DE69837095T2 - Fluorierung von proteinen und peptiden für positronemissionstomographie - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum radioaktiven Markieren von Proteinen und Peptiden mit Fluor-18 (F-18). Genauer gesagt werden diese Proteine und Peptide durch Umsetzen einer darin enthaltenen Thiolgruppe mit einem an F-18 gebundenen Markierungsreagens, welches auch eine mit Thiolen reaktionsfähige Gruppe hat, mit F-18 radioaktiv markiert. Die entstehenden mit F-18 markierten Proteine und Peptide sind bei der Herstellung von Zusammensetzungen für die bildliche Darstellung von Zielgewebe durch klinische Positronenemissionstomographie geeignet.
  • Beschreibung des verwandten Standes der Technik:
  • Positronenemissionstomographie (PET) ist eine hoch auflösende, nicht invasive Bildgebungstechnik für die Visualisierung einer Erkrankung des Menschen. Bei der PET werden 511 keV Gammaphotonen detektiert, die während des Positronenvernichtungszertalls erzeugt werden. Im klinischen Bereich ist Fluor-18 (F-18) eines der am häufigsten verwendeten positronenemittierenden Nuklide. F-18 hat eine Halbwertszeit (t1/2) von 110 Minuten und emittiert β+-Teilchen mit einer Energie von 635 keV. Es ist 97% angereichert.
  • Die kurze Halbwertszeit von F-18 hat seine Verwendung mit langlebigeren spezifischen zielorientierten Vektoren, wie Antikörpern, Antikörperfragementen, rekombinanten Antikörperkonstrukten und langlebigeren auf Rezeptoren gerichteten Peptiden, beschränkt oder verhindert. Überdies waren komplizierte chemische Reaktionen nötig, um die anorganischen Fluoridarten mit solchen organischen zielorientierten Vektoren zu verknüpfen. Bei typischen Syntheseverfahren wird eine Zwischenstufe radiofluoriert und die mit F-18 markierte Zwischenstufe wird zur Verknüpfung mit Aminogruppen von Proteinen gereinigt. Siehe z. B. Lang et al., Appl. Radiat. Isol., 45 (12):1155–63 (1994); Vaidyanathan et al., Bioconj. Chem., 5:352–56 (1994).
  • Diese Verfahren sind mühsam durchzuführen und erfordern die Bemühungen von spezialisierten professionellen Chemikern. Sie sind Formulierungen in einem Kit zur Verwendung in einem klinischen Bereich nicht zugänglich. Mehrfache Aufreinigungen von Zwischenstufen sind üblicherweise erforderlich, und die letzte Stufe, die eine Verknüpfung an Lysinreste in Proteinen umfaßt, ergibt üblicherweise Ausbeuten von 30–60%, was eine weitere Aufreinigungsstufe vor der Verabreichung an einen Patienten erforderlich macht. Überdies ergeben diese Verfahren fluorierte zielorientierte Spezies, die sich in der Niere ähnlich wie radioaktive Metalle ansammeln.
  • Es wurde kürzlich berichtet, daß 18F-Fluoriodmethan (18FCH2I) eine geeignete Zwischenstufe für die Fluorierung von organischen Zwischenstufen ist. Zheng et al., J. Nucl. Med., 38:177P (Abs. 761) (1997). Bei diesem Vorgang wird Diiodmethan mit dem F-18-Ion durch eine Reaktion bei Raumtemperatur in Acetonitrillösungsmittel fluoriert, was eine Ausbeute von bis zu 40% ergibt. Das 18FCH2I wird dann in Reaktionsgefäße destilliert, die zahlreiche starke Nukleophile in wasserfreiem Acetonitril enthalten, und bei 80°C für fünfzehn Minuten reagieren gelassen. Ein nukleophiler Angriff durch Carboxylate, Thiolate, Phenolate und insbesondere Amine ersetzt das verbleibende Iod aus 18FCH2I mit Gesamtausbeuten von 10 bis 35%. Die Reaktionsprodukte können durch Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt werden. Fluormethyldiethylamin, Fluormethylbenzoat, Fluormethylbenzylthioether und Fluormethyl-4-(2-hydroxy-3-aminopropoxy)-carbazol wurden mit diesem Verfahren hergestellt.
