JPH10501220A - 放射性核種による放射性免疫検出および放射性免疫療法のためのタンパク質のチオール化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 その一端においてタンパク質と反応することができるとともに、その他端において放射性核種と複合体形成することのできる保護第三級チオール含有二官能キレート化剤を、タンパク質に接触させてタンパク質とアセチル−ｔ−チオール基を含有する接合体を生成する。次に、タンパク質とアセチル−ｔ−チオール基を含有する接合体を脱保護し、次の工程で添加される放射性核種のための還元剤とを混合して還元剤とタンパク質−ｔ−チオール基含有接合体との混合物を調製する。この混合物を放射性核種と反応させてその放射性核種をタンパク質とｔ−チオール基を含有する接合体上に存在する側鎖スルフヒドリル基と反応させる。ヒトの患者に投与すべき組成物を製造するのに好適な診断キットおよび放射性免疫療法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 放射性核種による放射性免疫検出および放射性免疫療法のための タンパク質のチオール化１．発明の分野 本発明は、第三級チオール含有キレート化剤を用いてタンパク質上にスルフヒ ドリル基を発生させることによりスルフヒドリル基に強力に結合する放射性核種 の放射性金属イオンでタンパク質を放射性標識化(radiolabeling)するための１ 個のバイアルによる方法（単一バイアル法）およびキットに関する。第三級チオ ール含有キレート化剤を用いることにより、放射性核種で標識化されるフリーな スルフヒドリル基を発生するように脱保護され得るｔ−チオール含有誘導体を含 むタンパク質が提供される。２．関連技術の記載 還元された過テクネチウム塩(pertechnetate)からのＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１ ８６およびＲｅ−１８８イオン、Ｃｕ−６７イオン、Ｈｇ−１９７イオンおよび Ｂｉ−２１２イオンを含む特定の放射性金属は、イオウのリガンドに強力に結合 することが知られている。これら放射性金属の一部は、タンパク質、特に抗体ま たは抗体フラグメントに結合されていた。テクネチウム９９ｍは、その核特性故 にシンチグラフィー画像化に理想的な放射性核種である。テクネチウム９９ｍは 、単一光子エネルギーが１４０ｅＶであり、半減期が約６時間であり、⁹⁹Ｍｏ−^99m Ｔｃ発生剤から容易に得られる。 周期表においてテクネチウムの下の元素であるレニウムは、同様の化学的性質 を有しており、類似の技術を用いてタンパク質の標識化に用いることができる。 レニウムの同位体は３４種程あり、特にそのうちの二つ、すなわちレニウム１８ ６（ｔ_1/2＝９０時間、ガンマ１３７ＫｅＶ、ベータ１．０７ＭｅＶ、０．９３ ＭｅＶ）とレニウム１８８（ｔ_1/2＝１７時間、ガンマ１５５ＫｅＶ、ベータ２ ．１２ＭｅＶ）が、モノクローナル抗体手法を用いる放射性免疫療法のための主 な候補である。 抗体または抗体フラグメントのようなタンパク質を放射性金属で標識化するた めに一般的に二つの方法が用いられる。第１の手法は、放射性金属をタンパク質 分子に直接結合させる直接標識化法である。直接標識化は、タンパク質を還元さ せてフリーなスルフヒドリル基を発生させ、次に還元された放射性核種をフリー なスルフヒドリル基に直接結合させることを含む。タンパク質の直接標識化は、 「予備錫引(pre-tinning)」と呼ばれる、厳しい条件と長い「予備錫引」時間を 要するプロトコールを用いてなされるが、１００％の組み込み率での放射性標識 化は達成されていなかった。クロックフォード（Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄ）らの米国 特許第４，３２３，５４６号明細書(また、同第４，４２４，２００号明細書)を 参照されたい。このプロセスにおいて、極めて多量の第一錫イオンが長期間存在 することにより抗体の免疫活性が弱まる。このプロセスは、また、通常、標識化 後の精製カラムの使用を必要とした。他の直接標識化法は、別々のバイアル、す なわち、抗体用のものと、リン酸塩および／またはホスホン酸塩のようなトラン スキレート化剤に複合体形成する第一錫イオン用のものとを必要としていた。 直接標識化法に関するもう一つの問題は、^99mＴｃおよび／またはレニウムで 直接標識化された抗体が生体内で不安定である、すなわち、標識化された抗体を 血流中に注入したときに放射性核種の多くの部分が標識化された抗体からかなり 迅速に遊離することである。標識化された抗体を外部画像化に用いると、この不 安定性により、放射性標識化抗体が局在化するする位置以外の位置において放射 活性が蓄積される。このことは、放射性同位体の非特異的分布故にバックグラウ ンドの放射能が増加し、そして局在化された放射活性が弱まることにより、その 方 法の解像度を低下させる。ローデス(Rhodes)らのTUMOR IMAGING，第１２章，１ １１〜２４頁（Mason Publ.，米国，１９８２年）には、^99mＴｃで直接標識化さ れた不安定抗体を、手間のかかる透過クロマトグラフィー法を用いて精製し得る ことが開示されているが、これも、タンパク質を直接放射性標識化する方法をよ り複雑なものとする。最後に、残存するテクネチウムは、それ自体も、そのコロ イドとしても、除去することが困難であり、いずれも望ましくない非特異的なバ ックグラウンド放射に寄与する傾向がある。 タンパク質を放射性標識化する第２の方法は、複合化剤をタンパク質に結合さ せ、複合化剤を介して放射性金属をタンパク質に結合させる間接法である。複合 化剤は、典型的に、一端に、還元された放射性核種と複合体形成することのでき るフリーなまたは保護されたスルフヒドリル基、および他端に、タンパク質と反 応することのできる基を含む。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のよう な接合キレート化剤(conjugate chelating agent)を用いる（Khawら、J．Nucl． Med.，２３巻：１０１１〜１９頁（１９８２年））、またはビスチオセミカルボ ゾン類(bis-thiosemicarbozones)等の種々のイオウ／窒素（Ｓ₂Ｎ₂）キレート化 剤を用いる間接標識化法が知られている。KhawらのScience，２０９巻：２９５ 〜９７頁（１９８０年）は、ＤＴＰＡを介してインジウム１１１で標識化された 心臓のミオシンへの抗体、および心筋梗塞を画像化するための標識化抗体の使用 を開示している。また、KrejcarekらのBiochem．Biophys．Res．Commun.，７７ 巻：５８１〜８５頁（１９７７年）；Childs，R.L.およびHnatowich，D.J.，J． Nucl．Med.，２６巻：２９３頁（１９８５年）を参照されたい。さらに最近の方 法として、FritzbergらJ．Nucl．Med.，２７巻：９５７頁（１９８６年）、Baid ooらのCancer Research（補遺），５０巻：７７９ｓ〜８０３ｓ（１９９０年） は、キレート化剤として特定のジアミドジチオールおよびジアミノジチオール基 を用いることを記載している。 これらのキレート化剤は、標識化すべきタンパク質におけるジスルフィド結合 の還元に役立ち得るフリーなチオール基を含む。すなわち、前述の文献に記載の 方法による標識化は、タンパク質における還元ジスルフィド結合において直接的 に、またはキレート化剤上のフリーなスルフヒドリル基において起こり得る。こ れらの方法は、また、典型的に、還元剤を溶液中に維持するためにグルコヘプタ ノエートのようなトランスキレート化剤の使用も含む。従って、Fritzbergらお よびBaidooらにより開示された方法は、実用的でも使用容易でもなく、キレート 化剤にある側基であるフリーなスルフヒドリル基においてキレート化剤を特異的 に標識化することができないおそれがある。 上記の従来のキレート系の間接標識化技術の多くは、複雑なキレート化剤の合 成工程を含み、多くの場合、抗体の放射性標識化を達成するための「予備標識」 手順を必要とする。これらの処理工程があるため、診断の分野において望まれる ことが多い使い易さや実用性といった性質が損なわれることとなる。他の間接標 識化法は、タンパク質のチオール化（Wong，S.S.のCHEMISTRY OF PROTEIN CONJU GATION AND CROSS-LINKING，CRC Press,Inc.，Boca Raton，フロリダ州，１７〜 ２３頁（１９９１年））を含む。McCall，M.J.、Diril，H.、Meares，C.F.のBio conjugate Chem.，１巻：２２２〜２６頁（１９９０年）ならびにGoff，D.A.お よびCarroll，S.F.のBioconjugate Chem.，１巻：３８１〜８６頁（１９９０年 ）に記載されているようなイミノチオラン(iminothiolane)の開環を用いる方法 は、連続的にチオール類を生成する欠点を有しており、その結果、凝集物が形成 され、生成したチオール類を同時に誘導体化することが必要になる。Ｎ−アセチ ルホモシステインチオラクトン（N-acetylhomocysteine thiolactone）の使用も 、同様の問題があると予想される。タンパク質のリシン残基との反応において、 チオール化剤としてＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（S-acetylmercapto succinic anhydride）がしばしば用いられ、次の工程において酢酸チオールがチ オール に転化される。