JPH05500800A

JPH05500800A - 蛋白質のテクネチウム／レニウム標識方法

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Publication number: JPH05500800A
Application number: JP2509837A
Authority: JP
Inventors: グリフィス、ギャリー、エル．
Original assignee: イミュノメヂックス・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-06-12
Filing date: 1990-06-11
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2013-06-25
Also published as: ES2098250T3; WO1990015626A1; CA1335268C; AU647028B2; DE69030025T2; US5128119A; ATE149515T1; EP0403225A3; FI915832A0; KR920700689A; AU5924990A; EP0403225A2; JP2769244B2; EP0403225B1; IL94690A0; KR0178961B1; IL94690A; DE69030025D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質のテクネチウム／レニウム標識づけ法発明の背景本発明は蛋白質の、特に抗体およびもしくは抗体フラグメントの、テクネチウムとレニウム放射性同位元素による直接標識づ（ジの、改善され最適化された方法に関連している。

アイソトープ（同位元素）テクネチウム−９９ｍは、即時に利用できること、低価格および好ましい放射化学特性により、核医学診断ではもっとも価値のある物質の一つである。モノクロナール抗体など高分子標識づけに関しては、薬剤として広く用いられており、種々の経路で蛋白質に結合する。初期の検討は主として、二価性キレート法を用いる。すなわち蛋白質と結合する別の官能基を含有するキレート爬剤を使用することである。たとえば、抗体と結合し、放射性金属イオンをキレート化するために、種々の形のジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を用いた。

重度の状態と長い゛すずめつき前″時間を要する“すずめっきパ実験計画案を用いて、蛋白質の直接標識づけは試みたが、１００％とりこみ状態での放射標識には達しなかった。さらに、長時間の二価スズイオンの極度の高量の存在は、抗体の免疫反応性を弱めた。その過程は、全般的に標識化づけ後の精製カラムを必要とした。　Ｆ　（ａｂ’）２抗体フラグメントによる他の方法のすずめつき前処置の反復の試みは、Ｔｃ−９９ｍ標識づけ達成では成功しなかった。

他の、さらに最近の直接標識づけ法は、別々のびん（ヴアイアル）１つは抗体用、１つはリン酸およびもしくはホスホン酸用の反対の位置にあるキレート化荊と複合する二価スズイオン用のびんを必要とする。

周期律表ではテクネチウムの下の元素であるレニウムは、同様の化学特性を持ち、類似したやり方でテクネチウムに反応することが予想される。レニウムには約３４のアイソトープがあり、そのうちの２つは特にレニウム−１８６（ｔｌ／２（半減期、９０時間、ガンマ１３７ｋｅＶ）ベータ１．０７，０．９３ＭｅＶ）とレニウム−１８８（半減期１７時間、ガンマ１５５ｋｅＶ、ベータ２゜１２ＭｅＶ）は、モノクロナール抗体法を用いる放射性免疫療法の主な候補物質である９両アイソトープはガンマカメラ画像を目的とする適切なエネルギーで、ガンマ放射する。非放射性レニウム１８５を過剰含有する担体付加形レニウム−１８６を産出する。中性子による濃縮レニウム１８５衝撃により、原子炉施設からレニウム−１８６は得られる。レニウム１８８は、タングステン−１８８／レニウム１８８発生器、　（○ａｋ　Ｒｉｄｇｅ国立実験所）より得られ、タングステン突破のほとんどみられない、実質上無担体の形で、発生器より溶出される。

このアイソトープからの高いΔ＝１．６３ｇ−ｒａｄ／μＣ１−ｈのエネルギー蓄積は、別の位置エネルギー治療の可能性をはらむイツトリウム−９０（Δ＝１゜９９ｇ−ｒａｄ／μＣ１−ｈ）に接近しており、同時にレニウムの化学特性はイツトリウム（しばしばストロンチウム−９０で汚染されている）よりも、少量で骨探索剤からの治療可能性をはらみ、より良好な腫瘍／Ｉｌｌ器生分器上分布！ｋｉｌＩ定が可能となる。

多くの検討グループは、テクネチウムと同じやり方で抗体を標識づけするために、レニウムを利用する可能性をほのめかしたが、成功した検討はほとんど発表されなかった。

低いレニウム取りこみは、抗体−キレート共役で通常みられ、一般的にレニウムがｐｅｒｒｈｅｎａｔｅに再酸化し、複合体から解離する傾向がある。さらに二価性キレート法使用は、長い列の中間体をもつ有機合成が１分離されて、抗体共役前に精製される必要がある。

発明者などによるテクネチウムもしくはレニウムで放射標識されたＦ（ａｂ）’ ２フラグメントおよび実質的にＦａｂ’の遊離したフラグメントを産生する数多くの試みは成功しなかった。このような共役は、フレアランス率、腫瘍局在定位生分布を、有利に組み合わせるのに望ましい。

テクネチウムおよびレニウムの放射性同位元素による蛋白質の放射性標識に関する単純で、効率よく、できればｌヴアイアル法への需要は存続しつづける。

発明の目的本発明の一つの目的は、高度に免疫反応する、テクネチウムもしくはレニウム放射性標識抗体、もしくは反対側へのキレート化もしくは再酸化による標識消失に安定するＦ（ａｂ’）２フラグメントを特に含む抗体フラグメントを即時に産生ずることである。

発明の別の目的は、副産物による汚染が最小である標識づけされた高収量の生産物を産生する蛋白質の直接放射性標識づけ法を準備することである。

発明の別の目的はテクネチウムもしくはレニウム放射性同位元素を抗体もしくは抗体フラグメントへの導入使用用に、簡便で効率的な放射性標識キットを準備することである。

発明明細書と書きそえる特許申請をさらに検討する時に、本発明の目的と利点が、この分野に熟練した人達にさらに明らかになるだろう。

発明の概要テクネチウムもしくはレニウムの放射性同位元素で、空間的に隣接している遊離スルフヒドリル基を複数に含有する蛋白質を放射性標識する方法を準備することにより、前述の目的は達成される。その方法の段階としては、空間的に隣接している遊離スルフヒドリル基を複数に含有する前述の蛋白質溶液を、二価スズイオン、次にｒａｄｉｏｐｅｒｔｅｃｈｎｅｔａｔｅもしくはｒａｄｉｏｐｅｒｒｈｅｎａｔｅと接しよくさせ、実質的に完全に前述のｒａｄｉｏｐｅｒｔｅｃｈｎｅｔａｔｅもしくはｒａｄｉｏｐｅｒｒｈｅｎａｔｅを還元させる量よりも、二価スズイオンの量はテクネチウムの場合はわずかに過剰であり、レニウムの場合は多いに過剰であるので、放射標識蛋白質を回収する。

本発明は、発明の標識づけ過程を果たす、特にＴｃ−９９ｍとレニウム放射性標識抗体と抗体フラグメントを産生するテクネチウムもしくはレニウム放射性標識づけキットと１発明により、抗体と放射性標識づけした抗体フラグメントを用いる放射性抗体画像と治療において改善された方法を準備する。

詳細な説明特に抗体及び抗体細片の蛋白質に、少なくとも一個のスルフヒドリル基を有し、好ましくは、自由空間に隣接する複数のスルフヒドリル基を有する蛋白質は、マイルド条件においてテクネチウム及びレニウム放射性金属イオンと選択的に結合し、前記スルフヒドリル基と強固な結合を形成し、血液、その他の体液、及び組織中において極めて安定して存在する事が知られている０本発明に於ける試薬及び条件双方とも、非常に簡易化されているが、該方法はテクネチウム及びレニウムのラベリングに特定化される。しかも、驚く事にしかも予期しない事に、各ラベリングの最適条件は、夫々異なる。

本方法は広く構成されており、自由スルフヒドリル基を有し、しかもｉ　（ＩＩ）イオンを含む蛋白質溶液を、Ｔｃ−９９ｍ−過テクネチウム酸塩、或いは過レニウム酸塩の溶液と、治療用レニウム放射性同位元素或いはイメージ装置を使用して接触させる段階より成り、これにより、テクネチウム或いはレニウムの放射性ラベリングされた蛋白質溶液が得られる。該手順は、核薬品担当医師及び技術者にとっては、簡単でしかも実務的である。実施例には、ガンマイメージング、及び放射性治療法に有効な放射性ラベリングされた抗体及び抗体細片を、本発明方法による製造方法の応用をも含めている。

本発明によるラベリング方法及びキットは、テクネチウム及びレニウム放射性同位体を必要な自由スルフヒドリル基を有する他の蛋白質にも応用出来る。自由スルフヒドリル基を有する蛋白質であれば、直接ラベリングが可能である。二硫酸塩を有するものは１通常シスチン残留物を介して結合しているものであるが、還元剤により処置する事により自由スルフヒドリル基を形成する事が可能である。

