KR20160110119A - 알부민 기반 질환 추적 진단 또는 치료 나노플랫폼 - Google Patents

알부민 기반 질환 추적 진단 또는 치료 나노플랫폼 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알부민에 아자이드(N3)기 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 수식된, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 알부민 나노플랫폼에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 알부민 나노플랫폼에 아자이드(N3)기 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기를 포함하는 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼 제조용 키트, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알부민을 기반의 플랫폼은 혈관내구획에서 존재할 뿐만 아니라 그 크기로 인하여 신장에서의 결합 및 재흡수가 되지 않기 때문에 신장의 섭취를 피할 수 있어 이러한 신독성으로부터 자유로운 약물전달 및 방사성의약품으로서의 넓은 응용이 가능하다. 또한 본 발명은 변형을 최소화하여 오랜 시간 혈관내구획에 존재함으로써 표적 조직 및 장기로의 효과적인 약물 전달이 가능하여 표적 조직으로의 높은 섭취를 용이케 하는 플랫폼 기술이다.

Description

알부민 기반 질환 추적 진단 또는 치료 나노플랫폼 {Albumin-based disease targeting diagnostic or therapeutic nano-platform}
본 발명은 알부민에 아자이드(N3)기 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 수식된, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 알부민 나노플랫폼에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 알부민 나노플랫폼에 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기를 포함하는 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼 제조용 키트, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼에 관한 것이다.
현재 약물전달, 진단, 치료 응용 등은 알부민과 같은 나노입자를 기반으로 한 방법과 그 외에 소분자 기반으로 한 방법 등이 실제 임상 등에서 이용되고 있다. 나노입자를 기반으로 한 전달 및 치료는 리포좀, 항체 등의 다양한 물질을 이용한 약물 전달 방법으로, 그동안 많은 연구들에서 간을 비롯한 세망 내피계의 피할 수 없는 높은 섭취가 잘 알려져 있다.
소분자를 이용한 진단 및 치료 등의 접근에는 엽산수용체를 표적으로 한 약물 중합체로서의 Vintafolide, 신경내분비 종양의 소마토스타틴 수용체를 표적으로한 방사성동위원소 표지 DOTATOC 및 DOTATATE 등이 있다. 이러한 소분자 기반 영상화/표적 물질들은 표적 부위의 빠른 섭취와 높은 표적/비표적 섭취 비율을 보이는 것으로 알려져 있으나, 신장이 주 배설경로인 경우 그로 인한 신독성 등의 문제가 발생한다.
특히, 알부민을 이용한 약물전달, 진단, 치료 응용은 의약학 등 많은 분야에서 응용되고 있다. 대표적으로 Tc-99m이 표지된 알부민의 경우 단량체는 혈액의 혈관 내 이동, 분포 등을 평가하는 데에 사용되면, 응집체는 폐의 모세혈관을 막아 폐의 손상 부위를 평가하는 데 사용된다.
또한, 종양을 함유하는 감시 림프절을 진단하기 위한 용도로 제조된 방사성 동위원소(특히, Tc-99m)로 표지된 엽산 결합 인혈청 알부민이 개시되어 있다(대한민국 등록특허 제10-1395085호). 다만, 이는 알부민이 림프관을 통해서 전달되기 때문에 표적 부위의 섭취나 신독성 등의 기존 알부민 유도체의 문제점을 극복했다고 볼 수 없고 그 용도 또한 종양을 함유하는 감시 림프절을 진단 및 영상화하는데 불과하다.
아울러, 친수성 알부민과 소수성 담즙산을 결합하여 약물 전달용 복합체를 이루는 기술도 알려져 있다(대한민국 등록특허 제10-1043407호). 다만, 해당 단백질 복합체는 친수성 환경에서 자기 집합체를 형성하여 나노 입자 형태로 약물을 전달하는 것으로 특히 소수성 약물 전달에 목적이 있다는 한계점이 있다.
한편, 상기 기존의 방사성동위원소 표지 알부민 유도체는 영상으로 평가된 간으로의 섭취가 일정하지 않아 정확한 진단을 하는데 방해가 되어왔다. 이러한 문제의 근본적인 원인은 생체 유래 알부민의 표면에 여러 가지 기능기를 도입하면서 가해지는 물리화학적 스트레스(높거나 낮은 pH, 높은 온도, 유기용매, 산화/환원제)에 의한 알부민의 변성에서 유래할 것으로 예상되고 있다.
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 기존 알부민 또는 소분자 기반 생체 내 전달 나노입자에 대한 기술의 문제점을 해결하고자 노력한 결과, Cu-Free 클릭화학을 이용하여 알부민에 여러 가지 기능기(질환 추적물질, 활성물질, 방사성 동위원소 등)를 도입하여 알부민의 변성을 최소화하고, 혈관내구획에서 존재하고 신독성으로부터 자유로운 약물전달 및 방사성의약품으로서 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 알부민에 아자이드(N3)기 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 수식된, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법으로 제조한 알부민 나노플랫폼을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알부민 나노플랫폼에 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(cyclooctyne)기를 포함하는 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알부민 나노플랫폼에 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(cyclooctyne)기를 포함하는 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 의하여 제조된 전달물질 결합된 알부민 나노플랫폼을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 알부민에 아자이드(N3)기 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 수식된, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 (a) 알부민을 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)에 녹이고, 아자이드(N3)-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS를 DMSO에 녹이는 단계; 및 (b) 상기 단계에서 제조한 알부민 용액과 아자이드(N3)-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS 용액을 혼합하여, 20 내지 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응하는 단계를 포함하는, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 의하여 제조된 알부민 나노플랫폼을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (i) 알부민 단량체의 N-말단 아민기에 아자이드(N3)가 결합된 용액 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 결합된 용액을 준비하는 단계; 및 (ii) 상기 단계 (i)에서 제조된 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질 또는 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (i)에서 알부민 단량체에 아자이드(N3)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (ii)에서는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키며, 상기 단계 (i)에서 알부민 단량체에 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (ii)에서는 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키는 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 전달물질이 방사성 동위원소, 엽산(folate) 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid)인, 전달물질 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는 상기 방법에 의해 제조된 알부민 나노플랫폼에 도입된 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 반응기 개수가 1 내지 20개인 것인, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 단계 (i)의 용액을 pH 6.8 내지 pH 7.6 및 20 내지 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 준비하는, 알부민 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 4-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00001
), 3-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00002
), 2-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00003
), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(
Figure pat00004
), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(
Figure pat00005
), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(
Figure pat00006
), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(
Figure pat00007
), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)기(
Figure pat00008
) 또는 Biarylazacyclooctynone(BARAC)(
Figure pat00009
)인, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 의하여 제조된 전달물질 결합된 알부민 나노플랫폼을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 알부민 단량체가 포함된 용액(제1-1용액); (b) 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액(제1-2용액); 및 (c) 아자이드기(N3)가 결합된 전달물질 또는 사이클로옥테인기(Cyclooctyne)가 결합된 전달물질이 포함된 용액(제2용액)을 포함하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트로서, 상기 키트는 제1-1용액과 제1-2용액을 반응시킨 용액에 제2용액을 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 것을 특징으로 하며, 상기 제1-2용액이 아자이드(N3)가 포함된 용액일 경우 제2용액은 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액이며, 상기 제1-2용액이 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액일 경우 제2용액은 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 전달물질이 방사성 동위원소, 엽산(folate) 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid)인, 전달물질 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는 상기 방사성 동위원소가 3H, 11C, 18F 14Cl, 32P, 35S, 36Cl, 45Ca, 51Cr, 57Co, 58Co, 59F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Mo, 99mTc, 111In, 131I, 125I, 124I, 123I, 186Re, 188Re 및 177Lu로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 방사성 동위원소가 킬레이트제에 결합된 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구쳬예는 상기 킬레이트제가 NOTA, DOTA, DFO, DTPA, N2S2, p-SCN-Bn-NOTA, NODAGA, p-SCN-Bn-DOTA, TETA, p-SCN-Bn-DTPA, p-SCN-Bn-DFO 또는 HYNIC인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가, 4-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00010
), 3-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00011
), 2-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00012
), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(
Figure pat00013
), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(
Figure pat00014
), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(
Figure pat00015
), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(
Figure pat00016
), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)기(
Figure pat00017
) 또는 biarylazacyclooctynone(BARAC)(
Figure pat00018
)인, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 아자이드(N3)가 결합된 알부민 단량체 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 결합된 알부민 단량체가 포함된 용액(제1용액); (b) 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질이 포함된 용액(제2용액)을 포함하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트로서, 상기 키트는 제1용액과 제2용액을 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 것을 특징으로 하며, 상기 제1용액이 아자이드(N3)가 포함된 용액일 경우 제2용액은 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액이며, 상기 제1용액이 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액일 경우 제2용액은 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 전달물질이 방사성 동위원소, 엽산(folate) 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid)인, 전달물질 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 알부민에 아자이드(N3)기 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 수식된, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 일 양태는 (a) 알부민을 인산완충용액(PBS)에 녹이고, 아자이드(N3)-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS를 DMSO에 녹이는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 알부민 용액과 N3-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS 용액을 혼합하여, 20 내지 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응하는 단계를 포함하는, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 대한 것이다.
