CN104987398A - 一种铬-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种铬-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用，该铬-低密度脂蛋白螯合物是铬与低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成，可用于制备检测人体铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂。本发明首次证实了铬离子可直接作用于低密度脂蛋白。本发明建立了铬-低密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以检测一个地区人群体内低密度脂蛋白的含量，从而间接反映一个地区铬污染程度以及对人群的健康影响。本发明建立的铬-低密度脂蛋白螯合物定量检测方法准确度高重、复性好。
Description
技术领域
本发明涉及重金属离子的免疫学检测，具体涉及一种铬-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法与应用。
背景技术
脂蛋白(lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复合物，按密度分为高密度脂蛋白(high density lipoprotein，简称HDL)、中间密度脂蛋白(intermediate densitylipoprotein，简称IDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，简称LDL)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,简称VLDL)、乳糜颗粒(chylomicron，简称CM)。
血液中大约百分之三十的胆固醇是通过高密度脂蛋白从组织细胞中运输到肝脏转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。血液中约70％的胆固醇由LDL和VLDL所携带，而LDL所携带的胆固醇含量大于VLDL，由于LDL富含胆固醇，因而被称为“坏胆固醇”。其与多种疾病的发生、发展密切相关，特别是冠心病，糖尿病等疾病，研究发现LDL升高是动脉粥样硬化发生、发展的必备条件。2014年，CELL REPORTS报道，“坏胆固醇”还可促进癌症细胞的发展和转移。
LDL是动脉粥样硬化发生和发展的主要危险因素，其改变在血清蛋白中有很强的影响动脉粥样硬化作用，是冠状动脉疾病的重要危险因子，与心血管疾病危险程度呈正相关。因而定量检测血清中LDL对于心血管疾病具有重要意义，不仅可以用于早期识别动脉粥样硬化的危险性，而且可以作为降脂药物治疗过程的检测以及预后评价的指标之一。此外，其他一些疾病，诸如：肾病综合征、慢性肾功能衰竭、肝病及糖尿病等，也可使血清中LDL含量上升，而定量检测LDL也可用于这些疾病的早期诊断以及治疗效果监测，甚至作为预后好坏的评价指标之一。而对于营养不良、慢性贫血、骨髓瘤、急性心肌梗死、创伤和严重肝病等患者，血清LDL的含量将会下降，定量检测LDL也可用于这些疾病的早期诊断、治疗效果监测以及作为预后评价的指标之一。
铬(chromium，Cr)是元素周期表Ⅵ族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有光泽，有较高的熔点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪以来被广泛应用，每年全球铬生产量高达107吨，因而铬是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铬广泛应用于电镀、鞣革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关,但是同样也对人类的身体健康产生巨大影响。
自然界中铬主要以三价和六价的形式存在，而一般认为，三价铬是人类所需的微量元素，而六价铬才是明显的毒性物质。由于六价铬易通过细胞膜进入细胞，而且可以通过一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铬的毒性高于三价铬，达10—100倍。学者认为当水中的六价铬含量超过0.05mg/L即是有毒的。六价铬可以通过皮肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性暴露人群主要是通过呼吸道吸入六价铬灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食入被污染的食物、吸入等方式摄入六价铬。六价铬进入体内后，可以引发氧化应激、显色体畸变、细胞凋亡、多种DNA损伤(包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联、Cr-DNA配合物形成等)，从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。
如前所述，铬与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。随着对铬毒性研究的深入，人们逐渐认识到铬与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的角色，被认为是了解铬的毒性机理的关键所在，因此，对铬和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于铬与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铬之间的关系还不清楚，因而加强对于铬与蛋白质之间的关系至关重要。
关于铬中毒，特别是慢性铬中毒的评价，通过检测血铬含量也不能准确评价人体内的循环铬含量，无法进一步评估铬对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术的飞速发展，铬与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可以从免疫功能角度评价铬中毒，特别是慢性铬中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
发明内容
针对铬污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铬-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法，并建立铬-低密度脂蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铬-低密度脂蛋白螯合物在评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬-低密度脂蛋白螯合物，可以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程度。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铬-低密度脂蛋白螯合物，该铬-低密度脂蛋白螯合物是铬离子与低密度脂蛋白螯合物通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
本发明还提供一种上述的铬-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，即体外合成法，包括以下步骤：
