WO2012105801A2 - 긴 소수성 사슬이 도입된 리간드로 코팅된 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

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이영경
이동수
정준기
이명철
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Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles coated with ligands in which long hydrophobic chains have been introduced, and methods for their preparation.
  • Nanoparticles refers to particles that range in size from several nm to several hundred nm.
  • the nanoparticle technology is a core technology that is the foundation of the 21st century's high-tech industry and is an important part of the nanotechnology.
  • the nanoparticles exhibit unique properties such as light, electricity, and magnetism, which are different from bulk particles, and thus are excellent in various applications such as electromagnetic, optical, catalyst, sensor, storage, drug delivery systems, tissue engineering, and diagnostic samples.
  • the manufacturing technology of nanoparticles is emerging as a promising next-generation technology with a wide field of application.
  • the pharmaceutical sector using nanoparticles is not only highly value-added and expected to expand from US $ 3.99 billion in 2007 to US $ 26 billion in 2012, but also gives specificity to nanoparticles. It can be applied to the body to selectively transfer nanoparticles to a specific tissue, it can be useful also in the field of in vitro research such as tissue staining or cell binding assay.
  • nanoparticle detectors are being developed that can apply various methods simultaneously and detect specific types of targets simultaneously.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • CDKI Cycl in-Dependent Kinase 1
  • Fab fragment ant igenbinding fragments that bind to specific cancer cells
  • HSG histamine-succinyl-glycine
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2009-0044293 after partially modifying a part of the surface of the hydrophobic nanoparticles with hydrophilicity, the desired functional molecules are introduced into the hydrophilic group, and the functional nanoparticles which represent the hydrophobic ol as a whole are prepared, and then the nano The remaining portion of the particle surface is converted to hydrophilic to disclose a bio-imaging nanoparticle having both biocompatibility and target orientation.
  • Korean Patent Publication No. 2008-0037734 discloses a quantum dot composed of a cadmium selenite core and a zinc sulfide shell. Disclosed is a biocompatible molecular image quantum dot in which cysteamine and water-soluble monosaccharides are bonded to the surface of the compound.
  • the conventional nanoparticles have hydrophobic properties immediately after their preparation, they cannot be applied directly to biological or black medical research, which is a phenomenon occurring in water-soluble environments. Therefore, the nanoparticles must be prepared by performing an additional process of introducing hydrophilic residues. there is a problem.
  • nanoparticles are recognized as foreign substances in the body, there is a problem that they are immediately taken into the reticulum endothelial system. Therefore, in order to suppress this, an additional process of coating a polymer such as PEG on the nanoparticles is required.
  • the chemical reaction to form a covalent bond mainly to introduce various ligands to the hydrophilic-treated nanoparticles, but the chemical reaction is the reaction temperature, pH, presence of impurities Efficiency decreases due to numerous factors such as concentration difference and light.
  • the error becomes 4 ⁇ ⁇ ⁇ if the error becomes larger, and there are reactions ⁇ ⁇ side ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the present inventors studied a method of introducing various kinds of ligands in a simple and reproducible manner into various kinds of hydrophobic nanoparticles, and a substance in which a ligand is bound to one long alkyl chain. And synthesize it and share it By coating the hydrophobic nanoparticles through the sum, a method of easily introducing various ligands into the hydrophobic nanoparticles was found and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a nanoparticle coated with a non-covalent bond to the surface of the hydrophobic nanoparticles of the alkyl portion (R) of the compound represented by the formula (1).
  • Another object of the present invention includes adding hydrophobic nanoparticles to an aqueous solution in which the compound represented by Chemical Formula 1 is dissolved, and dissolving by selectively or in combination with dissolution means for stirring, heating, and ultrasonic irradiation.
  • the alkyl portion (R) of the compound represented by 1 is to provide a method for producing nanoparticles coated on the surface through a non-covalent bond.
  • Another object of the present invention to provide an imaging agent using the nanoparticles.
  • the present invention provides a nanoparticle coated with a non-covalent bond on the surface of the hydrophobic nanoparticles alkyl portion (R) represented by the formula (1):
  • the present invention includes the steps of adding hydrophobic nanoparticles to the aqueous solution directly dissolved and then dissolved by selectively or in combination with a dissolution means of stirring, heating and ultrasonic irradiation.
  • the alkyl moiety (R) of the compound represented by Formula 1 provides a method for preparing nanoparticles coated on a surface through a non-covalent bond.
  • the present invention provides an imaging agent using the nanoparticles.
  • Nanoparticles with functional groups can be applied to fluorescence detection, MRI, Raman spectroscopy, optical detection, PET, SPECT or gamma imaging devices, and by changing the ligand of the imaging agent, neovascularization, cancer cell detection, immune cell detection, hepatocytes It can be useful for detection, apoptosis detection and gene detection.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph of an instant thin film chromatography-silica 3 ⁇ 4 (ITLC-SG) of nanoparticles according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • 3 is a graph showing the stability of the isotopically labeled nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding force of the nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a cell fluorescence staining diagram showing in vitro cell binding of nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a cell fluorescence staining diagram showing the in vitro cell binding of nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a cell fluorescence staining diagram showing the cell binding of the nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a PET diagram showing the intracellular distribution of isotope-labeled nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a cell fluorescence staining diagram showing intracellular cell binding of ischemic model mice of isotopically labeled nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing PET results of normal mice administered with isotopically labeled nanoparticles according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 illustrates administration of isotopically labeled nanoparticles according to one embodiment of the present invention. Fluorescence microscopy results of liver and spleen of normal mice are shown.
  • the present invention provides a ligand in which an alkyl or alkenyl chain represented by Formula 1 is introduced:
  • L is a ligand and is selected from the group consisting of amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, vitamins, hormones, neurotransmitter chelating agents and sugars;
  • R is C 10 ⁇ C 30 alkyl or alkenyl
  • R alkenyl
  • the L is preferably RGD, cholecystokinin, neurotensin, EGF, VEGF, MMP (matrix metal loproteinase), octreotide, bombesin, TN14003, VIP (vascular intestinal peptide).
  • vasoactive intestinal peptide MSH (melanocyte stimulating hormone), substance ⁇ (substance P), lysine glutamate urea, cysteine, glutameric urea antibody, Pro antibody, fragment of antibody, Aptamer, Folic Acid, Biotin, IRDye, NOTA, DOTA-SCN, N02A, TI ) 2S 1X5M DPA fC ⁇ ⁇ fl ° ⁇ ⁇ ⁇ : i ⁇ T ⁇ "0 i ⁇ ⁇ rGa-68 , Ga- 67 , In 1 type selected from the group consisting of -Ill, Y-90, Lu-177, Tc-99m, Cu-64, 1-123, 1-124, 1-131, Zr-89, Sc-44, Gd More than one, more preferably one selected from the group consisting of RGD, NOTA-SCN, D0TA-SCN, lactose, mannose, rhodamine, and indocyanine green.
  • RGD is a peptide consisting of Arg-Gly-Asp
  • CRGDyK is a peptide in which Arg-Gly-Asp-D-Tyr—Lys is in cycle form;
  • N0TA is 1, 4, 7-triazacyclononane-1,4, 7-triacetic acid
  • N0TA-SCN is 2- (p-isothiocyanatobenzyl) -1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid;
  • D0TA is 1,4, 7, 10-tetraazacyclotetradecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid;
  • D0TA-SCN is 2- (p-isothiocyanatobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclotetradecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid;
  • D02A is 1,4,7, 10-tetracyclododecane-1,7-diacetate
  • D03A is 1,4, 7-tricarboxymethyl-1, 4, 7, 10—tetraazacyclododecane-1, 4, 7-triacetic acid.
  • DTPA is diethylenetriaminepentaacetic acid
  • HYNIC is hydrazinonicotinic acid.
  • the present invention provides nanoparticles wherein the alkyl portion (R) of the ligand (R-A-L) to which the alkyl or alkenyl chain is introduced is coated via a non-covalent bond to the surface of a hydrophobic nanoparticle.
  • the nanoparticles are bonded to alkyl or alkenyl chains having ligands introduced on their surfaces.
  • the surface of the nanoparticles may be coated using a detergent that is not included in Chemical Formula 1.
  • the digital device used at this time may preferably be TWON 60 or TWON 80.
  • the ligands are 30 alkyl chain introduced is because the tail one dividing without nokyimyeon forming liposomes in water, forming a misael or fine oil droplets with nanoscale Dissolves emulsification. At this time, if you enclose the hydrophobic nanoparticles instead of oil droplets, it becomes a nanoparticle bound to the ligand. Therefore, the ligand having one alkyl group tail according to the present invention is; It can replace many chemical reaction reagents necessary for covalently binding a ligand to nanoparticles.
  • the present invention is to add the hydrophobic nanoparticles dissolved in the organic solvent to the solution in which the organic solvent is removed or the compound represented by the formula (1) as it is, and the dissolution means of stirring, heating and ultrasonic irradiation selectively or It provides a method for producing nanoparticles coated on the surface of the alkyl portion (R) of the compound represented by the following formula (1) through a non-covalent bond comprising the steps of dissolving in combination to:
  • Method of producing nanoparticles according to the present invention is an organic solvent, dissolving the hydrophobic nanoparticles standing evaporation of the organic solvent to or remove or to without removing intact state long the compound and the PEG derivative and the one represented by the formula (1) alkane in the Or an alkane or alkene of the R moiety of Formula 1 to the surface of the nanoparticles by mixing with an aqueous solution containing a detergent containing an alkene chain and by selectively or in combination with dissolution means of stirring, heating and ultrasonic irradiation. It is possible to prepare nanoparticles in which the L portion of the ligand is exposed to the outside.
  • the prepared mixed solution may be separated by performing gel filtration or ultrafiltration, but is not limited thereto.
  • the hydrophobic nanoparticles according to the present invention are selected from nanoparticles having a hydrophobic surface made of an insoluble inorganic material, preferably quantum dots can be used.
