KR0178961B1 - 단백질의 테크네튬/레늄 라벨링 방법 - Google Patents

단백질의 테크네튬/레늄 라벨링 방법 Download PDF

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러셀 씨. 매클로치랜
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Abstract

공간적으로 인접한 복수개의 유리 술프히드릴기를 갖는 단백질 용액, 또는 특별한 경우 한개 이상의 디술피드기를 함유하는 무손산 단백질을 방사성 과테크네튬산염 또는 방사성 과레늄산염을 완전히 감소시키기에 충분한 양의 주석 이온과 접촉시킨 다음 방사성 과테크네튬산염 또는 방사성 과레늄산염과 접촉시키고, 또 방사성 라벨링된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 레늄 및 테크네튬 방사성 동위 원소로 단백질을 방사성 라벨링 시키는 방법. 상기 방법으로 제조된 방사성 라벨링된 단백질을 영상화하는 방법 및 방사성 라벨링된 단백질을 이용하는 방사성 요법과 항체 및 항체 단편을 방사성 라벨링 시키기 위한 키트가 기재되어 있다.

Description

[발명의 명칭]
단백질의 테크네튬/레늄 라벨링 방법
[발명의 배경]
본 발명은 단백질, 특히 항체 및/또는 항체 단편을 테크네튬 및 레늄의 방사성 동위원소로 직접 라벨링시키는 개선된 방법에 관한 것이다.
동위원소 테크네튬-99m은 구입하기 쉽고, 저가이며 방사화학 특성이 양호하기 때문에 진단학 의약 중에서 가장 귀하다. 그것은 모노클로날 항체와 같은 거대분자를 라벨링시키기 위한 시약(agent)으로서 널리 사용되며 여러 방법으로 단백질에 결합될 수 있다. 초기에는 주로 2관능 킬레이트법, 즉 단백질에 연결시키기 위한 또다른 관능기를 갖는 킬레이트제를 사용하였다. 예를들면 항체에 결합시킬 뿐만 아니라 여러 가지 형태의 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA)가 사용되었다.
소위 프리틴닝(pretinning) 프로토콜(protocol)을 사용하여 단백질을 직접 라벨링시키는 수법이 시도되었으나, 그 조건이 엄격하며 프리틴닝 시간이 오래 걸리고 방사성 라벨링이 100% 달성되지 못하였다. 더욱이, 장기간 동안 다량의 주석 이온이 존재하면 항체의 면역성을 완화시킨다. 또한, 이 방법은 라벨링 후 정제 칼럼을 일반적으로 필요로 한다. F(ab')2항체 단편으로 다른 것들을 반복해서 프린팅닝을 반복하려는 시도는 Tc-99m 라벨링을 달성하는데 만족스럽지 못하였다.
최근의 또다른 직접 라벨링 방법은 별도의 바이얼, 즉 항체용 바이얼과 포스페이트 및/또는 포스포네이트와 같은 트랜스킬레이트제에 착화합된 주석 이온용 바이얼을 필요로 하였다.
주기율표에서 테크네튬 이하의 원소인 레늄은 유사한 화학적 성질을 가지며 테크네튬과 유사한 방법으로 반응할 것으로 예상된다. 레늄은 34개의 동위원소가 있고, 그들중 2개 특히 레늄-186(t 1/2, 90h; 감마 137 KeV, 베타 1.07, 0.93 Mev)과 레늄-188(t 1/2, 17h; 감마 155KeV, 베타 2.12MeV)이 모노클로날 항체 수법을 이용한 방사선 면역 치료에 주로 사용된다. 두 동위원소들은 또한 감마 카메라 영상 목적에 적합한 에너지로 감마선을 방출한다. 레늄-186은 비방사성 레늄-185의 과량을 함유하는 담체-부가된 형태로 레늄-186은 제공하는 중성자로 농축 레늄-186을 때림으로써 반응 장치로부터 얻어진다. 레늄-188은 텅스텐-188/레늄 188 발생기(Oak Ridge National Laboratory)로부터 얻어지고 텅스텐이 거의 누출(breakthrough)된채 사실상 담체가 없는 형태로 발생기로부터 용리될 수 있다. 또한 높이 △=1.63 g-rad/μ Ci-h에서 이 동위 원소로 부터의 에너지 축적은 또다른 잠재적 치효 활성을 갖는 이트륨-90(△=1.99 g-rad/μ Ci-h)에 가깝고 동시에 레늄의 화학적 성질로 인해 이트륨(종종 스트론튬-90으로 오염되어 있음)보다 덜 뼈탐색제(bone-sereking agent)로 만들 수 있고 더 좋은 종약/장기의 생체내 분포와 선량(dosimetry)을 일으킬 수 있다.
테크네튬과 동일한 형태로 항체를 라벨링시키기 위해서 레늄을 이용할 수 있는가에 대해서 많은 연구기관들이 연구하였으나 성공적인 연구는 거의 공표되지 않았다. 항체-킬레이트 콘쥬게이트로서 레늄 혼입량이 적은 것이 통상 알려져 있고, 레늄을 과레늄산엽으로 재산화시킨 후 착화합으로부터 분해시키는 경향이 일반적으로 있다. 게다가, 2관능 킬레이트 수법을 이용하는 경우에는 항체 콘쥬게이션 전에 분리 및 정제해야 할 일련의 수많은 중가체와의 유기 합성을 필요로 한다.
테크네튬이나 레늄으로 방사성 라벨링되고 Fab' 단편이 거의 없는 F(ab')2단편을 생성하기 위한 본 발명자와 다른 사람들의 시도는 성공하지 못하였다. 그러한 콘쥬게이트는 클리어런스율(clearancee rate), 생체내 분포와 종양 정위(localisation)의 정도를 유리하게 조합하는데 바람직하다.
테크네튬과 레늄의 방사성 동위원소로 단백질을 방사선 라벨링시키기에 간단하고, 효과적이며 바람직한 1-바이어법이 계속 필요하게 되었다.
[발명의 목적]
본 발명의 한 목적은 트랜스킬레이트와 또는 재산화에 의한 라벨의손실에 안정한 고면역 반응성 테크네튬 또는 레늄 방사선 라벨링된 항체 또는 항체 단편, 특히 F(ab')2단편을 쉽게 생성하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 부생물에 의한 오염을 최소화하면서 라벨링된 생성물의 수율이 높게 단백질을 직접 방사선 라벨링시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 테크네튬 또는 레늄 방사성 동위원소를 항체 또는 항체 단편에 도입하는데 사용하기 위한 편리하고도 효과적인 방사선 라벨링 키트를 제공하는데 있다.
명세서와 청구범위를 더 연구하면, 본 기술 분야의 숙련자들이라면 본 발명의 또다른 목적 및 장점들을 쉽게 알 수 있을 것이다.
[발명의 개요]
상기 목적들은 공간적으로 인접한 복수개의 유리 술프히드릴기를 단백질을 테크네튬 또는 레늄의 방사성 동위원소로 방사선 라벨링시키기 위한 방법을 제공함으로써 달성되는데, 이 방법은 공간적으로 인접한 유리 술포히드릴기의 복수개를 갖는 상기 단백질 용액을 주석 이온과 접촉시킨 다음, 방사성 과테크네튬산염 또는 방사성 과레늄산염과 접촉시킨후 방사선 라벨링된 단백질을 회수하는 단계를 포함하고, 주석이온의 양은 테크네튬의 경우에는 약간 과량이며 레늄의 경우에는 상기 방사성 과테크네튬산염 또는 방사선 과레늄산염을 거의 완전히 환원시키는데 필요한 양보다 훨씬 과량이다. 양호한 구체예에서는 감마 영상화 및 방사선 동위 원소 치료에 유용한 방사선 라벨링된 항체 또는 항체 단편을 생성하는데 본 발명의 방법을 이용하는 것을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 라벨링 방법을 실시하기 위한 키트, 특히 Tc-99m 및 레늄 방사선 라벨링된 항체 및 항체 단편을 생성하기 위한 테크네튬 또는 레늄 방사선 라벨링 키트와 본 발명에 따라 방사선 라벨링된 항체 및 항체 단편을 사용하여 방사성 항체 영상화의 개선된 방법을 제공하는데 있다.