  • Wie oben diskutiert, sind die derzeit vorhandenen Verfahren zur Markierung von auf Proteinen basierenden zielorientierten Vektoren mit F-18 ungeeignet, z. B. das Verfahren, das in Nuclear Medicine & Biology, Band 21, Nr. 7, Seiten 911–919 beschrieben wird. Es gibt daher einen Bedarf für ein einfaches, effizientes Verfahren zum Einbau des F-18-Radionuklids in Peptid enthaltende zielorientierte Vektoren, wie Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente und auf Rezeptoren gerichtete Peptide, das die Verwendung solcher zielorientierter Vektoren in der routinemäßigen klinischen Positronenemissionstomographie ermöglicht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Einbau des F-18-Radionuklids in Peptid enthaltende, zielorientierte Vektoren zur Verfügung.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum radioaktiven Markieren von Thiol enthaltenden Peptiden mit Fluor-18 (F-18) zur Verfügung gestellt, welches das Umsetzen eines Peptids, welches eine freie Thiolgruppe enthält, mit einem Markierungsreagens der allgemeinen Formel 18F-(CH2)m-CR1R2-(CH2)n-X umfaßt, worin:
    n 0, 1 oder 2 ist,
    m 0, 1 oder 2 ist
    und n + m 0, 1 oder 2 ist,
    X aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat, Triflat, unsubstituierfem Maleimid, Maleimid, welches mit einer oder zwei Alkylgruppen substituiert ist, und Maleimid, welches mit einer Sulfonatgruppe substituiert ist, und
    R1 und R2 gleich oder verschieden sind und aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat, Triflat, Hydrogen, -CONH2, Carboxyl, Hydroxyl, Sulfonsäure, tertiärem Amin, quaternärem Ammonium, unsubstituiertem Alkyl, substituiertem Alkyl, -COOR', -CONR'2 oder COR', wobei die Substituenten der substituierten Alkylgruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -CONH2, Carboxyl, Hydroxyl, Sulfonsäure, tertiäres Amin und quaternäres Ammonium, und worin R' ein C1-C6-Alkyl oder Phenyl ist.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum radioaktiven Markieren von Thiol enthaltenden Peptiden mit F-18 zur Verfügung gestellt, welches das Umsetzen eines Peptids, das eine freie Thiolgruppe mit einem mit F-18 fluorierten Alken enthält, umfaßt, worin wenigstens eines der zwei Kohlenstoffatome mit Doppelbindung wenigstens eine Abgangsgruppe trägt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat und Triflat.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Peptid, das wie oben beschrieben mit F-18 radioaktiv markiert wurde, in eine Zusammensetzung zur Abgabe an ein Zielgewebe präpariert, unter Verwendung eines bispezifischen Antikörpers (bsMAb) oder eines bispezifischen Antikörperfragments (bsFab), das wenigstens einen für das Zielgewebe spezifischen Arm und wenigstens einen anderen Arm, der spezifisch für das mit F-18 markierte Peptid oder ein Hapten mit niederem Molekulargewicht, welches an das mit F-18 markierte Peptid konjugiert ist, enthält.
  • Bei dieser Methodik wird der bsMAb oder das bsFab einem Patienten verabreicht und kann zu dem Zielgewebe lokalisieren. Einige Zeit später (nach dem Entfernenlassen des ungebundenen bsMAb oder des ungebundenen bsFab), wird das mit F-18 markierte Peptid oder das Haptenkonjugat davon dem Patienten verabreicht. Da wenigstens einer der Arme des bsMAb oder des bsFab spezifisch für das mit F-18 markierte Peptid oder das an das mit F-18 markierte Peptid konjugierte Hapten ist, lokalisiert das mit F-18 markierte Peptid ebenfalls zu dem Ziel. Nach dem Entfernenlassen des ungebundenen mit F-18 markierten Peptids oder des ungebundenen Haptenkonjugats davon, wird das Ziel durch routinemäßige klinische Positronenemissionstomographie sichtbar gemacht.
  • Der bsMAb oder das bsFab ist idealerweise monoklonal und humanisiert. Bevorzugt enthält das mit F-18 markierte Peptid eine Thiolgruppe. Beispiele für geeignete Peptide sind X-Gly-D-Tyr-D-Trp-Gly-D-Lys(X)-Gly-D-Tyr-D-Trp-OH, worin X eine freie oder geschützte Aminosäuregruppe darstellt, Ac-Cys(Y)-D-Tyr-D-Trp-Gly-D-Cys(Y)-Gly-D-Tyr-D-Trp-OH, worin Y eine freie oder geschützte Thiolgruppe darstellt, und Ac-Gly-D-Iod-Tyr-D-Trp-Gly-D-Lys(Ac)-Gly-D-Iod-Tyr-D-Trp-OH. Das Hapten kann ein Metallchelatkomplex sein, der z. B. Mangan, Eisen oder Gadolinium umfassen kann, welche bei der Magnetresonanztomographie (MRI) geeignet sind.
  • Die oben beschriebenen bsMAb, bsFab und damit verbundenen Methodiken sind in der vorläufigen US Anmeldung Nr. 60/090,142 (mit dem Titel "Production and use of novel peptide-based agents for use with bispecific antibodies" und angemeldet am 22. Juni 1998) offenbart.
