JPH08508488A - タンパク質と二官能リガンドの複合体 - Google Patents

タンパク質と二官能リガンドの複合体

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JPH08508488A JP6522122A JP52212294A JPH08508488A JP H08508488 A JPH08508488 A JP H08508488A JP 6522122 A JP6522122 A JP 6522122A JP 52212294 A JP52212294 A JP 52212294A JP H08508488 A JPH08508488 A JP H08508488A
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ディリル，ハビベ
ハンセン，ハンス・ジェイ
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Abstract

(57)【要約】 癌、心血管または感染性疾患の検出または治療に有用な複合体が提供されている。複合体は、リガンドとタンパク質から成る。リガンドは、メルカプト基と結合できる部分を持ち、検出または治療に有用な金属をキレート化できる。タンパク質は、標的細胞、病変または病原体と関連する物質と反応する。複合体形成前に、タンパク質は、リガンドとの複合体形成部位となる少なくとも１個のメルカプト基を持つ。複合体の金属キレート、検出および治療法、複合体および複合体の薬剤組成の製造方法も提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質と二官能リガンドの複合体 発明の背景 １−発明の分野 本発明は、少なくとも１個の立体保護されたメルカプト基を持つタンパク質と 、メルカプト基と結合し、金属をキレート化することが可能な二官能リガンドの 複合体に関する。特に、このような複合体は、タンパク質の金属標識に有用であ り、従って疾病状態の検出または治療に利用できる。 ２−従来の技術の説明 診断および治療を目的とした金属キレートと金属キレート−タンパク質複合体 の形成方法に対する関心は今なお続いている。代表的なキレートと複合体の種類 、および複合体形成法が特に、米国特許第4,454,106号、第4,472,509号、第4,33 9,426号、第4,824,986号、第4,831,175号、第5,124,471号、ヨーロッパ特許公報 第0 279 307号、ドイツ特許第1,155,122号に明らかにされている。抗体、モノク ローナル抗体および組み換えDNA技術によって構造を改変されたそれらのフラグ メント（例えば、キメラ抗体）を含むその他のタンパク質、ポリクローナル抗体 、抗原、血中タンパク質、または血中リンパ球またはその他の細胞に結合したタ ンパク質も、複合体の形成に使用できる。 タンパク質と複合体を形成するための二官能金属キレートの合成方法は、アミ ノ酸アミドをエチレンジアミンに還元し、ハロゲン酢酸でアルキル化することに よって二官能エチレンジアミン四酢酸（EDTA）キレートに変換される一置換誘導 体を形成するというものである（Yeh et al.，Anal．Biochem．100:152(1979)） 。同様に、一置換ジエチレントリアミンは、エチレンジアミンをアミノ酸エステ ルで 反応させ、得られたアミドのカルボニル基を還元することによって合成される（ Brechbiel et al.，Inorg．Chem．25:2772-8(1986)）。ジエチレントリアミンを ハロ酢酸あるいはエステルによるアルキル化と、適用可能な場合にはその後の加 水分解によって、一置換二官能ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）キレートを 生成する。 二官能DTPAの別の合成方法は、DTPAまたはEDTAカルボキシレートをクロロギ酸 エステルと反応させ、反応性無水物を生成する方法である（Krejcarek et al.， Biochem．Biophys．Res．Commun．77:581(1977)）。二官能キレートとして使用 されるDTPAの二無水物は、親化合物DTPAの脱水により調製される（Hnatowich et al.，Int．J．Appl．Rad．Isot．33:327(1982)）。１位の炭素において一置換 されたEDTAキレートを使用することによって、置換されていないEDTAキレートよ りも、キレートからの金属の遊離を遅らせることも報告されている（Meares et al.，Anal．Biochem．142:68(1984)）。 従来の技術は、一置換二官能EDTAまたはDTPA無水物をタンパク質と混合し、続 いて金属と反応させキレート化することによって、金属−タンパク質キレートを 形成した（Krejcarek et al.，Biochem．Biophs．Res．Commun．77:581，(1977) ；Brechbiel et al.，Inorg．Chem．25:5783(1986)）。これらの方法に従って調 製された金属キレートと複合体を形成したモノクローナル抗体による腫瘍標的部 位のin vivoの画像化が報告されている（Khaw et al.，Science 209:295，(1980 )；Sheinberg et al.，Science 215:151，(1982)）。金属キレートと複合体を形 成したモノクローナル抗体によるin vivoのヒトの癌の診断も報告されている（R ainsbury et al.，Lancet 2:694(1983)）。キメラ抗体の利用とその利点がMorri son,S.L.，Hospital Practice 24:64-65，72-74，77-80(1989)によって検討され ている。キレートとタンパク質の間に加水分解可能な結合基を使用することによ る効果の可能性も論じられている（Paik et al.，J．Nucl．Med．30:1693-1701( 1989)）。 二置換二官能DTPA誘導体は、放射性金属でタンパク質を標識するのに有用であ ることが証明されている（Kozak，et al.，Cancer Research 49:2639-44(1989) ）。DTPAの炭素バックボーンに第二の置換基を導入することによって、抗体と結 合され、動物の循環血液中に注入された時に、DTPAリガンドからの金属解離を遅 延させることが観察された。 癌治療における放射性核種の有用性は、Kozak et al.，“放射性核種と複合体 を形成したモノクローナル抗体：免疫学、無機化学、核科学の合成”Trends in Biotechnology 4:(10):259-264(1985)の報告に明らかにされている。放射性核種 療法におけるビスマス-212のアルファ放射線の有用性が、次の２つの報告におい て更に検討されている。Kozak et al.，“ビスマス212標識抗-Tacモノクローナ ル抗体：放射線免疫療法の方法としてのアルファ粒子を放射する放射性核種”Pr oc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:474-478(1986)およびGansow et al.，“放射 線療法に使用するためのジェネレータにより産生される化学的に修飾されたモノ クローナル抗体にキレート化されたBi-212”Am．Chem．Soc．Symposium Series 15:215-227(1984)。ビスマスをタンパク質に確実に結合させるためのリガンドは まだ入手されていない（Macklis et al.，Science 240:1024−2(1988)）。 キレート化された金属イオンのその他の利用例が以下の文献に明らかにされて いる。Magerstadt et al.，“Gd(DOTA):NMR画像化または分光学のT1／T2緩和剤 としてのGd（DPTA）の代用物”Magnetic Resonance in Medicine 3:808-812(198 6)は、NMR画像化の緩和剤としてのガドリニウムの有用性を明らかにしている。S pirlet et al.，Inorgan．Chem．23:4278-4783(1984)の文献は、ランタニドキレ ートの有用性を明らかにしている。 しかし、治療を目的として、金属キレートと複合体を形成されたモノクローナ ル抗体の腫瘍部位を特定する特性を用いる試みは、一般に行われてはいない。放 射性核種−リンカー−抗体複合体の安定性に対する懸念、特に生体内での長時間 安定性に対する懸念が常にあるからである。この懸念は、複合体が放射線免疫療 法に使用され、アルファーまたはベーター線を放射する核種を含んでいる場合に は、特に大きい。これらの極めて毒性が高い治療用核種を安全に投与できる量は 、望ましくないそれらの核種の抗体−キレート複合体からの解離によって制限さ れる。 大部分の治療用核種は多価重金属で、天然に存在する必須元素であり、哺乳動 物の体内にゆっくり吸収され、一旦吸収されると殆ど排泄されないことが知られ ている鉄と幾分似た生理的行動を取る。鉄は大量で毒性を発揮し、生体内の循環 血液中に錯体以外の形態で存在することは決してない。 哺乳動物の身体は、遊離鉄を捕捉するために大きな努力を払っており、種々の 方法を用いている。 １つの方法は、トランスフェリンと呼ばれる鉄輸送タンパク（Fe3+のKd＞10-2 3 ）が関与している。トランスフェリンは（1）新しい赤血球が合成される骨髄の 中に鉄を輸送し、（2）将来使用するために貯蔵タンパク、フェリチン内に鉄を 蓄積する。一般に酸素リガンドを含む“硬酸”のアニオンに優先的に結合する金 属は、トランスフェリン捕捉系の対象となり易い。このような金属には、ガリウ ム、インジウム、イットリウム、ルテチウム、スカンジウム、サマリウム、ガド リニウム等が含まれる。 トランスフェリンにどの程度トランスキレーションされ易いかは、イオン半径 、トランスフェリンの攻撃に曝される金属−キレートの構造の厳密な性質等のそ の他の要因により、金属毎に異なる。 別の金属捕捉系は、タンパク質であるメタロチオネインに基づいている。これ は、7kD単位で21個の遊離システイン残基を持つ。このタンパク質の主な機能は 重金属の解毒で、特にイオウ含有リガンドを典型とする“軟酸”のアニオンに優 先的に結合する金属の捕捉である。このような金属には、銅、亜鉛、カドミウム 、 銀、水銀、鉛等が含まれる。 これら２つの系（トランスフェリンおよびメタロチオネイン）により、哺乳動 物は毒性を発揮する可能性がある重金属のバイオアベイラビリティーを調節する ことができ、それによって自分自身を望ましくない元素の影響から防御する。微 量の金属（キャリアーに結合されていない核種）を含む 抗体−キレートリンカ ー−放射性核種複合体を投与することは毒性学的には殆ど問題ないが、金属を含 む抗体複合体のデザインには、上記に概説された哺乳動物の防御と代謝のメカニ ズムを考慮に入れなくてはならない。 上記から、金属の解離を最小限に止め、生体内で標的部位に金属を高度に選択 的に輸送するために、金属をタンパク質に強固に結合するより有効な金属キレー トタンパク複合体が今なお必要とされている。 本開示の目的は、上記の観察結果を考慮に入れ、放射線免疫シンチグラフィー と特に放射線免疫療法のために改善された薬剤に関して説明することである。 発明の要約 一実施例において、本発明は、タンパク質と複合体を形成している二官能リガ ンドにキレート化される放射性核種を提供する。上記タンパク質は、マーカーに 結合し、複合体形成前には複合体形成部位となる立体保護されたメルカプト基を 少なくとも１個は持つ。 別の実施例において、本発明は抗体または抗体フラグメントと複合体を形成し ている二官能リガンドを提供し、この抗体または抗体フラグメントは、複合体形 成前には、複合体形成部位となる立体保護されたメルカプト基を少なくとも１個 は持つ。複合体は、腫瘍関連抗原と反応する抗体または抗体フラグメントを含む 。 別の実施例において、本発明は、抗体または抗体フラグメントと複合体を形成 している二官能リガンドを提供し、この抗体または抗体フラグメントは、複合体 形成前に、重鎖間のジスルフィド結合を切断処理され、複合体形成部位となり得 るフリーの立体保護されたスルフヒドリル（メルカプト）基を生成している。 別の実施例において、本発明は、疾病部位を検出する方法を提供する。この方 法は、抗原を産生する疾病あるいは抗原に関連する疾病の患者に、立体保護され たスルフヒドリル基において検出可能な金属とキレート形成している二官能キレ ート化剤と複合体を形成しており、抗原に特異的なタンパク質を、一定量非経口 的に注入することから成る。 別の実施例において、本発明は疾病の治療方法を提供する。この方法は、抗原 を産生する疾病、あるいは抗原に関連する疾病の患者に、立体保護されたスルフ ヒドリル基において治療用金属とキレート形成している二官能キレート化剤と複 合体を形成しており、抗原に特異的なタンパク質を、一定量非経口的に注入する ことから成る。 別の実施例において、本発明は滅菌注入用組成物を提供する。この組成物は、 複合体形成前に複合体形成部位となる立体保護されたメルカプト基を少なくとも １個は持つタンパク質と複合体を形成する二官能リガンドにキレート化されてい る金属を含む。 別の実施例において、本発明は、二官能リガンドと少なくとも１個のジスルフ ィド結合を持つタンパク質前駆体由来のタンパク質から成る複合体の調製方法を 提供する。この方法は、（a）タンパク質前駆体をジスルフィド還元剤と反応さ せ、立体保護されたジメルカプトタンパク質を生成し、（b）二官能キレート化 剤をジメルカプトタンパク質と接触させ、複合体を形成することから構成される 。 別の実施例において、本発明は抗体フラグメントと二官能リガンドから成る複 合体を生成する方法を提供する。この方法は、以下のステップから成る。 （a）ジスルフィド基を切断するために、複数の近接するフリーメルカプト基を 産生するには十分であるが、抗体を免疫学的に不活化するには不十分な量の還元 剤で無傷の抗体を部分的に還元し、部分的に還元された抗体を回収するステップ 。 （b）部分的に還元された抗体を切断し、還元されたF(ab')2フラグメントを生成 するステップ。 （c）部分的に還元されたF(ab')2フラグメント溶液を、立体保護されたメルカプ ト基と複合体を形成できる二官能キレート化剤と反応させるステップ。 別の実施例において、本発明は、マーカー物質に結合するペプチドと二官能キ レート化剤の複合体を生成する方法を提供する。この方法は、（a）少なくとも １個のペンダントなスルフヒドリル基（スルフヒドリル側基）を含むペプチドと 、（b）少なくとも１個のペンダントなスルフヒドリル基と特異的に複合体を形 成できる反応基を持つ二官能キレート化剤との混合物を溶液中で接触させるステ ップから成る。この場合、ペンダントなスルフヒドリル基は立体保護されている 。 詳細な説明 タンパク質物質と複合体を形成している二官能リガンドにキレート化されてい る放射性核種に係わる組成と方法、並びに癌、感染症、心血管疾患、炎症状態、 およびその他の病的状態を含む病変の検出と治療に複合体を使用する方法が提供 されている。 癌状態には、癌、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経腫が含まれる。 感染性疾患には、侵入する微生物または寄生虫を原因とするものが含まれる。 ここに使用される“微生物”は、ウィルス、細菌、リケッチア、マイコプラズマ 、原生動物、真菌、および類似の微生物を意味し、“寄生虫”は、感染性の、一 般に顕微鏡レベルまたは非常に小さな多細胞無脊椎動物、あるいはその卵または 幼弱型を意味し、抗体による除去、あるいは溶解または食作用による破壊を受け 易く、例えばマラリア原虫、スピロヘータ、嬬虫等が挙げられる。一方“感染物 質”または“病原体”は、微生物と寄生虫の両者を意味する。 心血管疾患は、血栓や栓塞を含む血管内凝固、心筋梗塞、その他の臓器の梗塞 、アテローム硬化性プラーク等の病変が含まれる。 従って、本発明による方法は、複数の空間的に近接する立体保護されたフリー のスルフヒドリル（メルカプト基）を含むタンパク質溶液を、二官能キレート化 剤溶液と接触させるステップを広く含み、これによって立体保護された部位にお いてタンパク質と複合体を形成する二官能キレート化剤溶液が得られる。 本発明による方法は、二官能キレート化剤と必須のフリーのスルフヒドリル（ メルカプト）基を持つその他のタンパク質の複合体形成に使用することができる 。１つ以上の近接するフリーのスルフヒドリル基を持つタンパク質は、直接標識 することができる。通常システイン残基により結合されているジスルフィド基を 還元剤で処理し、フリーのスルフヒドリル基を生成することができる。遺伝子工 学を利用して、フリーのスルフヒドリル（メルカプト）基を持つタンパク質を生 成することができる。 このタンパク質物質には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク 質、脂質タンパク質等が含まれ、例えばホルモン、リンホカイン、成長因子、癌 遺伝子と癌遺伝子生成物、アルブミン、サイトカイン、酵素、免疫モジュレータ ー、受容体タンパク質、抗受容体タンパク質、抗体および抗体フラグメントとサ ブフラグメント等が挙げられる。 このタンパク質物質は、少なくとも１個の立体保護されたメルカプト基または 少なくとも１個のアクセス可能なジスルフィド基のいずれかを有するのが特徴で 、後者は還元により複合体形成部位として利用できるメルカプト基を提供する。 本発明において特に関心が持たれるタンパク質物質は、抗体および抗体フラグ メントである。“抗体および抗体フラグメント”という言葉は、一般に抗原に特 異的に結合し、免疫複合体を形成する免疫グロブリンまたはそのフラグメントを 意味する。 抗体は、あらゆるクラスの免疫グロブリン全体を指し、例えば、IgG、IgM、Ig A、IgD、IgE、２つまたは複数の抗原またはエピトープに対する特異性を有する キ メラまたはハイブリッド抗体等が挙げられる。ポリクローナル抗体も利用でき、 ヒト、あるいは霊長類、ヤギ、ウサギ、マウス等の適切な動物のアフィニティー 精製された抗体が望ましい。モノクローナル抗体も本発明において使用するのに 適しており、特異性が高いため望ましい。これらは、現在では公知の方法と見な されている方法によって、すなわち免疫原性を有する抗原製剤による哺乳動物の 免疫感作、免疫リンパまたは脾臓細胞と不死の骨髄腫細胞系列との細胞融合、特 異的ハイブリドーマクローン等によって、容易に調製できる。