JP2941057B2

JP2941057B2 - 血栓造影用のテクネチウム‐９９ｍ標識ペプチド

Info

Publication number: JP2941057B2
Application number: JP6503844A
Authority: JP
Inventors: ディーン，リチャード・ティ; リスター−ジェイムズ，ジョン
Original assignee: Diatek Inc
Current assignee: Diatek Inc
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1993-05-21
Publication date: 1999-08-25
Anticipated expiration: 2014-08-25
Also published as: ES2150945T3; JPH10291939A; EP0641222A1; JPH07508289A; JP3380738B2; AU4384593A; CA2136330C; ATE196094T1; DK0641222T3; CA2136330A1; WO1993023085A1; DE69329382D1; ATE329624T1; AU677208B2; US5925331A; EP1004322B1; EP1004322A3; EP0641222B1; DE69334033D1; EP1004322A2

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景 1.発明の分野本発明は、放射線診断試薬および標識放射線診断剤の
製造に関する。さらに詳しくは、本発明は、テクネチウ
ム−99m（Tc−99m）で標識しうる試薬、かかる試薬を製
造し放射線標識する方法およびキット、ならびにかかる
試薬を用いて哺乳動物体内の血栓形成部位を造影する方
法に関する。

2.関連技術の説明血栓症及び血栓塞栓症、特に深静脈血栓症（DTV）お
よび肺塞栓症（PE）は、重篤な病状ならびに死亡に連が
る一般的な臨床状態である。合衆国においては、年に約
500万人の患者が１またはそれを超えるDTV罹病を経験
し、500,000を超えるケースのPEが発生し、その結果10
0,000人が死亡していると見積もられた（ジェイ、シー
ボウルド（J.Seabold）、ソサイエティー・オブ・ニュ
ークレア・メディシン・アニュアル・ミーティング・19
90（Society of Nuclear Medicine Annual Meeting 199
0））。また、早期のDTVから発生する全ての肺塞栓症は
90％を超えるとも見積もられている。幸いなことには、
抗凝固治療を十分に早期に適用した場合にはこれらの状
態が治療されうる。しかしながら、かかる治療は不必要
な予防適用を排除する危険（例えば、内出血）を伴う。
（組換え組織プラスミノーゲン活性化因子またはストレ
プトキナーゼのごとき）さらに進歩した血栓技術を急篤
な場面に用いることができるが、これらの技術でさえ大
きな危険を伴う。さらに、これらの技術を効果的に臨床
適用することは、治療効果をモニターできるよう、進行
する血栓部位を同定することを要する。

これらの理由により、イン・ビボ（in vivo）で血栓
を局在する迅速な手段、最も好ましくは、非侵入的方
法、が大変望ましい。血栓部位を同定するのに利用され
ている最近の方法は、コンスタント静脈造影（constant
venography）および圧縮Ｂ−モード超音波（compressi
on B−mode ultrasound）であり；どの技術を用いるか
の選択は、血栓の予想位置による。しかしながら、前者
の技術は侵入性であり、双方の技術とも患者にとって不
快である。加えて、これらの方法は数々の場合におい
て、不適か不明確な結果を得るかである。

核薬剤の分野では、（放射線トレーサーまたは放射性
薬品と呼ばれている）放射線標識トレーサー化合物を少
量内部投与してその分布を検出することにより、ある種
の病理状態を局在し、またそれらの広がりを評価する。
これらの放射性薬品を検出する方法は、一般的に、造影
法または放射線造影法として知られている。

放射線造影において、該放射線標識はガンマ線放射放
射核であって、ガンマ線検出カメラを用いて放射線トレ
ーサーの位置を決定する（しばしば、このプロセスはガ
ンマ・シンチグラフィーと呼ばれている）。該放射線ト
レーサーが病理部位（陽性コントラストという）に局在
するか、または別法として、該放射性トレーサーがかか
る病理部位に特に局在しないか（陰性コントラストとい
う）のいずれかにより選抜されるので、造影部位が検出
できる。

ヒトの光学的な放射線造影には、多くの因子を考慮し
なければならない。検出効果を最大化するため、100な
いし200keV範囲でのガンマエネルギーを放射する放射性
核種が好ましい。患者への吸収放射線量を最小限にとど
めるため、該放射線核種の物理学的半減期は、造影工程
が許容する限りできるだけ短くすべきである。いつ何時
でも検査を行えるよう、臨床部位で常に利用できる放射
線核種源を有しておくことが有利である。

放射線造影に有用な種々の放射線核種が知られてお
り、⁶⁷Ga、^99mTc（Tc−99m）、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹⁶⁹
Ybまたは¹⁸⁶Reを包含する。140keVのガンマ線を放射
し、６時間の物理的半減期を有し、モリブデン−99/テ
クネチウム−99m発生機を容易に該部位に利用できるた
め、Tc−99mが特に好ましい放射性核種である。

放射線造影、特にガンマシンチグラフィーは、イン・
ビボの血栓の位置を検出する非侵入方法を提供する。イ
ン・ビボに投与した場合には他の組織に優先して、血栓
成分に特異的に結合するガンマ線放射性トレーサーは、
血栓に結合した放射性トレーサーの位置を特定し血栓を
増感させる外部シンチグラフィーを提供しうる。

血栓には、いくつかの潜在的な放射性トレーサーの標
的が存在する。血栓は赤血球、大きな血小板、網状に架
橋したフィブリンから構成される。静脈性血栓はフィブ
リンに富んでいる一方、動脈性血栓は血小板に富む。か
くして、フィブリンおよび血小板は、各々複数の可能性
のある標的部位を有する点において、血栓造影の放射性
医薬品設計の明白な標的である。

循環血液中には通常見い出されないため、活性化血小
板およびフィブリンが血栓放射線造影の標的として用い
られている；循環血液は、不活性化血小板および（フィ
ブリン前駆体である）フィブリノーゲンを含有する。血
栓形成は、フィブリノーゲンのフィブリンへの蛋白分解
的変換、ならびに不活性化血小板の活性化状態への生理
学的な変換を含有する。（その前駆体、フィブリノーゲ
ンに対して）血流にはフィブリンが循環しておらず、循
環血小板はほとんどが不活性化のものであるため、フィ
ブリンおよび活性化血小板は、血栓以外のイン・ビボで
はいずこにも実質量範囲が認められないので、血栓造影
の最良かつ特異的な標的である。

しかしながら、放射線造影用の放射線標識フィブリノ
ーゲンおよび放射線標識血小板の使用は多くの欠点を有
する。放射線標識フィブリノーゲンおよび血小板の血液
および背景組織の消失は遅く、そのため注射と造影の間
に長い遅延を要する。また、すでに血栓に存在するフィ
ブリンおよび血小板は老化した血栓においても標的であ
るにもかかわらず、血栓年齢としての放射線標識血小板
は非効率的な造影因子となる。

造影血栓用の放射線トレーサーを提供する試みは先行
技術で知られている。これらは、¹¹¹Inまたは^99mTc（Tc
−99m）のいずれかで標識した自家移植血小板、ならび
に、¹²³I−および¹²⁵I−標識フィブリノーゲン（ガンマ
カメラに対して、後者はガンマシンチレーション・プロ
ーブに暴露して検出する）を包含する。加えて、酵素
（例えば、トロンビン）、酵素前駆体および他の因子の
ごとき凝固系の他の血栓関連成分も、トレーサーの血栓
関連標的として有用であり得る。血栓標識に用いるさら
なる放射線標識化合物は、プラスミン、プラスミノーゲ
ン活性化因子、ヘパリン、フィブロネクチン、フィブリ
ン断片E₁ならびに抗−フィブリンおよび抗−血小板モノ
クローナル抗体を包含する（ナイト（Knight）、1990
年、セミナーズ・イン・ニュークレア・メディシン（Se
m.Nucl.Med.）、第20巻:52−67頁をレビュー参照）。

