KR20100087511A - 면역세포 영상화 및 탐지를 위한 양기능성킬레이트제와 만노실 인혈청알부민의 결합체 및 그의 방사성동위원소 표지 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대식세포, 쿠퍼세포, 망상내피계나 림프계와 같은 면역세포 또는 그들로 이루어진 조직의 영상을 위한 것으로서, 양기능성킬레이트제 (bifunctional chelating agent; BCA)와 만노실 인혈청알부민 (mannosyl human serum albumin; MSA)의 결합체 및 그의 방사성동위원소 표지 화합물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 하기 화학식 1로 표시되는 양기능성킬레이트제(BCA)와 만노실 인혈청알부민(MSA)의 결합체, 그의 방사성동위원소 표지화합물 및 방사성 표지를 위한 키트에 관한 것으로, 종래 면역세포 영상용 방사성동위원소 표지 화합물보다 방사성동위원소의 표지가 용이하고, 림프계 흡수율이 높으며, 양전자단층촬영법 (positron emission tomography; PET)에 의하여 영상을 얻을 수 있어 림프계 영상에 우수한 특성을 가지고 있다.

[화학식 1]

(Man-L₁)_n-A-(L₂-BCA)_m

(상기식에서, Man, L₁, L₂, A, BCA, n 및 m은 발명의 상세한 설명에 기재한 바와 같다.)

양기능성킬레이트제, 만노스, 인혈청알부민, 양전자단층촬영법 등

Description

면역세포 영상화 및 탐지를 위한 양기능성킬레이트제와 만노실 인혈청알부민의 결합체 및 그의 방사성동위원소 표지 화합물{Complex of bifunctional chelating agents and mannosyl human serum albumins for imaging and detecting immune cells and radioisotope labeled compounds thereof}

본 발명은 대식세포, 쿠퍼세포, 망상내피계나 림프계와 같은 면역세포 또는 그들로 이루어진 조직의 영상을 위한 방사성의약품에 관한 것이다.

핵의학에서 림프계 영상은 림프절의 기능을 영상화하여 진단하는데 중요하게 사용된다. 특히 유방암이나 흑색종 등의 경우 종양에 방사성 콜로이드를 주사하여 림프절에 흡수시킨 후 이동하는 가장 가까운 림프절인 센티넬 림프절을 영상화하고 이를 절제하여 생검을 하여 전이 여부를 판단하면 수술시 과도한 절제를 피할 수가 있어 수술 후 부작용 및 미용에 큰 영향을 미친다. 따라서 센티넬 림프절의 영상은 갈수록 더 중요하게 될 것이다(참조: G. Mariani, L. Moresco, G. Viale, G. Villa, M. Bagnasco, G. Canavese, J. Buscombe, H.W. Strauss, G. Paganelli. "Radioguided sentinel lymph node biopsy in breast cancer surgery." J. Nucl. Med. 2001; 42:1198-1215; G. Mariani, M. Gipponi, L. Moresco, G. Villa, M. Bartolomei, G. Mazzarol, M.C. Bagnara, A. Romanini, F. Cafiero, G. Paganelli, H.W. Strauss. "Radioguided sentinel lymph node biopsy in malignant cutaneous melanoma" J. Nucl. Med. 2002; 43:811-827).

림프절 영상화의 원리는 조직에 적당한 방사성 콜로이드를 주사하여 림프계로 흡수시킨 후 림프절로 이동하여 축적되는 것을 영상화하는 것이고, 방사능이 축적된 림프절은 수술시에 감마프로브를 이용하여 탐지해 낼 수 있다. 이러한 림프절의 영상 및 탐지에 사용되는 방사성의약품은 ^{99 m}Tc으로 표지된 콜로이드 계통이 대부분이다. 입자크기가 작은 콜로이드일수록 림프절 흡수가 빨라서 이상적인 방사성의약품이라 할 수가 있다. 현재 사용되는 미립의 콜로이드는 안티모니황콜로이드로서 입자 크기가 약 10~20 nm 정도이고, 알부민 나노콜로이드는 50 nm, 황콜로이드는 100~200 nm 정도가 되므로 안티모니황콜로이드가 가장 이상적이라 할 수가 있다. 그렇지만 다른 콜로이드보다는 비교적 작아서 흡수가 빠르다고 하지만 그래도 너무 입자가 큰 단점이 있고, 제조하는데 2시간 동안 끓여 주는 단계가 있어 아침 일찍 결과를 알아야 하는 환자의 경우 사용이 어려운 문제가 있다. 또한 강산성에서 제조하여야 하는데 제조 후 중화를 하면 콜로이드가 불안정해 질 우려도 있다.

