 μL) 및 4M HCl (500 μL) 중 6R-2 (7.00 mg, 11.1 μmoL) 를 용해시키고, 70℃ 에서 1 h 동안 교반하였다 (도식 1b). 반응의 완결 후, 용액은 4M NaOH 로 중화되었고, 생성물은 반분취용 HPLC 로 정제되었다. 생성물 분획의 동결건조는 6R-γ-1 을 백색 고체로서 87% 수율 (4.62 mg) 로 달성하였고, 높은 화학적 및 부분입체이성질체 순도 >95% 를 달성하였다.
실
시예
3: 6
S
-3'-아자-2'-플루오로-5-메틸테트라히드로폴레이트의 합성
아세톤 (200 μL) 및 4M HCl (500 μL) 중 6S-2 (8.00 mg, 12.6 μmoL) 를 용해시키고, 70℃ 에서 1 h 동안 교반하였다 (도식 1b). 반응의 완결 후, 용액은 4M NaOH 로 중화되었고, 생성물은 반분취용 HPLC 로 정제되었다. 생성물 분획의 동결건조는 6S-γ-1 을 백색 고체로서 81% 수율 (4.96 mg) 로 달성하였고, 높은 화학적 및 부분입체이성질체 순도 >95% 를 달성하였다.
실시예
4: 원편광 이색성 (CD) 에 의한 두 레퍼런스 부분입체이성질체 (6
R
-1 및 6
S
-1) 의 절대 배치의 결정
6S- 및 6R-5-MTHF 및 두 레퍼런스 화합물 6R- 및 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF (6R -1 및 6S-1) 의 CD 스펙트럼을 기록하였다 (도 2A 및 2B). 두 쌍의 폴레이트 각각의 상응하는 6R- 및 6S-부분입체이성질체에 대해 반대 스펙트럼이 수득되었다. 6S- 및 6R-5-MTHF 의 스펙트럼이 레퍼런스 스펙트럼으로서 작용하였는데, 이는 이들 두 물질의 입체화학이 알려져 있기 때문이다. 문헌에, 프테린이 약 345 ㎚ 에서 전형적인 흡수 밴드를 보이고, 280 ㎚ 에서 두번째 밴드를 보인다는 것이 기록되어 있다. 이들 두 전형적인 흡수 밴드는 또한 모든 4 개의 기록된 CD 스펙트럼에서 가시적이다. 6S- 및 6R-5-MTHF 의 레퍼런스 스펙트럼과 두 레퍼런스 부분입체이성질체 6R- 및 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF 의 스펙트럼의 상관관계가 맺어질 수 있다 (도 3). 6R-5-MTHF 및 6R-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF 의 310 ㎚ 에서의 피크는 모두 음이고, 280 ㎚ 에서의 피크는 모두 양이기 때문에, 6R-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF 는 6R-이성질체인 것으로 추정될 수 있는데 (도 3A), 이는 이러한 흡수가 입체중심을 갖는 프테린에서 유래하기 때문이다. 동일한 상관관계가 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF 및 6S-5-MTHF (도 3B) 로 맺어질 수 있었고, 여기서 310 ㎚ 에서의 피크는 양이고, 280 ㎚ 에서의 피크는 모두 음이다. 이러한 결과를 기초로, 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF 는 6 위치에서 S-배치라는 것을 결론지을 수 있다.
실시예 5: 6
S-
및 6
R
-3'-아자-2'-[
18
F]플루오로-5-MTHF (6
S-
및 6
R
-[
18
F]1)
a
의 제조
a (i) [18F]CsF-K2.2.2, DMSO, 160℃, 10 분; (ii) 4M HCl, 70℃, 10 분.