본 발명에 사용되는 용어 "알부민"은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 혈액 중에 매우 많이 존재하며, 간에서 생성되는 단백질을 의미한다. 상기 알부민은 자연상태에 존재하는 단순 단백질 중 가장 분자량이 적다. 혈액 중의 혈청알부민은 혈장부피를 유지하고 회복시키는 기능이 있어서 과다 출혈에 따른 쇼크를 방지하고 수술 및 화상치료 등에 사용된다. 또한 헤모글로빈과 유사한 산소전달 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 상기 알부민은 제제화가 가능한 모든 알부민을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간 혈장으로부터 유래한 것이거나, 유전자 조작에 의해 제조된 재조합 인간혈청알부민일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 알부민에 대한 유전적 정보는 NCBI GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
본 발명에서 알부민의 표면에는 노출된 아미노기(-NH2)가 15 내지 20개일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 생체적합성을 갖는 알부민을 기반으로 생체 내로 약물 전달하거나 진단 또는 치료에 이용할 수 있는 나노플랫폼을 제조하고자, 대표적으로 인혈청알부민(human serum albumin, HSA)을 사용하였으며, 인혈청알부민의 표면에 클릭화학(Click chemistry)의 한쪽 기능기인 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 또는 아자이드(N3)기를 HSA의 변성을 최소화한 반응 조건으로 도입하였다.
본 발명에서 아자이드(azide, N3)기란 질소 3개에 의해서 이루어진 반응기로, 높은 반응성을 가지며, 특히 Cu-Free click chemistry의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자공여체(electron donor) 역할을 하여 triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기란 ring strain을 받고 있는 삼중결합을 포함하는 8원 지방족 고리를 말하며, 특히 Cu-Free click chemistry의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자수용체(electron acceptor) 역할을 하여, triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져있다. 사이클로옥테인(Cyclooctyne)의 구조적 특징, 즉 ring strain을 받고 있는 삼중결합 구조로 인하여 Cu(I) 촉매 없이도 click chemistry가 가능하게 한다. 또한, 본 발명에서 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기는 4-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00019
), 3-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00020
), 2-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00021
), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(
Figure pat00022
), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(
Figure pat00023
), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(
Figure pat00024
), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(
Figure pat00025
), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)기(
Figure pat00026
) 또는 biarylazacyclooctynone(BARAC)(
Figure pat00027
)일 수 있다.
본 발명에서 상기 인산완충용액은 pH 6.8 내지 pH 7.6일 수 있으며 특히 pH 7.0 내지 pH 7.4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 아자이드(N3)-NHS 용액 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS 용액을 제조하는데 필요한 용매인 DMSO의 양은 전체 반응용액의 2%(v/v)이하일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 N3-NHS 용액 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS 용액을 제조할 경우에는 DMSO의 양이 총 반응 부피에 대해 최소량이 들어가도록 하기 위하여, 전체 반응 용액 부피의 2 %(v/v) 이하로 포함되도록 준비하여 사용하였다.
본 발명에서 상기 (b) 단계에서 알부민과 아자이드(N3)-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS의 혼합 몰비율이 1:1 내지 1:25인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 의해 제조된 알부민 나노플랫폼에 도입된 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 반응기 개수는 1 내지 20개인 것일 수 있다.
본 발명의 알부민 나노플랫폼은 반응기 개수가 2개 이상, 특히 20개 가량일 수 있기 때문에, 본 발명의 알부민 나노플랫폼에 존재하는 다수의 반응기에 다양한 결합 물질을 결합시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 클릭반응에 활용할 수 있으며 알부민 고유의 성질을 잃지 않는 최적의 나노플랫폼을 제조하기 위하여 알부민 표면의 클릭반응 기능기의 개수를 조절하고자 하였다. ADIBO-NHS 또는 N3-NHS와 HSA의 반응비에 따라 HSA에 도입된 기능기의 개수를 정량하였다. 구체적으로, HSA-ADIBO 또는 HSA-N3 분자량을 MALDI-TOF 질량분석기로 측정하여 HSA에 도입된 ADIBO 또는 아자이드의 개수를 정량하였다. HSA 표면에 노출된 아미노기(-NH2)의 개수는 대략 15 내지 20개로 알려져 있으며, 반응에 투여된 ADIBO-NHS/HSA의 반응비 조절을 통하여 각각 1개, 4개, 8개, 14개 정도의 ADIBO가 도입됨을 확인할 수 있었으며, N3-NHS/HSA의 반응비 조절을 통하여 각각 1개, 2개, 6개, 13개 정도의 아자이드가 도입됨을 확인할 수 있었다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 따른 방법에 의하여 제조된 알부민 나노플랫폼을 제공한다. 특히, 본 발명에서 알부민 나노플랫폼은 알부민에 결합된 기능기가 아자이드(N3)기 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기일 수 있다.
본 발명에서 알부민, 아자이드(N3)기, 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기 등은 상기 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에서 (b) 단계에서 알부민 용액과 N3-NHS 용액을 혼합시켜 제조한 알부민 나노플랫폼의 경우, 알부민에 결합된 기능기가 아자이드(N3)기일 수 있으며, (b) 단계에서 알부민 용액과 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS 용액을 혼합시켜 제조한 알부민 나노플랫폼의 경우, 알부민에 결합된 기능기가 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 인간혈청알부민 용액과 ADIBO-NHS 용액 또는 N3-NHS 용액을 혼합시키고, 37℃에서 30분 동안 반응시켜, HSA-ADIBO와 HSA-N3를 제조하였다.
본 발명의 알부민 나노플랫폼은 이를 구성하고 있는 알부민 표면에 사이클로옥테인기(Cyclooctyne)기나 아자이드(N3)기의 기능기가 부착되어 있을 수 있으며, 해당 기능기들이 부착되어 있는 수는 알부민과 Cyclooctyne-NHS 또는 N3-NHS를 혼합, 반응시키는 반응비율에 따라 결정될 수 있다. 특히, 본 발명에서 알부민 나노플랫폼에 도입된 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인기(Cyclooctyne) 반응기 개수는 1 내지 20개일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은
(i) 알부민 단량체의 N-말단 아민기에 아자이드(N3)가 결합된 용액 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 결합된 용액을 준비하는 단계; 및
(ii) 상기 단계 (i)에서 제조된 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질 또는 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (i)에서 알부민 단량체에 아자이드(N3)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (ii)에서는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키며, 상기 단계 (i)에서 알부민 단량체에 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (ii)에서는 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키는 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 반응기로 사용되는 아자이드(N3)기는 전자공여체(electron donor)이고, 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기는 전자수용체(electron acceptor)이므로, 상기 단계 (i)에서 알부민 단량체에 아자이드(N3)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (ii)에서는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키며, 상기 단계 (i)에서 알부민 단량체에 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (ii)에서는 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키는 것이 효과적이다.
