DE69030025T2

DE69030025T2 - Verfahren zur Markierung von Proteinen mit Technetium/Rhenium

Info

Publication number: DE69030025T2
Application number: DE69030025T
Authority: DE
Inventors: Gary L Griffiths
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1989-06-12
Filing date: 1990-06-12
Publication date: 1997-06-19
Anticipated expiration: 2010-06-13
Also published as: AU647028B2; WO1990015626A1; EP0403225A2; EP0403225B1; KR0178961B1; ATE149515T1; ES2098250T3; JP2769244B2; US5128119A; IL94690A0; AU5924990A; DE69030025D1; CA1335268C; IL94690A; FI915832A0; KR920700689A; JPH05500800A; EP0403225A3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte und optimierte Verfahren zum direkten Markieren von Proteinen, insbesondere Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten mit Radioisotopen des Technetiums und Rheniums.
Das Isotop Technetium-99m zählt zu den wertvollsten in der diagnostischen Nuklearmedizin aufgrund seiner leichten Verfügbarkeit, geringen Kosten und vorteilhaften radiochemischen Eigenschaften. Es wird allgemein als Agens zur Markierung von Makromolekülen, wie monoklonalen Antikörpern benutzt und kann auf verschiedene Weisen an das Protein gebunden werden. Frühe Arbeiten gungen hauptsächlich den Weg über das bifunktionelle Chelat, d.h. die Verwendung eines Chelators, der eine weitere funktionelle Gruppe zur Bindung an das Protein enthielt. Verschiedene Formen von Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) wurden verwendet, z.B. um an den Antikörper zu binden und auch um das radioaktive Metallion zu chelatisieren.
Direkte Markierung von Protein wurde unter Benutzung eines "Pretinning-Protokolls" ebenso versucht. das scharfe Bedingungen und lange "Pretinning- Zeiten" erforderte, aber radioaktive Markierung mit 100%-iger Aufnahme wurde nicht erreicht. Überdies gefährdete die Gegenwart extrem hoher Mengen an Zinn(II)-ionen für lange Zeiträume die Immunoreaktivität des Antikörpers. Das Verfahren machte grundsätzlich auch eine Nach-Markierungs-Reinigungssäule erforderlich. Versuche, "Pretinning"-Verfahren anderer mit F(ab'&sub2;)-Antikörperfragmenten zu wiederholen, waren unbefriedigend beim Erzielen von Tc-99m-Markierungen.
Andere, neuere Direktmarkierungsmethoden machten getrennte Gefäße erforderlich, eines für den Antikörper und eines für Zinn(II)-ionen, die an einen Transchelator komplexiert waren, wie beispielsweise ein Phosphat und/oder Phosphonat.
Das Element unterhalb von Technetium im Periodensystem, Rhenium, hat ähnliche chemische Eigenschaften und sollte erwartungsgemäß in einer zu Technetium analogen Art reagieren. Es gibt etwa 34 Isotope von Rhenium, und zwei davon, besonders Rhenium-186 (t 1/2, 90 h; Gamma 137 keV, Beta 1,07, 0,93 MeV) und Rhenium-188 (t 1/2, 17 h; Gamma 155 keV, Beta 2,12 MeV), sind primäre Kandidaten zur Radioimmuntherapie unter Benutzung monoklonaler Antikörper. Beide Isotope haben auch Gamma- Emissionen bei geeigneten Energien für Gamma-Kamera-Bildgebungszwecke. Rhenium-186 wird aus Reaktoren durch Bombardierung von angereichertem Rhenium-185 mit Neutronen erhalten, was Rhenium-186 in einer Form mit zugesetzter Trägersubstanz, enthaltend einen großen Überschuß nicht radioaktiven Rheniums-185, ergibt. Rhenium-188 wird aus einem Wolfram- 188/Rhenium-188-Erzeuger (Oak Ridge National Laboratory) erhalten und kann aus dem Generator in einer im wesentlichen trägersubstanzfreien Form mit geringem Wolframdurchschlag ausgewaschen werden. Die Energieabgabe dieses Isotops bei einem hohem Δ = 1,63 g-rad/µCi-h ist ebenfalls nahe bei einem anderen wirksamen, energiereichen potentiellen Therapeutikum, Yttrium-90 (Δ = 1,99 g-rad/µCi-h, während gleichzeitig die chemischen Eigenschaften des Rheniums es zu einem weniger knochensuchenden Agens als Yttrium machen (welches oft mit Strontium-90 kontaminiert ist) und zu einer besseren Tumor/Organ-Bioverteilung und Dosierungsmessung führen.
Obwohl viele Arbeitsgruppen auf die Möglichkeit der Benutzung von Rhenium zur Markierung von Antikörpern in der gleichen Weise wie Technetium angespielt haben, wurden wenige erfolgreiche Arbeiten publiziert. Üblicherweise wird mit Antikörper-Chelatkonjugaten eine geringer Rheniumeinbau beobachtet und es gibt die allgemeine Tendenz von Rhenium, zum Perrhenat zurück zu oxidieren und dann aus der Komplexierung zu dissoziieren. Daneben erfordert der Weg über das bifunktionelle Chelat häufig eine organische Synthese mit einer langen Serie von Zwischenprodukten, die vor der Antikörperkonjugatbildung isoliert und gereinigt werden müssen.
Zahlreiche Versuche des Erfinders und von anderen, ein F(ab')&sub2;-Fragment, das mit Technetium oder Rhenium radioaktiv markiert und im wesentlichen frei von Fab'-Fragmenten ist, herzustellen, waren erfolglos. Solch ein Konjugat ist wünschenswert aufgrund seiner vorteilhaften Kombination von Ausscheidungs-Rate, Ausmaß der Tumorlokalisierung und Biodistribution.
Es besteht ein anhaltendes Bedürfnis nach einfachen, effizienten und vorzugsweise Ein-Gefäß-Methoden zur radioaktiven Markierung von Proteinen mit Radioisotopen von Technetium und Rhenium.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, in einfacher Weise einen immunreaktiven, mit Technetium oder Rhenium radioaktiv markierten Antikörper oder Antikörperfragmente, unter Einbeziehung von F(ab')&sub2;-Fragmenten herzustellen, die stabil gegenüber dem Verlust der Markierung durch Transchelierung oder Reoxidation sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur direkten radioaktiven Markierung eines Proteins zur Verfügung zu stellen, welches hohe Ausbeuten an markiertem Produkt mit minimaler Kontaminierung durch Nebenprodukte liefert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen einfachen und effizienten Kit zur radioaktiven Markierung zur Verwendung bei der Einführung von Technetium- oder Rhenium-Radioisotopen in einen Antikörper oder ein Antikörperfragrnent zur Verfügung zu stellen.
Durch weiteres Studium der Beschreibung und der anhängenden Ansprüche werden den Fachleuten weitere Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung offenbart.

Beschreibung der Erfindung

Die vorstehenden Ziele werden durch zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur radioaktiven Markierung eines Proteins, enthaltend eine Vielzahl räumlich benachbarten freier Sulfhydrylgruppen mit einem Radioisotop von Technetium oder Rhenium erreicht, umfassend die Schritte von Kontaktieren einer Lösung des Proteins, enthaltend eine Vielzahl räumlich benachbarter freier Sulfhydrylgruppen mit Zinn(II)-ionen und dann mit Radiopertechnetat oder Radioperrhenat, wobei die Menge an Zinn(II)-ionen in geringfiigigem Überschuß im Fall des Technetiums und in größerem Überschuß im Falle des Rheniums über der zur im wesentlichen vollständigen Reduktion des Radiopertechnetats oder Radioperrhenats erforderlichen Menge liegt und Isolierung des radioaktiv markierten Proteins.
Die Erfindung stellt ebenfalls Kits zur radioaktiven Markierung mit Technetium oder Rhenium zum Herbeiführen des erfindungsgemäßen Markierungsprozesses zur Verfügung, insbesondere um mit Tc-99m und Rhenium radioaktiv markierte Antikörper und Antikörperfragmente herzustellen, und verbesserte Methoden der Radioantikörperbildgebung und -therapie unter Benutzung von Antikörpern und Antikörperfragmenten, die gemäß der Erfindung radioaktiv markiert sind.