6S- 및 6R-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF 의 방사성 합성은, 문헌 (Betzel et al, (2013) Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3'-Aza-2'-[18F]fluorofolic Acid: A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting. Bioconjug. Chem. 24, 205-214.) 에 이전에 기재된 3'-아자-2'-[18F]플루오로엽산의 방사성 합성과 유사하게 수행되었다. 전구체 6R- 또는 6S-N 2-아세틸-3'-아자-2'-클로로-5-MTHF 디-tert-부틸에스테르 (6R- 또는 6S-2, 2.50 mg, 3.85 μmol) 를, 무수 DMSO (300 μL) 에 용해시키고, 공비 건조된 [18F]플루오라이드-크립테이트 착물 (30-35 GBq) 에 첨가하였다. 반응 혼합물을 160℃ 에서 10 분 동안 가열하였다. 이후, 용액을 5 분 동안 냉각시키고, H2O (5 mL) 를 첨가하였다. 용액을, Sep-Pak Plus tC18 카트리지 (Waters, 5 mL 의 MeOH 다음 10 mL 의 H2O 로 사전컨디셔닝됨) 를 통과시켜, 중간체 6R- 또는 S-[18F]2 를 트래핑하였다. 미반응 [18F]플루오라이드를 H2O (8 mL) 로 카트리지를 헹굼으로써 제거하였다. 또 다른 밀봉된 Wheaton 반응기 (5 mL) 로 카트리지를 통해 MeCN (2.5 mL) 을 통과시킴으로써 라벨링된 중간체 6R- 또는 6S-[18F]2 를 용리하였다. MeCN 의 거의 건조될 때까지의 증발은 감압 하 및 90℃ 에서 질소 스트림 하에서 수행되었다. 보호 기의 분열은, 4M HCl 용액 (1.25 mL) 을 reactivial 에 첨가하고, 10 분 동안 70℃ 에서 가열하여 6R- 또는 6S-[18F]1 을 수득함으로써 수행되었다. 반응 혼합물을 2 분 동안 냉각시키고, 4M NaOH (1.0 mL) 및 50 mg/mL 의 Na-(+)-L-아스코르베이트 (2.5 mL) 를 함유하는 10 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 7.4 를 첨가하여, 생성물을 안정화시키고, 산성 용액을 중화하였다. 생성물의 정제를 반분취용 방사성-HPLC 로 달성하였다. 생성물 분획을 수집하고, 멸균 및 무-피로겐 바이알로 멸균 필터를 통해 통과시켰다. 6R- 또는 6S-[18F]1 의 품질 컨트롤은 분석적 방사성-HPLC 에서 수행되었다. 합성의 끝에서, 350-1600 MBq (1-5% d.c. 수율) 의 최종 방사성 트레이서를 수득하였다. SA 는 46-250 GBq/μmol 범위였고, 방사성 화학물질 순도는 95% 초과였다.
반분취용 방사성-HPLC 정제는, 용매 시스템으로서 10 mM NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 7.4) 및 50 mg/mL 의 Na-(+)-L-아스코르베이트 중 0.1% EtOH (용매 A) 및 10 mM NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 7.4) 및 50 mg/mL 의 Na-(+)-L-아스코르베이트 중 40% EtOH (용매 B) 및 하기 구배: 0 - 15 분: 100 - 85% A, 15 - 40 분: 85% A, 및 4 mL/min 의 유속 (280 ㎚) 을 사용하여 수행되었다. 분석적 방사성-HPLC 는, 용매 시스템으로서 50 mM NaH2PO4 (pH 6.5) (용매 A) 및 50 mM NaH2PO4 중 30% MeCN (pH 8.0) (용매 B) 및 하기 구배: 0 - 14 분: 100 - 45% A, 14 - 17 분: 45 - 0% A, 17 - 25 분: 0% A, 25 - 26 분: 0 - 100 % A, 26 - 32 분: 100% A, 및 1 mL/min 의 유속 (280 ㎚) 을 사용하여 수행되었다.