A)铬-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物学方法重组的低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应，反应溶液；
B)铬-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-低密度脂蛋白螯合物。
作为优选，所述步骤B)中具体包括以下步骤：
(1)溶解样品：将上述步骤A)的铬-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得铬-低密度脂蛋白螯合物的溶液；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
所述能与低密度脂蛋白特异性结合的填料为吸附有可与低密度脂蛋白特异性结合物质的硅胶或树脂；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)的溶液，然后上柱，使低密度脂蛋白与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.10mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(5)收集：收集步骤(4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(6)透析：将步骤(5)的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
所述能与铬特异性结合的填料为吸附有可与铬特异性结合物质的硅胶或树脂；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(10)收集：收集步骤(9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(11)透析：将步骤(10)的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得铬-低密度脂蛋白螯合物。
作为优选，上述铬-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，还包括以下对铬-低密度脂蛋白螯合物的鉴定步骤，具体包括以下步骤：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
(4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。
本发明还提供一种如上述的铬-低密度脂蛋白螯合物在制备检测人体内铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种至少包括如上述的铬-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获低密度脂蛋白的蛋白或捕获金属铬的物质。
本发明还提供一种定量检测铬-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的铬-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明首次合成了铬-低密度脂蛋白螯合物；
2.本发明首次提出铬-低密度脂蛋白螯合物可用于制备检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用；
3.本发明实现了螯合型低密度脂蛋白的特异性识别和定量检测，以便定量检测人群血清中铬-低密度脂蛋白螯合物的含量，以评价一个地区铬污染程度的应用，为工业地区的铬污染水平提供间接指标。本发明建立的铬-低密度脂蛋白螯合物定量检测方法的准确度高、重复性好。
附图说明
图1为本发明所述的铬-低密度脂蛋白螯合物的非变性电泳条带图；
图2为本发明所述的铬-低密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等(采用PEG法)；
捕获低密度脂蛋白的蛋白为抗低密度脂蛋白抗体，可通过市售获得，如货号为“Abcamab157795”的anti-LDL抗体，以下实施方式中，所述与低密度脂蛋白特异性结合的物质、抗低密度脂蛋白抗体、抗LDL抗体均为捕获低密度脂蛋白的蛋白；
酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
稀释缓冲液为pH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取1.5g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3溶解加ddH2O定容至1000mL；
洗涤缓冲液为pH7.4的0.15M PBS溶液，配制方法示例：取0.2g的KH2PO4、2.90g的Na2HPO4·12H2O、8.0g的NaCl、0.2g的KCl、0.5mLTween-20，溶解加ddH2O定容至1000mL；
封闭液为牛血白清蛋白溶液，配制方法示例：取0.1g牛血白清蛋白，加入洗涤缓冲液稀释定容至100mL；
终止液为2M H2SO4，配制方法示例：取178.3mL的ddH2O，加浓H2SO4定容至200mL；
底物为甲基联苯胺(TMB)溶液，配制方法示例：取0.5mL浓度为2g/L的甲基联苯胺乙醇溶液，加底物稀释液稀释至10mL；
底物缓冲液pH为5.0，其中Na2HPO4的摩尔浓度为0.2M、柠檬酸的摩尔浓度为0.1M，配制方法示例：取1.42gNa2HPO4、0.96g柠檬酸，然后加入ddH2O至50mL，即得；
洗脱液的配制方法示例：将木瓜蛋白酶用pH 8.0,0.1mol/L Tris-HCI缓冲液配制成1-2mg/mL，再加入1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)37℃孵育30min，得洗脱液；
上样缓冲液可由如下比例的组分配制而成：Tris-HCl：1％溴酚蓝：ddH2O：甘氨酸＝15.5：2.5：7：25，其中Tris-HCl的pH为6.8、摩尔浓度为1M；
电泳缓冲液的配制方法如下：取3.0g Tris、14.4g甘氨酸、溶于800mLddH2O中，调pH至8.3后，定容至1L；
捕获铬的物质为货号为“广州然科公司RK10641”的鼠抗Cr mAb，以下实施方式中所述的与铬特异性结合的物质、抗Cr抗体、二抗、抗铬抗体均为捕获得铬的物质；
本发明提供一种铬-低密度脂蛋白螯合物，铬与低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
具体地，铬-低密度脂蛋白螯合物是由铬通过结合锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白上的载脂蛋白B或胆固醇、甘油三酯等结合而形成的螯合物。
本发明还提供铬-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
A)铬-低密度脂蛋白的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物学方法重组的低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应，反应溶液；
B)铬-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-低密度脂蛋白螯合物，具体包括以下步骤：
(1)溶解样品：将上述步骤A)的铬-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得铬-低密度脂蛋白螯合物的溶液；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
