JPS62230800A - 改良された放射性核種抗体カツプリング - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 光可例分立 本発明は、放射性ラベルされたタンパク質前駆体、その
製造方法及び診断剤及び治療剤としてのそれらの使用に
関する。

放射性ラベルされた化合物は、医学的診断及び治療にお
いて重要な道具である。そのような化合物は、種々の技
法、たとえば静脈血栓の診断、リンパ節の病理学的研究
及び腫瘍の検出、病朋及び治療に使用される。多くのこ
れらの化合物は、金属放射性核種、たとえばテクネチウ
ム−９９ｍを使用する。４７ｅＭ投与のために放射性核
種を使用する場合、その放射性核種は、目的の器官又は
病巣、たとえば癌部位に局部配置されることが所望され
る。従って、放射性核種は、特定の器官又は組織への選
択的結合性又はそれによる吸収性を提供するために通常
配合される。囲りの又は遠隔の組織に向けられたバック
グラウンド放射線を減じ、投与量を滅じ、盃ヱ　叩　イ
メージングのだめのハックグラウンドを最少にし、そし
て所望しない副作用を最少にするために、前もって選択
された部位に放射性核種を少しづつ向けることができる
ことに相当の興味がある。最後に、放射性核種が接合さ
れ得る特定のりガント又は受容体を含む方法が興味の対
象である。

既知の放射性ラベルされた化合物及び他の調製物は、し
ばしば１又はそれよりも多くの明確な欠点を有する。た
とえば、そのような調製物においては、放射性核種と対
象のタンパク質前駆体との間の結合が非特異的且つ／又
は不安定であり、そして順に、バックグラウンド放射線
の増加を導びき、調製物の診断的利用性を制限し、そし
て治療効果を制限しながら、目的としない部位への放射
線投与を増大する該調製物の解離をもたらす。

タンパク質−キレート接合体によるタンパク質前駆体の
ＨＭ　導体はより安定している。しかしながら、そのよ
うなタンパク質−キレ−１・誘導体の調製物は、比較的
苛酷な条件、たとえば有機溶媒及び過度のｐｌ＋及び温
度（これらは部分的変性をもたらすかも知れない）にゆ
だねる必要がある。さらに、放射性キレートの存在は、
特定のタンパク質前駆体の生物学的活性を激しく変える
ことができる。たとえば、キレートリガンドを通して金
属放射性核種により共有的にラヘルされた抗体は、減じ
られた免疫反応性（これは組織とのそれらの相互作用の
特異性を減じる）のものである。また、あるキレート接
合方法にゆだねられたタンパク質は、莞性／集合しゃす
く；そのような影響は、そめようなタンパク質が循環か
ら除かれるにつれて増大することができ、そして従って
イメージング又は治療のために利用できる放射性核種の
量を減少せしめることができる。さらに、キレート接合
体を使用して放射性ラベルされたあるタンパク質前駆体
は、危険なラベルされたタンパク質をさらに使用する患
者に免疫反応を誘導することができる。

〔関連する文献の説明〕 対象の文献は、Ｓｔｅｉｇｍａｎなど、、１５　Ｊ］ｕ
ｃ１．Ｍｅｄ。

５７３（１９７５）　（摘要）　　；　Ｐｅｔｔ＋ｔ＋
　など２１　Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ。

５９（１９８０）　；及びアメリカ特許第４，４２４，
２００号；第４，４２１，７３５号；第４，３２３，５
４６号；第４，２９３，５３７号；及び第４，０５７，
６１７号を含む。

〔発明の要約〕

自然状態でジスルフィド（シスチン）結合を含む、金属
放射性核種によりラベルされたタンパク質前駆体が提供
され、そしてこれは種々の病的状態の診断及び治療に使
用される。特に、キレート化された、金属放射性核種接
合体のタンパク質前駆体が、リンパ節及び静脈血栓の診
断及び腫瘍の検出及び病期のために使用される。放射性
核種によりラベルされたタンパク質、特に免疫グロブリ
ンが、腫瘍の放射性治療に使用される。

放射性核種によりラベルされた本発明のタンパク質前駆
体は、ジスルフィド還元剤による対象のタンパク質前駆
体の処理、次に該還元されたタンパク質前駆体（“Ｈ−
処理生成物゛）とたとえば””Ｔｃ、”ｈＲｅ及びＩＩ
ＩＩＩＲｅ又は６？Ｃｕを含む適切な放射性核種との反
応によって形成される。

