KR20190009330A

KR20190009330A - Pet-영상화 면역조정제

Info

Publication number: KR20190009330A
Application number: KR1020187036396A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 제이. 도넬리; 케네스 엠. 보이; 윤후이 장; 준영 김; 아드리엔 페나
Original assignee: 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2017-05-17
Publication date: 2019-01-28
Also published as: LT3458111T; CY1124241T1; IL262962B; JP6953444B2; HRP20210644T8; ES2864091T3; CA3024844A1; AU2017268291B2; EP3458111A1; IL262962A; US20190117801A1; HUE054306T2; SI3458111T1; JP2019520328A; MX2018014028A; CN109414514A; US20210386876A1; KR102378288B1; BR112018073642A2; EA038019B1

Abstract

본 발명은 체내의 다양한 과정을 영상화하기 위한, 질환 병리상태와 연관된 분자의 위치를 검출하기 위한, 및 질환 진행을 모니터링하기 위한 ¹⁸F-표지된 밀라분자의 합성 및 용도에 관한 것이다.

Description

PET-영상화 면역조정제

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 5월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/338,872를 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.

본 개시내용은 일반적으로 ¹⁸F-보결분자단을 함유하는 면역조정제 및 체내의 다양한 과정을 영상화하기 위한, 질환 병리상태와 연관된 분자의 위치를 검출하기 위한, 및 질환 진행을 모니터링하기 위한 ¹⁸F-표지된 면역조정제의 합성 및 용도에 관한 것이다.

양전자 방출 단층촬영 (PET)은 높은 감도 (fmol), 높은 해상도 (4-10 mm) 및 정량화될 수 있는 조직 유착을 사용하는, 진단 의약 및 약물 개발에서 가장 광범위하게 사용되는 방법 중 하나가 된 비-침습성 영상화 기술이다. PET 영상화에 의해 제공되는 살아있는 대상체에서의 생물학적 과정에 대한 가치있는 생체내 기능적 정보는 또한 동일한 도구가 전임상적 및 임상적 둘 다로 사용될 수 있다는 점에서 고유한 과도적 의료 이점을 제공한다.

PET는 ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ¹¹C, ¹⁵0, ¹³N, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁶Br, ⁸⁹Zr, ⁹⁴mTc, ⁸⁶Y 및 ¹²⁴I를 포함하는 양전자-방출 방사성동위원소로 표지된 분자의 설계 및 합성에 의존한다. 생체내에서, 이들 방사성추적자 또는 방사성리간드는 사용되는 동위원소에 따라 상이한 에너지를 갖는 동위원소의 핵으로부터 양전자를 방출한다. 분출된 양전자의 에너지는 그것이 반대 방향으로의 2개의 511 keV 감마선의 방출을 발생시키는 전자와 충돌하기 전에 그것이 이동하는 평균 거리를 제어한다. 이 양전자 소멸 사건에 의해 생성되는 감마선은 PET 영상화 스캐너에 의해 검출되어 시간의 함수로서 방사성추적자의 분포를 보여주는 평면 및 단층촬영 영상을 생성한다. 따라서, 다른 방출 예컨대 감마선, 알파 입자 또는 베타 입자에 의해 유발되는 소멸 및 선량측정 문제 전에 양전자가 이동하는 거리를 최소화하기 위해, 낮은 분출 에너지 동위원소를 갖는 순수한 양전자 방출체인 동위원소가 PET 영상화를 위해 바람직하다.

또한, PET 영상화에 사용되는 동위원소의 반감기는 방사성추적자 분자의 합성 및 분석, 환자로의 주사, 생체내 국재화, 비-표적 조직으로부터의 클리어런스, 및 선명한 영상의 생성을 가능하게 하기에 충분히 길어야 한다. ¹⁸F (β⁺ 635 keV 97%, t_1/ ₂ 110분)는 그의 낮은 양전자 방출 에너지, 측면 방출의 결여, 및 적합한 반감기 때문에 가장 광범위하게 사용되는 PET 방출 동위원소 중 하나이다.

본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 연결된 니트로-피리딘 및 말단 아지드를 함유하는 ¹⁸F-표지된 보결분자단으로 치환된 밀라분자에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 이관능성 접합 모이어티를 함유하는 밀라분자 (예를 들어, 고리 구속된 알킨 기를 가짐)는 "클릭" 생물직교 반응을 통해 ¹⁸F-표지된 보결분자단의 말단 아지드와 공유 결합을 형성하여 생리학적 조건 하에 안정한 방사성표지된 프로브를 생성한다. 생성된 생성물의 UV 흡광도는 추가로 생성물의 방사화학적 순도를 결정하기 위한 실용적이고 감도 높고 신속한 분석 방법을 제공한다. 이들 ¹⁸F 표지된 밀라분자는 가치있는 치료 정보를 제공할 수 있는 세포 및 조직 예컨대 종양에서 PD-L1의 존재를 검출하는 데 유용하다.

본 개시내용의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백할 것이며, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

도 1은 양측 PD-L1 (+) L2987 및 PD-L1 (-) 이종이식 종양을 보유하는 마우스에서의 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드의 대표적인 PET/CT 영상이다.
도 2는 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자에 대한 평균 시간-활성 곡선을 제시한다.
도 3은 비-인간 영장류에서의 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자의 대표적인 PET 영상이다.
도 4는 이종이식편 (A &B) 및 인간 비소세포 폐암 생검 조직 (C &D)에서의 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자의 자가방사도 영상을 제시한다.

그의 제1 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며,

여기서 x는 1 내지 8의 정수이고 R은 C₁-C₆알킬 기이다.

제2 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며,

여기서 x는 1 내지 8의 정수이고 R은 C₁-C₆알킬 기이다.

제3 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (III)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

제4 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (IV)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며,

여기서 x는 1 내지 8의 정수이고 R은 C₁-C₆알킬 기이다.

제5 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

제6 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (I)-(V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 영상을 수득하는 방법을 제공하며, 방법은

a) 화합물을 대상체에게 투여하는 것; 및

b) 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캐닝에 의해 화합물의 생체내 분포를 영상화하는 것

을 포함한다.

제6 측면의 제1 실시양태에서, 화학식 (I)-(V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 영상화된 분포는 질환의 존재 또는 부재를 나타낸다.

제7 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환의 진행을 모니터링하는 방법을 제공하며, 방법은

(a) 제1 시점에 질환의 진행의 모니터링을 필요로 하는 대상체에게 질환의 존재와 연관된 표적 분자에 결합하는 화학식 (I)-(V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하고 대상체의 적어도 한 부분의 영상을 수득하여 이환 세포 또는 조직의 양을 결정하는 것; 및

(b) 1회 이상의 후속적인 시점에 대상체에게 화합물을 투여하고 각각의 시점에 대상체의 적어도 한 부분의 영상을 수득하는 것

을 포함하며; 여기서 각각의 시점에서의 이환 세포 또는 조직의 치수 및 위치는 질환의 진행을 나타낸다.

제8 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 이환 세포 또는 조직을 정량화하는 방법을 제공하며, 방법은

(a) 이환 세포 또는 조직을 갖는 대상체에게 이환 세포 또는 조직과 함께 위치하는 표적 분자에 결합하는 화학식 (I)-(V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것; 및

(b) 이환 세포 또는 조직에서의 ¹⁸F의 방사능 방출을 검출하는 것

을 포함하며, 여기서 이환 세포 또는 조직에서의 방사능 방출의 수준 및 분포는 이환 세포 또는 조직의 정량적 척도이다.

제8 측면의 제1 실시양태에서, 질환은 고형암, 조혈암, 혈액암, 자가면역 질환, 신경변성 질환, 심혈관 질환 및 병원성 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

제9 측면에서, 본 개시내용은 PD-L1을 발현하는 조직 또는 세포의 정량적 영상을 수득하는 방법을 제공하며, 방법은 세포 또는 조직을 PD-L1에 결합하는 화학식 (I)-(V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염과 접촉시키는 것, 및 양전자 방출 단층촬영 (PET)을 사용하여 PD-L1을 발현하는 조직을 검출 또는 정량화하는 것을 포함한다.

제10 측면에서, 본 개시내용은 질환을 치료하기 위한 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 방법은

(a) PD-L1을 발현하는 세포를 후보 작용제의 존재 및 부재 하에 PD-L1에 결합하는 화학식 (I)-(V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염과 접촉시키는 단계; 및

(b) 양전자 방출 단층촬영 (PET)을 사용하여 후보 작용제의 존재 및 부재 하에 세포를 영상화하는 단계

를 포함하며, 여기서 후보 작용제의 존재 하의 방사능 방출의 양의 감소는 작용제가 PD-L1에 결합한다는 것을 나타낸다.

제11 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 진단제 또는 제약 조성물을 제공한다.

제12 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 화합물을 생성하는 데 사용하기 위한 반응 전구체, 및 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 생성하기 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 영상화제로서 사용하기 위한 화학식 (I)-(V)에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환을 진단하는 데 사용하기 위한 화학식 (I)-(V)에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 전형적으로, 진단은 대상체에서의 질환의 진행의 검출 또는 모니터링을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 화학식 (I)-(V)에 따른 화합물은 진단을 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 이환 세포 및 조직의 직접적 가시화는 양전자 방출 단층촬영을 사용하여 수행된다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (I)-(V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 사용하여, PD-L1 발현의 조직 및 세포에서의 수준 및 분포와 관련된, 대상체에서 질환을 생체외 진단하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환의 진행을 시험관내 모니터링하는 방법을 제공하며, 방법은

(a) 제1 시점에; 하나의 대상체의 세포 또는 조직의 샘플을 질환의 존재와 연관된 표적 분자에 결합하는 화학식 (I)-(V)의 화합물과 접촉시키고 양전자 방출 단층촬영을 사용하여 영상을 수득하는 것; 및

(b) 1회 이상의 후속적인 시점에; 세포 또는 조직의 또 다른 샘플을 화학식 (I)-(V)의 화합물과 접촉시키고 각각의 시점에 영상을 수득하는 것

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 이환 세포 또는 조직을 시험관내 정량화하는 방법을 제공하며, 방법은

(a) 하나의 대상체의 세포 또는 조직의 샘플을 질환의 존재와 연관된 표적 분자에 결합하는 화학식 (I)-(V)의 화합물과 접촉시키고 양전자 방출 단층촬영을 사용하여 영상을 수득하는 것; 및

(b) 이환 세포 또는 조직에서 ¹⁸F의 방사능 방출을 검출하는 것

본 개시내용의 측면 중 임의의 것의 한 실시양태에 따르면, 질환은 PD-L1을 발현하는 조직 및 세포에서의 수준 및 분포와 관련된다. 전형적으로, 질환은 고형암, 조혈암, 혈액암, 자가면역 질환, 신경변성 질환, 심혈관 질환 및 병원성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 질환은 고형암이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 개시내용은 화학식 (I)-(V)에 따른 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

¹⁸F-보결분자단 및 ¹⁸F-보결분자단을 생성하는 방법이 본원에 기재된다. 또한 ¹⁸F-보결분자단을 함유하는 방사성표지된 조성물, 및 이환 세포 및/또는 조직, 및 관련 생물학적 상태를 진단, 국재화, 모니터링 및/또는 평가하기 위한 이들 방사성표지된 조성물의 용도가 본원에 기재된다.

본 발명의 설명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖고, 질량 분광분석법, NMR, HPLC, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법이 사용된다.

본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. "또는" 또는 "및"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 게다가, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함하다", "포함한다" 및 "포함한"의 사용은 제한하는 것이 아니다.

본원에 사용된 "약"은 수의 플러스 또는 마이너스 10% 이내를 의미한다. 예를 들어, "약 100"은 90과 110 사이의 임의의 수를 지칭할 것이다. 본원에 사용된 "의료 영상화"는 임상 목적 (질환을 나타내거나, 진단하거나 또는 모니터링하는 것을 추구하는 의료 절차) 또는 의학 (통상 해부학 및 생리학 연구 포함)을 위한 대상체의 신체 (또는 그의 부분)의 영상을 생성하는 데 사용되는 기술 및 과정을 지칭한다.

본원에 사용된 "양전자 방출 단층촬영" 또는 "PET"는 체내 추적자 위치의 3차원 영상을 생성하는 비-침습성, 핵 의료 기술을 지칭한다. 방법은 생물학적 활성 분자 상에 체내로 도입된 양전자-방출 방사성핵종 (추적자)에 의해 간접적으로 방출된 감마선의 쌍을 검출한다. PET 영상화 도구는 매우 다양한 용도를 갖고, 전임상적 및 임상적 둘 다로 약물 개발을 보조한다. 예시적인 용도는 표적의 생체내 포화의 직접적 가시화; 정상 조직에서의 흡수를 모니터링하여 독성 또는 환자 대 환자 변동을 예측하는 것; 이환 조직; 종양 전이를 정량화하는 것; 및 시간 경과에 따른 약물 효능, 또는 시간 경과에 따른 내성을 모니터링하는 것을 포함한다.

