JP2954354B2 - 造影用のテクネチウム‐９９ｍ標識ペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、放射線診断試薬およびペプチド、ならびに
標識放射線診断剤の製法に関する。さらに詳しくは、本
発明は、テクネチウム−99m（Tc-99m）と錯体を形成す
る放射線標識結合部位を介してTc-99mで標識した特異的
結合ペプチドよりなる、哺乳動物体内の部位を造影する
ためのシンチグラフィー造影剤に関する。特に、本発明
の該ペプチド試薬は、多価リンカー部位に共有結合し、
その結果、該多価リンカー部位が、複数の特異的結合ペ
プチドに共有結合し、該Tc-99m結合部位が、複数の特異
的結合ペプチド、多価リンカー部位、あるいは該特異的
結合ペプチドおよび該多価リンカー部位の両方に共有結
合する。かかる試薬の製造方法および製造用キット、な
らびにかかる試薬の使用方法も提供される。

2.先行技術の説明 核薬剤の分野では、（放射線トレーサーまたは放射線
医薬製剤と呼ばれている）体内投与した少量の放射性標
識トレーサー化合物の分布を検出することにより、ある
種の病理疾患の位置を決定し、またはその程度を評価す
る。これらの放射線医薬製剤を検出する方法は、一般的
に、造影法または放射線造影法として知られている。

放射線造影において、該放射線標識はガンマ線放射放
射性核種であって、ガンマ線検出カメラを用いて放射性
トレーサーの位置が決定される（しばしば、このプロセ
スはガンマ・シンチグラフィーと呼ばれている）。該放
射線トレーサーが病理部位（陽性コントラストという）
に局在するか、または別法として、該放射性トレーサー
がかかる病理部位に特に局在しないか（陰性コントラス
トという）のいずれかにより該放射性トレーサーが選抜
されるので、造影部位が検出できる。

放射線造影に有用な種々の放射線核種が知られてお
り、⁶⁷Ga、^99mTc（Tc-99m）、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹⁶⁹Y
bまたは¹⁸⁶Reを包含する。ヒトにおける最適な放射線造
影には、数多くの要因を考慮しなければならない。検出
効率を最大化するためには、100ないし200keVの範囲の
ガンマ線エネルギーを放出する放射線核種が好ましい。
患者への吸収放射線量を最小限にとどめるため、該放射
線核種の物理的半減期は該造影工程が許容する限り短く
すべきである。いつ何時でも検査が行えるよう、臨床サ
イトで常に利用できる放射線核種源を有しておくのが有
利である。140keVのガンマ線を放射し、６時間の物理的
半減期を有し、モリブデン−99/テクネチウム−99m発生
機を容易に該部位に利用できるため、Tc-99mが好ましい
放射線核種である。

特異的結合ペプチド部位の特異的結合特性が所望の範
囲にわたっての放射能シグナルを濃縮するため、放射性
標識ペプチドを用いる造影方法の感度は、当該分野で公
知の他の放射線医薬製剤よりもはるかに高い。所望の標
的に特異的に結合する小さな合成ペプチドを、放射性ト
レーサーの基本として有利に用いることができる。これ
は:1.（それらを、バクテリアまたは哺乳動物細胞のご
とき生物系で産生させること、あるいはタンパク質断片
のごとき生物由来物質から単離することを要するのに対
して）それらは化学的に合成でき;2.それらが小さいた
め、標的に結合しなかった放射性トレーサーが身体から
迅速に除去され、それによりバックグラウンド（非標
的）放射能が減少し、標的が良好に見分けられる；なら
びに、3.小さなペプチドは、容易に化学的に操作して、
特定の結合部位へのそれらの親和性を最適化できるため
である。

ルーチン的に用いる放射線医薬製剤には、小さく容易
に合成される標識ペプチド分子が好ましい。患者に直接
注射でき、かつかかる部位に局在することにより病理部
位を造影できる小さな合成標識ペプチドの要望が明らか
にある。造影用の放射線核種としてのTc-99m特性、なら
びに放射性トレーサー分子としての特異的結合小合成ペ
プチドの有用性により、Tc-99m標識小合成ペプチドは、
ガンマシンチグラフィー用の放射性トレーサーとして明
らかな利点を提供する。

放射線標識蛋白および放射線標識ペプチドは、先行技
術にて報告されている。

エジ（Ege）ら、米国特許第4,832,940号は、局在した
Ｔ−リンパ球を造影するための放射線標識ペプチドを教
示している。

オレキサ（Olexa）ら、1982年、欧州特許出願第82301
7009号は、架橋フィブリンから単離したフラグメント
E₁、架橋フィブリンから単離したフラグメントE₂ならび
にフラグメントE₁およびE₂の間のアミノ酸配列媒介を有
するペプチドから選択される医薬上許容される放射線標
識ペプチドを開示している。

ランビー（Ranby）ら、1988年、PCT/US88/02276号
は、放射線標識化合物をフィビリンに共有結合させるこ
とを特徴とする、動物に沈着したフィブリンを検出する
方法を開示している。

ハドリー（Hadley）ら、1988年、PCT/US88/03318号
は、 （ａ）標識し弱毒化した血栓性蛋白を患者に投与し、こ
こに、該標識物がフィブリン結合ドメイン以外の血栓蛋
白部位に結合し；（ｂ）患者中の該標識血栓性蛋白の分
布パターンを検出する、段階よりなるフィブリン−血小
板塊をイン・ビボ（in vivo）で検出する方法を教示し
ている。

リース（Lees）ら、1989年、PCT/US89/01854号は、動
脈造影用の放射線標識ペプチドを教唆している。

ソベル（Sobel）、1989年、PCT/US89/02656号は、放
射線標識し酵素的に不活性化させた組織プラスミノーゲ
ン活性化因子を用いて動物中の１またはそれを超える血
栓位置を決定する方法を開示している。

スタットル（Stuttle）、1990年、PCT/GB90/00933号
は、配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RG
D）よりなり、イン・ビボでRGD結合部位に結合できる、
３ないし10個のアミノ酸を含有する放射性標識したペプ
チドを開示している。

マラガノア（Maraganore）ら、1991年、PCT/US90/046
42号は、 （ａ）阻害部位；（ｂ）リンカー部位；および（ｃ）ア
ニオン結合部位よりなる放射線標識血栓阻害剤を開示し
ている。

ロッドウェル（Rodwell）ら、1991年、PCT/US91/0311
6号は、「分子認識単位」と「エフェクタードメイン」
との結合物を開示している。

ツビス（Tubis）ら、1968年、インターナショナル・
ジャーナル・オブ・アプライド・ラディエーションズ・
アンド・アイソトープス（Int.J.Appl.Rad.Isot.）第19
巻:835-840頁は、ペプチドをテクネチウム−99mで標識
することを記載している。

サンドレハーゲン（Sundrehagen）、1983年、インタ
ーナショナル・ジャーナル・オブ・アプライド・ラディ
エーションズ・アンド・アイソトープス（Int.J.Appl.R
ad.Isot.）第34巻:1003頁は、ポリペプチドをテクネチ
ウム−99mで標識することを記載している。

放射線造影には最適であるが、Tc-99mの化学は、他の
化学要素として徹底的には研究されておらず、このよう
な理由によりテクネチウム−99mで放射線標識する方法
は豊富ではない。Tc-99mは、普通、Tc-99m過テクネチウ
ム酸（TcO₄ ^-；＋７酸化状態でのテクネチウム）とし
て、通常、モリブデン−99m/テクネチウム−99m発生機
から得る。しかしながら、過テクネチウム酸は他の化合
物に良好に結合しない。しかるに、ペプチドを放射線標
識するため、Tc-99m過テクネチウム酸をもう１つの形態
に転化しなければならない。テクネチウムは、水溶液中
にて安定なイオンを形成しないため、Tc-99mが分解し
て、不溶性の二酸化テクネチウムに転化するか、過テク
ネチウム酸に戻るのを阻害するに十分な動力学的および
熱力学的な安定性を有する配位錯体の形態でかかる溶液
中にて保持しなければならない。

放射線標識の目的には、テクネチウムイオンを囲む全
ての供与体基が単一のキレート配位子として供されるキ
レートとして、Tc-99m錯体が形成されるのが特に有利で
ある。これは、該キレーターと該ペプチドとの間の単一
のリンカーを通してキレート化Tc-99mがペプチドに共有
結合するのを可能にする。

これらの配位子は、時々、キレート部位と結合する部
位を有する二官能性キレート剤といわれている。かかる
化合物は、先行技術で公知である。

ビルネ（Byrne）ら、米国特許第4,434,151号は、造影
する器官または組織に局在できる末端アミノ含有化合物
に放射線核種をカップリングさせるホモシステイン チ
オラクトン由来の二官能性キレート剤を記載している。

フリッツバーグ（Frizberg）、米国特許第4,444,690
号は、2,3−ビス（メルカプトアセトアミド）プロパノ
エートに基づく一連のテクネチウム−キレート剤を記載
している。

ビルネ（Byrne）ら、米国特許第4,571,430号は、造影
する器官または組織に局在できる末端アミノ含有化合物
に放射線核種をカップリングできる、放射線核種キレー
ト用の新規なホモシステイン チオラクトン二官能性キ
レート剤を記載している。

ビルネ（Byrne）ら、米国特許第4,575,556号は、造影
する器官または組織に局在できる末端アミノ含有化合物
に放射線核種をカップリングできる、放射線核種キレー
ト用の新規なホモシステイン チオラクトン二官能性キ
レート剤を記載している。

デビソン（Davison）ら、米国特許第4,673,562号は、
主に腎機能モニター剤として用いる、ビスアミド−ビス
チオ−配位子およびその塩の錯体をキレートするテクネ
チウムを記載している。

ニコロッティ（Nicolotti）ら、米国特許第4,861,869
号は、抗体のごとき生物分子と複合体を形成させるのに
有用な二官能性カップリング剤を記載している。

フリッツバーグ（Frizberg）ら、米国特許第4,965,39
2号は、蛋白標識用のＳ−保護メルカプトアセチルグリ
シルグリシンに基づく種々のキレーターを記載してい
る。

フリッツバーグ（Frizberg）ら、欧州特許出願第8610
0360.6号は、テクネチウム標識造影剤の製造に有用なジ
チオール、ジアミノ、もしくはジアミドカルボン酸また
はアミン錯体を記載している。

ディーン（Dean）ら、1989年、PCT/US89/02634号は、
蛋白およびペプチドを放射線標識するための二官能性カ
ップリング剤を記載している。

フラナガン（Franagan）ら、欧州特許出願第9030642
8.5号は、一セットの有機キレート分子を介しての合成
ペプチド断片のTc-99m標識を開示している。