本処置により、もし前記二硫酸塩が非連続のポリペプチド鎖を連結しているものであれば、蛋白質を細片化し、或いは、該二硫酸塩が単一ポリペプチド鎖の遠隔断片を連結していれば、単に鎖分割に終り、蛋白質の構造変化を起こす可能性がある。スルフヒドリル基はポリペプチド鎖に導入されて、近接基を形成する。このためにトラウラ試薬（イミノチオレン）を使用する事は、好ましくないが、多数の隣接スルフヒドリル基を有するオリゴペプチド類を使用する事は、有効である。特に、金属チオネイン、或いは好ましくはその炭素終端のへキサペプチド断片（以下、ＭＣＴＰと言う、）を使用すると、好適に改良される。

公知の二硫酸塩結合の還元側、即ちヂチオスレイノール、システィン、メルカプタンエタノール等の同等還元剤を使用して、抗体、或いはＦ（ａｂ’）２細片を還元すると、浄化手順を含めて通常１時間未満の短時間の後に、実験値ｌ乃至ｌＯの自由スルフヒドリル基を有する抗体が得られる。第１錫イオンを還元剤として、テクネチウムを本発明の方法によりラベリングしたとき、蛋白質にＴｃ−９９ｍが１００％付着し、９５％の免疫反応性を示した。

無傷抗体を酵素によって分断したＦ（ａｂ’）、の部分還元を試みたが、しばしば分断が更に進行して相当量のＦａｂ″細片が形成された。後に過テクネチウム酸塩、或いは過レニウム酸塩を第１錫イオンで還元を行っても、二硫酸塩結合の還元を伴いＦａｂ’細片への分断が進行し、結果として、ラベルの一部を損失し単価細片に変化した。Ｆ　（ａｂ’）２抗体細片の改良製法として、即ち実質的にＦａｂ’細片にまで分断が進行しない方法として、驚異的な予想しなかった方法が発見された。即ち、還元された過テクネチウム酸塩、或いは過レニウム酸塩でラベリングした後、既に自由スルフヒドリル基を有するＦ（ａｂ’）、抗体細片へ分断することにより、結果として　ｐ（ａｂ’）２細片のラベリングが高効率のもと可能となり、しかも実質的にＦａｂ’細片への過剰分断をも避は得た。

　Ｆ　（ａｂ’）２−３Ｈは、前記方法で無傷抗体を部分還元して製造する事が出来る。或いは、酵素（例えばペプシン）により既知の条件で、好ましくは酸性条件で、また無酸素条件で分断しスルフヒドリル基含有の二価細片を形成した後、活性化したＭＣＴＰ或いは等価のポリチオール加危物と配合体を形成して自由スルフヒドリル基を無傷抗体に導入しても製造可能である。

１００％のＴｃ−９９ｍの取込みを達成するためには、５ｎ（ＩＩ）はより少量でなくてはならないと、考えられた。従来技術において、Ｔｃラベル化合物に使用する錫は、蛋白質１ｍｇ当り約１００〜２００μｇが使用されてきた。しかしながら、ＳＨ基の緊密な立体配置による強力な結合力と、ガンマイメージングに適当な放射量まで減量しなくてはならないので、通常ＴｃＯ４の量がｎｇオーダ（１０−’ｇ）以下に押えている為に、極く少量の５ｎ（ＩＩ）が有効に使用される。

還元作用は１通常水溶液中の第１錫イオンによって行われる。第１錫イオンは、舎兄反応を行うその時々に製造する。即ち箔状、粒状、粉状、リボン状の金属錫に、）（Ｃ１が如き酸水溶液を作用させ、好ましくは、０．１ｍＭのＨＣＩ水溶液として、通常５ｎＣ１２の形で加えられる。

通常、抗体、或いは抗体細片の濃度は、凡そ０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌで、好ましくは、約０．１〜５ｍｇ／ｍｌで、好ましくは、僅かに酸性であるｐＨが４゜０〜４．５である緩衝食塩水溶液で反応させる。かような場合、過テクネチウム酸塩のイメージの通常放射量にまで減量するに必要である第１錫イオンの量は、蛋白質の量に比例して、凡そ０．５〜２５μｇ／ｍｌが好ましい。

前記量の抗体、及び抗体細片をラベリングするには、過テクネチウム酸塩は、該抗体及び抗体細片１ｍｇ当り、通常的２〜５０ｍＣ１／ｍｇである。また、反応時間は、約０．１−１０分である。蛋白質及び第１錫の濃度が前記好適な濃度である場合は、過テクネチウム酸塩の必要量は、約５〜３０ｍＣ１／ｍｇであり、反応時間は、約１〜５分である。

過テクネチウム酸塩は、市販されており、一般的にはＮａＴｃ０４の水溶液として供給されている。過テクネチウム酸塩は、他の形であっても構わなく、他のメーカーが推薦するものを指示に従って適宜反応工程を変更しても構わず、当業者の良く知るところである。過テクネチウム酸塩は、活量が約０．２〜１０ｍＣ１／ｍｌの生理食塩水溶液、即ち０．９％食塩水溶液で使用され、ｐＨは緩衝されていて、約３〜７、好ましくは約３．５〜５，５．より好ましくは、約４，５〜５．０とする。緩衝剤には、酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、燐酸塩等が揚げられる。

還元反応は１通常不活性雰囲気、即ち、窒素、アルゴン等の、雰囲気中で行われる０反応温度は、通常室温、約１８〜２５℃で行われる。

これらの条件によると１本質的に定量的に蛋白質にラベリング方法能となり。

酸化に対して安定な、しかも食塩水中、血清中においてキレート化に強い生成物が得られる０例えば、いまやＩｇＧのラベリングは、予めチオール発生剤によって還元されたＩｇＧと、ＩｇＧ、１ｍｇ当り０．　５〜５μＧの第１錫によって、定量的に、繰返し不変的に行う事が出来る。３７℃の血清中に一晩放置後において、一般的に、少なくとも９５％のラベルが蛋白質に結合された状態で残る。

更に、該蛋白質の免疫活性も、前記血清培養によっても減する事なく、少なくとも２４時間後においても、前記抱合体は完全にイメージ剤として使用可能である。

前記組成において、燐化物、酒石酸塩、グルコヘプチル酸塩、その他既知のＳｎ　（ＩＩ）キレート剤、いずれの溶液中にも金属錫を入れなくてよい、第１塩化錫、第１酢酸塩にみられる５ｎ（ＩＩ）化合物は１本実験に使用して成功した。

その他。

容易に入手可能な通常の５ｎ（ＩＩ）塩にあっても、使用可能である。溶液中には。

３主要酸分しか含まれていない、即ち、還元された抗体、第１錫水溶液、及び過テクネチウム酸塩溶液である。以下の条件で、無傷抗体、及びＦａｂ／Ｆａｂ’ 細片とのＴｃ−９９ｍ１ＯＯ％抱合体を容易に得る事が出来る。　Ｆ　（ａｂ’ ）２の場合は、前記条件でＴｃ−９９ｍの１００％抱合体が得られるが、放射性ラベリングされたＦ（ａｂ’）２に加えて、放射性ラベリングされたＦａｂ’　も若干形成される。前記したＦ（ａｂ″）２改良製造方法によれば１本件は解決される。

前記生成物であるＴｃ−９９ｍ放射性ラベリングされた抗体、及び抗体細片は、シンチレーション・イメージングに好適に利用可能であり、対象として、腫瘍、病巣蛋白質、微細組織、凝血塊、心筋症不完全骨折、アテローム性動脈硬化斑、或いは正常器官・組織等が揚げられる。′前記方法により生成された放射性抗体溶液は、もし滅菌し、更に注射によって発熱する物質を除去した小瓶中で生成すればまただちに注射力呵能である。しかも、テクネチウム結合後、自由スルフヒドリル基をブロッキングする安定剤も不要である。

本発明による方法は、抗体、及び抗体細片のラベリングに最適であるが、アルブミン、蛋白質薬剤、ナトキン類、酵素類、ホルモン類、免疫調節剤、刺激受体蛋白質類等のラベリングも可能である。抗体には、−個若しくは複数の二層化物結合を有し、重鎮を連結し、また軽鎖とｍ鎖とを結合する二層化物結合もある。

後者の二層化物結合には５通常二硫化物還元剤が近接不能であるが、　ｉｉ鎖を連結する結合は１選択的に分断されるものである。前記生成細片は、免疫特異性を有し、抗原と結合する能力を有する。免疫′性グロブリンの！１ＨＪｌ［を連結する二層化物結合の還元を行うに当って、注意が必要である。それは、もし、還元条件が強烈であるか、還元剤が長時間に五って該細片と接触反応が続けられるなら、通常軽鎖と重鎮を連結している非活性二硫化物結合が結果として還元されるからである。