용어 "생물직교 화학"은 천연 생화학적 과정을 방해하지 않으면서 살아있는 시스템 내부에서 발생할 수 있는 임의의 화학 반응을 지칭한다. 용어는 물 중, 또는 물의 존재 하에 생리학적 pH에서 시험관내에서 발생하는 화학 반응인 화학 반응을 포함한다. 생물직교로 간주되기 위해, 반응은 선택적이고, 출발 화합물에서 발견되는 다른 관능기와의 부반응을 피한다. 또한, 반응 파트너 사이에 생성된 공유 결합은 강하면서 생물학적 반응에 대해 화학적으로 불활성이어야 하고, 목적하는 분자의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않아야 한다.

용어 "클릭 화학"은 신규 화합물 및 조합 라이브러리의 신속 합성을 위한 일련의 신뢰가능하고 선택적인 생물직교 반응을 지칭한다. 클릭 반응의 특성은 생리학적 조건 하에 안정한 화합물을 생성하기 위해 모듈성, 넓은 범위, 높은 수율, 입체특이성 및 단순한 생성물 단리 (비-크로마토그래피 방법에 의한 불활성 부산물로부터의 분리)를 포함한다. 방사화학 및 방사제약에서, 클릭 화학은 선택적 및 모듈 빌딩 블록을 사용하고, 촉매의 부재 하에 화학선택적 라이게이션이 생물학적으로 관련된 화합물을 방사성표지할 수 있게 하는 일련의 표지화 반응에 대한 일반적인 용어이다. "클릭 반응"은 구리에 의할 수 있거나, 또는 구리-무함유 클릭 반응일 수 있다.

용어 "보결분자단" 또는 "이관능성 표지제"는 밀라분자에 연결될 수 있는 방사성핵종 (예를 들어, ¹⁸F)을 함유하는 유기 소분자를 지칭한다.

본원에 사용된, "생물학적 표적"에 대한 일반적 언급으로서의 "표적"은 세포, 조직 (예를 들어, 암 또는 종양), 병원성 미생물 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균, 식물, 프리온, 원충 또는 그의 부분) 또는 생물학적 경로, 또는 생물학적 현상, 예컨대 조직 염증, 플라크 형성 등과 연관된 다른 분자를 지칭한다.

용어 "표적화 리간드", "표적화제" 또는 "표적화 분자"는 또 다른 분자에 결합하는 분자, 예컨대 펩티드, 밀라분자 등을 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 특정 실시양태에서, 표적화제는 특정한 세포, 조직, 병원체 또는 생물학적 경로와 연관된 분자를 "표적화"하기 위해 ¹⁸F-보결분자단에 결합된다.

본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다", "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합하다"는 생물학적 표적에 대해 친화도를 나타내지만, 관련 기술분야에서 이용가능한 기술, 예컨대, 비제한적으로, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 비아코어(BIACORE) 검정)에 의해 측정 시 다른 분자에 유의하게 결합하지 않는 (예를 들어, 약 10% 미만으로 결합하는) 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "IC₅₀"은 시험관내 또는 생체내 검정에서 최대 억제 반응의 50%인 수준까지, 즉 최대 억제 반응과 비처리 반응 사이의 절반으로 반응을 억제하는 ¹⁸F-방사성표지된-밀라분자 기반 프로브의 농도를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다.

용어 "진단" 또는 "검출"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 진단이 통상적으로 조직의 특정 조직학적 상태를 정의하는 것으로 지칭되는 반면, 검출은 특정한 검출가능한 표적을 함유하는 조직, 병변 또는 유기체를 인식하고 그의 위치를 나타낸다.

용어 "검출가능한"은 배경 신호를 초과하는 신호를 검출하는 능력을 지칭한다. 영상화제 및 진단제와 관련하여 본원에 사용된 용어 "검출가능한 신호"는 비-침습성 영상화 기술 예컨대, 비제한적으로, 양전자 방출 단층촬영 (PET)으로부터 유래된 신호이다. 검출가능한 신호는 대상체로부터 생성될 수 있는 다른 배경 신호로부터 검출가능하고 구별가능하다. 다시 말해서, 검출가능한 신호와 배경 사이에 측정가능하고 통계적으로 유의한 차이가 존재한다 (예를 들어, 통계적으로 유의한 차이는 검출가능한 신호와 배경 사이를 구별하기에 충분한 차이, 예컨대 검출가능한 신호와 배경 사이의 약 0.1%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 40% 또는 그 초과의 차이임). 표준 및/또는 보정 곡선은 검출가능한 신호 및/또는 배경의 상대 강도를 결정하는 데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 영상화제를 포함하는 조성물의 "검출가능한 유효량"은 임상 용도에 이용가능한 장비를 사용하여 허용되는 영상을 생성하기에 충분한 양으로 정의된다. 본원에 제공된 영상화제의 검출가능한 유효량은 1회 초과의 주사로 투여될 수 있다. 검출가능한 유효량은 개체의 감수성의 정도, 개체의 연령, 성별 및 체중, 개체의 특이 반응 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 영상화 조성물의 검출가능한 유효량은 또한 사용되는 기기 및 방법론에 따라 달라질 수 있다. 이러한 인자의 최적화는 관련 기술분야의 기술 수준 내에서 충분히 이루어진다.

영상화제와 관련하여 본원에 사용된 용어 "투여하는"은 영상화제를 포함하는 조성물을, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 영상화제를 위한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의하는, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 영상화제는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여는 또한 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "공-투여" 등은 단일 환자에 대한 선택된 제약 작용제의 투여를 포괄하는 것으로 의도되고, 작용제가 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 또는 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 요법을 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "환자" 및 "대상체"는 본원에 기재된 영상화제를 포함하는 조성물을 받는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 시험관내 용도, 예컨대 시험관내 진단 및 연구 용도를 위해, 상기 대상체의 체액 및 세포 샘플, 예컨대 혈액, 소변 또는 조직 샘플이 사용에 적합할 것이다.

용어 "샘플"은 조직 샘플, 세포 샘플, 유액 샘플 등을 지칭할 수 있다. 샘플은 대상체로부터 취해질 수 있다. 조직 샘플은 모발 (모근 포함), 협측 스왑, 혈액, 타액, 정액, 근육, 또는 임의의 내부 기관으로부터의 것을 포함할 수 있다. 유액은 소변, 혈액, 복수, 흉막액, 척수액 등일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 신체 조직은 피부, 근육, 자궁내막, 자궁 및 자궁경부 조직을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "동위원소적으로 순수한"은 요소, 화합물 또는 조성물이 하나의 동위원소를 다른 동위원소에 비해 더 큰 비율로 함유하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 요소, 화합물 또는 조성물은 약 40%, 50% 또는 60% 초과로 동위원소적으로 순수하다.

본원에 사용된 바와 같이, 표지된 분자는 표지된 분자가 비표지된 분자로부터 부분적으로 또는 전체적으로 분리됨으로써, 표지된 분자의 분획이 출발 혼합물에 비해 농축된 경우에 "정제된"다. "정제된" 표지된 분자는 표지된 및 비표지된 분자의 혼합물을, 약 5:95; 10:90; 15:85; 20:80; 25:75; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 75:25; 80:20; 85:15; 90:10; 95:5; 97:3; 98:2; 99:1 또는 100:0을 포함하나 이에 제한되지는 않는 거의 모든 비로 포함할 수 있다.

기 "OTf"는 화학식 CF₃SO₃을 갖는 트리플레이트 또는 트리플루오로메탄술페이트를 지칭한다.

용어 "할로" 또는, 대안적으로, "할로겐" 또는 "할라이드"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도를 의미한다.

명세서 전반에 걸쳐, 기 및 그의 치환기는 안정한 모이어티 및 화합물 및 제약상 허용되는 화합물로서 유용한 화합물 및/또는 제약상 허용되는 화합물을 제조하는 데 유용한 중간체 화합물을 제공하도록 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.

본원에 기재된 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.

¹⁸F 방사성표지된 보결분자단

한 측면에서, 하기 구조를 갖는 아지드에 공유 결합된 PEG화 ¹⁸F-피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이 본원에 제공되며,

여기서 x는 1 내지 8의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 3 내지 5의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 4이다. 관련 실시양태에서, ¹⁸F는 N 원자에 대해 오르토인 피리딘에 부착된다. 일부 실시양태에서, [O(CH₂)₂]_x 모이어티는 피리딘 고리 상의 질소에 대해 1-3 배위에 존재한다. 일부 실시양태에서, [O(CH₂)₂]_x 모이어티는 피리딘 고리 상의 질소에 대해 1-2 배위에 존재한다. 다른 실시양태에서, [O(CH₂)₂]_x 모이어티는 피리딘 고리 상의 질소에 대해 1-4 배위에 존재한다.

일부 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 화합물은 하기 구조 또는 그의 제약상 허용되는 염을 가지며,

여기서 x는 1 내지 8의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 3 내지 5의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 4이다. 일부 실시양태에서, [O(CH₂)₂]_x 모이어티는 피리딘 고리 상의 질소에 대해 1-3 배위에 존재한다. 일부 실시양태에서, [O(CH₂)₂]_x 모이어티는 피리딘 고리 상의 질소에 대해 1-2 배위에 존재한다. 다른 실시양태에서, [O(CH₂)₂]_x 모이어티는 피리딘 고리 상의 질소에 대해 1-4 배위에 존재한다.

일부 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 화합물은 하기 구조를 가지며,

여기서 x는 1 내지 8의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 3 내지 5의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 4이다.

일부 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 화합물은 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘 (¹⁸F-FPPEGA)이고, 하기 구조를 갖는다.

대안적 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 보결분자단은 플루오린화 반응을 방해하지 않는 피리딘 고리 상의 추가의 기를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피리딘 고리에 대한 부가는 C₁ _-6 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸 및 프로필을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 보결분자단은 하기 구조를 갖는 융합된 고리계이며,

여기서 "OPEG"는 [O(CH₂)₂]_x이고, x는 1 내지 8의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 3 내지 5의 정수이다. 일부 실시양태에서, x는 4이다.

관련 측면에서, 하기 구조를 갖는 아지드에 공유 결합된 PEG화 ¹⁸F-피리딘을 제조하는 방법이 본원에 제공되며,

여기서 x는 1 내지 8의 정수이며, 방법은

(a) x가 1 내지 8의 정수이고, R이 NO_2, Br, F 또는

이고 피리딘 고리의 N 원자에 대해 오르토인 하기 구조를 갖는 화합물 a의 용액을 제공하는 단계;

(b) ¹⁸O물 중 ¹⁸F, 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로[8.8.8]헥사코산 및 약염기의 혼합물을 제공하는 단계;

(c) 단계 (b)로부터의 혼합물을 건조시켜 고체를 형성하는 단계; 및

(d) 단계 (a)로부터의 용액을 단계 (c)로부터의 고체와 반응시켜 ¹⁸F-표지된 화합물을 형성하는 단계

를 포함한다.

특정 실시양태에서, 방법은 하기 구조 b를 갖는 ¹⁸F-피리딘 보결분자단을 생성하고

(여기서 ¹⁸F는 N 원자에 대해 오르토임),

(a) X가 NO₂, Br 또는

인 하기 구조의 화합물의 용액을 제공하는 단계

(여기서 X는 N 원자에 대해 오르토임);

(b) ¹⁸O물 중 ¹⁸F, 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로[8.8.8]헥사코산 및 약염기, 예컨대 K₂CO₃의 혼합물을 제공하는 단계;

를 포함한다.

특정 실시양태에서, 방법은 추가로 하기 제시된 반응식 I에 따라 하기 구조 a를 갖는 화합물을 생성하는 단계를 포함한다.

특정 실시양태에서, 방법은 하기 반응 조건:

에 따라 d로부터 e, ¹⁸F-피리딘 보결분자단 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘 (¹⁸F-FPPEGA)을 생성하는 것을 포함한다.

제제

제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본원에 기재된 ¹⁸F-표지된 표적화제 중 1종 또는 그의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물이 추가로 제공된다. 이러한 조성물은 (예를 들어, 2종 이상의 상이한) 본원에 기재된 작용제 중 1종 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 제약 조성물은 ¹⁸F-표지된 표적화제 및 약물의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, ¹⁸F-표지된 표적화제는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 또는 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

본원에 기재된 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하면서 임의의 목적하지 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 산 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.

본원에 기재된 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.

본원에 기재된 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한 아주반트 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 상기의 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시키는 것에 의해 이루어질 수 있다.

제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 본원에 기재된 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.