しかしながら、この試薬の使用により、抗体の立体配座および薬 物反応速度に影響のある、チオール化タンパク質の全電荷比が変化する（前記Wo ngらの文献）。（３−アセチルチオプロピオニル）チアゾリジン−２−チオンの ような他の試薬は、脱保護後に、非置換メチレン基に付加するメルカプト基を発 生する。 Deanの米国特許第５，１８０，８１６号明細書は、抗体上のフリーなスルフヒ ドリル基に付加するために第一級チオール基を含むキレート化剤を用いた、テク ネチウムで抗体を放射性標識化する方法を開示している。すなわち、最初に抗体 を還元し開裂してフリーなスルフヒドリル基を発生させるか、または、例えば２ −イミノチオランでタンパク質をチオール化してフリーなスルフヒドリル基を発 生させる。次に、一端に保護されたチオール基を含むキレート化剤を他端におけ る抗体上のフリーなスルフヒドリル基に付加するために用い、次に脱保護し、テ クネチウムとの接触により放射性標識化を行う。Deanのプロセスは、抗体上の抗 原結合部位の過剰のフラグメント化または破壊につながり得る不利益な抗体の開 裂を含んでいる。 Deanは、タンパク質上のアミノ官能基にキレート化剤を結合させるためにＮ− ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用し得ることを記載しているが、フリー なスルフヒドリル基を生成しないタンパク質の間接標識化、すなわち、例えばタ ンパク質上のアミノ官能基へのキレート化剤の付加による標識化は、Deanの第一 級チオール含有キレート化剤を用いて行うことはできない。その理由は、タンパ ク質のアミノ基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボン酸エステルと反応する のみならず、キレート化剤の反対端部における保護された第一級チオールの開裂 も行うからである。この開裂により、生成したフリーなチオール基の早期脱保護 および酸化が生じ、効率的かつ定量的な抗体の標識化が妨げられる。 キレート化剤の使用に関する他の問題は、タンパク質とキレート化剤の接合体 (protein-chelating agent conjugate)を、放射性核種との反応前に錫と接触さ せる単一ポットによる標識化を用いることができないことである。その理由は、 錫の存在がタンパク質におけるジスルフィド結合を還元して、それにより放射性 標識のキレート化剤特異性が破壊され、おそらくはタンパク質の有効性が損なわ れるためである。さらに、放射性核種としてレニウムを用いる免疫療法において 用いた場合、多くのキレート化剤は、腎臓に害のある量にまで蓄積される。画像 化の目的で用いられる、テクネチウムで放射性標識化された全ＩｇＧといった多 くの放射性標識化されたタンパク質は、クリアされて、肝臓に集まる傾向があり 、それにより、多くの腫瘍は体中に転移し得るので、画像化の効率に悪影響を与 える。また、多くの従来の放射性標識化されたタンパク質についての腫瘍対非腫 瘍比は低すぎる傾向があり、それにより画像化の効率に悪影響が与えられる。 すなわち、還元されていないまたはチオール化されていないタンパク質上の非 抗原性結合部位と複合体(complex)を形成することができるキレート化剤であっ て、錫と接触させられたり、続いて凍結または凍結乾燥されたときに放射性標識 化されたタンパク質が更に開裂されないように放射性核種と複合体を形成するこ とができるキレート化剤を用いてタンパク質を標識化する方法を開発する必要が ある。また、側鎖保護チオール基を含む二官能キレート化剤を用いることにより タンパク質を標識化する方法であって、タンパク質上の反応性基が二官能キレー ト化剤上の保護チオール基を早期に開裂しない方法も開発する必要もある。また 、使用するのが簡単で、複雑な合成手順またはタンパク質および還元剤用の複数 の容器を含まず、トランスキレート化剤の使用を含まない方法およびキットを開 発する必要もある。また、放射性免疫画像化または放射性免疫療法に用いるため のタンパク質を放射性標識化する方法であって、画像化の目的で、放射性標識化 されたタンパク質が優れた腫瘍吸収と、低い腎臓吸収を示し、肝臓で完全にクリ アされず、体中に広く拡がり、良好な腫瘍対非腫瘍比を提供する方法を開発する 必要も ある。また、錫が単一ポットでの標識化のキット内に存在していても、その後Ｆ ａｂ’に開裂しないＦ（ａｂ’）₂モノクローナル抗体を放射性標識化する方法 を開発する必要もある。 発明の概要 本発明の目的は、合成容易なキレート化剤を用いてタンパク質を放射性核種で 間接的に放射性標識化するのに有用な方法およびキット、ならびに過剰量の還元 剤の使用を含む複雑な還元手順を含まない方法を提供することにある。また、標 識化タンパク質の使用に先だって臨床家または技術者が用いることができ、放射 性核種用の還元剤での培養中にタンパク質が早期に開裂されない、タンパク質を 間接的に放射性標識化するための１個のバイアルによる方法（単一バイアル法） およびキットを提供することも本発明の目的である。本発明の更なる目的は、放 射性核種がキレート化剤と複合体形成する、タンパク質を間接的に放射性標識化 するための方法およびキットを提供することである。本発明の更なる目的は、放 射性免疫画像化または放射性免疫療法に用いるためのタンパク質を間接的に放射 性標識化する方法およびキットであって、画像化の目的で、放射性標識化タンパ ク質が優れた腫瘍吸収と、低い腎臓吸収を示し、肝臓で完全にクリアされず、体 中に広く拡がり、良好な腫瘍対非腫瘍比を提供する方法およびキットを提供する ことにある。 本発明のこれらのおよび他の目的によれば、（ａ）タンパク質のジスルフィド 結合を開裂することなくその一端においてタンパク質と反応することができると ともに、その他端において放射性核種と複合体形成することのできる第三級チオ ール含有キレート化剤を、タンパク質に接触させてタンパク質とアセチル−ｔ− チオール基を含有する誘導体を生成する工程と、（ｂ）該アセチル−ｔ−チオー ル基を脱保護してフリーなスルフヒドリル基を生成する工程と、（ｃ）脱保護さ れたタンパク質とキレート化剤の接合体(protein-chelating agent conjugate) と 次の工程で添加される放射性核種のための還元剤とを混合する工程と、（ｄ）工 程（ｃ）で得られる混合物を還元可能な放射性核種と接触させる工程とを含んで なるタンパク質を間接的に標識化する方法が提供される。還元された放射性核種 は、脱保護されたタンパク質とキレート化剤の接合体上に存在する側鎖のフリー なスルフヒドリル基と反応する。好ましくは、放射性核種は、この側鎖のフリー なスルフヒドリル基と反応して、５員環または６員環を形成する。 本発明のさらなる目的によれば、単一のバイアル中において、（ｉ）還元可能 な放射性核種のための還元剤と、（ｉｉ）上（工程（ａ）および（ｂ））に記載 の方法により調製したｔ−チオール含有誘導体とからなる混合物（Ａ）を、還元 されていない放射性核種（Ｂ）に接触させることを含んでなる、タンパク質を間 接的に標識化する方法が提供される。 本発明のさらなる目的によれば、（ｉ）次の工程で添加される還元可能な放射 性核種のための還元剤と、（ｉｉ）上記（工程（ａ）および（ｂ））に従って調 製した凍結または凍結乾燥したタンパク質分子のｔ−チオール含有誘導体とから なる混合物を含む単一のバイアルを含んでなる、タンパク質を間接的に標識化す るためのキットが提供される。 本発明のもう一つの態様によれば、腫瘍、感染性病巣、心筋梗塞、クロット、 アテローム性プラーク、または通常の器官もしくは組織を放射性免疫画像化する 方法であって、腫瘍により形成されたまたは腫瘍と結合した抗原に特異的に結合 するとともに外部検出することのできる薬学的に不活性な放射性同位体で放射性 標識化した抗体または抗体フラグメントをヒトの患者に非経口注入し、放射性標 識化抗体または抗体フラグメントが局在化し、ターゲットでないバックグラウン ドがクリアになるのに十分な時間後に、放射性標識化したタンパク質、抗原、ま たは抗体フラグメントの付着部位を外部画像化カメラにより検出する方法であっ て、放射性標識化したタンパク質、抗原、または抗体フラグメントとして、本発 明の方法により製造した標識化したタンパク質、抗原、または抗体フラグメント を用いることが向上点である方法が提供される。請求の範囲の方法により製造し た放射性標識化されたタンパク質は、そのような放射性免疫画像化方法において 用いた場合、肝臓に対するクリアランスおよびターゲット部対非ターゲット部比 等に関する上記の不利益をあまり被らない。 本発明のもう一つの態様によれば、腫瘍または感染性病巣により形成され、ま たはそれらと結合した抗原に特異的に結合するタンパク質を、そのタンパク質の ジスルフィド結合を開裂することなくその一端においてタンパク質と反応するこ とができるとともに、その他端において放射性核種と複合体形成することのでき る第三級チオール含有二官能キレート化剤に接触させて、タンパク質とアセチル −ｔ−チオール基を含有する接合体(protein-acetyl-t-thiol-containing conju gate)を形成する工程（ａ）を含んでなる放射性免疫療法が提供される。次に、 タンパク質とアセチル−ｔ−チオール基を含有する接合体を脱保護し、次の工程 で添加される治療的に有効な還元可能な放射性核種のための還元剤と混合し、還 元剤とこのタンパク質とｔ−チオールを含有する接合体との混合物を形成する。 