[발명의 상세한 설명]
단백질, 특히 적어도 하나의 술프히드릴기, 바람직하기로는 공간적으로 인접한 유리 술프히드릴기를 갖는 항체 또는 항체 단편은 온화한 조건하에서 테크네튬과 안정한 술프히드릴기에 견고한 결합을 형성할 수 있다는 사실이 발견되었다. 본 방법에서 시약과 조건 모두는 매우 단순하지만 방법은 테크네튬 또는 레늄 라벨링에 특히 적합하고, 각 라벨을 도입하는데 적합한 조건들은 서로 다르다는 사실을 우연히 알아냈다.
본 방법은 포괄적으로 유리 술프히드릴기를 함유하는 단백질과 Sn(II) 이온을 함유하는 용액을 Tc-99m-과테크네튬산염 또는 과레늄산염 이온과 접촉시켜(치료 또는 영상화 시설의 레늄의 방사성 동위원소 사용), 네트네튬 또는 레늄 방사선 라벨링된 단백질 용액이 얻어지는 단계를 포함한다. 본 발명은 핵의학 의사와 기술자에게 간편하고 실용적이다.
본 발명의 라벨링 방법과 키트는 없어서는 안될 유리 술포히드릴기를 갖는 다른 단백질에 테크네튬 및 레늄의 방사성 동위원소를 결합시는데 사용될 수 있다. 유리 술포히드릴기를 함유하는 단백질은 직접 라벨링될 수 있다. 일반적으로 시스틴 전기를 통해 결합된 디술피드기를 함유하는 것들은 유리술프히드릴기를 발생시키기 위해 환원제로 처리될수 있다. 이는 디술피드 결합이 불연속 폴리펩티드 사슬을 연결한 경우 단백질의 단편화를 가져올 수 있거나, 또는 디술피드 결합이 단일 폴리펩티드 사슬의 먼단편과 연결될 경우 구조(conformation) 변화를 포함하여 사슬 분리를 가져올 수 있다. 술프히드릴기는 폴리펩티드 사슬에 도입되어 인접기를 제공할 수 있다. 이러한 목적을 위해서 트라우트 시약(Traut's Reagent)(이미노티올란)을 사용하는 것은 바람직하지 못하다. 왜냐하면 수개의 인접 술프히드릴기를 함유하는 올리고펩티드를 사용하는 것은 효능이 있기 때문이다.
특히, 메탈로티온인 또는, 바람직하기로는 그의 C-말단 헥사펩티드 단편(이하 MCTP라고함)을 사용하면 큰 개선점을 얻는다.
항체 또는 F(ab')2단편을 공지의 디술피드기 환원제, 예를들면 디티오트레이톨, 시스테인, 메르캅토 에탄올 등으로 환원시키면 단시간내에, 보통 1시간내에 분석 결과 정체를 포함하여 1 내지 10의 유리 술프히드릴 기를 갖는 항체를 형성한다. 이러한 조건하에서 주석 이온과 같은 환원제를 사용하여 테크네튬으로 라벨링시킬 때 95% 이상의 면역 반응성을 보유함과 동시에 Tc-99m이 단백질에 100% 혼입된다.
무상(intact) 항체의 효소적 분해로부터 얻어진 F(ab')2를 부분적으로 산화시키는 경우 상당량이 다시 Fab'로 분해된다는 사실과 이어서 F(ab')2의 존재하에 과테크네튬산염 또는 과레늄산염을 주석 이온으로 환원시키면 디술피드 결합 환원 및 Fab'로의 분해를 가져와 약간의 라벨이 1가 단편으로 되는 사실이 발견되었다. Fab' 분해 생성물이 거의 없이 F(ab')2를 매우 효과적으로 라벨링시킬 수 있다는 사실이 우연히 발견되었다.
F(ab')2-SH는 상기한 바와같은 무상 항체의 부분 환원에 의해 또는 유리 술프히드릴기의 무상 항체로의 도입에 의해, 이를테면, 활성화 MCTP 또는 등가 폴리티올 가수(addend)와 콘쥬게이션, 그 다음 종래의 조건(바람직하기로는 산성)과 산소 부재하에 펩신 등으로 바람직하기로는 효소적 분해에 의해 술프히드릴-함유 2가 단편을 형성함으로써 생성될 수 있다.
100% Tc-99m 혼입을 위해서는 종래보다 훨씬 적은 Sn(II)가 필요하다.
대부분의 종래 수법에서 화합물을 Tc로 라벨링시키기 위해 사용될 주석의 총량은 단백질 mg당 약 100 내지 200㎍이다. 그러나 감마 영상화에 적합한 활성을 얻기위해서 통상 환원되어야 하는 TcO4의 10-9g이하의 양과 입체적으로 가까운 SH기의 강력한 결합력 때문에, 훨씬 적은양의 Sn(II)이 효과적으로 사용될 수 있다. 환원은 일반적으로 수용액중에서 주석 이온에 의해 이루어진다. 주석 이온은 수성산, 이를테면 HCl과의 접촉에 의해 주석금속 자체, 이를테면 박막, 과립, 분말, 부스러기 등으로부터 형성될 수 있으며 통상 SnCl2형태, 바람직하기로는 HCl중 약 0.1mM 용액 형태로 첨가된다는 사실을 알 수 있을 것이다.
일반적으로, 바람직하기로는 pH dir 4.0~4.5의 약산성으로 완충된 식염수로서 약 0.01 내지 10mg/ml, 바람직하기로는 약 0.1 내지 5mg/ml의 항체 또는 항체 단편 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 과테크네튬산염의 일반 영상화 활성을 감소시키는데 필요한 주석 이온의 양은 단백질 양에 대해 약 0.1 내지 50㎍/ml, 바람직하기로는 약 0.5 내지 2.5㎍/ml 이다.
상기 양의 항체 또는 항체 단편을 라벨링시킬 때, 과테크네늄산염의 양은 일반적으로 항체 또는 항체 단편 약 2 내지 50mCi/mg이고, 반응시간은 약 0.1 내지 10분이다. 상기한 단백질과 주석 이온의 바람직한 농도에서 과테크네튬산염의 양은 약 5 내지 30mCi/mg이 바람직하고 반응시간은 약 1 내지 5분이 바람직하다.
퍼테크네테이트는 보통 식염수 용액중에서 대부분의 경우 NaTc O4형태로 시중에서 구입할 수 있는 발생기로부터 일반적으로 얻어진다. 본 기술 분야의 숙련자라면 쉽게 알수 있는 바와 같이 또는 새로운 형태의 발생기의 공급자가 또는 알 수 있는 바와같이 그 방법을 적절히 변형함으로써 과테크네튬산염의 다른 형태로 사용될 수 있다. 과태크네튬산염은 식염수, 이를테면, pH 약 3 내지 7, 바람직하기로는 3.5 내지 5.5, 더욱 바람직하기로는 약 4.5 내지 5.0에서 완충된 0.9%(물리적 농도) 식염수 중에서 0.2 내지 10mCi/ml의 활성으로 사용될 수 있다. 적당한 완충제로는 아세테이트, 타르타레이트, 시트레이트, 포스페이트 등이 있다.
환원은 보통 불활성 가스, 예를 들면 질소, 아르곤 등의 불위기 하에서 이루어진다. 반응 온도는 약 실온, 예를들면 18 내지 25℃로 유지된다.
이들 조건은 산화에 대한 안정성이 높고 식염수 및 혈청에서의 트랜스 킬레이트화에대해 내성이 있는 형태로 라벨을 단백질에 거의 정량적으로 혼입하게 된다. 예를들면, 반드시 정량적인 수율로 IgG mg당 Sn(II) 0.5 내지 5㎍에 대해 티올-발생 시약으로 미리 환원된 IgG를 견고하게 라벨할 수 있다. 일반적으로, 37℃의 혈청 중에서 철야 방치시킨후 적어도 약 95%의 라벨이 단백질에 결합되어 있다. 더욱이 이 단백질의 면역 반응성은 이 혈철 배양후 거의 감소되지 않는데, 이는 콘쥬게이트가 적어도 24시간까지 완전 살아 있는 영상화제 이라는 것을 나타낸다.