제약 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균이고 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 다가알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내로 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시키는 것에 의해 이루어질 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 ¹⁸F-표지된 표적화제를 요구되는 양으로 상기 열거된 성분 중 1종 또는 그의 조합을 갖는 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 플러스 이전의 그의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.

단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 ¹⁸F-표지된 표적화제의 양은 치료되는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 ¹⁸F-표지된 표적화제의 양은 일반적으로 검출가능한 효과를 생성하는 조성물의 그러한 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 제약상 허용되는 담체와 조합된 활성 성분의 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 활성 성분의 약 1% 내지 약 30% 범위일 것이다.

투여 및 영상화

본원에 기재된 ¹⁸F-표지된 표적화제는 다양한 생체내 영상화 용도에 유용하다 (예를 들어, 조직 또는 전신 영상화를 위함). 특정 실시양태에서, ¹⁸F-표지된 표적화제는 표적-양성 세포 또는 조직, 예를 들어, 표적 발현 종양을 영상화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표지된 ¹⁸F-표지된 표적화제는 ¹⁸F-표지된 표적화제가 관심 조직 내로 흡수되기에 충분한 양으로 대상체에게 투여된다. 이어서, 대상체는 영상화 시스템 예컨대 PET를 사용하여 ¹⁸F 방사성핵종에 적절한 시간 양 동안 영상화된다. 이어서, 표적화제를 발현하는 세포 또는 조직에 결합된 ¹⁸F-표지된 표적화제가 영상화 시스템에 의해 검출된다.

전형적으로, 영상화 목적을 위해 약 1 mg 내지 200 mg 범위인 밀라분자의 투여량을 단일 정맥내 주입으로서 수용자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 상황이 좌우하는 바에 따라 더 낮은 또는 더 높은 투여량이 또한 투여될 수 있다. 전형적으로, 전형적인 성인의 경우에 단백질 또는 펩티드의 체표면적의 제곱 미터당 약 1 mg 내지 10 mg 범위인 투여량을 수용자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 상황이 좌우하는 바에 따라 더 낮은 또는 더 높은 투여량이 또한 투여될 수 있다. 영상화 목적을 위해 인간 대상체에게 투여될 수 있는 단백질 또는 펩티드의 투여량의 예는 약 1 내지 200 mg, 약 1 내지 70 mg, 약 1 내지 20 mg, 및 약 1 내지 10 mg이지만, 더 높은 또는 더 낮은 용량이 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 투여는 1일에 약 0.005μg/kg 체중 내지 약 50μg/kg 체중, 통상적으로 0.02μg/kg 체중 내지 약 3μg/kg 체중의 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자의 양으로 발생한다. PET 추적자와 연관된 질량은 천연 동위원소 형태, 즉 ¹⁸F PET 추적자의 경우 ¹⁹F로 존재한다. 본 발명의 조성물을 위한 특정한 분석 투여량은 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자의 약 0.5μg 내지 약 100μg을 포함한다. 투여량은 통상적으로 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자의 약 1μg 내지 약 50μg일 것이다.

투여 요법은 ¹⁸F-표지된 표적화제를 흡수한 조직 또는 세포의 선명한 영상을 수득하기 위한 최적의 검출가능한 양을 제공하도록 조정된다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 ¹⁸F-표지된 표적화제가 투여될 대상체를 위한 단일 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭한다. 본원에 기재된 투여 단위 형태에 대한 규격은 (a) ¹⁸F-표지된 표적화제의 표적화 부분의 고유한 특징; (b) 표적화될 조직 또는 세포; (c) 사용되는 영상화 기술에서 고유한 제한에 의해 좌우되고 그에 직접적으로 의존한다.

¹⁸F-표지된 표적화제의 투여의 경우에, 사용되는 투여량은 질환 유형, 사용되는 표적화 화합물, 대상체의 연령, 신체적 상태 및 성별, 질환의 정도, 검사될 부위, 및 다른 것들에 따라 달라질 것이다. 특히, 대상체에의 노출 용량에 대해 충분한 관리가 이루어져야 한다. 바람직하게는, ^18-F의 포화 용량이 환자에게 투여된다. 예를 들어, ¹⁸F-표지된 표적화제의 방사능의 양은 통상적으로 3.7 메가베크렐 내지 3.7 기가베크렐, 및 바람직하게는 18 메가베크렐 내지 740 메가베크렐 범위이다. 대안적으로, 투여량은 예를 들어 밀리퀴리로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 영상화 연구를 위해 투여되는 ¹⁸F 영상화제의 양은 5 내지 10 mCi이다. 다른 실시양태에서, 유효량은 약 1-5 mCi 범위에서 방출을 생성하기에 충분한 화합물의 양일 것이다.

본원에 기재된 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서, 특정한 환자의 세포 또는 조직, 조성물, 및 투여 방식에서 ¹⁸F-표지된 표적화제의 목적하는 흡수를 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 그러나, 본 개시내용의 ¹⁸F-표지된 표적화제의 총 1일 용법은 담당 의사 또는 다른 담당 전문가에 의해 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정한 대상체에 대한 구체적 유효 용량 수준은, 예를 들어, 사용되는 구체적 조성물의 활성; 사용되는 구체적 조성물; 숙주의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 사용되는 구체적 화합물의 배출 속도; 치료 지속기간; 사용되는 특정한 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 기타 인자를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 영상화에 요구되는, 인간 대상체 내로 투여되는 ¹⁸F-방사성표지된 프로브의 양은 처방 의사에 의해 결정될 것이며, 투여량은 일반적으로 ¹⁸F-방사성핵종으로부터의 방출의 양에 따라 달라질 것이다.

본원에 기재된 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 1개 이상을 사용하여 1개 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 ¹⁸F-표지된 표적화제에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의하는, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 특정 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물은 정맥내로 투여된다.

대안적으로, 본원에 기재된 ¹⁸F-표지된 표적화제는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 ¹⁸F-표지된 표적화제는 적절한 생체내 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 작용제는 그들을, 예를 들어, 리포솜 내에서 제제화함으로써 BBB를 가로지를 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1개 이상의 모이어티를 포함하므로, 표적화된 약물 전달을 증진시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조); 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하며; 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994)]을 참조한다.

하기 예시된 절차는 임상에서 환자에 대한 PET 영상화 연구를 수행하는 경우에 이용될 수 있다. 환자를 실험일 전 어느 때에 비표지된 밀라분자로 예비투약하고, 물은 자유롭게 섭취하게 하면서 적어도 12시간 동안 금식시킨다. 혈중 방사성추적자 투여 농도를 위해 20 G 2-인치 정맥 카테터를 반대측 척골 정맥 내에 삽입한다.

환자를 PET 카메라 내에 위치시키고 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자의 PET 추적자의 추적자 용량 (<20 mCi)을 i.v. 카테터를 통해 투여한다. 동맥 또는 정맥 혈액 샘플을 PET 스캔 전반에 걸쳐 적절한 시간 간격으로 취하여 혈장에서 [¹⁸F] 실시예 2 화합물의 비대사된 PET 추적자의 분획을 분석 및 정량화한다. 영상을 최대 120분 동안 획득한다. 방사성추적자의 주사 10분 이내 및 영상화 세션의 말미에, 1 ml 혈액 샘플을 수득하여 PET 추적자 전에 투여되었을 수 있는 임의의 비표지된 밀라분자의 혈장 농도를 결정한다.

단층촬영 영상을 영상 재구성을 통해 수득한다. 방사성추적자의 분포를 결정하기 위해, 관심 영역 (ROI)을 폐, 간, 심장, 신장, 피부 또는 다른 기관 및 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 재구성된 영상 위에 도시한다. 이들 영역에서의 시간 경과에 따른 방사성추적자 흡수를 사용하여, 검사된 다양한 투여 패러다임에서 임의의 개입의 부재 하에 또는 비표지된 밀라분자의 존재 하에 수득된 시간 활성 곡선 (TAC)을 생성한다. 데이터는 단위 부피당 단위 시간당 방사능으로 표시된다 (μCi/cc/mCi 주사된 용량). TAC 데이터를 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 처리하여, 비점유된 표적 양성 조직의 밀도에 비례하는 정량적 파라미터, 예컨대 결합 잠재력 (BP) 또는 분포 부피 (V_T)를 생성한다.

키트 및 제조 물품

본원에 기재된 ¹⁸F-방사성표지된 표적화 조성물을 생성하기 위한 키트 및 사용에 대한 지침서가 또한 제공된다. 키트는 전형적으로 지침서와 미리 결정된 양의 시약 패키징된 조합물, 및 키트의 내용물의 의도되는 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다.

예를 들어, 일부 실시양태에서, 키트는 보결분자단이 ¹⁸F로 부위 상에서 플루오린화된 다음, 표적화 분자 (예를 들어, 투여 전의 밀라분자)에 방사선표지된 보결분자단을 연결시키는 조건에 있기에 필요한 시약을 함유한다.

특정 실시양태에서, 키트는 ¹⁸F 표지된 항-PD-L1 밀라분자 생체내 영상화제, 예컨대 본원에 기재된 것을 형성하는 데 필요한 1종 이상의 시약을 포함한다. 예를 들어, 키트는 항-PD-L1 밀라분자를 포함하는 제1 바이알 및 [¹⁸F]FPPEGA를 포함하는 제2 바이알을 포함할 수 있다. 키트는 항-PD-L1 밀라분자를 포함하는 제1 바이알, 4-PEG-토실-아지드를 포함하는 제2 바이알 및 O¹⁸ 물 중 ¹⁸F를 포함하는 제3 바이알을 포함할 수 있다. 키트는 추가로 바이알, 용액 및 임의로 PD-L1 밀라분자-PEG4-DBCO-¹⁸F의 제조에 필요한 추가의 시약을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는 추가로 적어도 1종의 추가의 시약 (예를 들어, 제약상 허용되는 담체)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 방법에 따라 표지된 프로브를 생성하는 데 사용될 반응 전구체를 포함한다. 키트의 성분은 본원에 기재된 바와 같이 모니터링될 특정한 생물학적 조건에 맞춤화될 수 있다. 키트는 추가로 숙주 세포 또는 숙주 유기체에게 상기 열거된 성분의 다양한 조합을 투여하기 위한 관련 기술분야에 공지된 적절한 완충제 및 시약을 포함할 수 있다. 영상화제 및 담체는 용액 중에 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 키트의 영상화제 및 담체가 동결건조 형태인 경우에, 키트는 멸균되고 생리학상 허용되는 재구성 매질 예컨대 물, 염수, 완충 염수 등을 임의로 함유할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 이는 추가로 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용에 대한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.

용도

¹⁸F-표지된 표적화제를 사용하여 영상화하는 방법이 본원에 제공된다. 양전자 방출 단층촬영 (PET) 추적자 예컨대 본 발명의 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 PET 프로브는 시험관내 및 생체내 탐색 및 진단 영상화 용도에 사용하기 위한 현재 이용가능한 PET 기술과 함께 사용될 수 있다. PET 스캐닝에 의한 ¹⁸F 영상화를 위한 영상화 기술 및 장비는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,358,489; 6,953,567; 문헌 [Page et al., Nuclear Medicine And Biology, 21:911-919, 1994; Choi et al., Cancer Research 55:5323-5329, 1995; Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582, 1992] 참조), 임의의 이러한 공지된 PET 영상화 기술 또는 장치가 이용될 수 있다.

본원에 제공된 영상화 방법의 생체내 용도는 질환 진단, 질환 진행, 예후의 모니터링, 대상체가 치료에 반응할 가능성의 결정, 치료에 대한 적격성의 결정, 요법에 대한 임상 반응의 모니터링, 치료 화합물의 임상 평가 및 용량 선택, 동물 모델에서의 잠재적 약물 후보의 전임상 연구, 및 조직 및 기관에서의 표적 분자의 영역적 분포 및 농도의 연구를 포함한다. 시험관내 용도는 세포 검정 (예를 들어, 경쟁 검정, 친화도 검정 등)에서의 약물 후보의 스크리닝을 포함한다.

일부 실시양태에서, ¹⁸F-표지된 표적화제는 환자에서 후보 치료 화합물에 의한 조직 점유의 수준과 임상 효능 사이의 관계를 결정하기 위해; 장기간 임상 연구의 개시 전 약물 후보의 임상 시험을 위한 용량 선택을 결정하기 위해; 및 상이한 약물 후보의 효력을 비교하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물은 정상 또는 이환 조직 및/또는 기관 (예를 들어, 폐, 심장, 신장, 간 및 피부)의 생체내 영상화 방법에 사용된다. 예를 들어, ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물은 ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물의 관심 세포 또는 조직 내로의 흡수를 발생시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 이어서, 대상체는 ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물의 검출을 가능하게 하기에 충분한 시간 양 동안 적절한 영상화 시스템 (예를 들어, PET 시스템)에 도입된다. ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물로부터 검출된 신호의 위치는 관심 세포 또는 조직의 위치와 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 위치의 치수가 또한 결정될 수 있다. 생체내 영상화가 본원에 기재된다. 또한 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,126,916; 6,077,499; 6,010,680; 5,776,095; 5,776,094; 5,776,093; 5,772,981; 5,753,206; 5,746,996; 5,697,902; 5,328,679; 5,128,119; 5,101,827; 및 4,735,210을 참조한다.