先行技術で公知の血栓放射線標識方法のうち、最も有
望とされている方法は、放射線標識血小板、放射線標識
抗体および放射線標識フィブリン断片E₁である。これら
全てが、ルーチン使用に関しては重大な欠点を有する。

血栓造影への放射線標識自家移植血小板の使用は、自
家移植血液を抜き出し、次いで、血小板分離して無菌条
件下に放射線標識（加えて、放射線標識は該血小板を活
性化させぬよう行なわなければならない）し、次いで、
放射線標識血小板を患者に最投与することを要する。か
かる放射線標識血小板は、長期の循環時間を有し、早期
には非標的に対する標的の比が小さいため、当該放射線
造影は24ないし72時間を経過した後にのみに行うことを
要する。さらに、新らしい血小板を効率良く取り込まな
い老化血栓は視覚化しにくい。

また、放射線標識抗−フィブリンモノクローナル抗体
および抗−血小板モノクローナル抗体も、先行技術にお
いて（典型的には、DTVを造影するために）用いられて
いる。かかる試薬を用いる欠点は、抗体が（抗体断片で
も）、遅い血液および一般組織消失特性を有し、最適造
影に少なくとも数時間の経過を要する点である。加え
て、免疫的試薬は、患者中で免疫反応を誘導する能力を
有する。さらに、かかる試薬は、哺乳動物細胞系（ハイ
ブリドーマ）から調製しなければならず、かくして感染
性のヒトウイルスが混入する危険を伴う。

放射線標識蛋白およびその蛋白分解断片を血栓造影に
用いる方法が、先行技術に記載されている。例えば、断
片E₁は、凝集物由来のフィブリンの蛋白分解断片がフィ
ブリンと架橋したものである。¹²³IおよびTc−99mで標
識して、ヒトの高品質造影を提供する。

オレキサ（Olexa）ら、1982年、欧州特許出願番号No.
823017009号は、架橋したフィブリンから単離したフラ
グメントE₁、架橋フィブリンから単離したフラグメント
E₂ならびにフラグメントE₁およびE₂の間の中間のアミノ
酸配列を有する蛋白分解断片、から選択される医薬上許
容される放射線標識蛋白分解物断片を開示している。残
念なことには、これらの蛋白断片は研究室的にヒト・フ
ィブリノーゲンから調製しなければならず、リーチン的
製造には不適としている。

ハドリー（Hadley）ら、1988年、PCT/US88/03318号
は、（ａ）患者に標識し弱毒化した血栓蛋白を投与し、そこ
で該標識がフィブリン結合ドメイン以外の血栓蛋白部位
に結合し；（ｂ）患者中の該標識血栓蛋白の分布パター
ンを検出する、段階よりなるフィブリン−血小板塊をイ
ン・ビボで検出する方法を開示している。

ソルベ（Sobel）、1989年、PCT/US/89/02656号は、酵
素的に不活性化させた放射線標識組織プラスミノーゲン
活性化因子を用いて動物中の１またはそれを超える血栓
位置を決定する方法を開示している。

血栓結合能を有するペプチドは、先行技術で公知であ
る。

ロスラーティ（Rouslahti）およびピアシュバッサー
（Pierschbacher）、米国特許第4,578,079号は、Ｘ−Ar
g−Gly−Asp−Ｒ−Ｙ（ここで、ΧおよびＹはＨまたは
アミノ酸であって、ＲはThrまたはCys）の配列のペプチ
ドを記載しており、該ペプチドはイン・ビボで血栓結合
能を有する。

ロスラーティ（Rouslahti）およびピアシュバッサー
（Pierschbacher）、米国特許第4,792,525号は、Arg−G
ly−Asp−Χ（ここで、ΧはSer、ThrまたはCys）の配列
のペプチドを記載しており、該ペプチドはイン・ビボで
血栓結合能を有する。

クライン（Klein）ら、1992年、米国特許第5,086,069
号は、活性化血小板の細胞表面上に見い出され、GP II
b/III aに結合するグアニン誘導体を開示している。

ピアシュバッサー（Pierschbacher）ら、1989年、PCT
/US88/04403号は、細胞が基底（substratum）に結合す
る、立体構造が限定されたRGD含有ペプチドを開示して
いる。

ホーウィガー（Hawiger）ら、1989年、PUT/US89/0174
2号は、蛋白の２つの結合部位の配列よりなるペプチド
に関する。

ナット（Nutt）ら、1990年、欧州特許出願第9020201
5.5号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状RGD
ペプチドを開示している。

ナット（Nutt）ら、1990年、欧州特許出願第9020203
0.4号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状RGD
ペプチドを開示している。

ナット（Nutt）ら、1990年、欧州特許出願第9020203
1.2号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状RGD
ペプチドを開示している。

ナット（Nutt）ら、1990年、欧州特許出願第9020203
2.0号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状RGD
ペプチドを開示している。

ナット（Nutt）ら、1990年、欧州特許出願第9031114
8.2号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ペ
プチドを開示している。

ナット（Nutt）ら、1990年、欧州特許出願第9031115
1.6号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ペ
プチドを開示している。

アリ（Ali）ら、1990年、欧州特許出願第90311537.6
号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ペプチ
ドを開示している。

バーカー（Barker）ら、1991年、PCT/US90/03788号
は、血小板凝集を阻害する環状ペプチドを開示してい
る。

ピアシュバッサー（Pierschbacher）ら、1991年、PCT
/US91/02356号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物であ
る環状ペプチドを開示している。

エバートソン（Egbertson）ら、1992年、欧州特許出
願第0478328A1号は、GP II b/III a受容体の高親和性で
結合するチロシン誘導体を開示している。

オジマ（Ojima）ら、1992年、第204回学会、アメリカ
ン・ケミカル・ソサイエティー・アブストラクト（204t
h Meeting,Amer.Chem.Soc.Abst.）、44は、血小板凝固
阻害に有用な合成多価重合マルチメリックRDGFペプチド
を開示している。

ハートマン（Hartman）ら、1992年、ジャーナル・オ
ブ・メディシナル・ケミストリー（J.Med.Chem.）、第3
5巻:4640−4642頁は、GP II b/III a受容体に高親和性
を有するチロシン誘導体を記載している。

血栓の放射線造影に有用な放射線標識ペプチドが技術
報告されている。

ランビー（Ranby）ら、1988年、PCT/US88/02276号
は、フィブリンに放射線標識化合物を共有結合させるこ
とよりなる、動物のフィブリン沈殿を検出する方法を開
示している。

スタットル（Stuttle）、1990年、PCT/GB90/00933号
は、イン・ビボでRGD結合部位に結合でき、配列アルギ
ニン−グリシン−アパスギン酸（RGD）よりなる３ない
し10アミノ酸を含有する放射性標識ペプチドを開示して
いる。

ロッドウェル（Rodwell）ら、1991年、PCT/US91/0311
6号は、「エフェクター・ドメイン（effector domai
n）」と「分子認識単位」との結合物を開示している。

マラガノア（Maraganore）ら、1991年、PCT/US90/046
42号は、（ａ）阻害基；（ｂ）リンカー基；および
（ｃ）「アニオン結合外部部位」結合基よりなる放射線
標識血栓阻害剤を開示している。