  • the hydrophobic nanoparticles may be selected from polymers, dendrimers, and the like of organic compounds.
  • the hydrophobic alkanes or alken chains may be covalently bonded to the surface of the nanoparticles, thereby changing the surface to hydrophobicity.
  • semiconductor nanoparticles, metal nanoparticles, and metal compound nanoparticles comprising one element of zinc, cadmium, and lead, which are group ⁇ elements on the periodic table, and one element of sulfur, selenium, and tellurium, which are group VI elements,
  • the metals of the time are all metals belonging to the alkaline earth or transition element in the periodic table, as well as aluminum, gallium, indium, thallium and germanium.
  • Including, preferably, gold nanoparticles, silver nanoparticles, platinum nanoparticles, iron nanoparticles, iron oxide nanoparticles, manganese oxide nanoparticles including, but not limited to, chromium, tin, lead, antimony, bismuth, polonium, boron silicon, tellurium Antimony sulfide nanoparticles, iron sulfide nanoparticles, etc.), artificial organic polymer nanoparticles (such as PVC, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polycarbonate, etc.), dendrimer nanoparticles, polylysine nanoparticles , Chitosan nanoparticles, silicon or silicon compound nanoparticles and sugar nanoparticles or nanoparticles made of a combination thereof may be selected and used, more preferably quantum dots can be used.
  • artificial organic polymer nanoparticles such as PVC, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polycarbonate, etc.
  • Organic solvents that can be used to dissolve the hydrophobic nanoparticles may be used a volatile solvent such as chloroform, methylene chloride (MC), ethyl acetate (EtOAc), ether, acetone, nucleic acid, preferably chloroform Can be.
  • a volatile solvent such as chloroform, methylene chloride (MC), ethyl acetate (EtOAc), ether, acetone, nucleic acid, preferably chloroform Can be.
  • the hydrophobic nanoparticles are suspended in chloroform, blown with nitrogen to evaporate chloroform, and an aqueous solution containing the compound of Formula 1 and detergent is added, followed by a strong force at a temperature of 70 1 for 3 hours. It can be obtained by stirring.
  • the nanoparticles prepared by the above method have a ligand in which an alkane or alkene chain is introduced to the nanoparticle surface.
  • the present invention provides an imaging agent using the nanoparticles.
  • the imaging agent using nanoparticles according to the present invention can be used as a diagnostic imaging agent applicable to fluorescence detection, MRI, Raman spectroscopy, optical detection, PET, SPECT, gamma imaging device.
  • the imaging agent may be applied to neovascularization, cancer cell detection, immune cell detection, hepatocyte detection, apoptosis detection, gene detection by changing ligands.
  • nanoparticles of the present invention is applied to the ultrasonic wave or electromagnetic wave or
  • ⁇ -D-Mannopranosyl-phenylisothiocyanate (0.014 g, 0.04 mmol) is dissolved in chloroform (2) and TEA 0.012 mi, 0.09 ⁇ ol) is added, followed by stearylamine (0.012 g, 0.04 mmol) was added and stirred well at room temperature. As the reaction proceeded, the turbid reactions became clear. The reaction was confirmed by stirring for 15 hours, followed by mass spectrometry, in which the ⁇ -D-mannopyranosyl-phenylisothiocyanate peak disappeared and the mannose-stearylamine peak appeared.
  • Rhodamine ⁇ -isothiocyanate (0.015 g, 0.03 mmol) was dissolved in chloroform (1) and TEA (0.012 ml, 0.08 mmol) was added and stirred at room temperature for 30 minutes. Stear 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ . ⁇ 13 g, ⁇ .04 mmol) was reacted with a semi-ungwool mixture plus a ⁇ 5 letter ⁇ ⁇ ⁇ . Termination of the reaction confirmed by mass spectrometry that the rhodamine peak disappeared and the rhodamine-stearylamine peak appeared.
  • Tween 60 (Sigma-Aldrich) is a surfactant having a hydrophobic stearyl group bound to a hydrophilic PEG head, and QD655 and QD545, which are quantum dots, are purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). It was.
  • Aqueous solution of 60 43 ⁇ 4 aqueous solution 2 ⁇ was mixed with dry QD655 and then mixed while heating to 70 ° C overnight.
  • the reaction mixture is Sephacryl purchased from Sigma-Aldrich
  • the coated quantum dot solution was concentrated by Etratrafiltration (Ami con Ultracel—100 kDa cutoff) and the final concentration was determined by UV-Visible Hop Intensity.
  • the hydraulic radius and size distribution of the coated coated quantum spots were determined by dynamic light scattering (DLS, Malvern).
  • Dynamic light measurements were performed by dipping the coated quantum dot solution in midstream, sonicating for 1 minute, and then particle size and distribution from the volume-percent scattered at an angle of 90 ° at 25 ° C. Was obtained.
  • RGD-QD655 was prepared by coating and separating QD655 in the same manner as in Example 8 using 2% of 4% twenty six aqueous solution containing 5 mol% of RGD-stearylamine.
  • Example 2 instead of using the 4% twenty 60 in Example 8, prepared in Example 2
  • NOTA—QD655 was prepared by coating and separating QD655 in the same manner as in Example 8 using 43 ⁇ 4 Twenty 60 aqueous solution 2 1 containing 2 mol% of N0TA-stearylamine.
  • Example 8 Instead of using 60% 4% twenty-ol in Example 8 was prepared in Example 1
  • Example 8 In the same manner as in Example 8, except that a 4% aqueous 60 aqueous solution 2 containing RGD-stearylamine 5 ⁇ ) 13 ⁇ 4 and 2 mol of SCN-NOTA-stearylamine prepared in Example 2 was used. N0TA-RGD-QD655 was prepared by coating and separating on QD655.
  • Example 47> Instead of using 6% twenty six in Example 8, except that 6% twenty 60 aqueous solution containing 2 mol% of lactose-stearylamine prepared in Example 4 was used. Lac-QD545 was prepared by coating and separating the QD545 in the same manner as in Example 8.
  • ⁇ i50> instead of using the 4% twenty 60 in Example 8, except using the 43 ⁇ 4 twenty 60 aqueous solution 2 containing 2 mol of mannose-stearylamine prepared in Example 5 Man—QD655 was prepared by coating and separating the QD655 in the same manner as 8.
  • a 2% aqueous solution of 4% TN 60 containing 2 mol% of N0TA-stearylamine and 5 mol% of mannose-stearylamine prepared in Example 5 was coated on QD655 in the same manner as in Example 8. Separated to prepare N0TA-Man-QD655.
  • Example 2 Instead of using 6% tween 60 in Example 8, it was prepared in Example 2.
  • Example 8 Same as Example 8 except that 6 mol of a 60% aqueous solution containing 2 mol% of N0TA-stearylamine and 5 mol% of lactose-stearylamine prepared in Example 4 was used.
  • NOTA—Lac-QD655 was prepared by coating and separating the QD545.
  • the total fluorescence intensity was measured while storing the coated quantum dots prepared in Examples 8 to 17 at 4 t for one month, and the size of the particles was measured by measuring DLS (Dynamic light scattering).
  • the particle shape was measured by TEM, the transmission electron microscope. The fetus was observed.
  • PBS room temperature
  • human serum 37 ° C
  • 80> RGD-coated quantum dots of Example 10 according to the present invention bound to ⁇ 3 intigreen Ga-N0TA_RGD-QD655 and Ga-N0TA-QD655 were used for U87MG (human glycoma cells, ⁇ 3 strong expression), A431 (human squamous cell carcinoma, ⁇ 3 expression poor), MCF-7 (human breast cancer cell ⁇ 3 weak expression ) And binding experiments.
  • Example 10 In order to confirm whether the RGD-binding quantum dots of Example 10 were selectively ingested into the cells, 6 a-NOTA-RGD-QD655 containing c RGDyK (10 ⁇ ) was also included in the blocking study. .
  • the culture solution was removed to increase cell intake and washed three times with cold DPBS. Cells were dissolved with 1% SDS solution (0.5 Hi Aell) and radioactivity was measured with a gamma counter. Protein intake was measured by BCA (BCA Protein assay kit, Pierce) method and radioactivity intake was normalized to intake per mg protein. The results are shown in Table 1 and FIG.
  • Ga-N0TA—RGD-QD655 is o — 3.
  • the cells were washed with warm cell binding experiment buffer and added with 200 ⁇ of cell binding buffer solution containing 50 nM of PEG-QD655 of Example 8 or RGD-QD655 of Example 10 for 15 minutes. The reaction was over. Binding reaction was terminated by removing the cell binding buffer solution and washed three times with the appropriate DPBS. The cells were fixed with 3.73 ⁇ 4 paraformaldehyde solution and then mounted with DAPI solution. The results are shown in FIG.
  • RGD-QD655 of Example 10 was shown to bind only to U87MG cells expressing ⁇ 3 intigrins, and PEG-QD655 of Example 8 was not shown to bind to any cells.
  • PEG-QD655 of Example 8 was not shown to bind to any cells.
  • U87MG binding was blocked by cRGDyK.
  • cRGdyK 500 nM was added 1 minute before, and a blocking experiment was also performed. Mounted with DAPI solution to observe cell nuclei in confocal microscope. QD655 was scanned with 488 nm and DAPI and QD545 with 405 nm lasers. The fault is shown in FIG. 6
  • RGD-QD655 of Example 10 was shown to bind to U87MG tumor tissue expressing ⁇ 3 intigreen (a).
  • PEG-QD655 of Example 8 did not bind (b), but RGD-QD655 of Example 10 appeared to block U87MG binding by cRGDyK (c).
  • the tumors were placed in Tissue-Tek OCT compound (Sakura, Finetek) to obtain 7 ⁇ thick frozen sections, attached to slide glass, fixed with 3.7% (v / v) paraformaldehyde solution, and then DAPI. Mounted with solution and observed by confocal microscopy. The results are shown in FIG.