一旦還元されたならば、前記抗体−３日切半部は、十分無酸素状態で保管されれば、極めて安定である。低ｐＨで、特にｐ）（：６以下に保管すれば、安定性は増加する６液体窒素で前記抗体、及び抗体細片を急激に冷却すると、前記抗体等に含まれる複数の自由スルフヒドリル基は、長期間に五って劣化する事なく、また該スルフヒドリル基を減滅する事なく保管可能である事が分った。前記抗体− ３Ｈ５及び細片−３日種を窒素環境のもとで管内に封入する事は、低温における保護とともに、スルフヒドリル基が二硫化物に再酸化する事を防ぐためと思われる。

放射性ラベリングされる抗体、及び抗体細片は、腫瘍等によって生成されるか関係する抗原と、但しこの抗原にのみ限定しないが、結合する抗体であり得る。

前記抗原が生成されるか、関係する蛋白質は、腫瘍の他に病巣蛋白質、微細組織、凝血塊、心筋症不完全骨折、アテローム性動脈硬化斑、或いは正常器官・組織等が揚げられる。

用語「抗体、及び抗体細片」の意味するところは、一般的に免疫性グロブリンであり、特に抗原と結合し免疫複合体を形成する免疫性グロブリンを意味する。

この用語には、従来技術で言うＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及び同類を含み、無傷免疫性グロブリン類をペプシン分解によって得られる従来技術で言うＦ（ａｂ′）２細片が如き酵素分解物を含み、無傷免疫性グロブリン類をパパイン分解によって得られる従来技術で言うＦａｂ’細片を含み、Ｆ（ａｂ’）２細片及び無傷抗体夫々を二層化物結合分断によって得られる従来技術で言う単価Ｆａｂ ’及び軽・重鎖細片を含み、更に木質的に前記免疫性グロブリン類及び細片類に類似特性を有する生成物をも含むものである。前記用語「類似蛋白質」には、より大きい細片を更に分解或いは操作して得られる抗体サブ細片を含み、遺伝工学操作によって得られる抗体及び／或いは細片類を含み、更に、特に本質的に「古典的」な免疫性グロブリンと類似態様で結合する抗原認識分域を有する合成蛋白質を含む、前記蛋白質の木質的な要求事項は、部分還元、或いはポリチオール成分を導入する事で、還元された過テクネチウム酸塩、或いは還元された過レニウム酸塩放射性金属イオンのキレータ−として作用する、２個以上の近接したスルフヒドリル基を有する事である。

用語「還元された過テクネチウム酸塩」或いは「還元された過レニウム酸塩」の意味するところは、過テクネチウム酸塩、或いは過レニウム酸塩を第１ｉイオンによって還元し、チオール基によってキレート化合物を形成したテクネチウムイオン化合物、或いはレニウムイオン化合物を言う、一般的に、還元された過テクネチウム酸塩は、キレート化合物中ではＴｃ　（ＩＩＩ）　、及び／或いはＴｃ　（ＩＶ）及び／或いはＴｃ（Ｖ）の形で存在し、また還元されて過レニウム酸塩は、Ｒｅ（ＩＩＩ）及び／或いはＲｅ　（ＩＶ）及び／或いはＲｅ　（Ｖ）の形で存在していると考えられている。但し、高或いは低酸化状態及び／或いは多酸化状態は排除し得ず、これは本発明の範囲に含まれる。

レニウムは、周期律表ではテクネチウムの丁度真下に存在し、同様の外殻電子配位を有し、従って、化学的性質、特に類型化合物は全く同様に挙動すると推定される。事実、還元反応、キレート化反応に関する限り、定性的に全く同様に挙動する。しかし、化学反応速度は全然異なり、種々重要な点について相違する。

放射性同位体Ｒｅ−１８６は、医療用として魅力があり、イメージングにも利用可能である。その半減期は、約３．７日であり、高ＬＥＴベータ線放射能（１゜０７ＭｅＶ）、及び利用価値の高いガンマ放射能（０，１３７ＭｅＶ）を有する。

テクネチウムとの類推で、レニウムは過レニウム酸塩から出発し、還元されたレニウムイオンは蛋白質と無差別に結合する事ができた。従って、還元された過レニウム酸塩抗体のような蛋白質分子のスルフヒドリル基と結合させる、蛋白質のＲｅ−１８６ラベリング方法は、将来性がある。Ｒｅ−１８８は、核業者によって製造されたベータ線及びガンマ線放射能を有し、半減期約１７時間の人工放射性物質で、イメージング及び医療用に好適に利用される。レニウム１８８は核業者によって市販開発計画中であり、計画案によると、第１錫イオンとＩｇＧとが入っている小瓶に無キャリア型レニウム−１８８を直接投入し、レニウム放射性ラベリングをした蛋白質を生成し、直ちに２時間以内に使用する事になっている。

レニウム−１８８の半減期が１７時間であるので、製作工程を速く行う事が肝要である。　レニウムの場合の製造方法は、過テクネチウム酸塩を使用するときの方法を若干変更したものである。Ｔｃ−９９ｍのラベリング方法と対称的に、第１錫イオンの還元剤の危が少ないとき、また反応時間が短いときは、過レニウム酸塩は、還元された抗体をラベリングしない、しかしながら、第１錫、即ち酒石酸第】錫塩を多量に使用し、反応時間を長くすると、チオールによって還元された抗体はレニウムによって成功裏にラベリングする事ができる。

慎重に反応条件を整える事により、抗体に８０％以上にレニウムを反応時間数時間で導入する事ができる。この事は、レニウム−１８８の半減期が１７時間である事と、抗体に生理学的に放射能障害を与える可能性がある事の観点から、特に重要である。前記ラベリング方法は、現行の在ヨード−１３１による放射性ラベリング方法に比べて容易であり、イツトリウム−９０，及び銅−６７によって抗体に放射性ラベリングする現行方法に比べて、さらに単純である。ラベリング作業時間が短い事は、抗体の免疫活性を維持確保する。

反応条件は、過レニウム酸塩が無キャリア型（即ち、核業者によるＲｅ−１８８）か、キャリア付加型（即ち、核業者によるＲｅ−１８６）かによって、相違する。後者は、等画情性を得るために、多量の蛋白質は要求されないものの、多くの過レニウム酸塩が要求され、従って、第１錫イオンの還元剤が必要である。

この事は、従来技術では見られなかった考え方である。

一般的に、好ましくは抗体、或いは抗体細片である蛋白質で、しかも複数の近接するスルフヒドリル基を有する蛋白質は、レニウム放射性同位元素を医療用に使用する条件に応じた濃度で使用される。ラベリング可能な蛋白質の種類、及びテクネチウム・ラベリングで明らかになった抗体、及び抗体細片の輪郭は、レニウム・ラベリングにおいても、そのまま有効である。

核業者が供給する形態である。実質的に無キャリア型であるＲｅ−１８８−Ｎａ　Ｒｅ　Ｏ４は、抗体或いは細片と有利に反応する。該蛋白質の濃度は、約１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｍｇ／ｍｌで、この溶液は木質的には過テクネチウム酸塩のときの溶液、及び条件と同一である。使用した第１錫イオンの濃度は、一般的には約１００〜１０，０００μｇ／ｍｌで、好ましくは約５００〜５，０００μｇ／ｍｌで、蛋白質の量と比例させる事が好ましい、前記蛋白質、及び第１＃Ｉイオン濃度にあって、実質的に無キャリア型であるＲｅ−１８８−過レニウム酸塩の放射能は、約１０〜５００ｍＣｉ、好ましくは約５０〜２５０ｍＣ１であり、また蛋白質の濃度と比例させる事が好ましい０反応時間は、１分から４時間で、好ましくは、１５分から２時間である。驚いたことに期待に反して、薬剤の比率、及び反応時間は、過テクネチウム酸塩でラベリングするときの最適条件が過レニウム酸塩の場合と相違する事である。そして、逆の場合も。

相違する。

キャリア付加型のＲｅ−１８６−ＮａＲｅＯ４は、通常核反応炉によって製造される形態であり、一般的に１００乃至１，０００倍のＲａ−１８５をキャリアとして含有している。このキャリア付加型Ｒｅ−１８６−ＮａＲｅ０．によるラベリングは、スルフヒドリル基を有する蛋白質、即ち抗体、或いは細片と反応させて行う、該蛋白質の濃度は、約１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｍｌで、実質的にはＲｅ−１８８−過レニウム酸塩の溶液と同一であり、反応条件も実質的に同一である。しかしながら、キャリアの量が多い為、使用した第１錫イオンの量は、一般的には約１〜１，０００ｍｇ／ｍｌで、好ましくは約５〜５００ｍｇ／ｍｌで、また蛋白質の量に比例させる事が好ましい、レニウム放射性同位体の活量、及び反応時間ともに略同−に行った。