이들 농도에서, 포스포네이트, 타르타제이트, 글루코텝토네이트 또는 기타 공지된 Sn(II)킬레이트제와 같은 트랜스킬레이트제는 주석을 용액중에 유지하는데 필요하지 않다. 염화제일주석 및 아세트산 주석과 같은 Sn(II) 화합물들은 이들 실험에서 성공적으로 사용되었다. 기타 쉽게 이용할 수 있는 종래의 Sn(II)염과 또한 사용할 수 있다. 오로지 3가지 필수 성분이 있는데, 환원된 항체, 수성 주석이온 및 과테크네튬산염 용액이다. 하기에서 설명되는 조건하에서 intact 항체와 Fab/Fab' 단편으로의 Tc-99m 혼입이 쉽게 100%로 이루어질 수 있다. F(ab')2의 경우에 그 라벨링 조건은 Tc-99m을 100% 혼입시키지만, 방사선 라벨링된 F(ab')2이외에 방사선 라벨링된 Fab'의 특정량을 생성한다. 방사선 라벨링된 F(ab')2를 생성하기 위한 상기 개선된 방법에서는 이러한 문제점들을 없애준다.
그결과 형성된 Tc-99m 방사선 라벨링된 항체 및 항체 단편은, 이를테면 종양, 감염 병해, 미생물, 혈병, 심근 경색증, 아테롬성 동맥경화 반점, 또는 정상 기관 및 조직이 섬광 영상화(Scintigraphic imaging)에 사용하기에 적합하다. 이러한 영상법은 공지되어 있다.
상기와 같이 제조된 방사성 항체 용액은, 적당하게 멸균된 무발열성 물질 바이얼에서 제조되었다면 즉시 주사될 수 있다. 또한 테크네튬을 결합시킨 후 안정화시키기 위해 유리 술프히드릴기의 블록킹은 필요치 않다.
본 발명의 방법은 항체 또는 항체 단편을 라벨링시키기에 특히 효과적이지만, 알부민, 약제, 사이토카인, 효소, 호르몬, 면역 조절제, 수용체 단백질 등과 같은 단백질도 라벨링될 수 있다. 항체는 H사슬을 연결하는 1개 이상의 디술피드 결합 뿐아니라 L사슬과 H사슬을 서로 연결하는 디술피드 결합을 함유한다. 나중에 말한 디술피드 결합은 디술피드 환원제에 접근하기 어렵고, 보통 H사슬을 연결하는 결합이 선택적으로 분해된다. 생성한 단편은 면역 특이성 및 항원 결합능을 보유하고 있다. 이는 면역 글로불린의 H 사슬을 연결하는 디술피드 결합의 환원은, 만약 환원조건이 너무 격렬하거나 또는 환원제가 너무 오랫동안 단편과 접촉하는 경우 L 및 H 사슬을 연결하는 반응성이 적은 디술피드 결합이 결구 환원되기 때문에 주의를 기울여야 한다.
일단 환원되면 항체-SH 잔기는 급격하게 무-산소 조건하에서 보관하더라도 매우 안정하다. 낮은 pH, 특히 pH 6 미만에서 보관하면 안정성은 증가한다. 다수개의 유리 술프히드릴 기를 함유하는 항체 및 항체 단편을 액체 질소 온도로 급속히 냉각시키면 술프히드릴기의 오염 또는 손실없이 장시간 동안 보관 가능하다는 것이 밝혀졌다. 질소 분위기 내에서 항체-SH 또는 단편-SH 종류를 함유하는 튜브를 중탕하면 저온 안정성을 증가시키고 또 효과적으로 술프히드릴기가 디술디프로 재산화되는 것을 방지시킨다.
방사성 라벨링될 항체 또는 항체 단편은 종양, 감염 병해, 미생물, 기생충, 심근 경색, 응집물, 동맥경화증 반(plaque), 또는 정상 기관 또는 조직에 의해 제조되거나 또는 그와 결합된 항원에 결합하는 항체로 이해할 수 있다.
항체 및 항체 단편이란 용어는 항원에 특이적으로 결합하여 면역 복합체를 형성하는 면역 글로불린을 의미한다. 이 용어는 통상의 IgG, IgA, IgE, IgM등, 완전한 면역 글로불린을 펩신으로 분해하여 수득한 F(ab')2단편과 같은 통상의 효소 분해 생성물, 완전함 면역 글로불린을 파파인으로 분해하여 수득한 Fab 단편, F(ab')2단편 및 완전한 항체를 각가 디술피드 결합 분해시켜 수득한 통상의 1가 Fab' 및 L-H 사슬 단편뿐 아니라 면역 글로불린 및 단편과 같은 실질적으로 유사한 특성을 갖는 생성물을 포함한다.
이러한 유사한 단백질은 보다 큰 단편을 더 분해시키거나 조작하여 제조한 항체 하부 단편, 유전공항 처리된 항체 및/또는 단편, 및 전통적인 면역 글로불린과 실질적으로 유사하게 항원에 특이적으로 결합하는 항원 인식 영역을 갖는 합성 단백질을 포함한다. 이러한 단백질에 실질적으로 요청되는 것은, 폴리티올 잔기를 부분적으로 환원시키거나 또는 도입함으로써 환원된 과테크네튬산염 또는 환원된 과레늄산염 방사성 금속 이온에 대한 킬레이트로서 작용할 2개 이상의 인접하는 술프리드릴기를 가져야만 한다는 것이다.
환원된 과테크네튬산염 또는 환원된 과레늄산염이라는 것은 과테크네튬산염 또는 과레늄산염은 주석 이온으로 환원시키고 또 티올기로 킬레이트화시켜 수득한 테크네튬 또는 레늄 이온 종을 의미한다. 일반적으로 환원된 과테크네튬산염은 그러한 킬레이트에서 Tc(III) 및/또는 Tc(IV) 및/또는 Tc(V) 형태이고 또 환원된 과레늄산염은 Re(III) 및/또는 Re(IV) 및/또는 Re(V)형태이지만 그보다 더 높거나 낮은 산화 상태 및/또는 다중산화 상태도 배제되지 않고 본 발명의 범위 내에 속한다.
레늄은 주기율표에서 테크네튬 바로 아래에 위치하고, 동일한 외각 전자 구조를 가지고 있으므로 매우 유사한 화학특성, 특히 유사한 화합물 특성을 가질 것으로 생각된다. 실제로 레늄 화합물은 환원 및 킬레이트화에 관한 한 테크네튬 화합물과 질적으로 유사하지만 반응 속도라 상당히 상이하므로 특정 중요면에서 볼 때 상이하다.
방사성 동위 원소 Re-186은 치료에 유용하고 또 영상화하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 반감기가 약 3.7일이고, 높은 LET 베타 방출(1.07MeV) 및 유용한 감마 방출 에너지(0.137MeV)를 갖는다. 테크네튬과 유사하게 레늄은 과레늄산염으로부터 생성되고, 또 환원된 레늄 이온은 비 특이적으로 단백질에 결합될 수 있다. 따라서 환원된 과레늄산염이 항체와 같은 단백질 분자의 술프히드릴기에 결합되는 것과 같이 단백질을 Re-186으로 라벨링시키는 방법에 유리할 수 있다. Re-188은 반감기가 약 17시간으로, 발생기 제조된 베타 및 감마 방출체이어서 영상화 및 치료에 적합하다. 레늄-188을 제조하기 위한 발생기 개발이 현재 진행중이고; 또 바람직하게는 주석 이온 및 IgG을 함유하는 바이얼에 무 캐리어 레늄-188을 직접적으로 부가하여 2시간 미만내에 즉시 사용할 수 있는 레늄 방사성 라벨링된 단백질을 제조한다. 17시간이라는 레늄-188의 반감기는 특히 중요한 조제 과정을 가속시킨다.