次にこの混合物を治療的に有効な還元可能な放射性核種と混合し、それによりタ ンパク質とｔ−チオールを含有する接合体上に存在する側鎖スルフヒドリル基と 放射性核種とが反応して放射性標識化したタンパク質とｔ−チオールを含有する 接合体を含む溶液を生成し、それを腫瘍または感染性病巣の害を被っている患者 に非経口的に投与する。そのような放射性標識化されたタンパク質は、過剰腎臓 吸収等に関する上記不利益の害を被らない。 詳細な説明 本発明者らは、タンパク質、例えば側鎖スルフヒドリル基を有する抗体または 抗体フラグメントは、その後に脱保護されてフリーなスルフヒドリル基を生成す る保護側鎖チオール基を含むキレート化剤の使用故に、放射金属イオンを選択的 に結合してスルフヒドリル基に対して強力な結合を形成することができることを 発見した。これらの放射性標識化されたタンパク質は、腫瘍に結合する、過剰の 腎臓吸収を避ける、肝臓に対する過度のクリアランスを避ける、および優れた腫 瘍対非腫瘍比を提供する能力故に、放射性免疫画像化および放射性免疫治療法に 用いたときに非常に効果的である。さらに、放射性標識化する方法は、還元され ていないタンパク質、すなわちＦ（ａｂ’）₂の単一ポットでの標識化を可能に し、それによりタンパク質がキレート化剤に接合され、次に、還元剤がタンパク 質を開裂しない、すなわちＦ（ａｂ’）₂をＦａｂ’にしないような方法で放射 性核種のための還元剤と接触される。本発明者らは、さらに、タンパク質を還元 してそれによりジスルフィド結合を過剰に開裂する危険を侵すまたはタンパク質 の結合特異性を変える必要なく、タンパク質を上記方法で標識化し得ることを発 見した。さらに、本発明者らは、キレート化剤を含む第三級チオールの使用によ り、タンパク質上にフリーなスルフヒドリル基を生成することなく、あるいはタ ンパク質を還元することなく、かつキレート化剤上の保護チオール基を開裂する ことなくタンパク質への結合を行うことができ、それによりフリーなチオール基 の早期の脱保護と酸化損失を防止し得ることを発見した。本発明の方法において 試薬と条件の両方が大いに簡易なものになっており、この方法は、グルコヘプト ネート(glucoheptonate)のようなトランスキレート化剤を利用してまたは単一バ イアルのキットにおいて還元剤として錫を用いることによりテクネチウムまたは レニウム標識化に特に適している。 この明細書を通して、「タンパク質」という用語は、二つまたはそれ以上のア ミノ酸を有するポリペプチドを意味する。有利なことに、「タンパク質」は全抗 体（ＩｇＧ）、およびＦ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’またはＦａｂのような抗体フラ グメントを意味する。これらの全抗体または抗体フラグメントは、還元されたテ クネチウムまたはレニウムイオンのための安定および非安定標識化部位のを含む 。 「非安定部位」（一またはそれ以上の部位であり得る）は、容量が大きいが還元 テクネチウムへの類似性が低い（結合定数は幾分異なるが標識化の目的において はテクネチウムとレニウムの化学的性質は実質的に同じであるので、より一般的 に用いられるテクネチウムイオンを論議するときレニウムイオンが含まれると、 ここ以降において解される。）。この不安定部位は、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメン トの還元^99mＴｃによる全直接標識化の約８５％であり、ＩｇＧの還元^99mＴｃに よる全標識化の７６％である、第２の部位は安定水準を上昇させ、それぞれ１５ ％及び２４％の^99mＴｃによるＦ（ａｂ’）₂およびＩｇＧの全標識化をもたらす 。 本発明者らは、いかなる理論によっても束縛されるつもりはないが、アセチル −ｔ−チオール基含有タンパク質誘導体を生成するために保護された第三級チオ ール含有キレート化剤を用いることによりタンパク質を間接的に標識化すること が、第三級チオール含有キレート化剤の他端における保護されたチオールが早期 に開裂することなくかつタンパク質上のジスルフィド結合を開裂することなく、 抗体上の特異的非抗原結合部位への結合を可能にすると考えている。さらに、本 発明者らは、本発明のタンパク質とキレート化剤の接合体におけるタンパク質の ジスルフィド結合が、単一バイアルキットにおいて放射性核種のための還元剤を 混合した場合、開裂して要求される結合特異性または抗原性を有し得ない小さい フラグメントを形成したり、タンパク質上に側鎖スルフヒドリル基を形成すると いうことがない。従って、本発明のｔ−チオール含有キレート化剤を使用するこ とにより、脱保護されたキレート化剤側鎖スルフヒドリル基について特異的に標 識化することができタンパク質上に存在するフリーなスルフヒドリル基について はいかなるものも標識化しない。いかなる理論にも束縛される意図はなく、本発 明者らは、保護された第三級チオール含有キレート化剤はアシル開裂反応に向上 した耐性を有しており、それによりタンパク質上の反応性官能基、すなわちアミ ノ官能基がチオール基を早期に脱保護することが防止され、本発明のキレート化 剤の使用がタンパク質中のジスルフィド結合の不慮の還元を防止すると考えてい る。本発明の方法は、さらに、実質的に、標識化工程中に望ましくないコロイド の形成を防止し、還元剤の適切な割合と、酸素の排除のもとで、本発明の方法は 、不純物としての残留過テクネチウム塩の蓄積を防止する。 放射性標識化される抗体または抗体フラグメントを含むタンパク質は、腫瘍、 感染性病巣、微生物、寄生虫、心筋梗塞、クロット、アテローム性プラクまたは 通常の器官もしくは組織により生成されまたはそれらと関連した抗原を含むが、 それらに限定されることがない抗原に結合する抗体であり得る。この明細書全体 において、「抗体」または「抗体フラグメント」という用語は、通常、特異的に 抗原に結合して免疫複合体を形成するイムノグロブリンを意味する。これらの用 語は、従来のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等、従来の酵素消化生成物、例え ば、完全なイムノグロブリンのペプシン消化により得られるＦ（ａｂ’）₂フラ グメント、完全なイムノグロブリンのパパイン消化により得られるＦａｂフラグ メント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントおよび完全抗体のジスルフィド結合開裂に よりそれぞれ得られる軽重鎖フラグメントおよび従来の一価Ｆａｂ’、ならびに 、そのようなイムノグロブリンおよびフラグメントに実質的に類似の性質を有す るタンパク質である。そのような類似のタンパク質は、より大きなフラグメント 、遺伝子加工した抗体および／またはフラグメント、および、「従来の」イムノ グロブリンと実質的に同様の方法で抗原に特異的に結合する抗原確認領域を有す る合成タンパク質の更なる消化または処理により得られる抗体サブフラグメント を含む。タンパク質のフラグメントは、フリーなスルフヒドリル基を含む必要が なく好ましくは含むべきでないと解される。 本発明は、全抗体（ＩｇＧ）または抗体フラグメントＦ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ ’、Ｆａｂ、およびより有利にはＦ（ａｂ’）₂モノクローナル抗体のようなタ ンパク質を好ましく標識化する。Ｆ（ａｂ’）₂の直接または間接標識化の典型 的な方 法は、通常、完全抗体のＦ（ａｂ’）₂への還元を含んでいた。しかしながら、 完全抗体の酵素的開裂から生じるＦ（ａｂ’）₂の部分的還元を達成しようとす る試みは、かなりの部分がさらにＦａｂ’まで開裂することに至ることが多く、 また、Ｆ（ａｂ’）₂の存在下において、第一錫イオンで過テクネチウム塩また は過レニウム塩を還元しようとするより最近の試みでさえ、ジスルフィド結合の 還元およびＦａｂ’への更なる開裂により達成され、結果として一部の標識は一 価フラグメントへと失われ、そのような過剰のＦ（ａｂ’）₂のフラグメント化 がその有効性を損なうおそれがあることが、見いだされた。さらに、フリーなス ルフヒドリル基を含むキレート化剤の使用によりジスルフィド基が還元されたり 不慮の開裂が起こり、その結果、一部の標識が、キレート化剤上の側鎖のフリー なスルフヒドリル基と反応する代わりに、その抗体または抗体フラグメントへと 失われる。更なるＦａｂ’開裂生成物が実質的に生成することなく、二官能キレ ート化剤とのＦ（ａｂ’）₂抗体の接合体の製造を向上させるために、驚くべき ことに、そして予想外にも、Ｆ（ａｂ’）₂と保護された第三級チオール含有キ レート化剤との反応によりＦ（ａｂ’）₂の標識化が高い効率で起こることが発 見された。 本発明の方法は、タンパク質を保護された第三級チオール含有キレート化剤と 反応させて少なくとも一つの第三級保護チオール基を含むタンパク質とキレート 化剤の接合体を製造することを含む。第三級チオール含有キレート化剤は、タン パク質に共有結合し、脱保護後にタンパク質と放射性金属との結合に役立つ。そ のような共有結合を行う方法は当業者に良く知られている。例えば、活性エステ ル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはカップリング剤の イソチオシアン酸エステルを用いてそのカップリング剤をタンパク質上のアミノ 官能基に結合することができる。２−ヨードアセチルまたはカップリング剤のマ レイミド誘導体を使用してそのカップリング剤をタンパク質のスルフヒドリル基 に結合することができる。