이러한 단점을 피하기 위하여 분자 직경이 6~8 nm인 ^{99 m}Tc-인혈청알부민을 사용하기도 하는데 그러면 표지 시간이 짧고, 림프절 이동 속도가 빠른 장점이 있지만 림프절에 축적이 되지 않고 빠져 나가므로 영상의 콘트라스트가 약하고 센티넬 림프절 뿐만 아니라 다른 림프절에도 흡수가 되는 문제가 있다(참조:W.T. Phillips, T. Andrews, H.-L. Liu, R. Klipper, A.J. Landry Jr, R. Blumhardt, B. Goins. "Evaluation of [^{99 m}Tc] liposomes as lymphoscintigraphic agents: comparison with [^{99 m}Tc] sulfur colloid and [^{99 m}Tc] human serum albumin" Nucl. Med. Biol. 2001; 28:435-444).

이러한 문제점을 해결하기 위하여 면역세포에 존재하는 만노즈 수용체에 강력하게 결합하고, ^{99 m}Tc을 표지하기에 편리하며, 림프관으로 잘 섭취될 수 있는 분자 크기를 가졌으며, 인체내에서 부작용이 없는 방사성의약품이 개발되었는데 이는 다이설파이드결합을 환원한 만노즈 결합 인혈청알부민이다 (한국특허 제10-0557008호. 림프계 영상을 위한 디설파이드 환원형 만노즈결합혈청알부민 및 이를 포함한 방사성동위원소 표지화합물. 2006년 2월 23일. 출원인: 정재민, 이윤상; 발명인: 정재민, 홍미경, 이동수, 정준기, 이명철, 이윤상; Jeong JM, Hong MK, Kim YJ, et al "Development of 99mTc-neomannosyl human serum albumin (99mTc-MSA) as a novel receptor binding agent for sentinel lymph node imaging. Nucl Med Commun 2004, 25:1211-1217). 만노즈 결합 인혈청알부민은 만노즈 수용체에 강력하게 결합한다는 사실이 알려져 있다 (P. Stahl, et al, Cell 1980; 19:207-215). 따라서 상기 발명에서는 만노즈 결합 인혈청 알부민을 영상화에 가장 적절한 ^99mTc으로 표지하여 사용하면 림프절에 축적이 되어 림프계 영상을 할 수가 있다는 것을 추정하였 다. 게다가 인혈청알부민의 크기는 6~8 nm로서 현재 사용되는 콜로이드형 방사성의약품보다 크기가 작아 림프절 섭취가 빠르다. 그러나 만노즈 결합 인혈청알부민은 그대로는 ^{99 m}Tc로 표지가 잘 되지 않는다. 따라서 만노즈 결합 인혈청알부민을 적당한 환원제로 처리하여 다이설파이드결합을 환원한 만노즈 결합 인혈청알부민을 제조하였다. 이와 유사한 방법으로 갈락토즈 또는 락토즈 결합 인혈청알부민을 환원제롤 처리하여 다이설파이드결합을 환원하여 ^{99 m}Tc을 표지한 결과가 발표되어 있다 (한국특허 출원번호 제2001-0059413호, 2001.9.25, 정재민, 이재태, “간기능 영상화를 위한 디설파이드 환원형 갈락토즈 결합 혈청알부민 및 이를 포함한 방사성동위원소 표지 화합물”). 그러나 ^{99 m}Tc으로 표지된 물질은 감마선 촬영만 가능하고 양전자단층촬영이 불가능한 문제점이 있다.

최근에는 일반적인 감마카메라보다 영상이 뛰어난 양전자단층촬영이 널리 보급되고 더 나아가 양전자를 탐지할 수 있는 양전자프로브가 개발됨으로써 양전자 방출 핵종으로 표지된 면역세포 영상용 방사성의약품이 필요하게 되었다. 양전자 방출 핵종은 사이클로트론에서 생산되는 ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O 등이 있는데 이중 다른 핵종은 반감기가 너무 짧아 반감기가 110분인 ¹⁸F만이 사용 가능성이 있다. 그러나 표지과정에 증발과정과 고온으로 가열하는 과정 등이 있어 표지가 복잡하고 또한 단백질의 경우 변성이 일어날 우려가 있어서 바람직하지 않으며, 생산을 위하여 고가의 사이클로트론이 필요하다는 단점이 있다.

본 발명에서는 양기능성킬레이트제와 만노실 인혈청알부민의 결합체를 제조하였고, 이를 이용하여 방사성동위원소 표지화합물 및 방사성동위원소 표지용 키트를 제조한 결과, 종래 림프계 영상을 위한 방사성의약품과 달리 양전자 방출핵종인 ⁶⁸Ga과 같은 동위원소의 표지가 용이하며, 제조된 방사성동위원소 표지 화합물의 안정성이 우수하며, 또한 림프계나 간 및 비장 등에 축적율이 높아 림프계를 비롯한 각종 면역세포의 영상과 탐지에 우수한 특성을 가지고 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 면역세포의 영상과 탐지를 위하여 ⁶⁸Ga과 같은 금속성 방사성동위원소의 표지가 용이한 양기능성 킬레이트제-만노실 인혈청알부민 (BCA-MSA)을 제공하는 것이다. 여기에 사용되는 BCA는 바람직하게는 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)과 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)이 있고 이 중 더욱 더 바람직한 것인 NOTA이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안정성 및 면역세포의 영상과 탐지가 우수한 방사성동위원소 표지화합물을 제공하는 것이다. 이 때 사용되는 방사성동위원소는 거의 대부분의 금속성 방사성동위원소가 해당하나 가장 바람직하게는 ⁶⁸Ga을 들 수가 있 다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 면역세포의 영상과 탐지에 사용되는 방사성의약품을 만들기에 용이한 키트를 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 무균 바이알 안에 BCA-MSA와 완충용액으로 조성되어 금속성 방사성동위원소를 가하였을 때 쉽게 표지가 되어 면역세포 영상과 탐지에 적합한 약제학적으로 허용되는 방사성의약품을 제조하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은,