放射線標識ポリペプチドへのキレート剤の使用、なら
びにペプチドおよびポリペプチドをTc−99mで標識する
方法は先行技術で公知であり、（出典明示して本明細書
の一部とみなす）同時係属出願米国特許出願番号第07/6
53,012号、07/807,062号、07/871,282号、07/886,752
号、07/893,981号、07/955,466号、08/019,864号および
08/044,825号、ならびにPCT国際出願 PCT/US92/00757
号、PCT/US92/10716号、PCT/US93/02320およびPCT/US93
/_に開示されている。

イン・ビボでの血栓造影に用いる、Tc−99mで標識し
た（血液および背景組織の消失を向上させる）小さな、
（ルーチンに産業上実施でき、容易に調整できる）合成
分子の要望が未だ存在する。血栓成分に特異的に結合す
る、Tc−99mで放射線標識した小さな合成ペプチドは、
この要望を満たし、本発明により提供される。

発明の概要本発明は、シンチグラフィー造影剤である放射線標識
試薬を提供する。さらに詳しくは、本発明は、テクネチ
ウム−99m（Tc−99m）で放射線標識した血栓造影剤の製
造用試薬を提供する。本発明の試薬は、各々、イン・ビ
ボで血栓に特異的に結合し、かつ放射線標識結合部位に
共有結合したペプチドを包含する特異的結合化合物より
なるが、ペプチドに限定されるものではない。

好ましい具体例において、本発明は、該特異的結合化
合物が、４ないし100個のアミノ酸のアミノ酸配列を有
する線状または環状ペプチドである試薬を提供する。

好ましくは、約10,000ダルトン未満の分子量を有する
小さな化合物を使用するの明確な商業的利点である。か
かる小さな化合物は容易に製造しうる。さらに、それら
は免疫原性ではなく、脈管構造から容易に消失するよう
であり、かくして、血栓をより良好かつより迅速に造影
するのを可能とする。それに対して、抗体の断片または
10,000ダルロンを超える他の生物学的由来ペプチドのご
とき大きな分子は、製造するのにコストがかかり、免疫
原性があり、血流から消失するのが鈍速であるため、イ
ン・ビボの血栓を迅速に診断することを阻害するようで
ある。

本発明の一態様は、式：Ｃ（pgp）^ｓ−（aa）−Ｃ（pgp）^ｓ［式中、Ｃ（pgp）^ｓは保護システインであって、（a
a）はアミノ酸、好ましい具体例において、該アミノ酸
はグリシン］のTc−99m結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも
１の成分に特異的に結合する特異的結合化合物よりなる
哺乳動物体内の血栓を営造するために放射線標識されう
る血栓造影剤の製造用試薬を提供する。もう１の具体例
において、本発明は、式：Ａ−CZ（Ｂ）−［Ｃ（R¹R²）］ｎ−Ｘ［式中、Ａは、Ｈ、HOOC、H₂NOC、（ペプチド）−NHO
C、（ペプチド）−OOCまたはR₄;Bは、Ｈ、SHもしくは−
NHR³、−Ｎ（R³）−（ペプチド）またはR⁴;Zは、Ｈまた
はR⁴;Χは、SHもしくは−NHR³、−Ｎ（R³）−（ペプチ
ド）またはR⁴;R¹、R²、R³およびR⁴は、独立して、Ｈま
たは直鎖もしくは分岐鎖または環状の低級アルキル;nは
０、１または2;ここに、（１）Ｂが−NHR³または−Ｎ
（R³）−（ペプチド）である場合、ΧはSHであってｎは
１または2;（２）Χが−NHR³または−Ｎ（R³）−（ペプ
チド）である場合、ＢはSHであってｎは１または2;
（３）ＢがＨまたはR⁴である場合、ＡはHOOC、H₂NOC、
（ペプチド）−NHOC、（ペプチド）−OOC、ΧはSHであ
ってｎは０または1;（４）ＡがＨまたはR⁴の場合であっ
てＢがSHである場合、Χは−NHR³または−Ｎ（R³）−
（ペプチド）であって、ＸがSHである場合、Ｂは−NHR³
または−Ｎ（R³）−（ペプチド）；（５）ΧがＨまたは
R⁴である場合、ＡはHOOC、H₂NOC、（ペプチド）−NHO
C、（ペプチド）−OOCであってＢはSH;（６）Ｚがメチ
ルである場合、Χはメチル、ＡはHOOC、H₂NOC、（ペプ
チド）−NHOC、（ペプチド）−OOC、ＢはSHであって、
ｎは0;および（７）ＺがSHであってΧがSHである場合、
ｎは０でない；ここに、該チオール基は還元型］のTc−99m結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも
１の成分に特異的に結合する特異的結合化合物よりなる
哺乳動物体内の血栓を造影するために放射線標識しうる
血栓造影剤の製造用試薬を提供する。

もう１つの具体例においては、本発明は、式：［本発明の目的では、この構造式を有する放射線標識結
合部位とは、ピコリン酸（Pic）−に基づく部位をいう
こととなろう］あるいは［本発明の目的では、この構造式を有する放射線標識結
合部位は、ピコリルアミン（Pica）に基づく部位をいう
こととなろう］；（式中、ΧはＨまたは保護基；（アミ
ノ酸）はいずれかのアミノ酸；該放射線標識結合部位
は、該ペプチドおよび該放射線標識結合部位の錯体に共
有結合し、該放射線標識は電気的に中性である）の放射
線標識結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも１つ
の成分に特異的に結合する特異的結合化合物よりなる哺
乳動物体内の血栓を造影するために放射線標識されうる
血栓造影剤の製造用試薬を提供する。好ましい具体例に
おいて、該アミノ酸はグリシンであって、Χはアセトア
ミドメチル保護基である。さらなる好ましい具体例にお
いて、該特異的結合化合物は、アミノ酸、最も好ましく
はグリシンを介して、該放射線標識結合部位に共有結合
する。

本発明のさらにもう１の具体例は、ビスアミノビス
チオール放射線標識結合部位である放射線標識結合部位
に共有結合した、血栓の少なくとも１の成分に特異的に
結合する特異的結合化合物よりなる哺乳動物体内で血栓
を造影するために放射線標識されうる血栓造影剤の製造
用試薬を提供する。本発明にこの具体例における該ビス
アミノビスチオール基は：［式中、R⁵は、独立して、Ｈ、CH₃またはC₂H₅でもよ
く；各（pgp）^ｓは、独立して、チオール保護基またはＨで
もよく;m、ｎおよびｐは、独立して、２または3;Aは線
状もしくは環状の低級アルキル、アリール、複素環それ
らの組合せまたはそれらの置換誘導体であって；Χは特
異的結合化合物、好ましくはペプチドである］；および（式中、各R⁵は、独立して、Ｈ、１ないし６個の炭素原
子を有する低級アルキル、フェニルまたは低級アルキル
もしくは低級アルコキシで置換されたフェニル;m、ｎお
よびｐは、独立して、１または2;Aは線状または環状の
低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまた
はそれらの置換誘導体;VはＨまたはCO−ペプチド;R⁶は
Ｈまたはペプチド；但し、ＶがＨの場合、R⁶はペプチド
であり、R⁶がＨの場合、Ｖはペプチド）［本発明の目的
では、これらの構造式を有する放射線標識結合部位は
「BAT」基をいうこととなろう。］よりなる群から選択される式を有する。好ましい具体例
において、該試薬の該特異的結合化合物は、アミノ酸、
最も好ましくはグリシンを介して該放射線標識結合部位
に共有結合する。

本発明の前記態様の好ましい具体例において、該特異
的結合化合物は、４ないし100個のアミノ酸よりなるペ
プチドである。該放射線標識の最も好ましい具体例は、
テクネチウム−99mである。