所述能与低密度脂蛋白特异性结合的填料为吸附有可与低密度脂蛋白特异性结合物质的硅胶或树脂；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)的溶液，然后上柱，使低密度脂蛋白与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.10mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(5)收集：收集步骤(4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(6)透析：将步骤(5)的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
所述能与铬特异性结合的填料为吸附有可与铬特异性结合物质的硅胶或树脂；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(10)收集：收集洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得铬-低密度脂蛋白螯合物。
C)：对铬-低密度脂蛋白螯合物的鉴定，具体包括以下步骤：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
(4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。
本发明还提供一种至少包括如上述的铬-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
在本发明中，能实现本发明目的的试剂盒可以列出以下几种，但并不限于此。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获低密度脂蛋白的蛋白的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、可捕获铬的物质作为二抗、酶标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获低密度脂蛋白的蛋白的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、洗脱液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获低密度脂蛋白的蛋白的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、洗脱液、酸化剂、过氧化氢、标准品、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋白所需提取试剂、复溶液、含有可用于捕获铬的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、酶标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、标准品、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋白所需提取试剂、复溶液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋白所需提取试剂、复溶液、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液体、含有可用于捕获铬的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、酶标抗体、底物、终止液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液体、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液体、硝酸、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
上述几种试剂盒中，所述阳性对照为标准品，即螯合有重金属铬的低密度脂蛋白螯合物或螯合有重金属铬的BSA螯合物；所述阴性对照为稀释缓冲液。
上述试剂盒用于检测铬-低密度脂蛋白螯合物，以提高检测的准确性和重复性，并使之在临床中得到推广。
本发明还提供一种定量检测铬-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的铬-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。在本发明中，用检测铬-低密度脂蛋白螯合物的方法可以列出的有以下几种，但并不限于以下几种。
方法一：酶联免疫法(ELISA法)检测铬-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)包被：用稀释缓冲液将可以捕获低密度脂蛋白的蛋白稀释至250-2000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待测样本，并且温育：从循环系统取样，作待测样本；以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待测样本和标准品均稀释至10-40倍，加至微孔中，37℃作用1-2小时；
4)加入可以捕获铬的物质，并且温育：移去待测样本，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释5000-40000倍的抗铬抗体，37℃作用1-2小时，使抗铬抗体与低密度脂蛋白上的金属铬反应；
5)酶结合物温育：移去抗铬抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37℃作用1-2小时，使其与HRP酶标抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟；
7)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
8)取波长450nm，加完终止液后，将WLISA板置于酶标仪上分别读取待测样本组和标准品的OD值，绘制标准曲线，通过与标准品组比较，求得待测样本的含量。
本方法中，步骤8)也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测。
该方法利用ELISA原理，低密度脂蛋白上的铬可以被抗铬的特异性抗体所捕获，之后可以再被辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获(该抗体不识别包被蛋白)，捕获上的抗体在显色剂及终止液的作用下，可以在仪器下读出OD值，而不含有螯合金属铬的低密度脂蛋白，则不会被抗铬的特异性抗体所捕获，也不会与辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获，而所用试剂中也不含有金属铬(阴性对照组结果为阴性)，因而当所读取的OD值结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属铬。
方法二：酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法)检测铬-低密度脂蛋白螯合物按照如下步骤检测：