アルバート（Albert）ら、欧州特許出願WO 91/01144
号は、成長因子、ホルモン、インターフェロンおよびサ
イトカインに関連し、放射線核種キレート基に共有結合
した特異的認識ペプチドよりなる、放射線標識ペプチド
を用いた放射線造影を開示している。

ディーン（Dean）、（出典明示して本明細書の一部と
みなす）同時係属米国特許出願第07/653,012号は、イン
・ビボ放射線造影用の特異的結合ペプチドに共有結合し
たTc-99mキレート基よりなる、ペプチドを製造するため
の試薬および方法を教示している。

バイド（Baidoo）およびリーバー（Lever）、1990
年、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Bioconjuga
te Chem.）第１巻:132-137頁は、カチオン性テクネチウ
ム錯体を供するビスアミン ビスチオール基を用いて生
体分子を標識する方法を記載している。

システインまたはメルカプト酢酸のごときチオール含
有基を単に付加することによりペプチドを放射線標識す
ることができる。かかる工程は先行技術にすでに記載さ
れている。

シュチャット（Schochat）ら、米国特許第5,061,641
号は、少なくとも１の「垂れ下がった（pendent）」ス
ルヒドリル基よりなる蛋白を直接に放射線標識すること
を開示している。

ディーン（Dean）ら、（出典明示して本明細書の一部
とみなす）同時係属米国特許出願第07/807,062号は、遊
離チオールを含有する結合基を介して蛋白を放射線標識
することを教示している。

ゴードマンス（Goedemans）ら、PCT出願番号WO 89/07
456号は、環状チオール化合物、特に２−イミノチオラ
ンおよび誘導体を用いて蛋白を放射線標識することを記
載している。

トーンバック（Thornback）ら、EPC出願番号第904022
06.8号は、チオール含有化合物、特に２−イミノチオラ
ンを用いた、放射線標識蛋白またはペプチドの製造およ
び使用を記載している。

スタットル（Stuttle）、PCT出願番号WO 90/15818号
は、RGD−含有オリゴペプチドのTc-99m標識を記載して
いる。

特異的結合ペプチドをTc-99mで標識することは可能で
あるにもかかわらず、いくつかのかかるペプチドは低い
結合部位親和性を示し、それにより、十分なラジオアイ
ソトープが標的部位に局在して放射線造影を形成するに
は不十分な標的部位へのペプチド結合の強さとなる。こ
の問題を解決する努力において、特異的結合ペプチド繰
り返し単位の線状配列よりなるペプチドが先行技術に記
載されている。

ロッドウェル（Rodwell）ら、1991年、PCT/US91/0311
6号は、線状配列のペプチド配列RGDを開示している。

しかしながら、特異的結合ペプチド単位の別の配列が
好ましいであろう。

発明の概要 本発明は、放射線造影剤の製造に有用な試薬を提供す
る。本発明は、シンチグラフィー検出可能な造影を形成
するのに十分なイン・ビボの標的部位への親和性を有す
る、複数の特異的結合ペプチド部位よりなる試薬を提供
する。複数の特異的結合ペプチド部位を本発明の試薬に
取り込むことにより、個々の結合親和性がイン・ビボの
シンチグラフィー検出可能な造影を形成するのに十分で
ない特異的結合ペプチドを使用できるようにしている。
他の場合においては、ある種の特異的結合ペプチドによ
り形成される別の方法で許容されるシンチグラフィー造
影の改良が、本発明の試薬を用いて達成される。

本発明は、多価リンカー部位に共有結合した複数の特
異的結合ペプチド部位よりなるシンチグラフィー造影剤
を製造するための試薬を提供し、ここに、テクネチウム
−99m結合部位は、該特異的結合ペプチド、該多価リン
カー部位、または該特異的結合ペプチドおよび該多価リ
ンカー部位の両方に共有結合している。また、本発明
は、かかるペプチド試薬より製造するTc-99m標識シンチ
グラフィー造影剤も提供する。本発明の該特異的結合ペ
プチドは、イン・ビボで標的に特異的に結合するペプチ
ドよりなる。

本発明の第一の態様において、本発明は、多価結合部
位に共有結合した、各々3-100個のアミノ酸を有する、
多数の特異的結合ペプチドよりなり、さらに、複数の該
特異的結合ペプチド、該多価リンカー部位、またはその
両方に共有結合しているTc-99m結合部位よりなる、哺乳
動物体内部位を造影するためのTc-99m標識されうる試薬
を提供する。本発明の好ましい具体例は、線状および環
状の特異的結合ペプチドよりなる。

第二の態様において、本発明は、多価結合部位に共有
結合した、3-100個のアミノ酸配列を有する多数の特異
的結合ペプチドよりなり、さらに、複数の該特異的結合
ペプチド、該多価結合部位、またはその両方に共有結合
しているTc-99m結合部位よりなる、哺乳動物体内部位を
造影するためのTc-99m標識されうる試薬を提供し、ここ
に、該Tc-99m結合部位は、式： C(pgp)^s-(aa)-C(pgp)^s ［式中、Ｃ（pgp）^ｓは保護されたシステインであっ
て、（aa）はアミノ酸である］を有する。好ましい具体
例において、該アミノ酸はグリシンである。好ましい具
体例において、該ペプチドは、３ないし30個のアミノ酸
よりなる。本発明の好ましい具体例は、線状および環状
の特異的結合ペプチドよりなる。

第三の態様において、本発明は、多価結合部位に共有
結合した、3-100個のアミノ酸配列を有する多数の特異
的結合ペプチドよりなり、さらに、複数の該特異的結合
ペプチド、多価リンカー部位、またはその両方に共有結
合しているTc-99m結合部位よりなる、哺乳動物体内部位
を造影するためのTc-99m標識されうる試薬を提供し、こ
こに、該Tc-99m結合部位は、式： A¹-CZ¹(B¹)-[C(R¹R²)]_m-X¹ ［式中、A¹はＨ、HOOC、H₂NOCまたは−NHOC; B¹はSHまたはNHR³； X¹はＨ、メチル、SHまたはNHR³； Z¹はＨまたはメチル； R¹およびR²は、独立して、Ｈまたは低級アルキル； R³はＨ、低級アルキルまたは−Ｃ＝O; ｎは０、１または2; B¹がNHR³である場合、X¹はSH、Z¹はＨであってｎは１
または2;X¹がNHR³である場合、B¹はSH、Z¹はＨであって
ｎは０または2;B¹がＨである場合、A¹はHOOC、H₂NOC、
または−NHOC、X¹はSH、Z¹はＨであってｎは０または1;
Z¹がメチルである場合、X¹はメチル、A¹はHOOC、H₂NOC
または−NHOC、B¹はSHであってｎは0;ここに、チオール
基は還元型である］を有する。

好ましい具体例において、該ペプチドは、３ないし30
個のアミノ酸よりなる。本発明の好ましい具体例は、線
状および環状の特異的結合ペプチドよりなる。

もう一つの具体例において、本発明は、多価結合部位
に共有結合した、3-100個のアミノ酸を有する多数の特
異的ペプチドよりなり、さらに、複数の該特異的結合ペ
プチド、該多価リンカー部位、またはその両方に共有結
合しているTc-99m結合部位よりなる、哺乳動物体内部位
を造影するためのTc-99m標識されうるペプチド試薬を提
供し、ここに、該Tc-99m結合部位は、式： ［本発明の目的には、この構造を有する放射線標識結合
部位は、ピコリン酸（Pic）に基づく部位をいうであろ
う］ または ［式中、ＸはＨまたは保護用基であって、（amino aci
d）はいずれかのアミノ酸を意味する］を有する。本発
明の目的には、この構造を有する放射線標識結合部位
は、ピコリルアミン（Pica）に基づく部位をいうであろ
う。好ましい具体例において、該アミノ酸はグリシンで
あって、Ｘはアセトアミドメチル保護用基である。さら
なる好ましい具体例において、該ペプチドは３ないし30
個のアミノ酸よりなる。本発明の好ましい具体例は、線
状および環状の特異的結合ペプチドよりなる。

さらにもう１つの本発明の具体例は、多価結合部位に
共有結合した、3-100個のアミノ酸を有する多数の特異
的結合ペプチドよりなり、さらに、該特異的結合ペプチ
ド、該多価リンカー部位、またはその両方に共有結合す
るTc-99m結合部位よりなる、哺乳動物体内部位を造影す
るためのTc-99m標識されうるペプチド試薬を提供し、こ
こに、該Tc-99m結合部位は、式： ［式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、CH₃またはC₂H₅でもよ
く；各(pgp)^sは、独立して、チオール保護用基またはＨ
でもよく;m、ｎおよびｐは、独立して、２または3;A²は
線状もしくは環状の低級アルキル、アリール、複素環、
それらの組合せまたは誘導体であって;Xはペプチドであ
る］；および （式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、CH₃またはC₂H₅;m、ｎ
およびｐは、独立して、２または3;Aは線状もしくは環
状の低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せ
または誘導体;VはＨまたはCO−ペプチド；R⁴はＨまたは
ペプチド；但し、ＶがＨである場合、R⁴はペプチドで、
R⁴がＨである場合、Ｖはペプチド［本発明の目的のた
め、これらの構造を有する放射線標識結合部位は、「BA
T」部位と呼ばれるであろう］本発明の好ましい具体例
は、線状および環状の結合ペプチドよりなる。）を有す
る。

本発明の試薬は、該特異的結合ペプチドもしくは該放
射線標識結合部位またはその両方が多価結合部位に共有
結合しているものとして提供される。本発明の多価結合
部位は、特異的結合ペプチドまたはTc-99m結合部位に共
有結合できる少なくとも２つの同一リンカー官能基より
なる。好ましいリンカー官能基は、第一級または第二級
アミン、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール
反応性基である。好ましい具体例において、該多価結合
部位は、共有結合して分岐多価結合部位を形成する多数
の多価形成部分よりなる。好ましい具体例において、該
多価結合部分はリジン、ビス−サクシンイミジルメチル
エーテル（BSME）、４−（2,2−ジメチルアセチル）安
息香酸（DMAB）、トリス（サクシンイミジルエチル）ア
ミン（TSEA）、Ｎ−［２−（Ｎ′,N′−ビス（２−サク
シンイミドエチル）アミノエチル）］−N⁶，N⁹−ビス
（２−メチル−２−メルカプトプロピル）−6,9−ジア
ザノナンアミド（BAT-BS）、４−（O-CH₂CO‐Gly-Gly.a
mide）アセトフェノン（ETAC）およびビス−サクシンイ
ミドヘキサン（BSH）よりなる。