Ｈ−処理生成物、たとえば抗体は、放射性核種と特異的
に反応し、放射性核種によりラベルされた安定した抗体
又は放射性ラベルされた他の生成物を形成することが見
出された。Ｈ−処理生成物は、金属放射性核種との複合
体化の前及び後で種々の方法により安定化され又は修飾
され得る。

〔特定の態様の説明〕

金属放射性核種によりラベルされたタンパク質前駆体に
関する、改良された方法及び組成物並びに放射性イメー
ジング及び放射性治療のためｌ；、該放射性ラベルされ
たタンパク質前駆体（放射性ラベルされた生成物）の使
用が提供される。放射性ラベルされた生成物を生成する
ための方法により形成された安定した中間体がまた、提
供される：投与の十分前で、放射性ラベルされた生成物
の製造を完結することが所望される場合（但し、放射性
ラベリング段階を除＜）、そのような中間体が有用であ
り、その結果、投与のすぐ前で、放射性ラベリングのみ
が行なわれる必要がある。

金属放射性核種によりラベルされたタンパク質前駆体は
、選択されたタンパク質前駆体、ジスルフィド還元剤に
よる該選択されたタンパク質前駆体の処理、及びその後
、放射性核種により放射性ラベルされることから形成さ
れるであろう。

そのタンパク質前駆体とは、タンパク質、ポリペプチド
、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質又
は同様のものであろう。免疫グロブリン（抗体）、ポリ
クローナル又はモノクローナル抗体のいづれか又はその
特異的結合性フラグメントが特に興味の対象である。タ
ンパク質前駆体は、通常、少なくとも１□ＯＯＯＭＷ、
より普通には少なくとも約２．ＯＯＯＭＷ、一般的には
約１．６ＭＤａ　Ｉよりも小さく、より普通には約８０
０ＫＤａｌよりも小さいであろう。そのタンパク質前駆
体は、少なくとも１つの影響されやすいジスルフィド結
合を有することによって特徴づけられるであろう。

“影響されやすい”とは、還元に基づいて、チオール基
が金属放射性核種と結合するために得られることを意味
する。これは、実験的に決定され得る。

種々の金属が放射性核種として使用され得る。

これらの金属は、銅、たとえば”Ｃｕ　　；テクネチウ
ム、たとえば”＠Ｔｃ　　；レニウム、たとえばＩｌｌ
″Ｒｅ及び１ｌｌｓＲｅを含み；これらは一般的に、Ｈ
処理されたタンパク質前駆体と反応する場合、イオン、
たとえば６１Ｃｕ２＋、９９′″Ｔｃ＝Ｏ’°。

１１１＆、　Ｉ　ａｍ　Ｒｅ＝　Ｏ！３＋としてＨ処理
された生成物と反応するであろう。

タンパク質前駆体は、放射性核種の使用の性質に依存し
て広く異なる。従って、その化合物は、リガンド又は受
容体であることができる。リガンドは、ホルモン、リン
フ才力イン、成長因子、等のような種々の化合物、特に
表面膜受容体に結合する化合物（ここで該複合体は、そ
の表面に結合したまま残存し又はエンドサイト−シスさ
れる）を含むことができる。受容体の中には、表面膜受
容体、抗体、酵素、天然に存在する受容体、レクチン及
び同様のものがある。免疫グロブリン又はそれらの同等
物（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）、、Ｆｖ　、Ｔ
−細胞受容体、等を含む）が興味の対象である。

一般的に、選択されたタンパク質性ｖＡ質は、一般的に
約５〜８のｐＨ、典型的には６〜７のｐｌ＋の水性培地
中で、理論上過剰のジスルフィド還元剤、たとえばジチ
オトレイトール（ＤＴＴ）により処理され、そしてその
反応は、その選択されたタンパク質前駆体のすべてが還
元剤と反応するように十分な時間、進められるであろう
。通常、その時間は、約１５分〜約６時間であり、そし
て温度は約Ｏ〜５０℃、普通約４０℃を越えず、そして
好ましくは約２５℃であろう。特別な条件は、特定のタ
ンパク質前駆体、ｐｌ＋及び同様のものに従って選択さ
れるであろう。

ＤＴＴは、タンパク質前駆体の処理のために好ましい試
薬であるが、メルカプタン基又は一対のメルカプタン基
を含む他の還元剤、たとえば水素化ホウ素ナトリウム、
ナトリウムホスホロチオエート、ジチオエリトリトール
（ＤＴＥ）　、２−メルカプトエタノール、システィン
、Ｎ−アセチルシスティン及びグルタチオンも使用され
得る。