실시예
6: 분포 계수의 결정
6S-[18F]1 및 6R-[18F]1 의 분포 계수 (logD7.4) 는, 문헌 (Boss et al, (2015) Comparative Studies of Three Pairs of α- 및 γ-Conjugated Folic Acid Derivatives Labeled with Fluorine-18. Bioconjug. Chem. acs.bioconjchem.5b00644; Wilsonet al, (2001) An admonition when measuring the lipophilicity of radiotracers using counting techniques. Appl. Radiat. Isot. 54, 203-208.) 에 보고된 셰이크 플라스크 방법을 사용하여 결정되었다 (표 1). 간략하게, 방사성 트레이서는 포스페이트 완충액 (500 μL, pH 7.4) 및 n-옥탄올 (500 μL) 의 혼합물에 실온에서 첨가되었다. 샘플은 15 분 동안 오버헤드 셰이커에서 셰이킹되었고, 3 분 동안 5000 rpm 에서 원심분리되어 두 상을 분리하였다. 두 상의 분취액 (50 μL) 은 에펜도르프 튜브에 첨가된 다음, γ-카운터 (Wizard, PerkinElmer) 에서 분석되었다. 분할 계수는 n-옥탄올 및 포스페이트 완충 상의 방사능 농도 (cpm/mL) 사이의 방사성 (radio) 으로서 표현된다. 값은 두 독립적인 실험에서의 6회의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
표 1: 폴레이트 및 프테로에이트의 LogD7.4 값의 개요.
실시예
7: 시험관 내 특징규명
비-방사성활성 레퍼런스 화합물 6R-1 및 6S-1 의 결합 친화도는, [3H]엽산에 의한 변위 검정에서 KB 세포를 사용하여 결정되었다. 결과 (표 2) 는 두 레퍼런스 부분입체이성질체 6R-1 및 6S-1 가 FR-α 에 대해 유사한 높은 친화도를 갖고, 6S- 및 6R-5-MTHF 의 값과 유사하다는 것을 보였다. 동일한 실험 조건 하에서 엽산의 IC50 값은 0.6 ± 0.1 nM 로 확인된 한편, 3'-아자-2'-[18F]플루오로엽산은 IC50 값이 1.4 ± 0.5 nM 이었다. 산화 형태에 비해, 상응하는 환원된 아자-폴레이트 유도체, 6R-1 및 6S-1 은 FR-α 에 대해 약 17-배 낮은 친화도를 보인다.
표 2: 6R- 및 6S-5-MTHF 및 엽산에 비한, 6R- 및 6S-3'-아자-2'-플루오로-5-MTHF (6R-1 및 6S-1) 의 FR-α 에 대한 시험관 내 결합 친화도 데이터의 비교. (n = 3).
실시예
8: 세포 흡수 및 내재화
FR-특이적 세포 흡수 및 내재화를 조사하기 위해, 6R-[18F]1 및 6S-[18F]1 의세포 흡수 및 내재화가, FR-양성 KB 세포를 사용하여 수행되었다. 두 부분입체이성질체에 대해 시간에 따라 지속적으로 세포 흡수가 증가하여, 37℃ 에서 인큐베이션 3 h 후 총 첨가된 방사능의 약 60% (단백질의 0.3 mg 당 계산됨) 의 흡수가 유도되었다 (도 22). 내재화된 활성은 6R-[18F]1 에 대해 약 8% 였고, 6S-[18F]1 에 대해 약 두 배 더 높은 것으로 밝혀졌다 (16%). 6R-[18F]1 및 6S-[18F]1 은 높은 생체 내 안정성을 보였다. 단지 완전한 모 화합물만이 방사성 트레이서의 30 분 p.i. 에서 취해진 샘플에서 확인되었다. 6R- 및 6S-[18F]1 은 산화된 엽산 트레이서보다 더욱더 안정하였고, 여기서 간의 방사성 대사산물이 검출되었다. 방사성 트레이서와 과량의 엽산의 공동-인큐베이팅에 의한 FR-α 의 블로킹은 0.2% 미만의 방사성 폴레이트 흡수 저해를 유도하였다
실시예
9: 대사산물 연구
폴레이트 방사성 트레이서 6S/6R-[18F]5 (1:1 비, 53.7-52.3 MBq; ~0.62-1.15 nmol) 를 트레이서의 생체 내 안정성을 결정하기 위해 마우스에 정맥 주사하였다. 트레이서의 주사 60 분 후 마우스를 희생시키고, 혈액, 소변 및 간을 수집하고 분석하였다. 0.025% (v/v) 암모늄 히드록시드 및 10 mg/mL 2-메르캅토에탄올 함유 매우-저온 메탄올을 혈장, 균질화된 간 및 소변에 첨가하여, 단백질을 침전시켰다.6 원심분리 후, 혈장, 간 및 소변 샘플의 상청액은 방사성-UPLC 에 의해 분석되었다 (도 4). 샘플의 분석은 방사성 트레이서 주입 60 분 후 단지 완전한 모 트레이서 6S/6R-[18F]1 만을 나타냈다.