未反応のレニウムを除去するには短カラム装置を通す事で十分であり、もし、滅菌、発熱物質を含まない小瓶を使って反応させたなら、終了後、直接注射に使用可能である。レニウム・ラベリング後、自由スルフヒドリル基をブロックする為の安定剤は、必要でない。

驚異的な、またかって期待されていなかった展開によって、ここに少なくとも１個の二硫化基を有する無傷の抗体（予め還元を行っていない）である蛋白質を、比較的多量の第１錫イオンを使用する事により抗体とレニウム化合物とを還元と結合を同時に行う事により、簡単に、また直接レニウムによって放射性ラベリングが可能となった。かって広く伝承されていた「錫化前処理」、及びこれまでのテクネチウム−■ｇＧラベリング手法は、結果は好ましくなかった。長時間及び／或いは激しい反応では、本発明による■ｇＧ−レニウム注射液の好結果を得られない。

一般に、非還元たんばく質、例えば抗体の濃度、反応時間、過レニウム酸塩活性およびその他の条件は、より多量の第一すずイオンが用いられること以外は、スルフヒドリル含有たんばく質のＲｅ−１８６またはＲｅ−１８８ラベリングに関して、実質的に同じであろう、ラジオ過レニウム酸塩におけるラジオアイソトープが実質的にキャリヤフリーＲｅ−１８８である場合、溶液中の抗体または抗体断片の濃度は、有利には約１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第一すずイオンの危は、約５００−１０，０００μｇ／ｍｌ、好ましくは約５００〜５，０００μｇ／ｍｌである。ラジオ過レニウム酸塩におけるラジオアイソトープが、キャリヤ添加されたＲｅ−１８６である場合、抗体または抗体断片の同じ濃度において、第一すずイオンの量は、約５〜１，０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０〜５００ｍｇ／ｍ　Ｉである。

事実、非変性、非還元１ｇＧが用いられ、これは第一すず還元剤と共にガラス瓶に入れられ、室温で、わずか４５分後に、過レニウム酸塩でうまくラベルされた。ブレティニングは用いられず、抗体とすずとが混合されてから、過レニウム酸塩が直接添加される。秘訣は、急速な還元を実施するのに十分なすずを用いることである。典型的なよう素−１３１ラベル精製よりも操作がやり易い、短い分離カラムによって、すぐ注入できる純粋なレニウム−１ｇＧ共役が生じる。

用いられる条件へのＩｇＧのＩｋ′１１は、結合抗原の親和カラムに対して測定されたその免疫反応性を損なわない、第一すずイオンによるたんばく質ジスルフィド基のその場での還元が、過レニウム酸塩還元を伴ない、たんばく質−金属錯体の形成のために必要な条件を生じるようである。過テクネチウム酸塩は、同じ条件下において、ＩｇＧをラベルするのにはるかに不利であるという事実は、このことが最少限の操作で、レニウムラベルされた抗体を得るための、特に新規かつ効率的な方法であることを示唆している。

レニウムラベリングは、テクネチウムラベリングと実質的に同じ方法で実施される。この場合、系内に空気または酸素の不存在を保証するために、特別な配慮がなされる０本発明によって調製された、レニウムラベルされたたんばく質は、他の研究者によって見られたような、過レニウム酸塩への即座の再酸化の徴候を示さない、このことは、この方法が容易であるだけでなく、安定的でもあることを示している。このことと組み合わされて、次のような事実もある。すなわちこの方法には、はるかにわずかなＩｇＧ操作しか必要とされないこと、Ｒｅ−１８８が、便利なジェネレータフォーマットで用いられること（６０日間またはそれ以上の間、毎日使用できる単一のジェネレータを用いる）、およびストロンチウム汚染についての問題が起きず、レニウムラジオラベルされた１ｇＧを、魅力のある治療薬にすることなどである。

これらの方法によって生じたレニウム抗体共役は、溶液状で、大気に少なくとも５日間まで暴露された時でさえ、非常に安定であることが証明された。この長期的安定性は、ラベリング手順の間の免疫反応性の保持のように、免疫ラジオ治療において重要である。このことも証明されている。

このアプローチは、レニウム共役の安定性と同様、単純さ、有効性、効率性。

およびこの方法における主な操作がないことによって先行技術のアフ宅−チとはまったく異なるということが認識されなければならない、比較的多量のすず、および長い反応時間は、効率的な過テクネチウム酸塩ラベリングのためにはならないが、過レニウム酸塩には最適であり、一方、少しのすず、過テクネチウム酸塩には最適な、急速なラベリング条件は、過レニウム酸塩にはうまくいかないことを再び強調する。特に約１ｍｇの抗体およびＴｃ−９９ｍの映像化活性について、非常に少しのすずと５分の反応時間は、優れた結果を生じるが、一方Ｒｅ−１８６またはＲｅ−１８８ラベルの治療レベルについては、特に無傷の抗体が用いられるならば５００μｇ／ｍ１以上の第一すずイオンが望ましく、１時間に近い程度の反応時間が効果的である。

たんばく質、例えばＦａｂ’　、ＳＨまたはＦ（ａｂ’＞２断片、あるいは無傷の抗体を、ジェネレータ生産過テクネチウム酸塩を用いて、Ｔｃ−９９ｍでラジオラベリングする時に使用するためのキットは、抗体、あるいは抗体断片１単位用量あたり約０．０１〜１０ｍｇを含むであろう、この　抗体または抗体断片は、腫瘍、感染性障害、微生物、寄生体、心筋梗塞、血塊、アテローム斑、または正常な器官または組織と関連する抗原を特に結合し、かつ複数の隣接する遊離スルフヒドリル基、および第一すずイオン１単位用量あたり約０．１〜５０μｇを含む、このキットの成分は、使用の直前に、抗体または抗体断片１ｍｇあたり、Ｔｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩約２〜５０ｍＣ１と結合される。抗体／断片− ８１（およびＳｎ　（Ｉｔ）還元剤は、有利には、貯蔵できるガラス瓶中の１ｌｉ−溶液中で、例えば液体窒素洛中で結合されるか、あるいは好ましくは、過テクネチウム酸塩の添加に先立って、この技術においてよく知られているような、添加砂糖と共に凍結乾燥される。

レニウムのＲｅ−１８８ラジオアイソトープでの、抗体または抗体断片をラジオラベリングするためのキットは、典型的には、抗体または抗体断片１単位用量あたり約１〜２０ｍｇ含むであろう０例えば腫瘍または感染性障害と関連する抗原を特に結合し、かつ複数の隣接する遊離スルフヒドリル基、および第一すずイオン１単位用量あたり約１００〜１０，０００μｇを含み、使用の直前に、抗体または抗体断片１ｍｇあたり、実質的にキャリヤフリーＲｅ−１８８過レニウム酸塩約１０〜５００ｍＣ１と結合されるような抗体または抗体断片である。有利には、このキットの成分は、単一のガラス瓶中に入っており、ラベリングに使用されるまで、前記のように貯蔵されるか、あるいは凍結乾燥されるであろう。

レニウムのＲｅ−１８６ラジオアイソトープでの、抗体または抗体断片のラジオラベリングするためのキットは、典型的には、抗体または抗体断片１単位用量あたり約１〜２０ｍｇ含むであろう８例えば腫瘍または感染性障害と関連する抗原を特に結合し、かつ複数の隣接する遊離スルフヒドリル基、および第一すずイオン１単位用量あたり約１〜１，０００ｍｇを含み、使用の直前に、抗体または抗体断片１ｍｇあたり、キャリヤ添加されたＲｅ−１８６過レニウム酸塩約１０〜５００ｍＣ１と結合されるような抗体または抗体断片である。前記のような、単一のガラス瓶貯蔵および使用が好ましい。

両方のレニウムアイソトープでの無傷の非還元抗体をラベリングするためのキットは、前記のものと同様であろうが、ただし過レニウム酸塩を還元するのと同様、抗体におけるジスルフィド結合のいくつかを還元するために一般に用いられる、比較的多量な第一すずイオンの場合は除く。

このようなキット中のたんばく質は、有利には滅菌容器で冷凍されるか、あるいは凍結乾燥され、不活性ガス雰囲気下で、有利には冷却され、液体窒素浴中に貯蔵され、使用の直前に徐々に解凍される。これらのキットには、緩衝液、塩水の滅菌ガラス瓶、注射器、フィルター、カラム、および臨床医または専門家がすぐに使用できる、注入可能な製剤の調製を容易にするための同様な補助装置が追加されても都合がよい。