本発明の該試薬は、該特異的結合化合物または該放射
線標識結合部位が多価連結部位に共有結合しているよう
形成しうる。本発明の多価連結部位は、特異的結合化合
物または放射線標識結合部位に共有結合できる、少なく
とも２個の同一リンカー官能基（linker functional gr
oup）よりなる。好ましいリンカー官能基は、第一級も
しくは第二級アミン、ヒドロキシ基、カルボン酸基また
はチオール反応性基である。好ましい具体例において、
該多価連結部位は、ビス−スクシンイミジルエチルエー
テル（BSME）、４−（2,2−ジメチルアセチル）安息香
酸（DMAB）、トリス（スクシンイミジルエチル）アミン
（TSEA）、Ｎ−［２−（N_,N_−ビス（２−スクシンイ
ミドエチル）アミノエチル）］−N⁶,N⁹−ビス（２−メ
チル−２−メルカプトプロピル）−6,9−ジアザノナン
アミド（BAT−BS）、４−（Ｏ−CH₂CO−Gly−Gly−Cys.
アミド）アセトフェノン（ETAC）およびビス−スクシン
イミドヘキサン（BSH）よりなる。

また、本発明は、４ないし100個のアミノ酸のアミノ
酸配列および当該特異的結合ペプチドに共有結合したテ
クネチウム−99m結合部位を有する特異的結合ペプチド
と（ここに、該ペプチドは、GP II b/III a受容体につ
いてのリガンドであって、アミノ酸配列（アルギニン−
グリシン−アスパラギン酸）よりなるものではない線状
および環状のペプチド）、フィブリンの重合部位につい
てのリガンドであるペプチドと、アミノ酸配列（アルギ
ニン−グリシン−アスパラギン酸）よりなる環状ペプチ
ドよりなる群から選択される）とからなる、哺乳動物体
内の血栓を造影するための血栓造影剤も提供する。好ま
しい具体例において、フィブリンの重合部位についての
リガンドであるアミノ酸配列は、配列（グリシル−プロ
リル−アルギニル−プロリル）の多重コピーよりなる。

また、本発明は、本発明の試薬とTc−99mとの錯体で
あるシンチグラフィー造影剤および本発明の該試薬をTc
−99mで放射線標識する方法からなる。本発明により提
供される放射線標識錯体は、還元剤の存在下にて本発明
の該試薬とTc−99mとを反応させることにより形成され
る。好ましい還元剤としては、亜ジチオン酸塩イオン、
第一スズイオンおよび第一鉄イオンを包含するが、それ
らに限定されるものではない。また、本発明の錯体は、
本明細書中にて提供される予め還元したTc−99m錯体の
リガンド交換によって、本発明の試薬をTc−99mで標識
することにより形成させることもできる。

また、本発明は、本発明の試薬をTc−99mで放射線標
識した試薬であるシンチグラフィー造影剤製造用キット
も提供する。本発明の試薬をTc−99mで標識するための
キットは、予め定めた量の本発明の試薬またはその混合
物および該試薬をTc−99mで標識するのに十分な量の還
元剤を含有する密閉バイアルよりなる。

本発明は、イン・ビトロでの化学合成により本発明の
試薬を製造する方法を提供する。好ましい具体例におい
て、ペプチドは固相ペプチド合成法によって合成され
る。

本発明は、ガンマ・シンチグラフィー造影をイン・ビ
ボで得ることにより哺乳動物体内の血栓を造影するため
のTc−99m標識試薬である、シンチグラフィー造影剤を
用いる方法を提供する。これらの方法は、診断有効量の
本発明のTc−99m標識化合物を投与し、次いで、哺乳動
物体内の血栓部位に局在したTc−99m標識により放出さ
れるガンマ線を検出することからなる。

本発明の特に好ましい具体例は、以下のある種の好ま
しい具体例および請求の範囲の、さらに詳細な説明から
明らかとなるであろう。

発明の詳細な説明本発明は、哺乳動物体内の血栓を造影するための放射
線標識血栓造影在を製造するための、ペプチド試薬を含
めた試薬を提供する。本発明により提供される該試薬
は、血栓の少なくとも１の成分に結合しうる特異的結合
化合物に共有結合している放射線標識結合部位よりな
る。本発明の目的のため、血栓造影試薬なる語は、放射
線標識結合部位に共有結合し、好ましくはTc−99m、¹¹¹
Inまたは⁶⁸Ga、最も好ましくはTc−99mで放射線標識し
た特異的結合化合物よりなる本発明の具体例をいう。

この放射性同位元素の核種および放射能特性はそれを
理想的なシンチグラフィー造影剤とするので、Tc−99m
で標識することは、本発明の利点である。この放射性同
位元素は、140keVの単一光子エネルギーならびに約６時
間の放射性半減期を有し、⁹⁹Mo−^99mTc発生機から容易
に入手可能である。本発明のもう１つの利点は、（例え
ば、¹²⁵Iのごとき）先行技術の他の放射線核種に比し
て、好ましい放射線核種のいずれもが毒でないことであ
る。

Tc−99m結合部位と、本発明による提供されるチオー
ル保護基［（pgp）^ｓ］に共有結合しているチオールを
含有するかかる部位に共有結合した化合物とにおいて、
該チオール保護基と、同一または異なっていてもよく： −CH₂−アリール（アリールはフェニルまたはアルキル
もしくはアルキルオキシ置換フェニル）； −CH₂−（アリール）_２（アリールはフェニルまたはア
ルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニル）； −Ｃ（アリール）_３（アリールはフェニルまたはアルキ
ルもしくはアルキルオキシ置換フェニル）； −CH₂−（４−メトキシフェニル）； −CH−（４−ピリジル）（フェニル）₂; −Ｃ（CH₃）_３ −９−フェニルフルオレニル； −CH₂NHCOR（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはア
リール）； −CH₂−NHCOOR（Ｒは非置換または置換アルキルもしく
はアリール）； −CONHR（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはアリ
ール）； −CH₂−Ｓ−CH₂−フェニルでもよいが、これらに限定されるわけではない。

好ましい保護基は、式−CH₂−NHCOR（ここで、Ｒは１
ないし８個の炭素原子を有する低級アルキル、フェニル
または低級アルキル、ヒドロキシル、低級アルコキシ、
カルボキシもしくは低級アルコキシカルボニルで置換さ
れたフェニル）を有する。最も好ましい保護基はアセト
アミドメチル基である。

本発明の特異的結合ペプチドを含有する各々の具体例
は、アミノ酸配列よりなる。本発明中にて用いるアミノ
酸なる語は、全てのＬ−およびＤ−アミノ酸、天然発生
およびその他のものを含有することを意味する。本発明
により提供される特異的結合ペプチドよりなる試薬は、
限定しないが、以下のものを包含する（特に示さない限
り、以下のペプチド中のアミノ酸はＬ−アミノ酸であ
る）： GP II b/III a受容体に対するリガンド（CC_AcmGC_AcmGGRGDS）_３−TSEA ［Pic.SC_AcmSYNRGDSTC.アミド］_３−TSEA ［BAT］.Hly.GDP.Hly.GDF.アミド［BAT］G.Apc.GDV.Apc.GDFK.アミド CRIARGDWNDDYC CKFFARTVCRIARGDWNDDYCTGKSSDC トロンビンリガンド C_AcmGC_AcmNDGDFEEIPEEYLQ C_AcmGC_AcmGGF_DPRPGGGGNGDFEEIPEEYL ma−GGGGF_DPRPGGGGNGDFEEIPEEYL C_AcmGC_AcmGGF_DPRPGアミド（アセチル−F_DPRPG）₂KGGGC.アミドフィブリンの重合部位に対するリガンド［（GPRP）₂K］₂KC_AcmGC_Acm.アミド（GPRVVERHQSA）₂KC_AcmGC_Acm.アミド（GPRPC_AcmGC_AcmC）_３−TSEA ［GPRPPPGGC_AcmGC_AcmGGC］_３−TSEA ラミニンの誘導体フィブリノーゲンに対するリガンド CYGQQHHLGGAKQAGDV Pic.GC_AcmGQQHHLGGAKQAGDV GP II b/III aの誘導体 Pic.GC_AcmPSPSPIHPAHHKRDRRQ.アミド PSPSPIHPAHHKRDRRQC_AcmGC_Acm.アミド（アミノ酸の一字略語は、ジイ、ツバイ（G.Zuba
y）、バイオケミストリー（Biochamistry）、（第２
版）、1988年（マクミラン・パブリッシング：ニュー・
ヨーク（MacMillen Publishing:New York）、33頁；他
の略語は表Ｉの説明のごときものである）。本発明によ
り提供される試薬のこのリストは、例示的なものであっ
て限定または排除を意味するものではなく、本明細書中
に開示したペプチドおよび本明細書中に開示したごとき
結合基からなるキレート部位の組合せを含めた、かかる
ペプチドまたはその同等物の組合せからなる試薬が本発
明のキレート部位のいずれかに共有結合しえること、お
よびそれらは本発明の範囲内にあることを当業者ならば
理解するであろう。