あまり知られてい ないが、本発明における有用性に影響を与えるのは主にその抗体の抗原特異性で あることから、種間融合や、高頻度変異性領域の遺伝子工学操作等のモノクロー ナル抗体調製方法も除外されない。ヒトモノクローナル抗体、種間モノクローナ ル抗体、キメラ（例えばヒト／マウス）モノクローナル抗体、遺伝子工学により 産生される抗体等のモノクローナル抗体を産生する更に新しい技術も利用できる ことは明らかであろう。 本発明において有用な抗体フラグメントは、立体保護されたメルカプト基とF( ab')2を含み、F(ab')2とその同等物質にはハイブリッドフラグメントが含まれる 。免疫グロブリンの高頻度変異性抗原結合領域を保持し、立体保護されたメルカ プト基を持つサブフラグメントも有用である。これには、遺伝子工学によって作 製されたタンパク質または組み換えタンパク質が含まれる。これは、抗原結合部 位を含むか、そうでない場合には天然の免疫グロブリンフラグメントと殆ど同じ ように生体内での標的手段（ターゲティング・ビヒクル）としての機能を有する 。フラグメントは遺伝子工学によって産生されたものでも構わない。 抗体と免疫グロブリンのクラスの混合物も、ハイブリッド抗体を使用できるの と同様に、使用できることに言及すべきである。ハイブリッドは２つの異なる抗 原特異性を持つことができる。２つの特異性を有するハイブリッド抗体フラグメ ントは、米国特許第4,361,544号に明らかにされている抗腫瘍マーカーと同様に 調 製できる。その他のハイブリッド抗体調製法は、例えば米国特許第4,474,893号 および第4,479,895号およびMilstein et al.，Immunol．Today，5:299(1984)に 明らかにされている。 腫瘍抗原に対する抗体と病原体に対する抗体は公知である。例えば、腫瘍、ま たはウィルス、細菌、真菌、寄生虫等による感染性病変によって産生される、あ るいはそれらに関連するマーカー、抗原およびそのような微生物に関連する生成 物に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントが、特に下記において明らか にされている。Hansen et al.，米国特許第3,927,193号およびGoldenberg米国特 許第4,331,647号、第4,348,376号、第4,361,544号、第4,468,457号、第4,444,74 4号、第4,818,709号、第4,624,846号。特に、胃腸、肺、乳、前立腺、卵巣、精 巣、脳またはリンパの腫瘍、肉腫またはメラノーマなどの抗原に対する抗体の利 用が有利である。 心血管病変の検出と治療に有用なタンパク質にはフィブリン特有のタンパク質 、例えばフィブリノーゲン、可溶性フィブリン、抗フィブリン抗体およびフラグ メントフラグメントE1（架橋結合しているフィブリンの調整プラスミン消化によ って調製される60kDaのヒトフィブリンのフラグメント）、プラスミン（新鮮血 栓の溶解に関与する血中酵素）、プラスミノーゲン活性化因子（例えば、ウロキ ナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織中のプラスミノーゲン活性化因子）、ヘパリ ン、およびフィブロネクチン（450kDaの粘着性血漿糖タンパク質）、および血小 板、抗血小板抗体および抗体フラグメント、抗活性化血小板抗体および抗-活性 化血小板因子等の血小板指向性タンパク質等が含まれ、これらは、Koblik et al .，Semin．Nucl．Med.，19:221-237,1989に概説されている。この文献は、引用 することにより本明細書の一部をなすものとする。 感染症の病原体に対する多種多様なモノクローナル抗体が開発されており、い つでも入手可能なことを示すPolinによる概説、Eur．J．Clin．Microbiol.，3(5 ): 387-398，1984の中にまとめられている。これらには、病原体に対するモノクロ ーナル抗体（MAbs）とそれらの抗原が含まれている。それらの例を以下に示す。抗細菌モノクローナル抗体 Streptococcus agaractiae（乳腺炎のウシの乳汁および組織中に見いだされる一 種） レジュネラ・ニューモフィラ菌 化膿連鎖球菌 大腸菌 淋菌 髄膜炎菌 肺炎球菌 B型インフルエンザ菌 梅毒トレポネーマ ライム病スピロヘータ 緑膿菌 ライ菌 ウシ流産菌 結核菌 テタヌストキシン抗ウィルスモノクローナル抗体 HIV-l、-2、-3 A、B、C、D型肝炎 狂犬病ウィルス インフルエンザウィルス サイトメガロウィルス 単純ヘルペスＩ型およびII型 ヒト血清パルボ様ウィルス 呼吸シンシチアルウィルス 帯状疱疹ウィルス Ｂ型ウィルス ハシカウィルス アデノウィルス ヒトＴ細胞白血病ウィルス エプスタイン−バーウィルス ネズミ白血病ウィルス* オタフクカゼウィルス 水疱性口内炎ウィルス シンドビスウィルス リンパ球性脈絡炎ウィルス イボウィルス ブルータングウィルス センダイウィルス ネコ白血病ウィルス レオウィルス ポリオウィルス シミアンウィルス40* マウス乳腺腫瘍ウィルス* デング熱ウィルス 風疹ウィルス *＝動物のウィルス抗原生動物モノクローナル抗体 熱帯熱マラリア原虫 三日熱マラリア原虫 Toxoplasmag ondii Trypanosoma rangeli クルーズトリパノソーマ Trypanosoma rhodesiensei Trypanosoma brucei マンソン住血吸虫 日本住血吸虫 ウシのバベシア症の病原種 Elmeria tenella 回旋糸状虫 熱帯リューシュマニア 旋毛虫 Theileria parva 胞状条虫 ヒツジ条虫（Taenia ovis） 無鉤条虫 単包条虫 Mesocestoides corti抗マイコプラズマモノクローナル抗体 Mycoplasma arthritidis M．hyorhinis M．orale M．arginini Acholeplasma laidlawii M．salivarium M．pneumoniae 感染性微生物に対するモノクローナル抗体の更なる実施例が下記の文献に記載 されている。 ヒト免疫不全ウィルス１型（HIV-1）のgp120糖タンパク質抗原に対するモノク ローナル抗体は公知であり、そのような抗体の中の幾つかは、ヒトにおいて免疫 防御作用を発揮することができる。例えば、Rossi etal.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA，86:8055-8058,1990を参照。その他のウィルス抗原とウィルスによって 誘発される抗原に対するモノクローナル抗体も公知である。これは、エピトープ を適切に選択すれば、治療を行う標的と、それ以外を識別することができること を示している。 マラリア原虫に対するモノクローナル抗体は、スポロゾイト（種虫）、メロゾ イト（分裂小体）、シゾント（繁殖体）、生殖母細胞段階に対して指向できる。 モノクローナル抗体は種虫（種虫周辺抗原）に対して産生されており、in vitro と齧歯類において種虫を中和することが明らかにされている（N．Yoshida et al ．Science 207:71-73，1980）。 幾つかのグループは、トキソプラズマ症に関与する原生動物寄生虫T.gondiiに 対するモノクローナル抗体を作製した（Kasper et al．J．Immunol．129:1694-1 699,1982、同じく130:2407-2412,1983）。 幼住血吸虫の表面の抗原に対するモノクローナル抗体が作製され、in vivoま たはin vitroで幼住血吸虫に対して作用することが見いだされている（Simposon et al.，Parasitology，83:163-177,1981；Smith et al.，Parasitology，84:8 3-91,1982；Gryzch et al.，J．Immunol.，129:2739-2743，1982；Zodda et al. ， J．Immunol．129:2326-2328,1982；Dissous et al.，J．Immunol.，129:2232-22 34,1982）。 クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）は、シャーガス病の原因とな る種で、吸血性サシガメ科の昆虫によって感染する。モノクローナル抗体は、寄 生虫のある型から次の型への分化（エピマスティゴートからトリポマスティゴー トの段階へ）をin vitroで特異的に抑制し、細胞表面の糖タンパク質と反応する ものが産生されたが、この抗原は、寄生虫の哺乳動物型（血流）には存在しない （Sher et al.，Nature，300:639-640，1982）。 ヒトの大多数の感染症の原因となる多くの微生物（細菌、ウィルス、原生動物 、寄生虫）に対する適切なモノクローナル抗体が作製され、多くがin vitroの診 断目的に過去に使用されている。これらの抗体と、公知の方法によって産生可能 な新しいモノクローナル抗体とは、本発明の使用に適している。 望ましいタンパク質は、癌または肉腫細胞またはリンパ腫に存在する腫瘍関連 抗原と反応する抗体または抗体フラグメントである。このような抗体は、例えば Goldenberg et al.