Detaillierte Beschreibung

Es wurde jetzt gefunden, daß ein Protein, insbesondere ein Antikörper oder Antikörperfragment, das mindestens eine Sulfhydrylgruppe, und vorzugsweise eine Vielzahl räumlich benachbarter freier Sulfhydrylgruppen aufweist, selektiv Technetium- und Rheniumradiometallionen unter milden Bedingungen und unter Bildung fester Bindungen zu den Sulfhydrylgruppen binden kann, die in Blut und anderen Körperflüssigkeiten und Geweben völlig stabil sind. Sowohl die Reagenzien als auch die Bedingungen im vorliegenden Verfahren, sind stark vereinfacht, aber das Verfahren ist insbesondere an die Markierung mit Technetium oder Rhenium angepaßt und es wird überraschend und unerwarteterweise gezeigt, daß die optimalen Bedingungen zur Einführung jeder einzelnen Markierung unterschiedlich sind.
Das vorliegende Verfahren umfaßt allgemein den Schritt des Kontaktierens einer Lösung eines Proteins, enthaltend freie Sulfhydrylgruppen, wobei die Lösung auch Sn(II)-Ionen enthält, mit einer Lösung von Tc-99m-Pertechnetat- oder Perrhenationen (unter Benutzung eines Radioisotops von Rhenium mit therapeutischem oder bildgebendem Nutzen), wobei eine Lösung von mit Technetium oder Rhenium radioaktiv markiertem Protein erhalten wird. Das Verfahren ist einfach und praktisch für den nuklearmedizischen Arzt oder Techniker. Bevorzugte Ausführungsformen schließen die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung radioaktiv markierter Antikörper oder Antikörperfragmente, die für Gamma-Bildgebung und Radioisotopentherapie nützlich sind, ein.
Die Markierungsmethode und der Kit der Erfindung können dazu benutzt werden, Radioisotope von Technetium und Rhenium an andere Proteine mit den erforderlichen freien Sulfhydrylgruppen zu binden. Proteine, die freie Sulfhydrylgruppen enthalten, können direkt markiert werden. Diejenigen, die Disulfidgruppen enthalten, üblicherweise über einen Cysteinrest verbunden, können mit einem Reduktionsmittel behandelt werden, um die freien Sulfhydrylgruppen zu erzeugen. Dies kann zur Fragmentierung des Proteins führen, wenn die Disulfidbindung Polypeptidketten verbindet, die nicht durchgängig sind oder es kann lediglich zu Kettentrennung führen, möglicherweise unter Konformationswechsel des Proteins, wenn die Disulfidbindung weit auseinanderliegende Segmente einer einzelnen Polypeptidkette verbindet. Sulfhydrylgruppen können in eine Polypeptidkette eingeführt werden, um benachbarte Gruppen zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Traut's Reagenz (Iminothiolan) zu diesem Zweck ist nicht bevorzugt, wohingegen die Verwendung von Oligopeptiden, enthaltend mehrere benachbarte Sulfhydrylgruppen, wirksam ist. Besonders die Verwendung von Metallothionein oder, vorzugsweise, seinem C-terminalen Hexapeptidfragment (nachfolgend "MCTP"), führt zu einer signifikanten Verbesserung.
Die Reduktion eines Antikörpers oder F(ab')&sub2;-Fragments mit bekannten Disulfidbindungen reduzierenden Agenzien, z. B. Dithiothreitol, Cystein, Mercaptoethanol und dergleichen, ergibt nach einer kurzen Zeit, typischerweise weniger als eine Stunde einschließlich Reinigung, Antikörper, die nach einer Analyse 1 - 10 freie Sulfhydrylgruppen aufweisen. Wenn mit Technetium unter Verwendung eines reduzierenden Agens wie Zinn(II)-ionen unter den vorliegenden Bedingungen markiert wird, wird eine 100%-ige Aufnahme von Tc-99m in das Protein, zusammen mit einem > 95 %-igen Erhalt der Immunreaktivität beobachtet.
Es wurde gefunden, daß Versuche, eine teilweise Reduktion von F(ab')&sub2;, resultierend aus enzymatischer Spaltung von intaktem Antikörper, zu erreichen, oft zu beträchtlicher weiterer Spaltung zu Fab' führen, und daß sogar spätere Versuche, Pertechnetat oder Perrhenat in der Gegenwart von F(ab')&sub2; mit Zinn(II)-ionen zu reduzieren, von Reduktion der Disulfidbindung und weiterer Spaltung zu Fab' begleitet werden, was zum Verlust einiger Markierung an das einwertige Fragment führt. Zur verbesserten Herstellung von F(ab')&sub2;-Antikörperfragmenten, im wesentlichen frei von weiteren Fab'-Spaltungsprodukten, wurde überraschend und unerwarteterweise gefunden, daß die Spaltung von Antikörpern, die schon freie Sulfhydrylgruppen aufweisen, zu F(ab')&sub2;-Fragmenten, gefolgt von Markierung mit reduziertem Pertechnetat oder Perrhenat zu hocheffizienter Markierung des F(ab')&sub2; mit im wesentlichen keiner weiteren Spaltung zu Fab' führt. Das F(ab')&sub2;-SH kann durch teilweise Reduktion von intaktem Antikörper, wie oben beschrieben, hergestellt werden oder durch Einführung freier Sulfhydrylgruppen in intakten Antikörper, z.B. durch Konjugieren mit aktiviertem MCTP oder einem äquivalenten Polythioladdenden, gefolgt von Spaltung, vorzugsweise enzymatisch mit z.B. Pepsin, unter üblichen, vorzugsweise sauren Bedingungen und in der Abwesenheit von Sauerstoff unter Bildung des Sulfhydryl-enthaltenden zweiwertigen Fragments.
Viel weniger Sn(II) als früher gedacht wird benötigt, um 100%-ige Tc-99m- Aufnahme zu erreichen. Die grundsätzliche Menge von Zinn, die in den meisten Verfahren nach dem Stand der Technik zur Markierung von Verbindungen mit Technetium benutzt wird, ist etwa 100 - 200 Mikrogramm pro Milligramm Protein. Jedoch, aufgrund der großen Bindungskraft der sterisch nahen SH-Gruppen und der Subnanogramm-Mengen von TcO&sub4;&supmin;, das normalerweise reduziert werden muß, um adäquate Aktivität zur Gamma- Bildgebung zu erhalten, kann viel weniger Zinn effektiv genutzt werden. Die Reduktion wird durch Zinn(II)-ionen bewirkt, im allgemeinen in wäßriger Lösung. Es liegt auf der Hand, daß Zinn(II)-ionen in situ aus Zinnmetall, z.B. Folie, Granulate, Pulver, Drehspäne und dergleichen durch Kontakt mit wäßriger Säure, z.B. HCl, erzeugt werden können und üblicherweise in Form von SnCl&sub2; zugegeben werden, vorteilhafterweise in einer Lösung, die auch etwa 0,1 mM an HCl ist.
Im allgemeinen ist es vorteilhaft, mit einer Konzentration an Antikörper oder Antikörperfragment von etwa 0,01 10 mg/ml, bevorzugt etwa 0,1 - 5 mg/ml zu arbeiten, im allgemeinen in Salzlösung, vorzugsweise gepuffert auf einen leicht sauren pH von etwa 4,0 - 4,5. In solch einem Fall ist die Menge an Zinn(II)-ionen, die zur Reduktion zu einer normalen, bildgebenden Aktivität von Pertechnetat benötigt wird, etwa 0,1 - 50 µg/ml, bevorzugt etwa 0,5 - 25 µg/ml im Verhältnis zur Menge des Proteins.
Wenn man die vorstehende Menge an Äntikörper oder Antikörperfragment markiert, ist die Menge von Pertechnetat im allgemeinen etwa 2 - 50 mCi/mg an Antikörper oder Antikörperfragment und die Reaktionszeit ist etwa 0,1 - 10 Min. Mit den oben erwähnten bevorzugten Konzentrationen an Protein und Zinn(II)-ionen ist die Menge an Pertechnetat vorzugsweise etwa 5 - 30 mCi/mg und die Reaktionszeit ist vorzugsweise etwa 1 - 5 Min.
Pertechnetat wird im allgemeinen von einem kommerziell erhältlichen Erzeuger erhalten, sehr häufig in der Form von NaTcO&sub4;, normalerweise in Salzlösung. Andere Formen von Pertechnetat können benutzt werden, mit geeigneter Modifizierung des Verfahrens, wie es von dem Lieferanten einer neuen Form von Erzeuger vorgeschlagen würde oder wie es für den Fachmann offensichtlich wäre. Pertechnetat wird im allgemeinen mit einer Aktivität von etwa 0,2 - 10 mCi/ml in Salzlösung, z.B. 0,9% ("physiologische") Salzlösung auf einen pH von 3 - 7, bevorzugt 3,5 - 5,5 und besonders bevorzugt etwa 4,5 - 5,0 gepuffert. Geeignete Puffer beinhalten z.B. Acetat, Tartrat, Citrat, Phosphat und dergleichen.
Die Reduktion wird normalerweise unter einer Inertgasatmosphäre, z.B. Stickstoff, Argon oder dergleichen, bewirkt. Die Reaktionstemperatur wird im allgemeinen bei etwa Raumtemperatur, z.B. 18 - 25ºC, gehalten.
Diese Bedingungen führen routinemäßig zu im wesentlichen quantitativer Aufnahme der Markierung in das Protein, in einer Form, die hochstabil gegenüber Oxidation und resistent gegenüber Transchelierung in Salzlösung und Serum ist. Es ist nun beispielsweise möglich, IgG, das früher mit einem thiolerzeugenden Reagenz reduziert wurde, mit 0,5 - 5 µg Sn(II) pro Milligramm IgG in im wesentlichen quantitativer Ausbeute einheitlich zu markieren. Im allgemeinen bleiben wenigstens 95 % der Markierung nach Stehen über Nacht bei 37ºC in Serum an das Protein gebunden. Weiterhin wird die Immunoreaktivität dieses Proteins nach dieser Seruminkubation kaum verringert, was zeigt, daß die Konjugate immer noch völlig brauchbare bildgebende Agenzien bis zu mindestens 24 Stunden sind.