血小板GP II b/III a受容体をコードするアミノ酸配
列を有するペプチドよりなる本発明の具体例において、
各々の該試薬は、0.3μＭ以下の濃度で存在する場合に
血小板に富む血漿中のヒト血小板凝集を50％阻害するこ
とが可能である。

本発明の特異的結合ペプチドは、イン・ビトロで化学
合成できる。本発明のペプチドは、一般的にはアミノ酸
合成機で有利に製造できる。本発明の該ペプチドは、当
業者によく知られた技術を用いて、イン・ビトロ化学合
成する間に、該放射線標識−結合部位を該ペプチドに共
有結合させて合成できる。共有結合の特異的部位を決定
できるので、合成の間にかかるペプチドを放射線結合部
位に共有結合させるのが有利である。

ペプチド合成の間に、本発明の放射線標識結合部位
を、標的特異的ペプチドに導入できる。ピコリン酸より
なる具体例［Pic−）；例えば、Pic−Gly−Cys（保護
基）−］については、該放射線標識結合部位を合成中に
おける最後の（すなわち、アミノ−末端）残基として合
成できる。加えて、該ピコリン酸−含有放射線標識結合
部位は、リジンのＥ−アミノ基に共有結合して、例え
ば、ペプチド鎖中のいずれの位置にも導入できるaN（Fm
oc）−Ly−EN［Pic−Gly−Cys（保護基）］を提供しう
る。該標的結合ペプチドへ簡単な様式にて導入できるた
め、この配列が特に有利である。

同様に、該ペプチド鎖の該カルボキシル末端に配列
［−Cys（保護基）−Gly−］を含有させることにより、
ペプチド合成の間にピコリルアミン（Pica）−含有放射
線標識部位［−Cys（保護基）−Gly−Pica］も製造でき
る。該樹脂からペプチドが切断させた後に、該ペプチド
のカルボキシル末端を活性化し、ピコリルアミンにカッ
プリングさせる。この合成経路は、反応性の側鎖官能基
がマスク（保護）されたままであって、該ピコリルアミ
ンの結合の間には反応しないことを要する。

Pic−Gly−Cys−および−Cys−Gly−Picaキレート剤
を含有する小さな合成ペプチドの例は、以下に記載の実
施例に提供する。本発明は、イン・ビボで血栓に特異的
に結合し、Tc−99mを有する放射線標識ペプチドを中性
錯体として保持できる実質的にいずれのペプチドに、こ
れらのキレート剤を導入させることも提供する。

また、本発明は、Tc−99mで標識してもよいビスアミ
ンビスチオール（BAT）キレート剤を取り込む、特異
的に結合する小さなペプチドも提供する。本発明は、こ
れらのキレート剤を、イン・ビボにて血栓に特異的に結
合できる実質的にいずれものペプチドへ導入して、Tc−
99mを有する放射線標識ペプチドを中性錯体として保持
することを提供する。放射線標識結合部位としてのBAT
キレート剤を含有する小さな合成ペプチド試薬の例は、
以下に記載の実施例に提供する。

放射性Tc−99mと本発明の試薬との錯体の形成におい
ては、該テクネチウム錯体、好ましくはTc−99m過テク
ネチウム酸塩、を還元剤の存在下にて該試薬と反応させ
る。好ましい還元剤は、亜ジチオン酸、第一スズおよび
第一鉄イオンであり；最も好ましい還元剤は塩化第一ス
ズである。かかる錯体を製造する手段は、標識すべき予
め定めた量の本発明の試薬と、該試薬をTc−99mで標識
するのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルよ
りなるキット形態にて簡便に提供される。別法として、
該錯体は、本発明の該試薬と、テクネチウムおよび転移
リガンド（transfer ligand）として公知のもう１つの
化合物の予め形成させたラービル錯体とを反応させるこ
とによっても形成しうる。このプロセスは、リガンド交
換として公知であり、当業者によく知られている。該ラ
ビール錯体は、例えば、酒石酸、クエン酸、グルコン酸
塩またはマンニトールのごとき転移リガンドを用いて形
成しうる。Tc−99m過テクネチウム酸塩の中で本発明に
有用なものは、ナトリウム塩のごときアルカリ金属塩、
もしくはアンモニウム塩または低級アルキルアンモニウ
ム塩を包含する。

本発明の好ましい具体例において、テクネチウム標識
試薬の製造用キットを提供する。Tc−99mで該試薬を標
識するのに十分な量の、塩化第一スズのごとき、還元剤
を含有するバイアルに、適当量の該試薬を入れる。ま
た、（例えば、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩ま
たはマンニトールのごとき）記載したような適当量の転
移リガンドも含有しうる。また、該キットは、例えば、
浸透圧を調整するための医薬上許容される塩、緩衝液、
保存料等のごとき通常の医薬用添加物も含有できる。キ
ットの成分は、液体、凍結または乾燥の形態でもよい。
好ましい具体例において、キット成分は凍結乾燥形態に
て提供される。

本発明に関する放射線標識血栓造影試薬は、適量のTc
−99mまたはTc−99m錯体を該バイアルに添加し、以下の
実施例２に記載した条件下にて反応させることにより製
造しうる。

本発明により提供される放射性標識シンチグラフィー
造影剤は、適当な線量の放射活性を有する。Tc−99m放
射性錯体の形成において、mL当たり約0.01ミリキューリ
ー（mCi）ないし100mCiの濃度の放射能を含有する溶液
中で放射性錯体を形成させるのが一般的に好ましい。

Tc−99mで標識した場合には、本発明により提供され
る該血栓造影試薬は、哺乳動物体内の血栓を視覚化する
のに用いることができる。本発明に従い、該Tc−99m標
識試薬は１回ユニット注射用量にて投与する。本発明に
より提供される該Tc−99m標識試薬は、セーライン水性
媒質または血漿媒質のごとき、いずれの静脈内注射用の
通常の媒質で静脈内投与してもよい。一般的には、投与
する該ユニット用量は、約0.01mCiないし約100mCi、好
ましくは1mCiないし20mCiの放射能を有する。ユニット
用量にて注射する該溶液は、約0.01mLないし約10mLであ
る。静脈内投与の後に、数分以内にイン・ビボの血栓造
影が起こる。しかしながら、所望により、該放射線標識
試薬を患者に注射した後、数時間またはさらに長くにお
いてさえ造影が起こる。ほとんどの場合において、十分
量の用量を投与すると、約0.1時間以内に造影する領域
に蓄積しシンチフォト（scinttiphoto）が可能となるで
あろう。診断目的のシンチグラフィー造影のいずれの常
法も、本発明と一致して利用することができる。