(1) 하기 화학식 1로 표시되는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민;

[화학식 1]

(Man-L₁)n-Ａ-(L₂-BCA)m

(상기 식에서, Man은 만노실기이며, L₁ 및 L₂는 링커 또는 직접 결합이며, Ａ는 인혈청알부민이며, BCA는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 및 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)에서 선택되는 양기능성 킬레이트제이며, n과 m은 각각 1~58의 정수이다.)

(2) (1)에 있어서, 상기 L₁ 및 L₂가 각각 직접결합이거나, C₁~C₁₀의 알킬, C₄~C₁₀의 아릴, 티오유레아, 트리아졸, 모노펩타이드, 다이펩타이드, 트리펩타이드, C₄~C₁₀의 사이클로알킬, 벤질, 티오에테르, 아민, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 에테르, 하이드라진, 하이드라지드, 오탄당, 및 육탄당 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 복합체를 포함하는 링커인 것을 특징으로 하는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민;

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 L₁ 및 L₂가 하기 화학식에 의해 표현되는 링커인 것을 특징으로 하는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민;

(4) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 BCA가 NOTA인 것을 특징으로 하는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민;

(5) (1) 또는 (2)의 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민에 금속성 방사성 동위원소를 표지한 방사성동위원소 표지 화합물을 포함하는 면역세포 영상화용약제;

(6) (5)에 있어서, 상기 면역세포가 림프계 또는 망상내피계인 것을 특징으로하는 약제;

(7) (5)에 있어서, 상기 금속성 방사성동위원소가 ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ^{99 m}Tc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ²¹²Pb, ²¹²Bi 또는 ¹⁰⁹Pd인 것을 특징으로 하는 약제;

(8) (5)에 있어서, 상기 금속성 방사성동위원소가 ⁶⁸Ga인 것을 특징으로 하는 약제;

(9) (1) 또는 (2)의 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민 10 ng~100 mg을 포함하고, 용액상태, 냉동상태 또는 냉동건조된 상태로 밀봉된 비발열성 멸균 형태의 금속성 방사성 동위원소 표지 약제 제조용 키트;

(10) (9)에 있어서, 추가로 pH 1~9이고 농도가 1 μM~10 M인 완충용액 0.01 mL~10 mL를 포함하는 금속성 방사성 동위원소 표지 약제 제조용 키트;

(11) (10)에 있어서, 상기 완충용액이 초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산, 또는 이들의 나트륨염 또는 칼륨염인 것을 특징으로 하는 키트를 과제해결 수단의 요지로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 BCA-MSA, 그의 방사성 동위원소 표지 화합물 및 방사성 라벨링용 키트는 종래 면역세포 영상 및 탐지를 위한 방사성 동위원소 표지 화합물보다 ⁶⁸Ga과 같은 양전자를 방출하는 금속성 방사성 동위원소의 표지가 용이하며, 안정성이 우수하며, 또한 림프계 축적율이 높아 림프계 영상에 우수한 특성을 가지고 있다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민 (BCA-MSA)을 포함한다.

(Man-L₁)_n-A-(L₂-BCA)_m

상기 식에서, Man은 만노실기이며, L₁ 및 L₂는 링커 또는 직접 결합이며, Ａ는 인혈청알부민이며, BCA는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 및 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)에서 선택되는 양기능성 킬레이트제이며, n과 m은 각각 1~58의 정수이다.

상기 인혈청알부민은 분자량이 66,462이고, 분자의 장축이 8 nm, 단축이 6 nm이며, 등전점 (isoelectric point, IEP)이 4.8인 단백질로서, 혈장단백질의 50% (4 g/dl)를 구성하고 있으며, 단일 폴리펩타이드 체인으로 구성되어 있다. 총 58개의 라이신기가 있는데 N-터미날과 합치면 총 59개의 아미노기를 가지고 있는 셈이 되므로, 이론적으로 아미노기에 결합하는 BCA나 만노실기는 합쳐서 최대 59개가 결합할 수 있다.