また、本発明は、本発明の試薬とTc-99mとの錯体であ
るシンチグラフィー造影剤および本発明の試薬をTc-99m
で放射線標識する方法からもなる。本発明により提供さ
れる放射線標識錯体は、還元剤の存在下に本発明の試薬
とTc-99mとを反応させることにより形成される。好まし
い還元剤は、限定しないが、亜ジチオン酸イオン、第一
スズイオン、および第一鉄イオンを包含する。また、本
発明の錯体は、本明細書で提供した予め還元したTc-99m
錯体のリガンド交換により、本発明の試薬をTc-99mで標
識することによっても形成される。

また、本発明は、Tc-99mで放射線標識した本発明の試
薬であるシンチグラフィー造影剤を製造するためのキッ
トも提供する。本発明の試薬をTc-99mで標識するための
キットは、予め定めた量の本発明の試薬またはその混合
物および該試薬をTc-99mで標識するのに十分な量の還元
剤を含有する密閉バイアルよりなる。

本発明は、イン・ビトロ（in vitro）で化学合成する
ことにより本発明の試薬を製造する方法を提供する。好
ましい具体例において、ペプチドは、固相ペプチド合成
法により合成する。

本発明は、イン・ビボ・ガンマシンチグラフィー造影
を得ることにより、哺乳動物体内部位を造影するTc-99m
標識試薬であるシンチグラフィー造影剤を用いる方法を
提供する。これらの方法は、有効診断量の本発明のTc-9
9m放射線標識試薬を投与し、哺乳動物体内部位に局在し
たTc-99mにより放出されるガンマ線を検出することより
なる。

本発明の特に好ましい具体例は、以下のある種の好ま
しい具体例および請求の範囲のさらに詳細な説明から明
らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 Fig.1は、実施例５に記載する本発明のTc-99m標識シ
ンチグラフィー造影剤を用いた、雑種犬体内の深静脈血
栓造影のガンマシンチフォトを図示する。

発明の詳細な説明 本発明は、多価結合部位に共有結合した、3-100個の
アミノ酸配列を有する多数の特異的結合ペプチドよりな
り、さらに、該特異的結合ペプチド、該多価リンカー部
分またはその両方に共有結合したTc-99m結合部位よりな
る、哺乳動物体内の標的部位を造影するTc-99m標識シン
チグラフィー造影剤を製造するためのペプチド試薬を包
含する試薬を提供する。

このTc-99mの核特性および放射性特性が理想的なシン
チグラフィー造影剤とするため、このアイソトープで標
識することは本発明の利点である。このアイソトープ
は、140keVの単一光子エネルギーおよび約６時間の放射
性半減期を有し、⁹⁹Mo-^99mTc発生機から容易に入手でき
る。先行技術で公知の他の放射線核種は、さらに長期の
有効半減期を有するか（例えば、67.4時間の半減期を有
する¹¹¹In）または毒性である（例えば、¹²⁵I）。

放射線標識結合部位と、本発明により提供されるチオ
ール保護用基［(pgp)^s］に共有結合したチオールを包含
するような部位に共有結合したペプチドとにおいて、該
チオール保護用基は、同一または異なっていてもよく： −CH₂−アリール、（アリールは、フェニルまたはアル
キルもしくはアルキルオキシ置換フェニル）； −CH−（アリール）₂、（アリールは、フェニルまたは
アルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニル）； −Ｃ−（アリール）₃、（アリールは、フェニルまたは
アルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニル）； −CH₂−（４−メトキシフェニル）； −CH−（４−ピリジル）（フェニル）₂； −Ｃ(CH₃)₃ −９−フェニルフルオレニル； −CH₂NHCOR（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはア
リール）； −CH₂−NHCOOR（Ｒは非置換または置換アルキルもしく
はアリール）； −CONHR（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはアリ
ール）； −CH₂−Ｓ−CH₂−フェニル であるが、これらに限定されるものでない。

好ましい保護用基は、式−CH₂−NHCORを有し、ここ
に、Ｒは１ないし８個の炭素原子を有する低級アルキ
ル、フェニル、あるいは低級アルキル、ヒドロキシル、
低級アルコキシ、カルボキシ、または低級アルコキシカ
ルボニルで置換されたフェニルである。最も好ましい保
護用基は、アセトアミドメチル基である。

本発明の各特異的結合ペプチドを含有する具体例は、
アミノ酸配列よりなる。本発明で用いるアミノ酸なる語
は、天然に生じるものおよびその他の全てのＬ−ならび
にＤ−アミノ酸を包含させることを意図する。本発明に
より提供される特異的結合ペプチドよりなる試薬は、限
定しないが、以下のものを包含する（以下のペプチド中
のアミノ酸は、特に示さない限りＬ−アミノ酸であ
る）： （アミノ酸の単一略字は、ジー・ツバイ（G.Zuba
y），バイオケミストリー（Biochemistry）、（第２
版）、1988年（マクミラン・パブリッシング：ニュー・
ヨーク（MacMillen Publishing:New York）33頁）；他
の略字は表Ｉの脚注に見い出すことができる）。本発明
により提供される試薬のこのリストは例示的なものであ
って、限定またはは排除を意味するものではなく、本明
細書中に開示されるペプチドの組合せまたはその同等物
よりなる該試薬が本発明のいずれのキレート部位に共有
結合してもよいこと、ならびに、本明細書中に開示した
ごとき結合基よりなるかかるペプチドおよびキレート基
の組合せを包含することは本発明の範囲内であることを
は当業者に容易に理解されるであろう。

多価結合部位は、本発明の該特異的ペプチド、該Tc-9
9m結合部位、またはその両方に共有結合している。本発
明により提供される多価結合部位は、特異的結合ペプチ
ドまたはTc-99m結合部位に共有結合しうる少なくとも２
つのリンカー官能基よりなる。かかる官能基は、限定し
ないが、第一級および第二級アミン、ヒドロキシ基、カ
ルボン酸基およびチオール反応基を包含する。多価結合
部位は、好ましくは、特異的結合ペプチドまたはテクネ
チウム−99m結合部位に共有結合しうる少なくとも３つ
の官能基よりなる。好ましい多価結合部位は、リジン、
ホモリジン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタ
ミン酸のごときアミノ酸；線状および環状のアミンおよ
びポリアミン；ポリカルボン酸；ならびにジ−およびト
リマレイミドのごとき活性化さえたチオールを包含す
る。

また、その中で、該多価結合部位が、共有結合して分
岐した多価結合部位を形成する多数の多価結合部位より
なる具体例が好ましい。本発明の目的には、「分岐し
た」多価形成部位なる語は、限定しないが、式： を有する多価結合部位を包含させることを意図する。

本発明の特異的結合ペプチドは、イン・ビトロで化学
的に合成できる。かかるペプチドは、一般的にアミノ酸
シンセサイザー上で有利に製造できる。本発明のペプチ
ドは、当業者によく知られた技術を用いて、イン・ビト
ロの化学合成の間に、該放射線標識結合部位をペプチド
に共有結合させておいて合成できる。共有結合の特異的
部位が決定できるため、合成の間には該放射線標識部位
に共有結合させたかかるペプチドが有利である。

本発明の放射線標識結合部位は、ペプチド合成の間に
標的特異的ペプチドに導入することもできる。ピコリン
酸（Pic−）よりなる具体例［例えば、Pic-Gly-Cys（保
護用基）−］については、該放射線標識結合部位を、合
成において最後の（すなわち、アミノ−末端）残基とし
て合成できる。加えて、ピコリン酸を含有する放射線標
識結合部位を、リジンのε−アミノ基に共有結合させ
て、例えば、該ペプチド鎖のいずれの位置にも導入しう
るαＮ（Fmoc）‐Lys-εＮ［Pic-Gly-Cys（保護用
基）］を供してもよい。標的結合ペプチドへの導入の簡
単な様式を提供するため、この配列は特に有利である。

同様にして、該ピコリルアミン（Pica）を含有する放
射線標識結合部位［−Cys（保護用基）−Gly-Pica］
も、ペプチド合成の間に、配列［−Cys（保護用基）−G
ly−］を該ペプチド鎖のカルボキシル末端に包含させる
ことにより製造できる。該樹脂からの該ペプチドの切断
の後、該ペプチドのカルボキシル末端を活性化し、ピコ
リルアミンにカップリングさせる。この合成経路は、反
応性の側鎖官能基がマスクされた（保護された）ままで
あって、該ピコリルアミンの結合の間に反応しないこと
を要する。

該Pic-Gly-Cys−キレーターを含有する小合成ペプチ
ドの例を以下の実施例に提供する。本発明は、これらの
キレーターを実質的にいずれかのペプチドに導入して、
中性錯体としてTc-99mを保持する放射線標識ペプチドを
得ることを提供する。

また、本発明は、中性錯体としてTc-99mを保持した放
射線標識ペプチドを供する、Tc-99mで標識しうるビスア
ミン ビスチオール（BAT）キレーターを導入する特異
的結合小合成ペプチドも提供する。

放射線標識テクネチウムと本発明の試薬との錯体形成
においては、テクネチウム錯体、好ましくはTc-99m過テ
クネチウム酸の塩を、還元剤の存在下に本発明の試薬と
反応させる。好ましい還元剤としては、亜ジチオン酸イ
オン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンが挙げられ；
最も好ましい還元剤は塩化第一スズである。さらなる好
ましい具体例において、該還元剤は固相還元剤（solid-
phasereducing agent）である。便宜には、錯体および
かかる錯体を製造する手段は、予め定めた量の標識すべ
き本発明の試薬と、該試薬をTc-99mで標識するのに十分
な量の還元剤とを含有する密閉バイアルよりなるキット
形態で提供される。別法として、本発明の試薬と、予め
形成させたテクネチウムのラービル錯体およびトランス
ファーリガンドとして公知の他の化合物とを反応させる
ことによって該錯体を形成してもよい。このプロセス
は、リガント交換として公知であって、当業者によく知
られている。該ラービル錯体は、例えば、酒石酸、クエ
ン酸、グルコネートおよびマンニトールのごときトラン
スファーリガントを用いて形成しうる。本発明で有用な
Tc-99m過テクネチウム酸塩中には、ナトリウム塩のごと
きアルカリ金属塩、またはアンモニウム塩もしくは低級
アルキルアンモニウム塩が包含される。

本発明の好ましい具体例において、テクネチウム−99
m標識試薬を製造するためのキットが提供される。適量
の試薬を、き該試薬をTc-99mで標識するのに十分な量の
塩化第一スズまたは固相還元剤のごと還元剤を含有する
バイアルに導入する。適量の（例えば、酒石酸、クエン
酸、グルコネートおよびマンニトールのごとき）前記し
たトランスファーリガンドも含有できる。本発明に関す
るテクネチウム−99m標識シンチグラフィー造影剤は、
適量のTc-99mまたはTc-99m錯体を該バイアルに導入し、
以下の実施例４に記載の条件下にて反応させることによ
り製造できる。また、該キットは、例えば、浸透圧を調
整するための医薬上許容される塩、緩衝液、保存料等の
ごとき通常の医薬調整物質も含有できる。該キットの成
分は、液状、凍結または乾燥形態でもよい。好ましい具
体例において、キット成分は凍結乾燥形態にて提供され
る。本発明に関する放射線標識シンチグラフィー造影試
薬は、以下の実施例３記載の条件下に反応させることに
より製造してもよい。