  • Diese und andere Gegenstände und Gesichtspunkte der Erfindung werden dem Fachmann im Hinblick auf die hierin enthaltenen Lehren ersichtlich werden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt einfache und effiziente Verfahren zum Einbau des F-18-Radionuklids in Peptid enthaltende zielorientierte Vektoren, wie Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente und auf Rezeptoren gerichtete Peptide, zur Verfügung. Zur Vereinfachung wird der Begriff "Peptid" nachstehend und in den Ansprüchen als Verweis auf Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente und auf Rezeptoren gerichtete Peptide verwendet. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen solche zielorientierte Vektoren für die routinemäßige klinische Positronenemissionstomographie zur Verfügung.
  • Von allen auf Peptiden anwesenden Nukleophilen können nur freie Thiolgruppen schnell bei einem neutralen pH und mäßiger Temperatur alkyliert werden. Die vorliegende Erfindung macht sich diese einzigartige Eigenschaft freier Thiolgruppen zunutze und stellt Verfahren zum Markieren von Thiol enthaltenden Peptiden mit F-18 zur Verfügung.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die folgende Reaktion:
    Figure 00040001
    worin n 0, 1 oder 2 ist, m 0, 1 oder 2 ist und n + m 0, 1 oder 2 ist und X eine geeignete Abgangsgruppe, wie Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat, Triflat und ähnliches ist. Alternativ ist X Maleimid oder ein substituiertes Maleimid, das z. B. mit einer oder zwei Alkylgruppen oder einer Sulfonatgruppe substituiert ist. Beispiele für geeignete substituierte Maleimide umfassen 3-Methylmaleimid, 3,4-Dimethylmaleimid und 3-Sulfo-maleimid. R1 und R2 können gleich oder verschieden sein und werden, wie unten ausführlicher diskutiert, nach den wünschenswerten physikalischen Eigenschaften, die sie in das Reagens einbringen, ausgewählt. Im allgemeinen können R1 und R2 aus denselben Gruppen wie X ausgewählt werden und können gleich oder verschieden von X sein. Alternativ können R1 und R2 jeweils unabhängig Hydrogen, eine substituierte oder unsubstituierte, lineare oder verzweigte Alkylgruppe oder eine Carbonylfunktion, wie ein Ester, Amid oder Keton, z. B. -COOR', -CONR'2 oder COR' sein, wobei R' ein C1-C6-Alkyl oder Phenyl ist. Beispiele für geeignete R1- und R2-Gruppen oder Substituenten darauf umfassen auch Gruppen, die Wasserlöslichkeit vermitteln, wie -CONH2, Carboxyl, Hydroxyl, Sulfonsäure und tertiäre Amine oder quaternäres Ammonium.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid mit einem mit F-18 fluorierten Alken markiert, worin wenigstens eines der beiden Kohlenstoffatome mit Doppelbindung wenigstens eine Abgangsgruppe trägt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat und Triflat. Beispiele für geeignete fluorierte Alkene umfassen 18F-CH=Cl2, 18F-Cl=CH2 oder 18F-Cl=Cl2. Die Markierungsreaktion ist der oben beschriebenen entsprechend.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können zur Markierung jedes Thiol enthaltenden Peptids verwendet werden. Von besonderem Interesse sind als zielorientierte Vektoren geeignete Peptide. Beispiele solcher zielorientierter Vektoren umfassen Antikörper, F(ab')2-, F(ab)2-, Fab'- und Fab-Fragmente, einkettige Unterfragmente, wie sFvs, divalente Konstrukte, wie dsFvs, und Polypeptide, die eine oder mehrere freie Thiolgruppen enthalten. Siehe Choi et al., Cancer Res., 55:5323–29 (1995). Weitere Beispiele umfassen Antikörperkonstrukte, wie Antikörper, die IgG3- oder IgG3-F(ab')2-Gerüste enthalten. IgG3 haben mehrere Disulfidgruppen in Gelenkregionen, die zur Erzeugung mehrerer freier Thiolgruppen reduziert werden können.
  • Peptide, die ursprünglich keine freie Thiolgruppe enthalten, können gemäß der vorliegenden Erfindung markiert werden, indem zunächst das Peptid durch dem Fachmann bekannte Verfahren zur Addition einer freien Thiolgruppe modifiziert wird. Zum Beispiel kann das Peptid mit Reagenzien, wie 2-Iminothiolan, thioliert werden, oder intrinsische Disulfidbindungen, wie Cysteinreste, können reduziert werden. Eine Kombination beider Modifikationen kann auch durchgeführt werden, wie die Acylierung von Lysinresten mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat (SPDP), gefolgt von der kontrollierten Reduktion der angehängten Disulfidbindung.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid ein Fab- oder Fab'-Fragment. Diese Peptide haben freie Thiolgruppen in ihrer Gelenkregion, einer Stelle, die sowohl spezifisch als auch entfernt von den auf das Antigen zielorientierten Stellen ist.
  • Zur Optimierung der Reaktion mit den Thiol enthaltenden Peptiden hat das Markierungsreagens bevorzugt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
    • (1) Das Reagens kann leicht und schnell aus F-18 synthetisiert werden.