  • RGD-QD655 of Example 10 was ingested into U87MG tumor tissue expressing tigrin, which is ⁇ 3, intravenously, but not to A431 tumor tissue not expressing.
  • PEG-QD655 of Example 8 was not ingested in any tumor tissue.
  • ⁇ was ingested in U87MG tumor tissue, and foot ⁇ was not ingested in tumor tissue, and the normal tissue was mainly ingested in liver (a).
  • cRGDyK When injected together with cRGDyK, both tumor tissues were ingested only in the liver (b).
  • ⁇ 209> expressed in the ischemic tissue of the RGD-QD655 quantum dot of Example 10 according to the present invention The following experiment was performed to confirm the presence or absence of ⁇ 3 binding.
  • the tissues were frozen sections (7 ⁇ ) and subjected to DAPI staining and observed by fluorescence microscopy, and PEG-QD655 of Example 8 was used as the negative control. The results are shown in FIG.
  • Example 10 As shown in FIG. 9, after RGD-QD655 of Example 10 was cut intramuscularly and fluorescence was observed with a Maestro imaging system, ischemia-induced muscle (a) was found to be less than normal muscle (b). High intake was shown. This suggests that ⁇ 3 intigreen is expressed as neovascularization is formed in tissues that induced ischemia.
  • a and d overlap the fluorescence and the DAPI image
  • b and e represent the fluorescence image
  • e and f represent the DAPI image.
  • the N0TA-Man-QD655 and N0TA-Lac-QD655 prepared in Examples 15 and 16 were labeled with Ga-68 by the method of Experimental Example 2, followed by 68 Ga-NOTA-Man-QD655 (10.36 MBq / 0.15 m £) and PET-CT was taken 30 min after Ga-N0TA-Lac-QD545 (14.8 MBq / 0.08 was injected into the tail vein of normal ICR mice. The results are shown in FIG.
  • N0TA-Man-QD655 was found to be ingested in the liver and spleen (a), and 6 3 ⁇ 4a-N0TA-Lac-QD545 was mainly ingested in the liver and low intake in the spleen.
  • Man-QD655 (70 nM, 30) and Lac-QD545 (70 nM, 120) prepared in Examples 13 and 14 were mixed, and intravenously injected into the tail vein in 6-week-old normal ICR mice 20 minutes later. After regeneration, the liver and spleen were extracted, placed in an OCT compound, and shaken at -20 ° C, and then made into 7 ⁇ -thick copper slices, stained with DAPI solution, and observed by fluorescence microscopy.
  • blue DAPI shows the distribution of hepatocellular nuclei
  • green Lac-QD545 was ingested by hepatocytes, which occupy most of the liver, but not in the spleen.
  • the red Man-QD655 was shown to be consumed by much less Cooper cells than hepatocytes.
  • the nanoparticles according to the present invention are fluorescent detection, MRI, Raman spectroscopy, optical detection,
  • PET PET, SPECT or gamma imaging device
  • SPECT gamma imaging device

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Abstract

본 발명은 긴 알칸 또는 알켄사슬에 연결된 링커를 포함하는 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 리간드가 도입된 C10~30의 알킬 사슬을 비공유 결합으로 소수성 나노입자에 코팅함으로써 나노입자에 다양한 리간드를 용이하게 도입할 수 있고, 상기 방법에 의해 제조된 다양한 기능기를 가진 나노입자를 형광탐지, MRI, 라만 분광, 광학탐지, PET, SPECT 또는 감마영상 장치에 적용될 수 있고, 상기 영상화제의 리간드를 변화시켜 신생혈관탐지, 암세포 탐지, 면역세포 탐지, 간세포 탐지, 세포사멸 탐지, 유전자 탐지에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의명칭】
긴 소수성 사슬이 도입된 리간드로 코팅된 나노입자 및 이의 제조방법 【기술분야】
<1> 본 발명은 긴 소수성 사슬이 도입된 리간드로 코팅된 나노입자 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
<2>
【배경기술】
<3> 나노입자 (nanoparticle)란 입자 크기가 수 nm에서 수백 nm크기의 범주에 속 하는 입자를 말한다. 이러한 나노입자 기술은 21세기 첨단 산업외 근간이 되는 핵 심기술로서 나노 기술의 중요 부분을 차지하고 있다.
<4> 상기 나노입자는 벌크 입자와는 다른 빛, 전기 및 자기 등의 독특한 물성을 나타내어 전자기, 광학, 촉매, 센서, 저장, 약물전달시스템, 조직 공학, 진단 시료 등의 다양한 웅용 분야에서 뛰어난 성능올 나타내고, 나노입자의 제조 기술은 광범 위한 웅용 분야를 가진 차세대 유망 기술로 부각되고 있다.
<5> 특히, 나노입자를 이용한 의약학 분야는 시장 규모로 2007년 33억 9, 000만 달러에서 2012년에는 260억 달러로 확대될 것으로 예측될 정도로 부가가치가 높을 뿐만 아니라, 나노입자에 특이성을 부여하는 것은 특정 조직에 선택적으로 나노 입 자를 운반하는 기술을 체내 적용할 수 있고, 조직염색학이나 세포결합분석 등 시험 관 내 연구분야에도 유용하게 이용될 수 있다.
<6>
<7> 나노입자의 표면에 각종 리간드를 도입하는 것은 나노입자에 특정 조직에 대 한 특이성을 부여하고자 함도 있지만, 두 가지 이상의 다른 리간드를 도입하여 두 가지 이상의 표적에 결합할 수 있는 특이성을 부여할 수 있고, 이로 인해 생체 내 혹은 생체 외에서 특정 수용체나 항원 등에 특이적으로 결합시킬 수 있을 뿐만 아 니라, 하나의 나노입자에 방사성동위원소, 광학활성물질 , 자성체 등에서 선택되는 석직개의 람지지 g 결합시^타양한 켜ᅳ방 ^1공 ^ »
<9> 종래 다양한 탐지 원리에 의한 탐지방법이 널리 개발됨으로써, 여러 가지 방 법을 동시에 적용하고, 여러 가지 종류의 목표를 동시에 특이적으로 탐지해 낼 수 있는 나노입자 탐지자가 개발되고 있다 .
<ιο> 예를 들면, 표피생장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor; EGFR) 와 사이클린의존성 인산화효소 저해제 (Cycl in-Dependent Kinase 1; CDKI)에 동시 톡이성을 가진 양쪽 특이성 항체를 만들어, 세포표면에 있는 EGFR에 먼저 결합하여 세포내로 들어간 다음, 세포 속의 CDK에 결합하는 것이 보고된 바 있고 (Cornel issen B, et al. , Cancer Biother Radiophar , 24:163-173, 2009), 특정 암 세포에 결합하는 항원결합조각 (fragment ant igenbinding; Fab) 분절과 히스타민-석 시닐—글라이신 (HSG) 분절을 가지는 양쪽 특이성 엔지니어드 항체를 이용하여 2스텝 영상에 웅용된 경우도 보고된 바 있다 (Sharkey RM, et al. , Cancer Biother Radiopharm, 25:1-12, 2010).
<ii> 또한, 대한민국 공개특허 제 2009-0044293호에서는 소수성 나노입자의 일부 표면을 친수성으로 부분 개질한 후, 친수성기에 원하는 기능성 분자를 도입하고, 전체적으로 소수성올 나타내는 기능성 나노입자를 제조한 후, 나노입자 표면의 나 머지 부분을 친수성으로 전환시켜 생체 친화성 및 표적지향성을 모두 갖는 바이오- 이미지용 나노입자를 개시하였고, 대한민국 공개톡허 제 2008-0037734호에서는 카드 뮴 샐레나이트 코어 및 황화 아연 쉘로 이루어진 양자점의 표면에 시스테아민과 수 용성 단당류가 결합된 생체적합성 분자영상용 양자점을 개시하고 있다.
<12>
<13> 그러나, 종래 나노입자는 제조된 직후 소수성의 성질을 나타내어 수용성 환 경에서 일어나는 현상이 대부분인 생물학적 흑은 의약학적 연구에 그대로 적용될 수 없으므로 친수성 잔기를 도입하는 부가적인 공정을 수행하여 제조해야 하는 문 제가 있다. 또한, 나노입자는 체내에서 이물질로 인식되기 때문에 체내에 투여 즉 시 망상내피계에 섭취되는 문제가 있다. 따라서 이를 억제하기 위하여 상기 나노입 자에 PEG와 같은 폴리머를 코팅하는 부가적인 공정이 요구된다.
<14> 한편 , 상기 친수성으로 처리한 나노입자에 각종 리간드를 도입하기 위해 주 로 공유결합을 형성하는 화학반웅을 수행하였으나, 이러한 화학반웅은 반웅의 온 도, PH, 불순물의 존재 유무 각종 시약의 농도 차이, 빛 등 수많은 인자에 의하여 효율성이 떨어지고, 특히, 두가지 이상의 결합 반웅시에는 그 오차가 더욱 커지면 4^ ^ ^하게 되어 반웅^ ^측아 ^ ^^τ버 ^하 ^히^ ^ 제가 있다.
<15>
<16> 이에, 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 종류의 소수성 나노입자에 단순하고 재현성 높게 다양한 종류의 리간드를 도입하는 방법을 연구하 던 중, 하나의 긴 알킬사슬에 리간드를 결합시킨 물질을 합성하고, 이를 비공유 결 합을 통해 소수성 나노입자에 코팅시킴으로써, 소수성 나노입자에 다양한 리간드를 용이하게 도입시키는 방법을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
【발명의 내용】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킬부분 (R)이 소수성 나노입자표면에 비공유결합을통해 코팅된 나노입자를 제공하는 데 있다.
[화학식 1]
R一 Aᅳᄂ
(상기 R, A 및 L은 본 명세서에 정의한바와 같다).