상기 BCA-MSA는 용액상태에서는 냉동상태에서 보관하는 것이 안정하지만 냉동건조를 시킬 경우 냉장 보관하여도 안정하다. 냉동건조된 경우는 무산소 또는 진공 조건의 밀봉용기에 보관할 경우 더 안정하다.

본 발명의 BCA-MSA는 만노즈와 인혈청알부민의 결합시 직접 또는 링커를 이용하여 결합한다. 상기 L₁ 및 L₂는 C₁~C₁₀의 알킬, C₄~C₁₀의 아릴, 티오유레아, 트리아졸, 모노펩타이드, 다이펩타이드, 트리펩타이드, C₄~C₁₀의 사이클로알킬, 벤질, 티오에테르, 아민, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 에테르, 하이드라진, 하이드라지드, 오탄당, 및 육탄당 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 복합체를 포함한다.

또한, BCA-MSA의 상기 L₁ 및 L₂는 바람직하게 하기 화학식에 의해 표현된 바와 같다.

상기 만노실 및 링커를 포함한 만노실기는 혈청알부민의 아미노기와 결합하게 된다. 일 예로, 만노즈가 직접 또는 링커를 이용하여 결합된 혈청알부민은 하기 화학식 2 및 3과 같다. 하기 화학식 2는 만노즈와 인혈청알부민이 직접 결합한 만노실 인혈청알부민을 나타낸 것이고, 하기 화학식 3은 페닐기를 링커로 이용한 페닐만노실 인혈청알부민이다. 필요에 따라 상기 만노실 인혈청알부민에 1~58개의 만노즈 또는 링커를 포함한 만노즈를 포함시킬 수 있다.

상기 화학식으로 나타낸 MSA는 DOTA나 NOTA와 같은 BCA를 결합하여 BCA-MSA를 형성한다.

본 발명은 면역세포 영상 및 탐지에 사용되는 상기 화학식 1로 표시되는 BCA-MSA의 제조 방법을 포함한다.

구체적으로, 만노즈를 직접 또는 링커를 이용하여 인혈청알부민과 결합하여 MSA를 제조하는 단계(단계 1); 및, 상기 MSA에 DOTA나 NOTA가 포함된 BCA를 결합하는 단계(단계 2)로 이루어지고 이 단계의 순서는 바뀔 수 있다.

단계 1은 만노즈 또는 링커의 말단 부분을 혈청알부민과 결합하기 위하여 통상적인 화학 반응을 이용하여 티오시아네이트, 에스테르, 알데히드, 이미노메톡시알킬 등과 같은 결합가능한 관능기를 갖도록 변형을 시키거나, 직접 반응을 통하여 만노실 인혈청알부민을 제조한다.

구체적으로, 하기 반응식 1은 2-이미노-2-메톡시에틸-1-티오-β-D-만노즈(이하 "IME-티오만노즈"라 칭한다)를 사용하여 상기 화학식 2로 표시되는 만노실 인혈청알부민을 제조하는 것을 나타낸 것이다.

상기 반응식 1과 같이, D-만노즈를 아세틸화 및 브롬화를 시키고 티오유레아를 결합시킨 다음 클로로아세토니트릴을 반응시켜 시아노메틸 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-1-티오-β-D-만노피라노사이드를 합성한다. 이를 메탄올 용액 중에서 소디움메톡사이드와 반응시켜 IME-티오만노즈를 합성하고, 이를 pH 8~9의 조건 하에서 인혈청알부민(human serum albumin, HSA)의 아미노기(NH₂-)와 티오카바밀(thiocarbamyl) 형태로 결합하여 상기 화학식 2로 표시되는 만노실 인혈청알부민을 제조한다.

또한, 하기 반응식 2는 페닐만노즈와 인혈청알부민을 결합하여 상기 화학식 3으로 표시되는 페닐만노실 인혈청알부민을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

상기 반응식 2에서 보는 바와 같이, 페닐만노즈는 페닐기 말단의 SCN 부분과 인혈청알부민의 아미노기가 결합하여 안정한 상기 화학식 3으로 표시되는 페닐만노실 인혈청알부민을 제조한다.

단계 2는 상기 만노실 인혈청알부민과 BCA의 일종인 NOTA 또는 DOTA와 결합하는 단계이다. 이 때 반응식 3에서 보는 바와 같이 NOTA 또는 DOTA의 카르복실기와 인혈청알부민의 아미노기를 결합하여 아미드결합을 형성하기도 하고, 반응식 4에서 보는 바와 같이 NOTA 또는 DOTA에 벤질이소티오시아네이트를 도입한 유도체를 이용하여 티오시아네이트와 인혈청알부민의 아미노기를 결합하여 티오유레아결합을 형성할 수도 있으며, 그 외에도 수많은 다른 화학결합으로 링커를 넣을 수가 있다.

본 발명은 화학식 1의 BCA-MSA에 방사성 동위원소를 표지한 화합물을 포함한다.