과정은 레늄의 경우 과테크네튬산염과 함게 사용된 과정과는 어느 정도 변화될 수 있다. Tc-99m 과벨링 과정과는 대조적으로 과레늄산염은 소량의 주석 이온 환원제 및 짧은 반응 시간이 이용되면 환원된 항체를 라벨링시키지 않는다. 그러나 다량의 주석 이온 예컨대 타르타르산 주석을 사용하고 반응 시간을 더 길게 하는 것에 의해 티올-환원된 항체를 레뉴으로 성공적으로 라벨링시킨다.
조건을 적당하게 조작하는 것에 의해 수시간 내에 80% 이상의 레늄을 항체에 혼입시킬 수 있고, 이것은 반감기가 17시간이고 방사선에 의한 손상을 항체에 줄 가능성이 있는 레늄-188의 경우 특히 중요하다. 이 라벨링 과정은 요오드-131로 방사성 라벨링시킬때의 요건보다 더 간단하고 또 항체를 이트륨-90 및 구리-67로 라벨링시킬 때의 요건보다 훨씬 더 간단한다.
라벨링 시간이 짧은 것은 항체 면역 반응성을 확실하게 유지시킨다.
조건은 과레늄산염이 무 캐리어(예: 발생기-제조된 Re-188)인지 또는 캐리어 부가된(예: 반응기로부터 제조된 Re-186) 것인지에 따라 상이하고, 후자는 동일한 활성을 얻기 위해 도 많은 과레늄산염을 필요하므로 더 많은 주석 이온 환원제를 필요로 하지만 더 많은 단백질을 필요로 하는 것은 아니다. 이점은 종래 기술에서 취급되지 않은 면이다.
일반적으로 대수개의 인접하는 술프히드릴기를 함유하는 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편은 레늄 방사성 동위 원소의 바람직한 치료투여량을 나타내는 농도로 사용될 것이다. 라벨링될 수 있고 항체와 항체 단편의 정의가 테크네튬 라벨링에서 기재된 바와같은 단백질 유형이 레늄 방사성 원소 라벨링용으로 적합하다.
발생기로부터 흔히 제조될 수 있는 형태인 무 캐리어 Re-188-NaRe06으로 행하는 라벨링은 과테크네튬산염에서와 실질적으로 동일한 용액내 및 실질적으로 동일한 조건하에서, 약 1 내지 20mg/ml, 바람직하게는 10 내지 20mg/ml 단백질 농도의 술프히드릴 함유 단백질, 예컨대 항체 또는 그의 단편과 함께 실행하는 것이 유리하다. 사용될 주석 이온의 양은 일반적으로 약 100 내지 10,000㎍/ml, 바람직하게는 약 500 내지 5,000㎍ml이며 바람직하게는 단백질 양에 비례한다. 상술한 양의 단백질과 주석 이온을 사용하면, 약 10 내지 500mCi, 바람직하게는 약 50 내지 250mCi의 실질적으로 무 캐리어 Re-188-라레늄산염을 사용하는 것이 유리하고 또 이 또한 단백질 양에 비례한다. 반응 시간은 약 1분 내지 4시간, 바람직하게는 약 15분 내지 2시간이 유리하다. 놀랍게도 예기치 않게 과테크네튬산염 라벨링에 적합한 시약 비율 및 반응 시간은 과레늄산염 라벨링에는 효과적이지 않고, 또 그 역도 그러하다.
반응기로부터 흔히 제조되는 형태이고 또 약 100-내지 1,000배 과량의 Re-185를 캐리어로 함유하는 캐리어 부가된 Re-186-NaRe04로 행하는 라벨링은 Re-188-과레늄산염에서와 실질적으로 동일한 용역내 및 동일한 조건하에서, 약 1 내지 20mg/ml. 바람직하게는 10 내지 20ml/ml 단백질 농도의 술프히드릴 함유 단백질, 예컨대 단백질 또는 그의 단편을 사용하여 실행하는 것이 유리하다. 그러나 다량의 캐리어 때문에, 사용되는 주석 이온의 양은 보통 약 1 내지 1,000mg/ml, 바람직하게는 약 5 내지 500mg/ml 이고, 이 양은 또한 단백질 양에 비례한다. 이 동위 원소에 대해 거의 동일한 활성의 레늄 방사성 동위 원소와 거의 동일한 반응 시간이 이용된다.
짧은 칼럼으로 처리하면 반응되지 않은 레늄을 제거하기에 충분하므로, 만약 적합하게 멸균되어 방려성 물질이 제거된 바이얼에서 처리된다면, 처리즉시 주사될 수 있다. 또한 레늄 라벨링한 후에는 안정화시키기 위해 유리 술프히드릴기의 블록킹은 필요치 않다.
예기치 않은 발견으로서, 1개 이상의 디술피드기를 함유하는 단백질 예컨대 완전한 항체(미리 환원되지 않음)는 항체와 레늄을 동시에 환원시키고 결합시키기 위해 다량의 주석 이온을 사용하여 레늄으로 간단하고 직접적으로 방사성 라벨링될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 전 주석처리 과정은 어디엔 지게되어 있고 또 앞서의 테크네튬-IgG 라벨링 과정은 결과가 불향하다. 길고 심한 반응은 IgG-레늄 주사액을 성공적으로 제조하기에는 부적합하다.
일반적으로 반응되지 않은 단백질(예:항체)의 농도. 반응 시간, 과레늄산염 활성 및 기타 조건은 다량의 주석 이온이 사용된 외에는 술프히드릴 함유 단백질을 Re-186 또는 Re-188로 라벨링할 때와 실질적으로 동일하다.
방사성 과레늄산염에서 방사성 동위 원소가 실질적으로 무 캐리어 Re-188이면, 용액내의 항체 또는 항체 단편의 농도는 약 1 내지 20mg/ml, 바람직하게는 약 10 내지 20mg/ml 이고, 또 주석 이온의 양은 약 10 내지 20mg/ml 바람직하게는 약 500 약 5,00㎍/ml이다. 방사성 과레늄산염에서 방사성 동위 원소가 캐리어 부가된 Re-186이면, 동일한 항체 또는 항체 단편 농도에서 주석 이온의 양은 약 5 내지 1,000mg/ml, 바람직하게는 약 50 내지 500mg/ml이다.
사실상 바이얼 내에 있는 원형 그대로의 환원되지 않은 IgG는 주석 환원제로 처리된 다음 실온에서 45분 내에 성공적으로 과레늄산염으로 라벨링된다. 전 주석 처리는 하지 않지만 항체와 주석이 혼합된 후 과레늄산염을 직접 부가한다. 급속한 환원을 행하기 위해서는 충분한 양의 주석을 갖는 것이 중요하다. 작업 용이성에서 볼 때 전형적인 요오드-131 라벨링 정제보다 더 간단한 짧은 분리 칼럼처리 시키면 즉시 주사 가능한 순수한 레늄-IgG 결합물을 수득한다.
IgG를 이용한 조건에 노출시키면 항원 결합된 칼럼의 친화성으로 측정한 바와같이 면역반응성이 손상되지 않는다. 그 자리에서 단백질 디술피드기를 주석 이온으로 환원시키면 과레늄산염 환원이 수반되고 또 단백질-금속 착물을 형성하기 위한 필수 조건을 만든다. 동일 조건하에서 과테크네튬산염이 IgG틀 라벨링하는 것이 훨씬 못하다는 사실을 상기 과정이 레늄 라벨링된 항체틀 최소의 조작으로 수득하기 위해 특히 신규하고 유효한 경로임을 제시한다.
레늄 라벨링은 테크네튬 라벨링에서와 실질적으로 동일한 방식으로 실행하지만, 계내에 공기 또는 산소가 존재하지 못하도록 확실히 하기 위해 특히 주의해야 한다. 본 발명에 따라 제조된 레늄 라벨링된 단백질은 다른 작업자들이 나타낸 바와 같이 재산화되어 과레늄산염으로 되는 표시를 나타내지 않는데, 이는 본 발명의 방법이 손쉽고 안정하다는 것을 의미한다. 이와 관련하여 본 발명의 방법은 IgG 조작이 적고, Re-188이 발생기 유형으로부터 구입될 수 있고(1개의 발생기가 60일 이상 동안 하루 사용량을 생성 가능함) 또 스트론튬 오염 문제도 전혀 없으므로 레늄-방사성 라벨링된 IgG는 효과적인 치료제이다.