カップリング剤のヒドラジド誘導体を用いてカップリ ング剤をタンパク質上の酸化炭水化物基に結合することができる。または１−エ チル−３−（３−ジアミノプロピル）カルボジイミドのようなカルボジイミド試 薬を用いて、キレート化剤のあるアミノ基をタンパク質上のカルボキシル基に結 合させることができる。アミンおよびカルボキシル基を有する全抗体（ＩｇＧ） およびペプチドが自然に生成する。有利には、本発明の保護された第三級チオー ルを含有するキレート化剤は、抗体上のアミン官能基と複合体を形成する一方、 この抗体は還元またはチオール化されてスルフヒドリル基を生成することはなか った。より有利には、本発明の保護第三級チオール含有キレート化剤は、タンパ ク質上のアミン官能基と複合体を形成し、早期の脱保護を起こしてスルフヒドリ ル基を生じるアミン官能基とキレート化剤上の保護チオール基との反応は起こら ない。 本発明において有用な保護第三級チオール含有キレート化剤は、前述のように タンパク質官能基と安定な結合を形成することのできる求電子部分または求核部 分を含み、かつ脱保護後に所望の放射性核種と複合体形成することができ、タン パク質官能基と反応してチオール基を早期に脱保護することのない少なくとも一 つの保護第三級チオール基を含む複合体形成部分を含む任意のキレート化剤であ る。有利には、第三級チオール含有キレート化剤は、所望の放射性核種と５員環 または６員環の複合体を形成する。より有利には、本発明の第三級チオール含有 キレート化剤は、脱保護されテクネチウムで標識化することのできるアセチル− ｔ−チオール基含有誘導体を形成する。そのようなキレート化剤は、限定されな いが、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）−Ｎ−（３−メチル−３−アシルメ ルカプトブチリル）グリシネート(N-hydroxysuccinimidyl)-N-(3-methyl-3-acyl mercaptobutyryl)glycinate)およびこの化合物とジグリシンまたはトリグリシン との反応生成物を含む。 キレート化剤中に存在するいかなる側鎖スルフヒドリル基も、同じカップリン グ試薬の一部であり得るスルフヒドリル選択性求電子試薬と非相溶性であるので 、キレート化剤の結合中に求電子部分との反応から好適に保護され得る。次に、 保護チオールは、当業者に良く知られた機構を用いて脱保護することができる。 ここで用いる「保護チオール」（保護されたチオール）という言葉は、非反応性 になるようにチオール基が可逆的に誘導されたチオール含有部分を意味する。タ ンパク質基質に結合した後、キレート化部分を脱保護して放射性核種の結合のた めにキレート化官能基を露出することができる。特に、保護チオールは脱保護さ れて。放射性核種と複合体形成することのできる側鎖のフリーなスルフヒドリル 基を発生する。 反応からチオールを保護するのに適した基は、タンパク質の活性を実質的に変 えることなくタンパク質の存在下にフリーなスルフヒドリルを再生するための穏 やかな条件下に容易に除去することのできる有機および無機基である。有利には 、チオール保護基はチオールエステルである。当業者は、チオール基の脱保護お よび保護の手順を良く知っており、本発明の範囲においてそうすることは一般的 技術者が知る範囲に入っている。 本発明の方法は、後に添加される放射性核種を還元するために脱保護されたタ ンパク質とキレート化剤の接合体を還元剤に接触させることを含む。脱保護され たタンパク質とキレート化剤の接合体および還元剤は、典型的には、凍結または 凍結乾燥され、それにより、還元剤の存在に起因するタンパク質内のジスルフィ ド結合の開裂を防止する。本発明は、また、脱保護されたタンパク質とキレート 化剤の接合体および後に添加される放射性核種を還元するための還元剤を含むキ ットを含む。還元剤の添加時に、本発明の放射性標識化法を実施するために混合 物を用いることができる。放射性標識化されたタンパク質を提供するために放射 性核種をキットに添加することができる。さらに、保護されたタンパク質とキレ ート化剤の接合体を用いた場合、非予備還元放射性核種の添加前に脱保護剤を添 加することができる。本発明の単一バイアルまたはキットは、特定の免疫診断ま たは免疫治療手順のために、第三級チオール含有キレート化剤と複合体形成する 適当なタンパク質、抗体、抗体フラグメント等を含むように設計されている。 本発明の方法によれば、バイアルまたはキットは都合良く密封され、滅菌また は半滅菌条件下に試薬を導入または取り出す機構が設けられている。好ましくは 、注射器注入のためのポートを含むバイアルが本発明の方法において用いられる 。バイアルまたはキット内の試薬は、典型的には、水性の凍結または凍結乾燥し た状態で提供される。一つの態様において、試薬は低温で、例えば冷蔵庫内に数 日〜数週間、好ましくは約３．５〜５．５のｐＨ、より好ましくは４．５〜５． ０のｐＨで、好ましくは窒素またはアルゴンといった不活性ガスの雰囲気下に貯 蔵することができる。 貯蔵および安定化を容易にするために凍結乾燥状態で試薬を提供することも本 発明の範囲に含まれる。これは、約５．５のｐＨで、揮発性緩衝剤、例えば酢酸 アンモニウムの溶液から、好ましくはやはり凝集を防止するための安定化剤、例 えばトレハロースまたはスクロースのような糖の存在下に有利に行われる。その ような凍結乾燥条件は従来のものであり、一般的技術者に良く知られている。試 薬は冷凍し、使用前に解凍することもできるが、このやり方は、タンパク質とキ レート化剤の接合体の再酸化および凝集のより大きな危険性を伴う。 次に、本発明の標識化手順は、単に、放射性同位体、例えば、過テクネチウム ナトリウム水溶液を、還元剤および脱保護されたタンパク質とキレート化剤の接 合体を含むバイアルに添加することにより行うことができる。さらに、脱保護さ れたタンパク質とキレート化剤の接合体を用いる場合、実質的に１００％の組み 込みを行うために放射性同位体の添加前または添加中に脱保護試薬を添加するこ とができる。次に、バイアルの内容物を混合し、タンパク質の標識化の実施に十 分な時間培養する。培養の時間および条件は決定的ではないが、典型的には、タ ンパク質に^99mＴｃを実質的に１００％組み込むのに充分な時間行われる。「実 質的に１００％組み込む」というのは、テクネチウムの標識化に関しては、９８ ％を越える組み込み、好ましくは９９％を越える組み込み、より好ましくは１０ ０％の組み込みを意図する。通常、培養は約０．１〜約６０分の時間、好ましく は約１〜約５分の時間行われる。次に、放射性標識化されたタンパク質をバイア ルから取り出し、分離または精製は必要ないので直ちに使用することができる。 放射性核種のための還元剤は、好ましくは、好ましくは錫イオンとしての錫（ ＩＩ）である。典型的に、塩化錫が、タンパク質とキレート化剤の接合体を含む 混合物に添加される。当業者は、錫イオンは、その場で金属錫、例えばホイル、 粒子、粉末、削り屑等から、酸水溶液、例えば塩酸と接触させることにより発生 させることができ、好ましくはＨＣｌ中約０．１ｍＭの溶液中のＳｎＣｌ₂とし て通常添加されることを理解している。 通常、一般的には、好ましくは約４．０〜４．５の穏やかな酸性ｐＨに緩衝さ れた塩水中のタンパク質濃度約０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ 〜５ｍｇ／ｍｌの溶液を用いて操作することが有利である。そのような場合、過 テクネチウムの通常の画像化活性の低下に必要な錫イオンの量は、タンパク質の 量に比例して約０．１〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜２５μｇ／ｍｌ である。上記量のタンパク質を標識化するときに、過テクネチウム塩の量は通常 、約２〜５０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質であり、反応時間は約０．１〜３０分であ る。タンパク質および錫イオンの好ましい濃度を用いれば、過テクネチウムの量 は好ましくは５〜３０ｍＣｉ／ｍｇであり、反応時間は好ましくは約１〜２０分 である。 過テクネチウム塩は、通常、市販の発生剤、最も一般的には、通常塩水溶液中 のＮａＴｃＯ₄から得られる。新規態様の発生剤の供給者により指示されるよう にまたは一般的当業者に明らかなように、手順を適当に修正して、他の状態の過 テ クネチウム塩を使用することができる。過テクネチウム塩は、通常、食塩水、例 えば約３〜７、好ましくは３．５〜５．５、より好ましくは約４．５〜５．０の ｐＨに緩衝された例えば０．９％（「生理的」）食塩水中、約０．１〜１０ｍＣ ｉ／ｍｌの活性で使用される。適当な緩衝剤は、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、ク エン酸塩、リン酸塩等を含む。過テクネチウム塩の還元は、通常、窒素、アルゴ ン等の不活性ガスの雰囲気下に行われる。反応温度は、通常、室温、例えば１８ 〜２５℃に維持される。 この明細書全体において、「還元された過テクネチウム塩」または「還元され た過レニウム塩」は、過テクネチウム塩(pertechnetate)または過レニウム塩(pe rrhenate)の錫イオン還元により形成されチオール基によりキレート化されたテ クネチウムまたはレニウムイオンの種を意味する。