1)包被：将能够捕获低密度脂蛋白的蛋白，如抗低密度脂蛋白抗体(抗低密度脂蛋白抗体)包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释抗低密度脂蛋白抗体至250-2000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待测样本，并且温育：从循环系统中取样，作待测样本；以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释至10-40倍，加至微孔中，37℃作用1-2小时；
4)洗脱：移去待测样本，洗涤，加入洗脱液，在37℃下洗脱1-3小时；
5)检测：从ELISA微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上的铬，读出相应数值；
该实施例利用ELISA原理对低密度脂蛋白进行捕获，并结合原子吸收光谱(AAS)仪检测螯合于低密度脂蛋白上的铬；由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属铬。
方法三：酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法(ELISA法+ICP-MS法)检测铬-低密度脂蛋白螯合物按照如下步骤检测：
1)包被：将能够捕获低密度脂蛋白的蛋白，如抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释抗低密度脂蛋白抗体至250-2000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待测样本，并且温育：从循环系统取全血，作待测样本；以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释至10-40倍，加至微孔中，37℃作用1-2小时；
4)洗脱：移去待测样本，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱液，在37℃下洗脱1-3小时；
5)酸化：在步骤4)中的溶液中加入酸化剂对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化；
6)检测：加入过氧化氢，并且加热赶酸，并从ELISA试剂板中洗脱的溶液中取0.5mL液体，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于低密度脂蛋白的铬，读出相应数值。
该方法在利用ELISA原理的基础上，结合感耦合等离子体质谱(ICP-MS)原理，用电感耦合等离子体质谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上的铬；即先采用ELISA原理将血清中的铬-低密度脂蛋白螯合物提取出来，再采用感耦合等离子体质谱仪对螯合于低密度脂蛋白上的铬进行定量检测；由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含任何重金属，阴性对照组结果为阴性，不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属铬。
方法四：提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法(提纯法+ELISA法)检测铬-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，并将提取出的低密度脂蛋白复溶，得低密度脂蛋白的溶液；
2)包被：将抗铬抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释抗铬抗体至5000-40000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待测样本，并且温育：从步骤1)的溶液中取样，作待测样本；以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释至10-40倍，加至微孔中，37℃作用1-2小时；
5)酶结合物温育：移去待测样本，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，37℃作用1-2小时，使其与酶标抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟；
7)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
8)取波长450nm，加完终止液后，在酶标仪上分别读取待测样本组和标准品的OD值，绘制标准曲线，通过与标准品组比较，求得待测样本的含量。
本方法中，也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测。
方法五：提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法(提纯法+AAS法)检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，并将提取出的低密度脂蛋白复溶，得低密度脂蛋白的溶液；
2)检测：从步骤1)的溶液中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上的铬，读出相应数值。
方法六：提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法(提纯法+ICP-MS法)检测铬-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，并将提取出的低密度脂蛋白复溶，得低密度脂蛋白的溶液；
2)酸化：从步骤1)的溶液中取样，在溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化；
3)检测：加入过氧化氢，并且加热赶酸后取0.5mL溶液，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于低密度脂蛋白上的铬，读出相应数值。
方法四、方法五和方法六均是先分离出低密度脂蛋白，再采用特异性检测方法，测定低密度脂蛋白中铬-低密度脂蛋白螯合物上铬的含量；即先采用物理分离手段，如超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法等，将低密度脂蛋白从待测血浆样本中分离出来并复溶于生理盐水中，再利用ELISA原理、原子吸收光谱检测或进行检测电感耦合等离子体质谱法检测铬-低密度脂蛋白螯合物上的铬含量。
方法七：电泳法+ELISA/AAS/ICP-MS法检测铬-低密度脂蛋白螯合物，具体如下：
1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，将提取出来的低密度脂蛋白复溶于生理盐水中，得低密度脂蛋白的溶液；
2)制备胶床：根据需要选择合适的介质(如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)，按照相应要求制备好相应胶床；
3)加样：从步骤1)的溶液中取8μL溶液，以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品，加入2μL上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
4)电泳：连接电泳板，加电泳缓冲液，进行电泳，并根据需求将蛋白按照分子量、等电点等参数的不同进行分离；
5)检测：在胶床上找出含有金属的蛋白条带，将该条带取出，将该蛋白条带溶解，然后再分别利用ELISA或ICP-MS或AAS等原理检测铬含量。