본 발명의 다른목적은 상기 화학식 1로표시되는 화합물을 용해시킨 수용액 에 소수성 나노입자를 첨가하고, 교반, 가열 및 초음파 조사의 용해 수단을 선택적 으로또는 복합적으로 적용하여 용해시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시 되는 화합물의 알킬부분 (R)이 비공유 결합을 통해 표면에 코팅된 나노입자의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 이용한 영상화제를 제공하는 데 있다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 알킬부분 (R)이 소수성 나노입자 표면에 비공유결합을 통해 코팅된 나노입자를 제공한다:
[화학식 1]
R A-L
(상기 R, A 및 L은 본 명세서에서 정의한바와 같다).
≥한, 본 은 상기 W직ᅳ —화 · ^^용해시킨 수용액에 소 수성 나노입자를 첨가하고, 교반, 가열 및 초음파 조사의 용해 수단을 선택적으로 또는 복합적으로 적용하여 용해시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킬부분 (R)이 비공유 결합을 통해 표면에 코팅된 나노입자의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 나노입자를 이용한 영상화제를 제공한다. <32>
【유리한 효과】
<33> 본 발명의 C10-30의 알킬 사슬이 도입된 리간드를 비공유 결합으로 소수성 나 노입자에 코팅함으로써 소수성 나노입자에 다양한 리간드를 용이하게 도입할 수 있 고 , 상기 방법에 의해 제조된 다양한 기능기를 가진 나노입자를 형광탐지, MRI, 라 만 분광, 광학탐지 , PET, SPECT또는 감마영상 장치에 적용될 수 있고, 상기 영상 화제의 리간드를 변화시켜 신생혈관탐지, 암세포 탐지, 면역세포 탐지, 간세포 탐 지, 세포사멸 탐지, 유전자 탐지에 유용하게 사용될 수 있다.
<34>
【도면의 간단한 설명】
<35> 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 나노입자의 모식도이다.
<36> 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 나노입자의 인스턴트 얇은 막크로마토그 래피—실리카 ¾(ITLC-SG)를 분석한그래프이다.
<37> 도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 동위원소가 표지 된 나노입자의 안정성을 나타낸 그래프이다.
<38> 도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 나노입자의 결합력을 나타내는 그래프이 다.
<39> 도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 나노입자의 시험관 내 세포결합을 나타내 는 세포형광염색 도면이다.
<40> 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 나노입자의 체외 세포결합을 나타내는 세 포형광염색 도면이다.
<41> 도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 나노입자의 체내 세포결합을 나타내는 세 포형광염색 도면이다.
<42> 도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 동위원소가 표지 된 나노입자의 암이식 마우스내 체내분포를 나타내는 PET도면이다.
<43> 도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 동위원소가 표지 된 나노입자의 허혈 모
Figure imgf000006_0001
<44> 도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 동위원소가 표지 된 나노입자의 허혈 모 델 마우스의 체내 세포 결합을 나타내는 세포형광염색 도면이다.
<45> 도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 동위원소가 표지 된 나노입자를 투여한 정상 마우스의 PET결과를 나타낸 도면이다.
<46> 도 12는 본 발명의 일실시예에 따론 동위원소가 표지 된 나노입자를 투여한 정상 마우스의 간과 비장의 형광 현미경 결과를 나타낸 도면이다.
<47>
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
<48> 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
<49>
<50> 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 알킬 또는 알케닐 사슬이 도입된 리간 드를 제공한다:
<51> 【화학식 1】
R-A-L
<52> (화학식 1에서,
<53> 상기 L은 리간드로써, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물질 킬레이트화제 및 당으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
<54> 상기 A는 링커로써, -CH2-, -CH=, -C≡, ~Ν-, -ΝΗ-, -Ν=, ᅳ0-, -S-, -CS-,
-C0-, -Ρ04Η-, -Ρ03Η-, -Ρ02Η- 및 -벤젠-의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되 고; 및
<55> 상기 R은 C10~C30의 알킬 또는 알케닐이고;
<56> 이때, R이 알케닐인 경우, 사슬 중에 이중결합을 5개 이하로 포함할 수 있 다).
<57>
<58> 상기 L은 바람직하게, RGD, 콜레시스토키닌, 뉴로텐신, EGF, VEGF, MMP (메트 릭스 메탈로프로테이네이즈; matrix metal loproteinase) , 옥트레오타이드, 봄베신, TN14003, VIP (혈관활성 장내 펩타이드; vasoactive intestinal peptide), MSH (멜라 닌세포자극호르몬; melanocyte stimulating hormone) , 서브스턴스 Ρ (통증유발물질; Substance P), 라이신 글루타메이트 유레아, 시스테인, 글루타메이 유레아 항체, Pro항체, 항체의 분절, 앱타머, 엽산, 비오틴, IRDye, NOTA, DOTA-SCN, N02A, TI)2S 1X5M DPA fC 可可도 ^ fl °ΐ Β一 :i^T^ "0i¥≤rGa-68, Ga- 67, In-Ill, Y-90, Lu-177, Tc-99m, Cu-64, 1-123, 1-124, 1-131, Zr-89, Sc-44, Gd 표지화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고, 더욱 바람직하게는 RGD, NOTA-SCN, D0TA-SCN, 락토즈, 만노즈, 로다민 및 인도시아닌그린으로 이루어 진 군으로부터 선택되는 1종이다.
<59> <60> 바람직하게 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은;
<6i> cRGDyK-스테아레이트, N0TA-SCN-스테아릴아민, D0TA-SCN—스테아릴아민, 락토 즈-스테아릴아민, 만노즈 -SCN-스테아릴아민, 로다민 -SCN-스테아릴아민 및 인도시아 닌그린 -스테아릴아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
<62>
<63> 이때, RGD는 Arg-Gly-Asp로 구성되는 펩타이드이고;
<64> cRGDyK는 Arg-Gly-Asp-D-Tyr— Lys이 사이클형태로 된 펩타이드이고;
<65> N0TA는 1, 4, 7-트리아자시클로노난 -1,4, 7-트리아세트산이고;
<66> N0TA-SCN은 2-(p-이소치오시아나토벤질) -1,4,7-트리아자시클로노난 -1,4,7-트 리아세트산이고;
<67> D0TA는 1,4, 7, 10-테트라아자시클로테트라데칸 -1, 4, 7 , 10-테트라아세트산이고;
<68> D0TA-SCN은 2-(p-이소치오시아나토벤질) -1 ,4,7, 10-테트라아자시클로테트라데 칸 -1, 4 , 7, 10-테트라아세트산이고;
<69> D02A는 1,4,7, 10-테트라시클로도데칸 -1,7-다이아세테이트이고; 및
<7o> D03A는 1,4, 7-트리카복시메틸 -1 , 4 , 7 , 10—테트라아자시클로도데칸 -1, 4, 7-트리 아세트산이다.
<7i> DTPA는다이에틸렌트리아민펜타아세트산이고; 및
<72> HYNIC은 하이드라지노니코틴산이다.
<73>
<74> 또한, 본 발명은 상기 알킬 또는 알케닐 사슬이 도입된 리간드 (R-A— L)의 알 킬부분 (R)이 소수성 나노입자 표면에 비공유결합을 통해 코팅된 나노입자를 제공한 다.
<75> 상기 나노입자는 도 1에 나타낸 바와 같이, 나노입자 표면에 리간드가 도입 된 알킬 또는 알케닐 사슬이 결합되어 있다. 이 때 상기 화학식 1에 포함되지 않는 디터전트를 같이 사용하여 나노입자 표면을 코팅할수도 있다. 이 때 사용되는 디터 전트로는 바람직하게는 트원 60또는 트원 80이 될 수가 있다.
<77> 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 C10-30 알킬 사슬이 도입된 리간드 는 꼬리가 하나이므로, 물에 녹이면 리포좀을 형성하지 않고, 미샐을 형성하거나 기름 방울을 나노 크기로 잘게 나누어 녹이는 유화작용을 한다. 이때 기름 방울 대 신 각종 소수성의 나노입자를 둘러싸게 하면 리간드를 결합한 나노입자가 되는 것 이다. 따라서, 본 발명에 따른 하나의 알킬기 꼬리를 가지는 리간드는 ; 리간드를 나노입자에 공유결합으로 결합시키는 데 필요한 여 러 가지 화학반웅시 약을 대신할 수 있다. 나아가, 본 발명은 유기용매에 녹아 있는 소수성 나노입자를 유기용매를 제 거하거나 있는 그대로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 녹인 용액에 첨가하고, 교반, 가열 및 초음파 조사의 용해 수단을 선택 적으로 또는 복합적으로 적용하여 용해시 키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킬부분 (R)이 비 공유 결합을 통해 표면에 코팅된 나노입자의 제조방법을 제공한다 :
[화학식 1]
R-A-L
(상기 R, A 및 L은 본 명세서에서 정의한 바와 같다) . 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 유기용매'에 녹인 소수성 나노입자에 서 유기용매를 증발시켜 제거하거 나 제거하지 않고 그대로 둔 상태로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 PEG 유도체 및 하나의 긴 알칸 또는 알켄사슬을 포함한 디 터 전트를 포함한 수용액과 흔합하고 , 교반, 가열 및 초음파 조사의 용해 수단을 선 택적으로 또는 복합적으로 적용함으로써 상기 화학식 1의 R부분의 알칸 또는 알켄 이 나노입자 표면에 결합하고 L부분의 리간드가 밖으로 노출한 나노입자를 제조할 수 있다 . 상기 제조된 흔합 용액을 겔필트레이션 또는 울트라필트레이션을 수행하 여 분리하여 사용할 수도 있으나 이에 한정하지 않는다. 본 발명에 따른 상기 소수성 나노입자는 불용성 무기물로 이루어진 소수성 표면을 가진 나노입자로부터 선택되고 , 바람직하게는 양자점을 사용할 수 있다. 또 한 상기 소수성 나노입자는 유기화합물의 폴리 머나 덴드리 머 등으로부터 선택될 수 있다. 나아가 , 제조한 유기 혹은 무기 나노입자의 표면이 수용성 인 경우, 소수성 인 알칸 또는 알켄 체인을 나노입자의 표면에 공유결합하여 표면을 소수성으로 바꾸어 서 사용할 수 있다.
