WO2015126164A1 - 죽상동맥경화 영상화용 조성물 및 이를 이용한 죽상동맥경화 진단방법 - Google Patents

죽상동맥경화 영상화용 조성물 및 이를 이용한 죽상동맥경화 진단방법 Download PDF

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김성은
김응주
정재민
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for atherosclerosis imaging and a method for diagnosing atherosclerosis using the same.
  • Atherosclerosis is a disease that causes cholesterol deposition in the innermost membrane (endothelium) of blood vessels and proliferation of vascular endothelial cells resulting in narrowing or blockage of the vessels, leading to peripheral blood flow disorders.
  • endothelium the innermost membrane
  • cholesterol is deposited mainly on the innermost inner membrane of blood vessels, and endothelial cell proliferation occurs, resulting in the formation of atherosclerosis.
  • vascular diseases The inside of the atherosclerosis becomes thin like porridge, and its surrounding area is surrounded by a hard disk, a hard fibrous membrane.
  • the diameter of blood vessels is rapidly narrowed or the blood vessels are blocked at all, resulting in impaired blood circulation to the peripheral.
  • F-18 FDG Fluorine-18 fluorodeoxyglucose
  • the diagnostic principle of atherosclerosis using F18-FDG is to implement imaging of atherosclerosis using the principle of increasing FDG uptake with increasing glucose uptake in foam cells.
  • FDG is a type of glucose, it can be affected by blood glucose and metabolic hormones, which limits the control of certain body conditions for diagnosis. In the end, the accuracy of the diagnosis of atherosclerosis is reduced. have. In this case, because the conditions such as fasting or blood sugar control must be adjusted, high-risk groups such as diabetes are limited in their use.
  • the brain and heart use blood sugar as nutrients, but there is a problem that the brain and heart are difficult to utilize F-18 FDG despite the frequent occurrence of atherosclerosis.
  • expensive equipment, such as cyclotron is required, leading to a sharp increase in manufacturing costs.
  • Patent Document 1 Korean Patent Registration No. 10-1351411
  • Patent Document 2 Korean Patent Registration No. 10-1055700
  • Patent Document 1 The present invention relates to a method for selectively diagnosing malignant tumors by distinguishing malignant tumors from inflammatory lesions in F-18 FDG positron emission tomography
  • Patent Document 2 relates to a substance in which Ga-68 is labeled with mannosyl albumin.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, the object of the present invention is to improve the accuracy of the diagnosis of atherosclerosis, and to diagnose atherosclerosis in disease holders such as diabetes, atherosclerosis occurring in the brain and heart It is to provide a composition for atherosclerosis imaging that can diagnose the hardening. In addition, to provide a composition for atherosclerosis imaging at a high manufacturing cost, to provide a method for diagnosing atherosclerosis using the same.
  • Atherosclerotic imaging composition according to one aspect of the present invention for solving the above problems is bifunctional chelating agent-mannosyl phosphorus albumin, bifunctional chelating agent-mannosyl nanoparticles, bifunctional chelating agent-mannosyl polymer
  • a radioisotope labeled compound labeled with a metallic radioisotope is included in any one selected from the group consisting of:
  • Atherosclerosis diagnostic method uses the composition for atherosclerosis imaging according to the present invention.
  • Atherosclerosis imaging composition according to the present invention is excellent in the accuracy of the diagnosis of atherosclerosis, and enables the diagnosis of atherosclerosis even in patients with diseases associated with blood glucose metabolic disorders, such as diabetes, in the brain and heart It is a composition capable of an effective diagnosis of the atherosclerosis that occurred.
  • the manufacturing cost is lower than that of the conventional composition for imaging for atherosclerosis diagnosis. Therefore, it can be used to diagnose atherosclerosis effectively.
  • 1 and 2 are the results of measuring the labeling efficiency of 68 GaCl by TLC in the example.
  • Figure 4 shows the embodiment of the MSA-RITC binding to specialized mannose receptors in mouse macrophages.
  • Figure 6 shows a photograph showing that the RITC-labeled MSA in the atherosclerotic site in the rabbit aorta in which atherosclerosis occurred.
  • Figure 10 compares the SUV in the brain parenchyma with examples and comparative examples.
  • the inventors of the present invention as a result of diligent research to develop a composition for atherosclerosis imaging, which is excellent in the accuracy of diagnosis and can be applied to a person with a history such as diabetes, and can be applied to parts such as the brain and the heart, the present invention.
  • Atherosclerosis imaging according to the composition was found to complete the present invention.
  • F-18 FDG 18 F-FDG
  • the prior art has a problem that FDG is composed of glucose, which is inferior in accuracy, difficult to apply to people with a history such as diabetes, and difficult to apply to the brain and heart areas that are most problematic from the development of atherosclerosis.
  • the manufacturing cost of the F-18 FDG is expensive.
  • the pharmaceutical composition for atherosclerosis imaging according to the present invention is selected from the group consisting of bifunctional chelating agent-mannosyl phosphorous albumin, bifunctional chelating agent-mannosyl nanoparticles, bifunctional chelating agent-mannosyl polymer. It comprises a radioisotope labeled compound labeled with a metallic radioisotope in either.
  • the bifunctional chelating agent in the composition acts to bind to the radioisotope
  • the mannose group acts to bind to the mannose receptor
  • all of the serum serum albumin or nanoparticles or polymers bind to the bifunctional chelating agent and mannose.
  • the composition is preferably 1-100 nm in size, which is well dispersed in the blood and can travel around the blood vessel in the bloodstream. Since the bifunctional chelating agent and the mannose are only about 0.5 nanometers in size, most of the sizes It is occupied by carrier serum albumin, nanoparticles or polymers.