ラジオアイソトープが供給されるか、あるいは利用可能にされつる形態のバリエーションの機能としてと同様、患者あるいは治療法に個別に必要なものの機能として、通常の当業者には、これらのキットの変形例および修正例が容易に明らかになろう。

本発明の方法に従って調製された。ラジオラベルされたたんばく質、特に抗体および抗体断片は、非侵襲性のシンチグラフ映像方法において、また腫瘍および障害のラジオ抗体治療に適しており、実際特に都合がよく、また効き目があろうということも、通常の業者には明らかであろう、特に、腫瘍、感染性障害、心筋梗塞、血塊、アテローム環、あるいは正常な器官または組織を映像化する方法であって、前記腫瘍、感染性障害、心筋梗塞、血塊、アテローム環、あるいは正常な器官または組織によって生じたか、あるいはこれらと関連した抗原であって。

外部検出が可能である。製薬的に不活性なラジオアイソトープでラジオラベルされた抗原と特に結合する抗体または抗体断片が、非経口的に人間の患者に注入され、そしてラジオラベルされた抗体または抗体断片が局部限定し、かつ非標的バックグラウンドがきれいになるのに十分な時間がたった後、ラジオラベルされた抗体または抗体断片の１つまたは複数の離合部位が、外部映像化カメラによって検出されるような方法においては、本発明の方法によって作られた、Ｔｃ−９９ｍラベルされた抗体または抗体断片を、ラジオラベルされた抗体または抗体断片として用いることは、１つの改良であろう。

さらに、ｉ瘍または感染性障害を患っている患者のラジオ抗体治療方法であって、腫瘍または感染性障害によって生じたか、あるいはこれらと関連した抗原であって、治療効果のあるラジオアイソトープでラジオラベルされた抗原と特に結合する抗体および抗体断片が、非経口的に、このような腫瘍または感染性障害を患う人間の患者に注入されるような方法においては、予備還元された２あるいは非還元の抗体から、本発明の方法によって作られた、レニウムラジオラベルされた抗体または抗体断片を、ラジオラベルされた抗体または抗体断片として用いることは、１つの改良であろう。

これは以上くふうを行なわずに、当業者は、前記の記載を用いて、本発明を十分に利用できると考えられる９従って、下記の好ましい特別な実施態様は、この開示物の残りの部分を単に例証するだけであって、これを限定するものではまったくないと考えられるべきである。

下記の実施例において、すべての温度は、セラ氏で訂正されずに示されている。

実施例１抗体還元定型的操作で、精製されたモノクローナル抗−ＣＥＡ　Ｉ　ｇＧ　（胎児性癌抗原と特異的に結合した抗体、結腸直腸ガンに関与したマーカー）の５ｍｇをリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌ中に溶解し、ｐＨ６，２〜６．６に調節した溶液を２−メルカプトエタノール中で３０〜５０ミリモルに調製する。試料（サンプル）を室温で３０〜４０分放置した後、緩衝液として還元化酢酸を用いたアクリルアミドカラムで精製する。還元化１ｇＧ溶解液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（セントリコン）で１〜２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、エルマン反応によりＩｇＧ当たりのＳＨ基を分析する。それを便宜上４℃滅菌濾過して保持するか、あるいはＳＨ基の安定性を高めるために凍結保存する。

実施例２Ｔｃ−９９ｍ放射標識化定型的操作でＳｎ　（ＩＩ）１２５ナノグラムを含有する溶液を、実施例１に従って調製し、フリーのメルカプト基をもつモノクローナル抗−ＣＥＡ３．６Ｘ１０−１０モルを含有する溶液と混合する。その結果エルマン反応によるＩｇＧ当たりのＳＨ基は１．２存在し、Ｓｎ　（ＩＩ）のＩｇＧに対する比は２．９：１である。

生理食塩水中の過テクネチウム塩としてテクネチウム９９ｍ　２ｍＣ１を添加し、その後室温で３分間インキュベーションした。その結果、ＨＰＬｆ：により測定されたようにタンパク質とテクネチウムは１００％の結合率を示す、そして２つの異なる遊類用ｌＥ、衝液中でのＩＴＬＣにより残存している過テクネチウム塩は１％以下であることを示す、免疫活性率はＣＥＡカラムで測定した際、〉９８％である。標識化された抗体溶液は、直接、１ｎｖｉｖｏ（生体内）注入が可能であ実施例３Ｒｅ−１８６放射標識化定型的操作で、Ｓｎ　（ＩＩ）、８８０マイクログラムを含む溶液をモノクローナル抗−ＣＥＡ完全抗体１ｍｇを含む溶液と混合する。生理食塩水中の過レニウム塩として９００万ｃｐｍの活性をもつレニウム−１８６を１８．９ＸＩＯ−” モルを添加した後、室温で１時間インキュベーションした結果、タンパク質とレニウムは７５％結合率を示す、標識化された抗体は空気による酸化に対して安定でありそしてその免疫放射活性はＣＥＡカラムで測定した際高い値を示す、この溶液は直接に生体内注入が可能である。

実施例４Ｒｅ−１８８放射標識化定型的操作で、抗−ＣＥＡ　Ｆａｂ’　−８Ｈ（システィン、メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトールとＦ（ａｂ’）２の還元により生成されたＳＨ）の１ｍｇを１００ｍＭ酒石酸１ｍｌプラス５０＋ＩＩＭ酢酸緩衝液それにＳｎ（ｍ約１２３マイクログラムを含む５ｎ（ＩＩ）種と共にして、アルゴンの大気中に１く。

過１ノニウム塩溶液２０〜２０００マイクロリットルを濃度に依存し゛〔、レニウム濃度が約ｌＸｌ０−’モルに達するまで相当量を添加する。混合撹拌後１反応させ　６０から１００％のレニウム結合率を肥めるまで１から６時間反応させる。

標識化抗体フラグメントの溶液１．ｉ百接生体内注入が可能である。

標識化効率を確認するために、標識化されたタンパク質の試料を直ちにアクリルアミドカラムにかけそして酢酸緩衝液かあるいは生理食塩水のどちらかで溶出する。標識化タンパク質は空容１（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）　（約５ｍ１）と共に溶出し、更に生理食塩水中でのＩＴＬＣによりタンパク質結合化レニウムの割合は１００％であることを確認する。それらの共役複合体は注射器状円筒（シリンジバレル）を用いたミニ−カラムによる速やかな操作により同じ位高い精製度で精製され、再び１００％のタンパク質結合化標識体を与える。

標識化されたフラグメントを孔のサイズが０．０５ミクロン程度小さいフィルターを通過させて凝集のないことを示す、全てのカラム操作及び濾過操作において、本質的に放射活性は１００％の回収率で得られる。ＨＰＬＣ及びＩＴＬＣによるクロマトグラフィもタンパク質分画と共に溶出／移動する放射活性を示す。

実施例５Ｆ　（ａ、ｂ’）　２　Ｓｔｉ生成（ａ）完全抗体の部分的還元トリス緩衝液（０，ＩＭ、ｐ）４８．７）中の完全抗−リンパ腫１ｇＧ　２Ａ抗体溶液ＩＯと２０ｍｇ／ｍｌの間の濃度溶液を■、−システィン中で２５ミリモルに調製する。それを４℃でＩＯ分分間−た後、サイズ−排除（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィにより５０ｍＭ酢酸ｐＨ４，５により精製し、それを１０ｍｇ／μｌに濃縮された結合タンパク質分画とする。エルマン反応による分析はＩｇ０１モル当たりＳＨ基約３．５を示す０反応は、他のチオール還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）　、メタロチオネインＣ−末端へキサペプチド（ＭＣＴＰ＞及びその類似体により実施する。

（１））酵素消化上記、パート（ａ）に従がい生成された部分的還元化抗−リンバ肌抗体試料の消化は、少量のクエン酸溶液（ＩＭ＞でｐＨ４，０に調節した後、３７℃で３〜４時間、ペプシンでＩｇＧを処理（ｆｆｉ終濃度が２００μｇ／ｍｌに相当）することにより実施する１反応過程は１次にサイズ−排除１−ＩＰＬｃ操作を実施して、完全１ｇＧが全て消失した時点で４℃に冷却及びｐ）（を６．５に上昇させることにより反応を止める、そして直ちに、分離調製用ＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ２５０　デュポン社）にかけ、８から１５分間の保持時間の間に各１５秒毎に分画を集める。９．５分付近で溶出してきた分画を分析し、そして、もし再濃縮の前に同一性が確認されたらその分画を合する。このように生成されたＦ（ａｂ’＞２−ＳＨが、−価Ｆａｂ’の証明なくしてＨＰＬＣの１つのピークであることが確認される。それを放射標識化の前に液体窒素パス中に保存する。