이들 방법으로 생성된 레늄 항체 결합물은 용액 내에서 5일이상 대기에 노출되더라도 매우 안정하다는 것이 밝혀졌다. 안정성이 장시간 유지되는 것은 앞의 라벨링 과정 동안 면역 반응성이 유지되므로 면역 방사성 치료에서 중요하다.
본 발명의 시도는 단순성, 효과, 효율 및 공정에서 주요 조작 생략 뿐 아니라 레늄 결합물의 안정성에서 볼 때 종래 시도와는 상당히 상이하다는 것을 알 수 있다. 주석양이 비교적 많고 또 반응시간이 길면 과테크네튬산염 라벨링을 실행하기에는 부적합하지만 과레늄산염 라벨링에는 적합한 반면, 주석양이 적고 급속한 라벨링 반응 조건은 과테크네튬산염에는 적합하지만 과레늄산에는 작용하지 않는다. 특히 약 1mg의 항체에 대해 Tc-99m의 영상 활성, 극소량의 주석 및 5분간의 반응시간이면 우수한 결과를 내지만, 특히 완전한 항체를 사용하는 경우 Re-186 또는 Re-188 라벨링의 치료 수준은 500㎍/ml 이상의 주석 이온이 바람직하고 또 1시간 근처의 반응 시간이 효과적이다.
발생기로 제조된 과테크네튬산염을 사용하여 단백질 예컨대 Fab'-SH 또는 F(ab')2단편, 또는 완전한 항체를 Tc-99m으로 방사성 라벨링시키기 위한 키트는 종양, 감염 병해, 미생물, 기생충, 심근 경색, 응집물, 동맥경화증 반, 또는 정상 기관 또는 조직과 관련된 항원에 특이적으로 결합하고 또 인접하는 유리 술프히드릴기를 다수 함유하는 약 0.01 내지 10mg/단위 투여량의 항체 또는 항체 단편; 및 약 0.1 내지 50㎍/단위 투여량의 주석 이온을 포함한다. 상기 크트의 성분은 사용하기 바로 전에 항체 또는 항체 단편 mg당 약 2 내지 50mCi의 Tc-99m 과태크네튬산염과 함게 조합된다. 항체/단편-SH 및 Sn(II) 환원제는, 과테크네튬산염을 부가하지 전에, 바이얼 내에서 당일 성분으로 조합되어 액체 질소욕에서 보관되거나 또는 이 기술 분야에서 잘 공지된 바와 같이 부가된 당과함께 동결 건조될 수 있다.
항체 또는 항체 단편을 Re-188레늄 방사성 동위 원소로 방사성 라벨링 시키기 위한 키트는 전형적으로 종양 또는 감염 병해와 관련된 항원에 특이적으로 결합하고 또 인접하는 유리 술프히드릴기 다수개를 함유하는 약 1 내지 20mg/단위 투여량의 항체 또는 항체 단편; 및 약 100 내지 10,000㎍/단위 투여량의 주석 이온을 포함하며; 또 사용하기 바로 전에 항체 또는 항체 단편 mg당 약 10 내지 500mCi의 무 캐리어 R-188 과레늄산염과 조합된다. 유리하게는 키트 성분은 상술한 바와 같이 라벨링되기 전 까지는 한 바이얼에 보관하거나 동결 건조될 수 있다.
항체 또는 항체 단편을 Re-186 레늄 방사성 동위 원소로 방사성 라벨링시키기 위한 키트는 전형적으로 종양 또는 감염 병해와 관련된 항원에 특이적으로 결합하고 또 인접하는 유리 술프히드릴기 다수를 함유하는 약 1 내지 20mg/단위 투여량의 항체 또는 항체 단편; 및 약 1 내지 1,000mg/단위 투여량의 주석 이온을 포함하고; 또 사용하기 바로 전에 항체 또는 항체 단편 mg당 약 10 내지 500mCi의 캐리어 부가된 Re-186 과레늄산염과 조합된다.
상술한 바와 같은 단일 바이얼 보관 및 사용이 바람직하다.
환원되지 않은 완전한 항체틀 레늄 동위 원소로 라벨링시키는 키트는 항체내의디술피드 결합을 환원시킬뿐 아니라 과레늄산염을 환원시키기 위해 다량의 주석 이온이 사용되는 이외에는 상술한 바와 유사하다.
이러한 키트에 있는 단백질은 멸균 용기내 및 불활성 가스 분위기하에서 동결되거나 동결 건조되며, 유리하게는 액체 질소속에서 냉각 보관되며 또 사용하기 바로 전에 서서히 융해된다. 이 키트는 임상병리사 또는 기술자가 사용하기 위한 주사 조제를 제조하기 위해 완충액 멸균 바이얼, 식염수, 주사기, 필터, 칼럼 및 기타 보조 장치를 보충하는 것이 유리하다.
이들 키트가 환자 개인적인 필요 또는 식이요법에 따라 변화 및 변형될 뿐 아니라 방사성 동위원소가 제공되거나 얻어질 수 있는 형태에서의 변화도 가능하다는 것은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 잘 공지되어 있다.
본 발명에 따라 제조된 라벨링된 단백질, 특히 항체 및 항체 단편이 비 침해적인 신티그래픽 촬영(scintigraphic imaging) 방법에서 특히 효과적이고 또 종양 및 병해의 방사성 항체 요법에 적합하다는 것은 통상의 기술을 가진 사람에게 잘 공지되어 있다. 특히 종약, 감염 병해, 심근 경색, 응집물, 동맥 경화증 반 또는 정상 기관 또는 조직에 의해 제조되거나 또는 그와 결합된 항원에 특이적으로 결합하고 또 외부로 검출 가능한 약제학적으로 허용되는 불활성 방사성 동위 원소로 방사성 라벨링된 항체 또는 항체단편을 환자에게 비경구적으로 주사하며, 또 방사성 라벨링된 항체 또는 항체 단편이 자리를 잡고 또 라벨링되지 않는 것이 정돈되기에 충분한 시간후에 방사성 라벨링된 항체 또는 항체 단편의 증대 부위를 외부 영상화 카메라로 측정함으로써 종양, 감염 병해, 심근경색, 응집물 동맥 경화증 반 또는 정상기관 또는 조직을 영상화하는 방법에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 Tc-99m 라벨링된 항체 또는 항체 단편을 방사성 라벨링된 항체 또는 항체 단편으로서 사용하는 것은 진보라 할 수 있다.
더구나 종양 또는 감염 병해에 의해 제도되거나 또는 그와 결합된 항원에 특이적으로 결합하고 또 치료 유효량의 방사성 동위 원소로 방사성 라벨링된 항체 또는 항체 단편을 종양 또는 감염 병해로 고통받고 있는 환자에게 비 경구적으로 주사함으로써 종양 또는 감염 병해로 고통받고 있는 환자를 방사성 항체 요법으로 치료하는 방법에 있어서, 미리 환원되거나 또는 환원되지 않은 본 발명의 방법에 따라 제조된 레늄으로 방사성 라벨링된 항체 또는 항체 단편을 라벨링된 항체 또는 항체 단편으로서 사용하는 것은 진보라 할 수 있다.
더 자세히 설명하지 않아도 본 기술 분야의 기술자라면 상술한 설명을 이용하여 본 발명을 최대한 이용할 수 있을 것이다. 그러므로 하기한 바람직한 특수 구체예는 단순히 설명하기 위한 것이지 설명을 어떤 의미로든 본 발명을 제한하지 않는다.
하기 실시예서, 모든 온도는 섭씨로 나타낸다.