  • Phosphorus albumin is a rugby ball shape with a long axis of 6 nm and a short axis of 4 nm, which is an ideal size. Nanoparticles and polymers can be used in various sizes and materials because they are very diverse.
  • the pharmaceutical composition for atherosclerosis imaging according to the present invention is bound to mannose, which is a ligand of mannose receptor, with human serum albumin (mannosylated human albumin (MSA) or nanoparticles or polymers, followed by 68 Ga, 99 m Tc , 111 In, 18 F, 11 C, 123 I, 124 I and 131 I by attaching at least one radioisotope selected from the group to detect the molecular image of atherosclerosis, thereby atherosclerosis Diagnosis and progression of the disease will be diagnosed.
  • the mannose receptor is one of the cell membrane receptors present in foam cells in atherosclerosis.
  • the metallic radioisotope is preferably at least one selected from the group consisting of 68 Ga, 99 m Tc, 111 In, 18 F, 11 C, 123 I, 124 I and 131 I, most preferably May be 68 Ga.
  • the composition does not need to fast because there is no metabolic restriction, and because it is not associated with metabolic-related hormone status, it is applicable to subjects with a history of diabetes and the like. In addition, it can be used in the brain and heart areas to solve the problems of conventional F-18 FDG. In addition, unlike the F-18 FDG, it does not require complicated or expensive equipment, resulting in lower manufacturing costs. Expensive equipment called cyclotron was used to manufacture F-18 FDG.
  • the metallic radioisotope is 68 Ga as in the present invention, it can be easily manufactured with only a small device such as a galium generator. In addition, 68 Ga is preferable because it has excellent proton emission ability, and thus it is possible to realize a clearer image than when radiolabeled with other radioisotopes when diagnosed or imaged using F-18 FDG.
  • the bifunctional chelating agent is [1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid (NOTA)], [1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4, 7,10-tetraacetic acid (DOTA)], diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), hydrazinonicotinic acid (HYNIC), N 2 S 2 and N 3 S, characterized in that at least one selected from Although not present, the most preferred embodiment may be NOTA.
  • NOTA When NOTA is used as the bifunctional chelating agent, it is preferable because it is particularly well labeled with 68 Ga. If you want to label 99 m Tc, use HYNIC, N 2 S 2 , N 3 S. If you want to label 111 In, use DOTA.
  • Atherosclerosis diagnostic method uses the atherosclerosis imaging composition according to the invention, the diagnostic method includes all known diagnostic methods existing in the art.
  • Example One Ga -68 ( 68 Ga For cover NOTA - MSA Manufacture
  • Step 2 Preparation of Benzyl NOTA and Phenyl Mannose Binding Serum Albumin
  • Example 2 To the kit of Example 2, 1 ml of a 0.1 M hydrochloric acid solution of 68 GaCl prepared in 68 Ge / 68 Ga-generator (Cyclotron Co., Russia) was added, respectively, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes, 30 minutes, and 1 hour. After 2 hours, labeling efficiency was measured by TLC.
  • the stationary phase was ITLC-SG (Gelman Co., USA) was used as the developing solvent 0.1 M citric acid solution. Radioactivity distribution on the ITLC plate was measured using a TLC-scanner (Bioscan Co.). The labeled 68 Ga remained at the origin and the unlabeled 68 Ga moved to the top (FIG. 1).
  • MSA was prepared in the same manner as in Step 1 of Example 1. 100 mg of MSA was reacted with 16 mg (0.03 mmol) of rhodamine B isothiocyanate (RITC) dissolved in 13 mL of 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.5) for 20 hours at room temperature. The resulting RITC-MSA was separated and purified using physiological saline to PD-10 column and then freeze-dried. RITC bound per MSA was calculated by molecular weight measurement with a MALDI-TOF mass spectrometer equipped with a nitrogen laser (337 nm). For this purpose, 500 lasers were measured in linear mode. All samples were analyzed four times and the average molecular weights of MSA and RITC-MSA were taken.
  • MALDI-TOF mass spectrometer equipped with a nitrogen laser (337 nm). For this purpose, 500 lasers were measured in linear mode. All samples were analyzed four times and the average molecular weights of MSA and RITC
  • PET / CT images were taken of patients with atherosclerosis using the prepared atherosclerotic imaging composition.
  • PET / CT images were obtained using Philips' dedicated workstation Extended Brilliance Workspace V3.5. Specifically, this study was conducted at Korea University Guro Hospital, where the practitioner grabbed each region of interest (ROI) in the aorta so that the portion of the maximum radiation intake was centered.
  • the maximum standard uptake values (SUVs) and average standard intake coefficients of these regions of interest were calculated for the axially adjacent slices of the relative and inferior aorta.
  • the standard intake coefficient was obtained by dividing the radioactivity of the tissue by the total administered radioactivity over the total body weight.
  • the correlation coefficient of the mean standard intake coefficient measurement between the internal and external observers was greater than 0.9.
  • FIG. 4 shows that MSA-RITC binds to mannose receptors specialized in mouse macrophages, and its binding was inhibited by pre-culture with mannose receptor blocking antibodies (FIG. 4B). It is also shown that the binding of MSA in mannose receptors is content dependently reduced in flow cytometry studies by treatment with anti-CD 206 mannose receptor blocking antibodies (FIG. 4C).
  • F18-FDG which is conventionally used as a composition for atherosclerosis imaging, was used as a comparative example.