本発明により提供される放射性標識試薬は、適当な放
射能を有して提供される。Tc-99m放射性錯体の形成にお
いては、mL当たり約0.01ミリキューリー（mCi）ないし1
00mCiの濃度の放射能を含有する溶液中の放射性錯体を
形成するのが一般的に好ましい。

本発明により提供されるテクネチウム−99m標識シン
チグラフィー造影剤は、哺乳動物体内部位を視覚化する
のに用いることができる。本発明によると、該テクネチ
ウム−99m標識シンチグラフィー造影剤は、単一ユニッ
ト注射用量にて投与する。本発明によると、放射線標識
の後に、滅菌セーライン溶液または血漿のごとき当業者
に公知のいずれの通常の担体を利用しても、種々の器
官、腫瘍等を診断的に造影する注射溶液を製造すること
ができる。一般的に、投与すべき該ユニット用量は、約
0.01mCiないし約100mCi、好ましくは、1mCiないし20mCi
の放射能を有する。ユニット投与量で注射すべき溶液
は、約0.01mLないし約10mLである。静脈内投与した後
に、数分以内に該器官または腫瘍のイン・ビボ造影が起
こりうる。しかしながら、所望により、該放射線標識試
薬を患者に投与した後、数時間またはさらに長くにおい
てさえ造影が起こりうる。ほとんどの場合において、投
与した用量のうち十分な量が、約0.1時間以内に造影す
べき領域に蓄積して、シンチフォトをとるのを可能とす
るであろう。診断目的のシンチグラフィー造影のいずれ
の常法も、本発明により利用することができる。

本発明により提供される該テクネチウム−99m標識試
薬および錯体は、セーライン水性媒質のごとき静脈内注
射用のいずれの通常の媒質、または血液血漿媒質中にて
静脈内投与してもよい。また、かかる媒質は、例えば、
浸透圧を調整するための医薬上許容される塩、緩衝液、
保存料等のごとき通常の医薬調整物質も含有してもよ
い。好ましい媒質は、ノーマル・セーラインおよび血漿
である。

これらの化合物を製造し標識する方法は、以下の実施
例にさらに十分に説明されている。これらの実施例は、
前記した方法のある種の態様および有利な結果を説明し
ている。これらの実施例は、例示的に示されており、限
定するものではない。

実施例１ BATキレーターの合成 A.N-BoC-N′−（５−カルボキシペンチル）−N,N′−ビ
ス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピ
ル）エチレンジアミンの合成 a.2−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロパ
ナールの合成 無水THF（2L）に溶解したトリフェニルメチルメルカ
プタン（362.94g、1.31mol、100mol％）を、アルゴン下
に氷浴中で冷却した。水素化ナトリウム（油中の60％;5
4.39g、1.35mol、104mol％）を、少量ずつ20分間にわた
り添加した。次いで、２−ブロモ−２−メチルプロパノ
ール（206.06g、1.36mol、104mol％；スチーブンス（St
evens）とギリス（Gillis）、1957年、ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J,Amer.
Chem.Soc.）、第79巻:3448-51頁）を、20分間にわた
り徐々に添加した。該反応混合物を室温まで温度上昇さ
せ、12時間撹拌した。該反応を水（1L）でクエンチし、
ジエチルエーテル（３×1L）で抽出した。該エーテル抽
出物を合わせ、飽和NaCl溶液（500mL）で洗浄し、Na₂SO
₄上で乾燥し、濾過した。該溶媒を減圧下に留去して、
濃厚な橙色の油を得た。該粗油をトルエン（200mL）に
溶解し、熱ヘキサンで2Lに希釈した。その混合物を焼結
ガラス漏斗を通して濾過し、−５°に12時間冷却した。
生成した白色の結晶性固形物を濾過により回収して、26
6.36gの標題化合物（収率59％）を得た。得られた化合
物の融点は、83−85℃と測定された。核磁気共鳴特性付
け実験により以下の分子特性を得た：¹ H NMR（300MHz,CDCl₃）：δ1.24（s,6H,2CH₃）,7.2−
7.35（m,9H）,7.59−7.62（m,6H）,8.69（s,H,−COH）¹³ C NMR（75MHz,CDCl₃）：δ22.86,55.66,67.48,126.8
5,127.75,129.72,144.79,197.31 b.N,N′−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチル
チオプロピル）エチレンジアミンの合成 エチレンジアミン（1.3mL、0.0194mol、100mol％）
を、メタノール（40mL）および無水THF（40mL）に溶解
した２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロ
パナール（13.86g、0.0401mol、206mol％）にアルゴン
下にて添加し、酢酸を滴下することにより該pHをpH6に
調整した。その溶液を20℃にて20分間撹拌した。シアノ
ホウ水素化ナトリウム（1.22g、0.0194mol、100mol％）
を添加し、その反応物を室温にて３時間撹拌した。シア
ノホウ水素化ナトリウム（1.08g）をさらに添加し、そ
の反応物を20℃にて17時間撹拌した。シアノホウ水素化
ナトリウムの最後分部（1.02g）を添加し、その反応物
をアルゴン下にて６時間加熱還流した。その反応を0.5M
のHCl（100mL）でクエンチし、酢酸エチル（２×100m
L）で抽出した。その有機抽出物を合わせ、順次、2MのN
aOH（60mL）、飽和NaCl溶液（60mL）で洗浄し、乾燥（N
a₂SO₄）し、濾過した。その溶媒を減圧下に留去して、1
6.67gの粗生成物が得られ、これをトルエン／ヘキサン
から結晶化させて10.20g（収率73％）の標題化合物の白
色結晶を得た。得られた化合物の融点は、83−86℃と測
定された。721（MH＋）のm/zをFABMS分析で得た。核磁
気共鳴特徴付け実験により以下の分子特性を得た：¹ H NMR（300MHz,CDCl₃）：δ1.12（s,12H,4CH₃）,1.64
（s,4H,N-CH₂‐C(Me)₂‐Ｓ）,2.52（s,4H,N-CH₂‐CH₂‐
Ｎ）,5.31（S,2H,2-NH）,7.12-7.30（m,18H,Ar）,7.62-
7.65（m,12H,Ar） c.N−（５−カルボエトキシペンチル）−N,N′−ビス
（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）
エチレンジアミンの合成 K₂CO₃（1.92g、13.9mmol、100mol％）、続いて５−ブ
ロモバレリン酸エチル（3.30mL、20.8mmol、150mol％）
を、CH₃CH（60mL）中のN,N′−ビス（２−メチル−２−
トリフェニルメチルチオプロピル）エチレンジアミン
（10.03g、13.9mmol）に添加した。その反応物（3.30m
L、20.8mmol、150mol％）をアルゴン下に一晩加熱還流
した。次いで、その溶液を濃縮してペーストとし、0.25
MのKOH（100mL）および酢酸エチル（100mL）の間に分配
させた。その水層を酢酸エチル（１×50mL）で抽出し、
合わせた酢酸エチル層を50mLの水およびNaCl溶液（２×
50mL）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、橙色の油に濃縮し
た。フラッシュクロマトグラフィー（300gのフラッシュ
シリカ、100％のCHCl₃から５％のMeOH/CHCl₃）により精
製して、純粋な標題化合物（7.75g、収率66％）を得
た。（化合物C₅₅H₆₄N₂O₂S₂の計算分子量849.24に比し
て）849の（MH＋）をFABMS分析で得た。

d.N-Boc-N′−（５−カルボキシペンチル）−N,N′−ビ
ス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピ
ル）エチレンジアミンの合成 1MのKOH（25mL、25.0mmol、274mol％）、続いて水（2
50mL）を、ジオキサン（200mL）中のＮ−（５−カルボ
エトキシペンチル）−N,N′−ビス（２−メチル−２−
トリフェニルメチルチオプロピル）エチレンジアミン
（7.75g、9.13mmol）に添加した。次いで、均一な溶液
が得られるまで撹拌しつつ、ジオキサンを滴下した。そ
の反応物を、一晩徐々に加熱還流した。ロータリーエバ
ポレーターによりほとんどのジオキサンを留去し、1Mの
KH₂PO₄および飽和NaHCO₃で溶液のpHを〜７〜８に調整し
た。次いで、該溶液を酢酸エチル（３×75mL）で抽出
し、合わせた有機層をNaCl溶液（50mL）で洗浄し、Na₂S
O₄で乾燥し、濃縮して、泡状物／固形物（6.35g、収率8
5％）を得た。

上記反応からの粗精製物に、(BOC)₂O（3.35g、15.4mm
ol、200mol％）、CH₃CN（50mL）および塩化メチレン（5
0mL）、続いてトリエチルアミン（1.0mL、7.2mmol、93m
ol％）を添加した。その反応物を、アルゴン下に室温に
て一晩撹拌した。次いで、その反応溶液を濃縮して、水
（100mL）および酢酸エチル（50mL）の間に分配させ
た。その水層を酢酸エチル（１×50mL）で抽出し、合わ
せた酢酸エチル層を、５％クエン酸およびNaCl溶液（各
々50mL）で洗浄し、次いで、乾燥（Na₂SO₄）して橙色油
に濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（200gのフ
ラッシュシリカ、100％のCDCl₃から５％のメタノール／
クロロホルム）により精製して、純粋な標題化合物N-Bo
c-N′−（５−カルボキシペンチル）−N,N′−ビス（２
−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）エチ
レンジアミン（2.58g、収率36％）を得た。（化合物 C
₅₈H₆₈N₂O₄S₂の計算値921.31に比して）921の（MH＋）を
FABMS分析により得た。