상기 방사성 동위원소는 ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ^{99 m}Tc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu, ²¹²Pb, ²¹²Bi 또는 ¹⁰⁹Pd이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 ⁶⁸Ga 또는 ¹¹¹In을 사용하고, 가장 바람직하게는 ⁶⁸Ga를 사용한다.

⁶⁸Ga은 제너레이터에서 생산하는 양전자 방출 핵종으로서 단백질을 표지할 때 양기능성킬레이트제를 매개로 하여 쉽게 높은 효율로 표지할 수 있다. 또한 반감기가 68분이어서 양전자프로브를 이용하여 수술 중 림프절 탐지도 가능하므로 매우 이상적인 림프절 영상 및 탐지용 핵종이다.

상기 방사성 동위원소 표지 화합물은 화학식 1의 BCA-MSA와 방사성 동위원소를 첨가하여 반응시켜 제조한다. 이러한 표지 반응은 인체에 투여할 수 있도록 무균이고 발열성물질이 없는 수용액 중에서 수행하여 표지 후에는 바로 인체에 주사할 수 있게 한다.

상기 표지된 방사성 동위원소 표지 화합물은 피하주사로 몸에 투입하여, 림프계에 축적되어 통상적인 핵의학 장비를 통하여 림프계 기능 영상화를 하거나 감마 또는 베타 프로브를 이용하여 방사능이 분포한 림프절 탐지에 이용될 수 있다. 또는 정맥주사로 투여할 경우 간의 쿠퍼세포나 골수의 대식세포의 영상에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 BCA-MSA 10 ng~100 ㎎을 포함하는 약제학적으로 허용되는 비발열성 멸균 형태의 금속성 방사성 동위원소 표지 약제 제 조용 키트를 포함하는데, 이 때 동위원소 표지시의 수소이온 농도를 조절하기 위하여 pH 1~9이고 농도가 1 μM~10 M인 완충용액 0.01 mL~10 mL를 첨가하여 용해상태, 냉동상태 또는 냉동건조 상태로 밀봉하여 제조할 수 있다.

상기 키트용 완충용액은 초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산 또는 이들의 나트륨염 또는 칼륨염이 바람직하다.

또한, 본 발명의 면역세포 영상화 및 탐지용 키트는 추가로 산화방지제를 포함할 수 있다. 상기 산화방지제는 방사성동위원소로 표지된 BCA-MSA가 방사선분해에 의하여 변질되는 것을 방지하는 것으로, 비타민 C 또는 겐티식산 등이 바람직하며, 본 발명의 키트에는 단위투여량당 0~500 ㎎ 이 바람직하다.

상기 면역세포 영상화 및 탐지용 키트는 멸균 용기내에서 불활성 가스 환경하에서 동결되거나 동결 건조된다. 상기 키트는 임상 병리사 또는 기술자가 사용하기 위한 주사 조제를 제조하기 위해 완충액 멸균 바이알, 식염수, 주사기, 필터, 칼럼 및 기타 보조 장치를 보충할 수 있다. 상기 키트가 환자 개인적인 필요 또는 식이요법에 따라 변화 및 변형될 뿐 아니라 방사성 동위원소가 제공되거나 얻어질 수 있는 형태에서의 변화도 가능하다는 것은 본 기술 분야의 통상적인 지식을 가진 사람에게 널리 공지되어 있다.

상기 면역세포 영상화 및 탐지용 키트는 사용하기 바로 전에 BCA-MSA 1 ㎎ 당 0.1~500 mCi의 방사성 동위원소를 첨가하여 0.1~30 분 동안 반응을 시켜 방사성 동위원소 표지 화합물을 제조한다.

일 예로, 발생기로 제조된 ⁶⁸GaCl₃를 BCA-MSA 포함하는 면역세포 영상화 및 탐지용 키트에 첨가하여 37℃에서 1~30 분 동안 반응시켜 98~100%의 효율로 ⁶⁸Ga표지 화합물을 제조하였다.

본 발명의 실시예에 따르면, 방사성 동위원소 표지 화합물의 표지 효율을 측정한 경우, ⁶⁸Ga-BCA-MSA가 95% 이상인 표지 효율을 얻을 수 있었고, 혈청 속에서 37℃에 배양하였을 때 2시간 동안 안정하였으며, 마우스 발바닥에 투여 후 방사성 동위원소 표지 화합물의 대퇴부 림프절 이동을 영상화한 결과, 다른 방사성동위원소 표지 화합물보다 더 빨리 많이 이동함을 도 2에서와 같이 확인할 수가 있었다.

이하 본 발명의 실시예를 다음에 의하여 설명한다.