  • Tissue flakes were cut to 10 mm thick, placed on slides with poly-D-lysine, shielded from light at 45 ° C and dried and stored until use at room temperature.
  • the slide tissue was washed twice in PBS (pH 7.4) to remove the tissue compound and mounted using Fluoromount-G TM (Southern Biotech, Birmingham, AL). Fluorescence images were observed with IX81-ZDC focus drift compensating microscope (Olympus, Tokyo, Japan) at excitation wavelength and emission wavelength at 547 nm and 572 nm, respectively (FIG. 6).
  • FIG. 5A is a PET / CT image of 68 Ga-MSA of rabbits fed a normal diet, and showed no lesion of atherosclerosis and increased uptake of 68 Ga-MSA in tissues such as liver and bone marrow.
  • Fig. 5b is a PET / CT image of 68 Ga-MSA of a rabbit dieted with cholesterol, in which the atherosclerotic lesion in the front of the spine in the abdomen appears long in green.
  • Figure 5c is an enlarged photo of the atherosclerotic site in the animal of Figure 5b is observed in the green atherosclerotic lesion area in front of the yellow of the spine.
  • FIG. 6E shows atherosclerotic tissues observed with differential interference contrast (DIC) microscopy at the atherosclerotic site of the aortic rabbit ingested with cholesterol.
  • FIG. 6F shows the cell nuclei of atherosclerotic lesions using DAPI-staining in the same tissue through fluorescence confocal microscopy
  • FIG. 6G shows that fluorescence of labeled RITC was observed in MSA at the atherosclerotic site. 6H, when MSA was not labeled on the same atherosclerotic tissue, even when RITC was injected, it was confirmed that fluorescence of RITC could not be observed by fluorescence microscopy.
  • DIC differential interference contrast
  • FIG. 7A shows PET / CT images of 18 F-FDG of rabbits fed normal feeding, showing no lesions of atherosclerosis and increasing 18 F-FDG uptake in tissues such as liver and bone marrow.
  • Fig. 7b is a PET / CT image of 68 Ga-MSA of a cholesterol-fed rabbit, in which the atherosclerotic lesion in the anterior part of the spine in the abdomen appears green.
  • Figure 7c is an enlarged photo of atherosclerotic sites in the animal as shown in Figure 7b is observed in the green atherosclerotic lesions in front of the gray of the spine.
  • FIG. 8 shows a comparison of the SUV value of the inferior vena cava versus the SUV of the aortic atherosclerotic lesion
  • FIG. 9B shows the SUV of the heart to the SUV of the aortic atherosclerotic lesion. The TBR of the value is shown, and FIG.
  • FIG. 9C shows the TBR of the SUV value of the cerebral parenchyma compared to the SUV of the atherosclerotic lesion of the aorta.
  • Table 2 below shows the TBR value of the atherosclerotic site SUV of the aorta compared to the brain tissue SUV, and the case of the example was higher than that of the comparative example.
  • Figure 10 shows the effect of very low brain SUV compared to the comparative example in PET when using the Example.
  • 18 F-FDG enters the brain parenchyma through the cerebrovascular barrier, which causes metabolism according to the inflow of 18 F-FDG in the cerebral parenchyma, eventually resulting from atherosclerotic lesions. Or, it is difficult to distinguish precisely whether it is due to an increase in 18 F-FDG, which shows that it is difficult to properly use it to track atherosclerotic lesions in brain tissue.

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Abstract

본 발명은 죽상동맥경화 영상화용 조성물 및 이를 이용한 죽상동맥경화 진단방법 에 관한 것이다. 본 발명에 따른 죽상동맥경화 영상화용 조성물은 죽상동맥경화 진단의 정확도가 우수하며, 당뇨와 같은 혈당 조절이 필요한 질병 보유자를 대상으로 하여서도 죽상동맥경화의 진단을 가능하게 하며, 뇌와 심장에서 발생한 죽상동맥경화에 대하여도 효과적인 진단이 가능한 조성물이다. 또한 종래 죽상동맥경화 진단을 위한 영상화용 조성물에 비해 제조단가가 저렴하다. 그러므로 이를 이용하여 죽상동맥경화의 효과적인 진단이 가능하게 된다.

Description

죽상동맥경화 영상화용 조성물 및 이를 이용한 죽상동맥경화 진단방법
본 발명은 죽상동맥경화 영상화용 조성물 및 이를 이용한 죽상동맥경화 진단방법에 관한 것이다.
죽상동맥경화증(atherosclerosis)이란 혈관의 가장 안쪽 막(내피)에 콜레스테롤 침착이 일어나고 혈관 내피세포의 증식이 일어나 혈관이 좁아지거나 막히게 되어 그 혈관이 말초로의 혈류 장애를 일으키는 질환을 말한다. 이러한 죽상동맥경화증을 보다 구체적으로 살펴보면 오래된 수도관이 녹이 슬고 이물질이 침착하여 지름이 좁아지게 되는 것처럼, 주로 혈관의 가장 안쪽을 덮고 있는 내막에 콜레스테롤이 침착하고 내피세포의 증식이 일어난 결과 죽종이 형성되는 혈관질환을 말한다. 죽종 내부는 죽처럼 묽어지고 그 주변 부위는 단단한 섬유성 막인 경화반으로 둘러싸이게 되는데, 경화반이 불안정하게 되면 파열되어 혈관 내에 혈전이 생긴다. 또한 죽종 안으로 출혈이 일어나는 경우 혈관 내부의 지름이 급격하게 좁아지거나 혈관이 아예 막히게 되고, 그 결과 말초로의 혈액순환에 장애가 생긴다.