따라서, 특정 측면에서, ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브의 영상을 수득하는 방법이 제공되며, 방법은 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브를 대상체에게 투여하는 것, 및 PET에 의해 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브의 생체내 분포를 영상화하는 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 유인원, 원숭이, 래트 또는 마우스이다.

특정 측면에서, 대상체에서 질환의 존재를 진단하는 방법이 제공되며, 방법은 질환의 존재의 진단을 필요로 하는 대상체에게 질환의 존재와 연관된 표적 분자에 결합하는 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브를 투여하는 것, 및 대상체의 적어도 한 부분의 방사성-영상을 수득하여 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 질환은 고형암, 조혈암, 혈액암, 자가면역 질환, 신경변성 질환, 심혈관 질환 또는 병원성 감염이다.

¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물을 사용한 PET 영상화는 표적화 화합물을 정성적으로 또는 정량적으로 검출하는 데 사용될 수 있다. ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물 영상화제는 바이오마커로서 사용될 수 있고, 대상체에서의 양성 신호의 존재 또는 부재는, 예를 들어, 대상체가 주어진 요법, 예를 들어, 암 요법에 반응할 것인지, 또는 대상체가 요법에 반응하고 있는지 또는 그렇지 않은지를 나타낼 수 있다.

일부 실시양태에서, 이 방법의 단계는 질환의 위치 및/또는 크기가 시간 및/또는 치료의 함수로서 모니터링될 수 있도록 결정된 간격으로 반복될 수 있다. 특정 실시양태에서, ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물은 치료 (예를 들어, 화학요법 등)를 받는 대상체에서, 치료에 대한 반응을 가시화하는 것을 보조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물은 환자에서 질환의 진행 또는 퇴행을 모니터링하기 위해, 전형적으로 치료 전에, 및 치료 동안 주기적으로 (예를 들어, 매일, 매주, 매월, 이들 사이 간격 등) 가시화되고 사이징될 수 있다.

따라서, 특정 측면에서, 질환의 진행의 모니터링을 필요로 하는 대상체에서 질환의 진행을 모니터링하는 방법이 제공되며, 방법은 제1 시점에 대상체에게 질환의 존재와 연관된 표적 분자에 결합하는 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브를 투여하고 대상체의 적어도 한 부분의 영상을 수득하여 이환 세포 또는 조직의 양을 결정하는 것, 및 1회 이상의 후속적인 시점에 대상체에게 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브를 투여하고 각각의 후속적인 시점에 대상체의 적어도 한 부분 (예를 들어, 제1 시점과 동일한 부분)의 영상을 수득하는 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, 종양의 크기는 암 요법 (예를 들어, 화학요법, 방사선요법)을 받는 대상체에서 모니터링될 수 있고, 종양 퇴행의 정도는 ¹⁸F-방사성표지된 종양 표적화의 검출에 기초하여 실시간으로 모니터링될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원의 방법은 요법에 대한 환자의 반응을 평가하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료 화합물의 투여량을 선택하거나 또는 변형하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 방법은 독성 또는 환자별 변동을 분석하기 위해 정상 조직에서의 ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물의 흡수를 모니터링하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 방법은 약물 효능을 모니터링하거나 또는 약물 내성을 검출하는 데 사용된다.

일부 실시양태에서, 방사성표지된 화합물은 표준 제약 실시에 따라, 포유동물, 바람직하게는 인간에게, 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여, 제약 조성물로 투여된다. 이러한 조성물은 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여 경로를 포함하여 경구로 또는 비경구로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여는 정맥내이다. 특정 실시양태에서, 방사성표지된 화합물은 합성 1시간 미만 내에 정맥내 주사를 통해 투여된다.

일부 실시양태에서, 생체내 ¹⁸F-방사성표지된 표적화제의 생물학적 활성은 적절한 동물 모델에서의 생체분포 연구 및 동적 소형 동물 PET 영상화 연구에 의한 기관-특이적 흡수의 관점에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 생체분포 연구의 경우, 동물의 군은 ¹⁸F-방사성표지된 표적화제로 주사되고, 동물의 하위세트는 하나 이상의 시간 간격 (예를 들어, 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간)으로 희생된다. 관심 기관 및 조직은 신속하게 절제 및 칭량되고, 방사능 결정된다. 기관 및 선택된 조직에서의 축적된 방사능은 주사된 용량의 백분율로서 계산된다 (%ID).

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 ¹⁸F-방사성표지된 표적화제는 조직 또는 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 화합물을 선택하기 위한 스크리닝 도구로서 시험관내에서 사용된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이환 세포는 1종 이상의 후보 약물에의 노출 동안 또는 그 후에 ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물과 함께 인큐베이션된다. 약물 후보가 질환에 영향을 미치는 능력은 ¹⁸F-방사성표지된 표적화 화합물을 사용하여 시간 경과에 따라 영상화될 수 있다.

예를 들어, 선택된 표적 분자에 대한 특이적 결합 및 방사성표지된 조성물의 흡수의 관점에서 시험관내 ¹⁸F-방사성표지된 표적화제의 생물학적 활성의 완전성은 표적 분자를 발현하는 세포주에서 평가된다. 결합 및 세포 회합 검정의 경우, 세포는 4℃ 또는 37℃에서 적절한 시간 동안 ¹⁸F-방사성표지된 표적화 조성물과 함께 인큐베이션된다. 비특이적 결합은 과량의 비표지된 표적화제의 첨가에 의해 결정된다. 특이적 결합의 정도는 총 결합에서 비특이적 결합을 감산함으로써 계산된다. 흡수는 단백질의 마이크로그램당 세포에 대한 표적화제의 총 첨가된 용량의 백분율로서 표시된다 (%ID/μg 세포 단백질).

관련 측면에서, 본 발명은 ¹⁸F-방사성표지된 밀라분자-기반 프로브 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 생체내 또는 시험관내 진단 또는 방사성제약 조성물을 제공한다.

참조로 포함

특허 문서 및 웹사이트를 포함한 본원에 기재된 모든 문서 및 참고문헌은 전체적으로 또는 부분적으로 본 문서에 기록된 것과 동일한 정도로 본 문서에 참조로 개별적으로 포함된다.

본 개시내용은 이제 하기 실시예를 참조하여 기재되며, 이는 단지 예시적이고 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용이 상세하게 및 그의 구체적 실시양태와 관련하여 기재되었으나, 그의 취지 및 범주에서 벗어나지 않으면서 그에 대해 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

분석 조건 A:

칼럼: 워터스(Waters) BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴:물, 10 mM 아세트산암모늄 함유; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴:물, 10 mM 아세트산암모늄 함유; 온도: 50℃; 구배: 0% B, 3분에 걸쳐 0-100% B, 이어서 100% B에서 0.5분 유지; 유량: 1 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV.

분석 조건 B:

칼럼: 워터스 BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm 입자; 이동상 A: 5:95 메탄올:물, 10 mM 아세트산암모늄 함유; 이동상 B: 95:5 메탄올:물, 10 mM 아세트산암모늄 함유; 온도: 50℃; 구배: 0% B, 3분에 걸쳐 0-100% B, 이어서 100% B에서 0.5분 유지; 유량: 0.5 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV.

단일-커플링 절차:

이전 단계로부터의 수지를 함유하는 반응 용기에 피페리딘:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 3 또는 5분 동안 주기적으로 교반한 다음, 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 반응 용기에 피페리딘:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 3 또는 5분 동안 주기적으로 교반한 다음, 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 수지를 하기와 같이 연속하여 5회 세척하였다: 각각의 세척에 대해, DMF (4.0 mL)를 용기의 상단을 통해 첨가하고, 생성된 혼합물을 60초 동안 주기적으로 교반한 후에 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 반응 용기에 아미노산 (DMF 중 0.2M, 5.0 mL, 10 당량), 이어서 HATU 또는 HCTU (DMF 중 0.2M, 5.0 mL, 10 당량), 및 최종적으로 NMM (DMF 중 0.8M, 2.5 mL, 20 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 60분 동안 주기적으로 교반한 다음, 반응 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 수지를 하기와 같이 연속하여 4회 세척하였다: 각각의 세척에 대해, DMF (4.0 mL)를 용기의 상단을 통해 첨가하고, 생성된 혼합물을 30초 동안 주기적으로 교반한 후에 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 반응 용기에 아세트산 무수물:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 주기적으로 교반한 다음, 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 수지를 하기와 같이 연속하여 4회 세척하였다: 각각의 세척에 대해, DMF (4.0 mL)를 용기의 상단을 통해 첨가하고, 생성된 혼합물을 90초 동안 주기적으로 교반한 후에 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 생성된 수지를 직접 후속 단계에 사용하였다.

이중-커플링 절차:

이전 단계로부터의 수지를 함유하는 반응 용기에 피페리딘:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 3분 동안 주기적으로 교반한 다음, 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 반응 용기에 피페리딘:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 3분 동안 주기적으로 교반한 다음, 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 수지를 하기와 같이 연속하여 3회 세척하였다: 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척, 이어서 하단으로부터의 DMF (7 mL) 세척 및 최종적으로 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척. 반응 용기에 아미노산 (DMF 중 0.2M, 2.5 mL, 5 당량), HATU (DMF 중 0.5M, 1.0 mL, 5 당량), 및 DIPEA (NMP 중 2M, 0.5 mL, 10 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N₂ 버블링에 의해 75℃에서 5분 동안, 50℃에서 커플링된 Fmoc-Cys(Trt)-OH 및 Fmoc-His(Trt)-OH를 제외한 모든 아미노산에 대해 혼합하고, 반응 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 수지를 하기와 같이 연속하여 3회 세척하였다: 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척, 이어서 하단으로부터의 DMF (7 mL) 세척 및 최종적으로 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척. 반응 용기에 아미노산 (DMF 중 0.2M, 2.5 mL, 5 당량), HATU (DMF 중 0.5M, 1.0 mL, 5 당량), 및 DIPEA (NMP 중 2M, 0.5 mL, 10 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N₂ 버블링에 의해 75℃에서 5분 동안, 50℃에서 커플링된 Fmoc-Cys(Trt)-OH 및 Fmoc-His(Trt)-OH를 제외한 모든 아미노산에 대해 혼합하고, 반응 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 수지를 하기와 같이 연속하여 3회 세척하였다: 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척, 이어서 하단으로부터의 DMF (7 mL) 세척 및 최종적으로 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척. 반응 용기에 아세트산 무수물:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 65℃에서 2분 동안 주기적으로 버블링한 다음, 용액을 프릿을 통해 배출하였다. 수지를 하기와 같이 연속하여 3회 세척하였다: 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척, 이어서 하단으로부터의 DMF (7 mL) 세척 및 최종적으로 상단으로부터의 DMF (7 mL) 세척. 생성된 수지를 직접 후속 단계에 사용하였다.

하기 펩티드는 .1 mmol에서 합성되었다. 밑줄친 단은 이중-커플링 절차를 사용하고, 이탤릭체 잔기는 30분 단일 커플링으로 커플링되었다. ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Dap-Leu-Hyp-Trp-Dab-[(S)-2-아미노-3-(1-(카르복시메틸)-1H-인돌-3-일)프로판산]--[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Leu-Cys-Gly-[(S)-프로파르길글리신]; 여기서 (S) 프로파르길글리신을 2-클로로트리틸 수지 상에 혼입시켰다. 상기 절차에 따른 탈보호 및 고리화 후, 화합물을 하기와 같이 정제하였다: 조 물질을 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건 하에 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지(XBridge) C18, 19 x 200 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 메탄올:물, 10-mM 아세트산암모늄 함유; 이동상 B: 95:5 메탄올:물, 10-mM 아세트산암모늄 함유, 구배: 30분에 걸쳐 45-85% B, 이어서 100% B에서 5분 유지; 유량: 20 mL/분. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켰다. 생성물의 수율은 16.4 mg이었고, LCMS 분석에 의한 그의 추정 순도는 96%였다. 분석 조건 A: 체류 시간 = 1.49분; ESI-MS(+) m/z 992.3 (M + 2H), 가장 풍부한 이온. 분석 조건 B: 체류 시간 = 3.02분; ESI-MS(+) m/z 992.3 (M + 2H), 가장 풍부한 이온; ESI-HRMS(+) m/z: 계산치: 991.9953 (M+2H)

실측치: 991.9926 (M+2H).