Bei diesen Konzentrationen wird kein Transchelator wie Phosphonat, Tartrat, Glucoheptonat oder andere wohlbekannte Sn(II) chelatisierende Agenzien benötigt, um das Zinn in Lösung zu halten. Sn(II)-Verbindungen wie Zinn(II)chlorid und Zinn(II)acetat wurden in diesen Experimenten erfolgreich benutzt. Andere leicht erhältliche und konventionelle Sn(II)-Salze sind ebenfalls wirksam. Es gibt nur drei wesentliche Inhaltsstoffe; den reduzierten Antikörper, die wäßrigen Zinn(II)-ionen und die Pertechnetatlösung. Unter den hierin beschriebenen Bedingungen kann eine 100%-ige Aufnahme von Tc-99m in intakten Antikörper und Fab/Fab'-Fragmente leicht erreicht werden. Im Falle von F(ab')&sub2; führen die Markierungsbedingungen zu einer 100%-igen Aufnahme von Tc-99m, aber ergeben auch eine bestimmte Menge von radioaktiv markiertem Fab', zusätzlich zu radioaktiv markiertem F(ab')&sub2;. Die hierin beschriebene Verbesserung zur Herstellung von radioaktiv markiertem F(ab')&sub2; vermeidet dieses Problem.
Die resultierenden Tc-99m radioaktiv markierten Antikörper und Antikörperfragmente sind zum Gebrauch in szintigraphischer Bildgebung von z.B. Tumoren, infektiösen Läsionen, Mikroorganismen, Blutgerinnseln, Herzinfarkten, atheroskierotischen Plaques oder normalen Organen und Geweben geeignet. Solche bildgebenden Methoden sind im Fachgebiet wohl bekannt. Die Lösungen radioaktiv markierter Antikörper, wie sie oben hergestellt werden, sind fertig zur sofortigen Injektion bereit, wenn sie in einem richtig sterilisierten, pyrogenfreien Gefäß hergestellt werden. Es ist ebenfalls keine Blockierung freier Sulfhydrylgruppen nach der Bindung von Technetium zur Stabilisierung notwendig.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders attraktiv für die Markierung von Antikörpern und Antikörperfragmenten, obwohl Proteine wie Albumin, Arzneimittel, Cytokine, Enzyme, Hormone, Immunmodulatoren, Rezeptorproteine und dergleichen ebenfalls markiert werden können. Antikörper enthalten eine oder mehrere Disulfidbindungen, die die schweren Ketten verbinden, ebenso wie Disulfidbindungen, die leichte und schwere Ketten verbinden. Die letzteren Disulfidbindungen sind normalerweise für Disulfid reduzierende Agenzien weniger zugänglich und die Bindungen, die schwere Ketten verbinden, können normalerweise selektiv gespalten werden. Die resultierenden Fragmente behalten ihre Immunospezifität und Fähigkeit, an Antigene zu binden. Es liegt auf der Hand, daß die Reduktion von Disulfidbindungen, die die schweren Ketten eines Immunglobulins verbinden, vorsichtig herbeigeführt werden muß, da die normalerweise weniger reaktiven Disulfidbindungen, die leichte und schwere Ketten verbinden, ggf. reduziert werden, wenn die Reduzierungsbedingungen zu drastisch sind oder das reduzierende Agens mit den Fragmenten für eine zu lange Zeit in Kontakt belassen wird.
Einmal reduziert, sind die Antikörper-SH-Einheiten sehr stabil, wenn sie unter streng sauerstofffreien Bedingungen gelagert werden. Die Stabilität wird durch Lagerung bei niedrigerem pH insbesondere unterhalb pH 6, ebenfalls gesteigert. Es wurde gefunden, daß schnelles Abkühlen von Antikörper und Antikörperfragmenten, enthaltend eine Vielzahl freier Sulfhydrylgruppen, auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff deren Lagerung für verlängerte Zeiträume ohne Zerfall oder signifikanten Verlust an Sulfhydrylgruppen erlaubt. Es wird angenommen, daß das Baden der Röhrchen, die Antikörper- SH oder Fragment-SH-Spezies enthalten, in einer Stickstoffatmosphäre zum Schutz durch die niedrige Temperatur beiträgt und effektiv die Reoxidation von Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden verhindert.
Es liegt ebenfalls auf der Hand, daß die Antikörper oder Antikörperfragmente, die radioaktiv markiert werden sollen, Antikörper sein können, die an Antigene binden, welche Antikörper, die von Tumoren, infektiösen Läsionen, Mikroorganismen, Parasiten, Herzinfarkten, Blutgerinnseln, atherosklerotischer Plaque oder normalen Organen und Geweben produziert werden oder damit in Verbindung stehen, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Mit "Antikörpern und Antikörperfragmenten" sind im allgemeinen Immunglobuline gemeint, die spezifisch an Antigene unter Bildung von Immunkomplexen binden. Die Bezeichnungen schließen übliche IgG, IgA, IgE, IgM und dergleichen, übliche Enzymverdauprodukte wie F(ab')&sub2;-Fragmente, erhältlich durch Pepsinverdau von intakten Immunglobulinen, Fab-Fragmenten, erhalten durch Papainverdau von intakten Immunglobulinen, übliche einwertige Fab' und leicht-schwer Kettenfragmente, erhalten durch Disulfidbindungsspaltung von F(ab')&sub2;-Fragmenten bzw. intaktem Antikörper, ebenso wie Produkte, die im wesentlichen gleiche Eigenschaften wie solche Immunglobuline und Fragmente haben, ein. Solche ähnlichen Proteine schließen Antikörpersubfragmente, die durch weiteren Verdau oder Manipulation größerer Fragmente hergestellt wurden, gentechnisch konstruierte Antikörper und/oder Fragmente und synthetische Proteine, die einen Antigen-Erkennungsbereich, der spezifisch an ein Antigen in einer im wesentlichen analogen Weise zu einem "klassischen" Immunglobulin bindet, ein. Das einzige wesentliche Erfordernis für ein solches Protein ist, daß es zwei oder mehr benachbarte Sulfhydrylgruppen hat, die als Chelator für das reduzierte Pertechnetat oder Perrhenatradiometall-Ion dienen, vorteilhafterweise durch partielle Reduktion oder durch Einführen von Polythiolanteilen.
Mit "reduziertem Pertechnetat" oder "reduziertem Perrhenat" sind die Spezies von Technetium- oder Rheniumionen gemeint, die durch Reduktion von Pertechnetat oder Perrhenat mit Zinn(II)-ionen gebildet werden und von der (den) Thiolgruppe(n) chelatisiert sind. Es wird im allgemeinen angenommen, daß reduziertes Pertechnetat in der Form von Tc(III) und/oder Tc(IV) und/oder Tc(V) in solchen Chelaten vorliegt und daß reduziertes Perrhenat in der Form von Re(III) und/oder Re(IV) und/oder Re(V) vorliegt, aber höhere oder niedrigere Oxidationszustände und/oder mehrfache Oxidationszustände können nicht ausgeschlossen werden und sind innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Rhenium wird genau unterhalb von Technetium im Periodensystem gefunden und hat die gleiche äußere elektronische Schalenkonfiguration und es kann deshalb erwartet werden, daß es sehr ähnliche chemische Eigenschaften besitzt, insbesondere das Verhalten analoger Verbindungen. Tatsächlich verhalten sich Rheniumverbindungen qualitativ ähnlich zu Technetiumverbindungen insoweit, wie die Reduktion und Chelatisierung betroffen sind, aber ihre Reaktionsraten sind sehr unterschiedlich und sie sind unterschiedlich in bestimmten, wichtigen Beziehungen.
Das Radioisotop Re-186 ist attraktiv für die Therapie und kann ebenfalls zur Bildgebung benützt werden. Es hat eine Halbwertszeit von etwa 3,7 Tagen, eine hohe LET-Betaemission (1,07 MeV) und eine zweckmäßige Gammaemissionsenergie (0,137 MeV). In Analogie zum Technetium wird Rhenium aus Perrhenat hergestellt und die reduzierten Rheniumionen können nichtspezifisch an Protein binden. Entsprechend wäre eine Methode zur Re-186- Markierung von Proteinen, worin das reduzierte Perrhenat an Suifhydrylgruppen eines Proteinmoleküls wie eines Antikörpers gebunden ist, vorteilhaft. Re-188 ist ein Erzeuger-produzierter Beta- und Gamma-Strahler mit einer Halbwertszeit von etwa 17 Stunden und ist nützlich für Bildgebung und Therapie. Die Entwicklung kommerzieller Erzeuger für Rhenium-188 wird zur Zeit durchgeführt; und in einem bevorzugten Szenarium wird trägerfreies Rhenium-188 direkt in ein Gefäß, enthaltend Zinn(II)-ionen und IgG zugegeben, unter Bildung eines Rhenium radioaktiv markierten Proteins, welches in weniger als zwei Stunden gebrauchsfertig ist. Die Halbwertszeit von Rhenium-188 von 17 Stunden macht die Herstellungsgeschwindigkeit besonders wichtig.