タンパク質前駆体のジスルフィドの還元の後、その還元
剤は通常、放射性核種との複合体化を妨ぐために、そし
ていづれか反対の生理学的効果を避けるために除去され
るであろう。反応しなかった及び古い還元剤の除去は、
種々のクロマトグラフィー法、たとえば５ｅｐｈａｄｅ
ｘゲル処理法、微孔性濾過法、遠心分離法、等を用いて
便利且つ効果的に達成され得る。特別な分離の方法は、
本発明に臨界ではない。

特定の金属に依存して、種々の条件及び技術がＨ処理生
成物のラベリングのための金属放射性核種類を調製する
ために使用されるであろう。テクネチウム類を用意する
ために、ナトリウムペルテクネテートを、通常の条件下
で還元剤、たとえば錫イオン又は亜ジオチン酸の存在す
る溶液中で反応せしめる。好ましくは、弱いキレート剤
を、培地（たとえばタルトレート、グルコヘプトネート
、等を含む）中で誘発せしめ、それによって還元された
Ｔｃ−９釦の不安定な可溶性複合体を形成する。ラベリ
ングのためのレニウム類は、９５℃で製塩酸中次亜リン
酸を用いてベルレネートをレニウム（ｒＶ）へキサクロ
リドに還元することによって形成され得る。次に、ヘキ
サクロロレネートを、室温で酸素を含む９０％エチレン
ジアミン中でビス（エチレンジアミン）ジオキソレニウ
ム（Ｖ）に転換する。次に、そのビス（エチレンジアミ
ン）ジオキソレニウム（Ｖ）複合体を、蒸発又は再結晶
化によって回収し、そしてエチレンジアミンを、加熱し
ながら真空下で除去する。選択されたＨ処理生成物を放
射性ラベルするために適切な放射性鋼を、氷酢酸中に酸
化銅（Ｃｕｂ）を溶解し、そして酢酸銅を得るために酢
酸を蒸発することによって形成することができ、そして
次にラジオラベリングのために水に溶解することができ
る。

金属放射性核種の不安定複合体をまた、Ｈ処理生成物と
の複合体形成のために放射性核種の源として使用するこ
とができる。たとえば、Ｔｃ　−９９ｍグルコネート、
グルコヘプトネート、タルトレート、マロネート、又は
同様のものを使用することができる。同様に、放射性核
種の弱いキレート複合体、たとえばビス（エチレンジア
ミン）塩化第■銅、ビス（アクロ）−エチレンジアミン
硫酸銅又は硝酸銅及び同様のものも使用することができ
る。

典型的には、選択されたＨ処理タンパク質前駆体又は生
成物は、生理学的に許容できる培地、たとえば水又は適
切な緩衝溶液中に適切な放射線投与レベルを得るための
十分な量の放射性核種をまず、溶解することによって、
選択された金属放射性核種により放射性ラベルされ；次
に、適切な緩衝液中選択されたＨ処理生成物が添加され
る。好ましくは、その反応溶液又は緩衝液は、約５〜１
０の範囲のｐＨを有し、そしてその反応は、Ｈ処理生成
物のすべてを金属放射性核種と複合体化するために、十
分な時間、進められるであろう。通常、反応時間は、約
３０分〜約６時間であり、そして温度は約Ｏ〜約６０℃
、よりｔｉｆｆｌには約り５℃〜約５０℃の範囲である
。

■１処理生成物は、放射性ラベリングが必要なまで、貯
蔵のために種々の方法で安定化され得る。

たとえば、還元剤による処理の後、その■１処理生成物
は、約−１０℃以下、普通約−２０°Ｃで脱塩溶液中で
冷凍され得る。貯蔵のためには、周囲温度又は換算温度
で既知技法に従ってＨ処理生成物を個々の殺菌したバイ
アル中で凍結乾燥することがより便利であるとわかるで
あろう。最とも便利には、Ｈ処理生成物は、不安定な錯
生成剤又はスルホヒドリル基誘導体化剤のいづれかによ
り安定化される。次に、その安定化された１（処理生成
物は、後での使用のために凍結され、より好ましくは、
貯蔵のために無菌状粉末として凍結乾燥されるであろう
。

典型的には、Ｈ処理生成物の金属イオン安定化に関して
は、還元剤と選択されたタンパク質前駆体との間の反応
の完結後すぐに、理論的に過剰量の比較的弱い結合性金
属イオンの水溶液又は緩衝液が、添加されるであろう。