，Journal of Clinical Oncology，Vol 9，No.4，pp.548-564 ,1991およびPawlak et al.，Cancer Research，Vol 49，pp．4568-4577,1989の 中にそれぞれLL-2およびEPB-2として明らかにされているが、これらは同じ抗体 である。その他は、抗CEAモノクローナル抗体を明らかにしているPrimus et al. ，Cancer Res.，43:686-692，1983、抗CEAモノクローナル抗体を明らかにし、比 較しているHansen et al.，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，30:414,1989、結腸特 異性抗原-p（colon-specific antigen-p：CSAp）を明らかにしているGold et al .，Cancer Res.，50:6405-6409,1990、膵臓の腫瘍関連エピトープに対するモノ クローナル抗体を明らかにしているGold et al.，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.， 31:292,1990に明らかにされている。 少なくとも１個のフリーのスルフヒドリル（メルカプト）基を持つタンパク質 、 特に抗体または抗体フラグメントは、穏やかな条件の下でメルカプト基と結合で きる部分を持つリガンドと選択的に複合体を形成でき、スルフヒドリル基との強 固な結合を形成する。これは、血液およびその他の体液および組織中で極めて安 定性が高い。 抗体および幾つかの抗体フラグメントは、重鎖と結合する１個以上のジスルフ ィド結合と、軽鎖と重鎖を結合するジスルフィド結合を持つ。後者のジスルフィ ド結合には、ジスルフィド還元剤はアクセスしにくく、重鎖を結合するジスルフ ィド結合しか通常は選択的に切断できない。その結果得られるフラグメントは、 その免疫特異性と抗原結合能を保持している。還元条件が激し過ぎたり、還元剤 をフラグメントと長時間にわたり接触させたままにしておくと、通常は反応性が 乏しい軽鎖と重鎖を結合するジスルフィド結合が最終的に還元されることがある ので、免疫グロブリンの重鎖を結合するジスルフィド結合の還元は、注意深く実 施されなくてはならない。 ジスルフィド結合の還元は、システイン、メルカプトエタノール、ジエチオエ リスリトール（DTE）、ジチオスレイトール（DTT）、グルタチオン等のチオール 還元剤によって有効に実施される。 反応条件に応じて、ジスルフィド結合の還元は、（a）存在するジスルフィド 結合の一部のみを還元するため、ジスルフィドタンパク質からジメルカプトタン パク質を生成するか、あるいは（b）重鎖を結合するジスルフィド結合の全てを 完全に還元することによって、ジスルフィドタンパク質を切断し、フリーのメル カプト部位を含むフラグメントを生成する。 タンパク質に存在するジスルフィド結合の一部だけが還元され、それによって メルカプト基がタンパク質の三次構造によって立体保護されているジメルカプト タンパク質が生成されるのが望ましい。これによって、抗体の還元されたジスル フィド基の１つを介して抗体にキレートを付着させることにより、トランスフェ リンの攻撃から金属キレートを物理的により効果的に防御することが可能な複合 体が得られる。タンパク質のスルフヒドリル基は、互いに共有結合している鎖中 の対応するジスルフィドの役割のため、内側にあるため、タンパク質のリジン残 基上にリガンドが置換された従来の技術による複合体よりも、リガンドは、抗体 結合部位から離れ、かつより露出度の小さい位置に保持される。望ましいメルカ プト基の部位は、イミノチオレインを用いる反応でリジン残基をフリーのチオー ルに変換し、その結果キレートをこの分子の内側にないチオール部分に付着させ ることによっては不可能な方法で立体保護されたものでもある（Blatter et al. Biochemistry 24:1517-1524,1985）。 立体化学的に保護された位置においては、対応する金属−リガンド−モノクロ ーナル抗体は、トランスフェリンのような強力な競合タンパク質キレート化剤の 攻撃に長時間抵抗する。この効果は、上述のトランスフェリントランスキレーシ ョンメカニズムによる骨取り込み量を減少させるため、毒性が低くなるので金属 をより多く投与でき、より優れた治療効果を達成できる。この方法は、ヒトモノ クローナル抗体のような血液循環時間が長い薬剤や、半減期が長いアイソトープ が優れた治療効果を発揮すると思われる場合に、特に有用である。 少なくとも１個のジスルフィド結合を含むタンパク質、例えば抗体またはF(ab ')2フラグメントを公知のジスルフィド結合還元剤、例えばジチオスレイトール 、システイン、メルカプトエタノール等によって還元すると、典型的には精製時 間を含めて１時間未満の短時間で、分析により１−10個のフリーのスルフヒドリ ル（メルカプトまたはチオール）基を持つ抗体が生成される。 このようなジスルフィド還元にはシステインが望ましく、システインと同じ酸 化能を持つその他のチオールも有用である。ジスルフィド還元剤とタンパク質の 比率は、鎖間ジスルフィド結合の安定性によって異なり、個々のケースによって 至適化されなくてはならない。F(ab')2抗体フラグメントのジスルフィド結合は 、 10〜30mMのシステインによって効果的に実施され、望ましくは約20mMで、タンパ ク質濃度は約10mg/mlである。 一般に、約0.01〜10mg/mlの濃度の抗体または抗体フラグメントの溶液での実 施が有効で、0.1〜5mg/ml溶液が望ましく、溶液は、一般には生理食塩水で、4.0 〜4.5のやや酸性のpHに緩衝されているのが望ましい。 テクネチウムやレニウム等のアイソトープによる放射性同位元素標識を可能に すると言われているジスルフィド基を還元する本技術に精通する者にとって公知 のその他の方法がある。このような方法は、1988年10月６日発行ＷＯ第88／0783 2号、Reno et al．の米国特許第4,877,868号、Rhodesの米国特許第5,078,985号 に明らかにされており、これらの文献は引用することにより本明細書の一部をな すものとする。これらの報告は放射性同位元素標識に限定されているが、明らか にされた方法の変法は、少なくとも１個の立体保護されたメルカプト基を持つタ ンパク質を生成するための本発明において有用と思われる。 一旦還元されれば、厳密に酸素を含まない条件で保存すれば、メルカプト基を 含むタンパク質は極めて安定である。安定性は、特にpH6以下のpHが低い条件で 保存しても、高くできる。より望ましい安定化方法は、メルカプト基を含むタン パク質溶液を凍結することである。 広範にわたる有機キレート化剤またはリガンドが、タンパク質と複合体を形成 できる。タンパク質と複合体を形成する有機リガンドは、天然または合成アミン 類、ポルフィリン類、アミノカルボン酸類、イミノカルボン酸類、エーテル類、 チオール類、フェノール類、グリコール類、アルコール類またはポリアミン類、 ポリアミノカルボン酸類、ポリイミノカルボン酸類、アミノポリカルボン酸類、 イミノポリカルボン酸類、ニトリロカルボン酸類、ジニトリロポリカルボン酸類 、ポリニトリロポリカルボン酸類、エチレンジアミンテトラアセテート類、ジエ チレントリアミンペンタまたはテトラアセテート類、トリエチレンテトラアミン ヘ キサアセテート類、ポリエーテル類、ポリチオール類、クリプタンド類、ポリエ ーテルフェノレート類、ポリエーテルチオール類、チオグリコールまたはアルコ ールのエーテル類、ポリアミンフェノール類、全て非環式、環式高分子、環式、 環式高分子または多環式またはのいずれかで、あるいはその他の安定性が高い金 属キレートまたはクリプテート（cryptate）のいずれかから選択できる。 本発明において有用なリガンドは、タンパク質のメルカプト基に結合するのに 適切な、金属が結合されていない有機官能基を持つ。官能基は、ブロモアセトア ミド、マレイミド、または他の官能基の存在下にメルカプト基に特異的に結合す る２分子複合体形成剤またはカップリング剤である官能基の中から選択できる。 水酸基またはアミノ基よりもメルカプト基に選択的に結合するその他の部分は、 適当な反応条件下でヨードアセチル類、クロロアセチル類、有機水銀類、ハロゲ ン化アルキル類、s-トリアジン類、アジリジン類、エポキシド類、ビニルスルフ ォン類、ニトロソ尿素類である。 リガンドは、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）の誘導体が望ましい。 DTPAリガンドは金属イオンと強固に結合し、本発明に使用されるDTPA誘導体は、 金属キレート結合の観点からも、キレート−タンパク質複合体の観点からも安定 性のタンパク質と複合体を形成するキレートを形成することが見いだされている 。これらの特性は、特に生体内に応用する場合には非常に重要である。例えば、 血中導入後、キレートが金属を解離すると、これらのイオンはトランスフェリン または同等物と結合するか、あるいは全身の循環系全体に分布する傾向がある。 更に、これらのイオンは最終的に肝臓や脾臓等の臓器、骨、または腎臓内に集ま り、そこに留まる傾向がある。