Das Verfahren im Falle von Rhenium wird in Vergleich zu dem, das beim Einsatz von Pertechnetat benutzt wird ein wenig modifiziert. Im Gegensatz zu Tc-99m-Markierungsverfahren markiert Perrhenat keine reduzierten Antikörper, wenn niedrige Mengen von Zinn(II)-ionenreduktionsmittel und kurze Reaktionszeiten angewendet werden. Beim Gebrauch höherer Mengen von Zinn(II)-ionen, z.B. Zinn(II)tartrat, und längeren Reaktionszeiten werden jedoch Thiol-reduzierte Antikörper erfolgreich mit Rhenium markiert.
Durch umsichtige Manipulation der Bedingungen können mehr als 80% Aufnahme des Rheniums in den Antikörper in nur wenigen Stunden erreicht werden, was insbesondere wichtig für Rhenium mit seiner 17-stündigen Halbwertszeit und seinem Potential für radiobiologischen Schaden am Antikörper ist. Die Markierungsverfahren sind einfacher als die bisher für radioaktive Markierung mit Iod-131 benötigten und wesentlich einfacher als was gegenwärtig zur Markierung von Antikörpern mit Yttrium-90 und Kupfer-67 erforderlich ist. Die kurze Markierungszeit stellt Erhalt der Antikörperimmunreaktivität sicher.
Die Bedingungen werden abhängig davon variieren, ob das Perrhenat im wesentlichen trägersubstanzfrei (z.B. Erzeuger-produziertes Re-188) oder Trägersubstanz zugesetzt (z.B. Reaktor-produziertes Re-186) ist, wobei das letztere mehr Perrhenat für gleiche Aktivität und daher mehr Zinn(II)-ionen reduktionsmittel erfordert, obwohl nicht notwendigerweise mehr Protein. Dies ist ein Aspekt, der im Stand der Technik nicht behandelt wird.
Grundsätzlich wird ein Protein, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörperfragment, enthaltend eine Vielzahl benachbarter Sulfhydrylgruppen in Konzentrationen benutzt werden, die die bevorzugten Therapieanwendungen von Radioisotopen von Rhenium reflektieren. Die Proteintypen, die markiert werden können und die Definitionen von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die für die Technetium-Markierung offenbart werden, sind ebenfalls für die radioaktive Markierung mit Rhenium gültig.
Markierung mit im wesentlichen trägerfreiem Re-188-NaReO&sub4;, in der Form, wie sie normalerweise von einem Erzeuger produziert würde, wird vorteilhafterweise mit dem Sulfhydryl-enthaltenden Protein erreicht, z.B. Antikörper oder Fragment bei einer Proteinkonzentration von etwa 1 - 20 mg/ml, vorzugsweise 10 - 20 mg/ml in im wesentlichen den gleichen Lösungen und unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie mit Pertechnetat. Die benutzte Menge an Zinn(II)-ionen ist im allgemeinen etwa 100-10.000 µg/ml, vorzugsweise etwa 500 - 5.000 µl/ml, vorzugsweise im Verhältnis zur Menge des Proteins. Bei Benutzung der vorstehenden Mengen von Protein und Zinn(II)-ionen ist es vorteilhaft, etwa 10 - 500 mCi, vorzugsweise etwa 50 - 250 mCi von im wesentlichen trägerfreien Re-188- Perrhenat, vorzugsweise wieder im Verhältnis zu der Menge des Proteins zu benutzen. Die Reaktionszeit ist vorteilhafterweise etwa 1 min. - 4 h, vorzugsweise etwa 15 min. - 2 h. Überraschend und unerwarteterweise waren die Reagenzienverhältnisse und Reaktionszeiten, die für Pertechnetat-Markierung optimal waren, nicht für Perrhenat wirksam und umgekehrt.
Markierung mit Re-186-NaReO&sub4; mit zugegebener Trägersubstanz in einer Form, wie sie normalerweise von einem Reaktor produziert würde und die im allgemeinen etwa 100- bis 1.000-fachen Überschuß an Re-185 als Träger enthält, wird vorteilhafterweise mit dem Sulfhydryl-enthaltenden Protein, z.B. einem Antikörper oder Fragment, bei einer Proteinkonzentration von etwa 1 - 20 mg/ml, bevorzugt 10 - 20 mg/ml in im wesentlichen den gleichen Lösungen und unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen wie für Re- 188-Perrhenat bewirkt. Aufgrund der großen Trägermenge, ist die Menge an verwendet Zinn(II)-ionen jedoch im allgemeinen etwa 1 - 1.000 mg/ml, bevorzugt etwa 5 - 500 mg/ml und bevorzugt wieder im Verhältnis zu der Menge an Protein. Ungefähr die gleiche Aktivität an Rheniumradioisotop und etwa die gleichen Reaktionszeiten werden für dieses Isotop benützt.
Eine kurze Säulenprozedur ist normalerweise ausreichend, um jegliches ungebundene Rhenium zu entfernen und nach dieser Zeit ist es fertig zur sofortigen Injektion, wenn sie in einem richtig sterilisierten, pyrogenfreien Gefäß ausgeführt wird. Wiederum ist keine Blockierung freier Sulfhydrylgruppen nach der Rheniummarkierung zur Stabilisierung notwendig.
In einer überraschenden und unerwarteten Entwicklung wurde nun gezeigt, daß Proteine, die wenigstens eine Disulfidgruppe enthalten, z.B. intakte Antikörper (ohne vorherige Reduktion), einfach und direkt unter Benutzung einer größeren Menge von Zinn(II)-ionen mit Rhenium radioaktiv markiert werden können, um begleitend den Antikörper und die Rheniumspezies zu reduzieren und zu verbinden. Die "Pretinning"-Verfahren, die an anderer Stelle beschrieben werden und frühere Technetium-IgG-Markierungsverfahren ergaben schlechte Resultate. Lange und/oder schwere Reaktionen sind mit der erfolgreichen Erzeugung eines injizierbaren IgG-Rheniums unvereinbar.
Im allgemeinen wird die Konzentration an unreduziertem Protein, z.B. Antikörper, die Reaktionszeiten, Perrhenataktivitäten und andere Bedingungen im wesentlichen die gleichen wie für Re-186- oder Re-188-Markierung von Sulfhydryl enthaltenden Proteinen sein, mit der Ausnahme, daß eine größere Menge an Zinn(II)-ionen benutzt wird. Wenn das Radioisotop im Radioperrhenat im wesentlichen trägersubstanzfreies Re-188 ist, ist die Konzentration an Antikörper oder Antikörperfragment in der Lösung vorteilhafterweise etwa 1 - 20 mg/ml, bevorzugt etwa 10 - 20 mg/ml und die Menge an Zinn(II)- ionen ist etwa 500 - 10.000 µg/ml, bevorzugt etwa 500 - 5.000 µg/ml. Wenn das Radioisotop im Radioperrhenat Re-186 mit zugegebenem Träger ist, ist die Menge an Zinn(II)-ionen bei der selben Konzentration von Antikörper oder Antikörperfragment etwa 5 - 1.000 mg/ml, bevorzugt etwa 50 - 500 mg/ml.
Tatsächlich wurde unmodifiziertes, unreduziertes IgG genommen, in ein Gefäß mit einem zinnhaltigen Reduktionsmittel eingeführt und erfolgreich mit Perrhenat in lediglich 45 Minuten bei Raumtemperatur markiert. Kein "Pretinning" wird angewendet, sondern Perrhenat wird sofort, nachdem der Antikörper und Zinn gemischt sind, zugegeben. Der Schlüssel ist es, genügend Zinn zu haben, um eine schnelle Reduktion zu erreichen. Eine kurze Trennsäule, einfacher im Bedienungskomfort als eine typische Iod-131-Markierungsreinigung, ergibt ein reines Rhenium-IgG-Konjugat, fertig zur Injektion. Das IgG den angewandten Bedingungen auszusetzen, beeinträchtigt seine Immunoreaktivität nicht, wie auf einer Affinitätssäule von gebundenem Antigen gemessen wird. Es zeigt sich, daß eine in situ Reduktion von Protein-Disulfidgruppen durch das Zinnion die Perrhenatreduktion begleitet und die notwendigen Bedingungen für eine Protein-Metallkomplexbildung schafft. Die Tatsache, daß Pertechnetat IgG unter den gleichen Bedingungen wesentlich weniger vorteilhaft markiert, legt dies als insbesondere neue und effiziente Route zum Erhalt Rhenium-markierter Antikörper mit minimaler Manipulation nahe.
Rheniummarkierung wird in im wesentlichen der gleichen Art wie Technetiummarkierung erreicht, wobei man sich insbesondere darum kümmern muß, die Abwesenheit von Luftsauerstoff im System sicher zu stellen. Die erfindungsgemäß hergestellten, Rhenium-markierten Proteine zeigen keine Zeichen bereitwilliger Reoxidation zum Perrhenat, wie sie von anderen beobachtet wurde, was zeigt, daß das vorliegende Verfahren nicht nur leicht, sondern auch stabil ist. Damit gekoppelt sind die Tatsachen, daß viel weniger IgG- Manipulation für die vorliegende Methode gebraucht wird, daß Re-188 in einem zweckmäßigen Erzeuger-Format erhältlich ist (mit einem einzigen Erzeuger, der zu täglichem Gebrauch für eine Periode von 60 Tagen oder mehr in der Lage ist) und daß keine Probleme durch Strontiumkontamination angetroffen werden, was Rhenium-radioaktiv markiertes IgG zu einem attraktiven therapeutischen Agens macht.