此外，还可以利用此方法检测铬-低密度脂蛋白螯合物的等电点、分子量及含量等。
在方法七中，将低密度脂蛋白从全血中提取出来，再采用凝胶电泳法对所提取的低密度脂蛋白进行分离，再找出富含铬的相应条带，再检测相关低密度脂蛋白的含量；即低密度脂蛋白可以用多种方法提纯出来(例如超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法，ELISA方法等)，将提纯出来的低密度脂蛋白复溶，取一定量的低密度脂蛋白，利用电荷移动原理，进行电泳(electrophoresis，EP)，在凝胶板(可根据需要采用不同介质)上可根据分子量、等电点等不同跑出不同的条带，寻找出富含铬的相应条带，将凝胶中的蛋白质复溶，即可以在特定波长下检测相关低密度脂蛋白的含量，也可以利用ELISA、AAS、ICP-MS等原理检测出螯合于低密度脂蛋白上的铬含量，由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属铬。
实施例1：合成法合成铬-低密度脂蛋白鳌合物，包括以下步骤：
本实施例所制备的铬-低密度脂蛋白鳌合物，通过凝胶电泳进一步分离，并通过电感耦合等离子体质谱或原子吸收光谱进行检测定性鉴定。
本实施例使用的试剂的配制方法如下：
1)硼酸盐缓冲液，其摩尔浓度为0.01M，其制备方法如下：称取0.31g硼酸溶于400mLddH2O中，用0.1mol/L的NaOH调节pH至9.0，定容至500mL。
2)EDTA-NaHCO3溶液，其制备方法如下：取1.86g EDTA·2H2O和16.8g NaHCO3，溶于900mLddH2O中，用1.0M NaOH调整pH至8.0定容至1000mL，高压灭菌，室温保存；
3)ITCBE购买自日本同仁化学研究所，货号M030；
4)低密度脂蛋白溶液：称取4.0mg低密度脂蛋白溶于4.0mL0.01M pH9.0硼酸盐缓冲液中，充分振荡溶解，配制成1.0mg/mL的低密度脂蛋白溶液；
5)透析袋的截留分子量14000，购买自Bioshop Inc；
透析袋的预处理：将透析袋放入500mL的EDTA-NaHCO3溶液中，煮沸10min；倾弃EDTA-NaHCO3溶液，用ddH2O轻轻漂洗，再用500mL5mmol/L EDTA煮沸10min；弃掉煮沸液，彻底用ddH2O清洗，加入大量的ddH2O浸泡透析袋4℃过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋，用大量的ddH2O彻底冲洗其内外表面；
制备铬-低密度脂蛋白螯合物的方法，包括以下步骤：
A)铬-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物学方法重组的低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应，反应溶液，具体包括以下步骤：
1)取2.0mg ITCBE溶于2mLDMSO中；
2)缓慢将步骤1制备的液体加入低密度脂蛋白溶液中，边滴加边震荡，于25℃，100r/min的摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与低密度脂蛋白结合的ITCBE；
3)将透析所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴加80μl 1mmol/L铬离子溶液，边滴加边振荡，以免铬离子使蛋白变性沉淀；
4)将加好的溶液在25℃，100r/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析24h；
5)将透析好的液体于-20℃分装保存，得到铬-低密度脂蛋白螯合物的反应溶液。
B)铬-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-低密度脂蛋白螯合物，具体包括以下步骤：
(1)溶解样品：将上述步骤A)的铬-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得铬-低密度脂蛋白螯合物的溶液；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)的溶液，然后上柱，使低密度脂蛋白与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.10mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(5)收集：收集洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(10)收集：收集洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得铬-低密度脂蛋白螯合物。
C)对铬-低密度脂蛋白鳌合物的鉴定，具体步骤如下：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-低密度脂蛋白螯合物，复溶于生理盐水中，得铬-低密度脂蛋白螯合物的溶液，取8μL上述溶液，加入2μL上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，加电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流，环境温度为4度；至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳，图1为本发明所述铬-低密度脂蛋白鳌合物的非变性电泳条带图；
(4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。
D)鉴定结果
1)AAS检测结果
取步骤C)分离出的蛋白条带溶液，以石墨炉原子吸收光谱法(AAS)初步测定低密度脂蛋白中重金属铬的含量，如下表所示，以NaCl溶液、KBr溶液、KCl溶液为空白对照；
表1 低密度脂蛋白中铬的含量
2)同步辐射X荧光分析
蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机(BEPC)的4W1"同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2.2GeV，束流强度100mA。样品移动台(TSA200型，北京卓立汉光公司)可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移动以改变入射光斑位置，移动步长为0.0025mm。从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器(PGT Inc.LS30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信号用PGT多道分析仪(MCA 4000)获取输出。用11.5keV的单色同步辐射光激发样品，调节入射光斑(1mmx3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均匀缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AX IL软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶膜的荧光谱。
图2为本发明所述的铬-低密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图，图中横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带铬金属能量(含量)值。