還元された過テクネチウム塩 はそのようなキレートにおいてＴｃ（ＩＩＩ）および／またはＴｃ（ＩＶ）およ び／またはＴｃ（Ｖ）の状態であり、還元された過レニウム塩はＲｅ（ＩＩＩ） および／またはＲｅ（ＩＶ）および／またはＲｅ（Ｖ）の状態であるが、より高 いまたは低い酸化状態および／または複酸化の工程が本発明の範囲に含まれると 通常考えられる。 レニウムは周期表においてテクネチウムの直ぐ下に見つけられ、同じ外殻電子 配置を有しており、従ってテクネチウムに非常に類似した化学的特性、特に類縁 化合物に対する挙動を有することが予想される。実際、レニウム化合物は、還元 およびキレート化にについてテクネチウム化合物に類似した定性的挙動をするが 、それらの反応速度は全く異なり、特定の重要な性質について類似していない。 これらの相違にも係わらず、熟練技術者は、本発明をテクネチウムの標識化の開 示に基づいて修正して効果的なレニウムの標識化を達成することができる（例え ば、グリフィス（Griffiths）の米国特許第５，１２８，１１９号明細書の開示 を全体として、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。 放射性同位体Ｒｅ−１８６は治療に有意義であり、画像化にも使用することが できる。それは、半減期約３．７日、高ＬＥＴベータ放射線（１．０７ＭｅＶ） 、および便利なガンマ放射線エネルギー（０．１３７ＭｅＶ）を有する。テクネ チウムへの類推により、レニウムは過レニウム塩から製造され、還元されたレニ ウムイオンは非特異的にタンパク質に結合することができる。従って、還元され た過レニウム塩をタンパク質とキレート化剤の複合体上のスルフヒドリル基に結 合させる、タンパク質のＲｅ−１８６標識化法は有益である。Ｒｅ−１８８は半 減期が約１７時間の発生剤により製造されたベータおよびガンマ放射物であり、 画像化および治療に好適である。レニウム１８８のための市販の発生剤の開発が 近年行われており、好ましい計画では、キャリヤ無しのレニウム１８８を、第一 錫イオンおよびタンパク質とキレート化剤の複合体を含むバイアルに直接添加し て、約２時間以内に使用準備ができる、レニウムにより放射性標識化されたタン パク質を生成することができる。 一般に、例えば抗体といった非複合体形成タンパク質の濃度、反応時間、過レ ニウム塩活性および他の条件は、多量の錫イオンを使用する場合を除いて、Ｒｅ −１８６またはＲｅ−１８８の場合と実質的に同じである。放射性過レニウム塩 における放射性同位体が実質的にキャリヤ無しのＲｅ−１８８である場合、溶液 中の抗体または抗体フラグメントの濃度は、有利には、約１〜２０ｍｇ／ｍｌ、 好ましくは約１０〜２０ｍｇ／ｍｌであり、錫イオンの量は約５００〜１０００ ０μｇ／ｍｌ、好ましくは約５００〜５０００μｇ／ｍｌである。放射性過レニ ウム塩中の放射性同位体がキャリヤを添加されたＲｅ−１８６である場合、抗体 または抗体フラグメントの同じ濃度において、錫イオンの量は約５〜１０００ｍ ｇ／ｍｌ、好ましくは約５０〜５００ｍｇ／ｍｌである。 銅イオンも硫黄キレート化剤により強力にキレート化される。Ｃｕ−６７は、 画像化および治療のためのもう一つの有益な放射性核種である。それは、半減期 約２．６日、ベータ放射線（０．５７ＭｅＶ）、およびガンマ放射線（０．１８ ５ＭｅＶ）を有するが、ベータエネルギーは比較的に低い。Ｃ−６７は比較的費 用がかかり、現在容易に入手できないが、そのような条件は需要が生ずれば変わ りうる。Ｃ−６７は、チオールと強力なキレートを形成する場合、標識化は簡単 かつ迅速であり、放射性金属のための還元剤を必要としないという利点を有する 。 銅に対して類似のキレート化挙動を有する他の放射性核種、例えば、水銀、銀 および鉛も、本発明の方法に従ってチオール含有化合物に結合することができた 。Ｈｇ−１９７は半減期が約１．５日であり、７８〜２６８ｋｅＶのエネルギー 範囲のガンマ放射線を放射し、Ｐｂ−２０３は約２７５ｋｅｖの強力なガンマ線 放射物質であり、半減期が約５１時間であって、これらの物性ゆえに、水銀およ び鉛はガンマ線シンチグラフィーに好適である。Ａｇ−１１１は半減期７日であ り、約１．０２ＭｅＶのベータ線を放射し、Ｂｉ−２１２は半減期が約１時間で エネルギーが６．０９ＭｅＶのアルファ線放射物質であり、生体内治療にかなり 興味深いものである。Ｂｉ−２１２は、その場で（in situ）、２３９ＫｅＶの ガンマ線を放射し半減期が約１０．６日であるＰｂ−２１２前駆体から製造され る。すなわち、Ｂｉ−２１２療法のための抗体と第三級チオールを含有するキレ ート化剤の接合体はＰｂ−２１２標識化接合体であり、これを示すためにここで は、略記法である鉛／ビスマスまたはＰｂ／Ｂｉが用いられる。本発明は例示さ れた放射性核種に限定されないが、通常、スルフヒドリル基に強力に結合するイ オンに適用可能である。 前述の標識化条件により、典型的に、タンパク質とキレート化剤の複合体に標 識が実質的に１００％の組み込まれる、または実質的に定量的に組み込まれる。 この明細書全体において、「実質的に定量的に組み込まれ」という文言は、レニ ウム標識化に関しては、約８０％を越える組み込み、有利には約８５％を越える 組み込み、より有利には約９０％の組み込みを意味する。例えば、第三級チオー ル含有キレート化剤と複合体形成したＦ（ａｂ’）₂を、実質的に定量的な収率 で、Ｆ（ａｂ’）₂１ｍｇ当たり５〜２００μｇのＳｎ（ＩＩ）で絶えず標識化 することができる。さらに、この標識化タンパク質の免疫活性はこの血清培養の 後に大きく低下され、それは放射性標識化されたタンパク質とキレート化剤の接 合体が、少なくとも２４時間を越えてなお完全に活性な画像化剤であることを示 している。 前述の反応条件において、テクネチウムの標識化のために、ホスホン酸塩、酒 石酸塩、グルコヘプトネートまたは他の良く知られたＳｎ（ＩＩ）キレート化剤 のようなトランスキレート化剤は錫を溶液中に維持するために必要とされないが 、そのようなトランスキレート化剤を本発明により使用することができる。塩化 錫および錫イオンのようなＳｎ（ＩＩ）化合物が本発明において用いるのに好ま しいが、他の入手容易な従来のＳｎ（ＩＩ）塩も効果的である。必須成分は三つ だけ、すなわち、脱保護されたタンパク質とキレート化剤の接合体と、錫イオン 水溶液と、過テクネチウム塩溶液とである。ここに記載の反応条件下において、 実質的に１００％のＴｃ−９９ｍをタンパク質に組み込むことを容易に達成する ことができる。 得られた放射性標識化タンパク質は、例えば腫瘍、感染性病巣、微生物、クロ ット、心筋梗塞、アテローム性プラクまたは通常の器官もしくは組織のシンチグ ラフィー画像化に用いるのに適している。そのような画像化法は当分野において 良く知られている。先に調製された放射性標識化タンパク質溶液は、適当に滅菌 された発熱性物質非含有バイアルにおいて行われるのであれば、直ぐに注入に用 いることができる。テクネチウム結合の後にフリーなスフルヒドリル基のブロッ キングは、安定化に必要でない。 本発明の方法は、全抗体および抗体フラグメントの標識化に特に有意義である が、アルブミンのようなタンパク質、薬剤、サイトカイン、酵素、ホルモン、免 疫調整剤、受容体タンパク質等も標識化することができる。抗体は、重い鎖を結 合する一またはそれ以上のジスルフィド結合、および軽い鎖と重い鎖とを結合す るジスルフィド結合を含む。これらのジスルフィド結合の開裂を含む既知の方法 は、典型的に、重い鎖を結合するジスルフィド結合のみを選択的に開裂し、軽い 鎖と重い鎖とを結合するジスルフィド結合は開裂しない。不運なことに、これら の方法は、時折、注意深く行わないと、軽い鎖と重い鎖とを結合するジスルフィ ド結合の望ましくない開裂を引き起しそれにより抗体を役に立たないものにし得 る。さらに、フリーなチオール基を有するキレート化剤の使用によっても、タン パク質内のジスルフィド結合が開裂する。本発明の方法では、保護第三級チオー ル含有キレート化剤を使用し、それを全抗体または抗体フラグメント上の官能基 、好ましくはアミン基で複合化し、それによりジスルフィド基をそのままにして おくことにより、特異的にそのような望ましくない開裂を回避することができる 。 本発明の方法は、還元された放射性核種と複合体形成する水溶性トランスファ ーリガンドの使用も含む。通常、本発明の別の態様において有用なトランスファ ーリガンドは、テクネチウム９９ｍまたは任意の還元状態のレニウム放射性同位 体あるいは他の既知の放射性同位体を複合化して安定金属イオンおよび／または リガンドの複合体を形成することのできる水溶性（または水溶性にすることので きる）キレート化剤である。この複合体は、さらに、チオール基の脱保護後に、 放射性同位体を、タンパク質とキレート化剤の接合体上の存在する側鎖スルフヒ ドリル基と交換することができる。適当なトランスファーリガンドの例は、グル コヘプトネート、酒石酸塩、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ジ，トリまたはポリアルキル ホスホネート、ピロホスフェートまたはグリシンおよびその誘導体を含む。当業 者は、還元された放射性核種と複合体形成し、続いて還元された放射性核種を側 鎖スルフヒドリル基に移すことのできる任意のキレート化剤が本発明において有 用であることを理解する（例えば、ディーン（Dean）の米国特許第５，１８０， ８１６号明細書および／またはショチャット（Shochat）らの米国特許第５，０ ６ １，６４１号明細書の各々の記載の全てを引用することにより本明細書の一部を なすものとする）。 本発明は、チオール結合放射性金属が、一個以上の外来性のリガンドにより「 キャップ」される、別の態様も含む（上記ショチャット（Shochat）らの米国特 許参照）。