바람직하게는 주기율표상의 Π족 원소인 아연, 카드뮴 및 납 중의 1 원소와 주기율표상의 VI족 원소인 황, 셀레늄 및 텔루륨 중의 1 원소로 구성 되는 반도체 나노입자, 금속 나노입자 및 금속화합물 나노입자 (이 때의 금속은 주기율표상 알칼 리토류 또는 전이원소에 속하는 모든 금속과 알투미늄 , 갈륨, 인듐, 탈륨, 게르마 늄, 주석, 납, 안티모니, 비스무스, 폴로늄, 붕소 실리콘, 텔루륨을 포함하고 바 람직하게는 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 철 나노입자, 산화철 나노 입자, 산화망간 나노입자, 황화안티모니 나노입자, 황화철 나노입자 등을 들 수 있 다), 인조유기폴리머 나노입자 (PVC, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리 카보네이트, 등을 들 수 있다), 덴드리머 나노입자, 폴리라이신 나노입자, 키토산 나노입자, 실리콘이나 실리콘 화합물 나노입자 및 당 나노입자 또는 이들의 조합으 로 만들어진 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되어 사용할 수 있고, 더욱 바 람직하게는 양자점을사용할수 있다.
<89>
<90> 소수성 나노입자를 녹이는데 사용가능한 유기용매는 클로로포름 , 메틸렌클 로라이드 (MC), 에틸아세테이트 (EtOAc), 에테르, 아세톤, 핵산 등의 휘발성 용매를 사용할수 있고, 바람직하게는 클로로포름을사용할수 있다.
<91>
<92> 구체적으로, 소수성 나노입자를 클로로포름에 현탁시키고, 질소를 불어 클로 로포름을 증발시키고 상기 화학식 1의 화합물과 디터전트를 포함하는 수용액을 첨 가한후, 70 1의 온도에서 3시간동안강력하게 교반하여 얻을 수 있다.
<93> 상기의 방법으로 제조된 나노입자는 도 1에 나타낸 바와 같이 나노입자 표면 에 알칸또는 알켄 사슬이 도입된 리간드가 결합되어있다 .
<94>
<95> 또한, 본 발명은 상기 나노입자를 이용한 영상화제를 제공한다.
<96> 이때, 본 발명에 따른 나노입자를 이용한 영상화제는 형광탐지, MRI, 라만 분광, 광학탐지, PET, SPECT, 감마영상 장치에 적용 가능한 진단용 영상화제로 사 용할수 있다.
<97> 또한 , 상기 영상화제는 리간드를 변화시켜 신생혈관탐지 , 암세포탐지 , 면역 세포 탐지 간세포 탐지, 세포사멸 탐지, 유전자 탐지에 적용될 수 있다.
<98>
^> ^^푀ᅳ닉노입지애 -감마선아나 양전자썽출^ ^우 투과력 이 우수하여 영상화제로 사용할 수 있지만, 알파선이나 베타선 방출핵종으로 표지 할 경우 분자를 이온화시켜서 파괴하는 성질이 강하므로 악성 세포를 사멸하는 치 료제로사용할 수가 있다.
<100> 또한, 본 발명의 나노입자는 외부에서 가하여 주는 초음파나 전자기파 또는
입자성 방사선에 의하여 열, 오제전자ᅳ 광전자, 컴프턴 산란 전자, X-선 등의 2차 방사선을 방출하여 악성 세포를 사멸하므로 이를 이용한 치료제로도 사용할 수가 있다.
<101>
【발명의 실시를 위한 형태】
<102> 이하, 본 발명을실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
<103> 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용 이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<104>
<105> <실시예 1> RGD-스테아레이트의 합성
<106> c(RGDyK) (0.010 g, 0.02 mmol)을 클로로포름 (0.5 에 녹이고 트리에틸아민
(TEA) (0.007 ml, 0.05 隱 ol)을 가하여 실은에서 하룻밤 저어주었다. 스테아로일 클 로라이드 (0.015 g, 0.05 mmol)을 가하여 실온에서 하룻밤 더 저어 주면서 반웅하였 다. 반웅 종결은 질량분석으로 c(RGDyK) 피크가 없어지고 RGD-스테아레이트 피크가 나타나는 것으로 확인하였다. 반웅흔합물은 물로 세척한 후 유기층을 분리하여 농 축하였다. 다시 아세토나이트릴 (1 에 녹여 재결정하여 8 mg의 최종 생성물을 얻 었다. 수율: 57%. 질량스펙트럼 (ESI+),(M+H+): 886.6.
<107>
<108> <실시예 2> N0TA-SCN-스테아릴아민의 합성
<109> 2— (P-이소치오시아나토벤질) -1,4, 7-트리아자시클로노난 -1,4,7-트리아세트산 (
N0TA-SCN, 0.020 g, 0.04 mmol)을 클로로포름 (1 )에 녹이고 TEM0.012 ιύ, 0.09 mmol)을 가하여 실온에서 저어 주었다. 스테아릴아민 (0.014 g, 0.05 難 ol)을 반웅 흔합물에 가하고 20시간 동안 실은에서 저어 주었다. 반웅 종결은 질량분석으로 N0TA-SCN 피크가 없어지고 N0TA-SCN-스테아릴아민 피크가 나타나는 것으로 확인하 였다. 에테르 (3 ml X 2)에서 2 회 재결정하여 26 mg의 최종 생성물을 얻었다. 수 율: 72%. 질량스펙트럼 (ESI+),(M+H+): 720.5. <ιιι> <실시예 3> D0TA-SCN-스테아릴아민의 합성
<ιΐ2> 2- ( P-이소치오시아나토벤질) - 1 , 4, 7 , 10-테트라아자시클로테트라데칸-
1,4,7,10-테트라아세트산([)^7\- ^ 0.020 g, 0.04 mmol)을 클로로포름 (1 m£)에 녹 이고 TEA(0.015 mi, 0.10 mmol)을 가하여 실온에서 저어 주었다. 스테아릴아민 (0.015 g, 0.06 mmol)을 반응흔합물에 가하고 하룻밤 저어 주었다. 반웅 종결은 질 량분석으로 SCN-D0TA 피크가 없어지고 SCN-D0TA-스테아릴아민 피크가 나타나는 것 으로 확인하였다. 에테르 (3 mt X 2)에서 2회 재결정하여 23 mg의 최종 생성물올 얻었다. 수율: 77%. 질량스펙트럼 (ESI+),(M+H+): 821.5.
<113>
<114> <실시예 4> 락토즈-스테아릴아민의 합성
<U5> 스테아릴아민 (0.020 g, 0.07 瞧 ol)을 MeOH(2 ιη·0에 녹이고 여기에 물 (5 mi)
에 녹인 α-락토즈 (0.267 g, 0.74 麵 ol)을 가하여 0 °C에서 잘 섞어 준 다음, MeOH(l )과 초산 (4 에 녹인 소디움 시아노보로하이드라이드 (0.007 g, 0.11 mmol)를 한 방을씩 가하면서 잘 저어 주었다. 반웅 종결은 질량분석으로 락토즈 피 크가 없어지고 락토즈-스테아릴아민 피크가 나타나는 것으로 확인하였다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피 (2 X 5 cm, 핵산 /에틸아세테이트)로 분리하여 30 mg의 최종 생성물을 흰색 고체 형태로 얻었다. 수율: 68%. 질량스펙트럼 (ESI+),(M+H+): 596.4.
<116>
<117> <실시예 5>만노즈-스테아릴아민의 합성
<ιΐ8> α-D—만노피라노실 -페닐이소치오시아네이트 (0.014 g, 0.04 mmol)을 클로로포 름 (2 에 녹이고 TEA 0.012 mi, 0.09 睡 ol)을 가한 다음 스테아릴아민 (0.012 g, 0.04 mmol)을 가하고 실온에서 잘 저어 주었다. 반웅이 진행됨에 따라 흔탁한 반웅 액이 맑게 변했다. 15시간 동안 저으면서 반웅한 다음 질량분석으로 α-D-만노피라 노실—페닐이소치오시아네이트 피크가 없어지고 만노즈-스테아릴아민 피크가 나타나 는 것으로 반웅종결을 확인하였다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 (2 X 5 cm, 핵 산 /에틸아세테이트) 분리하여 26 mg의 최종 생성물을 크림색 고체 형태로 얻었다. 수율: 77%. 질량스펙트럼 (ESI+),(M+H+): 583.4.
<Π9>
<120> <실시예 6>로다민-스테아릴아민의 합성
<121> 로다민 Β-이소치오시아네이트 (0.015 g, 0.03 mmol)을 클로로포름 (1 )에 녹 이고 TEA(0.012 ml, 0.08 mmol)을 가하여 30분 동안 실온에서 저어 주었다. 스테아 ¾¾ΜΓϋ.ϋ13 g, ϋ.04 mmol)을 반웅혼합물^가하 π5자 Γ Τ겨 ^면저 만응 켰다. 반응 종결은 질량분석으로 로다민 피크가 없어지고 로다민—스테아릴아민 피 크가 나타나는 것으로 확인하였다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피 (2 X 5 cm, 핵산 /에틸아세테이트)로 분리정제하여 16 mg의 적포도주색 고체의 최종 생성물을 얻었 다. 수율: 74%. 질량스펙트럼 (ESI+),(M+H+): 769.5. <123> <실시예 7> 인도시아닌그린-스테아릴아민의 합성
<124> 시아뉴릭 클로라이드 (5 mg, 0.0271 瞧 οθ를 TEA(10 i , 0.0813 隱 ol)에 녹이 고 얼음 /소금조에서 고체가 생길 때까지 약 20분간 교반 한 후, 메틸렌클로라이드 (0.2 )를 반웅흔합물에 가하여 고체를 녹이고 인도시아닌그린 (22.5 mg, 0.0271 mmol)과 스테아릴아민 (7.5 mg, 0.0271 讓 ol)올 가하여 얼음 /소금조에서 30분 더 저 어주었다. TLC로 생성물을 분석하고 실리카겔 칼럼 크로마토그라피를 수행하여 분 리정제하였다. 수율: 56%(15 mg). Mass spectrum(ESH) , (M+MeCN+): 1044.62.