これらの作用は、金属の毒性とその放射能により 、深刻な結果を引き起こす可能性がある。更に、もしも、キレートが抗体と安定 性が高い複合体を形成しない場合には、標的部位に運ばれる金属の量が著明に減 少し、それに応じて効果も減少する。複合体が診断目的に使われる場合には、金 属の解 離は望ましくないバックグラウンドの放射能を増大させる可能性がある。また、 DTPA-タンパク質複合体と金属のキレート形成は短時間で達成され、収率は90％ を超える。これは、金属取り込み速度が遅いリガンドを上回る重大な実利的な利 点である。 本発明に使用できる金属には、２価以上の放射性または非放射性元素が含まれ る。１価の金属は一般に本発明の目的に適った安定性が十分高いキレートを形成 しない。代表的な放射性元素には、d-亜殻の遷移金属、IIIA、IVA、VA、VIA、VI IA、IIIB、IVB、VB属金属、ランタニド類、アクチニド類、超ウラン金属が含ま れる。非放射性金属は、常磁性、蛍光、リン光等の有用な物理特性によって、選 択される。本発明は金属または金属キレートの観点から論じられているが、実際 には金属イオンが複合体の中でキレートを形成していることは理解されるであろ う。 タンパク質と複合体を形成する金属キレートをin vivoの放射線画像化に使用 する場合には、インジウム-111（ガンマ線）またはガリウム-68（陽電子）のよ うなガンマ線または陽子電子を放射する放射性金属を、選択された検出方法に応 じて使用することができる。放射線療法を目的とする場合には、放射性金属はア ルファ線（例えば、ビスマス−212、アクチニウム-225、ビスマス-213、、ベー タ線（例えば、鉛-212、イットリウム-90、銅-67、スカンジウム-47）またはオ ージェ電子放射物質を使用できる。ビスマス-212のようなアルファ線放射物質を 治療に使用するのが望ましい。常磁性、蛍光、リン光を、例えばin vivoまたはi n vitroテストに使用できる。どの特定の金属または原子価の状態を選択するか は、技術者の裁量による。 金属のキレート化は、溶液中で実施され、強酸または強塩基の使用は避けるの が望ましい。どのようなキレート−抗体複合体を目的として金属のキレート化を 行う場合でも、抗体の生物活性または特異性を著明に低下させないpHで実施する 。一般に、許容範囲はpH3.2からpH9程度であるが、抗体によってはpHの範囲をよ り 狭く制限しなくてはならない場合がある。pHが５以下の場合、多くの金属にとっ て、金属イオンの抗体への偶発的結合は実質的に障害される。従って、望ましい 範囲は、普通はpH３から９程度である。しかし、使用される金属の溶液に固有の 要因によっては、pH９程度まで可能である。範囲内の適当なpHは技術者の裁量に よる。 本発明において有用な機能を発揮するDTPAリガンドは以下の式Ｉで示される構 造を持つ。 式中、R1またはR2は、 で、この場合Ｘは、水酸基またはアミノ基よりもメルカプト基に優先的に結合す る官能基で、ブロモアセトイミド、マレイミド、ヨードアセチル、クロロアセチ ル、有機水銀、ハロゲン化アルキル、−トリアジン、アジリジン、エポキシド、 ビニルスルホン、またはニトロソ尿素が望ましく、ブロモアセトアミドとマレイ ミドが最も望ましい。nは、１から15で、１〜５が望ましく、１が最も望ましい 。mは、０〜15で、０が最も望ましい。R1〜R4、R1'〜R4'は互いに独立してHまた はC1-5アルキル基、あるいはR3とR4は、共に１〜６個の、望ましくは４個の炭素 を持つアルキル鎖である。 本発明は、式Ｉの複合体の金属キレートを含む。この場合金属は、銅、鉛、鉄 マンガン、インジウム、ガドリウム、アクチニウム、ルテチウム、パラジウム、 クロム、イットリウム、スカンジウム、ビスマス、ランタニド、金、銀、ガリウ ム等の元素から選択される。このような金属キレートは、治療および診断（検出 ）薬としても利用できる。 本発明の特に望ましい実施例は、放射性同位体In-111、In-114m、Y-90、Bi-21 2、Ac-225、Pb-202、Pb-212、Ga-66、Ga-67、Ga-68、Cu-67、ガドリニウムが付 いた式Ｉのリガンドの金属キレートが関与する。 本発明において有用な二官能リガンドの更なる特徴は、それらが癌の検出と治 療に使われているその他の多様な放射性金属と生体内で安定な錯体を形成する点 である。従って、患者は、リガンドのIn-111抗体複合体によって画像化され、そ の後同じ抗体キレート複合体のイットリウム錯体によって治療されるので、患者 の腫瘍に輸送される放射能の線量の計算が容易となり、その結果治療を有効に実 施す可能性が増大する。 本発明の金属キレートと複合体を形成している抗体は、どの適切な薬剤担体中 でも生体内投与が可能である。先に述べたように、生理食塩水の使用が適切であ る。しばしば、担体には、抗体を安定化するために、ヒト血清アルブミンのよう な少量の担体タンパク質が含まれる。溶液内の金属キレートと複合体を形成して いる抗体の濃度は、選択できる。0.5mg/mlの濃度はいつでも得られるが、濃度は どのように適用されるかによって、大きく変動し得る。担体中の生物活性物質の 適正濃度は、その技術においてルーチンに決定される。 どのような適用に利用される場合でも有効放射線量または金属含有量も、その 適用の特殊性によって左右される。例えば腫瘍を治療する場合には、線量は、特 に腫瘍の量、アクセスし易さ、その他によって左右される。同様に、金属キレー トと複合体を形成している抗体を診断目的に利用する場合には、特に使用される 検知機器、検査部位の位置等によって左右される。抗原が特定部位だけでなく循 環血液中にも存在する場合には、循環血液中の抗原を治療前に除去することがで きる。このような抗原の除去は、例えば未標識抗体を使用して、あるいは血漿搬 出法によって達成できる。後者は、患者の血清を処理し抗原を除去する方法であ る。 便利なように、タンパク質複合体の生理的溶液は、金属を含まない滅菌バイア ルに、例えばタンパク質複合体約0.1〜100mg/バイアルを１回分として計り入れ 、バイアルは栓をし、密封して低温保存するか、あるいは凍結乾燥し、栓をし、 密封して保存する。これらのキットの変更と改変は、患者あるいは治療法のそれ ぞれのニーズによって、また放射性同位体が供給される、あるいは利用可能とな る形態によって左右されることは、通常の熟練した技術者には明らかであろう。 更に、病変によって産生される抗原、あるいは病変に伴う抗原と特異的に結合 し、有効量の放射性核種をキレート化している二官能キレート化剤と複合体を形 成している抗体または抗体フラグメントを、非経口的に患者に投与するような、 癌、心血管疾患、感染または炎症病変の検出または治療方法において、本発明の 方法に従って作られた放射性核種−二官能キレート化剤と複合体を形成している 抗体または抗体フラグメントの使用は、１つの改良例となる。 更に詳細な説明を加えなくても、本技術に精通する者は、先述の説明を用いて 本発明の全範囲を利用できるものと確信される。従って、以下の望ましい実施例 は、単に説明であって、本報告の残りの部分をいかなる方法でも限定するための ものではない。以下の実施例において、全ての温度はセ氏温度で補正されずに提 示されている。特に表示されていない限り、全ての割合とパーセンテージは重量 で表示されている。 実施例 例１ １Ａ-キレート対抗体比を決定するために使用されるインジウム／111In溶液の調 製 インジウム箔（226.3mg）をHClに溶解し、H2Oで希釈し、0.6N HCl中に100ml当 たり1.97×10-3モルとなるようにする。５μｌの1.97×10-2MのInCl3（9.85×10-8 モル）を94μlの0.1Mクエン酸アンモニウム、pH5.58と混合し、１μlの111In （13μCi）を0.1Mクエン酸アンモニウムに添加して、9.85×10-4Mクエン酸イン ジウムを生成し、クエン酸インジウム溶液を調製する。１Ｂ-111In溶液の調製 New England Nuclear社から購入した111InCl3を、0.1Mクエン酸アンモニウム 、pH5.58で希釈し、15μCi／μｌの溶液を得る。放射性同位元素標識に使用する 前に、この混合液を室温で１時間インキュベートする。 例２ ２Ａ-IgGのIgG-SHへの還元 ヒトα−フェトプロテインに対するネズミモノクローナル抗体（AFP）であるI gG（Goldenberg et al．J．Clin．Oncol．5:1827-1835,1987）を、2-メルカプト エタノール（26mM）により、pH8.7で４℃において10分間還元し、IgG-SHを生成 する。精製のために、還元混合物を、pH8.1の0.1M燐酸ナトリウム中でSephadex G-50-80のスピンカラムにかける。溶出液中のフリーの立体保護されたSH基の数 はEllman反応（Ellman，Arc．Biochem．Biopys．82:70-77,1959）により、IgGあ たり4.75個と決定される。２Ｂ-IgG-SHと二官能リガンドの複合体形成 450μlの２Ａで生成されるIgG-SH（7.3mg、4.7×10-8M）と８μｌのブロモア セトアミドベンジル−ジエチレントリアミンペント酢酸（Br-Bz-DTPA）（2.3×1 0-7モル）の混合物を37℃、pH8.1で30分間インキュベートすることによって、Ig G-SHと二官能リガンドの複合体が形成される。