이러한 죽상동맥경화의 발생 및 진행 여부를 확인하기 위한 방법으로는 PET/CT를 통한 분자영상 기법을 활용하여 확인하는 방법이 있다. 이러한 PET/CT를 통한 분자영상 기법을 활용하여 죽상동맥경화 여부를 진단하기 위해 종래에는 Fluorine-18 fluorodeoxyglucose(F-18 FDG)이 활용되어 왔다. 이러한 F18-FDG를 이용한 죽상동맥경화증의 진단 원리는 거품세포에서 포도당 섭취 증가에 따른 FDG 섭취 증가의 원리를 이용하여 죽상동맥경화의 영상화를 구현하는 것이다.
그러나 F18-FDG를 이용하여 죽상동맥경화를 영상화하여 진단하는 방법은 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 첫째, FDG가 포도당의 일종이기 때문에 혈중 포도당 및 대사관련 호르몬의 영향을 받을 수 있어 진단을 위한 일정한 신체 상태를 조절하는 데 한계가 있고, 결국에는 죽상동맥경화의 진단시 그 정확도가 떨어지게 된다는 문제점이 있다. 또한 이 경우에는 금식이나 혈당 조절 등의 조건을 맞추어야 하기 때문에 당뇨 등의 고위험군에서는 사용의 제한이 있다. 둘째로 뇌와 심장은 영양소로 혈당을 이용하는데, 정작 뇌와 심장은 죽상동맥경화가 빈번하게 발생하는 부위임에도 불구하고 F-18 FDG를 활용하기 어렵다는 문제점이 존재한다. 셋째, F-18 FDG를 생산하기 위해서는 cyclotron 등 고가의 장비가 필요하여 제조단가가 급격하게 상승한다는 문제점이 있다.
이러한 본 발명과 관련되는 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1351411호(특허문헌 1)와 대한민국 등록특허 제10-1055700호(특허문헌 2)에 개시되어 있으며, 구체적으로 상기 특허문헌 1은 F-18 FDG 양전자방출단층촬영에서 악성 종양과 염증 병변을 구분하여 악성 종양을 선택적으로 진단하는 방법에 관한 것이고, 특허문헌 2는 만노실알부민에 Ga-68을 표지한 물질에 관한 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 죽상동맥경화 진단의 정확도를 높이고, 당뇨와 같은 질병 보유자에도 죽상동맥경화의 진단이 가능하며, 뇌와 심장에 발생한 죽상동맥경화의 진단이 가능한 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 제공하는 것이다. 또한 높은 제조비용으로 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 제공하고, 이를 이용하여 죽상동맥경화를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 죽상동맥경화 영상화용 조성물은 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민, 양기능성킬레이트제-만노실 나노입자, 양기능성킬레이트제-만노실 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 금속성 방사성 동위원소를 표지한 방사성동위원소 표지 화합물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 죽상동맥경화 진단방법은 본 발명에 따른 상기 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 이용한다.
본 발명에 따른 죽상동맥경화 영상화용 조성물은 죽상동맥경화 진단의 정확도가 우수하며, 당뇨와 같은 혈당 대사장애가 동반된 질병 보유자를 대상으로 하여서도 죽상동맥경화의 진단을 가능하게 하며, 뇌와 심장에서 발생한 죽상동맥경화에 대하여도 효과적인 진단이 가능한 조성물이다. 또한 종래 죽상동맥경화 진단을 위한 영상화용 조성물에 비해 제조단가가 저렴하다. 그러므로 이를 이용하여 죽상동맥경화의 효과적인 진단이 가능하게 된다.
도 1 및 도 2는 실시예의 경우 68GaCl의 표지 효율을 TLC로 측정한 결과이다.
도 3은 방사화학적 순도를 측정하여 안정성을 검증한 결과이다.
도 4는 쥐 대식세포에서 특화된 만노스 리셉터에 MSA-RITC가 결합하는 양태 등을나타낸 것이다.
도 5 는 토끼에게 68Ga-MSA를 1 mCi를 정맥 주사한 후 양전자방출 단층촬영을 시행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 죽상동맥경화 병증이 발생한 토끼 대동맥에서 죽상동맥경화 부위에 RITC 표지 MSA가 있음을 검증한 사진 등을 나타낸 것이다.
도 7, 도 8, 및 도 9는 18F-FDG의 비교예와 68Ga-MSA의 실시예와 비교예의 경우를 가지고 죽상동맥경화 영상화를 비교한 것이다.
도 10은 실시예와 비교예를 가지고 뇌실질에서의 SUV를 비교한 것이다.
도 11, 도 12 및 도 13는 실시예의 경우 임상에서의 경동맥 동맥경화 부위에 대한 적용 가능성을 측정한 것으로서, 정상인과 병소가 있는 심근경색환자의 68Ga-MSA 영상 및 SUV 등을 비교하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이에 본 발명자들은 진단의 정확도가 우수하면서, 당뇨와 같은 병력을 가진 사람에게도 적용이 가능하고, 뇌와 심장 같은 부위에도 활용할 수 있는 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
일반적으로 종래의 죽상동맥경화의 발생 및 진행여부를 진단하기 위한 영상화용 조성물은 F-18 FDG(18F-FDG)를 사용하여 시행되어 왔다. 하지만 이러한 종래 기술은 FDG가 포도당으로 구성되어 있기 때문에 정확도가 떨어지며, 당뇨병과 같은 병력을 가진 사람에게는 적용하기 어렵고, 죽상동맥경화의 발병으로부터 가장 문제가 되는 뇌와 심장 부위에는 적용하기 어렵다는 문제점이 있었다. 또한 F-18 FDG의 제조 단가가 비싸다는 문제점이 있었다.