Rheniumantikörperpaare, die nach diesem Verfahren hergestellt sind, haben sich als sehr stabil herausgestellt, sogar, wenn sie in Lösung für mindestens fünf Tage der Atmosphäre ausgesetzt wurden. Diese Langzeitstabilität ist für ein Immunoradiotherapeutikum ebenso wichtig wie der Erhalt der Immunoreaktivität während der Markierungsprozeduren, was ebenfalls demonstriert wurde.
Es ist klar, daß der vorliegende Ansatz sehr unterschiedlich zu Ansätzen aus dem Stand der Technik ist aufgrund der Einfachheit, Effektivität, Effizienz und der Abwesenheit größerer Manipulationen während des Verfahrens, genauso wie aufgrund der Stabilität der Rheniumpaare. Es wird nochmals betont, daß die relativ höhere Menge an Zinn und die längeren Reaktionszeiten für effiziente Pertechnetatmarkierung nicht förderlich sind, aber für Perrhenat optimal sind, wohingegen wenig Zinn und schnelle Markierungsbedingungen, die optimal für Pertechnetat sind, bei Perrhenat nicht funktionieren. Insbesondere für etwa 1 mg Antikörper und eine bildgebende Aktivität von Tc-99m, führen sehr wenig Zinn und 5 Min. Reaktionszeit zu exzellenten Resultaten, wohingegen für therapeutische Stufen von Re-186- oder Re-188-Markierung mehr als 500 µg/ml Zinn(II)-ionen erwünscht sind, speziell, wenn intakter Antikörper benutzt wird und Reaktionszeiten in einer Größenordnung von nahe an einer Stunde wirksam sind.
Ein Kit zum Gebrauch bei der radioaktiven Markierung eines Proteins, z.B. eines Fab'-SH oder F(ab')&sub2;-Fragments oder eines intakten Antikörpers mit Tc-99m unter Benutzung Erzeuger-produzierten Pertechnetats, würde etwa 0,01 - 10 mg pro Einheitsdosis eines Antikörpers oder Antikörperfragments, das spezifisch ein Antigen im Zusamrnenhang mit einem Tumor, einer infektiösen Läsion, einem Mikroorganismus, einem Parasiten, einem Herzinfarkt, einem Blutgerinnsel, atherosklerotischer Plaque oder einem normalen Organ oder Gewebe bindet, und das eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen enthält, einschließen; und etwa 0,1 - 50 µg pro Einheitsdosis an Zinn(II)-ionen. Die Bestandteile des Kits werden gerade vor dem Gebrauch mit etwa 2 - 50 mCi von Tc-99m-Pertechnetat pro Milligramm Antikörper oder Antikörperfragment vereinigt. Der Antikörperlfragment-SH und das Sn(II)-Reduktionsmittel werden vorteilhalterweise in einer einzigen Lösung in einem Gefäß, das gelagert werden kann, z.B. in einem Bad aus flüssigem Stickstoff oder gefriergetrocknet, vorzugsweise mit zugesetztem Zucker, wie es in der Technik wohl bekannt ist, vor der Zugabe des Pertechnetats vereint.
Ein Kit zur radioaktiven Markierung eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem Re-188-Radioisotop von Rhenium würde typischerweise 1 - 20 mg pro Einheitsdosis eines Antikörpers oder Antikörperfragments einschließen, z.B. einen, der spezifisch ein Antigen bindet, das im Zusammenhang mit einem Tumor oder einer infektiösen Lasion steht und der eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen enthält; und etwa 1 - 10.000 µg pro Einheitsdosis von Zinn(II)-ionen; und würde gerade vor dem Gebrauch mit etwa 10 - 500 mCi eines im wesentlichen trägersubstanzfreien Re-188-Perrhenats pro Milligramm Antikörper oder Antikörperfragment zusammengefügt werden. Vorteilhafterweise würden die Bestandteile des Kits in einem einzigen Gefäß vorliegen und wie oben beschrieben, gelagert oder gefriergetrocknet werden, bis zum Gebrauch zum Markieren.
Ein Kit zum radioaktiven Markieren eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem Re-186-Radioisotop von Rhenium wird typischerweise etwa 1 - 20 mg pro Einheitsdosis eines Antikörpers oder Antikörperfragments, z.B. einem, der spezifisch ein Antigen im Zusammenhang mit einem Tumor oder einer infektiösen Lasion bindet und der eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen aufweist, einschließen; und etwa 1 - 1.000 mg pro Einheitsdosis an Zinn(II)-ionen, und würde gerade vor dem Gebrauch mit etwa 10 - 500 mCi an trägerhaltigem Re-186-Perrhenat pro Milligramm Antikörper oder Antikörperfragment zusammengefügt werden. Einzelgefäßlagerung und Gebrauch wie oben sind bevorzugt.
Ein Kit zur Markierung von unreduziertem intaktem Antikörper mit einem der Rheniumisotope wäre ähnlich zum Vorstehenden, mit Ausnahme der größeren Menge an Zinn(II)-ionen, die im allgemeinen dazu benutzt werden, um einige der Disulfidbindungen im Antikörper, genauso wie das Perrhenat, zu reduzieren.
Die Proteine in solchen Kits sind vorteilhafterweise gefroren oder gefriergetrocknet, in sterilen Gefäßen und unter einer Inertgasatmosphäre, vorzugsweise gekühlt und in einem Flüssig-Stickstoff-Bad gelagert und werden gerade vor der Benutzung vorsichtig aufgetaut.
Die Kits werden zweckmäßigerweise mit sterilen Gefäßen mit Puffern, Salzlösungen, Spritzen, Filtern, Säulen und dergleichen Hilfsmittel ergänzt, um die Zubereitung gebrauchsfertiger Zubereitungen durch den klinischen Arzt oder Technologen zu erleichtern.
Variationen und Modifikationen dieser Kits werden dem Durchschnittsfachmann sofort offenbar als eine Funktion der individuellen Bedürfnisse des Patienten oder der Behandlungskur, genauso wie Variationen in der Form, in der das Radioisotop zur Verfügung gestellt werden kann oder erhältlich sein kann.
Es wird für den Durchschhittsfachmann ebenfalls klar werden, daß die radioaktiv markierten Proteine, insbesondere Antikörper und Antikörperfragmente, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind, nützlich und tatsächlich besonders bequem und effizient bei Methoden der nicht-invasiven szintigraphischen Bildgebung und zur Radioantikörpertherapie von Tumoren und Läsionen sein werden. Insbesondere bei einer Methode zur Abbildung eines Tumors, einer infektiösen Läsion, eines Herzinfarkts, eines Blutgerinnsels, atherosklerotischer Plaque oder eines normalen Organs oder Gewebes, worin ein Antikörper oder Antikörperfragment, das spezifisch an ein Antigen, produziert oder in Zusammenhang stehend mit diesem Tumor, einer infektiösen Läsion, Herzinfarkt, Blutgerinnsel, atheroskierotischer Plaque oder normalem Organ oder Gewebe und das mit einem pharmazeutisch inerten Radioisotop, das zur externen Detektion geeignet ist, radioaktiv markiert ist, bindet, parenteral in einen menschlichen Patienten injiziert wird und, nach einer für den radioaktiv markierten Antikörper oder das Antikörperfragment zur Lokalisierung und für die Klärung des Hintergrunds, der nicht Ziel ist, ausreichenden Zeit und die Stelle oder die Stellen der Ablagerung des radioaktiv markierten Antikörpers oder der Antikörperfragmente durch eine externe bildgebende Kamera detektiert werden, wird es eine Verbesserung sein, als radioaktiv markierten Antikörper oder Antikörperfragment einen Tc- 99m-markierten Antikörper oder Antikörperfragment, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, zu verwenden.
Überdies wird es bei einem Verfahren zur Radio-Antikörpertherapie eines Patienten, der an einem Tumor oder einer infektiösen Läsion leidet, worin ein Antikörper oder Antikörperfragment, das spezifisch an ein Antigen bindet, das von einem Tumor oder einer infektiösen Lasion erzeugt wird oder damit in Zusammenhang steht und mit einem therapeutisch wirksamen Radioisotop radioaktiv markiert ist, parenteral in einen menschlichen Patienten, der an einem solchen Tumor oder einer solchen infektiösen Läsion leidet, injiziert wird, eine Verbesserung darstellen, als radioaktiv markierten Antikörper oder Antikörperfragment einen Rhenium-radioaktiv markierten Antikörper oder Antikörperfragment, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, zu benutzen, entweder aus vorreduziertem oder unreduziertem Antikörper.
Ohne weitere Ausführungen wird angenommen, daß der Fachmann unter Benutzung der vorangegangenen Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem ganzen Ausmaß benutzen kann. Die folgenden bevorzugten, spezifischen Ausführungsformen sind daher lediglich als darstellend und nicht als limitierend für die übrige Offenbarung in irgendeiner Weise auszulegen.
In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen unkorrigiert in Grad Celsius wiedergegeben;