B.N-Boc-N′−（５−カルボキシペンチル）−N,N′−ビ
ス−［２−（４−メトキシベンジルチオ）−２−メチル
プロピル］エチレンジアミンの合成 a.N,N′−ビス−［２−（４−メトキシベンジルチオ）
−２−メチルプロピル］−エチレンジアミンの合成 メタノール（500mL）中のN,N′−ビス（２−メルカプ
ト−２−メチルプロピル）エチレンジアミン（11.23g、
47,5mmol;ディジオ（DiZio）ら、1991年、バイオコンジ
ュゲート・ケミストリー（Bioconjugate Chem.）第２
巻:353頁およびコルビン（Corbin）ら、1976年、ジャー
ナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Che
m.）第41巻:489頁参照）の溶液を、氷／水浴中にて冷却
し、次いで、気体アンモニアで45分間にわたり飽和させ
た。これに、塩化４−メトキシベンジル（17.0mL、125m
mol、264mol％）を添加した。この反応物を、アルゴン
下で撹拌しつつ一晩放置して室温に温めた。この溶液を
濃縮してペーストととし、次いで、ジエチルエーテル
（150mL）および0.5MのKOH（200mL）の間に分配させ
た。さらに、その水層をジエチルエーテル（２×50mL）
で抽出した。合わせた有機層を、NaCl溶液で洗浄し、清
澄無色な油性物に濃縮した。該油性物をジエチルエーテ
ル（200mL）に溶解し、次いで、さらなる沈澱が見当た
らなくなるまでジオキサン中の4.0MのHClで酸性化し
た。濾過によりその白色沈澱物を収集し、ジエチルエー
テルで洗浄した。該白色固形物をpH〜２にて熱水から再
結晶させた。濾過によりその生成物を収集し、29.94gの
モノ−およびジ−HCl塩の混合物を得た。該HCl塩を、1M
のKOH（100mL）および酢酸エチル（100mL）の間に分配
させた。その水層を酢酸エチル（２×30mL）で抽出し、
合わせた有機層をNaCl溶液で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、
濃縮して淡黄色油の遊離塩基として純粋な生成物を得た
（18.53g、収率82％）。核磁気共鳴特徴付け実験により
以下の分子特性を得た：¹ H NMR（300MHz1,CDCL₃）：δ7.25（d,4H,J＝９）,6.83
（d,4H,J＝９）,3.78（s,6H）,3.67（s,4H）,2.63（s,4
H）,2.56（s,4H）,1.34（s,12H） b.N−（５−カルボエトキシペンチル）−N,N′−ビス−
［２−（４−メトキシベンジルチオ）−２−メチルプロ
ピル］エチレンジアミンの合成 CH₃CN（50mL）中のN,N′−ビス−［２−（４−メトキ
シベンジルチオ）−２−メチルプロピル］−エチレンジ
アミン（4.13g、8.66mmol）に、K₂CO₃（1.21g、8.75mmo
l、101mol％）、続いて５−ブロモ吉草酸エチル（2.80m
L、17.7mmol、204mol％）を添加した。その反応物を還
流温度にて一晩撹拌し、次いで、真空中にてペーストに
濃縮した。その残渣を、酢酸エチル（100mL）および0.5
MのKOH（100mL）の間に分配した。その水層を酢酸エチ
ル（１×50mL）で抽出し、合わせた有機層をNaCl溶液
（50mL）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、黄色油（〜6g）に
濃縮した。純相分取用HPLC（25分間にわたり、100％のC
HCl₃から５％のメタノール／クロロホルム）により精製
して、純粋な標題化合物（1.759g、収率34％）を得た。
（C₃₃H₅₂N₂O₄S₂の計算値604.90に比して）605の（MH
＋）をFABMS分析により得た。核磁気共鳴特徴付け実験
により以下の分子特性を得た：¹ H NMR（300MHz、CDCl₃）：δ7.25（d,4H,J＝8.5）,6.8
3（d,4H,J＝8.5）,4.13（q,2H,J＝７）,3.793（s,3H）,
3.789（s,3H）,3.74（s,2H）3.67（s,2H）,2.6（m,10
H）,2.31（t,2H,J＝７）,1.6（m,2H）,1.5（m,2H）,1.3
4（s,12H）,1.28（t,3H,J＝７） c.N-Boc-N′−（５−カルボキシペンチル）−N,N′−ビ
ス−［２−（４−メトキシベンジルチオ）−２−メチル
プロピル］エチレンジアミンの合成 THF（40mL）中のＮ−（５−カルボキシペンチル）−
N,N′−ビス−［２−（４−メトキシベンジルチオ）−
２−メチルプロピル］エチレンジアミン（586mg、0.969
mmol）に、水（30mL）および1MのKOH（2.5mL、2.5mmo
l、260mol％）を添加した。その均一な溶液をゆっくり
ぢと一晩加熱還流した。次いで、その溶液を室温に冷却
し、ロータリーエバポレーターにてTHFを留去した。そ
の残渣を、H₂Oで50mLに希釈し、該pHを1MのHClで〜２〜
３に調整した。その溶液を酢酸エチル（３×30mL）で抽
出し、合わせた有機層をNaCl溶液（50mL）で洗浄し、Na
₂SO₄で乾燥し、濃縮して未精製酸（422mg、収率75％）
を得た。

前記反応からの該粗生成物に、CH₃CN（40mL）および
(BOC)₂O（240mg、1.10mmol、150mol％）、続いてトリエ
チルアミン（0.200mL、1.43mmol、196mol％）を添加し
た。その均一な溶液を、アルゴン下に室温にて一晩撹拌
した。次いで、その溶液をペーストに濃縮し、酢酸エチ
ル（25mL）および1MのKH₂PO₄（25mL）の間に分配させ
た。その有機層を５％のクエン酸（２×25mL）およびNa
Cl溶液（25mL）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、黄色油性物
に濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（50mLのフ
ラッシュシリカゲル、100％のクロロホルムから15％の
メタノール／クロロホルム）により精製して、純粋な標
題化合物N-Boc-N′−（５−カルボキシペンチル）−N,
N′−ビス−［２−（４−メトキシベンジルチオ）−２
−メチルプロピル］エチレンジアミン（344mg、収率70
％）を得た。（C₃₆H₅₆N₂O₆S₂も計算値676.97に比して）
677の（MH＋）をFABMS分析により得た。核磁気共鳴特徴
付け実験により以下の分子特性を得た：¹ H NMR（300MHz、CDCl₃）：δ7.20（d,4H,J＝７）,6.79
（d,4H,J＝７）,3.75（S,3H）,3.74（S,3H）,3.68（M,4
H）,3.35（M,4H）,2.65（M,2H）,2.53（M,4H）,2.31
（M,2H）,1.59（M,2H）,1.43（S,11H）,1.30（S,6H）,
1.26（S,6H） C.BAT-BM（Ｎ−［２−Ｎ′,N′−ビス（２−マレイミド
エチル）アミノエチル）］−N⁶，N⁹−ビス（２−メチル
−２−トリフェニルメチルチオプロピル）−6,9−ジア
ザノナンアミド）の合成 BAT-BMは以下のごとく製造した。BAT酸（N⁹−（ｔ−
ブトキシカルボニル）−N⁶，N⁹−ビス（２−メチル−２
−トリフェニルメチルチオプロピル）−6,9−ジアザノ
ナン酸）（10.03g、10.89mmol）および75mLの乾燥塩化
メチレンCH₂Cl₂）を、磁性撹拌機およびアルゴン・バル
ーンを装備した250mLの丸底フラスコに添加した。この
溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（3.40mL、21.7
mmol、199mol％）、続いてＮ−ヒドロキシ−スクシンイ
ミド（3.12g、27.1mmol、249mol％）を添加した。この
溶液は、１時間以内に濁り始めることが観察され、さら
に室温にて合計４時間撹拌しつつインキュベートした。
次いで、30mLの塩化メチレン中のトリス（２−アミノエ
チル）アミン（30mL、200mmol、1840mol％）の溶液を添
加し、撹拌を一晩続けた。次いで、その反応混合物を減
圧下に濃縮し、その残渣を酢酸エチル（150mL）および
0.5Mの炭酸カリウム（K₂CO₃;150mL）の間に分配させ
た。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、濃縮して粗生
成物Ｎ−［２−Ｎ′,N′−ビス（２−アミノエチル）ア
ミノエチル）］−N⁹−（ｔ−ブトキシカルボニル）−
N⁶，N⁹−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチ
オプロピル）−6,9−ジアザノナンアミドを泡状物／油
として得た。

この粗生成物を、磁性撹拌気体を装備し、300mLのTHF
を含有した1000mLの丸底フラスコに添加し、次いで、30
mLの飽和重炭酸ナトリウム（NaHCO₃）、100mLの水およ
びＮ−メトキシカルボニルマレイミド（6.13g、39.5mmo
l、363mol％）を添加した。この均一な混合物を室温に
て一晩撹拌した。ロータリー・エバポレーターにより該
混合物からTHFを留去し、その水性残渣を酢酸エチル
（２×75mL）で２回抽出した。これら抽出物の合わせた
有機層を、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥
し、媒質濾過器を通して濾過し、約12gの粗生成物に濃
縮した。液体クロマトグラフィー（250gの二酸化ケイ素
／クロロホルム→クロロホルム中の２％メタノールのグ
ラジエントにて溶出）により精製して、5.3gの純粋な精
製物（Ｎ−［２−（Ｎ′,N′−ビス（２−マレイミドエ
チル）アミノエチル）］）−N⁹−（ｔ−ブトキシカルボ
ニル）−N⁶，N⁹−ビス（２−メチル−２−トリフェニル
メチルチオプロピル）−6,9−ジアザノナンアミド（収
率40％に相当）、あわせて、再精製により純粋な生成物
が得られる粗生成物約5gも得た。精製した生成物の化学
分析は、以下のごとくBAT-BMとしてのそれを同定した：¹ H NMR（200MHz、CDCl₃）：δ0.91（12H,s）,1.38（9H,
s）,1.2-1.6（4H,m）,2.06（2H,s）,2.18（2H,t,J＝
７）,2.31（4H,m）,2.55（2H,t,J＝５）,2.61（4H,t,J
＝６）,2.99（2H,s）,3.0-3.3（4H,m）,3.46（4H,t,J＝
６）,6.49（−NH,t,J＝４）,6.64（4H,s）,7.1-7.3（18
H,m）,7.6（12H,t,J＝17） D.［BAT］−結合（εＮ）Lys（αＮε‐Fmoc）［Ｎ−ε
−（N⁹−ｔ−ブトキシカルボニル）−N⁶，N⁹−ビス［２
−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］
−6,9−ジアザノナノイル）−Ｎ−α−Fmoc-lysineの合
成 撹拌機およびアルゴン・バルーンを装備した100mLの
一首丸底フラスコを、50mLのCH₂Cl₂中のN⁹−（ｔ−ブト
キシカルボニル）−N⁶，N⁹−ビス［２−メチル−２（ト
リフェニルメチルチオ）プロピル］−6,9−ジアザノナ
ン酸（BAT酸;3.29g、3.57mmol）で室温にて満たした。
これに、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC;580μ
Ｌ、3.70mmol、104mol％）、直後に続いてＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド（HOSu;432mg、3.75mmol、105mol％）
を添加した。その反応物を室温にて一晩撹拌し、その間
に白色沈殿物が発生した。その混合物を濾過し、その濾
液を固形泡状物に濃縮した。100mLの丸底フラスコ中の
その粗泡状物を、75mLのジメトキシエタンおよび水の2:
1混合物に溶解した。この均一の溶液に、Ｎ−α−Fmoc
−塩酸リジン（1.52g、3.75mmol、105mol％）、続いてK
₂CO₃（517mg、3.74mmol、105mol％）を添加し、その黄
色溶液を室温にて一晩撹拌した。次いで、その溶液を、
100mLの酢酸エチルおよび100mLの水を含有する250mLの
エルレンマイヤー・フラスコ（erlenmeyer flask）に注
いだ。その有機層を分離し、水層をさらに50mLの酢酸エ
チルで抽出した。合わせた有機層をブライン（100mL）
で１回洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し、黄色固形物に濃縮し
た。この粗生成物を低圧液体クロマトグラフィー（150g
のSiO₂、CHCl₃中のCHCl₃−＞10％メタノールで溶出）に
より精製した。このように、3.12gの命名した化合物を
製造した（収率69％）。該精製生成物の化学分析によ
り、以下のごとくその同定が確認された：¹ H NMR（300MHz、CDCl₃）：δ0.88（12H,s,broad）,1.0
5-1.45（19H,m）,1.8-2.1（4H,m）,1.8-2.47（4H,m）,
2.75-3.2（6H,m）,3.9-4.3（4H,m）,7.2（22H,m）,7.6
（16H,s,bound） FABMSのMH⁺により1270.6と予想され、1272であること
が見い出された。