これらのリガンドは、通常、このイオンの配位球を完成し、タンパク 質とキレート化剤の接合体により既に提供されているスルフヒドリル基を補足す るように設計される。イオンを強力に結合してそれによりタンパク質反応性基へ の硫黄−金属結合を弱め血清中の放射性金属標識の安定性を低下させるリガンド と、不充分なキレート化能を提供しそれにより、血清または骨髄中、またはクリ アランスが起こる肝臓、脾臓もしくは腎臓のような器官において他の外来性リガ ンドによりタンパク質からイオンが容易に抽出されるようなリガンドとの間で均 衡をとらなくてはならない。当業者は、既知の化学理論を用いてこの均衡をとる ことができ、適当な外来性キャッピングリガンドを設計することができる。 タンパク質、例えばＦａｂ’またはＦ（ａｂ’）₂フラグメントあるいは完全 抗体を、発生剤により生成された過テクネチウム塩を用いてＴｃ−９９ｍにより 放射性標識化するのに用いられるキットは、腫瘍、感染性病巣、微生物、心筋梗 塞、クロット、アテローム性プラクまたは通常の器官もしくは組織と結合してい る抗原を特異的に結合し、さらに、脱保護されて抗体−ｔ−チオール誘導体を形 成する抗体−アセチル−ｔ−チオール誘導体を形成するために、保護第三級チオ ール含有キレート化剤に結合される抗体または抗体フラグメント約０．０１〜１ ０ｍｇ／単位投与を含む。キットは、また、錫イオン約０．１〜５０μｇ／単位 投与を含む。キットの成分は、使用直前に、抗体または抗体フラグメント１ｍｇ 当たり約２〜５０ｍＣｉのＴｃ−９９ｍ過テクネチウム塩と合わせる。抗体およ び／または抗体フラグメント−ｔ−チオール誘導体およびＳｎ（ＩＩ）還元剤は 、例えば液体窒素浴中で貯蔵するかまたは凍結乾燥することのできるバイアル内 の単 一溶液中に有利に組み合わされ、好ましくは、過テクネチウム塩の添加前に、当 業者に良く知られているように糖を添加する。上記キットの一般的試薬の添加を 含む態様は、当業者の通常の技術の範囲内のものである。 抗体／抗体フラグメント−アセチル−ｔ−チオール誘導体を用いる場合、還元 剤と混合する前にまたは混合後に脱保護することができる。しかしながら、保護 された抗体／抗体フラグメント−アセチル−ｔ−チオール誘導体は、放射性核種 との反応前に脱保護されなくてはならない。同時に脱保護剤および放射性核種を 溶液に添加することができるが、反応経路は、通常、（ｉ）保護された抗体／抗 体フラグメント−アセチル−ｔ−チオール誘導体の脱保護および放射性核種の還 元、および（ｉｉ）接合体の標識化である。しかしながら、有利には、抗体／抗 体フラグメント−アセチル−ｔ−チオール誘導体は、還元剤と混合してキットに 貯蔵する前に脱保護される。本明細書を読むと、当業者は保護されたまたは脱保 護された抗体／抗体フラグメント−アセチル−ｔ−チオール誘導体を用いて方法 およびキットを設計することができる。 本発明のキット内のタンパク質は、滅菌容器内において有利に凍結または凍結 乾燥され、不活性ガスの雰囲気下、液体窒素浴内で有利に冷却および貯蔵され、 使用直前に穏やかに解凍する。このキットは、好ましくは、緩衝液の滅菌バイア ル、塩水、注射器、フィルター、カラム等の、診療家または技術者が用いるため の注入可能製剤の調製を容易するための補助手段によって補うことができる。 本発明の特に好ましい態様において、タンパク質の放射性標識化は、ｐＨ７． ５においてタンパク質をモル過剰のキレート化剤と反応させることにより（Ｎ− ヒドロキシスクシンイミジル）−Ｎ−（３−メチル−３−アシルメルカプトブチ リル）グリシネート（「キレート化剤」）を抗体（全またはフラグメント）に接 合させることにより行われる。抗体に添加されるチオールの数は、使用するキレ ート化剤のモル過剰を変化させることにより変えることができる。次に、タンパ ク質とキレート化剤の接合体を従来の手段により好ましく精製し、必要な場合ま たはときには、生成した接合体をチオール脱保護することができ、一旦チオール 脱保護すると、得られた生成物を塩化錫を用いて直ちに製剤化し、アルゴン雰囲 気または減圧下の密封バイアル内で、凍結乾燥されたキットとして貯蔵される。 そして、このキットは、放射性核種と混合することができる。 本発明の方法により調製した放射性標識化タンパク質、特に抗体および抗体フ ラグメントが、非侵襲性シンチグラフィ画像化の腫瘍および病巣の放射性抗体治 療の方法において好適であり、実際特に好ましく効果的であることが、当業者に 明らかである。特に、腫瘍、感染性病巣、心筋梗塞、クロット、アテローム性プ ラークまたは通常の器官もしくは組織を画像化する方法であって、腫瘍により形 成されたまたは腫瘍と結合した抗原に特異的に結合するとともに外部検出するこ とのできる薬学的に不活性な放射性同位体で放射性標識化されたタンパク質、抗 体または抗体フラグメントが、ヒトの患者に非経口的に注入され、放射性標識化 されたタンパク質、抗体、または抗体フラグメントが局在化し、ターゲットでな いバックグラウンド部分がクリアになるのに充分な時間後、放射性標識化された タンパク質、抗体、または抗体フラグメントの付着部位が外部画像化カメラによ り検出される方法において、改良点は、放射性標識化されたタンパク質、抗体ま たは抗体フラグメントとして、本発明の方法により製造した標識化タンパク質、 抗体、または抗体フラグメントを用いることである。そのような放射性標識化タ ンパク質、抗体、または抗体フラグメントは、肝臓においてあまりクリアされず 、良好な腫瘍対非腫瘍比と提供し、生体内における優れた腫瘍検出を提供する。 さらに、腫瘍または感染性病巣の害を被っている患者を放射性抗体治療する方 法であり、腫瘍または感染性病巣により生成されまたはそれらに関連している抗 原に特異的に結合し、治療に有効な放射性同位体で放射性標識化されたタンパク 質、抗体、または抗体フラグメントを、そのような腫瘍または感染性病巣の害を 被っているヒトの患者に非経口的に注入する方法において、改良点は、放射性標 識化したするタンパク質、抗体、または抗体フラグメントとして、本発明の方法 により製造したレニウムにより放射性標識化されたタンパク質、抗体、または抗 体フラグメントを用いることである。 さらなる説明がなくても、当業者は、上の記載および以下の例を用いて、本発 明を最大限の利用することができると考えられる。従って、以下の好ましい特定 の態様は、単に説明するものであって、いかなる場合においても開示の残りの部 分を制限するものではないと解される。さらに、この明細書において既述した全 ての文献の全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。 例例１ （Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）Ｎ−（３−メチル−３−アシルメルカプト ブチリル）グリシネートの調製 グリシン ｔ−ブチルエステル塩酸塩１．６８ｇ（１０ｍｍｏｌ）およびトリ エチルアミン１．４ｍｌの塩化メチレン５０ｍｌ中溶液を撹拌し、沈殿した塩化 トリエチルアンモニウムを濾去した。濾液を約１００ｍｌに希釈し、トリエチル アミン１．４ｍｌと混合し、塩化ジメチルアクロイル（１０ｍｍｏｌ）の塩化メ チレン（１０ｍｌ）中溶液に、不活性雰囲気下に滴加した。反応混合物を１８時 間撹拌し、水（３×１０ｍｌ）およびブライン（１０ｍｌ）で洗い、乾燥（無水 Ｎａ₂ＳＯ₄）した。酢酸エチル／ヘキサン混合液を用いた傾斜溶出を利用したシ リカゲル（２３０〜４００メッシュ）によるフラッシュクロマトグラフィーによ って、Ｎ−（３，３−ジメチルアクロイル）グリシン ｔ−ブチルエステル１． ０ｇ（５０％）を黄色液体として得た。 次に、Ｎ−（３，３−ジメチルアクロイル）グリシン ｔ−ブチルエステルを 過剰（５ｍｌ）のチオ乳酸に溶解し、３時間加熱還流（浴温９５℃）した。反応 混 合物を冷却し、ジエチルエーテルで希釈し、５％酢酸水溶液、水およびブライン で洗い、次に乾燥（無水Ｎａ₂ＳＯ₄）した。溶媒を蒸発させることにより、残渣 を得、それをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１０ｍｌとともに２時間撹拌した。Ｔ ＦＡの蒸発により残渣を得、それをフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル 、２３０〜４００メッシュ、メタノール／塩化メチレン傾斜）により精製した。 生成物（黄色ワックス状固体）であるＮ−（３−アセチルメルカプト−３−メチ ルブチリル）グリシンをＩＲおよびプロトン−ＮＭＲスペクトルにより特性付け した。プロトン−ＮＭＲスペクトル（４００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ₃）は、１．５２ （ｓ，６Ｈ），２，２６（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｓ，２Ｈ），４．０６（ｄ， ２Ｈ，Ｊ＝５．６）および６．４２（ｓ ｂｒ．，１Ｈ）に信号を示した。 上記の黄色ワックス状固体生成物（３６３ｍｇ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶 解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１８０ｍｇ、１当量）およびジシクロヘ キシルカルボジイミド（３２２ｍｇ、１当量）で処理した。反応混合物をアルゴ ン雰囲気下に１８時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾去し、濾液 を濃縮した。