[실시예 1]
[항체 항원]
정제된 모노클로날 항-CEA IgG(암태아성 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 직장암에 결합하는 마아커) 5mg을 6.2 내지 6.6으로 조정된 pH의 인산 완충 식염수(PBS) 1ml에 용해시킨 용액을 2-메르캅토에탄올로 30 내지 50 밀리몰로 만든다. 실온에서 30 내지 40분 동안 방치시킨후, 아크릴아미드 칼럼상에서 완충액으로서 산소 제거된 아세테이트를 사용하여 시료를 정제시킨다. 환원된 IgG 용액을 센트리콘 상에서 1 내지 2mg/ml로 농축시키고 또 엘만 반응으로 IgG당 SH기 수를 분석한다. 편의상 405℃에서 멸균 여과하여 보관하거나 또는 SH기의 안정성을 높이기 위해 냉동시켜 보관한다.
[실시예 2]
[Tc-99m 방사성 라벨링]
전형적으로 125mg의 Sn(II)틀 함유하는 용액을, 실시예 1에 따라 제조되고 엘만 반응에 의해 IgG당 1.2개의 SH를 갖는 유리 술프히드릴 기를 갖는 모노클로날항-CEA 3.6×10-10몰을 함유하는 용액과 혼합하여 Sn(II)대 IgG비를 2.9:1로 만든다. 과테크네튬산염으로 2mCi의 테크네튬-99m을 식염수에 부가한 다음 실온에서 5분간 배양하면 HPLC에 의해 측정된 바와같이 테크네튬 100%가 단백질에 혼입되고 또 2개의 상이한 용리 완충액으로 행한 LTLC에 의해 측정된 바와 같이 1% 미만의 과태크네튬산염이 잔류한다.
CEA 칼럼상에서 측정할 때 면역 반응성 98% 이상이다. 라벨링된 항체 용액은 체내 주사에 즉시 사용될 수 있다.
[실시예 3]
[Re-186 방사성 라벨링]
전형적으로, 880㎍의 Sn(II)를 함유하는 용액을 1mg의 모노클로날 항-CEA 완전 항체를 함유하는 용액과 혼합한다. 과레늄산염으로서 9×106cpm의 활성을 갖는 18.9×10-11몰 레늄-186을 식염수에 부가하고, 실온에서 1시간동안 배양하면 레늄 75%가 단백질로 혼입된다. 라벨링된 항체는 공기산화에 안정하며 그의 면역 반응성은 CEA 칼럼상에서 측정하면 높다. 상기 용액은 직접 생체내 주사될 수 있다.
[실시예 4]
Re-188 방사성 라벨링
전형적으로 항-CEA Fab'-SH (F(ab')2를 시스테인, 메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨로 환원시켜 생성된 SH) 1mg을 100mM 타르타르산 + 50mM 아세트산 완충액 1ml 및 약 123㎍의 Sn(II)를 함유하는 Sn(II) 종류와 함께 아르곤 분위기에 둔다. 농도에 따라 액 1×10-9몰의 레늄에 상응하는 과레늄산염 용액 20 내지 2000μl을 부가한다. 혼합한 후 1 내지 6시간에 걸쳐 레늄 혼합이 60 내지 100% 정도로 되게 반응을 진행시킨다. 라벨링된 항체 단편 용액은 직접적으로 생채내로 주사될 수 있다.
라벨링 효능을 확인하기 위해 라벨링된 단백질 시료를 아크릴아미드 칼럼에 부가하고 또 아세트산 완충액 또는 식염수로 용리시킨다. 라벨링된 단백질은 기공부피(약 5ml)를 용리해 내고 식염수로 ITLC로써 분석하면 100%의 단백질이 결합된 레늄임을 알수 있다. 이 결합물을 주사기 통을 이용한 미니 칼럼을 통해 정제하면 다시 100%의 단백질이 결합된 라벨링임을 알 수 있다.
라벨링된 단편은 0.05 마크론 정도로 작은 기공크기의 필터를 통과하며 응집물은 보이지 않는다. 모든 칼럼 과정 및; 여과에서 거의 100%의 방사능이 회수된다. HPLC 및 ITLC 상에서 크로마토그래피하면 단백질 분획에 따라 용리되고 이동하는 방사능을 나타낸다.
[실시예 5]
[F(ab')2-SH 제조]
(a) 완전한 항체의 부분적 환원
완전한 항-임파종 IgG 2A 항체를 10 내지 20mg/ml 사이의 트리스 완충액(0.1M, pH8.7)에 용해시킨 용액을 L-시스테인으로 25밀리몰로 만든다.
4℃에서 10분후, pH4.5의 50mM 아세트산을 사용한 크기별 배출 크로마토그래피에 의해 정제시키고, 또 모든 단백질 분획을 10mg/ml로 농축시킨다. 엘만 반응에 의해 분석하면 IgG몰당 약 3.5개의 SH기를 나타낸다. 환원은 디티오트레이톨(DTT), 2-메르캅토에탄올(2-ME) 메탈로티오네인 C-말단 헥스펩티드(MCTp) 등의 기타 티올 환원제를 사용하여 실행될 수 있다.
(b) 효소 분해
상기 (a)에 따라 제조된 부분적으로 환원된 항-임파종 항체 시료의 분해는 소량의 시트르산 용액 C(M)으로 pH를 4.0으로 조정하고 또 IgG를 37.5℃에서 3 내지 4시간 동안 펩신(최종 농도:200㎍/ml)으로 처리함으로써 실행된다. 크기별 배출 HPLC로써 반응시키고 또 모든 완전한 IgG가 제거된 후 온도를 4.5℃로 냉각시키고, pH를 5.5로 증가시키는 것에 의해 반응을 중지시키고 또 즉시 예비적 HPLC컬럼(Zor bax 250, 듀퐁사제품)에 걸어 보유시간 8 내지 15분간에 걸쳐 12초 마다 분획을 수거한다. 9.5분 근처에서 용리해 나온 분획을 분석하고, 또 동일한 것으로 판단되면 재농축시키기 전에 합한다. 이렇게 조제된 F(ab')2-SH는 HPLC상에서 1가의 Fab'를 전혀 나타내지 않고 1개의 피이크 만을 나타낸다. 이것을 방사성 라벨링시키기 전에 액체 전에 액체 질소욕에 보관한다.
[실시예 6]
[테크네튬-99m 라벨링]
전형적으로 실시예 5에 따라 제조된 부분적으로 환원된 항-임파종 F(ab')2-SH 1mg을 10내지 100mM 타르타르산 +50mM 아세트산 완충액 1ml 및 약 120㎍의 Sn(II)를 함유하는 Sn(II) 종류와 함께 이르곤 분위기에 둔다. 농도에 약 1×10-9몰 이하의 테크네튬에 해당되는 과테크네튬산염 용액 20 내지 200μl를 부가한다. 약 5분후, 실질적으로 100%의 테크네튬 라벨링가 F(ab')2단편에 결합되고 Fab' 단편화는 거의 없다.
라벨링된 단편은 0.05미크론 만큼 작은 기공 크기의 필터로 통과하므로 응집물이 없는 것을 나타낸다. 모든 칼럼 과정 및 여과 처리에서 실질적으로 100%의 방사능이 회수된다. HPLC 및 ITLC상에서 행한 크로마토그래피는 단백질 분획에 따라 용리되고 이동하는 방사능을 나타낸다. 라벨링된 단편은 대기에 72시간 이하 동안 노출될 때 아세트산 완충액 또는 식염수중 어디에서든 재산화에 대한 매우 강한 저항력을 갖는다. 따라서 테크네튬 방사성 라벨링된 생성물을 최소의 실험 처리로 수분내에 즉시 주사될 수 있다.
[실시예 7]
[레늄-188 라벨링]
전형적으로, 실시예 5에 따라 제조된 부분적으로 환원된 항-임파종 F(ab')2-SH 1mg을 10-100mM 타르타르산 +50mM 아세트산 완충액 1ml 및 약 120㎍의 Sn(II)를 함유하는 Sn(II) 종류와 함께 아르곤 분위기 하에 둔다.
농도에 따라 약 1×10-9몰 이하의 레늄에 해당되는 과레늄산염 20 내지 2000μl를 부가한다. 혼합한후, 라벨링을 1 내지 18시간 동안 방치하여 ITLC으로 측정하면 60내지 95%의 레늄 혼입이 관찰된다. 생성한 용액은 그대로 환자에게 주사될수 있다.