구체적으로 본 발명에 따른 죽상동맥경화 영상화용 약제학적 조성물은 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민, 양기능성킬레이트제-만노실 나노입자, 양기능성킬레이트제-만노실 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 금속성 방사성 동위원소를 표지한 방사성동위원소 표지 화합물을 포함한다.
상기 조성물 중 양기능성킬레이트제는 방사성동위원소와 결합하는데 작용을 하고, 만노즈기는 만노즈 수용체와 결합하는 작용을 하며, 인혈청알부민이나 나노입자 또는 폴리머는 모두 양기능성킬레이트제와 만노즈를 결합하는 운반지지체로 작용한다. 상기 조성물은 혈액 중에 잘 분산되어 혈류를 타고 혈관내를 돌아 다닐 수 있는 크기인 1-100 nm의 크기가 바람직한데 양기능성킬레이트제와 만노즈는 0.5 나노미터 정도의 크기밖에 되지 않으므로 대부분의 크기는 운반지지체인 인혈청알부민이나 나노입자 또는 폴리머가 차지한다. 인혈청알부민은 크기가 장축이 6 nm, 단축이 4 nm인 럭비공 모양이므로 이상적인 크기이고, 나노입자나 폴리머는 크기나 재질이 매우 다양하므로 적당한 크기와 재질을 선택하여 사용할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 죽상동맥경화 영상화용 약제학적 조성물은 만노스 수용체의 리간드인 만노즈에 인혈청알부민(mannosylated human albumin, MSA)이나 나노입자 또는 폴리머를 결합한 후, 여기에 68Ga, 99 mTc, 111In, 18F, 11C, 123I, 124I 및 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방사성 동위원소를 붙여 이를 detection 함으로써 죽상동맥경화의 분자 영상을 구현하고, 이를 통해 죽상동맥경화의 발병 여부 및 진행과정을 진단하게 된다. 상기 만노스 수용체는 죽상동맥경화 내 거품세포에 존재하는 세포막 수용체 중 하나이다.
상기 금속성 방사성 동위원소는 바람직하게는 68Ga, 99 mTc, 111In, 18F, 11C, 123I, 124I 및 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 가장 바람직하게는 68Ga일 수 있다.
상기 조성물은 대사적 제한이 없기 때문에 금식할 필요가 없으며, 대사 관련 호르몬 상태와 연관성이 없기 때문에 당뇨 등의 병력을 가진 대상자에게도 적용이 가능하다. 또한 뇌와 심장 부위에 사용할 수 있어 종래 F-18 FDG가 가진 문제점을 해소하는 것이다. 또한 F-18 FDG와는 달리 복잡하거나 고가의 장비를 필요로 하는 것이 아니어서 제조 단가가 저렴해진다. 종래 F-18 FDG의 제조에는 cyclotron이라는 고가의 장비가 사용되었다. 하지만 본 발명과 같이 금속성 방사성 동위원소를 68Ga로 하는 경우에는 Galium generator이라는 작은 장비만으로도 손쉽게 제조가 가능하다. 또한 68Ga은 양성자 방출 능력이 우수하여 진단시 다른 방사성 동위원소를 표지한 경우나, F-18 FDG를 사용하여 영상화한 경우에 비해 보다 선명한 영상의 구현이 가능하여 바람직하다.
한편 상기 금속성 방사성 동위원소를 99 mTc 또는 111In로 하는 경우에는 반감기가 길어 사용이 유용하다는 장점이 있다. 또한 123I, 124I 및 131I의 경우에는 제조단가가 보다 저렴해 진다는 장점이 있다. 그리고 68Ga, 99 mTc, 111In, 18F, 11C, 123I, 124I 및 131I 중 둘 이상의 동위원소를 동시에 붙여 사용하게 되면, 각각의 동위원소가 가진 효과가 일체적으로 발현되게 된다. 가령 68Ga와 99 mTc를 동시에 붙여 사용하게 되면, 진단의 정확도를 높임과 동시에, 당뇨 등의 질환을 가진 대상자에게도 적용이 가능하고, 뇌와 심장 부위에도 적용이 가능하며, 반감기도 길어져 유용하게 활용할 수 있게 된다.
상기 양기능성킬레이트제는 [1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)], [1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)], 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 하이드라지노니코틴산 (HYNIC), N2S2 및 N3S으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 가장 바람직한 실시예는 NOTA일 수 있다. 이렇게 양기능성킬레이트제로서 NOTA를 사용하게 되면 68Ga로 특히 잘 표지되는 효과가 있어 바람직하다. 만약 99 mTc으로 표지하려면 HYNIC, N2S2, N3S를 사용하고, 111In로 표지하려면 DOTA를 사용하는 것이 좋다.
발명의 또 다른 특징에 따른 죽상동맥경화 진단방법은 본 발명에 따른 상기 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 이용하며, 상기 진단방법은 당업계에 존재하는 공지의 진단방법을 모두 포함한다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: Ga -68( 68 Ga ) 표지를 위한 NOTA - MSA 의 제조
<단계 1: 페닐 만노즈 결합 인혈청알부민의 제조>
0.1 M 탄산완충액(pH 9.5) 5 ㎖에 20 ㎎의 인혈청알부민을 녹인 후 5.5 ㎎의 α-L-만노피라노실페닐이소티오시아네이트(α-L- mannopyranosylphenylisothiocyanate)를 가한 다음 실온에서 잘 저으면서 20 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 반응액을 -70 ℃에 냉동 보관하였다.