E.BAM（N¹−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N¹，N⁴−ビ
ス［２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロ
ピル］−1,4,10−トリアザデカンの合成 スターラー・バー、還流コンデンサーおよびアルゴン
・バルーンを付した250mLの一首丸底フラスコを、50mL
のCH₃CNおよび30mLのジオキサン中のN¹，N⁴−ビス［２
−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］
−エチレンジアミン（BAT-I;10.0g、14.01mmol）で満た
した。これに、Ｎ−（５−ブロモペンチル）−フタルイ
ミド（8.04g、27.1mmol、194mol％）、続いてK₂CO₃（2.
95g、21.3mmol、152mol％）を添加した。その混合物を
アルゴン下にて２日間加熱還流した。次いで、その反応
混合物を濃縮し、その残渣を150mLの水および150mLの酢
酸エチルの間に分配させた。その有機層を分離して、
（約pH10の）水層を50mLの酢酸エチルでさらに抽出し
た。合わせた有機層をブライン（75mL）で１回洗浄し、
Na₂SO₄上で乾燥し、油性物に濃縮した。低圧液体クロマ
トグラフィー（300gのSiO₂、CHCl₃中のCHCl₃−＞２％の
メタノールで溶出）により精製し、9.20gの９−フタル
イミド−N¹，N⁴−ビス［２−メチル−２−（トリフェニ
ルメチルチオ）プロピル］−1,4−ジアザノナンを黄色
泡状物（収率70％）として得た。この中間体の精製した
生成物の化学分析により、以下のごとくその同定が確認
された：¹ H NMR（300MHz、CDCl₃）：δ1.01（6H,s）,1.03（6H,
s）,1.15-1.4（2H,t）,1.98（2H,s）,2.10（2H,s）,2.2
8（2H,m）,2.45（3H,m）,3.68（2H,t）,7.15-7.35（18
H,m）,7.62（12H,t）,7.72（2H,m）,7.85（2H,m） FABMSのMH⁺により935.4と予想され、936であることが
見い出された。

スターラー・バーを付した500mLの一首丸底フラスコ
を、75mLのCH₃CNおよび20mLのCH₂Cl₂中の９−フタルイ
ミド−N¹，N⁴−ビス［２−メチル−２−（トリフェニル
メチルチオ）プロピル］−1,4−ジアザノナン（8.83g、
9.43mmol）で満たした。これに、K₂CO₃（1.30g、9.41mm
ol、100mol％）、続いて、重炭酸ジ−tert−ブチル（2.
15g、9.85mmol、104mol％）を添加し、その反応物を室
温にて一晩撹拌した。次いで、その反応混合物を濃縮
し、各々100mLの水および酢酸エチルの間に分配させ
た。その有機層を分離し、水層を50mLの酢酸エチルでさ
らに抽出した。合わせた有機層をブライン（75mL）で１
回洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し、濃縮して9.69gの未精製
９−フタルイミド−N¹−（ｔ−ブトキシカルボニル）−
N¹，N⁴−ビス［２−メチル−２−（トリフェニルメチル
チオ）プロピル］−1,4−ジアザノナンを黄色泡状物（9
9％粗収率）として得た。さらに精製することなくこの
粗生成物を用いた。

スターラー・バーおよび還流コンデンサーを付した25
0mLの一首丸底フラスコを、25mLのTHF中の９−フタルイ
ミド−N¹−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N¹，N⁴−ビス
［２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピ
ル］−1,4−ジアザノナン（5.50g、5.319.43mmol）で満
たした。これに、100mLのエタノールおよび5mLの水を添
加した。水の添加は、出発物質の溶液からの析出を引き
起こした。ヒドラジン水和物（1.2mL、24,7mmol、466mo
l％）を添加し、その反応物を２日間加熱還流した。そ
の反応混合物を濃縮し、各々100mLの水および0.25MのK₂
CO₃の間に分配させた。その有機層を分離し、ブライン
（75mL）で１回洗浄し、Na₂SO₄上に乾燥し、固形泡状物
に濃縮した。その粗生成物を、低圧液体クロマトグラフ
ィー（100gのSiO₂、CHCl₃−＞CHCl₃中の５％メタノー
ル、CHCl₃中の200mLの２％トリエチレナミンで予め処理
したカラム）により精製し、3.27gの純粋なN¹−（ｔ−
ブトキシカルボニル）−N¹，N⁴−ビス［２−メチル−２
−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］−1,4,10−ト
リアザデカンを黄色泡状物として得た（収率68％）。

精製生成物の化学分析により以下のごとく同定が確認
された：¹ H NMR（300MHz、CDCl₃）：δ0.9（12H,s）,1.2（6H,
s）,1.36（9H,s）,2.05（4H,m）,2.24（2H,t）,2.31（2
H,t）,2.62（3H,t）,3.0（2H,s,broad）,3.1（2H,s,bro
ad）,7.2（18H,m）,7.6（12H,t）FABMSのMH⁺により905.
5と予想され、906.5であることが見い出された。

実施例２ 多価結合部位の合成 1.TMEA［トリス（２−マレイミドエチル）アミン］の合
成 50mLの飽和重炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、氷浴中
にて冷却したトリス（２−アミノエチル）アミン（1.49
mL、10mmol）を、Ｎ−カルボメトキシマレイミド（4.80
8g、31mmol）で処理した。その混合物を氷上にて30分間
撹拌し、次いで、室温にてさらに30分間撹拌した。次い
で、その混合物をジクロロメタンおよび水の間に分配さ
せ、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させて
3.442gの生成物を得た。逆相薄層クロマトグラフィー
（RP-TLC）に付して、実質的に１スポット（アセトニト
リル:0.5Mの塩化ナトリウム1:1にてR_f＝0.63）を得た。
この生成物3.94mmol（1.817g）を20mLのテトラヒドロフ
ランおよび20mLの飽和重炭酸ナトリウムに溶解し、２時
間混合した。次いで、その反応混合物を酢酸エチルおよ
び水の間に分配させた。その有機層を飽和塩化ナトリウ
ムで洗浄し、硫酸マグネシウム上に乾燥し、濾過した。
その酢酸エチル溶液をヘキサンで希釈し冷却した。濾過
により固形TMEAを収集し、乾燥して832mgを得た。該生
成物の化学分析より、以下のごとくTMEAの同定を確認し
た：¹ H NMR（CDCl₃）:2.65（tr.2H）,3.45（tr.2H）,6.64
（s.2H）¹³ C NMR（CDCl₃）,35.5,51.5,133.9,170.4 2.TMEB（４−［１−（２−トリルスルホニルメチル）エ
テニルカルボニル］安息香酸）の合成 ローソン（Lawson）および共同研究者の方法（1990
年、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Bioconjuga
te Chemistry）第１巻:36頁）を用いて、２−チオクレ
ゾールから４−（ビス−（２−トルエンチオメチル）ア
セチル）安息香酸を製造した。得られた化合物の同定
は、以下のごとく化学分析により確立した： FABMS:MH⁺＝436¹ H NMR（CDCl₃）＝2.62（s,6H）,3.2-3.4（m,4H）,3.94
（d tr,1H）,7.10-7.26（m,8H）,7.64（d,2H）,8.07
（d,2H）¹³ C NMR（CDCl₃）:20.2,34.9,45.4,126.5,126.8,128.1,
129.9,130.3,130.4,132.9,133.9,138.9,140.5 50％のメタノール／水（12.5mL）中の４−（ビス−
（２−トルエンチオメチル）アセチル）安息香酸（1.86
5g、4.27mmol）に、酢酸（2.69mL）、続いて30％の過酸
化水素（2.61mL）およびタングステン酸二ナトリウム二
水和物（0.187g、0.56mmol）を添加した。その混合物を
一晩撹拌し、粗生成物を濾別した。メタノール／水から
再結晶させ、逆相HPLC（0.1％CF₃COOH／アセトニトリル
／水）に付して、TMEB（178mg）を得た。得られた化合
物の同定は、以下のごとき化学分析によって確立した：¹ H NMR（DMSO-d6）:2.68（s,3H）,4.56（s,2H）,5.95
（s,1H）,6.27（s,1H）,7.37-8.05（m,8H） 実施例３ 固相ペプチド合成法 固相ペプチド合成法（SPPS）は、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは２
−（1H−ベンゾ−トリアゾール−１−イル）−1,1,3,3
−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェー
ト／ヒドロキシベンゾトリアゾール（HBTU/HOBT）でカ
ップリングした９−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ル（Fmoc）アミノ末端保護と、カルボキシル末端酸には
ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン
（HMP）樹脂、あるいはカルボキシル末端アミドにはリ
ンク（Rink）アミド樹脂とを用いて、アプライド・バイ
オシステムズ（Applied Biosystems）・モデル431Aペプ
チドシンセサイザーを用いた0.25ミリモルスケールで行
った。樹脂結合生成物は、トリフルオロ酢酸、所望によ
り100:5:5:2.5:2の比の水、チオアニソール、エタンジ
チオール、およびトリエチルシランよりなる溶液を用い
て室温にて1.5ないし３時間ルーチン的に切断した。