방사성 라벨링 효능을 평가하기 위해, 라벨링된 단편을 아크릴아미드 칼럼에 즉시 부가하고 또 아세트산 완충액 또는 식염수중 어느 하나로 용리시킨다. 라벨링된 단백질은 기공부피(약 5ml)를 용리하고 또 이것은 식염수로 행한 ITLC에 의해 100%의 단백질이 결합된 레늄으로 밝혀진다. 이 결합물을 주사기 통을 이용한 미-컬럼으로 즉시 통과시킴으로써 동일하게 정제시켜도 다시 100%의 단백질이 결합된 라벨링임이 밝혀진다.
라벨링된 단편은 0.05 미크론 만큼 작은 기공 크기의 필터도 통과하므로 응집물이 없는 것을 나타낸다. 모든 칼럼 과정 및 여과 처리에서, 실질적으로 100% 방사능이 회수된다. HPLC 및 ITLC상에서 행한 크로마트그래피는 단백질 분획에 따라 용리되고 이동하는 방사능을 나타낸다. 라벨링된 단편은 대기에 72시간 이하 동안 노출될 때 아세트산 완충액 또는 식염수중 어디에서든 재산화에 대한 매우 강한 저항력을 갖는다. 따라서 레늄 방사성 라벨링된 생성물은 최소의 실험 처리로 수분내에 즉시 주사될 수 있다.
[실시예 8]
[F(ab')2-MCTP-SH 과정]
(a) 항체-MCTP 결합물
마우스 간 메탈로티오네인-1 단편(56-61) 6.2mg(1×10-5몰)(시그마케미컴 컴페니)을 pH4.4의 인산 완충액 495μl에 용해시키고, 또 pH4.4의 인산 완충액에 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 용해시킨 191mg/ml 용액 10μl와 처리시킨다. 최종 반응 pH가 4.0 내지 4.5 사이로 되도록 주의해야 하고 또 반응은 4.5℃에서 실행된다. 반응은 15분 동안 계속된다.
탈산소화된 트리스 완충액(pH8.7)에서 10내지 15mg/ml로 농축된 항-CEA IgG 항체 용액을 4.5℃로 냉각시키고 또 4.5℃에서 활성화된 MCTP로 10분간 처리한다. 상기 혼합물을 즉시 아크릴마이드 칼럼에 부가하고 또 탈산소화된 초산 나트륨/식염수 완충액 50/15mM(pH4.5)으로 용리시켜 IgG 분획을 수득한다. 엘만 반응으로 행한 분석은 항체당 약 5 내지 6개 SH기를 나타낸다.
(b) 효소 분해
항체-MCTP 결합물을 실시예5(b)와 유사하게 펩신을 사용하여 분획화시킨다. 분해 과정은 크기별 배출 HPLC로써 조정하며 또 반응 혼합물이 약 90% F(ab')2로 단편화되면(약 1시간에 걸쳐) 이것을 얼음상에 놓고 아세트산 완충액(pH4.5)을 사용한 예비적 크기별 배출 HPLC로써 정제시킨다. 정제된 F(ab')2-MCTP 분획을 모아 합친 다음 적당량의 주석 이온 용액을 부가한다. 생성한 용액을 얼려서 보관하거나 바람직하게는 액체 질소욕에 보관한다.
[실시예 9]
[방사성 라벨링]
실시예 8에 따라 제조된 F(ab')2-MCTP는, 단편/메탈로티오네인 결합물이 일반적으로 실시예 5의 과정에 따라 제조된 부분적으로 환원되고 분해된 항체보다 단편 분자당 더 많은 유리 티올기를 함유한다는 사실에 기초하여 적절히 조정하여, F(ab')2 -SH에 대한 실시예 6 및 7에서 설명한 바와 동일한 방식 및 동일한 과정으로 Tc-99m 및 레늄 방사성 동위원소로 방사성 라벨링될 수 있다.
F(ab')2-MCTP 및 Sn(II) 모두를 함유하는 실시예8(b)에 따른 바이얼 조제를 서서히 녹이고 또 실온으로 가온시키는 것이 유리하다. 고테크네튬산염을 식염수에 부가하고 약 5분간 반응시키면 즉시 생체내에 주사될수 있는 실질적으로 100% 라벨링된 F(ab')2용액이 생성된다. 과레늄산염을 식염수에 부가하고 1 내지 18시간 반응시키면 즉시 생체내 주사될 수 있는 60내지 100% 라벨링된 F(ab')2용액이 생성된다.
상기한 방법은 현재 Tc-Fab' 및 Re-Fab' 오염없이 Tc-라벨링된 및 Re-라벨링된 항체 F(ab')2를 제조할 수 있는 간단하고 매우 효과적인 방법이다.
상기한 실시예는 단순히 설명하기 위한 것이므로 본 발명의 범위와 정신을 벗어나지 않는한 여러 용도 및 조건에 따라 본 발명에 따른 방법. 키트 및 용도를 변화시키기 위해 본 기술 분야의 기술자는 여러변화와 변형을 실행할 수 있다.
본 발명의 광범위는 첨부된 특허청구의 범위와 그에 상응하는 것으로 규정된다.

Claims (24)

  1. 다수 개의 인접하는 유리 술프히드릴 기를 함유하는 단백질 용액을, 방사성 과태크네튬산염을 완전히 환원시키거나 또는 상기 용액으로부터 석출시키기에는 불충분한 과량의 주석 이온과 접촉시킨 다음 트랜스킬레이트화제 부재하에서 Tc-99m 방사성 과테크네튬산염과 접촉시키고 또 방사선 라벨링된 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 단백질을 Tc-99m 테크네튬 방사성 동위원소로 방사성 라벨링시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 항체, 항체 단편, 알부민, 약제, 사이토카인, 효소, 호르몬, 면역 조절제 또는 수용체 단백질인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 특이적으로 종양 마아커에 결합하거나 감염 병해, 미생물, 기생충, 심근 경색, 응집물, 동맥경화증반, 또는 정상기관 또는 조직과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 방법.
  4. 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 단백질 용액을, 방사성 과레늄산염을 실질적으로 완전히 환원시키기에 필요한 과량의 주석이온과 접촉시킨 다음 방사성과레늄산염과 접촉시키고 또 방사성 라벨링된 단백질을 회수 하는 것을 포함하는, 단백질을 레늄방사성 동위원소로 방사성 라벨링시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단백질이 항체, 항체 단편, 알부민, 약제, 사이토카인, 효소, 호르몬, 면역 조절제 또는 수용체 단백질인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단백질이 항체 또는 항체 단편이고, 유기 술프히드릴기가 전체 면역글로불린 또는 그의 F(ab')2단편을 티올 시약으로 부분적으로 환원시키거나 F(ab')2항체 단편을 Fab' 단편으로 티올 환원 및 분해시켜 제조되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 특이적으로 종양 마아커에 결합하거나 감염 병해, 미생물, 기생충, 심근 경색, 응집물, 동맥경화증반, 또는 정상기관 또는 조직과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 방사성 과레늄산염내에 있는 방사성 동위 원소가 실질적으로 무 캐리어 Re-188이고, 상기 용액내에 있는 항체 또는 항체 단편의 농도는 약 1 내지 200mg/ml이며, 또 주석 이온의 양은 약 100 내지 10,000㎍/ml이고, 과레늄산염의 양은 약 10 내지 500mCi이며, 반응 시간은 약 1분 내지 4시간인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 방사성 과레늄산염내에 있는 방사성 동위 원소가 캐리어 부가된 Re-186이고, 상기 용액내에 있는 항체 또는 항체 단편의 농도가 약 1 내지 20mg/ml이며, 또 주석 이온의 양이 약 1 내지 1,000㎍/ml이고, 과레늄산염의 양이 약 10 내지 500mCi이며, 반응시간이 약 1분 내지 4시간인 방법.