본 발명에서 알부민, 아자이드(N3)기, 사이클로옥테인기(Cyclooctyne)기 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 방법에 의해 제조된 알부민 나노플랫폼에 도입된 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 반응기 개수가 1 내지 20일 수 있다.
본 발명에서 상기 단계 (i)의 용액은 pH 6.8 내지 pH 7.6 및 20 내지 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 준비할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (i) 단계의 알부민의 N-말단 아민기에 아자이드(N3)가 결합된 용액 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 결합된 용액은 (a) 알부민을 인산완충용액(PBS)에 녹이고, 아자이드(N3)-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS를 DMSO에 녹이는 단계 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 알부민 용액과 N3-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS 용액을 혼합하여, 20 내지 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응하는 단계에 의하여 제조되는 것인 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 구체예는 상기 (ii) 단계에서 제조된 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼을 분리하는 단계를 포함하는, 전달물질 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 알부민 나노플랫폼은 반응기 개수가 2개 이상, 특히 20개 가량일 수 있기 때문에, 본 발명의 알부민 나노플랫폼에 존재하는 다수의 반응기에 다양한 결합 물질을 결합시킬 수 있다. 본 발명의 알부민 나노플랫폼에 결합될 수 있는 결합 물질은 단일 물질일 수 있으며, 다양한 결합 물질의 조합일 수 있다.
한편, 알부민 나노플랫폼에 결합된 전달물질이 2개 이상 물질의 조합일 경우에는 2개 이상의 물질의 조합을 동시에 알부민 나노플랫폼에 결합시키거나, 각 물질을 순차적으로 결합시킬 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 전달물질은 알부민 나노플랫폼에 결합하여 생체 내에 전달되는 물질을 의미하며, 이는 방사성 동위원소, 형광물질, 표적 분자, 활성물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 전달물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 표적 분자, 활성물질 각각의 단일 물질이거나 방사성 동위원소와 형광물질; 방사성 동위원소와 표적 분자; 방사성 동위원소와 활성물질; 형광물질과 표적 분자; 형광물질과 활성물질; 표적 분자와 활성물질; 방사성 동위원소, 형광물질과 표적 분자; 방사성 동위원소, 표적 분자와 활성물질; 방사성 동위원소, 형광물질과 활성물질; 형광물질, 표적 분자와 활성물질 또는 방사성 동위원소, 형광물질, 표적분자와 활성물질로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "동위원소"는 원자번호가 같지만 원자량이 다른 원소를 말하고, 동위원소 중 방사능이 있는 것을 "방사성 동위원소"라고 하며, 감마선이나 다른 아원자 입자를 방출하여 방사성 감쇠를 하는 특성을 이용하여 일반적으로 질병을 진단하는데 중요한 표지자로 사용되는 것이다. 본 발명에서 표지자로 사용할 수 있는 방사성 동위원소는 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용가능하며, 3H, 11C, 18F 14Cl, 32P, 35S, 36Cl, 45Ca, 51Cr, 57Co, 58Co, 59F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Mo, 99mTc, 111In, 131I, 125I, 124I, 123I, 186Re, 188Re 및 177Lu일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방사성 동위원소는 진단용 방사성 동위원소인 11C, 18F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 99mTc, 111In 및 123I 등일 수 있으며, 치료용 방사성 동위원소인 90Y, 177Lu 및 188Re 등일 수 있고, 특히, 64Cu 또는 177Lu일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 방사성 동위원소를 알부민에 연결하는 역할을 하는 킬레이트제를 사용할 수 있으며, 상기 킬레이트제는 예를 들어, NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DFO(3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), N2S2(diaminedithiol), p-SCN-Bn-NOTA(2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid) p-SCN-Bn-DOTA(2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), p-SCN-Bn-DTPA(2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid), p-SCN-Bn-DFO(1-(4-Isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), 또는 HYNIC(hydrazinonicotinic acid)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "형광물질"은 특정 파장에 대하여 특정 가시광선의 파장을 발하는 물질을 의미하며, 본 발명에서는 알부민 나노플랫폼에 결합하여 나노플랫폼의 위치를 확인하는데 사용될 수 있는 형광물질을 모두 포함한다. 구체적으로 본 발명에서 표지자로 사용할 수 있는 형광물질은 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용 가능하며, 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA) 등을 포함하는 로다민계; 플루오세인, FITC(fluorescein isothiocyanate) 및 FAM(fluorecein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein); 보디피계(bodipy, boron-dipyrromethene); 알렉사플로어계(alexa fluor); 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광물질을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "표적 분자"는 생체 내 특정 환경을 표적하는 분자를 의미하며, 구체적으로 생체 내 특정 환경에 존재하는 물질을 표적하여 본 발명의 알부민 나노플랫폼의 해당하는 특정 환경으로 유도하는 분자를 의미한다. 본 발명의 표적분자는 본 발명의 알부민 나노플랫폼을 특정 환경으로 유도하거나, 특정 환경의 유무, 특정 환경의 위치, 특정 환경의 정도 등을 확인할 수 있다. 본 발명에서 표적 분자가 표적하는 생체 내 특정 환경은 조직 특이적 특정 환경이거나 질환 특이적 특정 환경일 수 있다. 즉, 표적 분자는 조직 특이적으로 존재하는 물질을 표적하거나, 질환 특이적으로 존재하는 물질을 표적하는 것일 수 있다. 조직 특이적으로 존재하는 물질이란 조직 특이적으로 존재하는 단백질, RNA, 축적되거나 생성되는 화합물 등일 수 있고, 질환 특이적으로 존재하는 물질이란 질환 종류에 따라 존재하는 단백질, RNA, 축적되거나 생성되는 화합물 등일 수 있다. 특히, 본 발명에서 표적 분자는 암조직에 다수 존재하는 엽산 수용체를 표적하는 엽산(folate) 또는 이의 유도체, 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid) 또는 이의 유도체 일 수 있다.
본 발명의 "엽산"은 비타민의 일종으로, 비타민 B9 또는 비타민 M 이라고도 불린다. 엽산은 엽산 수용체와 특이적 결합을 이룬다. "엽산 수용체"는 종양 관련된 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 단백질로서, 결합된 엽산 또는 엽산 결합된 물질이 수용체-매개 엔도사이토시스를 통하여 섭취되도록 한다.
본 발명의 “RGD”는 3개의 아미노산, 즉 아르기닌(L-arginine), 글라이신(glycine), 및 아스파르트산(L-aspartic acid)으로 구성된 트리펩티드로서 파이브로넥틴(fibronectin)의 세포부착부위에서 최초로 발견되었다. 이들은 종양 혈관의 내피세포층에 주로 발현되고 있는 인테그린 수용체(integrin receptor)에 강한 친화력을 가지고 있기 때문에 약물 표적형 치료와 간단한 시약과 같은 연구에 보편적 수단으로 많이 쓰이고 있다.
본 발명에서 전달물질을 알부민에 결합시키기 위하여 CONH, NHCO, NHCONH, NHCSNH, OCONH, NHOCO, S, O, CO, (C=O)O, O(C=O), OCH2CH2, CH2CH2O, NH(CNH), (CNH)NH, NN 및 NH으로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 또는 그 이상으로 이루어진 링커(linker)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 조직이란 조직 특이적 성질을 갖는 조직일 수 있으며, 뇌, 안구, 신경, 뼈, 폐, 간, 위, 심장, 혈관, 근육, 대장, 소장, 십이지장, 식도, 자궁, 유방, 신장, 췌장, 요도, 피부, 난소, 호흡기관, 청각기관 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 질환이란 질환 관련 생체 내 부위가 질환 특이적 성질을 가지는 질환일 수 있으며, 암, 죽상동맥경화 등을 포함하는 심혈관 질환, 신생혈관형성 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 암은 원발암 또는 전이암일수 있다.