適当には、樹脂に結合した遊離Ｎ−末端アミノペプチ
ドをNMP（Ｎ−メチルピロリジノン）中の20％v/v無水酢
酸で30分間処理することにより、Ｎ−末端アセチル基を
導入した。適当には、適当な２−ハロ−酢酸をSPPSの間
にカップリングさせるべき最後の残基として用いるか、
樹脂に結合したＮ−末端遊離アミノペプチドを、NMP中
の２−ハロ−酢酸／ジイソプロピルカルボジイミド/N−
ヒドロキシスクシンイミドまたはNMP中の２−ハロ−無
水酢酸／ジイソプロピルエチルアミンの一方で処理する
かのいずれかにより、２−クロロアセチルおよび２−ブ
ロモアセチル基を導入した。適当には、0.5-1.0mMのEDT
Aを含有するリン酸または重炭酸緩衝液（pH8）中の0.1-
1.0mg/mL溶液を撹拌し、続いて酢酸で酸性化し、凍結乾
燥してHPLC精製することにより２−ハロアセチル化ペプ
チドを環化させた。適当には、Cys-Cysジスルフィド結
合の環化は、0.006MのK₃Fe(CN)₆のアリコート含有するp
H7の緩衝液中の0.1mg/mLの前駆体無システイン チオー
ルペプチドで、安定な黄色が消えなくなるまで処理する
ことによりCys-Cysジスルフィド結合の環化を行った。
過剰量のオキシダントを過剰量のシステインで還元し、
その混合物を凍結乾燥し、次いでHPLCにより精製した。

適当には、ペプチド合成の最後のおける残基としてピ
コリン酸を用いることにより「Pic」基を導入した。適
当には、ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドを用いて、ピコリルアミンを前駆
体ペプチドに結合させることにより「Pica」基を導入し
た。適当には、SPPSの間にカップリングさせるべき最後
の残基として適当なBAT酸を用いるか、該樹脂に結合し
たＮ−末端遊離アミノペプチドをNMP中のBAT酸／ジイソ
プロピルカルボジイミド/N−ヒドロキシスクシンイミド
で処理するかのいずれかによりBATリガンドを導入し
た。適当には、DMF、NMPもしくはCH₂Cl₂中のジイソプロ
ピルカルボジイミド/N−ヒドロキシスクシンイミドの混
合物またはHBTU/HOBtの混合物でペプチドカルボキシレ
ートを最初に活性化させ、続いてジイソプロピルエチル
アミンの存在下にカップリングさせることにより［BA
M］を該ペプチドに結合させ；カップリングさせた後
に、該結合物を前記のごとく脱保護化した。

適当には、単一のチオール含有ペプチド（50mMリン酸
ナトリウム緩衝液中の５ないし50mg/mL、pH8）を、予め
アセトニトリルに溶解した0.5モル当量のBMME（ビス−
マレイミドメチルエーテル）と室温にて約1-18時間反応
させることによりBSME付加物を製造した。その溶液を濃
縮し、その生成物をHPLCにより精製した。適当には、BM
MEの代わりにビス−マレイミドヘキサンを用いてBSH付
加物を製造した。

適当には、（DMF中の10ないし100mg/mLのペプチド濃
度、あるいは50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH8）／
アセトニトリルまたはTHF中の５ないし50mg/mLのペプチ
ド濃度の）単一のチオール含有ペプチドを、予めアセト
ニトリルまたはDMFに溶解した0.33モル当量のTMEA（ト
リス（２−マレイミドメチル）アミン；（出典明示して
本明細書の一部とみなす）同時係属出願米国特許出願第
07/955,466号参照）と、１モル当量のトリエタノールア
ミンの存在または不存在下、室温にて約1-18時間反応さ
せることによりBSME付加物を製造した。付加物を含有す
るかかる反応混合物を濃縮し、次いで、該付加物をHPLC
を用いて精製した。

適当には、（50mMのリン酸ナトリウム（pH8）／アセ
トニトリルまたはTHF中の２ないし50mg/mLペプチドの濃
度の）単一のチオール含有ペプチドを、予めアセトニト
リルまたはTHFに溶解した0.5モル当量のBAT-BM（Ｎ−
［２−（Ｎ′,N′−ビス（２−マレイミドエチル）アミ
ノエチル）］−N⁹−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N⁶，
N⁹−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプ
ロピル）−6,9−ジアザノナンアミド；（（出典明示し
て本明細書の一部とみなす）同時係属出願米国特許出願
第08/044,825号参照）と室温にて約1-18時間反応させる
ことにより製造した。次いで、その溶液を蒸発乾固さ
せ、10mLのTFAおよび0.2mLのトリエチルシランで１時間
処理することにより［BAT-BS］−ペプチド結合物を脱保
護した。その溶液を濃縮し、エーテルでその生成付加物
を沈殿させ、次いでHPLCにより精製した。

適当には、（DMF中の10ないし100mg/mLの）単一のチ
オール含有ペプチドを、0.5モル当量のTMEB（実施例２
に記載）および１モル当量のトリエタノールアミンと室
温にて約12-18時間反応させることによりDMAB付加物を
製造した。次いで、DMFを真空中にて留去し、その生成
物をHPLCにより精製した。

後記の表Ｉの脚注に記載した条件下における分取用高
圧液体クロマトグラフィー（HPLC）により粗ペプチドを
精製した。次いで、溶出画分を凍結乾燥し、各生成物の
同定を高速原子衝撃質量分析（FABMS）または電子スプ
レー質量分析（ESMS）により確認した。

実施例４ Tc-99mで放射線標識する一般的法 実施例３のごとく製造した0.1mgのペプチド試薬を、
0.1mLの水、もしくは50:50のエタノール：水、あるいは
リン酸緩衝セーライン（PBS）または50mMのリン酸カリ
ウム緩衝液（pH＝５、６または7.4）に溶解した。200mC
iまで含有するTc-99m過テクネチウム酸ナトリウム1.0mL
でグルコスカン・バイアル（Glucoscan vial）（イー・
アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール社（E.I.DuPont de Ne
mours,Inc.）製）を復元することによりTc-99mグリセプ
テートを製造し、室温にて15分間放置した。次いで、25
μｌのTc-99mグリセプテートを該試薬に添加し、室温ま
たは100℃にて15-30分間反応を進行させ、次いで0.2μ
ｍのフィルターを通して濾過した。

該Tc-99m標識ペプチド試薬の純度は、表Ｉの脚注に記
載した条件を用いたHPLCにより測定した。放射性成分
は、積算レコーダーにつなげた放射線検出機により検出
した。これらの条件下にては、Tc-99mグリセプテートお
よびTc-99m過テクネチウム酸ナトリウムが１ないし４分
の間に溶出する一方、Tc-99m標識ペプチドははるかに後
の時間に溶出する。

以下の表は、本明細書に記載した方法を用いて実施例
３に従い首尾よくTc-99m標識したペプチドを製造できた
ものを説明している。

ビダック・カラム（Vydak column）＝ガードカラム付
きのビダック（Vydak）218TP54RP-18、５μ×220mm×4.
6mm分析カラムウォーターズ・カラム（Waters column）
＝ウォーターズ・デルタパック（Waters DeltaPak）C1
8、５μ×150mm×3.9mmカラム 条件:1.10分間に100％のＡから100％のB₉₀、ウォーター
ズ・カラム 2.20分間に100％のＡから100％のB₉₀、ウォータ
ーズ・カラム 3.10分間に100％のＡから100％のB₉₀、ビダック
・カラム アミノ酸の単一略語は、ジー・ツベイ（G.Zubay）、
バイオケミストリー（Biochemistry）、（第２版）、19
88年（マクミラン・パブリッシング：ニュー・ヨーク
（MacMillen Publishing:New York）、33頁に見い出す
ことができる。下線は、誘導基の結合したアミノ酸間で
のチオール架橋の形成を示す；ペプチドは、かかる各ペ
プチド中の非保護システイン残基（Ｃ）の遊離チオール
基を介して、BSH、DMAB、BSME、TSEAまたは［BAT-BS］
リンカーに結合している。Picはピコリノイル（ピリジ
ン−２−カルボニル）;Acmはアセトアミドメチル;Apcは
Ｌ−［Ｓ−（３−アミノプロピル）システイン；F_DはＤ
−フェニルアラニン；Y_DはＤ−チロシン;K（Ｎ_ε‐BA
T）は側鎖のε−アミノ基を介してBAT基に共有結合した
リジン;maは２−メルカプト酢酸;BATはN⁶，N⁹−ビス
（２−メルカプト−２−メチルプロピル）−6,9−ジア
ザノナン酸;BAT-BSはＮ−［２−Ｎ′,N′−ビス（２−
スクシンイミドエチル）アミノエチル］−N⁶，N⁹−ビス
（２−メルカプト−２−メチルプロピル）−6,9−ジア
ザノナンアミド;BSMEはビス−スクシンイミドメチルエ
ーテル;TSEAはトリス−（２−スクシンイミドエチル）
アミン;BSHは1,6−ビス−スクシンイミドヘキサンであ
って;DMABは４−（2,2−ジメチルアセチル）安息香酸で
ある。本発明の試薬の化学構造は以下の通りである： 実施例５ イヌ・モデルにおけるTc-99m標識ペプチドを用いた深静
脈血栓症のイン・ビボ造影 雑種犬（25-35 lb、一晩絶食させた）にケタミンおよ
びアセプロザミンの組合せを筋肉内注射して鎮静させ、
次いで、ペンタバルビタールナトリウムを静脈内注射し
て麻酔した。各動物において、右大腿静脈の半末端に18
ゲージのアンギオカト（angiocath）を挿入し、8mmのダ
クロン^R(Dacron^R)を巻いたステンレス・スチール塞症コ
イル（クック・コーポレイション社（Cook Co.）、ブル
ーミントン、インディアナ州（Bloomingtton IN））を
大腿のおよそ中間部の大腿静脈に入れた。該カテーテル
を取り出し、傷を縫合し、該コイルの位置をＸ線によっ
て調べた。次いで、該動物を一晩で回復させた。

コイルを設置して１日後に、各々の動物を再度麻酔
し、各々の前脚にセーラインを静脈内点滴し、膀胱カテ
ーテルを挿入して尿を採取した。低エネルギー、全目的
コリメーターを装備し、Tc-99mにフォトピークを合わせ
たガンマカメラの下に該動物を仰向けに固定した。

Tc-99m標識ペプチド［185-370mBq（5-10mCi）Tc-99
m］をその挿入部位の１の前脚静脈ラインに連続して注
射した。第２のラインは、血液採取のため残した。