複合体形成されたAFP-IgG-S-Bz-D TPAをpH5.3の50/150mMアセテート／NaCl中の３mlのSephadex G-50-80のスピンカ ラムで精製する。UV（λ280nm）により、溶出液の複合体濃度は13.3mg/mlと決定 される。二官能 リガンド対IgG比は、金属結合分析により求められる。２Ｃ-抗体あたりのDTPA置換率を決定するために１Ａのインジウム／111In溶液で 標識する。 ２Ｂの複合体（５μl、4.3×10-10モル）を、１Ａの9.85×10-4Mクエン酸イン ジウム（4.9×10-9）溶液５μｌとpH5.58の0.1Mクエン酸アンモニウム10μｌと 混合する。混合物を室温で70分間インキュベートする。10mM（エチレンジアミン 四酢酸）中のITLCにより、36％のインジウムが複合体に結合されていることが示 される。非特異的に結合しているインジウムを除去するために、１μlの部分標 本を、１μlの0.1M EDTAと８μlのH2Oと混合し、10分間インキュベートする。10 mMEDTA（pH6.4）中のシリカゲルをしみ込ませたグラスファイバー片上のインス タント薄層クロマトグラフィー（ITLC）により、18％の111Inが複合体に結合さ れていることが示される。これより、キレート対IgG抗体比は、約２と計算され る。２Ｄ-111In溶液による標識： ２Ｂで生成されたAFP-IgG-S-Bz-DTPA（0.4μｌ、5.3μg）を、１の溶液と類似 の方法で得られる0.1Mクエン酸アンモニウム中の担体を含まない111In（726μCi ）40μlで処理する。放射性同位元素標識された混合物を室温で一晩インキュベ ートする。非特異的に結合した111Inを、EDTA（最終濃度）10mMを含む反応混合 物と室温で10分間処理することによって、除去する。EDTAチェイス混合物のITLC によって、63％のインジウムが抗体に結合されていることが示される。 ３mlのスピンカラム、Sephadex G-50-80、50/150mMアセテート／生理食塩水、 pH5.3、で精製が行われる。溶出液の高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）に より、生成物が、キャリブレーションされたサイズエクスクルージョンカラムで 8.52分で溶出することが示される。結合されていない111Inを確実に除去するた めに、EDTAチェイスとITLCを溶出液の部分標本で繰り返す。ITLCにより、放射能 の99％が元通り残っており、抗体に結合していることが示される。抗-AFPアフィ ゲルに対 する免疫反応性は93％と決定される。 例３ ３Ａ-IgGのIgG-SHへの還元 AFP（IgG）を、2-メルカプトエタノール（10mM）により、pH8.7で４℃におい て10分間還元し、IgG-SHを生成する。精製のために、還元混合物を、pH8.1の0.1 M燐酸ナトリウム中でSephadex G-50-80のスピンカラムにかける。溶出液中のフ リーの立体保護されたSH基の数は抗体あたり1.18個と決定される。３Ｂ-IgG-SHと二官能リガンドの複合体形成 450μlのIgG-SH（5.2mg、4.7×10-8M）と６μlのブロモアセトアミドベンジル -DTPA（Br-Bz-DTPA）（l.8×10-7モル）の混合物を37℃、pH8.1で30分間インキ ュベートすることによって、IgG-SHと二官能キレート化剤の複合体が形成される 。複合体をpH5.3の50/150mMアセテート／NaCl中の３mlのSephadex G-50-80のス ピンカラムで精製する。UV（λ280nm）により、溶出液の複合体濃度は13.1mg/ml と決定される。二官能リガンド対抗体比は、金属結合分析により求められる。３Ｃ-抗体複合体のDTPA置換率を決定するために１Ａのインジウム／111In溶液で 標識する。 ３Ｂの複合体（５μl、4.3×10-10モル）を、１Ａの9.85×10-4Mクエン酸イン ジウム（4.9×10-9モル）溶液５μlとpH5.58の0.1Mクエン酸アンモニウム10μl と混合する。混合物を室温で70分間インキュベートする。10mMEDTA中のITLCによ り、18％のインジウムが複合体に結合されていることが示される。非特異的に結 合しているインジウムを除去するために、１μlの部分標本を、１μlの0.1MEDTA と８μlのH2Oと混合し、10分間インキュベートする。10mMEDTA（pH6.4）中のITL Cにより、4.1％の111Inが複合体に結合されていることが示される。これより、 キレート対IgG抗体比は、0.48と計算される。３Ｄ-111In溶液による標識 ２ＢのAFP-IgG-S-Bz-DTPA（1.6μl、20μg）を、１Ａと類似の方法で得られる 0.1Mクエン酸アンモニウム中の担体を含まない111In（726μCi）40μlで処理す る。放射性同位元素標識された混合物を室温で一晩インキュベートする。非特異 的に結合した111Inを、EDTA（最終濃度10mM）を含む反応混合物と室温で10分間 処理することによって、除去する。10mMEDTA中のITLCによって、65％の活性が抗 体に結合されていることが示される。１mlのスピンカラム、SephadexG-50-80、5 0/1150mMアセテート／生理食塩水、pH5.3、で精製が行われる。溶出液のHPLCに より、生成物が8.52分で溶出することが示される。結合されていない111Inを確 実に除去するために、EDTAチェイスとITLCを溶出液の部分標本で繰り返す。ITLC により、放射能の99％が元通り残っており、抗体に結合していることが示される 。抗-AFPアフィゲルに対する免疫反応性は81％と決定される。３Ｅ-別の111In溶液による標識 AFP-IgG-S-Bz-DTPA（52μl、777μg）を、１Ａと類似の方法で得られる0.1Mク エン酸アンモニウム中の111In（2.69mCi）140μlで処理する。放射性同位元素標 識された混合物を室温で１時間インキュベートする。非特異的に結合した111In を、EDTA（最終濃度10mM）を含む反応混合物と室温で10分間処理することによっ て、除去する。10mMEDTA中のITLCによって、84％の活性が抗体に結合されている ことが示される。 １mlのスピンカラム、Sephadex G-50-80、50/150mMアセテート／生理食塩水、 pH5.3、で精製が行われる。溶出液のHPLCにより、生成物が8.59分で溶出するこ とが示される。結合されていない111Inを確実に除去するために、EDTAチェイス とITLCを溶出液の部分標本で繰り返す。ITLCにより、放射能の99.6％が抗体に結 合され、最初の部分に残っていることが示される。抗-AFPアフィゲルに対する免 疫反応性は97％と決定される。 例４ Ａ． LL2と呼ばれるネズミモノクローナル抗体のIgG（J．Clin．Oncol.1991） を低分子量メルカプタンにより還元し、ペプシン処理によりF(ab')2SHに変換し 、プロテインAのサブトラクションクロマトグラフィーと濾過により精製する。 全てのステップは、アルゴンガスをパージングした溶液を使用し、アルゴン環境 下に実施される。 Ｂ． F(ab')2-SHと二官能リガンドの複合体形成 450μlのF(ab')2-SH（5.2mg）と６μlのブロモアセトアミドベンジル−DTPA(B r-Bz-DTPA)(F(ab')2に対し5:1以上のモル比）の混合物を37℃、pH8.1で30分間イ ンキュベートすることによって、４ＡのF(ab')2-SHと二官能リガンドの複合体が 形成される。複合体をpH5.3の50/150mMアセテート／NaCl中の３mlのSephadex G- 50-80のスピンカラムで精製する。UV（λ280nm）により、溶出液の複合体濃度が 決定される。二官能リガンド／抗体比は、上述の金属結合分析により求められる 。 Ｃ． 111In溶液による標識 ４ＢのLL2-F(ab')2-S-Bz-DTPA（1.6μl、20μg）を、１Ａと類似の方法で得ら れる0.1Mクエン酸アンモニウム中の111In（726μCi）40μlで処理する。放射性 同位元素標識された混合物を室温で一晩インキュベートする。非特異的に結合し た111Inを、EDTA（最終濃度10mM）を含む反応混合物と室温で10分間処理するこ とによって、除去する。10mMEDTA中のITLCによって、抗体に結合されている放射 活性量が示される。１mlのスピンカラム、Sephadex G-50-80、50/150mMアセテー ト／生理食塩水、pH5.3、で精製が行われる。溶出液のHPLCにより、生成物が示 される。結合されていない111Inを確実に除去するために、EDTAチェースとITLC を溶出液の部分標本で繰り返す。ITLCにより、放射能の99％が元通り残っており 、抗体に結合していることが示される。抗-AFPアフィゲルに対する免疫反応性が 決定される。 例５−イットリウム-90によるAFP-IgG-S-Bz-DTPAの放射性同位元素標識 pH6.5の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液に溶解したAFP-IgG-S-Bz-DTPA（2μl、34μ g） を、pH6の0.5M酢酸ナトリウム緩衝液に溶解したイットリウム-90溶液（10μl、7 7μCi）に加える。