    • (2) Das Reagens hat eine angemessene Wasserlöslichkeit in dem neutralen (4–8) pH-Bereich. Mit "angemessener Wasserlöslichkeit" ist gemeint, daß das Reagens bis zu einer Konzentration, die einer stöchiometrischen Menge des verwendeten Thiol enthaltenden Peptids vergleichbar ist, leicht in Lösung geht. Wenn z. B. ein Antikörper markiert wird, ist eine typische Antikörperkonzentration etwa 50 mg/ml, was einer molaren Konzentration von etwa 3 × 10–4 M entspricht. In diesem Beispiel sollte das Reagens löslich sein bei einer Konzentration von etwa 3 × 10–4 M. Bei Peptidarten mit geringerem molekularen Gewicht wird mehr Peptid ohne Ausfällung in Lösung gehen und mehr Reagens kann verwendet werden. Da F-18 trägerfrei ist, könnten geringere Konzentrationen des fluorierenden Mittels auch wirksam sein.
    • (3) Die aktiven Halogenide des Reagens werden nicht unmittelbar durch Wasser bei neutralem pH (pH 4–8) hydrolysiert. Die Halogenide sollten folglich leichter mit SH oder S- als mit H2O reagieren. Solange das Reagens nicht unmittelbar durch Wasser (oder durch neutrale Pufferlösungen) hydrolysiert wird, gewährleistet die Selektivität und Reaktionsfähigkeit der Thiolgruppe eine effiziente Peptidmarkierungsreaktion.
    • (4) Die Abgangsgruppe X kann schnell, spezifisch und annähernd quantitativ durch freie Thiolkomponenten ersetzt werden. Ein carbokationisches Zentrum kann an dem Kohlenstoff herausgebildet werden, welches durch das Nukleophil angegriffen wird, z. B. können R1 und R2 elektronenziehende Gruppen sein. Das Vorhandensein von elektronenziehenden Gruppen in alpha-Position zu der -C-X-funktionellen Gruppe erleichtert ebenfalls das schnelle Ersetzen der X-Komponente. Beispiele für geeignete elektronenziehende Gruppen umfassen -COR', -CONR', -CO2R', -COOH, -CONH2 und -SO3H, worin R' ein C1-C6-Alkyl oder Phenyl ist.
  • Überdies kann das Vorhandensein von mehr als einer Abgangsgruppe in dem Markierungsreagens vorteilhaft sein. Mehrfache Abgangsgruppen, wie Iodgruppen, die an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden sind, verursachen sterische Spannung. Wenn eine Reaktion den Weggang einer einzelnen Abgangsgruppe umfaßt, wird die sterische Spannung abgebaut, was dem Ersetzen der X-Gruppe durch Thiol schnellere Reaktionskinetiken verleiht. Daher umfaßt das Markierungsreagens gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wenigstens zwei Abgangsgruppen, wie zwei Iodgruppen.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Peptid mit einem Markierungsreagens der allgemeinen Formel 18F-(CH2)m-CR1R2-(CH2)n-X markiert, worin n 0, 1 oder 2 ist, m 0, 1 oder 2 ist und n + m 0, 1 oder 2 ist und X eine austauschfähige Abgangsgruppe, wie Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat, Triflat und ähnliches ist. Alternativ ist X Maleimid oder ein substituiertes Maleimid, das z. B. mit einer oder zwei Alkylgruppen substituiert ist. Beispiele für geeignete substituierte Maleimide umfassen 3-Methylmaleimid, 3,4-Dimethylmaleimid und 3-Sulfo-maleimid. R1 und R2 können gleich oder verschieden sein und werden wie oben diskutiert nach den wünschenswerten physikalischen Eigenschaften, die sie in das Reagens einbringen, ausgewählt. Im allgemeinen können R1 und R2 aus denselben Gruppen wie X ausgewählt werden und können gleich oder verschieden von X sein. Alternativ können R1 und R2 unabhängig voneinander Hydrogen, eine substituierte oder unsubstituierte, lineare oder verzweigte Alkylgruppe oder eine Carbonylfunktion, wie ein Ester, Amid oder Keton sein, z. B. -COOR', -CONR'2 oder COR', worin R' ein C2-C6-Alkyl oder Phenyl ist. Beispiele geeigneter R1- und R2-Gruppen oder Substituenten daran umfassen auch solche, die Wasserlöslichkeit vermitteln, wie -CONH2, Carboxyl, Hydroxyl, Sulfonsäure und tertiäres Amin oder quaternäres Ammonium.