ガンマカメラ造影を注射と同時に開始した。最初の10
分間にわたり心臓上の前側造影を動的試験で得（10秒の
造影を得た）、次いで、注射後１、２、３および４時間
に静的造影を得た。脚部にわたる前側造影を500,000カ
ウント、または20分間（いずれにせよ短い）、注射後
１、２、３および４時間後に得た。鉛シールドを膀胱上
方に覆って設置して脚部造影を採取した。

最後の造影の後に各々の動物をペントバルビタールで
深く麻酔した。２つの血液試料をヘパリン処理したシリ
ンジを用いて心臓穿刺上に採取し、続いて安楽死させる
量の塩化カリウム溶液を心臓内または静脈内ホーラス注
射で投与した。血栓を含有する大腿静脈、反対の（対照
の）脚の同様な部位の静脈、血栓に隣接する静脈部位お
よび腿筋肉の試料を注意深く切り取った。血栓、コイル
およびコイル・ダクロン繊維（coil Dacron fibre）を
血管から切り取った。血栓、セーラインで洗浄した血管
試料、コイル（coil）およびコイル・ダクロン繊維を分
離し、各々の試料を予め重量を測定した試験管に入れ
た。その試料の重量を測定し、注射用量の既知画分と平
行して、Tc-99mチャンネルのガンマカウンターウェル中
にて計測した。

新鮮な血栓重量、血栓中の％注射用量（％ID）/gおよ
び麻酔の直前に得た血液ならびに血栓／血液ならびに血
栓／筋肉比を測定した。コンピューターに保存した造影
から、血栓および隣接筋肉を掃引する、注目する領域
（ROI）において測定したカウント／ピクセルの分析に
よって、血栓／バックグラウンド比を測定した。これら
の実験からの組織データは以下の表に示す。Tc-99m標識
ペプチドを用いてイン・ビボ検出した静脈血栓の位置を
示すシンチグラフィー画像を図１に示す。ここで、各造
影図は注射後以下の時間に撮影したシンチフォトを示
す:A＝23分;B＝１時間11分;C＝２時間19分;D＝３時間28
分およびＥ＝３時間42分。

これらの結果は、本発明のTc-99m標識試薬を用いる
と、イン・ビボにて深静脈血栓を容易かつ効率的に位置
決定できることを示す。位置決定は注射後１時間以内に
明らかに確立されるものであって、コントラストおよび
焦点の鮮明度が増大したままで、注射後４時間近くにわ
たって持続する。

これまでの開示は本発明のある特別の具体例を強調し
たものであって、全ての修飾またはそれに同等の変法
は、請求の範囲に記載するごとき本発明の精神および範
囲の中に入ることに注意すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−316329（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/00,7/06,7/08 A61K 49/02 G01N 33/60 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ａ）合成により調製された複数の特異的結
   合ペプチド、 ｂ）第一級アミン、第二級アミン、ヒドロキシル基、カ
   ルボン酸基およびチオール−反応性基よりなる群から選
   択される少なくとも２個の同一の官能基を含む多価リン
   カー、および ｃ）保護されたチオール、単一チオール、ピコリン酸、
   ピコリルアミンおよびビスアミン、ビスチオールよりな
   る群から選択される＿テクネチウム−99m結合部位を含
   み、 ここに、該ペプチドの各々は３ないし100個のアミノ酸
   を含み、かつ該多価リンカーに共有結合しており； ここに、該テクネチウム−99m結合部位は該ペプチドの
   全部もしくは一部、該リンカーまたは双方に共有結合し
   ており； ここに、チオール保護用基は−CH₂−アリール、−CH−
   （アリール）₂、−Ｃ−（アリール）₃、−CH₂−（４−
   メトキシフェニル）、−CH−（４−ピリジル）（フェニ
   ル）₂、−C(CH₃)₃、−９−フェニルフルオレニル、−CH
   ₂NHCOR、−CH₂‐NHCOOR、−CONHRおよび−CH₂‐S-CH₂−
   フェニルよりなる群から選択され、該アリールはフェニ
   ルまたはアルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニル
   であって、該Ｒは１ないし８個の炭素原子を有する低級
   アルキル、フェニル、あるいは低級アルキル、ヒドロキ
   シル、低級アルコキシ、カルボキシ、または低級アルコ
   キシカルボニルで置換されたフェニルである ことを特徴とするシンチグラフィー造影剤調製用の試
   薬。
2. 【請求項２】ａ）合成により調製された複数の特異的結
   合ペプチド、 ｂ）第一級アミン、第二級アミン、ヒドロキシル基、カ
   ルボン酸基およびチオール−反応性基よりなる群から選
   択される少なくとも２個の同一の官能基を含む多価リン
   カー、および ｃ） I. Ｃ（pgp）^s-(aa)-C(pgp)^s ［式中、C(pgp)^sは、−CH₂−アリール、−CH−（アリー
   ル）₂、−Ｃ−（アリール）₃、−CH₂−（４−メトキシ
   フェニル）、−CH−（４−ピリジル）（フェニル）₂、
   −C(CH₃)₃、−９−フェニルフルオレニル、−CH₂NHCO
   R、−CH₂‐NHCOOR、−CONHRおよび−CH₂‐S-CH₂−フェ
   ニルよりなる群から選択される基（チオール保護用基）
   で保護されたチオール基を有するシステインであり、 ここに、該アリールはフェニルまたはアルキルもしくは
   アルキルオキシ置換フェニルであり、該Ｒは１ないし８
   個の炭素原子を有する低級アルキル、フェニル、あるい
   は低級アルキル、ヒドロキシル、低級アルコキシ、カル
   ボキシ、または低級アルコキシカルボニルで置換された
   フェニルであって、 （aa）はアミノ酸を意味する］ II. A¹-CZ¹(B¹)-[C(R¹R²)]_n-X¹ ［式中、A¹はＨ、HOOC、H₂NOC、または−NHOC; B¹はSHまたはNHR³； X¹はＨ、メチル、SHまたはNHR³； Z¹はＨまたはメチル； R¹およびR²は独立してＨまたは低級アルキル； R³はＨ、低級アルキルまたは−Ｃ＝O; ｎは０、１または2; ここに、B¹がNHR³である場合、X¹はSHであり、Z¹はＨで
   あって、ｎは１または2; X¹がNHR³である場合、B¹はSHであり、Z¹はＨであって、
   ｎは１または2; B¹がＨである場合、A¹はHOOC、H₂NOCまたは−NHOCであ
   り、X¹はSHであり、Z¹はＨであって、ｎは０または1; Z¹がメチルである場合、X¹はメチルであり、A¹はHOOC、
   H₂NOCまたは−NHOCであり、B¹はSHであって、ｎは0; および、ここに、該チオール部位は還元形である］ ［式中、X²はＨまたは前記定義のチオール保護用基； （アミノ酸）はいずれかのアミノ酸を意味する］ ［式中、各R²は独立してＨ、CH₃またはC₂H₅； 各(pgp)^sは独立してＨまたは前記定義のチオール保護用
   基； ｍ、ｎおよびｐは独立して２または3; A²は線状もしくは環状の低級アルキル、アリール、複素
   環、またはそれらの組合せを意味する］ ［式中、各R²は独立してＨ、CH₃またはC₂H₅； ｍ、ｎおよびｐは独立して２または3; A³は線状もしくは環状の低級アルキル、複素環、または
   それらの組合せ； ＶはＨまたは−CO−ペプチド； R⁴はＨまたはペプチド； および、ここに、ＶがＨである場合、R⁴はペプチドであ
   つて、Ｖは−CO−ペプチドである］ よりなる群から選択されるテクネチウム−99m結合部位
   を含み、 ここに、該ペプチドの各々は３ないし100個のアミノ酸
   を含み、かつ該多価リンカーに共有結合しており；およ
   び ここに、該テクネチウム−99m結合部位は該ペプチドの
   全部もしくは一部、該リンカーまたは双方に共有結合し
   ていることを特徴とするシンチグラフィー造影剤調製用
   の試薬。
3. 【請求項３】ａ）合成により調製された複数の特異的結
   合ペプチド、 ｂ）第一級アミン、第二級アミン、ヒドロキシル基、カ
   ルボン酸基およびチオール−反応性基よりなる群から選
   択される少なくとも２個の同一の官能基を含む多価リン
   カー、および ｃ）式： C(pgp)^s-(aa)-C(pgp)^s ［式中、C(pgp)^sは式：−CH₂‐NH-CO-Rを有するチオー
   ル保護用基で保護されたチオール基を有するシステイン
   であって、（aa）はアミノ酸； ここに、該Ｒは１ないし６個の炭素原子を有する低級ア
   ルキル基、２−、３−、４−ピリジル、フェニル、また
   は低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボ
   キシもしくは低級アルコキシカルボニルで置換されたフ
   ェニルを意味する］ を有するテクネチウム−99m結合部位を含み、 ここに、該ペプチドの各々は３ないし100個のアミノ酸
   を含み、かつ該多価リンカーに共有結合しており；およ
   び ここに、該テクネチウム−99m結合部位は該ペプチドの
   全部もしくは一部、該リンカーまたは双方に共有結合し
   ていることを特徴とするシンチグラフィー造影剤調製用
   の試薬。
4. 【請求項４】C(pgp)^s-(aa)-C(pgp)^sが式： を有する請求項３記載の試薬。
5. 【請求項５】テクネチウム−99mで放射性標識した請求
   項１〜４いずれか１項記載の試薬を含むシンチグラフィ
   ー造影剤。
6. 【請求項６】還元剤の存在下で、試薬をテクネチウム−
   99mと反応させることを特徴とする請求項１〜４いずれ
   か１項記載の試薬を標識する方法。
7. 【請求項７】該還元剤が亜ジチオン酸イオン、第一スズ
   イオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される請
   求項６記載の方法。
8. 【請求項８】放射線医薬製剤調製物を調製するためのキ
   ットであって、所定量の請求項１〜４いずれか１項記載
   の試薬と、テクネチウム−99mで試薬を標識するのに十
   分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルを含む該キッ
   ト。
9. 【請求項９】イン・ビトロ化学合成を用いることを特徴
   とする請求項１〜４いずれか１項記載の試薬の製法。
10. 【請求項１０】該多価リンカーが分岐した多価リンカー
    を形成するための複数の多価リンカーを含む請求項１〜
    ４いずれか１項記載の試薬。
11. 【請求項１１】 よりなる群から選択される、シンチグラフィー造影剤調
    製用の試薬。
12. 【請求項１２】 である請求項11記載のシンチグラフィー造影剤調製用の
    試薬。
13. 【請求項１３】請求項11または12記載の試薬およびテク
    ネチウム−99mを含むシンチグラフィー造影剤。
14. 【請求項１４】診断有効量の請求項１〜４、11または12
    いずれか１項記載の試薬および医薬上許容される担体を
    含む哺乳動物体内の標的部位を造影するための医薬組成
    物。