본 발명의 용어, "활성물질"이란 천연물, 비타민, 활성 약제, 생물제, 화합물, 아미노산, 단백질, 펩티드, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 이들의 유사체, 동족체 및 유도체일 수 있으며, 특히 항비만 약물, 중추신경계 자극제, 카로티노이드, 코르티코스테로이드, 엘라스타제저해제, 항진균제, 종양 치료제, 항구토제, 진통제, 심혈관제, 항염증제, 구충제, 항부정맥제, 항생제, 항응고제, 항우울제, 항당뇨제, 항간질제, 항히스타민제, 항고혈압제, 항무스카린제, 항미코박테리아제, 면역억제제, 항갑상선제, 항바이러스제, 항불안제, 진정제, 수렴제, 알파-아드레날린성 수용체 차단제, 베타-아드레날린성 수용체 차단제, 혈액 제제, 심장수축촉진제, 조영매, 기침 억제제, 진단 시약, 진단 영상화제, 이뇨제, 도파민작동제, 지혈제, 면역반응제, 지질조절제, 근육이완제, 부교감신경흥분제, 항알러지제, 식욕억제제, 교감신경흥분제, 갑상샘제, 혈관확장제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 알부민 나노플랫폼에 대표적인 방사성 동위원소인 Cu-64와 암조직에 다수 존재하는 엽산 수용체를 표적하는 엽산(folate)을 전달물질로 결합시킨 알부민 나노플랫폼을 제조하였다. 구체적으로, Cu-64를 이용하여 NOTA-N3에 방사성동위원소 표지한 후, 이를 HSA-ADIBO 또는 HSA-N3, 및 HSA-folate에 첨가하여 반응시킨 결과, Cu-64-NOTA-N3가 결합된 HSA-Folate 유도체를 제조하였다.
본 발명의 다른 구체적 실시예에서는 본 발명의 알부민 나노플랫폼에 대표적인 방사성 동위원소인 Cu-64와 암조직에서 발현되는 인테그린 αvβ3을 표적하는 cyclic RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid)를 전달물질로 결합시킨 나노플랫폼을 제조하였다. 구체적으로, Cu-64를 이용하여 NOTA-N3에 방사성동위원소 표지한 후, 이를 HSA-ADIBO 또는 HSA-N3, 및 HSA-RGD에 첨가하여 반응시킨 결과, Cu-64-NOTA-N3가 결합된 HSA-RGD 유도체를 제조하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼을 제조하는 방법에 의하여 제조된 전달물질 결합된 알부민 나노플랫폼을 제공한다.
본 발명에서 알부민, 전달물질 등은 상기 설명한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은
(a) 알부민 단량체가 포함된 용액(제1-1용액);
(b) 아자이드(N3)을 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액(제1-2용액); 및
(c) 아자이드기(N3)가 결합된 전달물질 또는 사이클로옥테인기(Cyclooctyne)가 결합된 전달물질이 포함된 용액(제2용액)을 포함하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트로서, 상기 키트는 제1-1용액과 제1-2용액을 반응시킨 용액에 제2용액을 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 것을 특징으로 하며, 상기 제1-2용액이 아자이드(N3)가 포함된 용액일 경우 제2용액은 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액이며, 상기 제1-2용액이 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액일 경우 제2용액은 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명에서 알부민, 아자이드(N3)기, 사이클로옥테인기(Cyclooctyne)기, 전달물질 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에 있어서 상기 방사성 동위원소는 킬레이트제에 결합되어 있을 수 있으며, 상기 킬레이트제는 NOTA, DOTA, DFO, DTPA, N2S2, p-SCN-Bn-NOTA, NODAGA, p-SCN-Bn-DOTA, TETA, p-SCN-Bn-DTPA, p-SCN-Bn-DFO 또는 HYNIC일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은
(a) 아자이드(N3)가 결합된 알부민 단량체 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 결합된 알부민 단량체가 포함된 용액(제1용액);
(b) 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질이 포함된 용액(제2용액)을 포함하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트로서, 상기 키트는 제1용액과 제2용액을 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 것을 특징으로 하며, 상기 제1용액이 아자이드(N3)가 포함된 용액일 경우 제2용액은 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액이며, 상기 제1용액이 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액일 경우 제2용액은 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트를 제공한다.
본 발명에서 알부민, 아자이드(N3)기, 사이클로옥테인기(Cyclooctyne)기, 전달물질 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 알부민을 기반의 플랫폼은 혈관내구획에서 존재할 뿐만 아니라 그 크기로 인하여 신장에서의 결합 및 재흡수가 되지 않기 때문에 신장의 섭취를 피할 수 있어 이러한 신독성으로부터 자유로운 약물전달 및 방사성의약품으로서의 넓은 응용이 가능하다. 또한 본 발명은 변형을 최소화하여 오랜 시간 혈관내구획에 존재함으로써 표적 조직 및 장기로의 효과적인 약물 전달이 가능하여 표적 조직으로의 높은 섭취를 용이케 하는 플랫폼 기술이다.
도 1은 알부민 나노플랫폼의 제조 과정을 개시하고 있는 것으로, 구체적으로 알부민 표면에 존재하는 아미노기에 ADIBO-NHS나 N3-NHS를 반응시켜, HSA-ADIBO 또는 HSA-N3를 제조하는 방법을 개시하는 모식도이다.
도 2는 알부민과 ADIBO-NHS의 반응비에 따른 HSA-ADIBO의 분자량의 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight) 질량분석기로 측정한 결과이다.
도 3은 알부민과 ADIBO-NHS의 반응비를 달리한 제1유형 내지 제4유형의 반응에 있어서 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량 증가에 따른 피크의 움직임을 측정한 결과이다.
도 4는 알부민과 N3-NHS의 반응비에 따른 HSA-N3의 분자량을 MALDI-TOF 질량분석기로 측정한 결과이다.
도 5는 HSA-ADIBO에 방사성 동위원소(Ga-68, Cu-64 및 Lu-177)로 표지한 NOTA-N3를 결합한 동위원소 표지 알부민 나노플랫폼을 정상 동물(마우스)의 꼬리정맥을 통해 투여한 후 시간에 따른 생체 내 방사능을 측정한 영상 화면이다.
도 6는 HSA-N3에 방사성 동위원소(Ga-68, Cu-64 및 Lu-177)로 표지한 NOTA-ADIBO를 결합한 동위원소 표지 알부민 나노플랫폼을 정상 동물(마우스)의 꼬리정맥을 통해 투여한 후 시간에 따른 생체 내 방사능을 측정한 영상 화면이다.
도 7은 Folate가 결합되지 않은 FNR648-Albumin의 경우, Folate가 결합된 FNR648-Albumin-Folate를 이용한 경우, FNR648-Albumin-Folate를 이용하면서 Blocking한 경우 KB 세포주의 표적영상 화면이다.
도 8은 액와 종양 마우스 모델에 Cu-64 방사성 동위원소로 표지된 HSA-Folate를 꼬리정맥을 통해 투여한 후 시간에 따른 생체 내 방사능을 측정한 영상 화면이다.
도 9는 복강 암 전이 마우스 모델에 Cu-64 방사성 동위원소로 표지된 HSA-folate를 꼬리정맥을 통해 투여한 후 시간에 따른 생체 내 방사능을 측정한 영상화면이다.
도 10은 In-vivo에서 Folate가 결합되지 않은 Cu-64-Albumin의 경우, Folate가 결합된 Cu-64-Albumin-Folate을 이용한 경우, Cu-64-Albumin-Folate를 이용하면서 Blocking한 경우의 동물실험의 표적영상 화면이다.