[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘의 합성

시약 및 조건: a) NaN₃, 에탄올 90℃ 17시간; b) NaH, 2-니트로피리딘-3-올 0-60℃, 4시간; c) K.2.2.2 K[¹⁸F], DMSO 120℃ 10분;

실시예 1: 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠술포네이트의 제조

((옥시비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일) 비스(4-메틸벤젠술포네이트) (5 g, 9.95 mmol) 및 아지드화나트륨 (0.647 g, 9.95 mmol)의 혼합물을 에탄올 (50 mL) 중에 용해시키고, 반응물을 90℃에서 17시간 기간에 걸쳐 환류시켰다. 용매를 부분적 진공을 사용하여 제거한 다음, 40 그램 실리카 카트리지 상에 로딩하고, 플래쉬 크로마토그래피 (이스코콤비플래쉬(IscoCombiFlash) - 헥산 중 10% 에틸 아세테이트에서 출발하여 45분 기간에 걸쳐 헥산 중 90% 에틸 아세테이트로 진행하는 선형 구배 방법을 사용하여 용리함)를 사용하여 정제하였다. 풀링된 분획을 TLC에 의해 체크하고, 합하여 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠술포네이트를 무색 오일로서 수득하였다. 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠술포네이트 생성물의 반응성 성질로 인해, 이 물질을 임의의 추가의 특징화 없이 "그 자체"로 사용하였다.

실시예 2: 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘의 제조

0℃에서 DMF (10 mL) 중 수소화나트륨 (0.129 g, 3.21 mmol)의 현탁액에 DMF (5 mL) 중 2-플루오로피리딘-3-올 (0.363 g, 3.21 mmol)의 교반 용액을 적가한 다음, 이어서 DMF (5 mL) 중 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠술포네이트 (1.00 g, 2.68 mmol)의 용액을 적가하였다. 현탁액을 0℃에서 10분 동안 유지한 다음, 1시간 동안 주위 온도로 되게 한 후, 60℃에서 4시간 동안 추가로 가열하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 100 ml의 에틸 아세테이트를 첨가한 후 농축 염수 용액을 사용하여 3회 개별 세척 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (이스코콤비플래쉬 - Hex 중 10 - 50% EtOAc를 사용하여 용리함)를 사용하여 정제하여 무색 오일을 수득하였다. 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘 (702 mg, 2.233 mmol, 83% 수율)을 투명한 오일로서 단리하였다. ¹H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.75 (dt, J=4.9, 1.6 Hz, 1H), 7.33 (ddd, J=10.0, 8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.10 (ddd, J=7.9, 4.9, 0.7 Hz, 1H), 4.30 - 4.16 (m, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 2H), 3.80 - 3.61 (m, 10H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H) ¹³C NMR (101MHz, 클로로포름-d) d 142.3, 137.7, 137.5, 123.4, 123.4, 121.7, 121.6, 77.3, 76.7, 70.9, 70.7, 70.6, 70.0, 69.4, 69.0, 50.6 ¹⁹F NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ -83.55. HRMS (ESI) 이론치:C13H20FN4O4+ m/z 315.464; 실측치 315.1463.

실시예 3: 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-니트로피리딘의 제조

수소화나트륨 (0.121 g, 3.01 mmol) (오일 중 60% 현탁액)을 DMF (7.0 mL) 중에 용해시키고, 생성된 현탁액을 0℃로 냉각시켰다. DMF (1.5 mL) 중 2-니트로피리딘-3-올 (0.384 g, 2.74 mmol)의 용액을 천천히 첨가한 후, DMF (1.5 mL) 중 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠술포네이트 (1.023 g, 2.74 mmol)를 적가하였다. 현탁액을 0℃에서 10분 동안 유지한 다음, 2시간 동안 주위 온도로 되게 한 후 72시간 기간 동안 60℃ 가열하였다. 반응물을 10 ml의 DI수에 이어서 에틸 아세테이트 추출물 (3 x 10 mL)로 켄칭하였다. 풀링된 EtOAc 추출물을 농축 염수 용액 (10 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 담황색 오일을 수득하였다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 24 g 실리카 카트리지, 25 mL/분, 헥산 중 10% 에틸 아세테이트에서 출발한 후, 25분 기간에 걸쳐 헥산 중 50% 에틸 아세테이트로 선형 변화시켰다. 그 후, 구배를 이 용매 조성에서 10분 동안 유지한 다음 10분 기간에 걸쳐 100% 에틸 아세테이트로 변화시켰다. 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-니트로피리딘을 크로마토그램의 30-40분 부분 사이에 용리시키고, 풀링된 분획을 감압 하에, 이어서 진공 하에 2시간 동안 증발시켜 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-니트로피리딘 (687 mg, 1.973 mmol, 72.0% 수율)을 담황색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 8.11 (dt, J=4.9, 1.6 Hz, 1H), 7.60 (ddd, J=10.0, 8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.52 (ddd, J=7.9, 4.9, 0.7 Hz, 1H), 4.30 - 4.16 (m, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 2H), 3.80 - 3.61 (m, 10H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H) ¹³C NMR (101MHz, 클로로포름-d) d 147.3, 139.5, 128.4, 124.4, 71.1, 70.7, 70.6, 70.0, 69.9, 69.3, 50.7. HRMS (ESI) 이론치:C13H20N5O6+ m/z 342.1408; 실측치 342.1409.

실시예 4: 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-브로모피리딘의 합성

0℃에서 디메틸포름아미드 (DMF, 5 mL) 중 수소화나트륨 (NaH, 25.7 mg, 0.643 mmol)의 현탁액에 DMF (1 mL) 중 2-브로모피리딘-3-올 (112 mg, 0.643 mmol)의 용액을 적가한 후, DMF (1 mL) 중 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠술포네이트 (200 mg, 0.536 mmol)의 용액을 적가하였다. 현탁액을 0℃에서 10분 동안 유지한 다음, 주위 온도로 되게 하고, 1시간 동안 유지한 후, 60℃로 4시간 동안 가열하였다. 가열이 완료되면, 조 반응 혼합물의 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 반응물을 50 mL의 에틸 아세테이트 중에 재구성하고, 2 x 50 mL의 수성 염수 용액으로 세척하고, 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 반응물을 역상 HPLC를 사용하여 정제하여 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-브로모피리딘, TFA (112 mg, 0.229 mmol, 42.7% 수율)를 담황색 오일로서 수득하였다. HRMS ESI m/z (M+H), 이론치 C13H20BrN4O4 375.0664 실측치 375.0662; ¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ 7.97 (dd, J=4.6, 1.5 Hz, 1H), 7.54 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1H), 7.40 (dd, J=8.1, 4.6 Hz, 1H), 4.24 (dd, J=5.3, 3.9 Hz,2H), 3.85 - 3.78 (m, 2H), 3.68 - 3.62 (m, 2H), 3.62 - 3.52 (m, 8H), 3.42 - 3.34 (m, 2H).

트리메틸아닐륨 화합물의 합성

실시예 5: 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-N,N-디메틸피리딘-2-아민의 합성

디메틸술폭시드 (DMSO, 2.5 mL) 중 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘 (160 mg, 0.509 mmol), 탄산칼륨 (K₂CO₃, 84 mg, 0.611 mmol), 및 디메틸아민 (물 중 40%, 0.097 mL, 0.764 mmol)의 혼합물을 밀봉된 압력-방지 용기에서 110℃에서 14시간 동안 가열하였다. 가열이 완료되면, 조 반응 혼합물의 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 반응물을 50 mL의 에틸 아세테이트 중에 재구성하고, 2 x 50 mL의 수성 염수 용액으로 세척하고, 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 반응물을 정상 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-N,N-디메틸피리딘-2-아민 (140 mg, 0.413 mmol, 81% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.86 (dd, J=4.9, 1.5 Hz, 1H), 7.02 (dd, J=7.8, 1.5 Hz, 1H), 6.73 (dd, J=7.8, 4.9 Hz, 1H), 4.20 - 4.07 (m, 2H), 3.98 - 3.86 (m, 2H), 3.81 - 3.61 (m, 9H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H), 3.13 - 2.94 (m, 6H), 1.69 (s, 2H). HRMS (ESI) 이론치:C15H26N5O4+ m/z 340.1980; 실측치 340.1979.

실시예 6: 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-N,N,N-트리메틸피리딘-2-아미늄의 합성

메틸 트리플루오로메탄술포네이트 (0.065 mL, 0.589 mmol)를 밀봉된 용기 내의 톨루엔 (1.5 mL) 중 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-N,N-디메틸피리딘-2-아민 (40 mg, 0.118 mmol)의 용액에 정상 질소 스트림 하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 14시간 기간에 걸쳐 교반하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 2x 10 ml의 에테르로 세척하고, 2 x 1 ml의 디클로로메탄으로 공비 건조시키고, 고압 진공 하에 밤새 건조시켜 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-N,N,N-트리메틸피리딘-2-아미늄, 트리플루오로메탄술포네이트 염을 정량적 수율로 농후한 무색 오일로서 수득하였다.

LCMS m/z 354.33; ¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ 8.24 - 8.17 (m, 1H), 7.98 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.75 (ddd, J=8.2, 4.6, 3.2 Hz, 1H), 4.44 (br. s., 2H), 3.88 (d, J=3.9 Hz, 2H), 3.69 - 3.45 (m, 21H).

실시예 7: 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-N,N,N-트리메틸피리딘-2-아미늄, 트리플루오로메탄술포네이트 염을 사용한 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘의 합성

수성 [¹⁸F]-플루오라이드 용액 (2.0 ml,33.3 GBq/ 900 mCi)을 펜실베니아주 웨스트 포인트 소재의 피.이.티. 네트(P.E.T. Net)® 파마슈티칼스에서 구입하여 Sep-Pak 라이트 QMA로 직접 전달하였다 [Sep-Pak 라이트 QMA 카트리지를 사용 전에 5ml의 0.5 M 중탄산칼륨, 5 ml의 탈이온수, 및 5 ml의 MeCN으로 순차적으로 사전-조건화함]. 이러한 전달이 완료되면, 탄산칼륨 (15 mg/ml; 0.1ml)에 이어서 탄산칼륨 (30 mg/ml, 0.1 ml), 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로[8.8.8]헥사코산 (15 mg, 0.04 mmol) 및 1.2 ml의 MeCN의 혼합물의 순차적 첨가에 의해 수성 [¹⁸F] 플루오라이드를 QMA Sep-Pak로부터 방출시켰다. 용매를 90℃ 및 진공에서 온화한 질소 스트림 하에 증발시켰다. 공비 건조를 1 ml 부분의 아세토니트릴로 2회 반복하여 무수 K.2.2.2/K[¹⁸F]F 복합체를 생성하였다. 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-N,N,N-트리메틸피리딘-2-아미늄, 트리플루오로메탄술포네이트 염 (2 mg, 5.6 μmol)을 500 마이크로리터의 DMSO 중에 용해시키고, 건조된 크립탄드에 첨가하였다. 이 용액을 120℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 후, 조 반응 혼합물을 3 ml의 DI수로 희석하였다. 이어서, 조 반응 혼합물의 전체 내용물을 전달하고, 로딩하고, 역상 HPLC를 사용하여 하기 조건 하에 정제하였다: HPLC 칼럼: 루나(Luna) C18 250 x 10 용매 A: DI수 중 0.1% TFA; 용매 B: 아세토니트릴 중 0.1% TFA, 4.6 ml/분의 유량, 등용매 방법 32% B를 사용함, UV를 280 nm에서 모니터링함. [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘을 크로마토그램의 24분 마크에서 단리하고, 2분 기간에 걸쳐 수집하였다. 이 생성물을 10 ml의 DI수를 함유하는 100 ml 플라스크 내에 수집하고, 전체 내용물을 워터스로부터의 Sep-Pak Vac tC18 6 cc 1g sep pack로 전달하였다. 이 반응으로부터 6.1 GBq/164 mCi의 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘을 단리하였다. 이를 3 ml의 에탄올을 사용하여 sep-pak로부터 방출시키고, 필름만이 바이알 내에 잔류할 때까지 이 용액을 98℃ 열원, 온화한 질소 스트림, 및 진공을 사용하여 15분 기간에 걸쳐 감소시켰다. 최종 생성물을 100% 1x PBS 완충제 중에 재구성하였고, 이는 이 매질에서 37℃에서 1시간 초과 동안 안정하였다.

[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘을 사용하여, 알킨을 함유하는 적절한 펩티드와의 "클릭" 아지드-알킨 반응을 이용함으로써, ¹⁸F-표지된 생성물 (예를 들어, ¹⁸F-표지된 항-PD-L1 마크로시클릭 펩티드, 하기 기재된 바와 같음)을 생성할 수 있다.