  10. 1개 이상의 디술피드 기를 함유하는 완전한 항체 또는 F(ab')2항체단편의 용액을 방사성 과레늄산염을 거의 완전히 환원시키는 데 필요한 양이상의 과량의 주석 이온과 접촉시킨 다음 방사성 과레늄산염과 접촉시키고 또 방사성 라벨링된 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 완전한 항체 또는 F(ab')2항체 단편을 레늄 방사성 동위 원소로 방사성 라벨링시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 특이적으로 종양 마아커 또는 감염 병해와 관련된 항원과 결합하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 방사성 과레늄산염내에 있는 방사성 동위 원소가 실질적으로 무 캐리어 Re-188이고, 상기 용액내에 있는 항체 또는 항체 단편의 농도가 약 1 내지 20mg/ml이며, 주석 이온의 양은 약 500 내지 10,000㎍/ml이고, 과레늄산염의 양이 약 50 내지 260mCi이고, 또 반응시간이 약 1분 내지 4시간인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 방사성 과레늄산염내에 있는 방사성 동위 원소가 캐리어 부가된 Re-186이고, 상기 용액내에 있는 항체 또는 항체 단편의 농도가 약 1내지 20mg/ml이며, 주석 이온의 양이 약 5내지 1,000㎍/ml이고, 과레늄산염의 양이 약 10 내지 500mCi이며, 반응시간이 약 1분 내지 4시간인 방법.
  14. (a) 디술피드기를 분해하기 위해 완전한 항체를, 중앙부의 다수개의 유리 술프히릴기를 생성하기에는 충분하지만 항체를 분해하거나 또는 면역학적으로 불활성화 시키기에는 불충분한 양의 환원제로써 부분적으로 환원시키고; (b) 상기 부분적으로 환원된 항체를 분해하여 부분적으로 환원된 F(ab')2단편을 생성시키며; (c) 상기 부분적으로 환원된 F(ab')2단편용액을, 방사성 과테크네튬산염을 거의 완전히 환원시키는데 필요한 양 이상의 과량이지만 용액으로부터 석출되기엔 불충분한 양의 주석 이온과 접촉시킨 다음 방사성 과테크네튬산염 또는 과레늄산염과 접촉시키고, 또 Fab' 항체 단편과 응집물이 거의 없는 방사성 라벨링된 F(ab')2를 회수하는 것을 포함하는, 레늄 방사성 동위원소로 방사성 라벨링된 F(ab')2항체 단편을 제조하는 방법.
  15. (a) 완전한 항체를, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 부가물과 결합시켜 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 항체 결합물을 회수하고; (b) 상기 항체 결합물을 붕해시켜 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 F(ab')2단편 결합물을 생성하며; (c) 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 F(ab')2단편 결합물의 용액을, 방사성 과테크네튬산염 또는 방사성 과테늄산염을 실질적으로 완전히 환원시키는데 필요한 양 이상의 과량이지만 용액으로부터 석출되기엔 불충분한 양의 주석 이온과 접촉시킨 다음 방사성 과태크네튬산염 또는 방사성 과레늄산염과 접촉시키고, 또 실질적으로 Fab' 항체 단편과 응집물이 없는 방사성 라벨링된 F(ab')2를 회수하는 것을 포함하는, Tc-99m 또는 레늄 방사성 동위원소 방사성 라벨링된 F(ab')2항체 단편을 제조하는 방법.
  16. 적합한 용기내에서, 항원을 특이적으로 결합하고 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 0.01 내지 10mg/단위투여량의 항체 또는 항체 단편; 및 약 0.1 내지 50㎍/단위투여량의 주석 이온을 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 테크네튬 방사성 동위 원소 Tc-99m으로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  17. 적합한 용기내에서, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 1 내지 20mg/단위 투여량의 항체 또는 항체 단편 ; 및 약 100 내지 10,00㎍/단위투여량의 주석 이온을 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 실질적으로 무 캐리어 레늄 방사성 동위원소 Re-188로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  18. 적합한 용기내에서, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 1 내지 20mg/단위투여량의 항체 또는 항체 단편; 및 약 1 내지 1,000mg/단위 투여량의 주석 이온을 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 캐리어 부가된 레늄 방사성 동위 원소 Re-186으로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  19. (a) 완전한 항체를, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 부가물과 결합시키고, 또 생성한 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 항체 결합물을 회수하고 ; 또 (b) 상기 항체 결합물을 붕해시켜 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 F(ab')2단편 결합물을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조하는 다수개의 인접한 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 0.01 내지 10mg/단위 투여량의; 및 약 0.1 내지 50㎍/단위 투여량의 주석이온을 적합한 용기내에 포함하는, F(ab')2항체 단편을 테크네튬 방사성 동위 원소 Tc-99m으로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  20. (a) 완전한 항체를, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 부가물과 결합시키고, 또 생성한 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 항체 결합물을 회수하고 ; 또 (b) 상기 항체 결합물을 붕해시켜 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 F(ab')2단편 결합물을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조하는 다수개의 인접한 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 1 내지 20mg/단위 투여량의 F(ab')2항체 단편 ; 및 약 100 내지 10,000㎍/단위 투여량의 주석 이온을 적합한 용기내에 포함하는, F(ab') 항체 단편을 레늄방사성 동위 원소인 무 캐리어 Re-188로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  21. (a) 완전한 항체를, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 부가물과 결합시키고, 또 생성한 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 항체 결합물을 회수하고; 또 (b) 상기 항체 결합물을 붕해시켜 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 함유하는 F(ab')2단편 결합물을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조하는 다수개의 인접한 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 1 내지 20mg/단위 투여량의 F(ab')2항체 단편 ; 및 약 1 내지 1,000mg/단위 투여량의 주석 이온을 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 캐리어 부과된 레늄 방사성 동위 원소 Re-186로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  22. (a) 디술피드기를 분해하기 위해 완전한 항체를, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 생성하기에는 충분하지만 항체를 분해하거나 또는 면역학적으로 불활성화 시키기에는 불충분화 시키기에는 불충분양의 환원제로써 부분적으로 환원시키고 ; (b) 상기 부분적으로 환원된 항체를 분해하고 부분적으로 환원된 F(ab')2단편을 생성시키는 단계로된 방법으로는 제조한 다수개의 인접한 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 0.01 내지 10mg/단위 투여량의 F(ab')2항체 단편 ; 및 약 0.1 내지 50㎍/단위 투여량의 주석 이온을 적합한 용기내에 포함하는, F(ab')2항체 단편을 네트네튬 방사성 동위원소 Tc-99m으로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  23. (a) 디술피드기를 분해하기 위해 완전한 항체를, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 생성하기에는 충분하지만 항체를 분해하거나 분해하거나 또는 면역학적으로 불활성화 시키기에는 불충분양의 환원제로써 부분적으로 환원시키고 ; (b) 상기 부분적으로 환원된 항체를 분해하고 부분적으로 환원된 F(ab')2단편을 생성시키는 단계로된 방법으로 제조한 다수개의 인접한 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 1 내지 20mg/ 단위 투여량 F(ab')2항체 단편 ; 및 약 100 내지 10,000㎍단위 투여량의 주석 이온을 적합한 용기내에 포함하는, F(ab')2항체 단편을 무 캐리어 레늄 방서성 동위 원소 Re-188으로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
  24. (a) 디술피드기를 분해하기 위해 완전한 항체를, 다수개의 인접하는 유리 술프히드릴기를 생성하기에는 충분하지만 항체를 분해하거나 또는 면역학적으로 불활성화 시키기에는 불충분양의 환원제로써 부분적으로 환원시키고; (b) 상기 부분적으로 환원된 항체를 분해하여 부분적으로 환원된 F(ab')2단편을 생성시키는 단계로된 방법으로 제조한 다수개의 인접한 유리 술프히드릴기를 함유하는 약 1 내지 20mg/단위 투여량의 F(ab')2항체 단편; 및 약 1 내지 1,000㎍/단위 투여량의 주석 이온을 적합한 용기내에 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 캐리어 부가된 레늄 방사성 동위 원소 Re-186으로 방사성 라벨링시키기 위한 키트.
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