これらの化合物を製造し、標識する方法は、以下の実
施例でさらに十分に説明する。これらの実施例は、前記
した方法および有利な結果のある種の態様を説明してい
る。これらの実施例は、例示的な方法で示されており、
限定するものではない。

実施例１固相ペプチド合成ジクロロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾ
トリアゾールまたは２−（1H−ベンゾトリアゾール−１
−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムへキサフ
ルオロホスフェート／ヒドロキシベンゾトリアゾール
（HBTU/HOBT）でカップリングした９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル（Fmoc）アミノ末端保護を用い、
カルボキシル末端酸にｐ−ヒドロキシメチルフェノキシ
−メチルポリスチレン（HMP）を用いるか、あるいはカ
ルボキシル末端アミドにリンクアミド樹脂（Rink amide
resin）を用いて、アプライド・バイオシステムズ・モ
デル431A・ペプチド・シンセサイザー（Applied Biosys
teems Model 431A Pepitde Synthesizer）を用いた0.25
ミリモル（mmol）スケールで固相ペプチド合成（SPPS）
を行った。樹脂に結合する生成物は、100:5:5:2.5:2の
比にて室温で0.5−３時間調製したトリフルオロ酢酸、
水、チオアニソール（アルギニン残基が当該ペプチドよ
りなる場合）、エタンジチオールおよびトリエチルシラ
ンからなる溶液を用いてルーチン的に切断した。

適当には、NMP（Ｎ−メチルピロリジノン）中の20％v
/vの無水酢酸で該樹脂に結合させた遊離Ｎ−末端アミノ
ペプチドを30分間処理することによりＮ−末端アセチル
基を導入した。適当には、SPPSの間にカップリングさせ
るべき最後の残基として適当な２−ハロ−酢酸を用いる
か、あるいは、NMP中の２−ハロ−酢酸／ジイソプロピ
ルカルボジイミド/N−ヒドロキシスクシンイミドまたは
NMP中の２−ハロ−無水酢酸／ジイソプロピルエチルア
ミンで処理するかのいずれかにより、２−クロロアセチ
ルおよび２−ブロモアセチル基を導入した。適当には、
0.5−1.0mMのEDTAを含有するリン酸または重炭酸緩衝液
（pH8）中の0.1−1.0mg/mL溶液を48時間撹拌し、続いて
酢酸で酸性化し、凍結乾燥してHPLC精製することによ
り、２−ハロアセチル化ペプチドを環化させた。適当に
は、Cys−Cysジスルフィド結合環化は、pH7の緩衝液中
の0.1mg/mLの前駆体システイン−遊離チオールペプチド
を、アリコットの0.006MのFe₃（CN）_６で黄色が安定し
て維持されるまで処理することにより行った、過剰量の
オキシダントを過剰量のシステインで還元し、該混合物
を凍結乾燥し、次いで、HPLCにより精製した。

適当には、ペプチド合成における最後の残基としてピ
コリン酸を用いることにより「Pic」基を導入した。適
当には、ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドを用いて、ピコリルアミンを前駆
体ペプチドに結合させることにより「Pica」基を導入し
た。適当には、SPPSの間にカップリングさせるべき最後
の残基として適当なBAT酸を用いるか、あるいはNMP中の
BAT酸／ジイソプロピルカルボジイミド/N−ヒドロキシ
スクシニミドで樹脂に結合するＮ−末端遊離アミノペプ
チドを処理することにより樹脂BATリガンドを導入し
た。適当には、最初にDMF、NMPまたはCH₂Cl₂中のジイソ
プロピルカルボジイミド/N−ヒドロキシスクシンイミド
またはHBTU/HOBtの混合物でペプチドのカルボキシレー
トを活性化し、続いてジイソプロピルエチルアミンの存
在下にカップリングさせることにより［BAM］を該ペプ
チドに結合させ；カップリングの後に、該結合物を前記
のごとく脱保護化させた。

適当には、単一のチオールを含有するペプチド（50mM
リン酸ナトリウム緩衝液、５ないし50mg/mL、pH8）を、
アセトニトリルに予め溶解した0.5モラー当量のBMME
（ビス−マレイミドメチルエーテル）と、室温にて約１
−18時間反応させることによりBSME付加物を調製した。
該溶液を濃縮し、その生成物をHPLCで精製した。適当に
は、BMMEの代わりにビス−マレイミドヘキサンを用いる
ことによってBSH付加物を調製した。

適当には、アセトニトリルまたはDMFに予め溶解した
0.33モラー当量のTMEA（トリス（２−マレイミドエチ
ル）アミン；（出典明示して本明細書の一部とみなす）
同時継続出願、米国特許出願第07/955,466号参照）と、
１モラー当量のトリエタノールアミンの存在もしくは不
存在下に、室温にて約１−18時間（DMF中の10ないし100
mg/mLペプチド濃度、または50mMのリン酸ナトリウム（p
H8）／アセトニトリルまたはTHF中の５ないし50mg/mLの
ペプチドの濃度で）単一のチオールを含有するペプチド
を反応させることによりTSEA付加物を調製した。付加物
を含有するかかる反応混合物を濃縮し、次いで該付加物
をHPLCを用いて調製した。

適当には、単一のチオールを含有するペプチドを（50
mMのリン酸ナトリウム（pH8）／アセトニトリルまたはT
HF中の２ないし50mg/mLペプチド濃度で）、アセトニト
リルまたはTHF中に予め溶解した0.5モラー当量のBAT−B
M（Ｎ−［２−（Ｎ′,N′−ビス（２−マレイミドエチ
ル）アミノエチル）］−N⁹−（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）−N⁶,N⁹−ビス（２−メチル−トリフェニルメチル
チオプロピル−6,9−ジアザノナンアミド；同時継続出
願である米国特許出願第08/044,825号参照）と、室温に
て約１−18時間反応させることによりBAT−BS付加物を
調製した。次いで、該溶液を蒸発乾固させ、10mLのTFA
および0.2mLのトリエチルシランで１時間処理すること
により［BAT−BS］−ペプチド結合物を脱保護化した。
その溶液を濃縮し、該生成付加物をエーテルで沈殿さ
せ、次いで、HPLCにより精製した。

ウォーターズ・デルタ・パック（Waters Delta Pak）
C18カラムおよびアセトニトリルで修飾した水中の0.1％
トリフルオロ酢酸（TFA）を用いた勾配溶出液を用いた
分取用高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、粗
精製ペプチドを精製した。溶出した画分からアセトニト
リルを留去させ、次いで、凍結乾燥した。各々の生成物
の同一性は、高速原子衝撃質量分析器（FABMS）により
確認した。

実施例２ Tc−99mで放射線標識する常法実施例２で調製した0.1mgのペプチド試薬を0.1mLの
水、または50:50のエタノール：水、あるいはリン酸緩
衝セーライン（PBS）、あるいはリン酸カリウム衝撃液
（pH＝５、６または7.4）に溶解した。グルコスカン（G
lucoscan）・バイアル（イー・アイ・デュポン・ドゥ・
ヌムール社（E.I.DuPont de Nemours,Inc.）製）を、20
0mCiまでを含有するTc−99m過テクネチウム酸ナトリウ
ムの1.0mLで再生し、室温に15分間放置することによりT
c−99mグルセプテートを調製した。次いで、25μｌのTc
−99mグリセプテートを該ペプチドに添加し、室温また
は100℃にて15−30分間反応を進行させ、次いで0.2μｍ
のフィルターに通して濾過した。