好ましくは、使用される金属イオンは亜鉛イオン（Ｚｎ
”°）であるが、しかし他の二価又は三価の金属イオン
、たとえばカルシウムイオン、マグネシウムイオン及び
同様のものも使用され得る。前記金属イオンの種々の弱
く結合した陰イオン性塩も使用され得る。安定した陰イ
オンは、クロリド、ヨーシト、ホスフェート、グリシネ
ート、アセテート、グリコネート、マロネート及び同様
のものを含むことができる。

その金属イオン及びカウンターイオンは、生物学的に許
容されるべきであり；安定化されたＨ処理生成物が処理
される場合、毒性金属イオンは、放射性ラベリング及び
投与の前、イオン交換樹脂として使用されるに過ぎない
。金属イオン安定性Ｉ］処理生成物は、典型的には、■
１処理生成物の放射性ラベリングと同じ方法で、金属放
射性核種により放射性ラベルされる。その安定化金属イ
オンは、使用される特定の放射性核種との急速な交換の
ために選択されるであろう。その安定化金属イオンは、
金属放射性核種が該安定化イオンよりもＨ処理生成物に
一層強く結合するように選択されるであろう。

他方、Ｈ処理生成物は、スルホヒドリル基誘導体化剤に
よる、ジスルフィド結合へのビス（スルホヒドリル）成
分の再結合によって、不活性化に対して安定化され得る
。好ましくは、そのスルホヒドリル誘導体化剤は、還元
剤による処理に基づいて形成されるスルホヒドリル基と
反応し、そして放射性ラベリングのために除去できるよ
うに選択される。しかしながら、いくつかの金属放射性
核種、たとえばｌ＋　？　Ｃｕ　２　”イオンのために
は、放射性ラベリングの前、誘導体化された基の除去が
不必要であるように誘導体化剤を選択することが可能で
ある。好ましくは、スルホヒドリル基は、シアネート（
ＯＣＮ−）イオンを用いて３．ｆｆｉ　８体化され；他
の可能な誘導体化剤は、無水酢酸、Ｎ−アセチルイミダ
ゾール、無水マレイン酸、無水琥珀酸、スルフイツトイ
オン、トリニトロベンゾスルホン酸及び同様のものであ
る。

シアネートは、タンパク質のスルホヒドリル基のための
可逆的且つ特異的な変性剤として有用であるＣＧ、Ｒ，
５ｔａｒｋ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　（１９６４
）　　２３９　：１４１１）。わずかに酸性条件（約ｐ
ｌ＋　６　）下で、ＫＮＣＯは、特別にタンパク質のス
ルホヒドリル基と反応し、Ｓ−カルバミルシスティンを
形成する。これらの条件下で、アミノ基及びグアニジニ
ル基との反応は最少である。Ｓ−カルバミルタンパク質
の出発のスルホヒドリル及びシアネートへの分解は、ア
ルカリ触媒され、そしてｐ１１８及びそれ以上で容易に
起こる。従って、シアネート保護された、ＤＴＴ処理抗
体は、放射性核種によるラベリング又は“活性化”の前
、アルカリへの短時間の暴露によって“活性化”され得
、そして放射性ラベリングは、アルカリ性ｐＨで同時に
行なわれ得る。たとえばＴｃ−９９ｍ−タルトレートラ
へリングは、ｐ１１８〜１０で行なわれ、そしてシアネ
ート保護タンパク質が従来の活性化を伴わないで放射性
ラベリング反応に添加される。

対象の放射性ラベルされた生成物は、放射性）亥種が所
望される特定の部位に依存して、リンパシステム又は同
様のシステム中にｍ人するために、静脈内、動脈内、腹
膜内、腫瘍内、皮下内に注射することによって咄乳頻宿
主に投与され得る。−般的に、宿主中に注射されるべき
量は、宿主の大きさに依存して約１〜３０００μＣ４／
宿主のｋｇであろう。ヒトのためには、その投与量は、
普通約１０〜５０ｍ　Ｃｉ　／　７０　ｋｇ宿主テアリ
、ヨリ好マシ＜は約２５〜３５ｍ　Ｃｉ　／　７０　ｋ
ｇ宿主であろう。下等哺乳類、たとえばマウスのための
投与量は、生物分布研究のためには約２５〜１００μＣ
ｉであり、ところがイメージング研究のためには１００
０μＣｉまで又はそれよりも高い投与量であろう。放射
性核種の投与の後、その目的に依存して、宿主は、検出
又は治療のために１種々の方法で処理され得る。