실시예 10:
18
F-기반 환원된 폴레이트의 생체 내 조사: 6
R
-3'-아자-2'-[
18
F]플루오로-5-MTHF (6
R
-[
18
F]1) 및 6
R
-3'-아자-2'-[
18
F]플루오로-5-MTHF (6
S
-[
18
F]1)
6R-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (6R-[18F]1), 6S-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (6S-[18F]1) 각각의 주입 후 15 마리의 KB 종양을 갖는 마우스로 생체내 분포 연구를 수행하였다. 3 회 포인트에 대한 값 (방사성 트레이서의 주입 30 분, 60 분 및 90 분 후) 는 표 1 및 표 2 에 제시된다. 블로킹 실험의 경우, 마우스는 트레이서 10 분 전에 100 ㎍ 의 엽산을 주입 받고, 60 분 p.i 에 희생되었다.
표 1.
주입 후 상이한 시점에서 KB 종양을 갖는 마우스에서의 6R-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (6R-[18F]1) 의 생체내 분포.
나타난 값은 3 내지 4 마리 동물로부터의 데이터의 평균 ± S.D. 를 나타냄.
표 2.
주입 후 상이한 시점에서 KB 종양을 갖는 마우스에서의 6S-3'-아자-2'-[18F]플루오로-5-MTHF (6S-[18F]1) 의 생체내 분포.
나타난 값은 3 내지 4 마리 동물로부터의 데이터의 평균 ± S.D. 를 나타냄.
생체내 분포 연구는 6R- 및 6S-부분입체이성질체 모두에 대해 높은 종양 흡수를 보였다. 이미 30 분 p.i. 에서, 6R-[18F]1 에 대해 13.3 ± 1.80% IA/g 및 6S-[18F]1 에 대해 11.13 ± 0.90% IA/g 의 높은 종양 흡수가 관찰되었다 (도 5). 종양 흡수는 6R-이성질체에 대해 23.9 ± 2.74% IA/g 및 6S-이성질체에 대해 19.2 ± 4.16% IA/g (90 분 p.i. 에서) 로, 시간에 따라 추가로 증가하였다. 이러한 값은 대략 산화된 트레이서 3'-아자-2'-[18F]플루오로엽산 (12.59 ± 1.77 % IA/g) 에서 수득된 방사능 축적량의 2배였다. 종양 흡수는 엽산의 사전-주입에 의해 효율적으로 블록되었다. 종양 결합의 특이성은 R- 및 6S-이성질체에 대해 각각 85% 및 89% 였다. 유의한 더 높은 양의 방사능이, 6S-트레이서 (8.10 ± 1.16% IA/g) 에 비해 6R-트레이서 (14.3 ± 1.36% IA/g) (30 분 p.i.) 의 경우 간에서 확인되었다. 90 분 p.i. 에서, 간의 방사능 흡수는 6R-이성질체 (16.8 ± 3.58% IA/g) 의 경우 약간 증가한 한편, 방사능 수준은 S-이성질체 (5.86 ± 1.11% IA/g) 의 경우 감소하였다. 비장 흡수는 이미 30 분 p.i. 에서 6R-이성질체의 경우 현저히 증가하였고, 90 분 p.i. 