BEISPIEL 1

Antikörperreduktion

In einem typischen Experiment wird eine Lösung von 5 mg gereinigtem monoklonalen anti-CEA IgG (Antikörper, der spezifisch an ein karzinoembryonales Antigen bindet, ein Marker, der mit colorectalem Krebs in Zu sammenhang steht) in 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei einem pH, der auf 6,2 - 6,6 eingestellt wird, 30 - 50 millimolar an 2-Mercaptoethanol gemacht. Nach Stehen bei Raumtemperatur für 30 - 40 Minuten wird die Probe auf einer Acrylamidsäule mit von Sauerstoff befreitem Acetat als Puffer gereinigt. Die reduzierte IgG-Lösung wird auf 1 - 2 mg/ml aufkonzentriert auf Centricon und wird auf SH-Gruppen pro IgG durch die Ellman-Reaktion untersucht. Es wird zweckmäßigerweise steril filtriert bei 4 1/2 C oder gefroren für größere Stabilität der SH-Gruppen gelagert.

BEISPIEL 2

Tc-99m-Radiomarkierung

In einem typischen Experiment wird eine Lösung, enthaltend 125 Nanogramm von Sn(II) mit einer Lösung, enthaltend 3,6 x 10&supmin;¹&sup0; Mol monoklonalen anti-CEA mit freien Sulfhydrylgruppen, hergestellt gemäß Beispiel 1 und 1,2 SH pro IgG nach Ellman-Reaktion aufweisend, gemischt, was ein 2,9:1- Verhältnis von Sn(II) zu IgG ergibt. Zugabe von 2 mCi Technetium-99m als Pertechnetat in Salzlösung, gefolgt von Inkubation für 5 Minuten bei Raum temperatur ergibt, wie durch HPLC gemessen, eine 100%-ige Aufnahme von Technetium in das Protein und weniger als 1 % restliches Pertechnetat, gemessen durch ITLC in zwei unterschiedlichen Elutionspuffern. Die Immunoreaktivität ist > 98%, wenn sie auf einer CEA-Säule gemessen wird. Die Lösung von markiertem Antikörper kann direkt zur in vivo Injektion benutzt werden.

BEISPIEL 3

Re-186-Radiomarkierung

In einem typischen Experiment wird eine Lösung, enthaltend 880 Mikrogramm Sn(II) mit einer Lösung, enthaltend 1 mg monoklonalen anti-CEA intakten Antikörper, gemischt. Zugabe von 18,9 x 10&supmin;¹¹ Mol Rhenium-186, mit einer Aktivität von 9 Millionen cpm, als Perrhenat in Salzlösung, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur, ergibt eine 75%- ige Aufnahme von Rhenium in das Protein. Der markierte Antikörper ist stabil gegenüber Luftoxidation und seine Immunoreaktivität ist hoch, wenn sie auf einer CEA-Säule gemessen wird. Die Lösung kann direkt zur in vivo Injektion benutzt werden.

BEISPIEL 4

Re-188-Radiomarkierung

In einem typischen Experiment wird eine Lösung, enthaltend 1 mg von Anti-CEA Fab'-SH (SH erzeugt durch eine Reduktion von F(ab')&sub2; mit Cyste in, Mercaptoethanol oder Dithiothreitol), in einer Argonatmosphäre zusammen mit 1 ml von 100 mM Tartrat + 50 mM Acetatpuffer und einer Sn(II)-Spezies, enthaltend etwa 123 µg von Sn(II), gegeben. 20 - 2.000 µl einer Perrhenatlösung, abhängig von der Konzentration, äquivalent zu etwa 1 x 10&supmin;&sup9; Mol Rhenium wird zugegeben. Nach dem Mischen wird die Reaktion in 1 - 6 Stunden bewirkt mit einer beobachteten Rheniumaufnahme von 60-100%. Die Lösung von markiertem Antikörperfragment kann direkt zur in vivo Injektion benutzt werden.
Um die Markierungseffizienz zu bestätigen, wird eine Probe des markierten Proteins sofort auf eine Acrylamidsäule aufgebracht und entweder mit Acetatpuffer oder Salzlösung eluiert. Das markierte Protein eluiert mit dem Leervolumen (etwa 5 ml) und es zeigt sich durch ITLC in Salzlösung, daß es 100%-ig an an das Protein gebundenem Rhenium ist. Die Konjugate können genauso gut durch einen schnellen Lauf durch eine Minisäule unter Benutzung eines Spritzenzylinders gereinigt werden, um wiederum eine 100%-ig proteingebundene Markierung zu ergeben.
Das markierte Fragment tritt durch Filter mit einer Porengröße von wenigstens 0,05 Micron, ohne daß sich Aggregation zeigt. In allen Säulenverfahren und Filtrationen wird im wesentlichen eine 100%-ige Wiedergewinnung der Radioaktivität erreicht. Chromatografie auf HPLC und ITLC zeigt, daß die Radioaktivität mit der Proteinfraktion eluiert/wandert.

BEISPIEL 5

F(ab')&sub2;-SH Produktion

(a) Teilweise Reduzierung von intaktem Antikörper

Eine Lösung von intaktem Anti-Lymphom IgG 2A Antikörper in Tris-Puffer (0,1M, pH 8,7) zwischen 10 und 20 mg/ml wird 25 Millimolar an L- Cystein gemacht. Nach 10 Minuten bei 4ºC wird sie durch Größenausschlußchromatografie in 50 mM Acetat, pH 4,5, gereingt und die vereinigten Proteinfraktionen auf 10 mg/µl konzentriert. Analyse durch die Ellman- Reaktion zeigt ungefähr 3,5 SH-Gruppen pro Mol IgG. Eine Reduktion kann durch andere thiolreduzierende Agentien, z.B. Dithiothreitol (DTT), 2-Mercaptoethanol (2-ME), Metallothionein C-terminales Hexapeptid (MCTP) und dergleichen erreicht werden.