<125>
<126> <실시예 8> PEG결합 QD655 양자점의 제조
<127> 종래의 트원 60(Tween 60; 시그마 -알드리치)은 친수성 PEG 머리에 소수성 스 테아릴기가 결합한 계면활성제이고, 양자점인 QD655와 QD545는 인비트로젠 (Carlsbad, CA, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다.
<i28> QD655(100 pmol)를 불활성기체 환경에서 증발시켜 용매를 제거한 후ᅵ 트원
60의 4¾ 수용액 2 ^를 건조한 QD655와 섞은 다음 하룻밤 동안 70 °C로 가열하면서 섞어 주었다. 상기 반웅흔합물은 시그마-알드리치에서 구입한 세파크릴 (Sephacryl
)S-300 HR 칼럼 (V0=7.5 ι , Vd=20 )으로 붕산완층액을 홀려서 분리하였다. 상기 분획은 플루오로미터와 흡광분광계로 측정하였다.
<!2 > 코팅된 양자점 용액은 을트라필트레이션 (Ami con Ultracel— 100 kDa cutoff)으 로 농축하였고, 최종 농도는 UV-가시광선 홉광도로 결정하였다. 분리한 코팅된 양 자점의 수력학적 반경과 크기 분포는 다이나믹 라이트 스캐터링 (DLS, Malvern
Zetasizer Nano ZS90 system, Marlvern Instrument Ltd. , U.K.)과 투과전자현미경
(TEM, JRM-1400, JE0L, Japan)으로측정하였다.
<130> 다아나믹 라이트 측정은 코팅된 양자점 용액을 중류수로 회석하고 1분 동안 소니케이션 한 다음 실시하였으며, 25 °C에서 90° 각도로 산란되어 나오는 부피-퍼 센트로부터 입자의 크기와 분포를 구하였다.
^ ^ 네거티브-스테인 TEM 영상을 ^ᅵ기 위 ?팅된 구리 리ᄃ엔—-코 ¾ L
양자점 용액을 한 방을 떨어뜨린 후, 우라닐 아세테이트 포화용액으로 염색한 다음 가속 전압을 80 keV로 하여 촬영하였다.
<132>
<133> <실시예 9> PEG결합 QD545 양자점의 제조
<134> QD545(100 pmol)을 불활성기체 환경에서 증발시켜 용매를 제거한 후, 클로로 포름 (50 ^)에 현탁시키고, 6¾의 트원 60 수용액 (2 을 넣어 준 후, 70 °C에서 3 시간 동안 강력하게 교반 하였다.
<135> 상기 반웅혼합물의 분리 정제, 농도측정, 수력학적 반경 및 크기분포 측정은 코팅된 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하였다.
<136>
<137> <실시예 10> RGD-QD655의 제조
<138> 상기 실시예 8에서 4% 트원 60을 사용하는 대신, 상기 실시예 1에서 제조된
RGD-스테아릴아민을 5 mol% 포함하는 4% 트원 60 수용액 2 ^올 사용하여 상기 실 시예 8과 동일한 방법으로 QD655에 코팅하고 분리하여 RGD-QD655를 제조하였다.
<139>
<140> <실시예 11> NOTA-QD655의 제조
<141> 상기 실시예 8에서 4% 트원 60을 사용하는 대신, 상기 실시예 2에서 제조된
N0TA-스테아릴아민을 2 mol%로 포함하는 4¾ 트원 60 수용액 2 1 을 사용하여 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 QD655에 코팅하고 분리하여 NOTA— QD655을 제조하였다.
<142>
<143> <실시예 12> N0TA-RGD-QD655의 제조
<144> 상기 실시예 8에서 4% 트원 60올 사용하는 대신, 상기 실시예 1에서 제조된
RGD-스테아릴아민 5 π )1¾와 상기 실시예 2에서 제조된 SCN-NOTA-스테아릴아민을 2 mol 포함하는 4% 트원 60 수용액 2 을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 8 과 동일한 방법으로 QD655에 코팅하고 분리하여 N0TA-RGD-QD655를 제조하였다.
<145>
<146> <실시예 13> Lac-QD545의 제조
<!47> 상기 실시예 8에서 6% 트원 60을 사용하는 대신, 상기 실시예 4에서 제조된 락토즈-스테아릴아민을 5 mol% 포함하는 6% 트원 60 수용액 2 ^을 사용하는 것올 제외하고는 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 QD545에 코팅하고 분리하여 Lac- QD545를 제조하였다.
<148>
^T49^- 실시예 U> MarFQDeSS하겨†¾
<i50> 상기 실시예 8에서 4% 트원 60을 사용하는 대신, 상기 실시예 5에서 제조된 만노즈-스테아릴아민을 2 mol 포함하는 4¾ 트원 60 수용액 2 을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 QD655에 코팅하고 분리하여 Man— QD655를 제조하였다.
<151> <152> <실시예 15> N0TA-Man-QD655의 제조
<i53> 상기 실시예 8에서 4% 트원 60을 사용하는 대신, 상기 실시예 2에서 제조된
N0TA-스테아릴아민을 2 mol% 포함하고, 실시예 5에서 제조된 만노즈-스테아릴아민 을 5 mol% 포함하는 4% 트원 60 수용액 2 ^을 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 QD655에 코팅하고 분리하여 N0TA-Man-QD655를 제조하였다.
<154>
<155> <실시예 16> N0TA-Lac-QD545의 제조
<156> 상기 실시예 8에서 6% 트원 60을 사용하는 대신, 상기 실시예 2에서 제조된
N0TA-스테아릴아민을 2 mol% 포함하고, 실시예 4에서 제조된 락토즈—스테아릴아민 을 5 mol% 포함하는 6% 트원 60 수용액 2 ^를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실 시예 8과 등일한 방법으로 QD545에 코팅하고 분리하여 NOTA— Lac-QD655를 제조하였 다.
<157>
<158> <실시예 17> 로다민 -산화철나노입자의 제조
<159> 산화철 나노입자 5 mg을 2 ml 유리바이알에 넣고 1 ^의 클로로포름을 가한 다음 5분간 초음파를 가하여 잘 분산시켰다. 상기 실시예 6에서 제조된 로다민-스 테아릴아민 5 mol%를 포함하는 4% 트원 60 수용액 2 m£을 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 산화철나노입자에 코팅하고, 아미콘 필터로 분리하여 로다민 -산화철나노 입자를 제조하였다.
<160>
<161> <실시예 18> NOTA-Man-산화철나노입자의 제조
<ΐύ2> 상기 실시예 2에서 합성한 N0TA-SCN-스테아릴아민 2 mol¾와 실시예 5에서 제 조된 만노즈-스테아릴 아민 2 mol%를 포함하는 8% 트원 60 용액을 80 °C로 가열하 고 여기에 산화철 나노입자의 클로로포름 분산액 (5 mg/mL) 0.1 ^를 떨어뜨린 다음 30분동안 초음파를 가하여 분산시킨 다음 80 °C에서 한시간 더 가열한 후, 다시 1 시간 더 초음파를 가하여 분산시켰다. 반응혼합물을 세파크릴 S500(Sephacryl 5 ϋθ) 컬럼을 통과시켜 분리 성제하여 NOTA-Man—산화철나노입자를 세조하었다.
<163>
<164> <실험예 1> 안정성시험
<165> 상기 실시예 8 내지 17에서 제조된 코팅된 양자점을 4 t에서 한 달 동안 보 관하면서 총 형광강도를 측정하였고, 또한 DLS(Dynamic light scatter ing;입경측 정)를 측정하여 입자의 크기를 측정하였으며, 투과전자현미경인 TEM으로 입자의 형 태를 관찰하였다.
<166> 그 결과 총 형광광도와 입자크기의 변화가 없어서 안정함을 알 수 있었다. <167>
<168> <실험예 2> 방사성동위원소 표지 실험
<169> 상기 실시예 2에서 제조된 N0TA-SCN-스테아릴아민을 2 mol% 포함하는 트원
60으로 코팅한 실시예 11의 양자점 (NOTA-QD655, 50 nM, 100 에 2 M 초산나트튬 완충액 (300 id, pH 5.2)을 가하고 잘 섞어 준 후, 6 aCI3(in 0.5 l of 0.1 M HC1,
300-500 MBq)를 첨가하여 47 °C에서 25분 동안 반웅을 수행하였다. 표지 효율은 인스턴트 얇은 막 크로마토그래피―실리카겔 (ITLC—SG; instant thin layer chromatography)를 0.1 M 구연산용액으로 전개하여 측정하였다.
<170> 그 결과, 표지 되지 않은 6¾a은 용매 전단부까지 올라갔고, 표지 된 양자점 은 원점에 남아 있는 것을 확인하였고, 표지효율은 98%이상으로 나타났다. 표지 된 양자점은 NAP-10 칼럼 (GE Healthcare, U.S.A.)을 이용하여 생리식염수를 홀려주어 분리하였고, 방사능은 아미콘 (Ami con) 여과장치를 이용하여 농축하였다. 분리 후 방사 화학적 순도는 99¾보다 높게 나타났다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
<171>
<172> <실험예 3> 방사성동위원소 표지된 양자점의 안정성 실험
<173> 상기 실험예 4의 방사성 동위원소가 표지 된 양자점의 안정성을 확인하기 위 하여 하기 실험을 수행하였다.