残渣をイソプロパノールから晶出して（Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミジル）Ｎ−（３−メチル−３−アシルメルカプトブチリル）グリシネートを淡 白色固体（収量３３５ｍｇ）として得た。例２ （Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）Ｎ−（３−メチル−３−アシルメルカプト ブチリル）グリシネートのネズミＦ（ａｂ）２への接合 腹水から精製したＩｇＧから調製した、従来法により調製したＣＥＡへのモノ クローナルネズミ抗体であるＩｍｍｕ−１４Ｆ（ａｂ）₂（８８５μｌ；６．２ ６ｍｇ）およびシステインの不存在下に消化したパパインの５０ｍＭｈｅｐｅｓ ／１５０ｍＭ塩水（ｐＨ７．５）中溶液をＤＭＦ２５μｌと共に渦巻くように混 合物した。この溶液に、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）Ｎ−（３−メチル − ３−アシルメルカプトブチリル）グリシネートのＤＭＦ溶液（ＤＭＦ３４５μｌ 中に２．３ｍｇ、キレート化剤／抗体モル比＝４）１１μｌを、渦巻くように混 合しつつ添加した。得られた透明溶液を４℃に１８時間維持、または室温に２時 間維持して抗体とキレート化剤の接合体を生成した。この接合体を、ｐＨ７の０ ．１Ｍリン酸ナトリウムを用いたセファデックスによる遠心分離サイズ排除クロ マトグラフィーにより精製した。この材料を冷蔵庫に貯蔵し、必要なときにチオ ール脱保護（以下の例）した。例３ 接合体のチオール脱保護 例２により調製した接合体１００μｌを１Ｍヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ ８）２０μｌと、０．６ｍｌエッペンドルフ（eppendorf）バイアル中で渦巻く ように混合し、１分間アルゴンパージした。室温で１０分間放置後、生成物をサ イズ排除カラム（セファデックス５０／８０、５０ｍＭ酢酸塩／１５０ｍＭ塩水 、ｐＨ５．３）上で精製した。溶出物を濃度およびフリーなチオール含量につい て分析した。ｐＨ７の０．１ＭのＰＢＳ中ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸） （ＤＴＮＢ）１０ｍＭを用いるエルマンズアッセイ(Ellman's assay)により、抗 体当たり平均１．１当量の（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）Ｎ−（３−メチ ル−３−アシルメルカプトブチリル）グリシネートであることを示す１．１チオ ール基／抗体の値を得た。 （Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）Ｎ−（３−メチル−３−アシルメルカプ トブチリル）グリシネート６当量を用いて接合化反応を繰り返して、抗体当たり 平均１．８〜２．２チオール基の接合体を得た。例４ 例３のチオール脱保護接合体の調製、凍結乾燥およびテクネチウム９９ｍ標識化 例３により調製した新しくチオール脱保護したＦ（ａｂ’）₂接合体（２００ μ ｇ，抗体当たり１．１チオール）を、錫（ＩＩ）２５μｇの酒石酸塩（９．２ｍ Ｍ）−酢酸塩（５０ｍＭ）−塩水（１５０ｍＭ）緩衝液１５０μｌ中溶液と混合 し、２ｍｌガラスバイアル中で凍結乾燥した。凍結乾燥物を減圧下、密封バイア ル中に貯蔵した。 （Ｔｃ−９９ｍ）過テクネチウム塩発生剤−溶出物１ｍｌを添加することによ りＴｃ−９９ｍ放射性標識化を行って５ｍＣｉ／ｍｇの特異的活性を達成した。 凍結乾燥したものとしないものの両方について抗体とキレート化剤の接合体への 標識化を行った。放射ＨＰＬＣ分析において３０分間後に標識化を行うことによ り抗体とキレート化剤の接合体中に放射活性が１００％組み込まれたことが示さ れた。凍結乾燥物の同様の標識化は９７％の組み込みを示した。例５ ヒト結腸腫瘍異種移植ＬＳ１７４Ｔを有するヌードマウスにおけるＴｃ−９９ｍ 標識化Ｉｍｍｕ−１４ Ｆ（ａｂ）₂の生分布 新しくチオール脱保護した抗体とキレート化剤の接合体（２００μｌ，抗体当 たり１．８９チオール基）を、全容積１ｍｌとしてＴｃ−９９ｍグルコヘプトネ ート２ｍＣｉで標識化した。放射性標識化材料およびＣＥＡによる放射性標識化 フラグメントの短時間培養により形成された抗体−抗原複合体について行ったＨ ＰＬＣ分析により、生成物が放射化学純度および免疫反応性において満足できる ことがわかった。 標識化した接合体を、１０匹の１１週齢のＬＳ−１７４腫瘍を有するヌードマ ウスに静脈内投与した。５匹のマウスがそれぞれ４時間および２４時間の後注入 で死んだ。器官を切り出し、組織１ｇ当たりの注入投与％、器官当たりの注入投 与％、および腫瘍対非ターゲット器官比を得た。腫瘍吸収は、４時間および２４ 時間でそれぞれ４．２および４．４％ＩＤ／ｇであった。腫瘍対血液比は、４時 間での１．２から２４時間での９．４に増加した。これらの結果は、生体内にお けるターゲティング能の保持を示し、全ＩｇＧより早いクリアランスおよびＴｃ −Ｆａｂ’に類似の腫瘍対血液比を示している。例６ ヒト化されたＩｍｍｕ−１４Ｆ（ａｂ’）₂の接合体の調製およびＴｃ−９９ｍ 標識化 従来法により調製されたＣＥＡへのヒトモノクローナル抗体であるヒト化され たＩｍｍｕ−1４Ｆ（ａｂ’）₂２．１２ｍg（５．５ｍｇ／ｍｌ）の５０ｍ Ｍ ｈｅｐｅｓ／１５０ｍＭ塩水緩衝液（ｐＨ７．５）中溶液を、６倍過剰の（Ｎ− ヒドロキシスクシンイミジル）Ｎ−（３−メチル−３−アシルメルカプトブチリ ル）グリシネートと３０℃において２時間培養した。共溶媒としてＤＭＦ（５％ ｖ／ｖ）を用いた。遠心分離サイズ排除クロマトグラフィー（セファデックス ５０／８０，ｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウム中に平衡）により精製して、純 粋な接合体を得、それを１．６Ｍ（最終濃度）のヒドロキシルアミン水溶液（ｐ Ｈ８）を用いて室温において１０分間チオール脱保護した。二つの連続精製（セ ファデックス５０／８０上，０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ６．５）により、チ オール脱保護接合体を得、それを充分にアルゴンパージし、氷上に貯蔵した。１ ０ｍＭのＤＴＮＢを用いたチオールについてのエルマンズアッセイにより、抗体 １分子当たり２．２個のチオール基の値が得られた。 前述のように調製し、さらにその１／１０の体積の酢酸ナトリウムによりｐＨ ６で緩衝した接合体約２００μｇをＴｃ−９９ｍグルコヘプトネート（前述のよ うに新しく調製したもの）１ｍＣｉと混合した。２０分間の後標識化の後の放射 性ＨＰＬＣによる分析により、ヒト化された抗体に関して９５％を越える放射活 性が示され、その５．５％のみが分子量が高い物質であった。 本発明を前述の特に好ましい態様を参照して記載した。当業者は、本発明の精 神および範囲から大きく離れることなく本発明の種々の修正を加えることができ ることを理解する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年５月３１日 【補正内容】 請求の範囲（補正） １．過テクネチウム塩または過レニウム塩のための還元剤とタンパク質の接合 体との混合物を放射性過テクネチウム塩または放射性過レニウム塩に接触させる ことを含んでなる、タンパク質をテクネチウムまたはレニウムで放射性標識化す る方法であって、上記タンパク質接合体が上記タンパク質に共有結合するキレー ト化剤を含み、上記キレート化剤がＮ−（３−メチル−３−メルカプトブチリル ）グリシネート部分を含むことを特徴とする方法。 ２．タンパク質の接合体を還元された放射性過テクネチウム塩または還元され た放射性過レニウム塩に接触させることを含んでなる、タンパク質をテクネチウ ムまたはレニウムで放射性標識化する方法であって、上記タンパク質接合体が上 記タンパク質に共有結合しているキレート化剤を含み、上記キレート化剤がＮ− （３−メチル−３−メルカプトブチリル）グリシネート部分を含むことを特徴と する方法。 ３．上記還元された過テクネチウム塩または過レニウム塩が、上記タンパク質 に接触する前にグルコヘプトネートによりキレート化される、請求項１または２ に記載の方法。 ４．上記タンパク質が、Ｆ（ａｂ’）₂またはＦ（ａｂ）₂抗体フラグメントで ある、請求項１または２に記載の方法。 ５．上記キレート化剤が、上記タンパク質上のアミノ官能基に共有結合してい る、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６．上記キレート化剤が、アミド結合により上記タンパク質に共有結合してい る、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ７．上記キレート化剤が、ペプチド結合剤により上記タンパク質に共有結合し ている、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．上記ペプチド結合剤が、ジグリシンまたはトリグリシンである、請求項７ に記載の方法。 ９．上記Ｎ−（３−メチル−３−メルカプトブチリル）グリシネート部分が、 ヒドロキシルアミンを用いてＮ−（３−メチル−３−アシルメルカプトブチリル ）グリシネート部分を脱保護することにより調製される、請求項１〜８のいずれ かに記載の方法。 １０．上記キレート化剤が、Ｔｃ−９９ｍのカチオンと複合体形成する、請求 項１〜９のいずれかに記載の方法。 １１．