<단계 2: 벤질 NOTA 및 페닐 만노즈 결합 인혈청알부민의 제조>
상기 단계 1에서 제조한 1 ㎖ 만노실 인혈청알부민(13.6 ㎎/㎖)에 10 mg의 p-SCN-Bz-NOTA를 넣은 후 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세파덱스 G-25 칼럼을 이용하여 벤질 NOTA 및 페닐 만노즈 결합 인혈청알부민을 분리 정제하였다.
실시예 2: 만노즈 수용체 영상화용 키트의 제조
1 ㎖ 벤질 NOTA 및 페닐 만노즈 결합 인혈청알부민(13.6 ㎎/㎖), 0.3 ㎖ 초산나트륨 완충용액(0.5 M, pH 5.5)을 첨가한 후 단백질 1 ㎎에 해당하는 양씩 바이알에 분주한 다음 -70 ℃에서 냉동하고 이를 냉동 건조하여 보관하였다.
실시예 3: 만노즈 수용체 영상화용 키트를 이용한 68 Ga 이 표지 화합물의 제조
상기 실시예 2의 키트에 68Ge/68Ga-발생기(Cyclotron Co., Russia)에서 제조된 68GaCl의 0.1 M 염산 용액 1 ㎖를 각각 첨가하여 37℃에서 반응하면서 10분, 30분, 1시간, 2시간 후에 표지효율을 TLC로 측정하였다. 이때 고정상은 ITLC-SG (Gelman Co., USA)를 사용하였고 전개용매는 0.1 M 구연산 용액을 사용하였다. ITLC 플레이트 상의 방사능분포는 TLC-스캐너 (Bioscan Co.)를 사용하여 측정하였다. 표지된 68Ga은 원점에 남아 있고 표지 되지 않은 68Ga은 꼭대기로 움직였다(도 1). 또한 pH가 4~5 사이에서는 37 ℃에서 30 분간 반응하면 표지가 거의 종료되는 것을 알 수 있었다(도 2). 이와 같이 표지한 68Ga-NOTA-MSA를 인혈청과 혼합하여 37 ℃에서 배양하였을 때의 방사화학적 순도를 측정하여 안정성을 검증하였다. 이 결과는 하기 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 혈청 중에서 37 ℃로 배양하였을 경우 2 시간 동안 99 % 이상의 순도를 유지하였고, 실제 핵의학적 영상을 얻는 것은 표지 후 1 시간 이내에 대부분 주사하므로 충분히 실용적으로 안정함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 만노즈 수용체 형광 영상화를 이용한 RITC - MSA 화합물의 제조
우선 상기 실시예 1의 단계 1과 같은 방법으로 MSA를 제조하였다. MSA 100 mg을 0.1 M 탄산나트륨 완충액 (pH 9.5) 13 mL에 녹인 16 mg(0.03 mmol)의 로다민 B 이소치오시아네이트 (RITC)와 20 시간 동안 실온 암소에서 반응시켰다. 생성된 RITC-MSA는 PD-10 칼럼으로 생리식염수를 사용하여 분리 정제한 다음 냉동 건조하였다. MSA 당 결합한 RITC는 질소레이저(337 nm)를 장착한 MALDI-TOF 질량 스펙트로미터로 분자량을 측정하여 계산하였다. 이를 위하여 선형모드에서 500 회의 레이저를 발사하여 측정하였다. 모든 샘플은 4회씩 분석하였고 MSA와 RITC-MSA의 분자량은 그 평균값을 취하였다.
이러한 실시예의 과정을 통해 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 제조하였다.
또한 이렇게 제조된 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 이용하여 죽상동맥경화 병증의 환자를 대상으로 PET/CT 영상을 촬영하였다. 이때 PET/CT 영상은 Philips사의 전용 워크스테이션 Extended Brilliance Workspace V3.5를 이용하여 얻었다. 구체적으로는 고려대학교 구로병원에서 실시하였으며, 이때의 실시자는 방사능 섭취가 최대인 부분이 가운데에 오게 대동맥에서 각각의 관심영역 (ROI, region of interest)을 잡았다. 상대동맥과 하대동맥의 축방향으로 인접한 슬라이스들에 대하여 이 관심영역들의 최대 표준섭취계수(SUV, standard uptake value)와 평균 표준섭취계수를 구하였다. 표준섭취계수는 조직의 방사능을 전체 체중에 대하여 총 투여한 방사능으로 나눈 값으로 하였다. 내부관찰자와 외부관찰자간에 평균 표준섭취계수 측정치의 상관계수는 0.9보다 컸다.
한편, 하기 도 4(도 4a)는 쥐 대식세포에서 특화된 만노스 리셉터에 MSA-RITC가 결합함을 나타내고, 그것의 결합은 만노스 리셉터 차단항체와 함께 미리 배양함으로써 저지되었음을 나타낸다(도 4b). 또한 만노스 리셉터에서 MSA의 결합이 안티-CD 206 만노스 리셉터 차단항체와 함께 처리함에 의해 유세포 분석기 연구에서 함유량 의존적으로 감소함을 나타낸다(도 4c).