(b) Enzymatischer Verdau

Der Verdau einer Probe von teilweise reduziertem Antilymphoma-Antikörper, hergestellt nach Teil (a) oben, wird durch Einstellen des pH auf 4,0 mit ein wenig Zitronensäurelösung (1M) und Behandlung des IgG mit Pepsin (äquivalent zu einer Endkonzentration von 200 µg/ml für 3 - 4 Stunden bei 37 1/2 C durchgeführt. Der Fortgang der Reaktion wird durch Größenausschluß HPLC verfolgt, und, wenn das gesamte intakte IgG verschwunden ist, wird die Reaktion durch Kühlen auf 4 1/2 C und Anheben des pH auf 5,5 gestoppt und sofort auf eine präparative HPLC-Säule (Zorbax 250, Dupont) aufgebracht und es werden alle 12 Sekunden Fraktionen gesammelt, zwischen 8 und 15 Minuten Retentionszeit. Die Fraktionen, die um 9,5 Minuten eluieren, werden analysiert und, wenn sie für identisch befunden sind, vor der Rekonzentrierung vereinigt. Das so hergestellte F(ab')&sub2;-SH, wird als ein Signal ohne Anzeichen für einwertiges Fab' auf der HPLC gefunden. Es wird vor der radioaktiven Markierung in einem Flüssig-Stickstoff-Bad aufbewahrt.

BEISPIEL 6

Technetium-99m-Markierung

In einem typischen Experiment wird 1 mg teilweise reduziertes Antilymphom F(ab')&sub2;-SH, hergestellt gemäß Verfahren 5, in einer Argonatmosphäre mit 1 ml von 10 - 100 mM Tartrat + 50 mM Acetatpuffer und einer Sn(II)- Spezies, enthaltend etwa 120 µg Sn(II), zusammengegeben. 20 - 2.000 µl einer Pertechnetatlösung, abhängig von der Konzentration, äquivalent zu bis zu etwa 1 x 10&supmin;&sup9; Mol Technetium werden zugegeben. Nach nur etwa 5 Minuten sind im wesentlichen 100% der Technetiurnmarkierung an das F(ab')&sub2;-Fragment gebunden, mit im wesentlichen keiner weiteren Fragmentierung zu Fab'.
Das markierte Fragment tritt durch Filter mit einer so geringen Porengröße wie 0,05 Micron, ohne Aggregation zu zeigen. In allen Säulenverfahren und Filtrationen wird eine im wesentlichen 100%-ige Rückgewinnung der Radioaktivität erhalten. Chromatografie auf HPLC und ITLC zeigt, daß die Radioaktivität mit der Proteinfraktion eluiert/wandert. Markiertes Fragment ist hochresistent gegenüber Reoxidation entweder in Acetatpuffer oder Salzlösung, wenn es für bis zu 72 Stunden der Atmosphäre ausgesetzt wird. Daher kann ein Technetium-radioaktiv markiertes Produkt innerhalb weniger Minuten zur Injektion fertig sein mit minimaler Laborbearbeitung.

BEISPIEL 7

Rhenium-188-Markierung

In einem typischen Experiment wird 1 mg teilweise reduzierten Antilymphoms F(ab')&sub2;-SH, hergestellt nach Beispiel 5, in einer Argonatmosphäre mit 1 ml von 10 - 100 mM Tartrat + 50 mM Acetatpuffer und einer Sn(II)- Spezies, enthaltend etwa 120 µg Sn(II), zusammengebracht. 20 - 2.000 µl einer Perrhenatlösung, abhängig von der Konzentration, äquivalent zu bis zu etwa 1 x 10&supmin;&sup9; Mol Rhenium werden zugegeben. Nach dem Mischen kann die Markierung 1 bis 18 Stunden stehen gelassen werden, wobei Rheniumaufnahmen, durch ITLC, von 60 - 95 % beobachtet werden. Die resultierendc Lösung kann wie sie ist zur Injektion in einen Patienten benutzt werden.
Um die Radiomarkierungseffizienz zu beurteilen, wird das markierte Fragment sofort auf eine Acrylamidsäule gegeben und entweder mit Acetatpuffer oder Salzlösung eluiert. Das markierte Protein eluiert mit dem Leervolumen (ungefähr 5 ml) und es zeigt sich durch ITLC in Salzlösung, daß es zu 100% proteingebundenes Rhenium enthält. Die Konjugate können genauso gut durch einen schnellen Lauf durch eine Minisäule unter Benutzung eines Spritzenzylinders gereinigt werden, um wiederum 100% proteingebundenen Marker zu ergeben. Der Marker tritt durch Filter mit einer so geringen Porengröße wie 0,05 Micron, ohne Aggregation zu zeigen. In allen Säulenverfahren und Filtrationen wird im wesentlichen eine 100%-ige Rückgewinnung der Radioaktivität erreicht. Chromatografie auf HPLC und ITLC zeigt, daß die Radioaktivität mit der Proteinfraktion eluiert/wandert. Markierte Fragmente sind hochresistent gegenüber Reoxidation entweder in Acetatpuffer oder Salzlösung, wenn sie für bis zu 72 Stunden der Atmosphäre ausgesetzt werden. Daher kann ein Rhenium-markiertes Produkt innerhalb höchstens weniger Stunden bei minimaler Laborbearbeitung fertig zur Injektion sein.

BEISPIEL 8

F(ab')&sub2;-MCTP-SH-Herstellung

(a) Antikörper-MCTP-Konjugat

Mäuselebermetallothionein-1-Fragment (56 - 61), 6,2 mg (1 x 10&supmin;&sup5; Mol) (Sigma Chemical Company) wird in 495 µl Phosphatpuffer, pH 4,4, aufgelöst und mit 10 µl einer 191 mg/ml Lösung von 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid in Phosphatpuffer, pH 4,4, behandelt. Es wird sorgfältig darauf geachtet, einen abschließenden Reaktions-pH zwischen 4,0 und 4,5 sicherzustellen und die Reaktion wird bei 4 1/2 C durchgefuhrt. Die Reaktion dauert 15 Minuten an.
Eine Antikörperlösung von Anti-CEA IgG, konzentriert auf 10 - 15 mg/ml in von Sauerstoff befreitem Tris-Puffer (pH 8,7) wird auf 4 1/2 gekühlt und mit aktivierter MCTP fur 10 Minuten bei 4 1/2 behandelt. Die Reaktionsmischung wird dann sofort auf eine Acrylamidsäule gegeben und die IgG- Fraktion durch Elution mit von Sauerstoff befreitem Natriumacetat/Salzlösungspuffer 50/150 mM, pH 4,5, gesammelt. Analyse durch die Ellman- Reaktion zeigt etwa 5 - 6 SH-Gruppen pro Antikörper.

(b) Enzymatischer Verdau

Das Antikörper-MCTP-Konjugat wird unter Benutzung von Pepsin analog zu Beispiel 5 (b) fragmentiert. Der Verdauprozeß wird durch Größenausschluß HPLC verfolgt und wenn die Reaktionsmischung zu etwa 90% F(ab')&sub2; fragmentiert ist (in ungefähr 1 Stunde) wird sie auf Eis gelegt und sofort durch präparative Größenausschluß-HPLC unter Benutzung eines Acetatpuffers bei pH 4,5 gereinigt. Gereinigte F(ab')&sub2;-MCTP-Fraktionen werden gesammelt, vereinigt und eine geeignete Menge von Zinn(II)-ionenlösung zugegeben. Die entstehenden Lösungen werden gefroren gelagert, vorzugsweise in einem Flüssig-Stickstoff-Bad.

BEISPIEL 9

Radioaktive Markierung

Der F(ab')&sub2;-MCTP, hergestellt nach Beispiel 8, kann mit Tc-99m und Radioisotopen von Rhenium in der gleichen Weise und mit den gleichen Verfahren, wie in Beispiel 6 und 7 oben für F(ab')&sub2;-SH beschrieben, radioaktiv markiert werden mit einer geeigneten Anpassung an die Tatsache, daß das Fragment/Metallothioneinpaar grundsätzlich mehr freie Thiolgruppen pro Fragment-Molekül als der nach dem Verfahren von Beispiel 5 hergestellte, teilweise reduzierte, aufgeschlossene Antikörper, enthält.
Es ist zweckmäßig, die Ein-Gefäßpräparation nach Beispiel 8 (b), enthaltend sowohl den F(ab')&sub2;-MCTP und Sn(II) zu benutzen, die vorsichtig aufgetaut und auf Raumtemperatur erwärmt wurden. Zugabe von Pertechnetat in Salzlösung und Umsetzung für etwa 5 Minuten ergibt eine Lösung von im wesentlichen 100% markiertem F(ab')&sub2;, fertig zur in vivo Injektion. Addition von Perrhenat in Salzlösung und Umsetzung für 1 - 18 Stunden ergibt eine Lösung von 60 - 100% markiertem F(ab')&sub2;, bereit zur in vivo Injektion. Es wird angenommen, daß dies die einzige derzeit verfügbare, leichte und hocheffiziente Methode, zur Produktion Tc-markierter und Re-markierter Antikörper F(ab')&sub2;-Fragmente ist, die unkontaminiert von Tc-Fab' und Re- Fab' sind.
Die vorangegangenen Beispiele sind lediglich illustrativ, und zahlreiche Variationen und Modifikationen können vom Durchschnittsfachmann bewirkt werden, um die Methode, den Kit und dessen erfindungsgemäßen Gebrauch in bezug auf viele Anwendungen und Bedingungen anzupassen, ohne vom Umfang und vom Sinn der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur radioaktiven Markierung eines Proteins mit dem Tc-99m- Radioisotop von Technetium, umfassend die Schritte des Kontaktierens einer Lösung eines Proteins, das eine Vielzahl benachbarter Sulfhydrylgruppen enthält, mit Zinn(II)-ionen und dann mit Tc-99m-Radiopertechnetat in Abwesenheit eines Transchelators, wobei die Menge der Zinn(II)-ionen in leichtem Überschuß über der zum im wesentlichen vollständigen Reduktion des Radiopertechnetats erforderlichen Menge liegt, aber nicht ausreicht, um aus der Lösung auszufallen, und Isolierung des radioaktiv markierten Proteins.