実施例６テクネチウムー９９ｍ標識定型的操作で、実施例５に従って生成された部分的還元化抗−リンバＩＰＩＰ（ａｂ’）２−３Ｈの１ｍｇを１Ｏ−１００ｄ酒石酸１ｍｌプラス５０ｍＭ酢酸緩衝液それに５ｎ（ＩＩ）約１２０マイクログラムを含む５ｎ（ＩＩ）種と共にしてアルゴンの大気中に置く、過テクネチウム塩溶液２０〜２０００マイクロリットルを濃度に依存して、テクネチウム濃度が約ｌＸｌ０−９モルに達するまで相当量を添加する。わずか約５分後、テクネチウム標識体の約１００％が実質的にＦ（ａｂ’）２フラグメントに結合し、それ以上のＦａｂ’　へのフラグメンテーション（分裂）は実質的に伴なわない。

標識化フラグメントの孔のサイズが０．０５ミクロン程度小さいフィルターを通過させて、凝集のないことを示す、全てのカラム操作及び濾過操作において、本賀的に放射活性は１００％回収率で得られる。ＨＰＬＣとＩＴＬＣによるクロマトグラフィもタンパク質分画と共に溶出／移動する放射活性を示す、標識化フラグメントは７２時間に達するまでの大気中でのＩｋＨの際、酢酸緩衝液かあるいは生理食塩水のどちらかによる再酸化に強く抵抗する。従って、テクネチウム放射標識化生成体は、最小実験室処理で２〜３分以内に注入に対する準備が可能である。

実施例７レニウム−１８８標識定型的操作で、実施例５に従って生成された部分的還元化抗−リンパＰａＦ（ａｂ’）２−３Ｈの１ｍｇを１０−１００ｍＭ酒石酸１ｍｌプラス５０ｍＭ酢酸緩衝液と５ｎ（ＩＩ）約１２０マイクログラムを含む５ｎ（ＩＩ）種と共にしてアルゴンの大気中に置く、過レニウム塩溶液２０〜２０００マイクロリツトルを濃度に依存して、レニウム濃度が約１×１０１モルに達するまで相当量を添加する。混合撹拌後、標識体を１から１８時間、放置後［ＴＬＣによりレニウム結合率は６０がら９５％であることを認める。結果として得た溶液は患者への注入用して使用可能である。

放射標識化効率を評価するために、標識化フラグメント・は、直ちにアクリルアミドカラムにかけ、酢酸緩衝液かあるいは生理食塩水のどちらかで溶出する。標識化タンパク質は空容量（約５ｍ１）と共に溶出しそして、生理食塩水中でのＩＴＬＣにより、タンパク質結合化レニウムの割合が１００％であることを認める。

それらの共役複合体は注射器状円筒を用いたミ二カラムによる速やかな操作により、同じ位高い精製度で精製され、再び１００％のタンパク質結合化標識体を与える。

４１８体は孔のサイズが０．０５ミクロン程度小さいフィルターを通過させて。

凝集のないことを示す、全てのカラム操作及び濾過操作において、本寅的に放射活性は１００％の回収率で得られる。ＨＰＬＣ及びＩＴＬＣによるクロマトグラフィもタンパク質分画と共に溶出／移動する放射活性を示す、標識化フラグメントは７２時間に達するまで大気中に暴露した際、酢酸緩衝液あるいは生理食塩水のどちらかによる再酸化に強く抵抗する。従って、レニウム放射標識化生成体は最小実験室処理で、多くて２〜３時間以内に注入に対する準備が可能である。

実施例８Ｆ　（ａｂ’）　２−ＭＣＴＰ−３Ｈ生成（ａ）抗体−ＭＣＴＰ共役複合体マウス肝メタロチオネインー１−フラグメント（５６〜６１）６．２ｍｇ　（ＩＸＩＯ−５モル）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）をリン酸緩衝液、ｐＨ４，４の４９５μｌ中に溶解し、リン酸緩衝液中の１−エチル− ３（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミドの１９１ｍｇ／ｍｌ溶液ｌＯμ１．ｐＨ４，４で処理する。注意点は、最終反応はｐＨ４，０と４．５の間で確実に行なうことでありそして反応は４℃で実施することである０反応は１５分間、続行する。

脱酸素化トリス緩衝液、ｐＨ８，７中にＩＯ〜１５ｍｇ／ｍｌに濃縮された抗− ＣＥＡ　ｒｇＧの抗体溶液を４℃に冷却した後、４℃で１０分間、活性化ＭＣＴＰで処理する。それから直ちに反応混合液をアクリルアミドカラムにかけそしてＩｇＧ分画を脱酸素化酢酸ナトリウム／生理食塩水緩衝液５０／１５０ｍＭｒ＋Ｈ４，５で溶出して集める。エルマン反応による分析は１抗体につき約５〜６のＳＨ基を示す。

（ｂ）酵素消化抗体−ＭＣＴＰ共役複合体を実施例５（ｂ）に類似した方法で、ペプシンを用いて分解する。消化過程はサイズ排除ＨＰ　Ｌ　Ｃでモニターし、そして反応溶液が約９０％Ｆ　（ａｂ）’、に分解された時（約１時間）、それを氷上に置き、直ちに酢酸緩衝液、ｐＨ４，５を用いた準備調製用サイズ排除ＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製する。

精製されたＦ　（ａｂ）’２−ＭＣＴＰ分画を集め、合し、そして適当量の第一スズイオンを添加する。結果得られた溶液は、液体窒素バス中に凍結保存するのが望ましい。

実施例９放射標識化実施例に従って生成されたＦ　（ａｂ’）２−ＭＣＴＰは、実施例６及び７でＦ（ａｂ’）２−３Ｈに対して上記で述べたように、Ｔｃ−９９ｍ及び同じ種類のレニウムの放射能同位体を用い、更に同じ操作法により、放射標識化することが可能である。これは、フラグメント／メタロチオネイン共役複合体が一般的に、実施例５の操作に従って生成された部分的還元化、消化抗体よりも多いフリーのチオール基をフラグメント分子毎に含んでいるという事実に対する適切な調整を伴う。

実施例８に従った単一バイアルの分ｍ調製品、これはＦ　（ａｂ’）２−ＭＣＴＰと５ｎ（ＩＩ）を含んでいるがこれを徐々に解凍して室温まで暖めて使えることは便利である。生理食塩水中の過テクネチウム塩の添加及び約５分間の反応は生体内注入の準備の整った、実質的に１００％の標識化Ｆ　（ａｂ’）２溶液を生成調製する。生理食塩水中の過剰レニウム塩の添加及び１〜１８時間の反応は生体内注入の準備の整った６０〜１００％の標識化Ｆ（ａｂ’）２溶液を生成する。

これは、Ｔｃ−標識化及びＲｅ−標識化抗体Ｆ（ａｂ″）２フラグメント生成の際に使われ、Ｔｃ−Ｆａｂ’及びＲｅ−Ｆａｂ’　による汚染もない現在有効である、唯一の簡単かつ高効率の方法である、と信じられている。

前述の実施例は単に実例にすぎずそして多数の変化及び修正が、この発明の領域及び精神からはずれることなく様々な取り扱い及び条件でこの発明に従がいそのことから方法、キット（一式）及び使用法を適用するために技術上の通常の熟練技術の１つにより実施されることが可能である。

この新案発明の広範な領域は、追加される主張、そしてそのことにより同等の、周縁部によって定義される。

手続補正書　＞Ｌｌ− 平成４年１月砺ら日蛋白質のテクネチウム／レニウム標識づけ法３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称（氏名）　イミュノメヂックス・インコーホレーテッド４、代理人　〒１０４　電話０３−３５５２−２５４４住所　東京都中央区八丁堀四丁目１０番１号６、補正の対象（１）明細書の翻訳文（２）請求の範囲の翻訳文７、補正の対象（１）明細書の翻訳文別紙の通り、浄書を提出する国際調査報告１１１１１ｍ１１４ｔ＋組＾１１１１１１＋１＊ｆｉ〜、、ＰＣτ／υ５９０１０３１４２ＰＣＴ／ＵＳ９０１０３１４２Ｉｎ　ＣｌａｉＩＴｌｇ　３８．４６　ａｎｄ　４７　ｄｒａｗｎｃｌａｓａ　４２４．　＃ｕｂｃＬＡｓｓ　９；　′。ｍｅｔｈｏｄａ　ｏｆ　ｉｍａｇｉｎｇ　Ｑ　ｖｉｖｏ　ｃｌａａｓｉｆｉｅｄ　ｉ■