检测条件的确定
1.抗低密度脂蛋白抗体、抗Cr抗体最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的确定。
酶联免疫法检测铬-低密度脂蛋白螯合物的方法，具体包括以下步骤：
1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体蛋白包被于固相载体上，分别用稀释缓冲液将包被蛋白以1：250、1：500、1：10000、和1：2000的倍比稀释，加入ELISA板微孔中，每个浓度包被三排，4℃保存18小时；
2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加入封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，洗涤；
3)加待测样本：用稀释缓冲液将待测血浆样本按1：10、1：20、1：40的倍比稀释，加至微孔中，以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品，设置阴性对照和空白对照，加至微孔中，37℃作用1小时；
4)加抗Cr抗体：移去待测血浆样本，洗涤，加入用稀释缓冲液按1：5000、1：10000、1：20000、1：40000的倍比稀释的抗Cr抗体，37℃作用1小时，使其与低密度脂蛋白上的金属铬反应；
5)加酶标：移去抗Cr抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37℃作用1小时，使其与抗Cr抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，洗涤，加入底物，37℃避光作用30min，加入终止液；
7)检测：于450nm波长下在酶标仪上分别读取标准品、待测血浆、阳性对照、阴性对照和空白对照样本的OD值，求得待测样本的含量。
本实施例中，采用本发明提供的铬-低密度脂蛋白螯合物标准品作为阳性对照，分别以不加待测血浆作为阴性对照1，即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封闭液、抗Cr抗体、酶标和底物；
以不加抗Cr抗体的对照试验组作为阴性对照2，即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封闭液、待测血浆、酶标和底物；
以不加酶标的对照试验组作为阴性对照3、即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封闭液、待测血浆、抗Cr抗体和底物；
以同时不加待测样本和抗Cr抗体的对照试验组作为阴性对照4，即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封闭液、酶标和底物；
以不加抗低密度脂蛋白抗体作的对照试验组为空白对照1，即加入了封闭液、待测血浆、抗Cr抗体、酶标和底物；
以及以只加底物的对照试验组为空白对照2，以只加PBS的对照试验组为空白对照3。
表2为不同抗低密度脂蛋白抗体稀释倍比、血浆稀释倍比、抗Cr抗体稀释倍比的样本OD值数据，
表2 不同抗低密度脂蛋白抗体、Cr抗体以及血浆稀释倍比下的检测结果
从表2可知，抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:500时，样本OD值大于平行条件下的其它抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比；该组样本中，血浆稀释倍比为1:10时，抗Cr抗体稀释倍比为1:10000时，OD值最大，为0.858。
表3为抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:500、血浆稀释倍比为1:10、Cr抗稀释倍比为1:10000时相对应的阳性对照、阴性对照和空白对照的OD检测值，
表3 阳性对照、阴性对照及空白对照的检测结果
从表3可知，阴性对照组OD检测值小于0.1，说明该优化条件下，本方法的系统误差性小，满足分析方法要求，所以选此值所对应的浓度作为最佳工作浓度。
2.ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
为寻求最适宜的洗脱条件，通过酶联免疫法在抗Cr抗体与酶标抗体温育后，以不同浓度的洗脱液进行洗脱，再通过酶标仪检测OD值，具体步骤如下：
(1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体蛋白包被于固相载体上，用稀释缓冲液按1：500的倍比稀释，加入ELISA板微孔中，4℃保存16小时；
(2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤后，加封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并洗涤；
(3)加酶标抗体：移去封闭液，洗涤后，加入用稀释缓冲液稀释至抗体浓度为2μg/mL的HRP酶标抗体，37℃作用2小时，使其与抗Cr抗体反应；
(4)洗脱：移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中木瓜蛋白酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度＝1:80、1:40、1:20、1:10、1:5，分别放置于37℃温度下作用1h、2h、3h；移去洗脱液，洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟，加终止液终止反应；
(5)于450nm的检测波长下在酶标仪上分别读取每个微孔的OD值，具体结果参见表4，
表4 不同洗脱液稀释倍数下的检测结果
通过比较OD值，以判断ELISA孔壁上结合的抗Cr抗体-酶标抗体复合物洗脱程度，当OD值最低时，抗Cr抗体-酶标抗体复合物洗脱程度达到最大。如表4所示，当洗脱液中木瓜蛋白酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度＝1:20时，洗脱程度最高，而作用时间为1h、2h、3h时，各组OD值变化不大，可见随着时间的延长，酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的情况下，延长消化时间并不能提高消化率，所以本实验中洗脱液的作用时间为1-3h皆可，综上所述，我们选择洗脱液1:20作为最适工作浓度，1-3h作为最适洗脱时间。
应用实施例
应用实施例1
采用酶联免疫法(ELISA法)检测100份标本血浆中的铬-低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法一记载的方法检测，具体操作步骤如下：
1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释至500倍，加入ELISA板微孔中，37℃保存1小时后于冰箱中4℃储存；
2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，洗涤，ELISA板37℃放置1小时后于冰箱中4℃储存；
3)加样：以标本血浆作为待测样本，以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品均稀释10倍，加至微孔中，37℃作用1小时；
4)加抗Cr抗体：移去样品，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释至10000倍的抗Cr抗体，37℃作用1小时，使其与低密度脂蛋白上的金属铬反应；