에서 6S-이성질체 (1.82 ± 0.49% IA/g) 에 비해 6R-이성질체 (13.0 ± 4.14% IA/g) 의 경우 7-배 더 높은 흡수가 관찰되었다. 대조적으로, 신장 흡수는 30 분 p.i. 에서 6R-[18F]1 에 비해 6S-[18F]1 의 경우 상당히 더 높았고 (6R-형태: 34.5 ± 2.45% IA/g, 6S-형태: 42.5 ± 2.73% IA/g), 부분입체이성질체 둘 모두의 경우 시간에 따라 거의 일정하게 유지되었다 (90 분 p.i.: 6R-형태: 29.8 ± 7.46% IA/g, 6S-형태: 42.3 ± 7.05% IA/g). 그러나, 두 값은 모두 3'-아자-2'-[18F]플루오로엽산 (57.3 ± 8.40 % IA/g) 에 비해 상당히 낮았다. 침샘 흡수에서의 유의한 차이가 또한, 두 부분입체이성질체에 대해 관찰되었고, 여기서 6S-이성질체의 3-배 더 높은 양이 침샘 90 분 p.i. 에서 확인되었다 (6R-형태: 7.31 ± 1.17% IA/g, 6S-형태: 21.4 ± 4.59% IA/g).
종양-대-신장 비는 6S-[18F]1 의 경우 유의하게 더 낮았고 (30 분 p.i.: 0.26 ± 0.01% IA/g), 90 분 p.i. 에서 0.45 ± 0.07% IA/g 의 값으로 1.7 배 증가하였다 (도 6). 대조적으로, 6R-[18F]1 의 종양-대-신장 비는 이미 30 분 p.i. 에서 0.39 ± 0.05% IA/g 였고, 90 분 p.i. 에서 0.83 ± 0.17% IA/g 로 2.1 배 증가하였다. 따라서, 6R-[18F]1 의 종양-대-신장 비는 각각 6S-[18F]1 및 3'-아자-2'-[18F]플루오로엽산에 비해 대략 2- 및 4-배 더 높다. 종양-대-간 비는 6S-[18F]1 의 더 낮은 간 흡수로 인해, 모든 조사된 시점에서 6R-이성질체에 비해 6S-이성질체의 경우 더 높았다. 따라서 간에서 90 분 p.i. 에서, 6S-이성질체에 비해 6R-[18F]1 의 3-배 더 높은 축적이 관찰되었다 (6R-형태: 16.8 ± 3.58 % IA/g, 6S-형태: 5.86 ± 1.11 % IA/g). 간에서의 S-이성질체의 더 낮은 흡수는, 간 가까이에 위치하는 FR-양성 종양을 묘사하는 것을 허용할 수 있기 때문에 영상 관점으로부터 유리하다. 종양-대-혈액 비는 두 이성질체 모두에 대해 시간에 따라 일정하게 증가하였고, 6S-이성질체의 비는 6R-이성질체에 비해 유의하게 더 높았다.
가장 관련 있는 장기 및 조직에서의 시간-의존성 조직 분포가 도 7 및 8 에 나타난다.
상이한 장기 및 조직에서의 두 18F-폴레이트 트레이서의 축적된 활성은 도 9 에 나타난다.
각각의 방사성 트레이서의 주입 30 분, 60 분 및 90 분 후에서 종양-대-백그라운드 비는 도 10-12 에 나타난다.
실시예 11: PET/CT 영상 연구
실험 계획은 표 3 에 제시된다.