次の例は、例示的であって、限定するものではない。

劃−」− ＤＴＴ処理されたタンパク質前駆体の調製。

ａ０皿Ｐ、れたモノクロ−ルー　の１゜１゜ リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ　；　０．０５Ｍのホスフェー
ト、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐｌ＋７．５　”）
　２．５　ｍｊ！中マウマウスモノクローナル抗体２５
曙液に、ＰＢＳ中、ＤＴＴの比較的濃溶液を添加し、１
ｍＭの最終ＤＴＴ？震度にした。得られた溶液を、室温
で３０分間、攪拌した。

全反応混合物を、ＰＢＳにより前もって平衡化された５
ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　　２５　（１，５ｃｕ＋　Ｘ　
５．　Ｑ　ｃｒｌｌのプラスチックカラム、ＰＢＳによ
り溶離される）上で精製し６、そして１．２ｒｒｌの両
分を集めた。０．１よりも大きな吸光度（２８０ｎｍ）
を有する脱塩された両分を、−緒にし、小さなバイアル
中にアリコートし、そして−２０℃ですぐに凍結した。

ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによるその反応混合物の分析（例８）
は、プールされた両分中に七ツマー抗体のみの存在、及
び従って集合の不在性を示した。

ｂ、ＤＴＴ几　されたヒト面？１アルフ゛ミンのれ製。

ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）６．０■及びリン酸緩衝
溶液（ＰＢＳ　；　０．０５Ｍ　（５０ｍＭ）のリン酸
ナトリウム；０．１５Ｍの塩化ナトリウム；　ｐＨ７，
５）　　１．２ｍＭの溶液に、ＤＴＴの比較的濃溶液を
添加し、１ｍＭの最終Ｄ　Ｔ　Ｔ　？Ｗ度にした。室温
で１５分間、攪拌した後、その反応混合物を、例１ａに
要約された方法に従って、５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２
５カラムから溶離することによって脱塩した。そのタン
パク質含有性画分をプールし、小さなバイアル中にアリ
コートし、そして−２０℃で凍結せしめた。

Ｄ　Ｔ　’Ｔ”処理されたタンパク質前駆体を貯蔵する
ためのもう１つの方法は、下記に述べられている。

五−１ ＤＴＴ処理されたタンパク質前駆体の放射性ラベリング
。

Ｔｃ　　９９ｍ−タルトレートの？容液を、５ｎＣ１２
１００、＋１ｇ（約０．４３μモル）、酒石酸二ナトリ
ウム７５曙（約０．３２ｍモル）及びナトリウム（Ｔｃ
　−９９ｍ）ペルテクネテート３．２　ｍ　Ｃｉ中に、
９％エタノールを含むカズ抜きされた蒸留水１，１ｍｆ
ｆを添加することによって調製した。この混合物を、１
５分間、水浴中で５０℃で加熱した。冷却した後、別の
容器中に、Ｔｃ　　９９ｍ−タル１−レート１００μｍ
、０．２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８、０）２
００μｌ及び例１におけるようにして調製され、そして
使用するすぐ前に融解された、ＤＴＴ処理された抗体１
００μｇを混合した。その溶液の合計体積を、０．１５
Ｍの塩化ナトリウムの水溶液により０．５ｍｊ！に調整
し、そして５０℃で６０分間、インキエベートした。得
られた溶液のＩＩＰＬＣ分析（例８）は、モノマー抗体
の存在を示し、そして集合がラベリング法によって引き
起こされなかったことを指摘した。

例７の方法に従っての反応生成物の分析は、８４％のＴ
ｃ−９９ｍが抗体に結合されたことを示した。類似する
実験を、抗体をＤＴＴ処理しないで行ない；その反応生
成物の分析は、１８％のみのＴｃ−９９ｍが抗体に結合
されたことを示した。

この実験を、ＧｌｕｃｏｓｃａｎＴ１４キット（Ｎｅｗ
　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒｓケンブリッヂ、マサ
チューセソツ）を用いて行なった。Ｇｌｕｃｏｓｃａｎ
”バイアルを、ナトリウム（Ｔ　ｃ　−９９ｍ）ペルテ
クネテート３ｍＣ１及び十分な０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液により再構成し、１．０ｍｌの最終体積を得た
。そのバイアルを室温で１５分間、保持した。別々に、
０．２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋　６．０　
）　　２００μｌ、上記で調製されたＴｃ−９９ｍ−グ
ルコヘプトネート溶液１００μｌ及び例１におけるよう
にして調製された、ＤＴＴ処理された抗体１００μｇを
混合した。