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含む蛋白質の溶液を第１錫イオンと接触させてから、さらにトランスケレータの存在下でＴｃ−９９ｍ−ラジオパーテクネテートと接触させ、このとき第１錫イオンの量は該ラジオパーテクネチートを実質的に完全に還元するのに必要な量よりも僅かに過剰であるが該溶液から沈澱するほどには十分ではないものとし、次に放射能標識付けした蛋白質を回収する段階を含む蛋白質をテクネチウムのＴｃ−９９ｍラジオアイソトープで放射能標識付けする方法。
【請求項２】該蛋白質が、抗体または抗体フラグメントである請求項１の方法。
【請求項３】該蛋白質が、アルブミン、薬剤、サイトカイン、酵素、ホルモン、免疫モジュレータまたは受容体蛋白質である請求項１の方法。
【請求項４】該遊離スルフヒドリル基が、チオール試薬による全免疫グロブリンまたはそのＦａ（ａｂ′）２フラグメントの部分還元によりつくられる請求項２の方法。
【請求項５】該遊離スルフヒドリル基が、チオール還元およびＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントのＦａｂ′フラグメントヘの開裂によりつくられる請求項２の方法。
【請求項６】該抗体または抗体フラグメントが特異的に腫瘍マーカーを拘束する請求項２の方法。
【請求項７】該抗体または抗体フラグメントが、感染病巣、微生物、寄生虫心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織と関連する抗原を特異的に拘束する請求項２の方法。
【請求項８】該溶液中の抗体またはフラグメントの濃度が、約０．０ｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約０．１〜５０μｇ／ｍｇである請求項２の方法。
【請求項９】該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約０．１〜５ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約０．５〜２５μｇ／ｍｌである請求項２の方法。
【請求項１０】パーテクネートの量が、約２〜５０ｍＣｉ／抗体または抗体フラグメント１ｍｇであり、反応時間が、約０．１〜１０分である請求項８の方法。
【請求項１１】パーテクネートの量が、約５〜３０ｍＣｉ／抗体または抗体フラグメント１ｍｇであり、反応時間が、約１〜５分である請求項８の方法
【請求項１２】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含む蛋白質の溶液を第１錫イオンと接触させてから、さらにラジオパーレネートと接触させ、このとき第１錫イオンの量は該ラジオパーレネートを実質的に完全に還元するのに必要な量よりも過剰であるものとし、次に放射能標識付けした蛋白質を回収する段階を含む蛋白質をレニウムのラジオアイソトープで蛋白質を放射能標識付けする方法。
【請求項１３】該蛋白質が、抗体または抗体フラグメントである請求項１２の方法。
【請求項１４】該蛋白質が、アルブミン、薬剤、サイトカイン、酵素、ホルモン、免疫モジユレータまたは受容体蛋白質である請求項１２の方法。
【請求項１５】該遊離スルフヒドリル基が、チオール試薬による全免疫グロブリンまたはそのＦａ（ａｂ′）２フラグメントの部分還元によりつくられる請求項１３の方法。
【請求項１６】該遊離スルフヒドリル基が、チオール還元およびＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントのＦａｂ′フラグメントヘの開裂によりつくられる請求項１３の方法。
【請求項１７】該抗体または抗体フラグメントが特異的に腫瘍マーカーを拘束する請求項１３の方法。
【請求項１８】該抗体または抗体フラグメントが、感染病巣、微生物、寄生虫、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織と関連する抗原を特異的に拘束する請求項１３の方法。
【請求項１９】ラジオパーレネート中のラジオアイソトープが、実質的にキャリアーを有さないＲｅ−１８８であり、該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約１００〜１０，０００μｇ／ｍｌである請求項１３の方法。
【請求項２０】該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１０〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約５００〜５，０００μｇ／ｍｌである請求項１９の方法。
【請求項２１】パーレネートの量が、約１０〜５００ｍＣｉであり、反応時間が、約１分〜４時間である請求項１９の方法。
【請求項２２】パーレネートの量が、約５０〜２５０ｍＣｉであり、反応時間が、約１５分〜２時間である請求項２１の方法。
【請求項２３】ラジオパーレネート中のラジオアイソトープが、キャリアー添加Ｒｅ−１８６であり、該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約１〜１，０００ｍｇ／ｍｌである請求項１３の方法。
【請求項２４】該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１０〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約５〜５００ｍｇ／ｍｌである請求項２３の方法。
【請求項２５】パーレネートの量が、約１０〜５００ｍＣｉであり、反応時間が、約１分〜４時間である請求項２３の方法。
【請求項２６】パーレネートの量が、約５０〜２５０ｍＣｉであり、反応時間が、約１５分〜２時間である請求項２５の方法。
【請求項２７】少なくとも１個のシスルフィルド基を含む無傷の抗体またはＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントの溶液を第１錫と接触させてからさらにラジオパーレネートと接触させ、このとき第１錫イオンの量は該ラジオバーレネートに実質的に完全に還元するのに必要な量よりも過剰であるものとし、次に放射能標識付けした蛋白質を回収する段階を含む無傷の抗体またはＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントをレニウムのラジオアイソトープで放射能標識付けする方法。
【請求項２８】該抗体または抗体フラグメントが特異的に腫瘍マーカーを拘束する請求項２７の方法。
【請求項２９】該抗体または抗体フラグメントが、感染病巣と関連する抗原を特異的に拘束する請求項２７の方法。
【請求項３０】ラジオパーレネート中のラジオアイソトープが、実質的にキャリアーを有さないＲｅ−１８８であり、該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約５００〜１０，０００μｇ／ｍｌである請求項２７の方法。
【請求項３１】該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１０〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約５００〜５，０００μｇ／ｍｌである請求項３０の方法。
【請求項３２】パーレネートの量が、約１０〜５００ｍＣｉであり、反応時間が、約１分〜４時間である請求項２９の方法。
【請求項３３】パーレネートの量が、約５０〜２５０ｍＣｉであり、反応時間が、約１５分〜２時間である請求項３２の方法。
【請求項３４】ラジオパーレネート中のラジオアイソトープが、キャリアー添加Ｒｅ−１８６であり、該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１〜２０ｍｇ／ｍｌであり、第１錫イオンの量が、約５−１，０００ｍｇ／ｍｌである請求項２７の方法。
【請求項３５】該溶液中の抗体または抗体フラグメントの濃度が、約１０〜２０ｍｇ／ｍ１であり、第１錫イオンの量が、約５０〜５００ｍｇ／ｍｌである請求項３４の方法。
【請求項３６】パーレネートの量が、約１０〜５００ｍＣｉであり、反応時間が、約１分〜４時間である請求項３４の方法。
【請求項３７】パーレネートの量が、約５０〜２５０ｍＣｉであり、反応時間が、約１５〜２時間である請求項３６の方法。
【請求項３８】腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織を画像診断する方法であり、該腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織によりつくられていてまたは該腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織と関連していて外部的に検出できる薬学的に不活性なラジオアイソトープで放射能標識付けされた抗原に特異的に固定する抗体または抗体フラグメントを人間の患者に非経口的に注入し、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが局在化し非標的バックグランドが透明になる十分な時間の後、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントの増大部位を外部的な画像診断カメラにより検出する画像診断方法において、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが、請求項２の方法に従ってつくられたＴｃ−９９−ｍ標識付けをした抗体または抗体フラグメントである画像診断方法。
【請求項３９】腫瘍または感染病変を病んでいる患者の放射線抗体治療の方法であり、腫瘍または感染病巣によりつくられていてまたは腫瘍または感染病巣と関連していて、治療学的に有効なラジオアイソトープで放射能標識付けされた抗原に特異的に固定する抗体または抗体フラグメントが、該腫瘍または感染病変を病んでいる人間の恵者に非経口的に注入される放射線抗体治療の方法において、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが、請求項１３の方法に従ってつくられたレニウムで放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントである放射能抗体治療の方法。
【請求項４０】腫瘍または感染病変を病んでいる恵者の放射線抗体治療の方法であり、腫瘍または感染病巣によりつくられていてまたは腫瘍または感染病巣と関連していて、治療学的に有効なラジオアイソトープで放射能標識付けされた抗原に特異的に固定する抗体または抗体フラグメントが、該腫瘍または感染病変を病んでいる人間の患者に非経口的に注入される放射線抗体治療の方法において、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが、請求項２７の方法にしたがってつくられたレニウムで放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントである放射能抗体治療の方法。
【請求項４１】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含む抗体または抗体フラグメントを単位用量当たり約０．０１〜１０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約０．１〜５０μｇを適当な容器に含んでなるテクネチウムのＴｃ−９９ｍラジオアイソトープにより抗体または抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキット。
【請求項４２】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含む抗体または抗体フラグメントを単位用量当たり約１〜２０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約１００〜１０，０００μｇを適当な容器に含んでなるレニウムの実質的にキャリアーを有さないＲｅ−１８８ラジオアイソトープにより抗体または抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキット。
【請求項４３】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含む抗体または抗体フラグメントを単位用量当たり約１〜２０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約１〜１，０００ｍｇを適当な容器に含んでなるレニウムのキャリアー添加Ｒｅ−１８６ラジオアイソトープにより抗体または抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキット。