실시예 8: "클릭 화학"을 사용한 ¹⁸F-방사성표지된 마크로시클릭 펩티드의 생성

A. [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘을 형성하기 위한 4-PEG-토실-아지드 전구체의 플루오린화

수성 [¹⁸F]-플루오라이드 용액 (2.0 ml, 29.6 GBq/ 800 mCi)을 도와다의 IBA로부터 구입하고, BMS 프린스턴 뉴저지주 지점으로 운송하고, 이 샘플을 본 발명자들의 맞춤 제작된 원격 제어 합성으로 전달하였다. 이 용액을 Sep-Pak 라이트 QMA로 전달하였다 [Sep-Pak 라이트 QMA 카트리지를 사용 전에 5ml의 0.5 M 중탄산칼륨, 5 ml의 탈이온수, 및 5 ml의 MeCN으로 순차적으로 사전-조건화함]. 이러한 전달이 완료되면, 탄산칼륨 (증류수 (DI) 중 30 mg/ml, 0.1 ml), 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로[8.8.8]헥사코산 (15 mg, 0.04 mmol) 및 1.4 ml의 아세토니트릴의 혼합물의 첨가에 의해 수성 [¹⁸F] 플루오라이드를 QMA Sep-Pak로부터 방출시켰다. 용매를 90℃ 및 진공에서 온화한 질소 스트림 하에 증발시켰다. 공비 건조를 1 ml 부분의 아세토니트릴로 2회 반복하여 무수 K.2.2.2/K[¹⁸F]F 복합체를 생성하였다. 이 과정이 완료되면 크립탄드를 추가로 완전 진공 하에 15분 기간 동안 건조시켰다. 전체 과정은 완료하기까지 35분이 걸렸다.

이 건조된 [¹⁸F]/크립탄드 고체에 DMSO 중 2 mg의 3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-니트로피리딘 0.5 ml를 첨가하고, 이 혼합물을 120℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 후 조 반응 혼합물을 3 ml의 증류수로 희석한 다음, 전체 내용물을 하기 HPLC 칼럼 및 조건으로 전달 및 로딩하였다: HPLC 칼럼: 루나 C18 250 x 10 mm; 용매 A: DI수 중 0.1 % 트리플루오로아세트산 (TFA); 용매 B: 아세토니트릴 중 0.1 % TFA; 유량 4.6 ml/분; 압력 1820 PSI; 등용매 방법 32% B; UV - 280 nm. [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘 ([¹⁸F]-FPPEGA) 생성물을 크로마토그램의 24분 마크에서 단리하고, 2분 기간에 걸쳐 수집하였다. 이 생성물을 15 ml의 DI수를 함유하는 100 ml 플라스크 내에 수집하고, 전체 내용물을 Sep PakVac tC18 6 cc 1g sep pack (PN WAT036795)로 전달하였다. [¹⁸F]-FPPEGA를 2.5 ml의 에탄올을 사용하여 Sep Pak로부터 방출시키고, 이 용액을 건조 시까지 15분 기간에 걸쳐 98℃ N₂ 및 진공 하에 감소시켰다. 이 화합물을 0.1 ml DI수 중에 용해시켰다. 이 생성물을 하기를 사용하여 분석하였다: 배리안(Varian) HPLC HPLC 칼럼 루나 C18 (2) 4.6 x 150 mm 용매 A: DI수 중 0.1% TFA; 용매 B: 아세토니트릴 중 0.1% TFA; 유량 1.0 ml/분; 구배 방법 0분 90% A 10% B; 15분 30% A 70% B; 17분 30% A 70% B; 18분 90% A 10% B; 20분 90% A 10% B; UV - 280 nm. 14.1 GBq (380 mCi)의 [¹⁸F]-FPPEGA를 단리하였다. 이 생성물을 그대로 사용하여 PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드를 함유하는 알킨으로의 "클릭" 화학을 완료하였다.

B. 마크로시클릭 펩티드에 대한 [¹⁸F]-FPPEGA의 커플링

[¹⁸F]-방사성표지된 마크로시클릭 펩티드를 합성하기 위한 개략도가 도 (a)에 제시된다

(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44R,47S,49aS)-36-((1H-인돌-3-일)메틸)-6-(2-아미노-2-옥소에틸)-33-(2-아미노에틸)-47-(아미노메틸)-24,27-디부틸-30-((1-(카르복시메틸)-1H-인돌-3-일)메틸)-40-히드록시-12-(4-히드록시벤질)-21,44-디이소부틸-9,10,25,28-테트라메틸-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-테트라데카옥소헥사테트라콘타히드로-1H,5H-디피롤로[2,1-g1:2',1'-x][1]티아[4,7,10,13,16,19,22,25,31,34,37,40,43]트리데카아자시클로펜타테트라콘틴-18-카르복스아미도)아세트아미도)펜트-4-인산 (0.75 mg, 0.378 μmol)을 0.250 ml의 DI수 및 0.25 ml의 tert-부틸 알콜 중에 용해시켰다. 이 용액에 1 mg 황산제2구리 및 1 mg의 아스코르브산나트륨을 함유하는 0.250 ml DI수 용액을 첨가하였다. 최종적으로, 14.1 GBq (380 mCi)의 [¹⁸F]-FPPEGA 용액 (섹션 A에 기재된 바와 같이 제조됨) 0.1 ml를 첨가하고, 반응물을 주위 온도에서 20분 동안 온화하게 혼합하였다. 이 조 반응 생성물의 내용물에 0.5 ml의 아세토니트릴에 이어서 1.5 ml의 DI수를 첨가하고, 이 혼합물을 역상 HPLC 칼럼을 사용하여 정제하였다. HPLC 칼럼: 루나 C18 250 x 10 mm; 용매 A: DI수 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA); 용매 B: 아세토니트릴 중 0.1% TFA; 유량 4.6 ml/분; 압력 1820 PSI; 등용매 방법 37% B; UV - 220 nm. 생성물을 크로마토그램의 27-31분 마크 사이에 단리하고, 도 (b)에 제시된 바와 같이 4분 기간에 걸쳐 수집하였다. 2.5 GBq (67 mCi)의 [¹⁸F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-인돌-3-일)메틸)-6-(2-아미노-2-옥소에틸)-33-(2-아미노에틸)-47-(아미노메틸)-24,27-디부틸-30-((1-(카르복시메틸)-1H-인돌-3-일)메틸)-40-히드록시-12-(4-히드록시벤질)-21,44-디이소부틸-9,10,25,28-테트라메틸-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-테트라데카옥소헥사테트라콘타히드로-1H,5H-디피롤로[2,1-g1:2',1'-x][1]티아[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]테트라데카아자시클로펜타테트라콘틴-18-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-플루오로피리딘-3-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판산을 단리하였다. 이 용액을 추가로 20 ml의 DI수로 희석하고, 이 용액을 C-18 sep-pak (워터스 50 mg, 5 ml의 에탄올에 이어서 10 ml의 DI수로 사전-활성화시킴)에 전달하여 용액으로부터 임의의 유기 용매를 제거하였다. 이 sep-pak를 추가로 10 ml의 멸균 주사용수로 세척하였다. 이 생성물을 0.5 ml의 에탄올을 사용하여 sep-pak로부터 방출시키고, 멸균 바이알 내로 멸균 여과하고, 주사용 염수를 사용하여 5 부피% 에탄올 용액으로 희석하였다. 이 생성물을 역상 HPLC를 통해 도 (b)에 제시된 바와 같이 분석하였다: 비-방사성 표준의 공동-주사에 의한 화학적 확인, 방사화학적 순도 및 화학적 순도, 비활성. 비-방사성 참조 표준물로 공동-용리된 단리된 생성물은 100% 방사화학적으로 및 95% 화학적으로 순수하며, 0.37 (10 mCi) GBq/nmol의 비활성을 가졌다.

하기 파라미터를 사용하여 분석 역상 HPLC를 수행하였다:

조르박스(Zorbax) SB-C18 250 x 4.6 mm 칼럼; 용매 A: DI수 중 0.05% 포름산; 용매 B: 아세토니트릴 중 0.05%; 유량 1.0 ml/분; 구배 방법 20분에 걸쳐 30%에서 50% B; UV - 220 nm.

도 (a)

[¹⁸F]-방사성표지된 PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드를 합성하기 위한 개략도

[¹⁸F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-인돌-3-일)메틸)-6-(2-아미노-2-옥소에틸)-33-(2-아미노에틸)-47-(아미노메틸)-24,27-디부틸-30-((1-(카르복시메틸)-1H-인돌-3-일)메틸)-40-히드록시-12-(4-히드록시벤질)-21,44-디이소부틸-9,10,25,28-테트라메틸-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-테트라데카옥소헥사테트라콘타히드로-1H,5H-디피롤로[2,1-g1:2',1'-x][1]티아[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]테트라데카아자시클로펜타테트라콘틴-18-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-플루오로피리딘-3-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판산은 진단 영상화, 기초 연구 및 방사선치료 용도를 포함한 다양한 시험관내 및/또는 생체내 영상화 용도에 사용될 수 있다. 가능한 진단 영상화 및 방사선치료 용도의 구체적 예는 PD-L1 양성 종양의 위치, 관련 활성을 결정하고/거나 정량화하는 것, PD-L1 양성 종양의 방사선면역검정, 및 포유동물 또는 그의 기관 또는 조직 샘플에서 PD-L1 양성 종양의 분포를 결정하는 자가방사선촬영을 포함한다.

특히, [¹⁸F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-인돌-3-일)메틸)-6-(2-아미노-2-옥소에틸)-33-(2-아미노에틸)-47-(아미노메틸)-24,27-디부틸-30-((1-(카르복시메틸)-1H-인돌-3-일)메틸)-40-히드록시-12-(4-히드록시벤질)-21,44-디이소부틸-9,10,25,28-테트라메틸-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-테트라데카옥소헥사테트라콘타히드로-1H,5H-디피롤로[2,1-g1:2',1'-x][1]티아[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]테트라데카아자시클로펜타테트라콘틴-18-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-플루오로피리딘-3-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판산은 폐, 심장, 신장, 간 및 피부 및 인간 및 실험 동물의 다른 기관에서의 PD-L1 양성 종양의 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화에 유용하다. [¹⁸F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-인돌-3-일)메틸)-6-(2-아미노-2-옥소에틸)-33-(2-아미노에틸)-47-(아미노메틸)-24,27-디부틸-30-((1-(카르복시메틸)-1H-인돌-3-일)메틸)-40-히드록시-12-(4-히드록시벤질)-21,44-디이소부틸-9,10,25,28-테트라메틸-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-테트라데카옥소헥사테트라콘타히드로-1H,5H-디피롤로[2,1-g1:2',1'-x][1]티아[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]테트라데카아자시클로펜타테트라콘틴-18-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-플루오로피리딘-3-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판산을 사용한 PET 영상화는 하기 정보를 수득하는 데 사용될 수 있다: 후보 PD-L1 종양-치료 의약에 의한 조직 점유의 수준과 환자에서의 임상 효능 사이의 관계; 장기간 임상 연구의 개시 전 PD-L1 종양-치료 의약의 임상 시험을 위한 용량 선택; 구조적으로 신규한 PD-L1 종양-치료 의약의 효력 비교; PD-L1 종양-치료 의약에 의한 임상 표적의 치료 동안 생체내 수송체 친화도 및 밀도에 대한 PD-L1 종양-치료 의약의 영향 조사; 유효 및 비유효 치료 동안 PD-L1 양성 종양의 밀도 및 분포의 변화.

실시예 9: GE 트레이서랩(TRACERlab) FX2 N 합성 유닛 상의 합성 방사성합성을 위한 일반적 절차에 따른 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘의 자동화 제조

상업용 트레이서랩 FX2 N 합성 모듈 (GE)을 사용한 자동화 합성

[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘의 자동화 합성을 비-카세트 유형 GE 트레이서랩 FX2 N 합성 모듈을 사용하여 수행하였다. 합성 유닛의 설정을 표 ()에 요약한다. 수성 [¹⁸F]-플루오라이드 용액 (2.0 ml, 29.6 GBq/ 800 mCi)을 Sep-Pak 라이트 QMA로 전달하였다 [Sep-Pak 라이트 QMA 카트리지를 사용 전에 5ml의 0.5 M 중탄산칼륨, 5 ml의 탈이온수, 및 5 ml의 아세토니트릴로 순차적으로 사전-조건화함]. 이러한 전달이 완료되면, 반응기에의 용리 혼합물 ("V1"로부터의 것)의 첨가에 의해 수성 [¹⁸F] 플루오라이드를 QMA Sep-Pak로부터 방출시켰다. 용매를 온화한 질소 스트림 및 진공 하에 증발시켰다. 전구체의 용액 ("V3"으로부터의 것)을 건조된 크립탄드 잔류물에 첨가하고, 이 반응 혼합물을 10분 동안 120℃ 가열하였다. 이어서 4 ml의 증류수 ("V4"로부터의 것)를 반응기 내의 조 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 로딩의 종료를 제어하는 액체 센서를 통해 반정제용 HPLC의 5 ml 샘플 주사 루프로 전달하였다. 혼합물을 반정제용 HPLC 칼럼 (루나 C18(2). 250x10mm, 페노메넥스(Phenomenex)) 상에 로딩하였다. 수성 0.1% 트리플루오로아세트산 용액 중 35% 아세토니트릴의 혼합물을 분당 4.6 ml의 속도로 칼럼을 통해 플러싱하였다. 생성물을 이 HPLC 칼럼으로부터 15 ml 증류수를 함유하는 희석 플라스크 내에 수집하고, 그의 전체 내용물을 tC18 1 그램, 고체 상 추출 카트리지로 전달하였다. 3 ml의 에탄올에 의해 352 mCi (13 GBq)의 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘을 이 카트리지 ("V14"로부터의 것)로부터 방출시켰고, 이는 알킨을 함유하는 적절한 펩티드와의 "클릭" 아지드-알킨 반응을 이용함으로써 ¹⁸F 표지된 펩티드 생성물을 생성하는 데 사용될 수 있다.