추가 제조예: rMSA 키트를 이용한 Tc-99m-MSA(99 mTc-MSA)의 제조
상기 실시예의 키트에 Mo-99/Tc-99m-제너레이터(삼영유니텍)에서 제조된 과테크네슘산염(99 mTcO4-)의 생리식염수 용액 2 ㎖ 또는 5 ㎖를 각각 첨가하여 실온에서 1~30 분 동안 반응하였다. 테크네슘의 방사성 동위원소 표지 효율은 ITLC(instant thin layer chromatography)에 소량의 반응물을 찍은 후 생리식염수로 전개한 다음 TLC-스캐너로 방사능 분포를 측정함으로써 결정하였다. 표지된 테크네슘은 원점에 남아 있었고, 다른 테크네슘은 모두 용매 전단을 따라 이동하였다. 표지 결과 항상 99% 이상의 효율을 나타내었다. 표지한 99 mTc-MSA를 실온에 그대로 두었을 때와 인혈청과 혼합하여 37 ℃에서 배양하였을 때의 시간에 따른 방사화학적 순도(%)를 통하여 안정성을 측정하였다. 상기 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
시간 혈청 실온
0.5 96.0 94.5
1.0 92.2 96.4
2.0 96.0 91.1
3.0 94.4 94.0
6.0 97.4 N.D.
20.0 90.5 91.0
24.0 88.7 95.3
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 실온에 방치하였을 경우와 혈청 중에서 37 ℃로 배양하였을 경우 모두 20 시간 동안 90% 이상의 순도를 유지하였고, 혈청에서 37 ℃로 배양하였을 경우 24 시간째에 88.7%로 떨어지지만 실제 핵의학적 영상을 얻는 것은 표지 후 1 시간 이내에 대부분 주사하므로 충분히 실용적으로 안정함을 확인할 수 있었다.
비교예
상기 실시예와는 다르게 죽상동맥경화 영상화용 조성물로 기존에 사용되는 F18-FDG를 본 비교예로 하였다.
실험예
실험예 1: 실시예의 경우 토끼에서의 죽상동맥경화 분자 영상
12 주령의 일반 토끼(New Zealand white rabbits) 10 마리를 대상으로 하였다. 그리고 각각 5마리를 무작위로 배정하여 한 그룹은 정상의 먹이를 먹였으며, 나머지 한 그룹은 1 %의 콜레스테롤을 함유한 식이를 주고 아무런 조치를 취하지 않았다. 사육은 표준화된 조건(21 ℃, 습도 41 % - 62 %)에서 규칙적인 낮/밤 (10/14 시간) 주기로 물과 사료에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 3개월의 식이 요법 후에 마취상태에서 68Ga-MSA를 1 mCi를 정맥주사하고 10 분 후부터 10 분간 전신을 대상으로 양전자방출 단층촬영을 시행하였다(도 5, 6). 다음날 토끼는 마취 후 RITC표지-MSA(42 μg/0.1 mL) 또는 RITC 를 0.9 % 식염수에 섞어 토끼의 귀정맥을 통해 주사한 10 분 후에 토끼를 안락사 시키고 대동맥을 박리하여, 섭씨 영하 20 ℃에 보관하였다. 대동맥 절편은 상온에서 30 분간 4 %(v/v) buffered formalin solution에서 고정하고 cold PBS (pH 7.4)로 세척 후 optimum cutting temperature compound(OCT compound, Sakura, Tokyo)에 embed시키고, 조직 투과를 위하여 하루 경과 후 섭씨 영하 80 ℃에 보관하였다. 조직 박편은 10 mm 두께로 절단 후 poly-D-lysine과 함께 슬라이드에 놓고 섭시 45 ℃에서 빛을 차단하고 말려서 상온에서 사용시까지 보관하였다. 슬리이드 조직편은 PBS(pH 7.4)에 2회 세척하여 조직 compound를 없애고, Fluoromount-G™ (SouthernBiotech, Birmingham, AL)를 이용하여 mount하였다. 형광 영상은 IX81-ZDC focus drift compensating microscope (Olympus, Tokyo, Japan)로 excitation 파장과 emission 파장을 각각 547 nm 및 572 nm에서 관찰하였다(도 6).
도 5a는 정상 먹이를 먹인 토끼의 68Ga-MSA의 PET/CT영상으로서, 죽상동맥경화의 병소가 보이지 않으며 간과 골수 등의 조직에 68Ga-MSA의 uptake가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 도 5b는 콜레스테롤을 식이한 토끼의 68Ga-MSA의 PET/CT영상으로서, 복부에서 척추 앞부분의 죽상경화 병소가 초록색으로 길게 보인다. 도 5c는 도 5b 동물에서 죽상동맥경화 부위를 확대한 사진으로 척추의 노란색 앞에 초록색의 죽상경화 병소 부위가 관찰된다.
도 6E는 콜레스테롤을 섭취한 토끼 대동맥의 죽상동맥경화 부위에서 DIC(differential interference contrast) 현미경으로 관찰한 죽상경화조직이다. 또한, 도 6F는 동일한 조직에서 형광 confocal 현미경을 통하여 DAPI-염색을 이용한 죽상경화 병소의 세포 핵을 관찰한 것이며, 도 6G를 통해서는 죽상동맥경화 부위의 MSA에서 표지 RITC의 형광이 관찰되고 있음을 확인할 수 있으며, 도 6H를 통해서는 동일한 죽상동맥경화 조직에 대하여 MSA가 표지 되어 있지 않는 경우에는 RITC를 주사한 경우에도 형광현미경으로 RITC의 형광을 관찰할 수 없었음을 확인할 수 있었으며, 도 6I는 이들 사진들을 모두 동시에 융합하여 얻은 영상으로 만노스 리셉터에서 RITC-MSA의 특화된 결합력을 보여주는 사진이다. 즉, 표지 RITC를 이용하여 MSA가 죽상경화 부위에 잘 결합됨을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 실시예와 비교예의 죽상동맥경화 영상 비교
상기 실시예와 비교예의 경우를 가지고 죽상동맥경화 진단 영상이 선명함을 비교하는 실험을 진행하였다. 실험의 방법은 같은 토끼에 2 일 간격으로 68Ga-MSA와 18F-FDG를 각각 주사하여 비교하는 방법으로 진행하였으며, 이의 결과는 도 7, 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 7a는 정상 먹이를 먹인 토끼의 18F-FDG의 PET/CT영상으로서, 죽상동맥경화의 병소가 보이지 않으며 간과 골수 등의 조직에 18F-FDG의 uptake가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 도 7b는 콜레스테롤을 식이한 토끼의 68Ga-MSA의 PET/CT영상으로서, 복부에서 척추 앞부분의 죽상경화 병소가 초록색으로 길게 보인다. 도 7c는 도 7b와 같은 동물에서 죽상동맥경화 부위를 확대한 사진으로 척추의 회색 앞에 초록색의 죽상경화 병소 부위가 관찰된다.