도 11a는 반응 A와 반응 B에 있어서 cRGDyK-알부민의 세포막 및 세포 내부에서의 결합정도를 공초점 레이저로 측정한 영상 화면이다.
도 11b는 반응 A와 반응 B에 있어서 알부민의 세포막 및 세포 내부에서의 결합정도를 공초점 레이저로 측정한 영상 화면이다.
도 12a는 반응 A에서 Cu-64가 표지된 cRGDyK-알부민을 6주령 마우스 종양모델의 꼬리정맥을 투여한 후 시간에 따른 PET를 측정한 영상 화면이다.
도 12b는 반응 B에서 Cu-64가 표지된 cRGDyK-알부민을 6주령 마우스 종양모델의 꼬리정맥을 투여한 후 시간에 따른 PET를 측정한 영상 화면이다.
도 13은 반응 A와 반응 B에서의 시간에 따른 %ID/g 값의 그래프이다.
도 14는 본 발명의 알부민 나노플랫폼의 개념도로, 특히 본 발명 알부민 나노플랫폼의 구조도와 결합 가능한 성분들의 예시들과 장점에 대해 개시한 개념도이다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위해 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 알부민 나노플랫폼의 제조
본 발명자들은 생체적합성을 갖는 알부민을 기반으로 생체 내로 약물 전달하거나 진단 또는 치료에 이용할 수 있는 나노플랫폼을 제조하고자 하였다. 이를 위하여, 대표적으로 인혈청알부민(human serum albumin, HSA)을 사용하였으며, 인혈청알부민의 표면에 클릭화학(Click chemistry)의 한쪽 기능기인 Azadibenzocyclooctyne(ADIBO) 또는 아자이드(N3)기를 HSA의 변성을 최소화한 반응 조건으로 도입하였다.
구체적으로 하기와 같은 과정을 통하여 알부민 나노플랫폼을 제조하였다.
1-1. 알부민 준비 및 ADIBO 기능기 도입
(1) 알부민 용액 준비 및 ADIBO-PEG4-NHS를 녹인 DMSO 용액 준비
먼저, 인혈청알부민(HSA)는 녹십자의료재단에서 20% 액상 형태로 판매되는 전문의약품인 녹십자-알부민(주) 인간혈청알부민 20% 100 mL을 구입하여 이용하였으며, PBS(pH 7.4)에 5 mg/ 50 ㎕ 농도로 녹여 알부민 용액을 준비하였다.
아울러 ADIBO-NHS는 퓨처캠(FC-6123)에서 구입하여 사용하였으며, DMSO에 2 mg/ 50 ㎕ 농도로 녹여 ADIBO-NHS 용액을 준비하였다.
다만, 상기 ADIBO-NHS 용액을 제조할 경우에는 DMSO의 양이 총 반응 부피에 대해 최소량이 들어가도록 하기 위하여, 전체 반응 용액 부피의 2 %(v/v) 이하로 포함되도록 준비하였다.
다음으로, Ependorf(EP) 튜브에 5 mg/ 50 ㎕의 HSA 용액을 넣고, PBS(pH 7.4 이상)를 첨가하여 500 ㎕으로 만들었다(A 시료). 또한, 별도의 EP 튜브에 DMSO에 녹인 2 mg/ 50 ㎕의 ADIBO-NHS 용액을 반응 비율(molar ratio)에 맞게 넣고, 상기와 같이 PBS를 이용하여 500 ㎕로 만들었다(B 시료). B 시료를 제조할 때, 용액을 EP 튜브에 넣을 때 튜브의 벽면을 이용하여 흘려 넣고, 바로 vortexing하여 빠르게 분산시켜준다. 상기 제조한 A 시료와 B 시료를 혼합시키고, Tip type의 항온기를 이용하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다.
(2) 알부민 표면 기능기 개수 조절
클릭반응에 활용할 수 있으며 알부민 고유의 성질을 잃지 않는 최적의 나노플랫폼을 제조하기 위하여 알부민 표면의 클릭반응 기능기의 개수를 조절하고자 하였다.
상기 목적에 따라, ADIBO-NHS와 HSA의 반응비에 따라 HSA에 도입된 ADIBO 기능기의 개수를 정량하였다. 구체적으로, HSA-ADIBO 분자량을 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight) 질량분석기로 측정하여 HSA에 도입된 ADIBO의 개수를 정량하였다. 이에 대한 결과는 하기 표 1과 같다(도 2).
Mass(peak)
 Mass 값-HSA mass
 ADIBO 도입 개수
 반응몰비
(ADIBO-NHS/HSA)
 %conjugation
HSA
 66692
반응1
(RXN#1)
 66982
 290
 1
 1.12
 89.28571
반응2
(RXN#2)
 67894
 1202
 4.14483
 5.56
 74.54676
반응3
(RXN#3)
 69059
 2367
 8.16207
 11.24
 72.65302
반응4
(RXN#4)
 70748
 4056
 13.9862
 22.47
 62.24388
HSA 표면에 노출된 아미노기(-NH2)의 개수는 대략 15 내지 20개로 알려져 있으며, 반응에 투여된 ADIBO-NHS/HSA의 반응비 조절을 통하여 각각 1개, 4개, 8개, 14개 정도의 ADIBO가 도입됨을 확인할 수 있었다.
또한 물성평가를 위해 ADIBO-NHS/Albumin 의 반응 비율을 조정하여 4가지 유형의 반응을 새롭게 수행하여 각각의 관능화도(Degree Of Funcionalization; DOF), 알부민 나노플랫폼의 크기(size) 및 제타포텐셜(zeta potential)을 확인하였다. 구체적으로, MALDI-TOF를 이용하여 평균분자량을 통한 관능화도을 확인하였고, 동적 레이저 산란(Dynamic Laser Scattering; DLS) 장비를 통하여 알부민 나노플랫폼의 크기(size) 와 제타포텐셜(zeta potential)을 확인하였다.
4가지 유형의 반응에 대한 MALDI-TOF 결과를 확인하였고, 분자량이 증가함에 따라 피크(Peak) 가 움직이는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 반응 비율에 따른 DOF는 하기 표 2와 같다.
Mw(분자량)
 Mw-AL
(분자량-알부민분자량)
 DOF(관능화도)
Albumin
 66419.5
 0
 0
제1유형
 67470.9
 1051.5
 2.347098
제2유형
 68132.1
 1712.7
 3.822991
제3유형
 69324.2
 2904.8
 6.483929
제4유형
 71860.8
 5441.4
 12.14598
[ ADIBO - Albumin의 분자량 측정과 제타전위 측정]
동적 레이저 산란장치를 이용하여, 아무런 처리를 하지 않은 알부민을 기준으로 하여 DOF에 따른 zeta potential의 변화를 확인하였다. 이에 대한 결과는 하기 표 3과 같다.
Albumin
 DOF
 Zeta Difference Value
 크기
제1유형
 2.347098
 -0.6
 변화없음
제2유형
 3.822991
 3.7
 변화없음
제3유형
 6.483929
 5.5
 변화없음
제4유형
 12.14598
 2.9
 응집(50nm 초과)
DOF에 따라 표면 전하가 바뀌는 것을 확인하였고, 이 변화의 크기는 DOF 값에 비례하여 나타남을 확인할 수 있었다. 이때, 제4유형 반응의 경우 그 크기가 50nm를 초과하는 것으로 관찰되었는데 이는 소수성 ADIBO기의 응집(aggregation)에 의한 것으로서, 이로부터 제4유형 반응의 표면전하는 DOF를 반영하지 못한 것으로 파악된다.
1-2. 알부민 준비 및 아자이드 기능기 도입
(1) 알부민 용액 준비 및 N3-NHS를 녹인 DMSO 용액 준비
먼저, 인혈청알부민(HSA)는 녹십자의료재단에서 20% 액상 형태로 판매되는 시약(상동)을 구입하여 이용하였으며, PBS에 5 mg/ 50 ㎕ 농도로 녹여 알부민 용액을 준비하였다.