<i74> Ga-68로 표지 된 6 a-N0TA-QD655 양자점을 PBS(pH 7.2-7.4, 0.5 m£)에 녹여 실온에 2시간 동안 안정성을 측정하고, 사람 혈청 (0.5 m ^에 녹여 37 °C에서 2 시 간 동안 안정성을 측정하였다. 안정성 측정을 위한 방사 화학적 순도 측정은 실험 예 2의 ITLC-SG조건으로 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
<175>
<176> 도 3에 나타낸 바와 같이, PBS (실온)에서는 2시간 후에 97%가 넘고 사람 혈 청 (37 °C)에서는 2시간 후에 96%가 넘는 안정성을 나타내었다.
<177> 이는 6¾a-N0TA-QD655를 실온에서 두었을 때와 혈청에 넣어 37 °C에서 배양 하였을 때에 관계없이 안정한 것으로 확인되었다.
<!78>
<179> <실험예 4> 시험관 내 동위원소표지 양자점 결합실험
<|80> 본 발명에 따른 실시예 10의 RGD가 코팅된 양자점이 ανβ3 인티그린에 결합 하는지 확인하기 위하여 Ga-N0TA_RGD-QD655와 Ga-N0TA-QD655를 U87MG (사람 글리 오마 세포, ανβ3 발현 강함), Α431(사람 편평상피종, ανβ3 발현 약함), MCF-7( 사람 유방암세포 ανβ3 발현 약함)과 결합실험을 수행하였다.
<ΐ8ΐ> 상기 각각의 세포돌을 둘베코의 인산염완층 -생리식염액 (Dulbeco's Phosphate
Buffered Saline; DPBS)로 세척하고, 세포결합 실험용 완층액 (pH 7.4, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2> 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 0.1%(wt/vol) 우혈청알부민)으 로 한 번 더 세척하였다. 각 세포들은 0.37 MBq의 각각의 표지 된 양자점을 포함한 세포결합 실험용 완충액 (1 과 5% 이산화탄소 존재하에 37 °C에서 15분간 반웅을 수행하였다.
<182> 실시예 10의 RGD 결합 양자점이 선택적으로 세포에 섭취가 되는지를 확인하 기 위하여 cRGDyK(10 μΜ)를 포함하고 있는 6 a-NOTA-RGD-QD655도 같이 반웅시켜 블로킹 연구도 병행하였다. 상기 배양액올 제거하여 세포섭취를 증단시키고 냉각시 킨 DPBS로 3회 세척하였다. 1% SDS 용액 (0.5 Hi Aell)으로 세포를 녹여 내어 감마 카운터로 방사능을 측정하였다. BCA(BCA Protein assay kit, Pierce) 방법으로 단 백질 양을 측정하여 방사능 섭취량을 단백질 mg당 섭취율로 표준화하였다. 그 결과 를 표 1 및 도 4에 나타내었다.
<183> 【표 1】
Figure imgf000017_0001
<184> 상기 표 1 및 도 4에 나타낸 바와 같이 , Ga-N0TA— RGD-QD655는 o — 3
그린을 발현하는 U87MG 세포에만 결합하는 것으로 나타났고, 다른 세포에는 결합하 지 않는 것으로 나타났으며, 이를 cRGD로 블로킹하였을 때는 U87MG 세포에도 결합 하지 않는 것으로 나타났으나, 58Ga-NOTA-QD655는 어떠한 세포주에도 결합하지 않는 것으로 나타났다.
<185> <186> <실험예 5> 시험관 내 양자점 세포 형광 염색 실험
<187> 본 발명에 따른 양자점에 대한 콘포칼 영상을 얻기 위하여 실험하기 하루 전 날 8—웰 유리 챔버 슬라이드 (Lab-Tek Chamber Slide System, Nalge Nunc Interantional)에 1.5x104 eel 1 /chamber씩의 세포를 깔아 주었다.
<188> 세포가 안정화된 후 , 따뜻한 세포결합 실험용 완충액으로 세척하여 주고 , 실 시예 8의 PEG-QD655 또는 실시예 10의 RGD-QD655를 50 nM씩 포함한 세포결합용 완 층액 200 ^씩을 가하여 15분 동안 반웅시켰다. 세포결합 완층액을 제거하여 결합 반웅을 종결시키고 넁각한 DPBS로 3회 세척하였다, 세포는 3.7¾ 파라포름알데히드 용액으로 고정한 다음 DAPI 용액으로 마운팅 하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었 다.
<189>
<190> 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 10의 RGD-QD655는 ανβ3 인티그린을 발현 하는 U87MG 세포에만 결합하는 것으로 나타났고, 실시예 8의 PEG-QD655는 어떠한 세포에도 결합하지 않는 것으로 나타났으나, 실시예 10의 RGD-QD655는 cRGDyK에 의 하여 U87MG 결합이 블로킹 되었다.
<191>
<192> <실험예 6> 체외 양자점 조직형광염색 실험
<1 3> U87MGC2X105 cells/0.1 m ) 세포를 Balb/c 누드마우스의 한쪽 대퇴부에 피 하주사하여 종양모델을 만들었다. 종양의 크기가 1 cm3 이상이 되었을 때 종양 조직 을 -20 °C에서 7 μηι의 냉동 절편올 만들어서 슬라이드 글라스에 붙이고 아세톤으 로 -20 °C에서 20분간 고정하였다. 10%(v/v) 우태아 혈청에 실온에서 30분간 배양 하고, 실시예 10의 RGD-QD655(30 nM, 100 )를 가하여 4 'C에서 하룻밤 배양하여 형광염색하였다. 실시예 10의 RGD-QD655를 결합하기 전에 cRGdyK(500 nM)를 1분 전 에 가하여 블로킹 실험도 하였다. 공초점 현미경에서 세포핵을 관찰하기 위하여 DAPI 용액으로 마운팅하였다. QD655는 488 nm 그리고 DAPI와 QD545는 405 nm의 레 이저로 스캔닝히여 .포¾ 영상을 얻었다. 그 결파를 도 6에 나타내었다ᅮ
<194>
<195> 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 10의 RGD-QD655는 ανβ3 인티그린을 발현 하는 U87MG 종양조직에 결합하는 것으로 나타났다 (a). 반면, 실시예 8의 PEG-QD655 는 결합하지 않았으나 (b), 실시예 10의 RGD-QD655는 cRGDyK에 의하여 U87MG 결합이 블로킹 되는 것으로 나타났다 (c).
<196> <197> <실험예 7> 체내 양자점 조직형광염색 실험
<198> U87MG(2X105 cells/0.1 m ^와 A431(lxi07 cells/0.1 mi) 세포를 양쪽 대퇴 부에 피하주사하여 종양을 만든 Balb/c 누드마우스에 실시예 8의 RGD-QD655(120 nM, 0.1 m£)을 꼬리정맥으로 주사하였다. 음성 콘트를로는 실시예 8의 PEG- QD655C127 nM, 0.1 )을 주사하였다. 투여한 지 1 시간 후에 마우스를 회생시킨 다음 장기를 적출하여 노란색 필터를 사용한 입사광을 이용하여 마에스트로 이미징 시스템 (Maestro imaging system)올 이용하여 형광영상을 얻었다.
<199> 또한, 종양을 OCT 미디엄 (Tissue-Tek O.C.T. compound, Sakura, Finetek)에 넣어 7 μηι 두께의 냉동 절편을 얻어서 슬라이드글라스에 붙이고 3.7%(v/v) 파라포 름알데히드 용액으로 고정한 다음 DAPI 용액으로 마운팅하여 콘포칼 현미경으로 관 찰하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
<200>
<201> 도 7에 나타낸 바와 같이 , 실시예 10의 RGD-QD655를 정맥주사시, ανβ3 인 티그린을 발현하는 U87MG 종양조직에 섭취되었지만, 발현하지 않는 A431 종양조직 에는 섭취되지 않는 것으로 나타났으며, 실시예 8의 PEG-QD655는 어떠한 종양 조직 에도 섭취되지 않았다.
<202>
<203> <실험예 8> 동위원소 표지 양자점 PET
<204> 상기 실험예 2와 같이 Ga-68을 표지한 58Ga-N0TA-RGD-QD655(30~40 MBq in
0.1 mi normal saline)를 U87MG 암세포를 키운 마우스에 꼬리정맥을 통한 정맥주 사를 하고 1 시간 후에 아이소플루란으로 마취한 다음 PET을 촬영하였다. 블로킹 연구를 위하여.는 CRGDyK(l mM)을 동시에 주사하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었 다.
<205>
<206> 도 8에 나타낸 바와 같이 , 실시예 10의 RGD-QD655를 정맥주사시 ανβ3 인티
그^음 밤혀하는 U87MG 종양조직에 섭취되는 ^ :^인하였고, 발 ^^는 종양조직에는 섭취되지 않았고, 정상조직 중에는 주로 간에 섭취되는 것이 나타났 다 (a). cRGDyK를 같이 주사한 경우에는 두 종양조직에 모두 섭취되지 않고 간에만 섭취하는 것으로 나타났다 (b).
<207>
<208> <실험예 9> 뒷다리 허혈 모델 마우스의 RDG-QD655의 체내 결합 실험
<209> 본 발명에 따른 실시예 10의 RGD-QD655 양자점의 허혈성 조직에서 발현되는 ανβ3 결합 유무를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
<210>
<2ΐι> 10주 된 ICR 마우스의 왼쪽 대퇴동맥을 묶어서 뒷다리에 허혈 모델을 만들었 다. 묶은지 1주일 후 실시예 10의 RGD-QD655(50 nM, 0.15 을 꼬리 정맥으로 정 맥주사 한 후, 허혈을 만든 대퇴부의 근육과 반대쪽 대퇴부의 근육올 잘라내어 마 에스트로 이미징 시스템 (Maestro Imaging Systme)으로 형광을 관찰하였다.