  • Beispiele für geeignete Markierungsreagenzien umfassen: 18F-Cl3, 18F-CHl2, 18F-Cl2COOH, 18F-Cl2COOCH3, 18F-Cl2CH2OH, 18F-CHlCH2OH, 18F-CHlCOOCH3, 18F-Cl2CH2COOH, 18F-Cl2CH2N+(CH3)3, 18F-Cl2-CH2-Maleimid, 18F-Cl2-CONH2, 18F-Cl2-CO2CH3, 18F-CHBr2, 18F-CBr2CH2CH2-SO3H, 18F-CH2Cl2COOH, 18F-CH2Cl2CONH2, 18F-CHlCO2CH3, 18F-Cl2CONH2, 18F-CHlCONH2, 18F-CBr2CH2OH, CH3-COCBr2-18F, 18F-Cl2CHCN, CBrF2-18F, 18F-CBr(CONH2)2 und C6H5-COCBr2-18F. Andere geeignete Markierungsreagenzien werden für den Fachmann offensichtlich sein.
  • Das Markierungsreagens kann durch die Fluorierung einer entsprechenden Verbindung mit F-18 hergestellt werden. Das Nachstehende sind Beispiele von Verbindungen, die zur Herstellung der oben dargelegten Markierungsreagenzien fluoriert werden können: Cl4, CHl3, CHl2COOCH3, Cl3COOH, Cl3COOCH3, Cl3CH2OH, CHl2CH2OH, Cl3CH2COOH, Cl3CH2N+(CH3)3, Cl3CH2-Maleimid, Cl3-CONH2, Cl3-CO2CH3, CHlBr2, ClBr2CH2CH2-SO3H, CH2Cl3COOH, CH2Cl3CONH2, CHl2CO2CH3, Cl3CONH2, CHl2CONH2, CBr3CH2OH, CF3COCl3, CH3COCBr3, Br2CHCN, Cl3CHCN, CBr2F2, CBr2(CONH2)2 und C6H5-COCBr3.
  • Andere geeignete Verbindungen werden dem Fachmann offensichtlich sein.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Markierungsreagens ein mit F-18 fluoriertes Alken, worin wenigstens eines der beiden Kohlenstoffatome mit Doppelbindung wenigstens eine Abgangsgruppe trägt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat und Triflat. Beispiele für geeignete fluorierte Alkene umfassen 18F-CH=Cl2, 18F-Cl=CH2 und 18F-Cl=Cl2. Diese Markierungsreagenzien können durch die Fluorierung von entsprechenden Verbindungen mit F-18, wie ICH=Cl2, Cl2=CH2, Cl2=Cl2, hergestellt werden. Andere fluorierte Alkene, die gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden für den Fachmann offensichtlich sein.
  • F-18 kann aus Zyklotrons nach dem Beschuß von mit O-18 angereichertem Wasser mit Protonen erhalten werden. Das angereicherte H-18F enthaltende Wasser kann mit einer Base mit einem Gegenion, das irgendein Alkalimetall (M) ist, wie Kalium oder ein anderes monovalentes Ion, neutralisiert werden, und das Wasser kann abgedampft werden, wobei sich ein M-18F-Rest ergibt, welcher für die weitere Verwendung in ein organisches Lösungsmittel aufgenommen werden kann. Im allgemeinen wird das Gegenion so ausgewählt, daß es dem Fluoridion ermöglicht, schnell in einer organischen Phase mit einem Halogen zu reagieren. Kalium wird im allgemeinen als Gegenion verwendet, da es billiger ist als Cäsium. Bei trägerfreiem F-18 werden jedoch geringfügige Mengen an Gegenion benötigt, und die Kosten des Gegenions können weitgehend ignoriert werden.
  • Obwohl Kalium gemäß der vorliegenden Erfindung als Gegenion geeignet ist, ist Cäsium gegenüber Kalium bevorzugt, da Cäsium ein größeres Ion mit einer weiter verteilten Ladung ist. Dementsprechend hat Cäsium lockerere Ionenwechselwirkungen mit dem kleinen Fluoridatom und beeinträchtigt daher nicht die nukleophilen Eigenschaften des Fluoridatoms. Aus ähnlichen Gründen ist Kalium gegenüber Natrium bevorzugt, und im allgemeinen steigt die Eignung eines Metalls der Gruppe Ia als Gegenion gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn man im Periodensystem abwärts geht. Reagenzien der Gruppe Ib, wie Silber, sind auch geeignet als Gegenionen gemäß der vorliegenden Erfindung. Weiterhin können Ionen vom Typ Transferion für organische Phasen, wie Tetraalkylammoniumsalze, auch als Gegenionen verwendet werden.
  • Da Fluorid das am meisten elektronegative Element ist, hat es eine Neigung hydriert zu werden und seinen nukleophilen Charakter zu verlieren. Um dies zu minimieren, wird die Markierungsreaktion bevorzugt unter wasserfreien Bedingungen durchgeführt. Zum Beispiel kann Fluorid (als Kaliumfluorid oder als Komplex mit einem der anderen oben diskutierten Gegenionen) in organische Lösungsmittel, wie Acetonitril oder THF, eingebracht werden. Mit der Hilfe von Mitteln, die das Gegenion binden, wie Kryptofix 2.2.2 (4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]-hexacosan), ist das Fluoridion sehr nukleophil in diesen Lösungsmitteln.