아울러 N3-NHS는 퓨처켐(FC-6048)에서 구입하여 사용하였으며, DMSO에 2 mg/ 50 ㎕ 농도로 녹여 ADIBO-NHS 용액을 준비하였다.
다만, 상기 N3-NHS 용액을 제조할 경우에는 DMSO의 양이 총 반응 부피에 대해 최소량이 들어가도록 하기 위하여, 전체 반응 용액 부피의 2 %(v/v) 이하로 포함되도록 준비하였다.
다음으로, Ependorf(EP) 튜브에 5 mg/ 50 ㎕의 HSA 용액을 넣고, PBS(pH 7.4 이상)를 첨가하여 500 ㎕으로 만들었다(A 시료). 또한, 별도의 EP 튜브에 DMSO에 녹인 2 mg/ 50 ㎕의 N3-NHS 용액을 반응 비율(molar ratio)에 맞게 넣고, 상기와 같이 PBS를 이용하여 500 ㎕로 만들었다(C 시료). C 시료를 제조할 때, 용액을 EP 튜브에 넣을 때 튜브의 벽면을 이용하여 흘려 넣고, 바로 vortexing하여 빠르게 분산시켜준다. 상기 제조한 A 시료와 C 시료를 혼합시키고, Tip type의 항온기를 이용하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다.
(2) 알부민 표면 기능기 개수 조절
클릭반응에 활용할 수 있으며 알부민 고유의 성질을 잃지 않는 최적의 나노플랫폼을 제조하기 위하여 알부민 표면의 클릭반응 기능기의 개수를 조절하고자 하였다.
상기 목적에 따라, N3-NHS와 HSA의 반응비에 따라 HSA에 도입된 아자이드 기능기의 개수를 정량하였다. 구체적으로, HSA-N3 분자량을 MALDI-TOF 질량분석기로 측정하여 HSA에 도입된 아자이드의 개수를 정량하였다. 이에 대한 결과는 하기 표 4와 같다(도 4).
Mass(peak)
 Mass 값-HSA mass
 아자이드 도입 개수
 반응몰비
(N3-NHS/HSA)
 %conjugation
HSA
 66742
반응1
(RXN#1)
 66885
 143
 1
 1.12
 89.29
반응2
(RXN#2)
 67149
 407
 2.85
 5.56
 51.19
반응3
(RXN#3)
 67607
 865
 6.05
 11.24
 53.82
반응4
(RXN#4)
 68569
 1827
 12.78
 22.47
 56.86
HSA 표면에 노출된 아미노기(-NH2)의 개수는 대략 15 내지 20개로 알려져 있으며, 반응에 투여된 N3-NHS/HSA의 반응비 조절을 통하여 각각 1개, 2개, 6개, 13개 정도의 아자이드가 도입됨을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 알부민 나노플랫폼을 기반으로 한 질환표적물질 및 활성물질 결합
2-1. 알부민 표면의 ADIBO - 기능기를 활용한 Folate receptor 표적 물질 결합
상기 실시예 1에서 제조한 알부민 플랫폼의 ADIBO-기능기를 활용하여 전달물질을 결합시킨 알부민 나노플랫폼을 제조하고자 하였다. 이에 본 실험에서는 전달물질로서 다양한 암종 조직의 세포에서 과발현되는 것으로 알려진 엽산 수용체(folate receptor)를 표적하는 엽산(folate) 유도체를 결합하였다. 본 실험에서 결합한 엽산 유도체는 N-말단의 아미노산 side chain에 아자이드-기능기를 도입한 것으로 이를 이용하여 Folate receptor를 표적화하고자 하였다.
먼저, Folate-N3의 수용성이 낮아 반응성이 낮음을 개선하기 위하여 sodium tartrate dibasic dihydrate를 folate-N3 용액에 소량 첨가하였다. HSA-ADIBO 또는 HSA-N3 (40 nmol)를 PBS(300 ㎕)에 녹이고 folate-N3 또는 folate-ADIBO (10 nmol)를 섞고, 37℃에서 1시간 반응시켰다.
반응 후 PD-10(desalting) 컬럼을 통하여 folate-N3 결합된 HSA-ADIBO(HSA-Folate) 유도체만을 분리하여 수득하였다.
2-2. 알부민 표면의 ADIBO - 기능기를 활용한 RGD 표적 물질 결합
상기 실시예 1에서 제조한 알부민 플랫폼의 ADIBO-기능기를 활용하여 전달물질을 결합시킨 알부민 나노플랫폼을 제조하고자 하였다. 상기 실시예 2-1 과 같은 방법으로 진행하였으며, 이에 본 실험에서는 전달물질로서 인테그린 αvβ3 타겟능을 확인하기 위해 cyclic RGDyK 유도체를 결합하였다. 본 실험에서 결합한 cyclic RGDyK 유도체는 cyclic RGDyK에 ADIBO-기능기를 도입한 것으로 이를 이용하여 인테그린 αvβ3 타겟성능을 확인하고자 하였다.
HSA-ADIBO (40 nmol)를 PBS(300 ㎕)에 녹이고 cyclic RGDyK-N3 를 섞은 후, 4℃에서 24 시간 반응시켰다.
반응 후 PD-10(desalting) 컬럼을 통하여 cyclic RGDyK-N3 결합된 HSA-ADIBO(HSA-cyclic RGDyK) 유도체만을 분리하여 수득하였다.
이때 HSA-ADIBO 는 실시예 1-1의 표 1의 반응 2(RXN#2), 반응3(RXN#3), 반응4(RXN#4)를 사용하였으며, cyclic RGDyK-N3 결합반응의 상세 반응에 따른 분자량의 변화는 하기 표 5와 같다.
HSA-ADIBO
 Peak(Mw)
 (-each)
 DOF
Rxn#2
 67688.79
 1388.79
 2.933155
Rxn#3
 69365.25
 3065.25
 6.473874
Rxn#4
 71848.11
 5548.11
 11.71773
HSA-cRGDyK
 Peak(Mw)
 (-each)
 DOF
Rxn#2
 69109.8
 1421.01
 1.591829
Rxn#3
 73019.2
 3653.95
 4.09319
Rxn#4
 77700.41
 5852.3
 6.555803
실시예 3: 알부민 나노플랫폼을 기반으로 한 방사성동위원소 표지
3-1. ADIBO - 또는 N 3 - 킬레이트제를 이용한 방사성동위원소 표지
본 실시예에서는 Cu-64를 이용하여 NOTA-N3에 방사성동위원소 표지 후 이를 HSA-ADIBO, HSA-folate 및 HSA-RGD에 결합하였다.
구체적으로 Cu-64 방사성 동위원소를 이용한 표지를 용이하게 하기 위하여 HCl 용액에 존재하는 Cu-64 방사성동위원소 용액의 HCl을 기화하면서 고순도 질소(99.999%)를 불어주어 Cu-64 HCl 용액을 건조시켰다.
pH 5.3의 1 M sodium acetate를 200 ㎕ 이용하여 pH를 5로 맞춘 후, 여기에 10 nmol의 NOTA-N3 용액(10 ㎕ 미만)을 첨가하여 37℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이후, 0.1M citrate와 0.1M sodium carbonate 용액에서 박막크로마토그래피(thin layer chromatography)를 통해 방사성 동위원소가 모두 NOTA-N3에 착화됨을 확인하였다.
3-2. 알부민과 ADIBO - 또는 N 3 - 방사성동위원소의 결합
(1) HSA-ADIBO와 방사성동위원소 표지된 NOTA-N3
Cu-64가 표지된 NOTA-N3의 1 nmol (20 ㎕)을 취하여 HSA-Albumin, HSA-Folate 혹은 HSA-RGD 300 ㎕에 첨가하여 37℃에서 60분간 반응 후 PD-10(desalting) 컬럼을 통하여 Cu-64-NOTA-N3가 결합된 HSA-Folate 및 HSA-RGD 유도체를 분리하여 수득하였다.