표 (1).

실시예 10: IBA 신테라(Synthera) 합성 유닛 상에서의 합성 방사성합성을 위한 일반적 절차에 따른 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘의 자동화 제조

상업용 신테라 합성 모듈 (IBA)을 사용한 자동화 합성

[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘의 자동화 합성을 카세트 유형 IBA 신테라 합성 모듈 및 적절하게 조립된 통합 유체 프로세서 키트를 사용하여 수행하였다. 통합 유체 프로세서 (IFP) 키트에 이 합성을 위한 적절한 전구체를 로딩하였고, 이는 표 ()에 요약된다. 배리안 HPLC 유닛 상에서 정제를 수행하였다. HPLC의 주사 루프의 충전은 HPLC 유닛 상에서 정상 질소 스트림에 의해 제어하였다. 둘 다의 자동화의 설정을 표 ()에 요약한다. 수성 [¹⁸F]-플루오라이드 용액 (2.0 ml, 29.6 GBq/ 800 mCi)을 Sep-Pak 라이트 QMA로 전달하였다 [Sep-Pak 라이트 QMA 카트리지를 사용 전에 5ml의 0.5 M 중탄산칼륨, 5 ml의 탈이온수, 및 5 ml의 아세토니트릴로 순차적으로 사전-조건화함]. 이러한 전달이 완료되면, 반응기에의 용리 혼합물 ("V1"로부터의 것)의 첨가에 의해 수성 [¹⁸F] 플루오라이드를 QMA Sep-Pak로부터 방출시켰다. 용매를 온화한 질소 스트림 및 진공 하에 증발시켰다. 전구체의 용액 ("V2"으로부터의 것)을 건조된 크립탄드 잔류물에 첨가하고, 이 반응 혼합물을 120℃에서 10분 동안 가열하였다. 이어서 3 ml의 증류수 ("V4"로부터의 것)를 반응기 내의 조 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 로딩의 종료를 제어하는 액체 센서를 통해 반정제용 HPLC의 5 ml 샘플 주사 루프로 전달하였다. 혼합물을 반정제용 HPLC 칼럼 (루나 C18(2). 250x10mm, 페노메넥스) 상에 로딩하였다. 수성 0.1% 트리플루오로아세트산 용액 중 35% 아세토니트릴의 혼합물을 분당 4.6 ml의 속도로 칼럼을 통해 플러싱하였다. 생성물을 이 HPLC 칼럼으로부터 15 ml 증류수를 함유하는 희석 플라스크 내에 수집하고, 그의 전체 내용물을 tC18 1 그램, 고체 상 추출 카트리지로 전달하였다. 3 ml의 에탄올에 의해 325 mCi (12 GBq)의 [¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-2-플루오로피리딘을 이 카트리지로부터 방출시켰고, 이는 알킨을 함유하는 적절한 펩티드와의 "클릭" 아지드-알킨 반응을 이용함으로써 ¹⁸F 표지된 펩티드 생성물을 생성하는 데 사용될 수 있다.

표 (2).

실시예 11: 항-PD-L1 마크로시클릭 펩티드 영상화제에 의한 PD-L1-음성 종양으로부터 PD-L1-양성 종양의 구별

PET 영상화의 경우, 신속한 혈액 클리어런스율은 비-관련 조직으로부터 고갈시키기 위해 "배경" 프로브 신호에 필요한 시간 양을 최소화함으로써, 보다 천천히 클리어링되는 작용제, 예컨대 항체에 비해 이점을 제공한다. 임상에서, 긴 혈액 반감기 항체-기반-PET 추적자는 영상을 수집할 수 있기 전에 주사후 수일의 대기를 필요로 할 수 있다. 신속한 클리어링 프로브는 프로브가 주사된 동일한 날에 수집될 수 있는 높은 콘트라스트 영상에 대한 기회를 제공하고, 매우 중요하게는, 그들은 또한 연구되는 동물 또는 검사되는 환자에 대한 전체 방사선 노출을 감소시키는 역할을 할 수 있다.

이 실험에서, [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 생성하였으며, 마우스에서 hPD-L1-양성 종양과 hPD-L1-음성 종양 사이를 구별하는 그의 능력에 대해 시험하였다.

2×10⁶개 hPD-L1(+) L2987 인간 폐 암종 세포 및 4×10⁶개 hPD-L1(-) HT-29 인간 결장 암종 세포를 마우스의 대향하는 측면에 피하로 도입함으로써 양측 이종이식 종양을 보유하는 마우스를 생성하였다. 종양이 대략 300 mm³에 도달하면 (세포 이식 대략 2-3주 후), 영상화를 위해 동물을 선택하였다. 각각의 연구의 체중 및 종양 크기를 측정하고, 영상화 절차 전 영상화 날에 기록하였다. 마우스를 마취제 유도 챔버에 넣고, 3% 이소플루란 흡입 마취제를 100% O₂에서 1-1.5 L/분의 속도로 전달하였다. 진정되면, 마우스를 유도 챔버에서 제거하고, 플렉시글라스 4-챔버 마우스 호텔 (BMS-어플라이드 바이오테크놀로지(BMS-Applied Biotechnology) 그룹에 의해 맞춤 제작됨)에 넣은 채로 계속해서 1-1.5% 이소플루란 흡입 마취제를 제공하고, 100% O₂에서 2 L/분의 속도로 노즈-콘을 통해 전달하였다. 동물을 영상화 동안 저체온을 방지하기 위해 외부 독립형 온도 조절 유닛 (M2M 이미징 코포레이션(M2M Imaging Corp))을 사용하여 따뜻하게 유지하였다. 마우스 호흡을 영상화 절차 동안 계속적으로 모니터링하였으며, 이소플루란은 마취의 깊이에 따라 조정될 수 있다. 이어서 마우스를 4마리의 동물을 위한 용량을 갖는 맞춤 동물 수용함에 넣었으며, 여기서 그들은 연구 지속기간 동안 마취 하에 유지되었다. 동물 수용함을 마이크로PET® F120™ 스캐너 (지멘스 프리클리니칼 솔루션즈(Siemens Preclinical Solutions), 테네시주 녹스빌)로 전달하였다. 이 기기의 축방향 도시 영역은 7.6 cm이다. 이러한 제한에 의해, 스캐닝 영역이 바로 눈앞에서부터 꼬리의 대략 기저부까지 있도록 동물을 위치시켰다. 최종 PET 영상의 감쇠 보정의 목적으로 ⁵⁷Co 포인트 공급원을 사용하여 10분 전송 영상을 먼저 획득하였다. 전송 스캔 후에, 방사성추적자 용액을 이전에 설치된 꼬리 정맥 카테터를 통해 투여하고 2시간 방출 영상을 획득하였다. 주사된 방사성추적자 용액을 총 8마리 마우스 (체중: 22.2 ± 2.0 그램) 내에 주사하였으며, HT-29의 경우 종양 부피 203.0 ± 51.4 mm³ 및 L2987의 경우 422.9 ± 128.4 mm³가 세포 이식후 16-17일에 영상화되었다. 각각의 마우스는 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 (124.0 ± 8.4 μCi, 추적자 질량: 1.0 ± 0.4 μg/kg) IV 주사 30분 전에 PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드 60 mg/kg (N=4) 또는 염수 (N=4)의 SC 용량의 단일 주사를 받았다. 수집된 전송 영상을 사용하여 감쇠 보정하면서 최대 사후 (MAP) 알고리즘을 사용하여 영상을 재구성하고, 방사성동위원소 붕괴에 대해 보정하였다. 최종 영상에서, 관심 영역 (ROI)을 ASIPro 소프트웨어 (지멘스 프리클리니칼 솔루션즈)를 사용하여 종양 경계 주위에 도시하였다. 시간-활성 곡선을 각각의 ROI에 대해 계산하여 2시간 방출 영상 과정에 걸친 종양 부피 내의 방사성추적자의 정량적 도면을 생성하였다. 최종 비교를 위해, 개별 시간-활성 곡선을 각각의 특정 동물에 대해 주사된 방사성추적자 용량에 기초하여 정규화하였다. 각각의 시간-활성 곡선의 최종 10분 (방사성추적자 주사후 90-100분)을 사용하여 종양 전역에서 방사성추적자 흡수를 비교하였다. 이러한 방법론을 사용하여, hPD-L1(+) L2987 이종이식편에서의 방사성추적자 흡수는 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자만을 받은 동물에서의 hPD-L1(-) HT-29 이종이식편에서 관찰된 것의 8.1배였다. 방사성추적자 주사 30분 전에 PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드 60 mg/kg의 SC 용량을 받은 동물에서, hPD-L1(+) L2987 이종이식편에서의 흡수는 hPD-L1(-) HT-29 이종이식편에서 관찰된 것의 단지 0.7배였다 (도 1, 도 2 및 표 3).

표 3: 실시예 11의 PET 영상으로부터 유래된 HT-29 및 L2987 종양에서의 표준 흡수 값 (SUV)

이들 결과는 생체내 hPD-L1(+) vs. hPD-L1(-) 이종이식 종양의 구별의 직접적 가시화를 제공한다. 특이성은 방사성추적자 주사 30분 전에 PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드 60 mg/kg을 사전투여함으로써 추가로 입증되었으며, 이는 hPD-L1(+) 종양에서의 방사성추적자 흡수를 hPD-L1(-) 이종이식편의 수준까지 감소시켰다. 이는 PET 영상화를 사용한 PD-L1 조직 발현의 가시화를 위한 PD-L1 마크로시클릭 펩티드의 사용을 추가로 검증하였다.

실시예 12: 항-PD-L1 마크로시클릭 펩티드 영상화제를 사용한 비-인간 영장류에서의 PET 영상화

항-PD-L1 밀라분자-기반 영상화제는 또한 시노몰구스 원숭이에서 수행된 경우에 유사한 결과를 제시하였다. 이들 연구에서, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 생성된 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드를, 시노몰구스 원숭이에서 높은 콘트라스트 영상을 생성하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 본원에 기재된 항-PD-L1 마크로시클릭 펩티드는 시노몰구스 PD-L1에 대해 높은 친화도를 유지한다 (그러나 설치류 PD-L1에 대해서는 낮은 친화도를 가짐). 게다가, 시노몰구스 원숭이는 마우스 모델에서와 같이 PD-L1(+) 종양을 함유하지 않으므로, 영상화 성능은 주로 내인성 PD-L1 발현과 관련된 영상에서 측정된 배경 수준에 대해 평가되었다 (PD-L1(+) 조직의 고감도 검출에 대한 잠재력을 부여하는 낮은 배경을 가짐). 이들 연구에서, 생성된 PET 영상에서의 배경 수준은 매우 낮았으며, 주목할 만한 방사성추적자 축적은 주로 신장, 비장, 및 방광에서 나타났다.

이전에 설치된 혈관 접근 포트 (VAP)를 갖는 시노몰구스 수컷 원숭이를 0.02 mg/kg 아트로핀, 5 mg/kg 텔라졸 및 0.01 mg/kg 부프레노르핀 I.M.으로 마취시켰다 (모두 단일 시린지 내에 채취됨). 이어서 영상화 절차 동안 수화를 유지하기 위해 유액 투여를 위한 i.v. 카테터를 요측피 혈관 내에 넣었다. 동물에 기관내 관 - 통상적으로 3.0 mm를 삽관하고, 마이크로PET® F220™ PET 기기 (지멘스 프리클리니칼 솔루션즈, 테네시주 녹스빌)의 영상화 베드로 전달하였다. 마취를 이소플루란 및 산소로 유지하고, I.V. 유액 (LRS)을 영상화 절차 동안 6 ml/kg/시간의 속도로 투여하였다. 마이크로PET® F220™ 기기의 축방향 도시 영역이 단지 7.6 cm이므로, 5개의 별개의 베드 위치에 걸친 영상을 획득하여 심장 바로 위에서 대략 골반까지의 동물의 복합 영상을 생성하였다.