<212> 또한, 조직을 냉동절편 (7 μηι)을 얻어 DAPI 염색을 하여 형광현미경으로 관 찰하였고, 음성 콘트를로는 실시예 8의 PEG-QD655를 사용하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
<213>
<214> 도 9에 나타낸 바와 같이 , 실시예 10의 RGD-QD655를 정맥주사 후 근육을 잘 라서 마에스트로 이미징 시스템으로 형광을 관찰한 결과, 허혈을 유발한 근육 (a)이 정상근육 (b)보다 높은 섭취를 보이는 것으로 나타났다. 이는 허혈을 유발한 조직에 신생혈관이 형성되면서 ανβ3 인티그린이 발현됨을 보여준다.
<215> 또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 허혈을 유발한 근육과 정상근육을 형 광현미경으로 관찰한 결과, 허혈을 유발한 조직 (a, b, c)이 허혈을 유발하지 않는 조직 (d, e, f)보다 더 진한 형광으로 나타나는 것으로 관찰되었다.
<216> 이때, a 및 d는 형광과 DAPI 영상을 겹친 것이고, b 및 e는 형광영상, 그리 고 e 및 f는 DAPI 영상을 나타낸다.
<217>
<2i8> <실험예 10> 6 a-N0TA-Man-QD655와 68Ga-N0TA-Lac-QD545를 투여한 정상 마우 스의 PET 영상
<219> 간과 비장에는 만노스 수용체를 가진 쿠퍼 세포가 많이 존재하고, 간세포에 는 갈락토즈 수용체가 많이 존재하여 만노스를 결합한 나노입자는 간과 비장에 많 이 섭취되고 갈락토즈를 결합한 나노입자는 간에 많이 섭취되는 것이 보고되어 있 으며, 또한 락토즈는 갈락토즈를 포함하고 있으므로 락토즈를 결합한 나노입자도 간에 많이 섭취되는 것이 보고되어 있어, 본 발명에 따른 6¾a-N0TA-Man-QD655와
68Ga-N0TA-Lac-QD545 양자점을 투여한 마우스의 PET 영상을 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
<220> 상기 실시예 15 및 16에서 제조된 N0TA-Man-QD655와 N0TA-Lac-QD655를 실험 예 2의 방법으로 Ga-68로 표지한 다음, 68Ga-NOTA-Man-QD655(10.36 MBq/0.15 m£)과 Ga-N0TA-Lac-QD545(14.8 MBq/0.08 를 정상 ICR 마우스의 꼬리 정맥으로 주사하 고 30분 후에 PET-CT를 촬영하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
<221>
<222> 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 6 a-N0TA-Man-QD655 및 5 a-
N0TA-Lac-QD545를 주사한 마우스의 PET과 CT 영상을 겹쳐서 확인한 결과, 6 a-
N0TA-Man-QD655는 간과 비장에 섭취되는 것을 확인되었고 (a), 6¾a-N0TA-Lac-QD545 는 주로 간에 섭취가 많이 되고, 비장에는 섭취가 낮은 것을 확인할 수 있었다.
<223>
<224> <실험예 11> N0TA-Man-QD655와 N0TA_Lac-QD545를 동시 투여한 정상 마우스의 간과 비장조직 형광 현미경 관찰
<225> 상기 실시예 13 및 14에서 제조된 Man-QD655(70 nM, 30 와 Lac-QD545(70 nM, 120 )를 혼합하여, 6주 된 정상 ICR 마우스에 꼬리정맥으로 정맥주사하고 20 분 후에 회생시켜, 간과 비장을 적출하여 OCT 컴파운드에 넣어서 -20 °C에서 넁동 한 다음 7μιη 두께의 넁동 절편을 만들고 DAPI 용액으로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
<226>
<227> 도 12에 나타낸 바와 같이, 푸른색 DAPI는 간 세포핵의 분포를 나타내고, 초 록색 Lac-QD545는 간의 대부분을 차지하는 간세포에 의하여 섭취되었지만, 비장에 는 섭취되지 않는 것으로 나타났다. 또한, 붉은색 Man-QD655는 간세포에 비하여 훨 씬 적은 쿠퍼세포에 의하여 섭취가 되었음을 보여준다.
<228>
<229> 따라서 본 발명에 따른 나노입자는 형광탐지, MRI, 라만 분광, 광학탐지,
PET, SPECT또는 감마영상 장치에 적용될 수 있고, 상기 영상화제의 리간드를 변화 시켜 신생혈관탐지, 암세포 탐지 , 면역세포 탐지 , 간세포 탐지 , 세포사멸 탐지 , 유 전자 탐지에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】 【청구항 11 하기 화학식 1로 표시되는 알칸또는 알켄사슬이 도입된 리간드 (R-A-L)의 알 킬부분 (R)이 소수성 나노입자 표면에 비공유결합을 통해 코팅된 나노입자:
[화학식 1]
R-A-L
화학식 1에서,
상기 L은 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물 질, 당, 킬레이트화제 및 형광염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드이고; 상기 A는 CH2-, -CH=, -C≡, -N -, -NH -, -N=, -0-, -S-, -CS-, -CO-,
-P04H -, -Ρ03Η-, -P02H- 및 -벤젠-의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 이고; 및
상기 R은 C10~C30의 알칸 또는 알켄이고;
이때, R이 알켄인 경우, 사슬 중에 이중결합을 5개 이하로 포함할 수 있다.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 L은 RGD, 콜레시스토키닌, 뉴로텐신, EGF, VEGF, MMP( 메트릭스 메탈로프로테이네이즈; matrix metal loproteinase) , 옥트레오타이드, 봄 베신, TN14003, VIP (혈관활성 장내 펩타이드; vasoactive intestinal peptide), MSH (멜라닌세포자극호르몬; melanocyte stimulating hormone), 서브스턴스 P (통증 유발물질; Substance P), 라이신 글루타메이트 유레아, 시스테인 글루타메이트 유 레아, 항체, 항체의 분절, 앱타머, 엽산, 비오틴, NOTA, DOTA-SCN, N02A, D02A, D03A, DTPA, HYNIC, 이미노다이아세테이트 유도체 또는 이들의 Ga_68, Ga-67, In- Ill, Y-90, Lu-177, Tc-99m, Cu-64, 1-123, .1-124, 1-131, Zr-89, Sc-44, Gd 표지 화합물, 갈락토즈, 락토즈, 만노즈, 로다민, 인도시아닌그린, Cy3, Cy3.5, Cy5丄 Cy5.5, Cy7, Cy7.5, 알렉사 플로어 (Alexa Fluor), 오레곤 그린 (Oregon Green), 퍼 시픽 블루 염색제 (Pacific Blue dye), IRDye로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 3]
제 1항에 있어서, 상기 소수성 나노입자는 주기율표상의 Π족 원소인 아연, 카드뮴 및 납 중의 1 원소와 주기율표상의 VI족 원소인 황, 셀레늄 및 텔루륨 중의 1 원소로 구성되는 반도체 나노입자, 금속 나노입자 및 금속화합물 나노입자, 실리 콘 또는 실리콘 화합물 나노입자, 인조유기폴리머 나노입자, 덴드리머 나노입자, 폴리라이신 나노입자, 키토산 나노입자, 당 나노입자 또는 이들의 조합으로 만들어 진 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 나노입자는 PEG 유도체 및 하나의 긴 알칸 또는 알켄 사슬을 포함한 디터전트의 알칸 또는 알켄 부분이 소수성 나노입자 표면에 비공유 결합을 통해 더 코팅되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 5]
유기용매에 녹아 있는 소수성 나노입자를 유기용매를 제거하거나 있는 그대 로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물과 PEG유도체 및 하나의 긴 알칸 또는 알켄사 슬을 포함한 디터전트를 포함한 수용액과 흔합하고, 교반, 가열 및 초음파 조사의 용해 수단을 선택적으로 또는 복합적으로 적용하여 분산시키는 단계를 포함하는 하 기 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킬부분 (R)이 비공유 결합을 통해 표면에 코팅 된 나노입자의 제조방법 :
[화학식 1]
R A-L
(상기 화학식 1의 R, A 및 L은 제 1항에 정의한 바와 같다).
【청구항 6】
제 5항에 있어서, 상기 소수성 나노입자는 주기율표상의 Π족 원소인 아연, 카드뮴 및 납 중의 1 원소와 주기율표상의 VI족 원소인 황, 셀레늄 및 텔루륨 중의 1 원소? 구성되는 반? 체 _나노 J¾^ ^^나노입자 금속화합물 나노입자, 실리 콘 또는 실리콘 화합물 나노입자, 인조유기폴리머 나노입자, 덴드리머 나노입자, 폴리라이신 나노입자, 키토산 나노입자, 당 나노입자 또는 이들의 조합으로 만들어 진 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 7]
제 1항의 나노입자를 이용한 영상화제 .
【청구항 8】
제 7항에 있어서, 상기 영상화제는 형광탐지, MRI, 라만 분광, 광학탐지,
PET, SPECT, 감마영상 장치에 적용되는 것을 특징으로 하는 나노입자를 이용한 영 상화제 .
【청구항 9】
거 17항에 있어서, 상기 영상화제는 리간드를 변화시켜 신생혈관탐지, 암세포 탐지, 면역세포 탐지, 간세포 탐지, 세포사멸 탐지 , 유전자 탐지에 적용되는 것을 특징으로 하는 나노입자를 이용한 영상화제 .
【청구항 10]
알파선이나 베타선올 방출하거나, 외부에서 가하는 초음파나 전자기파 또는 입자성 방사선을 홉수하여 열 또는 2차 방사선을 방출하여 악성세포를 사멸하는 것 을 특징으로 하는 제 1항의 나노입자를 이용한 치료제 .
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