溶液を混合し、室温で45分間インキュベートする。インキュ ベーション後0.01Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）中で行われた標識混合物の 部分標本のインスタント薄層クロマトグラフィー（ITLC）から、タンパク質に伴 う放射活性が96.6％であることが明らかにされた。非特異的に結合しているイッ トリウムをテストするために、標識混合物の部分標本に、0.01MEDTA溶液を室温 で10分間作用させる。上記と同じ溶媒系でITLCから、EDTAを作用させた後に抗体 に結合されているイットリウムが96.4％であることが示される。 例６−対照例 ６Ａ-IgGと二官能リガンドの複合体形成 450μlのIgG-SH（5.2mg、4.7×10-8M）と６μlのブロモアセトアミドベンジル -DTPA（Br-Bz-DTPA）（1.8×10-7モル）の混合物を37℃、pH8.1で30分間インキ ュベートすることによって、還元されていないAFP（IgG）と二官能リガンドの複 合体が形成される。複合体をpH5.3の50/150mMアセテート／NaCl中の３mlのSepha dex G-50-80のスピンカラムで精製する。UV（λ280nm）により、溶出液の複合体 濃度が決定される。二官能リガンド／抗体比は、２つの異なる実験において金属 結合分析により0.04と0.06と決定されたことから、フリーのチオール基が存在し なければ複合体形成は起こらないことが明らかにされた。 例７−生成物による治療 疾病が疑われる被験者に、標的組織に対する特異性の観点から適切に選択され たIgGを使用し、上記の方法に従って調製された111In-IgG複合体を注入する。注 入後適切な時間が経過した後（１〜336時間）、被験者をプラナーまたはSPECT（ シングルフォトンエミッションCT）で撮像する。 例８−生成物による治療 上記の方法で90Y-IgGの試料を希釈し、使用されるIgGにより治療される疾病を 有する患者に、毒性を最小限に止め治療効果を発揮する適当な線量の90Yを注入 する。 前記実施例は、単に説明のためのもので、本技術において通常の技術を有する 者は数多くの変更および改変を行い、本発明による方法、キット、およびその使 用法を、本発明の範囲と意図から逸脱すること無く、種々の利用法と条件に適合 させることができる。 本発明の広範にわたる範囲は、添付の請求の範囲と、無数のその同等物によっ て規定される。
【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年４月１１日 【補正内容】 請求の範囲（補正） １．（a）癌病変または感染性病変に関連するマーカーと特異的に結合する少 なくとも１個の立体保護されたメルカプト基を持つ抗体または抗体フラグメント と、 （b）（i）上記立体保護されたメルカプト基に結合される第一の官能部分 と（ii）イットリウム-90イオンをキレート化できる第二の官能部分とを持つ少 なくとも１個のリガンドと、 から成る治療用複合体の前駆複合体。 ２．上記リガンドの上記第２の官能部分にキレート化されているイットリウム -90と、請求項１記載の前駆複合体とを含む治療用複合体。 ３．上記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１記載の複合体。 ４．上記抗体フラグメントが、F(ab)2またはF(ab')2である請求項１記載の複 合体。 ５．上記抗体または抗体フラグメントが、リンパ腫、癌、肉腫、白血病、骨髄 腫または神経腫瘍から成るグループから選択される癌と関連する抗原と特異的に 結合する、請求項１記載の複合体。 ６．上記マーカーが、ウィルス抗原またはウィルスによって誘発される抗原で ある請求項１記載の複合体。 ７．上記リガンドの第一の官能部分が、アセトアミド、サクシニイミド、有機 水銀、アルキル、水酸化アルキル、アミノアルキル、アルキルスルフォン、チオ 尿素から成るグループから選択される請求項１記載の前駆複合体。 ８．上記リガンドが、次の式Ｉ （式中、R1またはR2のどちらか１つは、 で示される構造を持ち、ここで、Xは、水酸基またはアミノ基よりもメルカプト 基に優先的に反応する官能基で、nは、１〜15、Yは、(CH2)n、mは、０〜15、R1 〜R4とR1'〜R4'は、それぞれ独立して、HまたはC1-5アルキル基、あるいはR3とR4 は一緒になって１〜６個の炭素を持つアルキル鎖を形成する。） で示される構造を持つ請求項１記載の複合体。 ９．Xが、アセトアミド、サクシニイミド、有機水銀、アルキル、水酸化アル キル、アミノアルキル、アルキルスルフォン、チオ尿素から成るグループから選 択される請求項８記載の複合体。 10．Xが、アセトアミドまたはサクシニイミドである請求項９記載の複合体。 11．上記リガンドが、次の式Ｉ （式中、R1またはR2のどちらか１つは、 で示される構造を持ち、ここで、Xは、アセトアミドまたはサクシニイミド基で 、 R1〜R4とR1'〜R4'は、それぞれ独立して、HまたはC1-5アルキル基、あるいはR3 とR4は、一緒になって１〜６個の炭素を持つアルキル鎖を形成する。） で示される構造を持つ請求項１記載の複合体。 12．マーカーを産生あるいはマーカーに関連する感染性疾患の患者の治療に使 用するための、上記疾病を有する患者に非経口的に注入される治療薬の製造にお いて、マーカーに特異的で、立体保護されている切断されたジスルフィドを介し てイットリウム-90とキレート形成しているリガンドと複合体を形成しているモ ノクローナル抗体を含む複合体の治療量の使用。 13．上記リガンドが、アセトアミド、サクシニイミド、有機水銀、アルキル、 水酸化アルキル、アミノアルキル、アルキルスルフォン、チオ尿素から成るグル ープから選択される請求項12記載の使用。 14．マーカーを産生する、あるいはマーカーに関連する癌患者の治療に使用す るために、上記癌患者に非経口的に注入される治療薬の調製において、マーカー に特異的で、立体保護されている切断されたジスルフィドを介し、イットリウム -90とキレート形成しているリガンドと複合体を形成しているモノクローナル抗 体から成る複合体の治療量の使用。 15．上記リガンドが、アセトアミド、サクシニイミド、有機水銀、アルキル、 水酸化アルキル、アミノアルキル、アルキルスルフォン、チオ尿素から成るグル ープから選択される請求項14記載の使用。 16．上記モノクローナル抗体が、リンパ腫、癌、肉腫、白血病、骨髄腫または 神経腫瘍から成るグループから選択される癌と関連する抗原に特異的に結合する 請求項14記載の使用。 17．（a）請求項２記載の治療用複合体と、 （b）薬剤として許容可能な注入用賦形剤と、 から成る滅菌された注入可能な組成物。 18．（a）癌病変または感染性病変に関連するマーカーと特異的に結合する抗 体または抗体フラグメントのジスルフィド結合を部分的に還元し、少なくとも１ 個のメルカプト基を持つジメルカプトタンパク質を生成するステップと、 （b）上記ジメルカプトタンパク質を、（i）メルカプト基に結合できる第 一の官能部分と、（ii）イットリウム-90イオンをキレート化できる第二の官能 部分とを持つリガンドに、接触させるステップと、 を含み、 ここで、上記接触ステップにより、立体保護されたメルカプト基に結合した少 なくとも１個のリガンドを有する抗体または抗体フラグメントの複合体が生成さ れる、治療用複合体の前駆複合体の製造方法。 19．請求項18記載の前駆複合体の上記リガンドの上記第二の官能部分とイット リウム-90をキレート形成させるステップを更に含み、該キレート形成ステップ の生成物が癌病変または感染性病変を治療するための治療用複合体である、治療 用複合体の製造方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/553 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 33/574 8415−4Ｃ Ａ６１Ｋ 43/00 ＡＤＵ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 ハンセン，ハンス・ジェイ アメリカ合衆国、08783 ニュー・ジャー ジー、ミスティック・アイランド、ノー ス・バージー・ドライヴ 2617