(2) HSA-N3와 방사성동위원소 표지된 NOTA-ADIBO
HSA-ADIBO를 이용하여 folate-N3 및 방사성동위원소가 표지된 NOTA-N3를 결합하는 방법 외에 HSA-N3를 이용할 경우, folate-N3 대신 folate-ADIBO 및 RGD-ADIBO, 및 NOTA-ADIBO를 이용하여 같은 조건으로 다음과 같이 진행할 수 있다.
Cu-64가 표지된 NOTA-ADIBO의 1 nmol(20 ㎕)을 취하여 300 ㎕의 HSA-N3에 첨가하여 37℃에서 60 분간 반응한 후 PD-10(desalting) 컬럼을 통하여 Cu-64 NOTA-ADIBO가 결합된 HSA-Folate 및 HSA-RGD 유도체를 분리하여 수득하였다.
3-3. 알부민과 형광물질의 결합
HSA-ADIBO를 이용하여 FNR648-N3의 형광이 결합된 HSA-FNR648 복합체를 만들 수 있다. 이때 100 nmol/10 ㎕ 의 FNR648-N3를 준비하여, HSA-ADIBO 의 몰 수와 동량의 형광물질을 그에 해당하는 부피(㎕)만큼 취하여 HSA-ADIBO 용액에 첨가하여 37℃에서 60분간 반응한 후 PD-10(desalting) 컬럼을 통하여 FNR648-N3가 결합된 HSA-FNR648 복합체만을 분리하여 수득하였다. 동일한 방법으로 HSA-folate 유도체 및 HSA-RGD 유도체를 HSA-ADIBO 대신 사용하여, 형광과 표적물질이 동시에 결합된 복합체 FNR648-Albumin-folate 및 FNR648-Albumin-RGD를 만들 수 있었다.
실시예 4: 알부민 나노플랫폼의 정상동물 및 동물모델 영상 실험
4-1. 정상 동물에서의 알부민 영상
(1) 동위원소 표지 HSA-ADIBO 이용 정상동물 방사능 측정
ADIBO 기능기 개수가 각각 상이한 HSA-ADIBO (RXN1, RXN2, RXN3 및 RXN4)에 3가지 상이한 동위원소(Ga-68, Cu-64 또는 Lu-177)를 각각 표지한 동위원소 표지 HSA-ADIBO를 마우스(정상군)에 꼬리정맥으로 투여하였고 PET(positron emittion tomography)나 SPECT(single-photon emission computed tomography) 장비로 시간대 별 생체 내 분포 변화를 관찰하였다.
그 결과, 투여 직후에는 방사능이 혈액 풀에서 뚜렷하게 측정되는 것을 확인할 수 있으며, 알부민 표면에 결합된 ADIBO 기능기의 수가 많은 동위원소 표지 HSA-ADIBO일 수록 간조직뿐만 아니라, 림프절에서 강한 방사능 신호가 측정되는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
(2) 동위원소 표지 HSA-N3 이용 정상동물 방사능 측정
아자이드 기능기 개수가 각각 상이한 HSA-N3 (RXN1, RXN2, RXN3 및 RXN4)에 3가지 상이한 동위원소(Ga-68, Cu-64 또는 Lu-177)를 각각 표지한 동위원소 표지 HSA-N3를 마우스(정상군)에 꼬리정맥으로 투여하였고 PET나 SPECT 장비로 시간대 별 생체 내 분포 변화를 관찰하였다.
그 결과, 투여 직후에는 방사능이 혈액 풀에서 뚜렷하게 측정되는 것을 확인할 수 있으며, 알부민 표면에 결합된 아자이드 기능기의 수가 많은 동위원소 표지 HSA-N3일수록 간조직에서 강한 방사능 신호가 측정되는 것을 확인할 수 있었다(도 6)
4-2. 종양/신생혈관 타겟 알부민 영상
(1) Folate-알부민을 이용한 엽산수용체 발현 종양의 표적영상 평가
본 발명의 folate와 결합한 알부민이 종양조직에 표적화 되는지를 확인하기 위하여 종양 동물모델을 이용하여 확인하고자 하였다.
동물실험과 더불어 동물 모델을 위해 사용한 KB 세포에서의 표적능 확인을 위해 실시예 3으로 얻어진 FNR648-Albumin-Folate를 이용한 세포주의 특이적 표적영상을 확인하였다(도 7).
도 7에서 확인할 수 있듯이 Folate가 결합되지 않은 FNR648-Albumin의 경우, Folate가 결합된 FNR648-Albumin-Folate를 이용한 경우, FNR648-Albumin-Folate를 이용하면서 Blocking(folic acid를 처리한 FNR648-Albumin-Folate 보다 100배 더 처리)한 경우의 세포주 특이적 형광 영상을 확인할 수 있었다. 반면에 FNR648-Albumin-Folate를 처리한 세포주에서는 뚜렷한 표적영상을 확인할 수 있었다.
동물영상은 다음과 같이 얻을 수 있었다. 먼저, 액와 종양 마우스 모델의 꼬리정맥을 통해 Cu-64 동위원소로 표지 된 HSA-Folate를 투여하였고, 알부민의 위치를 PET나 SPECT 장비로 생체 내 방사능을 측정하였다. 구체적으로 Cu-64가 표지된 HSA-Folate를 투여한 후 시간(0h, 4h, 18h, 24h 및 48h)에 따라 생체 내 방사능을 측정하였다.
그 결과, 투여 직후부터 24시간까지 방사능이 혈액 풀에서 뚜렷하게 측정되는 것을 확인할 수 있으며, 4시간째부터 48시간까지 종양조직에서 강한 방사능 집적이 관찰되어, 본 발명에 따른 HSA-folate가 종양조직 특이적으로 집적하는 것을 확인하였다(도 8).
다음으로, 복강 암 전이 마우스 모델의 꼬리정맥을 통해 Cu-64 동위원소로 표지 된 HSA-folate를 투여하여, 알부민의 위치를 PET나 SPECT 장비로 생체 내 방사능을 측정하였다. 구체적으로 Cu-64 표지 HSA-Folate를 투여한 후 시간(0h, 4h, 24h 및 48h)에 따라 생체 내 방사능을 측정하였다.
그 결과, 투여 직후부터 24시간까지 방사능이 혈액 풀에서 뚜렷하게 측정되는 것을 확인할 수 있으며, 4시간째부터 48시간까지 복강 내에 미만성 및 결절성 섭취가 뚜렷이 관찰되어, 본 발명에 따른 HSA-folate가 복강 전이 종양 특이적으로 집적하는 것을 확인하였다(도 9).
또한, 표적에 특이적임을 확인하기 위해 In-vivo에서 Folate가 결합되지 않은 Cu-64-Albumin의 경우와, Folate가 결합된 Cu-64-Albumin-Folate를 이용한 경우, Cu-64-Albumin-Folate를 이용하면서 Blocking(folic acid를 처리한 Cu-64-Albumin-Folate 보다 100배 더 처리)한 경우의 동물실험을 진행하였으며, 도 7에서 얻어진 세포주 데이터의 결과와 일치됨을 확인하였다(도 10).
(2) cyclic RGDyK-알부민을 이용한 인테그린 αvβ3 발현 세포주 종양의 표적영상 평가
cRGDyK-알부민이 세포수준에서 결합하는지를 확인하기 위하여, 형광 표지된 알부민과 cRGDyK-알부민을 세포에 처리해준 후 공초점 현미경을 이용해 그 분포를 확인하였다(도 11a 및 도 11b).