방사성 트레이서의 주입 1 h, 2 h 및 3 h 후에 스캔된 각 마우스의 PET/CT 영상 (최대 강도 프로젝션, maximal intensity projection (MIP)) 이 도 13-18 에 나타난다.
높은 KB 종양 이종이식 흡수가 이미 1 h p.i. 에서 방사성 트레이서 모두에 대해 관찰되었고, 종양은 두 화합물 모두에 대해 3 h p.i. 에서 높은 강도로 매우 잘 시각화되었다. 그러나, 간에서의 방사능 축적은 주로 6R-이성질체에 대해 관찰되었고, 3 h p.i. 후, 간 흡수는 거의 관찰되지 않았다. FR-양성 신장은 1 h p.i. 에서 6R-[18F]1 로 명백히 시각화되었지만, 3 h p.i. 에서는 거의 관찰되지 않았다. 대조적으로, 높은 신장 축적이 모든 조사된 시점에서 6S-[18F]1 의 경우 관찰되었다. 추가로, 높은 방사능 흡수는 침샘에서 명백하였다. 블로킹 연구는, 방사성 트레이서의 투여 10 분 전 엽산을 주입함으로써 수행되었고, 모든 FR-양성 조직 (KB 종양 이종이식, 신장, 침샘 및 맥락총) 에서 6R-[18F]1 및 6S-[18F]1 의 현저히 감소된 흡수를 유발하였다 (도 15 및 도 17).
생체내 분포 및 PET 영상 결과를 기초로, 6S-이성질체는 바람직하게는 신장 경로를 통해 배출되는 한편, 6R-이성질체는 주로 간 담도 경로를 통해 배출되는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 12: 세포 흡수 및 내재화 연구는 RT16 및 D4 세포로 지칭되는, FR-α 및 FR-β 형질감염된 CHO 세포로 수행되었다.
FR-α 및 FR-β 각각을 발현하는, RT16 및 D4 세포에서의 산화 (18F-아자Fol) 및 환원된 18F-폴레이트 (18F-5-Me-아자-THF 의 6S-이성질체 및 6R-이성질체) 의 흡수 및 내재화를 연구하였다. 두 세포주는 모두 Larry Matherly Wayne State University, Detroit, U.S.; Golani et al., J Med Chem, 2016, 59, 7856 에 의해 호의적으로 제공되었다
FR-α 를 발현하는 RT16 종양 세포를 사용하는 경우, 모든 세 18F-폴레이트 트레이서 (산화 및 환원된 버젼) 는 유사한 흡수를 보였고, 이는 인큐베이션 1 h 후 43-50% 범위였고, 3 h 후 56-66% 범위였다. 방사성 트레이서의 내재화된 분획은 인큐베이션 1 h 후 8-10% 에 도달하였고, 3 h 후 9-12% 까지 약간 증가하였다.
FR-β 를 발현하는 D4 세포를 사용하는 경우, 환원된 방사성 트레이서의 6S-이성질체 및 18F-아자Fol 의 흡수는 인큐베이션 1 h 후 대략 70% 에 도달하였고, 3 h 후 80% 에 도달하였다. 환원된 버젼의 6S-이성질체 및 18F-아자Fol 의 내재화된 분획은 인큐베이션 1 h 후 각각 20% 및 12% 였다. 이러한 수는 인큐베이션 시간이 3 h 으로 연장된 경우 약간 증가하였다. 그러나, 이러한 D4 세포를 사용하는 것은, 단지 3% 의 환원된 폴레이트 방사성 트레이서 (6R-이성질체) 만이 흡수되었고, 약 1% 가 내재화되었다는 것을 보였다. 추가 2 h 인큐베이션 후 변화는 관찰되지 않았다.