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．複合体形成前に複合体形成部位となる少なくとも１個のメルカプト基を持 ち、標的病変または病原微生物関連物質と反応するタンパク質と、金属をキレー ト化でき、かつメルカプト基に選択的に結合する部分を持つリガンドとを含む、 リガンドとタンパク質の複合体。 ２．上記タンパク質が、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、リンホカイン、 成長因子、アルブミン、サイトカイン、酵素、免疫モジュレーター、受容体タン パク質、抗受容体タンパク質、抗体または抗体フラグメントである請求項１記載 の複合体。 ３．上記タンパク質が、複合体形成前に還元され、ジメルカプトタンパク質が 形成される少なくとも１個のジスルフィド結合を持つ、請求項１記載の複合体。 ４．上記ジメルカプトタンパク質が、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、 またはそれらの特異的結合性のフラグメントである請求項３記載の複合体。 ５。上記ジメルカプトタンパク質が、モノクローナル抗体である請求項４記載 の複合体。 ６．上記フラグメントが、F(ab)2またはF(ab')2である請求項４記載の複合体 。 ７．上記タンパク質が、リンパ腫、癌、肉腫、白血病、骨髄腫または神経腫瘍 に関連する抗原と反応する抗体または抗体フラグメントである請求項１記載の複 合体。 ８．上記標的物質が、ウィルス抗体またはウィルスによって誘導される抗原で ある請求項１記載の複合体。 ９．上記病変が、癌、心血管、感染または炎症病変である請求項１記載の複合 体。 10．上記心血管病変が、血栓、塞栓、梗塞またはアテローム硬化性プラークで ある請求項９記載の複合体。 11．複合体形成前に複合体形成部位となる少なくとも１個の立体保護されたメ ルカプト基を持ち、疾病状態に関連する抗原と反応する抗体または抗体フラグメ ントと、メルカプト基に結合する官能部分を持ち、かつ疾病状態の検出と治療に 有用な金属をキレート化できるリガンドとを含む、リガンドと複合化している抗 体または抗体フラグメント。 12．複合体形成前に複合体形成部位となる少なくとも１個のメルカプト基を持 ち、疾病状態に関連する抗原と反応する抗体または抗体フラグメントと、抗体ま たは抗体フラグメントのメルカプト基に結合する官能部分を持ち、かつ疾病状態 の検出と治療に有用な金属をキレート化しているリガンドとを含む、リガンドと 抗体または抗体フラグメントの複合体。 13．毒物または薬物と複合体を形成する前に、複合体形成部位となることがで きる立体保護されたフリーのスルフヒドリル基を生成するために、重鎖間のジス ルフィド結合の切断処理を施し、標的細胞、疾病病変または病原体に関連する物 質と反応する抗体または抗体フラグメントと、リガンドとを含む、リガンドと抗 体または抗体フラグメントの複合体。 14．メルカプト基に特異的に結合する、結合された非金属から成る有機官能基 を持つリガンドが、天然アミン、合成アミン、ポリフィリン、アミノカルボン酸 、イミノカルボン酸、エーテル、チオール、フェノール、グリコール、アルコー ル、ポリアミン、ポリアミノカルボン酸、ポリイミノカルボン酸、アミノポリカ ルボン酸、イミノポリカルボン酸、ニトリロカルボン酸、ジニトリロポリカルボ ン酸、ポリニトリロポリカルボン酸、エチレンジアミンテトラアセテート、ジエ チレントリアミンペントアセテート、トリエチレンーテトラアミンヘキサアセテ ート、ポリエーテル、ポリチオール、クリプタンド、ポリエーテルフェノレート 、ポリエーテルチオール、チオグリコールエーテル、アルコールエーテルまたは ポリアミンフェノールである請求項１記載のリガンド／タンパク質複合体。 15．結合された非金属から成る有機官能基が、ブロモアセトイミド、マレイミ ド、ヨードアセチル、クロロアセチル、有機水銀、ハロゲン化アルキル、s-トリ アジン、エポキシド、ビニルスルフォンまたはニトロソ尿素である請求項１記載 のリガンドとタンパク質の複合体。 16．リガンドが、次の式Ｉ （式中、R1またはR2のどちらか１つは、 で示される構造を持ち、ここで、Ｘは、水酸基またはアミノ基とよりもメルカプ ト基と優先的に反応する官能基で、nは、１〜15、Yは、(CH2)n、mは、０〜15、R1 〜R4とR1'〜R4'は、それぞれ独立して、HまたはC1-5アルキル基、あるいはR3と R4は一緒になって１〜６個の炭素を持つアルキル鎖を形成する。） で示される構造を持つ請求項２記載の複合体。 17．Xが、ブロモアセトアミド、マレイミド、ヨードアセチル、クロロアセチ ル、有機水銀、ハロゲン化アルキル、s-トリアジン、エポキシド、ビニルスルフ ォンまたはニトロソ尿素である請求項16記載の複合体。 18．Xが、ブロモアセトアミドまたはマレイミドである請求項17記載の複合体 。 19．上記リガンドが、次の式Ｉ （式中、R1またはR2のどちらか１つは、 で示される構造を持ち、ここで、Xは、ブロモアセトイミドまたはマレイミドで 、R1〜R4とR1'〜R4'は、それぞれ独立して、HまたはC1-5アルキル基、あるいはR3 とR4は一緒になって１〜６個の炭素を持つアルキル鎖を形成する。） で示される構造を持つ請求項16記載の二官能リガンドとタンパク質の複合体。 20．キレート化が可能な金属が、２価以上の放射性または非放射性元素である 請求項１記載の複合体。 21．上記金属が、d-殻遷移金属、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA、IIIB、IVBまた はＶB属金属、ランタニド、アクチニドまたは超ウラン元素である請求項20記載 の複合体。 22．キレート化される金属が、常磁性、蛍光、リン光から成るグループから選 択される物理特性を有する請求項21記載の複合体。 23．キレート化される金属が、ガンマ線を放射する放射性金属、陽電子を放射 する放射性金属、アルファ線を放射する放射性金属、ベート線を放射する放射性 金属またはオージェ電子放射物質である請求項20記載の複合体。 24．リガンドとキレートを形成する金属が、銅、鉛、鉄、マンガン、インジウ ム、イットリウム、スカンジウム、ビスマス、ランタニド、金、、銀、アクチニ ウム、ガドリニウム、ルテチウム、パラジウム、クロム、またはガリウムである 請求項20記載の複合体。 25．リガンドとキレートを形成する金属が、In-111、In-114m、Y-90、Bi-212 、Ac-225、Pb-202、Pb-212、Ga-66、Ga-67、Ga-68、Cu-67またはガドリニウムで ある請求項20記載の二官能リガンドとタンパク質の複合体。 26．マーカーまたはレセプターを産生あるいはそれらに関連する疾病の検出方 法であって、当該疾病のマーカーまたはレセプターに特異的で、立体保護されて いる切断されたジスルフィドを介して検出可能な金属とキレート形成しているリ ガンドと複合体を形成しているモノクローナル抗体を含む検出可能量の複合体を 、疾病を有する患者に非経口的に注入することから成る疾病の検出方法。 27．マーカーまたはレセプターを産生あるいはそれらに関連する疾病の治療方 法であって、当該疾病のマーカーまたはレセプターに特異的で、立体保護されて いる切断されたジスルフィドを介して治療用金属とキレート形成しているリガン ドと複合体を形成しているモノクローナル抗体を含む治療量の複合体を、疾病を 有する患者に非経口的に注入することから成る治療方法。 28．上記タンパク質が、リンパ腫、癌、肉腫、白血病、骨髄腫または神経腫瘍 に関連する抗原と反応する抗体または抗体フラグメントである請求項27記載の方 法。 29．抗原を産生あるいはそれに関連する癌を有する患者に、該抗原に特異的で 、切断されたジスルフィドを介して細胞毒性金属とキレート形成しているリガン ドと複合体を形成している細胞毒性量のモノクローナル抗体を、非経口的に注入 することから成る癌の治療方法。 30．（a）金属とキレート形成し、また立体保護されている切断されたジスル フィド部位でタンパク質に結合する部分を持つリガンドを含み、該タンパク質が 、標的細胞、病変または病原微生物によって産生され、あるいはそれらの関連す る物質と反応するようなタンパク質複合体と、 （b）薬剤として許容可能な注入用賦形剤と、 を含む滅菌された注入可能な組成物。 31．（a）タンパク質前駆体とジスルフィド還元剤を反応させ、立体保護され たジメルカプトタンパク質を形成し、 （b）リガンドをジメルカプトタンパク質と接触させ、複合体を形成する 、ことから成る方法で、立体保護されたメルカプト基と選択的に結合する部分を 持つキレート化が可能なリガンドと、少なくとも１個のジスルフィド基結合を持 つタンパク質前駆体由来のタンパク質から成る複合体の製造方法。 32．キレート化が可能なリガンドとジメルカプトタンパク質との複合体を金属 と接触させて、キレート化された複合体を形成するステップを更に含む請求項31 記載の方法。 33．マーカーまたはレセプターを産生あるいはそれらに関連する腫瘍または病 原体が関与する疾病を有する患者の治療に使用するために、疾病を有する患者に 非経口的に注入される治療薬を調製する場合の、マーカーまたはレセプターに特 異的で、立体保護されている切断されたジスルフィドを介して検出可能な金属と キレート形成しているリガンドと複合体を形成しているモノクローナル抗体から 成る複合体の治療量の使用。 34．抗原を産生あるいは抗原に関連する癌の患者の治療に使用するために、癌 患者に非経口的に注入される治療薬を調製する場合の、癌によって産生され、あ るいは癌に関連する抗原に特異的で、立体保護されている切断されたジスルフィ ドを介して細胞毒性金属とキレート形成しているリガンドと複合体を形成してい るモノクローナル抗体から成る複合体の細胞毒性量の使用。 35．上記モノクローナル抗体または抗体フラグメントが、リンパ腫、癌、肉腫 、白血病、骨髄腫または神経腫瘍と関連する抗原と反応するモノクローナル抗体 または抗体フラグメントである請求項34記載の方法。
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