하기 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 비교예의 경우에는 18F-FDG 와 68Ga-MSA 모두에서 죽상 동맥경화의 병소를 두 약제 모두 사용함으로써 확인할 수 있었다. 반면에, uptake가 증가함에 있어서는 18F-FDG를 이용한 비교예에서 보다는 68Ga-MSA 를 이용한 실시예의 경우가 도 9에 나타나듯이 보다 우수한 결과를 보임을 확인할 수 있었는데, 보다 구체적으로 하기 도 9를 살펴보면 하기 도 9a에서는 대동맥 죽상동맥경화 병소의 SUV 대비 하대정맥의 SUV값의 비교값(TBR: target-to-background ratio)을 보여주고 있으며, 도 9b에서는 대동맥 죽상동맥경화 병소의 SUV 대비 심장의 SUV값의 TBR을 보여주고 있고, 도 9c에서는 대동맥의 죽상동맥경화 병소의 SUV 대비 뇌실질의 SUV값의 TBR을 보여주는 것이다. 이러한 도 9의 결과를 종합한 결과 비교예에 비하여 실시예에서 보다 우수한 결과를 보임을 확인할 수 있어, 실시예의 경우가 비교예의 경우보다 죽상동맥경화 영상의 선명도가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다.
한편, 하기 표 2는 뇌 조직SUV 대비 대동맥의 죽상동맥경화 부위 SUV의 TBR치를 나타난 것이며, 실시예의 경우가 비교예의 경우보다 높게 나타났다. 또한 여기에 더하여 하기 도 10은 실시예를 사용한 경우 PET 안에서 비교예와 비교하여 매우 낮은 뇌 SUV의 영향을 나타내었다. 반면에, 비교예를 사용한 경우 뇌혈관 장벽을 통과하여 뇌실질로 18F-FDG가 들어가게 되고, 이를 통해 뇌실질 안에서 18F-FDG 유입에 따른 대사가 이루어지게 되며, 결국에는 죽상동맥경화 병소로 인한 것인지 아니면 18F-FDG 증가로 인한 것인지 정확하게 구별이 안되어 뇌 조직에서는 죽상동맥경화 병소의 추적에 제대로 활용하기 어려움을 보여주고 있다.
표 2
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실험예 3: 실시예의 경우 임상에서의 적용 가능 여부 측정
상기 실시예의 경우 임상에서 적용이 가능한 것인지를 비교예와 비교하여 측정하는 실험을 진행하였다. 이의 실험은 급성심근경색 환자군과 정상대조군을 대상으로 경동맥 부위의 죽상경화부위의 68Ga-MSA 영상을 비교하는 phase I 임상연구 방법으로 진행하였으며, 이의 결과는 하기 도 11, 도 12, 및 도 13 에 나타내었다. 하기 도 11은 급성심근경색 환자에서 초음파로 확진된 경동맥부위의 죽상동맥경화 병소 부위의 68Ga-MSA 영상을 나타낸 예로, 목부위의 초록색의 죽상경화부위가 잘 관찰되었고, 도 12는 경동맥에 죽상경화 병소가 없는 대조군에서의 68Ga-MSA 영상을 나타낸 예로 아무런 이상부위가 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 도 13에서 확인되듯이 경동맥에 죽상경화가 있는 심혈관질환자들에서 정상대조군에 비하여 68Ga-MSA PET/CT영상에서 시각적 판단(PET_visual_grade)과 SVU(PET_RCA_grade) 및 target SUV/background SUV ratio(PET_RCA_TBR)를 이용한 중증도 진단방법 모두에서 죽상동맥경화 병소의 영상을 이용하여 죽상동맥경화의 병소 유무의 판별이 쉽게 확인할 수 있어 실시예의 경우 임상에서도 적용 가능한 죽상동맥경화 영상화용 조성물에 해당하는 것임을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (6)

  1. 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민, 양기능성킬레이트제-만노실 나노입자, 양기능성킬레이트제-만노실 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 방사성 동위원소를 표지한 방사성동위원소 표지 화합물을 포함하는 죽상동맥경화 영상화용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는 68Ga, 99mTc, 111In,18F, 11C, 123I, 124I 및 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화 영상화용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는 68Ga인 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화 영상화용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 양기능성킬레이트제는 [1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)], [1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)], 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 하이드라지노니코틴산 (HYNIC), N2S2 및 N3S으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화 영상화용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 양기능성킬레이트제는 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)인 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화 영상화용 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 죽상동맥경화 영상화용 조성물을 이용하는 죽상동맥경화 진단방법.
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