  • Wie oben diskutiert, wird das Markierungsreagens zur Markierung von zielorientierten Vektoren, die ein Thiol enthaltendes Peptid mit F-18 umfassen, gemäß der folgenden Reaktion markiert:
    Figure 00080001
  • Alternativ ist das Markierungsreagens ein mit F-18 fluoriertes Alken, wobei wenigstens eines der beiden Kohlenstoffatome mit Doppelbindung wenigstens eine Abgangsgruppe trägt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat und Triflat. Dieses mit F-18 fluorierte Alken markiert zielorientierte Vektoren in gleicher Weise wie die oben dargelegte Reaktion.
  • Lenken der Reaktion des fluorierten Markierungsreagens in Richtung freier Thiolgruppen auf dem zielorientierten Vektor ermöglicht einen annähernd quantitativen Einbau von F-18 in den zielorientierten Vektor innerhalb einer kurzen Zeitspanne. Allgemein wird die Reaktion innerhalb weniger Minuten bei Raumtemperatur abgeschlossen sein, und komplizierte Aufreinigungsstufen werden nicht notwendig sein. Angesichts der sehr kurzen Halbwertszeit von F-18 ist die Reaktionsgeschwindigkeit von sehr großer Bedeutung. Da freies F-18 leicht mit Hydroxylionen in Hydroxyapatitkristallen im Knochen ausgetauscht werden kann und es daher ein knochensuchendes Mittel ist, ist überdies die reduzierte Menge an freiem Fluorid, das in dem Endprodukt verbleibt, ein bedeutender Vorteil der vorliegenden Erfindung.
  • Die Ausführungsformen der Erfindung werden weiter durch Beispiele veranschaulicht, die Gesichtspunkte der Erfindung ausführlich zeigen. Diese Beispiele stellen spezifische Teile der Erfindung dar und sollen nicht als ihren Umfang beschränkend ausgelegt werden.
  • BEISPIELE
  • Fluordiiodessigsäure (18F-Cl COOH)
  • 100 mCi F-18-Fluorid (aus dem Beschuß von mit O-18 angereichertem Wasser erhalten) in Kryptofix 2.2.2 (4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan) enthaltendem, trockenem Tetrahydrofuran und eine Aufschlämmung von Kaliumcarbonat wird mit Triiodessigsäure behandelt. Nach 30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur wird das gewünschte Markierungsmittel 18F-Cl2COOH erhalten und durch Umkehrphasensäulenchromatographie aufgereinigt. Dieses Markierungsreagens wird dann zur Markierung einer Vielzahl von Thiol enthaltenden zielorientierten Vektoren verwendet oder für die gleiche Verwendung an klinische Einsatzorte gesandt.
  • Mit F-18 markiertes Fab'-SH-Fragment
  • Ein 1 mg Probengefäß mit lyophilisiertem Fab'-SN-NP4 (ein Antikörperfragment gegen karzinoembryonales Antigen) wird mit 1 ml einer Lösung aus 18F-Cl2COOH in 0,1 M Natriumacetatpuffer bei pH 6 rekonstituiert. Die Reaktion kann für 30 Minuten bei Raumtemperatur weiterlaufen.
  • Ein Aliquot der Mischung wird für die Analyse durch HPLC unter Verwendung einer Größenausschluß-Größenbestimmungssäule und durch ITLC (Sofort-Dünnschichtchromatographie) unter Verwendung von mit Silicagel imprägnierten Glasfaserstreifen (Gelman Sciences) entfernt. Diese Analyse zeigt, daß die Thiolgruppen der Gelenkregion des Antikörperfragments nukleophiles Ersetzen beider Iodatome des 18F-Cl2COOH durchführen und daß diese Reaktion mit annähernd quantitativer Ausbeute verläuft. Das mit F-18 markierte Fab'-Fragment ist daher bereit für die Injektion.
  • Fluordiiodmethan (18F-CHl2)
  • Eine Probe von 100 mCi F-18-Fluorid (durch Beschuß von mit O-18 angereichertem Wasser erhalten) in Kryptofix 222 enthaltendem, trockenem Acetonitril und eine Aufschlämmung von Kaliumcarbonat wird mit Triiodmethan behandelt. Nach 30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur wird das Markierungsreagens 18F-CHl2 erhalten und durch Umkehrphasensäulenchromatographie aufgereinigt. Das Markierungsreagens wird dann zur Markierung einer Vielzahl von Thiol enthaltenden zielorientierten Vektoren verwendet oder für die gleiche Verwendung an klinische Einsatzort versandt.