該Tc−99m標識ペプチドの純度を、表Ｉの注脚に記載
した条件を用いたHPLCにより測定した。放射性成分は、
積算記録機につなげたイン−ライン線量検出機によって
検出した。Tc−99mグルセプテートおよびTc−99m過テク
ネチウム酸は、これらの条件下にて１ないし４分に溶出
されたが、Tc−99m標識ペプチドはさらにずっと後に溶
出された。

以下の表は、本明細書記載の方法を用いた実施例１に
従って調製したペプチドのTc−99m標識が首尾よく行わ
れたことを示す。

＊上付文字は、以下の標識条件を示す： 1.該ペプチドを50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）
に溶解し、室温にて標識した。

2.該ペプチドを50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）
に溶解し、100℃にて標識した。

3.該ペプチドを水に溶解し、室温にて標識した。

4.該ペプチドを水に溶解し、100℃にて標識した。

5.該ペプチドを50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）
に溶解し、100℃にて標識した。

6.該ペプチドを50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH5.0）
に溶解し、室温にて標識した。

7.該ペプチドをエタノール／水の50:50の混合液に溶解
し、100℃にて標識した。

＊＊（R_Tの後の上付文字で示される）HPLC方法共通：溶媒A ＝0.1％のCF₃COOH/H₂O 溶媒B₇₀＝0.1％のCF₃COOH/70％のCH₃CN/H₂O 溶媒B₉₀＝0.1％のCF₃COOH/90％のCH₂CN/H₂O 溶媒液速＝1mL/分ビダック・カラム（Vydak column）＝（ガードカラム
を付けた）ビダック218TP54RP−18,5μ×220mm×4.6mm
分析カラムブラウンリー・カラム（Brownlee column）＝ウォー
ターズ・デルタ−パックC18,5μ×150mm×3.9mmカラム方法1:ブラウンリー・カラム 10分間に100％のＡな
いし100％B₇₀ 方法2:ビダック・カラム 10分間に100％のＡな
いし100％のB₉₀ 方法3:ビダック・カラム 10分間に100％のＡな
いし100％のB₇₀ 方法4:ウォーターズ・カラム 20分間に100％のＡな
いし100％のB₉₀ 方法5:ウォーターズ・カラム 10分間に100％のＡな
いし100％のB₉₀ ＊＊＊ドデジル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電
気泳動により確認した。

＊＊＊＊アフィニティーカラムへの該ペプチドの結合に
より確認した。

アミノ酸の一文字略語は、ジイ、ツベイ（G.Zuba
y）、バイオケミストリー（Biocchemistry）（第２版
（2d.ed.）、1988年（マクミラン・パブリッシング（Ma
cMillen Publishing）：ニュー・ヨーク（New York）33
頁））参照；アンダーラインは、結合したアミノ酸の誘
導基間でのチオール結合の形成を示す；ペプチドは、各
ペプチド中の非保護システイン残基（Ｃ）の遊離チオー
ル基を介してBSH、ETAC、BSME、TSEAまたは［BAT−BS］
リンカーに結合しているペプチド;Ac＝アセチル;Bz＝ベ
ンゾイル;Pic＝ピコリノイル（ピリジン−２−カルボニ
ル）;Acm＝アセトアミドメチル;Mob＝４−メトキシベン
ジル;Apc＝Ｌ−［Ｓ−（３−アミノプロピル）システイ
ン;Hly＝ホモリジン;F_D＝Ｄ−フェニルアラニン;Y_D＝Ｄ
−チロシン;ma＝２−メルカプト酢酸;mmp＝２−メルカ
プト−２−メチルプロピオン酸;BAT＝N⁶,N⁹−ビス（２
−メルカプト−２−メチルプロピル）−6,9−ジアザノ
ナン酸;ETAC＝４−（Ｏ−CH₂CO−Gly−Gly−Cys.アミ
ド）アセトフェノン;BAT−BS＝Ｎ−［２−N_,N_−ビス
（２−スクシンイミドエチル）アミノエチル］−N⁶,N⁹
−ビス（２−メルカプト−２−メチルプロピル）−6,9
−ジアザノナンアミド;BSME＝ビス−スクシンイミドメ
チルエーテル;TSEA＝トリス−（２−スクシンイミドエ
チル）アミン;NES＝Ｎ−エチルスクシンイミド;BSH＝1,
6−ビス−スクシンイミドヘキサン^ａ＝電子スプレー（electrospray）質量分析［ESMS］に
より確認した。

実施例３血小板凝集阻害アッセイ本質的にはツッカー（Zucker）による記載（1989年、
メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzym
ol.）、第169巻:117−113頁）のごとく血小板凝集実験
を行った。簡単には、マイクロリットル当たり300,000
個の血小板よりなる新鮮なヒト血小板−リッチ血漿を用
いて、予想される血小板凝集阻害化合物の存在下または
不存在下で血小板凝集をアッセイした。アデノシン二リ
ン酸溶液を最終濃度10ないし15マイクロモラーにて添加
することにより、血小板の凝集を誘導し、その血小板の
凝集の程度をバイオ／データ・アグレゴメーター（バイ
オ／データ・コーポレーション社、ホルシャム、ペンシ
ルバニア州（Bio/Data Corp.,Horsham,PA））を用いて
モニターした。用いた血小板凝集阻害化合物の濃度は0.
1ないし500μg/mLで変化させた。血小板凝集の程度を50
％で減じる阻害剤濃度（CI₅₀と定義されている）は、阻
害剤濃度vs血小板凝集の程度をプロットすることにより
求めた。ペプチドRGDSについての阻害曲線は、陽性対照
として試験した各血小板バッチに対して測定した。

これらの実験結果を表Ｉに示す。表Ｉにおいて、試験
した化合物は以下の通りである：（略語は、表Ｉの説明に見い出される）これらの結果は、本発明のペプチド試薬が、多くの場
合において天然起源のRGDS配列のものより、活性化血小
板に高親和性をもって結合することを証明している。

実施例４イヌ・モデルにおけるTc−99m標識ペプチドを用いた深
静脈血栓症のイン・ビボ造影雑種犬（25−351b、一晩絶食させた）にケタミンおよ
びアセプロザミンの組合せを筋肉注射して鎮静させ、次
いで、ペンタバルビタールナトリウムを静脈内注射して
麻酔した。各動物において、右大腿静脈の半末端に18ゲ
ージのアンギオカト（angiocath）を挿入し、8mmのダク
ロン^Ｒ（Dacron^R）を巻いたステンレス・スチール塞症
コイル（クック・コーポレイション社（Cook Co.）、ブ
ルーミントン、インディアナ州（Bloomingtton IN））
を大腿のおよそ中間部の大腿静脈に入れた。該カテーテ
ルを取り出し、傷を縫合し、該コイルの位置をΧ線によ
って調べた。次いで、該動物を一晩で回復させた。

コイルを設置して１日後に、各々の動物を再度麻酔
し、各々の前脚にセーラインを静脈内点滴し、膀胱カテ
ーテルを挿入して尿を採取した。低エネルギー、全目的
コリメーターを装備し、Tc−99mにフォトピークを合わ
せたガンマカメラの下に該動物を仰向けに固定した。

Tc−99m標識ペプチド［185−370mBq（５−10mCi）Tc
−99m］をその挿入部位の１の前脚静脈ラインに連続し
て注射した。第２のラインは、血液採取のため残した。

ガンマカメラ造影を注射と同時に開始した。最初の10
分間にわたり心臓上の前側造影を動的試験で得（10秒の
造影を得た）、次いで、注射後１、２、３および４時間
に静的造影を得た。脚部にわたる前側造影を500,000カ
ウント、または20分間（いずれにせよ短い）、注射後
１、２、３および４時間後に得た。鉛シールドを膀胱上
方に覆って設置して脚部造影を採取した。