上記キレート化剤が、Ｒｅ−１８６のカチオンと複合体形成する、請求 項１〜９のいずれかに記載の方法。 １２．上記キレート化剤が、Ｒｅ−１８８のカチオンと複合体形成する、請求 項１〜９のいずれかに記載の方法。 １３．（ｉ）タンパク質に共有結合しているＮ−（３−メチル−３−メルカプ トブチリル）グリシネート部分を含むキレート化剤を含むタンパク質接合体と、 （ｉｉ）後の工程で添加される過テクネチウム塩または過レニウム塩のための還 元剤を含む滅菌容器とを含んでなるヒトの患者に投与するための組成物を形成す るのに好適な診断キット。 １４．タンパク質に共有結合しているＮ−（３−メチル−３−メルカプトブチ リル）グリシネート部分を含むキレート化剤を含んでなるタンパク質接合体。 １５．上記タンパク質が、Ｆ（ａｂ’）₂またはＦ（ａｂ）₂抗体フラグメント である、請求項１３または１４に記載のキットまたは接合体。 １６．上記タンパク質接合体が、上記キットに含まれる前に凍結乾燥される、 請求項１３〜１５のいずれかに記載のキットまたは接合体。 １７．腫瘍または感染性病巣の害を被っている患者にＲｅ−１８６またはＲｅ −１８８で標識化したタンパク質接合体を非経口的に投与することを含んでなる 放射性免疫療法であって、上記タンパク質接合体が、上記腫瘍または感染性病巣 に特異的に結合するタンパク質に共有結合するキレート化剤を含み、上記キレー ト化剤がＮ−（３−メチル−３−メルカプトブチリル）グリシネート部分を含む ことを特徴とする方法。 １８．腫瘍、感染性病巣、心筋梗塞、クロット、アテローム性プラクまたは通 常の器官もしくは組織を放射性免疫画像化する方法であって、上記腫瘍、感染性 病巣、心筋梗塞、クロット、アテローム性プラクまたは通常の器官もしくは組織 により形成されたまたはそれらと結合した抗原に特異的に結合するとともに薬学 的に不活性なテクネチウムまたはレニウムの放射性同位体で放射性標識化された タンパク質を、ヒトの患者に非経口的に注入し、放射性標識化されたタンパク質 が局在化し、ターゲットでないバックグラウンド部分がクリアになるのに充分な 時間後、放射性標識化されたタンパク質の付着部位を外部画像化カメラにより検 出する方法において、上記放射性標識化されたタンパク質が、請求項１〜１２の いずれかに記載の方法により製造されるものであることを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 7419−4Ｈ Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８Ｄ 51/00 8615−4Ｃ Ａ６１Ｋ 43/00 51/08 9454−4Ｃ 49/02 Ｂ 51/10 9051−4Ｃ 37/02 ＡＤＵ Ｃ０７Ｂ 59/00 ＡＢＳ Ｃ０７Ｋ 14/00 ＡＤＷ 16/00 ＡＢＡ // Ｃ０７Ｍ 5:00 Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グリフィス，ゲイリー・エル アメリカ合衆国、 07960 ニュー・ジャ ージー、モリスタウン、エッジヒル・アヴ ェニュー 36 (72)発明者 ハンセン，ハンス・ジェイ アメリカ合衆国、 08087 ニュー・ジャ ージー、ミスティック・アイランド、ノー ス・バージー・ドライヴ 2617

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）タンパク質のジスルフィド結合を開裂することなくその一端におい てタンパク質と反応することができるとともに、その他端において放射性核種と 複合体形成することのできる第三級チオール含有キレート化剤を、タンパク質に 接触させてタンパク質とアセチル−ｔ−チオール基を含有する接合体を生成する 工程と、 （ｂ）上記アセチル−ｔ−チオール基を脱保護する工程と、 （ｃ）上記タンパク質−ｔ−チオール基含有接合体と、次の工程で添加される 還元可能な放射性核種のための還元剤とを混合して、該還元剤とタンパク質−ｔ −チオール基含有接合体との混合物を調製する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）の上記混合物を放射性核種と反応させてその放射性核種を上 記タンパク質−ｔ−チオール基含有接合体上に存在する側鎖スルフヒドリル基と 反応させる工程と を含んでなるタンパク質の放射性核種による放射性標識化方法。 ２．工程（ｂ）をヒドロキシルアミンを用いて行う請求項１に記載の方法。 ３．上記保護第三級チオール含有二官能キレート化剤が（Ｎ−ヒドロキシスク シンイミジル）Ｎ−（３−メチル−３−アシルメルカプトブチリル）グリシネー トである請求項１に記載の方法。 ４．上記タンパク質がＦ（ａｂ’）₂またはＦ（ａｂ）₂抗体フラグメントであ る請求項１に記載の方法。 ５．上記保護第三級チオール含有キレート化剤が上記タンパク質上のアミノ官 能基と反応する請求項１に記載の方法。 ６．上記放射性核種が上記タンパク質−ｔ−チオール基含有接合体と５員また は６員環を形成する請求項１に記載の方法。 ７．上記放射性核種がＴｃ−９９ｍである請求項１に記載の方法。 ８．上記放射性核種がＲｅ−１８６である請求項１に記載の方法。 ９．上記放射性核種がＲｅ−１８８である請求項１に記載の方法。 １０．請求項７に記載の方法により標識された放射性標識化タンパク質。 １１．請求項８に記載の方法により標識された放射性標識化タンパク質。 １２．請求項９に記載の方法により標識された放射性標識化タンパク質。 １３．（ｉ）タンパク質とｔ−チオール基を含有する接合体と、（ｉｉ）後の 工程で添加される放射性核種のための還元剤を含む滅菌容器とを含んでなるヒト の患者に投与するための組成物を形成するのに好適に診断キット。 １４．上記タンパク質−ｔ−チオール基含有接合体が上記キット内に納められ る前に凍結乾燥される請求項１３に記載のキット。 １５．上記タンパク質がＦ（ａｂ’）₂またはＦ（ａｂ）₂抗体フラグメントで ある請求項１３に記載のキット。 １６．（ａ）タンパク質のジスルフィド結合を開裂することなくその一端にお いてタンパク質と反応することができるとともに、その他端において放射性核種 と複合体形成することのできる第三級チオール含有キレート化剤を、腫瘍または 感染性病巣により形成されたまたはそれらと関連した抗原に特異的に結合するタ ンパク質に接触させてタンパク質とアセチル-ｔ−チオール基を含有する接合体 を生成する工程と、 （ｂ）上記アセチル−ｔ−チオール基を脱保護する工程と、 （ｃ）上記タンパク質−ｔ−チオール基含有接合体と、次の工程で添加される 治療に有効な還元可能な放射性核種のための還元剤とを混合して、還元剤とタン パク質−ｔ−チオール基含有接合体との混合物を調製する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）の上記混合物を治療に有効な還元可能な放射性核種と反応さ せてその放射性核種をタンパク質−ｔ−チオール基含有接合体上に存在する側鎖 スルフヒドリル基と反応させて、放射性標識化タンパク質−ｔ−チオール基含有 接合体を製造する工程と、 （ｅ）上記腫瘍または感染性病巣の害を被っている患者に上記放射性標識化タ ンパク質−ｔ−チオール基含有接合体を非経口的に投与する工程と を含んでなる放射性免疫療法。 １７．上記治療に有効な放射性核種が、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８から 選択されるレニウムの放射性同位体である請求項１６に記載の方法。 １８．腫瘍、感染性病巣、心筋梗塞、クロット、アテローム性プラクまたは通 常の器官もしくは組織を放射性免疫画像化する方法であって、上記腫瘍、感染性 病巣、心筋梗塞、クロット、アテローム性プラーク、または通常の器官もしくは 組織により形成されまたはそれらと関連した抗原に特異的に結合するとともに、 外部検出することのできる、薬学的に不活性な放射性同位体で放射性標識化され たタンパク質を、ヒトの患者に非経口的に注入し、放射性標識化されたタンパク 質が局在化し、ターゲットでないバックグラウンド部分がクリアになるのに充分 な時間後、放射性標識化されたタンパク質の付着部位を外部画像化カメラにより 検出する方法において、上記放射性標識化されたタンパク質が請求項１に記載の 方法により製造されるものであることを特徴とする方法。 １９．上記外部画像化することのできる薬学的に不活性な放射性同位体が、テ クネチウム９９ｍである請求項１８に記載の方法。 ２０．上記放射性標識化タンパク質が、放射性標識化Ｆ（ａｂ’）₂またはＦ （ａｂ）₂抗体フラグメントである請求項１９に記載の方法。 ２１．（ａ）タンパク質のジスルフィド結合を開裂することなくその一端にお いてタンパク質と反応することができるとともに、その他端において放射性核種 と複合体形成することのできる第三級チオール含有キレート化剤を、タンパク質 に接触させてタンパク質とアセチル−ｔ−チオール基を含有する接合体を生成す る工程と、 （ｂ）上記アセチル−ｔ−チオール基を脱保護する工程と、 （ｃ）上記タンパク質−ｔ−チオール基を含有する接合体を還元された過テク ネチウム塩と反応させて、その還元された過テクネチウム塩をタンパク質−ｔ− チオール基含有接合体上に存在する側鎖スルフヒドリル基と反応させる工程と を含んでなるタンパク質を放射性核種で放射性標識化する方法。 ２２．上記タンパク質が、Ｆ（ａｂ’）₂またはＦ（ａｂ）₂抗体フラグメント である請求項２１に記載の方法。 ２３．上記還元された過テクネチウム塩が、グルコヘプトネートでキレート化 される請求項２１に記載の方法。