  • Mit F-18 markiertes Oktreotid
  • Ein 1 mg Probengefäß mit lyophilisiertem, reduziertem Oktreotid (D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol) wird mit 1 ml einer Lösung aus 18F-CHl2 (zunächst in DMSO angesetzt) in 0,1 M Natriumacetatpuffer bei pH 6, welche 20% DMSO enthält, rekonstituiert. Die Reaktion kann für 30 Minuten bei Raumtemperatur weiterlaufen. Alternativ kann sie bei erhöhten Temperaturen und in nichtwäßrigen Lösungsmitteln, z. B. DMSO, durchgeführt werden und später gekühlt und/oder zur Injektion verdünnt werden.
  • Ein Aliquot der Markierungsmischung wird für die Analyse durch HPLC unter Verwendung einer Größenausschluß-Größenbestimmungssäule und ITLC (Sofort-Dünnschichtchromatographie) unter Verwendung von mit Silikagel imprägnierten Glasfaserstreifen (Gelman Sciences) entfernt. Die Analyse zeigt, daß zwei Thiolgruppen von Cysteinylresten des Oktreotids das nukleophile Ersetzen von beiden Iodatomen von 18F-CHl2 durchführen und daß diese Reaktion mit annähernd quantitativer Ausbeute verläuft. Das mit F-18 markierte, rezyklisierte (Bindung: -S-CH-18F-S-) Oktreotidpeptid ist daher bereit für die Injektion.
  • Fluordiiodacetamid (18F-Cl2CONH2)
  • 100 mCi F-18-Fluorid (aus dem Beschuß von mit 0–18 angereichertem Wasser erhalten) in Kryptofix 2.2.2 (4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan) enthaltendem, trockenem Tetrahydrofuran und eine Aufschlämmung von Kaliumcarbonat wird mit Triiodacetamid behandelt. Nach 30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur wird das gewünschte Markierungsmittel 18F-Cl2CONH2 erhalten und durch Umkehrphasensäulenchromatographie aufgereinigt. Dieses Markierungsreagens wird dann zur Markierung einer Vielzahl von Thiol enthaltenden zielorientierten Vektoren verwendet oder für die gleiche Verwendung an klinische Einsatzorte gesandt.
  • Mit F-18 markiertes Cys-LHRH
  • Ein 1 mg Probengefäß mit lyophilisiertem Cys-LHRH (LHRH, dessen Aminoende ein angehängtes Cystein in reduzierter Thiolform trägt), welches mit 1 ml einer Lösung aus 18F-CHlCONH2 in 0,1 M Natriumacetatpuffer bei pH 6 rekonstituiert ist. Die Reaktion kann für 2 Stunden bei 50°C weiterlaufen. Die Thiolgruppe des modifizierten Peptids des Antikörpers führt nukleophiles Ersetzen des Iodatoms von 18F-ClHCONN2 durch, und die Reaktion verläuft mit annähernd quantitativer Ausbeute. Das mit F-18 markierte Peptid ist bereit für die Injektion.

Claims (23)

  1. Verfahren zum radioaktiven Markieren von Thiol enthaltenden Peptiden mit Fluor-18 (F-18), welches umfaßt, daß man ein Peptid, welches eine freie Thiolgruppe enthält, mit einem Markierungsreagens der allgemeinen Formel 18F-(CH2)m-CR1R2-(CH2)n-X umsetzt, worin: n 0, 1 oder 2 ist, m 0, 1 oder 2 ist und n + m 0, 1 oder 2 ist, X aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat, Triflat, unsubstituiertem Maleimid, Maleimid, welches mit einer oder zwei Alkylgruppen substituiert ist, und 3-Sulfo-maleimid, und R1 und R2 gleich oder verschieden sind und aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat, Triflat, Wasserstoff, -CONH2, Carboxyl, Hydroxyl, Sulfonsäure, tertiärem Amin, quaternärem Ammonium, unsubstituiertem Maleimid, Maleimid, welches mit einer oder zwei Alkylgruppen substituiert ist, 3-Sulfo-maleimid, unsubstituiertem Alkyl, substituiertem Alkyl, -COOR', -CONR'2 oder COR', wobei die Substituenten der substituierten Alkylgruppen aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus -CONH2, Carboxyl, Hydroxyl, Sulfonsäure, tertiärem Amin und quaternärem Ammonium, und wobei R' ein C1-C6-Alkyl oder Phenyl ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei X 1 ist und wenigstens einer von R1 und R2 1 ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus F(ab')2-, F(ab)2-, Fab'- und Fab-Antikörperfragmenten, Einzelketten-Antikörperunterfragmenten, divalenten Antikörperfragmentkonstrukten und Antikörperkonstrukten, die IgG3- oder IgG3-F(ab')2-Gerüste umfassen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Markierungsreagens aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 18F-Cl3, 18F-CHl2, 18F-CHlCOOCH3, 18F-Cl2COOH, 18F-Cl2COOCH3, 18F-Cl2CH2OH, 18F-CHlCH2OH, 18F-Cl2CH2COOH, 18F-Cl2CH2N+(CH3)3, 18F-Cl2CH2-Maleimid, 18F-CHlCONH2, 18F-Cl2CONH2, 18F-CHBr2, 18F-CBr2CH2CH2-SO3H, 18F-CBr2CH2OH, CH3COCBr2-18F, CBrF2-18F und 18F-CBr(CONH2)2.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Markierungsreagens aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 18F-CH2Cl2COOH und 18F-CH2Cl2CONH2.