2. Verfahren zur radioaktiven Markierung eines Proteins mit einem Radioisotop von Rhenium, umfassend die Schritte des Kontaktierens einer Lösung eines Proteins, das eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen enthält mit Zinn(II)-ionen und dann mit Radioperrhenat, wobei die Menge an Zinn(II)-ionen im Überschuß über der zur im wesentlichen vollständigen Reduktion des Radioperrhenats erforderlichen Menge liegt, und Isolierung des radioaktiv markierten Proteins.

3. Verfahren zur radioaktiven Markierung eines intakten Antikörpers oder eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments mit einem Radioisotop von Rhenium, umfassend die Schritte des Kontaktierens einer Lösung eines intakten Antikörpers oder eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments, enthaltend mindestens eine Disulfidgruppe mit Zinn(II)-ionen und dann mit Radioperrhenat, wobei die Menge der Zinn(II)-ionen im Überschuß über der zum im wesentlichen vollständigen Reduktion des Radioperrhenats erforderlichen Menge liegt, und Isolierung des radioaktiv markierten Proteins.

4. Verfahren zur Herstellung eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments, mit Tc- 99m oder einem Radioisotop von Rhenium radioaktiv markiert ist, umfassend die Schritte:

(a) teilweise Reduktion eines intakten Antikörpers mit einem Reduktionsmittel zur Spaltung von Disulfidgruppen in einer Menge, die ausreicht, eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen zu erzeugen, aber nicht genügt, um den Antikörper zu spalten oder ihn immunologisch zu inaktivieren und Isolierung des teilweise reduzierten Antikörpers;

(b) Spalten des teilweise reduzierten Antikörpers, um ein teilweise reduziertes F(ab')&sub2;-Fragment zu erzeugen; und

(c) Kontaktieren einer Lösung dieses teilweise reduzierten F(ab')&sub2;- Fragments mit Zinn(II)-ionen und dann mit Radiopertechnetat oder Radioperrhenat, wobei die Menge der Zinn(II)-ionen in leichtem Überschuß über der zur im wesentlichen vollständigen Reduktion des Radiopertechnetats erforderlichen Menge liegt, aber nicht ausreicht, um aus der Lösung auszufallen, und Isolierung des radioaktiv markierten F(ab')&sub2;-Fragments im wesentlichen frei von Fab'- Antikörperfragmenten und -aggregaten.

5. Verfahren zur Herstellung eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments, radioaktiv markiert mit Tc-99m oder einem Radioisotop von Rhenium, umfassend die Schritte:

(a) Konjugieren eines intakten Antikörpers mit einem Addenden, enthaltend eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen und Isolierung des resultierenden Antikörperkonjugats, enthaltend eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen;

(b) Spalten des Antikörperkonjugats, unter Bildung eines F(ab')&sub2;-Fragmentkonjugats das eine Vielzahl benachbarter freier Sulffiydrylgruppen enthält; und

(c) Kontaktieren einer Lösung von F(ab')&sub2;-Fragmentkonjugaten, enthaltend eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen, mit Zinn(II)-ionen und dann mit Radiopertechnetat oder Radioperrhenat, wobei die Menge an Zinn(II)-ionen im Überschuß über der zur im wesentlichen vollständigen Reduktion des Radiopertechnetats oder Radioperrhenats erforderlichen Menge liegt, aber nicht ausreicht, um aus der Lösung auszufallen, und Isolierung von radioaktiv markiertem F(ab')&sub2; im wesentlichen frei von Fab'-Antikörperfragmenten und -aggregaten.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein ein Antikörper oder Antikörperfragment ist und wobei die freien Sulfhydrylgruppen durch teilweise Reduktion von ganzem Immunglobulin oder einem F(ab')&sub2;-Fragment davon mit einem Thiolreagens hergestellt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein ein Antikörper oder Antikörperfragment ist und wobei die freien Sulfhydrylgruppen durch Thiolreduktion und Spaltung eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments zu einem Fab'-Fragment erzeugt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4, 5, 6 oder 7, wobei das Protein ein Antikörper oder Antikörperfragment und das Radioisotop Tc- 99m ist; und wobei die Konzentration an Antikörper oder Antikörperfragment in der Lösung 0,01- 10 mg/ml die Menge an Zinn(II)-ionen 0,1 - 50 µg/ml die Menge an Pertechnetat 2 - 50 mCi/mg an Antikörper oder Antikörperfragment und die Reaktionszeit 0,1 - 10 min. beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Protein ein Antikörper oder Antikörperfragment ist und das Radioisotop im wesentlichen trägersubstanzfreies Re-188 ist; und wobei die Konzentration an Antikörper oder Antikörperfragment in der Lösung 1 - 20 mg/ml, die Menge an Zinn(II)-ionen 100 - 10.000 µg/ml, die Menge an Perrhenat 10 - 500 mCi und die Reaktionszeit 1 min. - 4 h beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Protein ein Antikörper oder Antikörperfragment und das Radioisotop Re-186 mit zugegebener Trägersubstanz ist; und wobei die Konzentration an Antikörper oder Antikörperfragment in der Lösung 1 - 20 mg/ml, die Menge an Zinn(II)-ionen 1 - 1.000 mg/ml, die Menge an Perrhenat 10 - 500 mCi und die Reaktionszeit 1 min. - 4 h beträgt.

11. Kit zum radioaktiven Markieren eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem Tc-99m-Radioisotop von Technetium, umfassend, in einem geeigneten Behälter, 0,01 - 10 mg pro Einheitsdosis eines Antikörpers oder Antikörperfragments, das spezifisch ein Antigen bindet und eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen enthält; und 0,1 - 50 µg pro Einheitsdosis an Zinn(II)-ionen.

12. Kit zur radioaktiven Markierung eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem im wesentlichen trägersubstanzfreien Re-188-Radioisotop von Rhenium, umfassend, in einem geeigneten Behälter, 1 - 20 mg pro Dosiseinheit eines Antikörpers oder Antikörperfragments, das spezifisch ein Antigen bindet und eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen enthält; und 100 - 10.000 µg pro Einheitsdosis an Zinn(II)- ionen.

13. Kit zur radioaktiven Markierung eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem Re-186-Radioisotop von Rhenium mit zugegebener Trägersubstanz, umfassend in einem geeigneten Behälter, 1 - 20 mg pro Einheitsdosis eines Antikörpers oder Antikörperfragments, das spezifisch ein Antigen bindet und eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen enthält; und 1 - 1.000 mg pro Einheitsdosis an Zinn(II)-ionen.

14. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, zur radioaktiven Markierung eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments, wobei dieses F(ab')&sub2;-Antikörperfragment nach einem Verfahren hergestellt wird, das die Schritte umfaßt:

(a) Konjugieren eines intakten Antikörpers mit einem Addenden, enthaltend eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen und Isolierung des resultierenden Antikörperkonjugats, enthaltend eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen; und

(b) Spalten des Antikörperkonjugats, unter Erhalt eines F(ab')&sub2;-Fragmentpaars, enthaltend eine Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen.

15. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur radioaktiven Markierung eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments, wobei das F(ab')&sub2;-Antikörperfragment nach einem Verfahren hergestellt wird, das die Schritte umfaßt:

(a) teilweise Reduktion eines intakten Antikörpers mit einem Reduktionsmittel zur Spaltung von Disulfidgruppen in einer Menge, die zur Erzeugung einer Vielzahl benachbarter freier Sulfhydrylgruppen ausreicht, aber nicht ausreichend ist, um den Antikörper zu spalten oder ihn immunologisch zu inaktivieren, und Isolierung des teilweise reduzierten Antikörpers;

(b) Spalten des teilweise reduzierten Antikörpers, unter Bildung eines teilweise reduzierten F(ab')&sub2;-Fragments.