각각의 도시 영역에 대해, 최종 PET 영상의 감쇠 보정의 목적으로 ⁵⁷Co 포인트 공급원을 사용하여 10분 전송 영상을 먼저 획득하였다. 전송 영상이 모든 베드 위치에 대해 획득되면, 대략 1.7 mCi (대략 0.12 μg/kg)의 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자를 설치된 VAP를 통해 투여하였다. 이어서 심장에서 대략 중심이 되는 위치 1에서 시작하여 동물의 골반으로 움직이면서 각각의 베드 위치에 대해 순차적으로 5분 지속기간 방출 스캔을 획득하였다. 각각의 위치 (1 내지 5)에서 영상이 획득되면, 영상화 베드를 다시 베드 위치 1로 되돌리고 과정을 반복하였다. 이러한 절차를 사용하여, 영상화 연구의 지속기간에 걸쳐 각각의 베드 위치에 대해 총 5개의 별개의 영상을 획득하였다.

수집된 전송 영상을 사용하여 감쇠 보정하면서 필터링된 역투사 (FBP) 알고리즘을 사용하여 개별 영상을 재구성하고, 방사성동위원소 붕괴에 대해 보정하였다. 이어서 영상화 연구의 지속기간을 포괄하는 단일 패스로부터 수득된 모든 5개 베드 위치로부터의 영상을 정렬함으로써 최종 복합 영상을 생성하였다 (즉 단일 복합 영상은 위치 1 내지 5 베드로부터의 순차적 영상의 각각의 세트로부터 생성됨). 최종 영상을 육안으로 검사하여 가시적 방사성추적자 흡수 구역 (즉, 비장, 신장, 방광) 및 배경 조직 (근육)을 나타내었다 (도 3). [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자의 배경 축적은 매우 낮았으며, 배경 조직 예컨대 근육에서는 신호가 거의 보이지 않았다. 추가적으로, 흡수가 면역-조직화학 및 mRNA 발현에 기초하여 PD-L1(+)인 비장에서 검증되었다. 따라서, 시노몰구스 원숭이에서의 연구는 내인성 PD-L1과 관련하여 고감도 PD-L1 영상화에 대한 잠재력을 입증한다. 시노몰구스 원숭이 비장에서의 특이적 결합의 성질을 결정하기 위해 하기 방식으로 차단 연구를 수행하였다.

시노몰구스 원숭이 (4.4 kg, 수컷)는 기준선에서 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자 (~1.7 mCi, 질량: 0.21 μg/kg)의 단일 IV 주사를 받았다. 다음 날에 (투여후), 동일한 NHP가 방사성추적자 주사 (~1.7 mCi, 질량: 0.12 μg/kg) 2시간 전에 2 mg/kg 항-PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드의 단일 SC 용량을 받았다. 다양한 기관에서의 추적자 흡수가 표 4에 열거된다. 기준선 및 투여후의 대표적인 PET 영상은 도 3에 플롯팅된다. 항-PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드의 혈장 농도는 각각의 영상화 날에 방사성추적자 주사 0, 10, 30, 60, 90분 후에 측정되었다 (표 4). 특이적 결합 신호가 비-인간 영장류의 비장 내에서 관찰되었으며, 추적자 흡수의 93%가 2 mg/kg의 특이적 PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드로 차단되었다.

설치류 및 시노몰구스 원숭이에서의 PET 연구는 ¹⁸F 표지된 항-인간 PD-L1 마크로시클릭 펩티드가 낮은 수준 PD-L1 발현을 갖는 조직의 고감도 검출에 대한 잠재력을 갖는, PD-L1 양성 조직의 생체내 표지화를 위한 강력하고 특이적인 프로브를 제공한다는 것을 제시한다.

또한 항-PD-L1 항체를 사용하여 생체내 영상화 실험을 수행하였고, 이 영상화제가 검출된 구역이 PD-L1 영상화제로 검출된 동일한 구역임에 따라 항-PD-L1 밀라분자 영상화제가 생체내에서 PD-L1 양성 세포를 성공적으로 검출한다는 것을 확인하였다.

표 4. 기준선 및 2 mg/kg PD-L1 결합 마크로시클릭 펩티드 투여후의 각각의 기관에서의 추적자 SUV

* % 변화 = (이전의 SUV - 이후의 SUV)/이전의 SUV

실시예 13: [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자를 사용한 시험관내 자가방사선촬영

인간 폐 종양 조직을 OCT 중에 포매하고, 동결될 때까지 2-5분 동안 2-메틸부탄 중에서 냉각시켰다. 샘플을 사용 시까지 -80℃ 동결기에서 저장하였다. 인간 이종이식편 조직을 또한 검정에 포함시켰다. 2×10⁶개 hPD-L1(+) L2987 인간 폐 암종 세포 및 4×10⁶개 hPD-L1(-) HT-29 인간 결장 암종 세포를 마우스의 대향하는 측면에 피하로 도입함으로써 양측 이종이식 종양을 보유하는 마우스를 생성하였다. 생성된 이종이식 종양이 적절한 크기 (대략 200-300 mm³)에 도달하면, 마우스를 2% 이소플루란으로 마취시키고, 경추 탈구를 통해 희생시켰다. 신선한 종양 조직을 절제하고, OCT에 침지시키고, 동결될 때까지 2-5분 동안 2-메틸부탄 중에서 냉각시켰다. 이어서 조직을 호일/지프락(ZIPLOC)® 백 내에 포장하고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 모든 조직 (인간 폐 종양 및 이종이식편)에 대해 저온유지장치를 사용하여 5 μm 두께의 절편 (2개 절편/슬라이드로서 수집됨)으로 자르고, 유리 현미경 슬라이드 상에 해동-탑재하고, 대략 30분 동안 공기 건조되도록 하였다. 각각 0.1 nM, 1 nM 및 10 nM의 콜드 (비표지된) 펩티드를 사용한 차단 연구. 농도당 1개 슬라이드로, 개별 슬라이드를 인큐베이션을 위해 유리 슬라이드 인큐베이션 챔버로 전달하였다. 개별적으로, 0.25 nM [¹⁸F]-(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-인돌-3-일)메틸)-6-(2-아미노-2-옥소에틸)-33-(2-아미노에틸)-47-(아미노메틸)-24,27-디부틸-30-((1-(카르복시메틸)-1H-인돌-3-일)메틸)-40-히드록시-12-(4-히드록시벤질)-21,44-디이소부틸-9,10,25,28-테트라메틸-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-테트라데카옥소헥사테트라콘타히드로-1H,5H-디피롤로[2,1-g1:2',1'-x][1]티아[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]테트라데카아자시클로펜타테트라콘틴-18-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-플루오로피리딘-3-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판산의 원액을, 300 ml의 트윈 80을 사용하여 10.6 μl의 방사성리간드 원액 (실험 당시에 7064 nM)을 희석시킴으로써 생성하였다. 이 원액으로부터, 40 ml를 각각의 인큐베이션 챔버에 첨가하였다. 이들 챔버 중 1개는 오직 방사성리간드 완충제 용액만을 함유하였으며, 이는 총 결합 절편으로 지칭된다. 다른 인큐베이션 챔버는 40 ml의 이 원액을 적절한 농도의 차단 화합물 (0.1 nM, 1 nM 또는 10 nM의 비표지된 펩티드)과 함께 받았다. 슬라이드를 개별 완충제 용액 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 최대 결합에 도달시켰다. 인큐베이션 후에, 각각의 처리군으로부터의 슬라이드를 인큐베이션 용액으로부터 제거하고, 빙냉 세척 완충제 (트윈 80)에 3분 동안 넣고 4회 개별 세정하였다. 이어서 슬라이드를 차가운 공기 스트림 하에 대략 30분 동안 건조시켰다. 공기-건조된 슬라이드를 영상화 플레이트 (BAS-SR 3545S) 상에 밤새 실온에 둠으로써 슬라이드를 노출시켰다. 생체영상화 분석기 (후지필름 형광 영상 분석기, FLA-9000)를 사용하여 영상화 플레이트를 스캐닝하였다. 자가방사도 영상의 픽셀 크기는 100 μm였다. 멀티-게이지 소프트웨어를 사용하여 영상 분석을 수행하였다. 관심 영역 (ROI)을 모든 연구 군에서 전체 종양 조직을 둘러싸도록 도시하였다. 조직-연관 방사능으로부터의 자가방사선촬영 신호를 이들 ROI로부터 정량화하였다. 총 결합 절편에 비한 [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자의 명백한 변위를 인간 폐 종양 절편뿐만 아니라 인간 이종이식 절편 둘 다에서 3개의 상이한 농도 (0.1 nM, 1 nM 및 10 nM)의 비표지된 펩티드에 대해 결정하였다. [¹⁸F]표지된 마크로시클릭 PD-L1 펩티드 방사성추적자의 용량 의존성 변위는 비표지된 펩티드의 첨가에 의해 모든 조직 절편에서 관찰되었다 (도 4). 각각의 조직으로부터의 일련의 5 μm 조직 절편에 샘플 내 PD-L1 항원 발현의 수준을 검증하기 위한 항-인간-PD-L1 면역조직화학적 절차를 적용하여 인간 폐 샘플 내 PD-L1 발현을 확인하였다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims

화학식 (I)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

여기서 x는 1 내지 8의 정수이고 R은 C₁-C₆알킬 기이다.
제1항에 있어서, 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

여기서 x는 1 내지 8의 정수이고 R은 C₁-C₆알킬 기이다.
제1항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
화학식 (IV)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

여기서 x는 1 내지 8의 정수이고 R은 C₁-C₆알킬 기이다.
제4항에 있어서, 화학식 (V)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항의 화합물의 영상을 수득하는 방법이며,
a) 화합물을 대상체에게 투여하는 것; 및
b) 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캐닝에 의해 화합물의 생체내 분포를 영상화하는 것
을 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 제1항의 화합물의 영상화된 분포가 질환의 존재 또는 부재를 나타내는 것인 방법.
대상체에서 질환의 진행을 모니터링하는 방법이며,
(a) 제1 시점에 질환의 진행의 모니터링을 필요로 하는 대상체에게 질환의 존재와 연관된 표적 분자에 결합하는 제1항의 화합물을 투여하고 대상체의 적어도 한 부분의 영상을 수득하여 이환 세포 또는 조직의 양을 결정하는 것; 및
(b) 1회 이상의 후속적인 시점에 대상체에게 제1항의 화합물을 투여하고 각각의 시점에 대상체의 적어도 한 부분의 영상을 수득하는 것
을 포함하며; 여기서 각각의 시점에서의 이환 세포 또는 조직의 치수 및 위치는 질환의 진행을 나타내는 것인 방법.
대상체에서 이환 세포 또는 조직을 정량화하는 방법이며,
(a) 이환 세포 또는 조직을 갖는 대상체에게 이환 세포 또는 조직과 함께 위치하는 표적 분자에 결합하는 제1항의 화합물을 투여하는 것; 및
(b) 이환 세포 또는 조직에서의 ¹⁸F의 방사능 방출을 검출하는 것
을 포함하며, 여기서 이환 세포 또는 조직에서의 방사능 방출의 수준 및 분포는 이환 세포 또는 조직의 정량적 척도인 방법.
제9항에 있어서, 질환이 고형암, 조혈암, 혈액암, 자가면역 질환, 신경변성 질환, 심혈관 질환 및 병원성 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
PD-L1을 발현하는 조직 또는 세포의 정량적 영상을 수득하는 방법이며, 세포 또는 조직을 PD-L1에 결합하는 제1항의 화합물과 접촉시키는 것, 및 양전자 방출 단층촬영 (PET)을 사용하여 PD-L1을 발현하는 조직을 검출 또는 정량화하는 것을 포함하는 방법.
질환을 치료하기 위한 작용제를 스크리닝하는 방법이며,
(a) PD-L1을 발현하는 세포를 후보 작용제의 존재 및 부재 하에 PD-L1에 결합하는 제1항의 화합물과 접촉시키는 단계; 및
(b) 양전자 방출 단층촬영 (PET)을 사용하여 후보 작용제의 존재 및 부재 하에 세포를 영상화하는 단계
를 포함하며, 여기서 후보 작용제의 존재 하의 방사능 방출의 양의 감소는 작용제가 PD-L1에 결합한다는 것을 나타내는 것인 방법.
제1항의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
제1항의 화합물을 생성하는 데 사용하기 위한 반응 전구체, 및 제1항의 화합물을 생성하기 위한 지침서를 포함하는 키트.