그러나 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 벤질 NOTA - 티오만노실 인혈청알부민의 제조

단계 1 : 만노실 인혈청알부민의 제조

상기 반응식 1과 같이, 100 g의 D-만노즈를 400 ㎖의 무수아세트산(acetic anhydride)과 3 ㎖의 과염소산 혼합액에 온도를 30~40℃로 유지시키며 30분에 걸쳐 서서히 교반하면서 가하였다. 상기 D-만노즈를 포함한 혼합액에 30 g의 무정형 인을 가한 후 반응 용기를 얼음으로 식혔다. 상기 혼합액 온도를 20℃ 이하로 유지시키면서 180 g의 브롬을 서서히 가하고 36 ㎖(0.9 당량)의 증류수를 온도 상승을 방지하면서 30분에 걸쳐 서서히 가하였다. 반응 용기를 막은 다음 2 시간 더 실온에서 반응시킨 후 300 ㎖의 클로로포름을 가하고 그 혼합물을 800 ㎖의 얼음 물을 넣어 놓은 분액여두에 부었다. 클로로포름 층을 모아 여과하여 인을 제거한 다음 동량의 얼음물로 두 번 세척하였다. 중조 수용액으로 한번 더 세척하여 잔류하고 있는 산을 제거한 다음 염화칼슘으로 탈수하고 감압 건조하고, 디에틸에테르에 녹여 재결정하여 융점 87°C의 결정을 얻었다. 2-S-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-만노피라노실)-2-티오슈도유레아 하이드로브로마이드 9.74 g (20 mmol)을 40 ml의 물과 아세톤 1:1 혼합용액에 녹이고 클로로아세토니트릴 5 ml (79 mmol)을 가하여 완전히 녹인다. 탄산칼륨 3.2 g (23.2 mmol)과 소디움 바이설파이트 4.0 g (40.4 mmol)을 가하고 실온에서 30 분간 잘 저어 준다음 반응 혼합물을 160 ml의 얼음물에 가하고 2 시간 동안 더 저어준다. 생성된 침전을 여과하여 모으고 찬 물로 세척한다. 공기 중에 건조시킨 침전을 끓는 메탄올에 녹이고 여과하여 불순물을 없앤 다음 냉장고에 보관하여 결정을 얻는다: 회수율 72 %, 융점 95~97 ℃. 회수한 결정 40 mg을 1.5 ml의 무수 메탄올에 녹인다. 이 때 40 ℃ 정도로 가열하여 잘 녹게 한다. 여기에 소디움메톡사이드를 0.8 mg 넣고 잘 섞은 다음 48 시간 동안 실온에서 반응시켜 IME-티오만노즈를 합성한다: 22 mg, 수득율 55 %. 다음에 0.2 M 붕산완충액 (pH = 8.5) 1 ㎖에 인혈청알부민 100 ㎎을 녹인 후 22 ㎎ IME-티오만노즈와 격렬히 섞어주었다. 37℃에서 1.5 시간 반응시켜 -70 ℃에 냉동 보관하여 만노실 인혈청알부민을 수득하였다.

단계 2 : 벤질 NOTA - 티오만노실 인혈청알부민의 제조

상기 단계 1에서 제조한 1 ㎖ 만노실 인혈청알부민(13.6 ㎎/㎖)에 10 mg의 p-SCN-Bz-NOTA를 넣은 후 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세파덱스 G-25 칼럼을 이용하여 벤질 NOTA-티오만노실 인혈청알부민을 분리 정제하였다.

< 실시예 2> 벤질 NOTA - 페닐 만노실 결합 인혈청알부민

단계 1 : 페닐 만노실 인혈청알부민의 제조

상기 반응식 3과 같이, 0.1 M 탄산완충액(pH 9.5) 5 ㎖에 20 ㎎의 인혈청알부민을 녹인 후 5.5 ㎎의 α-L-만노피라노실페닐이소티오시아네이트 (α-L- mannopyranosylphenylisothiocyanate)를 가한 다음 실온에서 잘 저으면서 20 시간동안 반응시켰다. 반응액을 -70 ℃에 냉동 보관하여 페닐 만노실 인혈청알부민을 수득하였다.

단계 2 : 벤질 NOTA - 페닐 만노실 인혈청알부민의 제조

상기 단계 1에서 제조한 1 ㎖ 페닐 만노실 인혈청알부민(13.6 ㎎/㎖)에 10 mg의 p-SCN-Bz-NOTA를 넣은 후 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세파덱스 G-25 칼럼을 이용하여 벤질 NOTA-페닐 만노실 인혈청알부민을 분리 정제하였다.

< 실시예 3> 면역세포 기능 영상화용 키트의 제조

1 ㎖ 벤질 NOTA-페닐 만노실 인혈청알부민(13.6 ㎎/㎖), 0.3 ㎖ 초산나트륨 완충용액(0.5 M, pH 5.5)을 첨가한 후 단백질 1 ㎎에 해당하는 양씩 바이알에 분주한 다음 -70 ℃에서 냉동하고 이를 냉동건조하여 보관하여 면역세포 기능 영상화용 키트를 제조하였다.