その合計体積を、０．１５Ｍの塩化すトリウム溶液によ
り０．５ｍｊ！に調整し、そして５０℃で６０分間、イ
ンキュベートした。ＩＥＰＬＣ分析は、七ツマー抗体の
みの存在を示した。例７の方法に従ってのその反応生成
物の分析は、９５％のＴｃ−９９ｍが抗体に結合された
ことを示した。ＤＴＴにより処理されなかったが、しか
し同じＴｃ−９９ｍグルコペプトネートラベリング法に
ゆだねられた抗体は、抗体への６％のみのＴｃ−９９ｍ
の結合をもたらした。

Ｃ０ＤＴＴ几ｒ　れたＨ３Ａ（７）　　；　　−べ’７
１・ バイアル中に、例２ａに従って調製されたＴｃ−９９ｍ
タルトレート？８液１００μβを、例１ｂの方法に従っ
て調製された、ＤＴＴ処理されたｌ５Ａ１００μｇ及び
０．２　Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）２
００μｌと共に混合した。その溶液の合計体積を、０．
１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液により０．５ｍｌに調整
し、そして５０°Ｃで６０分間、インキュベートした。

例７の方法に従ってのその反応生成物の分析は、８９％
のＴｃ　　９９ｍがＩ　Ｓ　Ａに結合されたことを示し
た。

炭−１ 放射性ラベルされたＤＴＴ処理抗体の安定性。

ＤＴＴ処理された抗体を、例１の方法に従って調製し、
そして例２ａの方法に従ってＴｃ　−９９ｍタルトレー
トによりラベルした。例７の方法に従ってのその反応生
成物の分析は、９５％のＴｃ　−９９ｍがこの方法によ
って抗体に結合されたことを示した。ジエチレントリア
ミンペンタ酢酸（ＤＴｒ’Ａ）を、ラベルされた抗体の
溶液に添加し、２■／ｍｌの最終濃度にした。従って、
ＤＴＰＡ、（すなわちテクネチウムの有効なキレート剤
）は、過剰に存在した。その得られた溶液を水浴中で５
０℃で６０分間、加熱した後、例７に従っての分析は、
初めから結合されているＴｃ−９９ｍの９７％がＤＴＰ
Ａによる処理の後、結合したままで残存したことを示し
た。

■−土 亜鉛イオンにより安定化されたＤＴＴ処理抗体（Ｚｎ　
−ＤＴＴ処理抗体）の調製。

ａ、゛・１の亜　イオンの２、夫を″わないで。

ＤＴＴにより処理された抗体を、例１の方法に従って調
製した。但し、最終調製物を凍結しなかった。塩化亜鉛
（ＺｎＣＩ！　２）の水溶液を、すぐＤＴＴ処理抗体の
溶液に添加し、０．１ｍＭの最終亜鉛イオン濃度を有す
る溶液を得た。この溶液を、さらに使用するまで室温で
貯蔵した。

ｂ、ｕの　　イオンの・　。

例１の方法に従った。但し、塩化亜鉛の水溶液を、元の
反応混合物に添加し、０．１ｍＭの最終亜鉛イオン濃度
を得た。その得られた溶液を、前もってＰＢＡにより平
衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−２５カラム上で
脱塩した。抗体を含む両分を、室温で貯蔵した。

Ｃ０灯肛血生。

例４ｂの方法の後、亜鉛イオンによってのみ処理された
抗体を特徴づけるために、ＤＴＴの除去を行なった。

■−エ 亜鉛イオンにより安定化された抗体の放射性ラベリング
。

処理されていない抗体、ＤＴＴ処理された抗体（例１）
、Ｚｎ−ＤＴＴ処理された抗体（例４）、脱塩された、
Ｚｎ　−ＤＴＴ処理された抗体（例４ｂ）及び対照抗体
（例４ｃ）の溶液のそれぞれを、例２ａの方法に従って
Ｔｃ−９９ｍタルトレートによりそれぞれ放射性ラベル
した。このラベリング法は、個々の溶液の調製の後、す
ぐ行なわれた。第２シリーズの放射性ラベリング実験を
、２４時間室温で５つの溶液のそれぞれの貯蔵の後、行
なった。１０の溶液のそれぞれを、結合されたＴｃ　−
９９ｍの％のために例６の方法に従って分析した；その
結果は第１表に示される。