最後の造影の後に各々の動物をペントバルビタールで
深く麻酔した。２つの血液試料をヘパリン処理したシリ
ンジを用いて心臓穿刺上に採取し、続いて安楽死させる
量の塩化カリウム溶液を心臓内または静脈内ホーラス注
射で投与した。血栓を含有する大腿静脈、反対の（対照
の）脚の同様な部位の静脈、血栓に隣接する静脈部位お
よび腿筋肉の試料を注意深く切り取った。血栓、コイル
およびコイル・ダクロン繊維（coil Dacron fibre）を
血管から切り取った。血栓、セーラインで洗浄した血管
試料、コイル（coil）およびコイル・ダクロン繊維を分
離し、各々の試料を予め重量を測定した試験管に入れ
た。その試料の重量を測定し、注射用量の既知画分と平
行して、Tc−99mチャンネルのガンマカウンターウェル
中にて計測した。

新鮮な血栓重量、血栓中の％注射用量（％ID）/gおよ
び麻酔の直前に得た血液ならびに血栓／血液ならびに血
栓／筋肉比を測定した。コンピューターに保存した造影
から、血栓および隣接筋肉を掃引する、注目する領域
（ROI）において測定したカウント／ピクセルの分析に
よって、血栓／バックグラウンド比を測定した。これら
の実験からの組織データは以下の表に示す。Tc−99m標
識ペプチドを用いてイン・ビボ検出した静脈血栓の位置
を示すシンチグラフィー画像は図１に示す。

これらの結果は、本発明のTc−99m標識試薬を用いて
イン・ビボで深静脈血栓を容易かつ効率的に位置決定で
きることを示す。位置決定は注射後１時間以内に明らか
に確立されるものであって、コントラストおよび焦点の
鮮明度が増大したままで、注射後４時間近くにわたって
持続する。

これまでの開示は本発明のある特別の具体例を強調し
たものであって、全ての修飾またはそれに同等の変法
は、請求の範囲に記載するごとく、本発明の精神および
範囲の中に入ることに注意すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/60 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｂ (56)参考文献特表平７−504902（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／10759（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／10463（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/00 C07K 7/06,7/08,5/10 A61K 51/00 G01N 33/60 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】テクネチウム−99m結合部位に共有結合し
た、白血球以外の、血栓の少なくとも１の成分に結合で
きる特異的結合化合物を含み、ここに該テクネチウム−
99m結合部位が、式：Ｃ（pgp）^ｓ−（aa）−Ｃ（pgp）^ｓ［式中、Ｃ（pgp）^ｓは保護されたチオール基を有する
システインであって、（aa）はアミノ酸を意味する］を有し、ここに、（pgp）^ｓはチオール保護基であって、同一で
も異なってもよく、 −CH₂−アリール（アリールはフェニルまたはアルキル
もしくはアルコキシ置換フェニルである）； −CH−（アリール）_２（アリールはフェニルまたはアル
キルもしくはアルコキシ置換フェニルである）； −Ｃ−（アリール）_３（アリールはフェニルまたはアル
キルもしくはアルコキシ置換フェニルである）； −CH₂−（４−メトキシフェニル）； −CH−（４−ピリジル）（フェニル）₂; −Ｃ（CH₃）₃; −９−フェニルフルオレニル； −CH₂NHCOR（Ｒは１ないし８個の炭素原子を有する低級
アルキル、２−、３−、４−ピリジル、フェニル、また
は低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボ
キシもしくは低級アルコキシカルボニルで置換されたフ
ェニルを意味する）； −CH₂NH−COOR（Ｒは前記定義に同じ）； −CONHR（Ｒは前記定義に同じ） −CH₂−Ｓ−CH₂−フェニルである、哺乳動物体内の血栓を造影するためのシンチグ
ラフィー造影剤を製造するための試薬。
【請求項２】該特異的結合化合物とＣ（pgp）^ｓ−（a
a）−Ｃ（pgp）^ｓとが_1ないし_20個のアミノ酸を通し
て共有結合している請求項１記載の試薬。
【請求項３】該（pgp）^ｓが式： −CH₂−NH−CO−Ｒ［式中、Ｒは１ないし６個の炭素原子を有する低級アル
キル、２−、３−、４−ピリジル、フェニル、または低
級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ
もしくは低級アルコキシカルボニルで置換されたフェニ
ルを意味する］を有する請求項１記載の試薬。
【請求項４】Ｃ（pgp）^ｓ−（aa）−Ｃ（pgp）^ｓが式：を有する請求項１記載の試薬。
【請求項５】該特異的結合化合物が、４ないし100個の
アミノ酸を含むペプチドである請求項１記載の試薬。
【請求項６】式：を有する請求項５記載の試薬。
【請求項７】該特異的結合化合物と、該テクネチウム−
99m結合部位とが、_1ないし_20個のアミノ酸を通して共
有結合している請求項１〜６いずれか１項記載の試薬。
【請求項８】還元剤の存在下に請求項１〜７いずれか１
項記載の試薬とテクネチウム−99mを反応させることに
より形成されたシンチグラフィー造影剤。
【請求項９】該還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一ス
ズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される
請求項８記載のシンチグラフィー造影剤。
【請求項１０】予め還元されたテクネチウムイオン−99
m錯体のリガンド交換により、請求項１〜７いずれか１
項記載の試薬をテクネチウム−99mで標識することによ
り形成されたシンチグラフィー造影剤。
【請求項１１】式：と複合体化したテクネチウム−99mを含むシンチグラフ
ィー造影剤。
【請求項１２】予め定めた量の請求項１〜７いずれか１
項記載の試薬と、該試薬をテクネチウム−99mで標識す
るのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルを含
む放射性医薬性剤を製造するためのキット。
【請求項１３】還元剤の存在下に試薬をテクネチウム−
99mと反応させる工程よりなる請求項１〜７いずれか１
項記載の試薬を標識する方法。
【請求項１４】該還元剤が亜ジチオン酸イオン、第一ス
ズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される
請求項13記載の方法。
【請求項１５】イン・ビトロで化学合成することよりな
る請求項１〜７いずれか１項記載の試薬の製法。
【請求項１６】該合成が固相ペプチド合成である請求項
15記載の方法。
【請求項１７】イン・ビトロ化学合成の間に、該テクネ
チウム−99m結合部位が該化合物に共有結合される請求
項15または16記載の方法。
【請求項１８】さらに、複数の特異的結合化合物に共有
結合し、かつ複数のテクネチウム−99m結合部位にも共
有結合した多価連結部位よりなって、多量体シンチグラ
フィー造影剤を製造するための試薬を形成し、ここに、
該多量体シンチグラフィー造影剤の分子量は約20,000ダ
ルトン未満である請求項１〜７いずれか１項記載の試
薬。
【請求項１９】該多価連結部位が、ビス−スクシンイミ
ジルメチルエーテル、４−（2,2−ジメチルアセチル）
安息香酸、Ｎ−［２−（Ｎ′,N′−ビス（２−スクシン
イミド−エチル）アミノエチル）］−N⁶,N⁹−ビス（２
−メチル−２−メルカプトプロピル）−6,9−ジアザノ
ナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル）アミ
ン、ビス−スクシンイミドヘキサン、４−（Ｏ−CH₂CO
−Gly−Gly−Cys.アミド）アセトフェノンまたはその誘
導体である請求項18記載の試薬。
【請求項２０】式：を有する試薬を含む哺乳動物体内の血栓を造影するため
の医薬組成物。