본 실험에서의 반응 A 및 B는 각각 실시예 2-2의 반응 2(RXN#2) 및 반응 3(RXN#3)을 의미한다.
cRGDyK-알부민을 반응 A와 반응 B로 비교했을 때, cRGDyK가 더 많이 붙어있는 반응 B가 세포막과 세포 내부에 더 많이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 형광이 표지된 cRGDyK-알부민을 처리한 그룹과 함께, cRGDyK-알부민이 cRGDyK에 의해 세포에 결합하는 것을 확인하기 위해 형광이 표지된 cRGDyK-알부민을 처리하기 전에 cRGDyK를 과량으로 처리한 그룹을 만들어 세포에서의 분포를 확인하였다. 그 결과, cRGDyK를 과량으로 전 처리 해준 그룹은 세포에 분포하는 cRGDyK-알부민이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 또한, 반응 A에 비해 반응 B의 경우에 cRGDyK로 과량 전처리 해준 경우에 세포에 존재하는 cRGDyK-알부민이 확연히 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 11a).
알부민에 의한 세포 결합 또한 확인하기 위해 형광표지된 알부민을 동일하게 처리한 그룹 또한 진행하였다. 그 결과 알부민에 의한 세포 주변 분포가 있는 것을 확인할 수 있었고, 이는 알부민을 과량으로 전처리 한 경우에 많이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 또한 알부민에 의한 결합은 반응 A와 반응 B에서 큰 차이를 보이지 않았다. 그리고 각각의 반응을 알부민과 cRGDyK-알부민을 비교해 봤을 때, 반응 A의 경우에는 알부민과 cRGDyK-알부민에서의 세포 결합정도의 차이가 크지 않았으나, 반응 B에서는 cRGDyK-알부민의 경우가 훨씬 더 많이 세포막과 세포 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 11b).
상기 결과를 종합해 보았을 때, cRGDyK-알부민의 경우에 cRGDyK가 더 많이 결합되어 있는 반응 B의 경우가 cRGDyK에 의해 세포에 더 많이 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 cRGDyK-알부민이 cRGDyK에 의해 세포에 의해 결합하여 분포하는 것을 알 수 있었다.
또한, 동위원소가 표지된 cRGDyK-알부민이 생체 내의 분포 패턴 및 인테그린 αvβ3 타겟능을 확인하기 위해 6주령 마우스의 오른다리에 인테그린 αvβ3를 발현하는 SK-OV3 세포주를 4 x 106씩 심어주어 종양 모델을 확립하였다. 이후 3-4주 후에 종양의 직경이 5-10mm정도인 때에, Cu-64로 표지한 알부민과 cRGDyK-알부민을 종양모델이 만들어진 마우스에 꼬리 정맥을 통해 주사하여 준 후, 10분, 4시간, 24시간, 48시간째에 시간별로 PET 영상을 획득하였다(도 12a 및 도 12b).
반응 A의 경우에는 Cu-64 표지된 알부민과 cRGDyK-알부민이 종양에 분포하는 정도가 거의 비슷했으나, 반응 B의 경우에는 cRGDyK-알부민이 더 많이 종양에 축적된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 정맥 주사 후 4시간째에 가장 높게 나타났다.
더 정확한 분석을 위하여 영상에서 종양 부위에 관심영역을 설정하여 종양 부위에 주입하여준 Cu-64-HSA-RGDyK가 얼마나 축적이 되었는지 확인할 수 있도록 %ID/g 값을 계산하였다. 그 결과, 반응 B의 cRGDyK-알부민에서 가장 높은 값이 나왔으며, 이 값은 4시간째에 5.37 ± 1.09 %ID/g으로 가장 높게 측정되었다. 따라서 cRGDyK가 많이 붙어있는 경우에 cRGDyK에 의해 종양을 표적하여 영상화 할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 13).
(3) ADIBO-알부민을 이용한 SPARC 과발현 세포주 종양의 표적영상 평가
상기 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 알부민 나노플랫폼을 활용하면, 방사성 동위원소와 질환 표적분자 등 다양한 물질들을 한번에 전달할 수 있고, 이의 활성과 지속성이 우수한 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 알부민 나노플랫폼은 물질의 체내 머무르는 시간을 증가시키고, 목적하는 장기 외의 다른 장기로의 섭취가 적어지며(신배출 등이 적음), 다양한 물질을 combination으로 전달할 수 있고, 진단/치료용으로 사용 가능한 질환 타겟 플랫폼으로 사용될 수 있는 장점이 있다(도 14).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 알부민단량체가 포함된 용액(제1-1용액);
    아자이드(N3)을 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액(제1-2용액); 및
    아자이드기(N3)가 결합된 전달물질 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질이 포함된 용액(제2용액)을 포함하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트로서,
    상기 키트는 제1-1용액과 제1-2용액을 반응시킨 용액에 제2용액을 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 것을 특징으로 하며,
    상기 제1-2용액이 아자이드(N3)가 포함된 용액일 경우 제2용액은 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액이며, 상기 제1-2용액이 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액일 경우 제2용액은 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전달물질은 방사성 동위원소, 엽산(folate) 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid)인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 3H, 11C, 18F 14Cl, 32P, 35S, 36Cl, 45Ca, 51Cr, 57Co, 58Co, 59F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Mo, 99mTc, 111In, 131I, 125I, 124I, 123I, 186Re, 188Re 및 177Lu로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  4. 제2항에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 킬레이트제에 결합된 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 킬레이트제는 NOTA, DOTA, DFO, DTPA, N2S2, p-SCN-Bn-NOTA, NODAGA, p-SCN-Bn-DOTA, TETA, p-SCN-Bn-DTPA, p-SCN-Bn-DFO 또는 HYNIC인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기는
    Figure pat00028
    ,
    Figure pat00029
    ,
    Figure pat00030
    ,
    Figure pat00031
    ,
    Figure pat00032
    ,
    Figure pat00033
    Figure pat00034
    ,
    Figure pat00035
    또는
    Figure pat00036
    인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  7. 아자이드(N3)가 결합된 알부민 단량체 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 결합된 알부민 단량체가 포함된 용액(제1용액);
    아자이드(N3)기가 결합된 전달물질 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질이 포함된 용액(제2용액)을 포함하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트로서,
    상기 키트는 제1용액과 제2용액을 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 것을 특징으로 하며,
    상기 제1용액이 아자이드(N3)가 포함된 용액일 경우 제2용액은 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액이며, 상기 제1용액이 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 포함된 용액일 경우 제2용액은 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 전달물질은 방사성 동위원소, 엽산(folate) 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid)인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼 제조용 키트.
  9. (a) 알부민 단량체의 N-말단 아민기에 아자이드(N3)가 결합된 용액 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)이 결합된 용액을 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질 또는 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (a)에서 알부민 단량체에 아자이드(N3)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (b)에서는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키며, 상기 단계 (a)에서 알부민 단량체에 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (b)에서는 아자이드(N3)기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액과 반응시키는 것을 특징으로 하는, 알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 전달물질은 방사성 동위원소, 엽산(folate) 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid)인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 알부민 단량체에 도입된 아자이드(N3) 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)의 개수는 1 내지 20개인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 단계 (a)의 용액은 pH 6.8 내지 pH 7.6 및 20 내지 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 준비하는 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기는
    Figure pat00037
    ,
    Figure pat00038
    ,
    Figure pat00039
    ,
    Figure pat00040
    ,
    Figure pat00041
    ,
    Figure pat00042
    Figure pat00043
    ,
    Figure pat00044
    또는
    Figure pat00045
    인 것을 특징으로 하는 알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  14. (a) 알부민 단량체를 포함하는 용액, 아자이드(N3)-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS를 포함하는 용액을 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 알부민 용액과 아자이드(N3)-NHS 또는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)-NHS를 포함하는 용액을 혼합하여, pH 6.8 내지 pH 7.6에서 반응하는 단계를 포함하는 알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  15. 제9항 또는 제14항의 제조방법으로 제조된 알부민 나노플랫폼.
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