  6. Verfahren zum radioaktiven Markieren von Thiol enthaltenden Peptiden mit Fluor-18 (F-18), welches umfaßt, daß man ein Peptid, welches eine freie Thiolgruppe umfaßt, mit einem mit F-18 fluorierten Alken umsetzt, wobei wenigstens eines der beiden Kohlenstoffatome mit Doppelbindung wenigstens eine Agangsgruppe trägt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Iodid, Bromid, Chlorid, Azid, Tosylat, Mesylat, Nosylat und Triflat.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mit F-18 fluorierte Alken aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 18F-CH=Cl2, 18F-Cl=CH2 und 18F-Cl=Cl2.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus F(ab')2-, F(ab)2-, Fab'- und Fab-Antikörperfragmenten, Einzelketten-Antikörperunterfragmenten, divalenten Antikörperfragmentkonstrukten und Antikörperkonstrukten, die IgG3- oder IgG3-F(ab')2-Gerüste umfassen.
  9. Verwendung eines mit F-18 markierten Peptids oder Haptenkonjugats und eines bispezifischen Antikörpers oder Antikörperfragments, umfassend einen Arm, der für ein Zielgewebe des Patienten spezifisch ist, und einen weiteren Arm, der für ein mit F-18 markiertes Peptid oder ein Hapten mit niedrigem Molekulargewicht, das an das mit F-18 markierte Peptid konjugiert ist, spezifisch ist, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zum Detektieren eines Gewebes, wobei: (a) der bispezifische Antikörper oder das Antikörperfragment so an einen Patienten zu verabreichen ist, daß der bispezifische Antikörper oder das Antikörperfragment an das Zielgewebe binden kann und nicht zielgerichteter bispezifischer Antikörper oder Antikörperfragment entfernt werden kann, (b) das mit F-18 markierte Peptid oder das Haptenkonjugat davon so an den Patienten zu verabreichen ist, daß das mit F-18 markierte Peptid oder das Haptenkonjugat davon an den bispezifischen Antikörper oder das Antikörperfragment binden kann und das ungebundene, mit F-18 markierte Peptid oder das Haptenkonjugat davon entfernt werden kann, und (c) das mit F-18 markierte Peptid detektiert wird, wobei das Zielgewebe detektiert wird.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das mit F-18 markierte Peptid eine Thiolgruppe enthält.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das mit F-18 markierte Peptid unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 markiert wird.
  12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das mit F-18 markierte Peptid unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 6 markiert wird.
  13. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das mit F-18 markierte Peptid X-Gly-D-Tyr-D-Trp-Gly-D-Lys(X)-Gly-D-Tyr-D-Trp-OH ist und X eine freie oder geschützte Aminosäuregruppe darstellt.
  14. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das mit F-18 markierte Peptid Ac-Cys(Y)-D-Tyr-D-Trp-Gly-D-Cys(Y)-Gly-D-Tyr-D-Trp-OH ist und Y eine freie oder geschützte Thiolgruppe darstellt.
  15. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das mit F-18 markierte Peptid Ac-Gly-D-Iod-Tyr-D-Trp-Gly-D-Lys(Ac)-Gly-D-Iod-Tyr-D-Trp-OH ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Hapten ein Metallchelatkomplex ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Metallchelatkomplex Mangan, Eisen oder Gadolinium umfaßt.
  18. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der bispezifische Antikörper oder das Antikörperfragment monoklonal ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment humanisiert ist.
  20. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das mit F-18 markierte Peptid mittels Positronenemissionstomographie detektiert wird.
  21. Kit zur Verwendung in einem Verfahren zum Detektieren von Gewebe in einem Patienten, welcher in separaten Behältern ein mit F-18 markiertes Peptid oder ein Haptenkonjugat davon und einen bispezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment, umfassend ei nen Arm, der für ein Zielgewebe des Patienten spezifisch ist, und einen weiteren Arm, der für ein mit F-18 markiertes Peptid oder ein Hapten mit niedrigem Molekulargewicht, das an das mit F-18 markierte Peptid konjugiert ist, umfaßt.
  22. Kit nach Anspruch 21, welcher ein mit F-18 markiertes Peptid umfaßt, wie es in einem der Ansprüche 10 bis 15 definiert ist.
  23. Kit nach Anspruch 21, welcher ein Hapten umfaßt, wie es in Anspruch 16 oder 17 definiert ist.
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