환원된 버젼의 방사성 트레이서 (6S-이성질체) 및 18F-아자Fol 의 유의한 흡수는, RT16 (FR-α) 세포뿐 아니라 D4 세포 (FR-β) 세포를 사용하는 경우 관찰되었다 (도 23). 환원된 폴레이트의 6R-이성질체는 RT16 세포로의 보다 높은 흡수 (FR-α-선택성을 나타냄) 를 보인 한편, D4 세포로의 흡수는 매우 낮았다 (도 24 및 도 25). 이러한 결과는 6R-이성질체 (6S-5Me-THF 로 지칭되는 환원된 폴레이트의 천연 버젼에 상응함) 가 FR-α 에 선택적으로 결합한다는 가설과 일치했다.
Claims (14)
- 시험관 내 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo) 에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화에서 또는 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 및 이의 치료의 모니터링에서 사용하기 위한, 식 Ia 또는 Ib 의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[식 중,
R1, R2 는 서로 독립적으로 H 또는 직쇄 또는 분지형 C1-C6 알킬이고,
R3, R4 는 서로 독립적으로 H, 포르밀, 또는 메틸임]. - 제 1 항에 있어서,
R1, R2 가 서로 독립적으로 H 또는 직쇄 또는 분지형 C1-C6 알킬이고,
R3 이 메틸이고,
R4 가 H 인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염. - 제 1 항에 있어서, 식 IIa 또는 IIb 를 갖는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[식 중,
R1, R2 는 서로 독립적으로 H, 또는 C1-C12 알킬임]. - 제 1 항에 있어서, 식 IIIa 또는 IIIb 를 갖는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
. - 제 1 항에 있어서, 99% 초과의 입체이성질 순도; 또는 99.5% 초과의 입체이성질 순도를 갖는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 염이 알칼리 또는 알칼리 토금속 염, 소듐, 포타슘, 마그네슘 또는 칼슘 염인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상화 방법으로서, 상기 방법이 진단적 영상화 양의, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 적어도 하나를 투여하는 단계, 및 상기 세포 또는 세포 집단의 진단적 영상을 얻는 단계를 포함하는 진단적 영상화 방법.
- 제 7 항에 있어서, 진단적 영상화가 시험관 내 또는 생체 내에서 폴레이트-수용체를 발현하는 세포 또는 세포 집단에 대해 수행되는 진단적 영상화 방법.
- 제 7 항에 있어서, 진단적 영상화가 인간 난소 암종 세포에 대해 수행되는 진단적 영상화 방법.
- 조직 샘플에서 폴레이트 수용체를 발현하는 세포의 시험관 내 검출 방법으로서, 결합이 발생하고, 오토라디오그래피 (autoradiography) 등에 의해 상기 결합을 검출하는 것을 허용하는, 충분한 시간 및 조건 동안, 유효량의 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 상기 조직 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 시험관 내 검출 방법.
- (i) 진단적 영상화 양의, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 적어도 하나를 투여하는 단계, 및 (ii) 상기 적어도 하나의 화합물로부터 신호를 검출함으로써 PET 를 사용하여 진단적 영상화를 수행하는 단계를 포함하는 대상체의 진단적 영상화 방법.
- (i) 진단적 영상화 양의, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 적어도 하나를 투여하는 단계, 및 (ii) 상기 적어도 하나의 화합물로부터 신호를 검출함으로써 PET 를 사용하여 진단적 영상화를 수행하는 단계를 포함하는 대상체의 모니터링에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- (i) 치료적 활성물질과 함께 진단적 영상화 양의, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 적어도 하나를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계, 및 (ii) 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 치료 과정을 따르기 위해 상기 적어도 하나의 화합물로부터 신호를 검출함으로써 PET 를 사용하여 진단적 영상화를 수행하는 단계를 포함하는 대상체의 암 또는 염증성 및 자가면역 질환 치료의 모니터링에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 염증성 및 자가면역 질환의 진단 또는 치료의 임의의 다른 방법과 함께 사용되는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
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