< 실시예 4> 면역세포 기능 영상화용 키트를 이용한 ⁶⁸Ga 표지 화합물의 제조

상기 실시예 3의 키트에 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-발생기(Cyclotron Co., Russia)에서 제조된 ⁶⁸GaCl의 0.1 M 염산 용액 1 ㎖를 각각 첨가하여 37℃에서 반응하면서 10분, 30분, 1시간, 2시간 후에 표지효율을 TLC로 측정하였다. 이때 고정상은 ITLC-SG (Gelman Co., USA)를 사용하였고 전개용매는 0.1 M 구연산 용액을 사용하였다. ITLC 플레이트 상의 방사능분포는 TLC-스캐너 (Bioscan Co.)를 사용하여 측정하였다. 표지된 ⁶⁸Ga은 원점에 남아 있고 표지되지 않은 ⁶⁸Ga은 꼭대기로 움직였다 (도 2). 또한 pH가 4~5 사이에서는 37℃에서 30분간 반응하면 표지가 거의 종료되는 것을 알 수 있었다 (도 3).

< 비교예 1> ^{99 m} Tc - 안티모니황콜로이드 ( ^{99 m} Tc - antimony sulfur colloid : ^{99 m} Tc - ASC )

한국원자력연구소에서 제조한 ASC 키트 바이알에 ^{99 m}TcO₄ ^-를 혼합하여 50 ℃에서 30 분간 배양하여 표지하였다.

< 비교예 2> ^{99 m} Tc -주석콜로이드 ( ^{99 m} Tc - tin colloid )

한국원자력연구소에서 제조한 tin colloid 키트 바이알에 ^{99 m}TcO₄ ^-를 혼합하여 실온에서 10분간 배양하여 표지하였다.

< 비교예 3> ^{99 m} Tc - 인혈청알부민 ( ^{99 m} Tc - human serum albumin ; HSA )

Daiichi사에서 제조한 HSA 키트 바이알에 ^{99 m}TcO₄ ^-를 혼합하여 실온에서 10분간 배양하여 표지하였다.

< 비교예 4> ^{99 m} Tc - 만노실 인혈청알부민 ( ^{99 m} Tc - mannosyl human serum albumin ; MSA )

한국특허 제10-055708호에 의하여 제조한 MSA 키트 바이알에 ^{99 m}TcO₄ ^-를 혼합하여 실온에서 10분간 배양하여 표지하였다.

< 실험예 1> 방사성 동위원소 표지 화합물의 안정성 실험

상기 실시예 4에서 표지한 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA를 인혈청과 혼합하여 37℃에서 배양하였을 때의 방사화학적 순도를 통하여 안정성을 측정하였다. 상기 결과는 하기 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 혈청 중에서 37℃로 배양하였을 경우 2 시간 동안 99% 이상의 순도를 유지하였고, 실제 핵의학적 영상을 얻는 것은 표지 후 1 시간 이내에 대부분 주사하므로 충분히 실용적으로 안정함을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2> 감마카메라와 PET 영상에 의한 림프절 흡수 확인

랫트 (체중 평균 200 g, 수컷, Sprague-Dawley)를 사용하여 감마카메라 영상에 의한 림프절 섭취율을 측정하였다. 상기 랫트의 발바닥에 상기의 비교예 1, 3, 4에서 제조한 테크네슘 표지 물질 500 μCi/10 μl 씩을 투여하였다. 1 시간 후에 감마선카메라 (Sigma 410, Ohio-Nuclear, USA)로 영상을 얻었다. 본 발명의 실시예 4의 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA는 마우스 (체중 평균 20 g, 수컷, ICR)의 발바닥에 500 μCi/10 μl 씩을 투여하고 1시간 후에 동물용 PET로 영상을 얻었다. 상기 결과는 각각 하기 도 5와 도 6에 나타내었다. 종래기술에 의해서는 도 5와 같이 감마카메라에 의한 촬영만이 가능하였으나, 본원발명 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA를 사용하는 경우 도 6과 같이 PET 영상을 얻을 수 있으므로 더 좋은 품질의 영상을 얻을 수 있었다.

< 실험예 3> 정맥주사 후 생체내분포시험에 의한 면역세포 분포 확인

마우스 (체중 평균 20 g, 수컷, ICR)에 상기 실시예 4의 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA 1 μCi 씩을 꼬리정맥의로 주사하고 10 분, 30 분, 60 분 후에 마우스를 희생시켜 해부한 다음 각 장기를 적출하여 무게를 재고 각 조직에 분포한 방사능을 감마선계수기 (CobraIII, Packard, USA)로 측정하였다. 그 값을 이용하여 단위 g당 주사량에 대 한 백분율(% ID/g)을 구하는 표준적인 방법에 의하여 생체내분포를 측정하였다. 상기 결과는 표 2에 나타내었다.

표 2에 의하면 모든 시간대에서 간의 흡수가 59~61% ID/g으로 가장 높았고, 비장의 흡수가 17~21% ID/g으로 두 번째로 높았다. 뼈의 흡수는 4% ID/g 정도여서 세 번째였는데 이 조직들은 모두 망상내피계를 가지고 있어서 면역세포가 집중하여 있는 것이 특징이다.