■一旦 放射性う・＼リング度の分析。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、タンパク
質放射性う・＼リング度を決定した。シリカゲル含浸さ
れたグラスファイバーシートを、Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉ
ｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、ミシガ
ンから得、そして製造説明書に従って活性化した。その
放射性ラベリング反応混合物の２〜５μｌアリコートを
、スポットし、そしでＴＬＣストリップを、０゜６５Ｍ
の酢酸アンモニウム、２５％メタノール中で、展開せし
めた。そのＴＬＣストリップを半分に切り、そしてそれ
ぞれ半分を、適切な放射性核種のために調整された放射
能カウンターにより計数した。タンパク質及びタンパク
質結合放射能は、原点で残り、そして非タンパク質放射
能は、溶媒面を移動する。タンパク質の放射性ラベリン
グ度を、次の式を用いて計算した： 以下余白 結合された％タンパク質＝ これらの結果から、いくつかの観察が行なわれ得る。抗
体のＤＴＴ処理は、Ｔｃ　　９９ｍとの放射性ラベリン
グ度をひじょうに高める。しかしながら、ＤＴＴ処理さ
れた抗体溶液が２４時間、室温で保持される場合、結合
されるＴｃ−９９ｍ度は、処理されていない抗体に結合
されるＴｃ−９９ｍ度よりも高くない。これは、ＤＴＴ
処理が抗体中のジスルフィド結合を減じ、ビス（スルホ
ヒドリル）成分（室温で２４時間内に元のジスルフィド
結合を形成するために再結合する）を産生ずるという仮
説を示し、そして支持する。

Ｚｎ　−ＤＴＴ処理された抗体の調製後放射性ラベリン
グの効率は、本質的に、Ｚｎ”添加しないでのラベリン
グの効率と同じである。しかしながら、亜鉛イオンによ
る付加処理は、スルホヒドリル基の酸化を効果的に妨げ
、従って、ＤＴＴ処理された抗体を安定化し、そして臨
床的に所望される場合、放射性ラベリングのために本発
明の方法及び組成物の使用を促進する。その放射性ラベ
リング効率は、Ｚｎ　−ＤＴＴ処理された抗体が過剰の
亜鉛イオンを除去するために脱塩化されてもいずれにせ
よ、使用される亜鉛イオン濃度で本質的に同じである。

ＤＴＴ処理を伴わないでの亜鉛イオンによる抗体の処理
は、実際に、放射性ラベリング効率を低下せしめる。

［ 集合の高性能液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）分
析。

サイズ排除＋１ＰＬｃを、東洋ソーダＴＳに３０００カ
ラム、７、５　ａｓ　Ｘ　３０　ｃｍ　（ＫｒａＬｏｓ
、　Ｉｎｃ、＋　Ｒａｍ５ｅｙ、　ＮＪから入手できる
）を用いて行なった。そのカラムを、１．０ｍｌ／分で
０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０、２　Ｍ−のリン
酸ナトリウム溶液（ｐＨ７，０）により溶離した。カラ
ム溶離剤を、直線ＵＶ検出器及び直線放射能検出器の両
者を用いて、モニターした。

そのカラムを、適切なタンパク質分子橙標準を用いて調
整し、そしてその対照は、放射性ラベリングする前の研
究下のタンパク質であった。

ＤＴＴ処理された抗体（２５ｍｇ）を、例１の方法に従
って用意した。但し、その反応混合物を、０．０５Ｍの
リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ−の塩化ナトリウム溶液
（ｐｌ＋　６．０　）により前もって平衡化された５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２５上で精製した。クロマトグラ
フィー処理後、すぐに、シアン化カリウム５ｍｇ／ｍ１
水溶液６０μｌを添加し、そしてｐＨを、ＩＭ−の酢酸
の添加によって６．０に維持した。３０分後、その溶液
を、ＰＢＳにより前もって平衡化された５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　　Ｇ　−２５上で脱塩した。タンパク質を含む両分
を集め、約１０■／ｍｌに濃縮し、そして４°Ｃで貯蔵
した。シアネート保護の抗体を、例２ａの方法に従って
、Ｔｃ−９９ｍ−タルトレートによりラベルする。

五−エ Ｔｃ　　９９ｍによりラベルされた“Ｈ−処理化成物”
のヒトＦＭＸ−Ｍｅｔ　ＩＩ腫瘍細胞への結合。

ＤＴＴ処理及び続いてＴｃ−９９ｍラベリングが目標と
する抗原を結合するために抗体成分に対して有する効果
を、細胞結合アッセイによって評価した。そのアッセイ
は、Ｔ、　Ｌｉｎｄｍｏ−、など、。