【請求項４４】Ｔｃ−９９ｍまたはレニウムのラジオアイソトープにより放射能標識付けされたＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントをつくる方法において、（ａ）無傷の抗体を、複数の近位遊離スルフヒドリル基を生じさせるのには十分であるが該抗体を免疫学的に不活性とするかまたは開裂させるのには不十分な量のジスルフィド基開裂用還元剤により部分還元し、部分還元された抗体を回収する段階；（ｂ）該部分還元された抗体を開裂させて部分還元されたＦ（ａｂ′）２フラグメントを生じさせる段階；および（ｃ）該部分還元されたＦ（ａｂ′）２フラグメントの溶液を第１錫イオンと接触させてから、ラジオパーテクネテートまたはラジオパーレネートと接触させ、このとき第１錫イオンの量は該ラジオパーテクネテートを実質的に完全に還元するのに必要とされる量よりも過剰であるが該溶液から沈澱する程十分ではないものとし、次に、Ｆａｂ′抗体フラグメントを実質的に含まない放射能標識付けされたＦ（ａｂ′）２を回収する段階、を含んでいる方法。
【請求項４５】Ｔｃ−９９ｍまたはレニウムのラジオアイソトープにより放射能標識付けされたＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントをつくる方法において、（ａ）複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むアデンドにより無傷の抗体を抱合し、得られる複数の近位遊離スルフヒドリル基を含む抗体抱合体を回収する段階；（ｂ）該抗体抱合体を開裂させて複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２フラグメント抱合体を生じさせる段階；および（ｄ）複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２フラグメント抱合体を第１錫イオンと接触させてから、ラジオパーテクネテートまたはラジオパーレネートと接触させ、このとき第１錫イオンの量は該ラジオパーテクネテートまたはラジオパーレネートを実質的に完全に還元するのに必要とされる重よりも過剰であるが該溶液から沈殿する程十分ではないものとし、次にＦａｂ′抗体フラグメントを実質的に含まない放射能標識付けされたＦ（ａｂ′）２を回収する段階、を含んでいる方法。
【請求項４６】腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織を画像診断する方法であり、該腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性血脈硬化プラークまたは正常な器官または組織によりつくられていてまたは該腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織と関連していて外部的に検出できる薬学的に不活性なラジオアイソトープで放射能標識付けされた抗原に特異的に固定する抗体または抗体フラグメントを人間の患者に非経口的に注入し、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが局在化した非標的バックグランドが透明になる十分な時間の後、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントの増大部位を外部的な画像診断カメラにより検出する画像診断方法において、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが、請求項４４の方法に従ってつくられたＴｃ−９９−ｍ標識付けをしたＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントである画像診断方法。
【請求項４７】腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織を画像診断する方法であり、該腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織によりつくられていてまたは該腫瘍、感染病巣、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化プラークまたは正常な器官または組織と関連していて外部的に検出できる薬学的に不活性なラジオアイソトープで放射能標識付けされた抗原に特異的に固定する抗体または抗体フラグメントを人間の恵者に非経口的に注入し、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが局在化し非標的バックグラウンドが透明になる十分な時間の後、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントの増大部位を外部的な画像診断カメラにより検出する画像診断方法において、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが、請求項４５の方法に従ってつくられたＴｃ−９９−ｍ標識付けをしたＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントである画像診断方法。
【請求項４８】腫瘍または感染病変を病んでいる患者の放射線抗体治療の方法であり、腫瘍または感染病巣によりつくられていてまたは腫瘍または感染病巣と関連していて、治療学的に有効なラジオアイソトープで放射能標識付けされた抗原に特異的に固定する抗体または抗体フラグメントが、該腫瘍または感染病変を病んでいる人間の患者に非経口的に注入される放射線抗体治療の方法において、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが、請求項４４の方法にしたがってつくられたレニウムで放射能標識付けされたＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントである放射能抗体治療の方法。
【請求項４９】腫瘍または感染病変を病んでいる患者の放射線抗体治療の方法であり、腫瘍または感染病巣によりつくられていてまたは腫瘍または感染病巣と関連していて、治療学的に有効なラジオアイソトープで放射能標識付けされた抗原に特異的に固定する抗体または抗体フラグメントが、該腫瘍または感染病変を病んでいる人間の患者に非経口的に注入される放射線抗体治療の方法において、該放射能標識付けされた抗体または抗体フラグメントが、請求項４５の方法にしたがってつくられたレニウムで放射能標識付けされたＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントである放射能抗体治療の方法。
【請求項５０】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを単位用量当たり約０．０１〜１０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約０．１〜５０μｇを適当な容器に含んでなるテクネチウムのＴｃ−９９ｍラジオアイソトープによりＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキットにおいて、該Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントが、（ａ）複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むアデンドにより無傷の抗体を抱合し、得られる複数の近位遊離スルフヒドリル基を含む抗体抱合体を回収する段階；および（ｂ）該抗体抱合体を開裂させて複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２フラグメント抱合体を生じさせる段階、を含む方法によりつくられるキット、
【請求項５１】複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを単位用量当たり約１〜２０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約１００〜１０，０００μｇを適当な容器に含んでなるレニウムの実質的にキャリアーを有さないＲｅ−１８８ラジオアイソトープによりＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキットにおいて、該Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントが、（ａ）複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むアデンドにより無傷の抗体を抱合し、得られる複数の近位遊離スルフヒドリル基を含む抗体抱合体を回収する段階；および（ｂ）該抗体抱合体を開裂させて複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２フラグメント抱合体を生じさせる段階、を含む方法によりつくられるキット。
【請求項５２】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを単位用量当たり約１〜２０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約１〜１，０００ｍｇを適当な容器に含んでなるレニウムのキャリアー添加Ｒｅ −１８６ラジオアイソトープにより抗体または抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキットにおいて、該Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントが、（ａ）複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むアデンドにより無傷の抗体を抱合し、得られる複数の近位遊離スルフヒドリル基を含む抗体抱合体を回収する段階；および（ｂ）該抗体抱合体を開裂させて複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２フラグメント抱合体を生じさせる段階、を含む方法によりつくられるキット。
【請求項５３】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを単位用量当たり約０．０１〜１０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約０．１〜５０μｇを適当な容器に含んでなるテクネチウムのＴｃ−９９ｍラジオアイソトープによりＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキットにおいて、該Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントが、（ａ）無傷の抗体を、複数の近位遊離スルフヒドリル基を生じさせるのには十分であるが該抗体を免疫学的に不活性とするかまたは開裂させるのには不十分な量のジスルフィド基開裂用還元剤により部分還元し、部分還元された抗体を回収する段階；および（ｂ）該部分還元された抗体を開裂させて部分還元されたＦ（ａｂ′）２フラグメントを生じさせる段階、を含む方法によりつくられるキット。
【請求項５４】複数の近位遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを単位用量当たり約１〜２０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約１００〜１０，０００μｇを適当な容器に含んでなるレニウムの実質的にキャリアーを有さないＲｅ−１８８ラジオアイソトープによりＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキットにおいて、該Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントが、（ａ）無傷の抗体を、複数の近位遊離スルフヒドリル基を生じさせるのには十分であるが該抗体を免疫学的に不活性するかまたは開裂させるのには不十分な量のジスルフィド基開裂用還元剤により部分還元し、部分還元された抗体を回収する段階；および（ｂ）該部分還元された抗体を開裂させて部分還元されたＦ（ａｂ′）２フラグメントを生じさせる段階、を含む方法によりつくられるキット。
【請求項５５】複数の隣接遊離スルフヒドリル基を含むＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントを単位用量当たり約１〜２０ｍｇおよび第１錫イオンを単位用量当たり約１〜１，０００ｍｇを適当な容器に含んでなるレニウムのキャリアー添加Ｒｅ −１８６ラジオアイソトープにより抗体または抗体フラグメントを放射能標識付けするためのキットにおいて、該Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントが、（ａ）無傷の抗体を、複数の近位遊難スルフヒドリル基を生じさせるのには十分であるが該抗体を免疫学的に不活性するかまたは開裂させるのには不十分な量のジスルフィド基開裂用還元剤により部分還元し、部分還元された抗体を回収する段階；および（ｂ）該部分還元された抗体を開裂させて部分還元されたＦ（ａｂ′）２フラグメントを生じさせる段階、を含む方法によりつくられるキット。