< 실험예 4> 마우스 정맥주사 후 PET 영상화

상기 실시예 4에서 얻은 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA 2 mCi를 마우스 꼬리정맥으로 주사하고 1 시간과 2 시간 후에 PET영상을 얻었다. 그 결과는 도 7에 있는데 1 시간과 2 시간 영상 모두 간이 가장 진하게 보이고 그 다음으로 비장이 흐리게 보였다. 이는 간과 비장에 면역세포인 망상내피계가 많이 분포한 결과로서 본원발명의 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA가 면역세포의 영상에 이용가능하다는 것을 의미한다.

도 1은 본 발명의 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민 (bifunctional chelating agent-mannosyl human serum albumin; BCA-MSA)을 도식화한 것으로, 만노실기와 양기능성킬레이트제를 직접 또는 링커를 통해 인혈청알부민에 결합한 것이다. 이 때, Man은 만노실기이고, L₁ 및 L₂는 링커 또는 직접결합이며, 또한 BCA는 양기능성킬레이트제를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 벤질 NOTA(1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산)- 페닐 만노실 인혈청알부민에 ⁶⁸Ga을 표지하여 TLC로 분석한 것이다.

도 3은 본 발명의 벤질 NOTA-페닐 만노실 인혈청알부민에 ⁶⁸Ga을 여러 가지 pH에서 표지하면서 시간에 따른 표지 효율 변화를 본 것이다.

도 4는 본 발명의 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA의 37℃ 혈청 중에서의 안정성을 본 것이다.

도 5는 본 발명의 대조군으로서 ^{99 m}Tc-HSA (인혈청알부민)와 ^{99 m}Tc-ASC (안티모니황콜로이드)와 ^{99 m}Tc-MSA (만노실 인혈청알부민)를 랫트의 오른쪽 발바닥에 주사하고 1시간 후에 림프계로 옮겨가는 것을 감마카메라로 영상을 얻은 것이다.

도 6은 본 발명의 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA를 마우스 오른쪽 발바닥에 주사하고 1시간 후에 (Man-L₁)_n-A-(L₂-BCA)_m 림프계로 옮겨가는 것을 PET로 영상을 얻은 것이다.

도 7은 본 발명의 ⁶⁸Ga-NOTA-MSA를 마우스 꼬리정맥으로 주사한 다음 PET로 영상을 얻은 것이다.

Claims (11)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민.

   [화학식 1]

   (Man-L₁)n-Ａ-(L₂-BCA)m

   상기 식에서,

   Man은 만노실기이며,

   L₁ 및 L₂는 링커 또는 직접 결합이며,

   Ａ는 인혈청알부민이며,

   BCA는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 및 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)에서 선택되는 양기능성 킬레이트제이며,

   n과 m은 각각 1~58의 정수이다.
2. 제1항에 있어서, 상기 L₁ 및 L₂가 각각 직접결합이거나, C₁~C₁₀의 알킬, C₄~C₁₀의 아릴, 티오유레아, 트리아졸, 모노펩타이드, 다이펩타이드, 트리펩타이드, C₄~C₁₀의 사이클로알킬, 벤질, 티오에테르, 아민, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 에테르, 하이드라진, 하이드라지드, 오탄당, 및 육탄당 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 복합체를 포함하는 링커인 것을 특징으로 하는 양기능성킬레이 트제-만노실 인혈청알부민.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 L₁ 및 L₂가 하기 화학식에 의해 표현되는 링커인 것을 특징으로 하는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민.

   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 BCA가 NOTA인 것을 특징으로 하는 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민.
5. 제1항 또는 제2항의 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민에 금속성 방사성 동위원소를 표지한 방사성동위원소 표지 화합물을 포함하는 면역세포 영상화용 약제.
6. 제5항에 있어서, 상기 면역세포가 림프계 또는 망상내피계인 것을 특징으로 하는 약제.
7. 제5항에 있어서, 상기 금속성 방사성동위원소가 ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ²¹²Pb, ²¹²Bi 또는 ¹⁰⁹Pd인 것을 특징으로 하는 약제.
8. 제5항에 있어서, 상기 금속성 방사성동위원소가 ⁶⁸Ga인 것을 특징으로 하는 약제.
9. 제1항 또는 제2항의 양기능성킬레이트제-만노실 인혈청알부민 10 ng~100 mg을 포함하고, 용액상태, 냉동상태 또는 냉동건조된 상태로 밀봉된 비발열성 멸균 형태의 금속성 방사성 동위원소 표지 약제 제조용 키트.
10. 제9항에 있어서, 추가로 pH 1~9이고 농도가 1 μM~10 M인 완충용액 0.01 mL~10 mL를 포함하는 금속성 방사성 동위원소 표지 약제 제조용 키트.
11. 제10항에 있어서, 상기 완충용액이 초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산, 또는 이들의 나트륨염 또는 칼륨염인 것을 특징으로 하는 키트.

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