Ｊ、ｏｆ　Ｉｌｌｌｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　（１９
８４）　７２　：　７７〜８９によって記載されている
アッセイの変形であった。放射性ラベルされた９、２．
２７抗−黒色腫抗体を、過剰抗原の状態を表わすように
予定された、固定された濃度のヒ）　Ｉ’ＭＸ−Ｍｅｔ
　ＩＩ黒色腫腫瘍細胞と共に２時間、インキュベートし
た。その腫瘍細胞への放射性ラベルされた抗体の非特異
的結合のための対照として、腫瘍細胞を、２００倍過剰
の放射性ラベルされていない同じ特異性の抗体の存在下
で少なくとも１時間、ブレインキュベートした。目標細
胞及び放射性ラベルされた抗体のインキュベーションの
後、放射能のレベルを、γウェルカウンターにより定量
した。この方法における９、２．２７モノクロ一ナル抗
体の分析は、約７６％の目標細胞への抗原特異性結合を
示し、そして４％よりも少ない非特異性結合成分を示し
た。

本発明の組成物及び方法を用いることによって、それら
の本来の状態でジスルフィド結合を含むタンパク質前駆
体を急速に放射性ラベルすることができ、且旦±で使用
するために放射性核種により置換された試薬を提供する
ことができる。その試薬は、純粋形及び良好な収率で提
供され得る。

放射性ラベリングは、タンパク質前駆体が変性も集合も
しない温和な条件下で効果的に行なわれる。

さらに、ＤＴＴにより処理することによって提供された
反応性タンパク質前駆体は、周囲温度で長期貯蔵のため
に安定化され得、そして次に、必要な場合、投与のすぐ
前で放射性ラベルされ得る。

従って、低レベルの放射能のみが非特異的に指図され、
そして結合されるであろう目的の部位に放射性核種を安
全に向けることができる。本発明の組成物及び方法は、
そのようにラベルされたタンパク質前駆体の生物学的活
性に対する効果を最少にしながら、対象の生理学的特性
を有する、安定に放射性ラベルされたタンパク質性組成
物を提供する。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができることは当業者
に明らかである。従って、その説明及び例は、本発明の
範囲を限定するものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも１つのジスルフィド結合を有するタンパ
   ク質前駆体から金属放射性核種によりラベルされたタン
   パク質を調製するための方法であって： ジメルカプトタンパク質を形成するために前記タンパク
   質前駆体とジスルフィド還元剤とを反応せしめ； 精製されたジメルカプトタンパク質を提供するために古
   いジメルカプトタンパク質及び反応しなかった還元剤を
   除去し；そして 前記放射性核種によってラベルされたタンパク質を形成
   するために、実質的にタンパク質前駆体を含まない、前
   記精製されたジメルカプトタンパク質と金属放射性核種
   とを組合せることを含んで成る方法。 ２、前記タンパク質前駆体がモノクローナル又はポリク
   ローナル抗体又はその特異的結合フラグメントである特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、誘導体化されたタンパク質を得るために、前記精製
   されたジメルカプトタンパク質と弱配位カチオンとを反
   応せしめる段階をさらに含んで成る特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ４、メルカプト基に再生できる誘導体化されたタンパク
   質を調製するために前記精製されたジメルカプトタンパ
   ク質とメルカプト基のための誘導体化剤とを反応せしめ
   、そして前記組合せ段階の前、前記ジメルカプトタンパ
   ク質を再生する段階をさらに含んで成る特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ５、前記金属放射性核種が＾９＾９ｍＴｃ、＾１＾８＾
   ６Ｒｅ、＾１＾８＾８Ｒｅ又は＾６＾７Ｃｕを含む特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ６、特許請求の範囲第２項記載の方法による生成物。 ７、貯蔵安定性の金属放射性核種複合タンパク質を調製
   するための方法であって： ジメルカプトタンパク質を形成するために、ジスルフィ
   ド還元剤とジスルフィド含有タンパク質前駆体とを反応
   せしめ；そして 精製されたジメルカプトタンパク質を提供するために古
   い前記ジメルカプトタンパク質及び反応しなかった還元
   剤を除去することを含んで成る方法。 ８、前記タンパク質前駆体がモノクローナル又はポリク
   ローナル抗体又はその特異的結合性フラグメントである
   特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、ジメルカプトタンパク質に再生できる誘導体化され
   た生成物を調製するために、前記精製されたジメルカプ
   トタンパク質とメルカプト基のための弱い結合性カチオ
   ン又は誘導体化剤とを反応せしめる段階をさらに含んで
   成る特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、特許請求の範囲第７、８又は９項記載の方法によ
   る生成物。