5)加酶标：移去抗Cr抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释至抗体浓度为2μg/mL的酶标抗体，37℃作用1小时，使其与抗Cr抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，洗涤，加入底物，37℃避光作用30min，滴加入终止液；
7)检测：于450nm波长下在酶标仪上分别读取待测样本组和标准品的OD值，结果如表5所示。
表4 方法一对100份标本血浆的实测结果
本应用实施例1中，步骤7)中，也可以不使用酶标仪检测，而是直接通过显色进行定性检测。
应用实施例2
采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法)检测100份标本血浆中铬-低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法二记载的方法检测，具体操作步骤如下：
1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释包被蛋白至500倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜18小时；
2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，洗涤，ELISA板4℃下保存；
3)加样：以标本血浆作待测样本，以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品稀释至10倍，加至微孔中，37℃作用1小时；
4)洗脱：移去待测血浆样本，洗涤，加入0.8mol/L的Na2HPO4溶液，37℃作用2小时；
5)检测：从ELISA微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测待测样本和标准品中螯合于低密度脂蛋白上的铬，结果如表6所示。
表6 方法二对100份标本血浆的实测结果
应用实施例3：
采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法(ELISA法+ICP-MS法)检测100份标本血浆中铬-低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法三记载的方法检测，具体操作步骤如下：
1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释包被蛋白至500倍，加入ELISA板微孔中，4℃保存18小时；
2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，洗涤，ELISA板4℃保存；
3)加样：以标本血浆作待测样本，以已知含量的铬-低密度脂蛋白螯合物作标准品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品稀释至10倍，加至微孔中，37℃作用2小时；
4)洗脱：移去待测样本和标准品，洗涤，加入0.8mol/L的Na2HPO4溶液，37℃洗脱2小时；
5)酸化：在溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
6)检测：取样，于电感耦合等离子体质谱仪下检测待测样本和标准品中螯合于低密度脂蛋白上的铬，结果如表7所示。
表7 方法三对100份标本血浆的实测结果
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种铬-低密度脂蛋白螯合物，其特征在于，该铬-低密度脂蛋白螯合物是铬离子与低密度脂蛋白螯合物通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
2.制备如权利要求1所述的铬-低密度脂蛋白螯合物的方法，包括以下步骤：
A)铬-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物学方法重组的低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应，反应溶液；
B)铬-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-低密度脂蛋白螯合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述步骤B)中具体包括以下步骤：
(1)溶解样品：将上述步骤A)的铬-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得铬-低密度脂蛋白螯合物的溶液；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)的溶液，然后上柱，使低密度脂蛋白与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.10mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(5)收集：收集步骤(4)洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(6)透析：将步骤(5)的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；
(10)收集：收集步骤(9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
(11)透析：将步骤(10)的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得铬-低密度脂蛋白螯合物。
4.根据权利要求2所述的铬-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，其特征在于，步骤B)后还包括步骤C)：对铬-低密度脂蛋白螯合物的鉴定；
其中，步骤C)中具体包括以下步骤：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
(4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。
5.一种如权利要求1所述的铬-低密度脂蛋白螯合物在制备检测血样中铬-低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
6.一种至少包括如权利要求1所述的铬-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括包被液，该包被液含有捕获低密度脂蛋白的蛋白或捕获金属铬的物质。
8.一种定量检测铬-低密度脂蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的权利要求1所述的铬-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铬-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
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2015
- 2015-07-14 CN CN201510413265.9A patent/CN104987398A/zh active Pending
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