DE69310733T2

DE69310733T2 - Technetium-99m-markierte peptide zur bilderzeugung

Info

Publication number: DE69310733T2
Application number: DE69310733T
Authority: DE
Inventors: Richard T. Bedford Nh 03110 Dean; John Bedford Nh 03110 Lister-James
Original assignee: Diatide Inc
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1992-06-05
Filing date: 1993-06-04
Publication date: 1997-10-30
Anticipated expiration: 2013-06-05
Also published as: EP0644778A1; JP2954354B2; US6667389B1; EP0644778B1; CA2137009A1; US5508020A; US6113878A; US5976494A; DK0644778T3; ATE152918T1; HK1007685A1; ES2105292T3; DE69310733D1; AU688264B2; WO1993025244A1; CA2137009C; JPH07506592A; AU4528793A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft radiodiagnostische Reagenzien und Peptide sowie Verfahren zur Herstellung markierter radiodiagnostischer Mittel. Speziell betrifft die Erfindung Abbildungsmittel für die Scintigraphie zum Abbilden von Orten in einem Säugerkörper, die spezifisch bindende Peptide umfassen, die mit Technetium-99m (Tc99m) über eine Radiomarkierungs-Bindungseinheit markiert sind, die einen Komplex mit Tc-99m bildet. Insbesondere sind die Peptid-Reagenzien der Erfindung kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden, so daß die mehrwertige Bindungseinheit kovalent mit einer Vielzahl der spezifisch bindenden Peptide verknüpft ist, und die Tc-99m-Bindungseinheiten sind kovalent an eine Mehrzhl der Verbindungen spezifisch bindende Peptide, mehrwertige Bindungseinheit oder sowohl spezifisch bindende Peptide als auch mehrwertige Bindungseinheit gebunden. Verfahren und Kits zur Herstellung derartiger Reagenzien und Verfahren zur Verwendung derartiger Reagenzien werden ebenfalls bereitgestellt.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Im Bereich der Nuclearmedizin werden bestimmte pathologische Zustände lokalisiert (oder ihr Ausmaß wird abgeschätzt) durch Ermitteln der Verteilung kleiner Mengen von in das Innere des Körpers verabreichten, radioaktiv markierten Tracer-Verbindungen (die Radiotracer oder Radiopharmazeutika genannt werden). Verfahren zur Ermittlung bzw. zum Auffinden dieser Radiopharmazeutika sind allgemein bekannt als Abbildungsverfahren oder Radio-Abbildungsverfahren.
Bei der Durchführung von Radio-Abbildungsverfahren ist das Radiolabel bzw. die radioaktive Marker-Verbindung ein Gamma-Strahlung emittierendes Radionuclid, und der Radiotracer wird unter Verwendung einer Gamma-Strahlung aufspürenden Kamera lokalisiert (dieses Verfahren wird oft bezeichnet als Gamma-Scintigraphie). Der abgebildete Ort ist aufspürbar bzw. ermittelbar, da entweder der Radiotracer so gewählt wird, daß er sich an einem pathologischen Ort befindet (dies wird als positiver Kontrast bezeichnet), oder alternativ wird der Radiotracer so ausgewählt, daß er sich spezifisch nicht an derartigen pathologischen Orten findet (dies wird als negativer Kontrast bezeichnet).
Es ist von einer gewissen Anzahl von Radionucliden bekannt, daß sie für Radio-Abbildungs- bzw. -Bildgebungsverfahren nützlich sind, einschließlich &sup6;&sup7;Ga, 99mTc (Tc-99m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²&sup5;I, ¹&sup6;&sup9;Yb oder ¹&sup8;&sup6;Re. Für optimale Radio-Bildgebungsverfahren beim Menschen muß eine Anzahl von Faktoren in Betracht gezogen werden. Um die Effizienz der Detektion zu maximieren, ist ein Radionuclid bevorzugt, das Gamma-Energie im Bereich von 100 bis 200 kev emittiert. Um die vom Patienten absorbierte Strahlungsdosis zu minimieren, sollte die physikalische Halbwertszeit des Radionuclids so kurz sein, wie es das Bildgebungs- bzw. Abbildeverfahren erlaubt. Um zu ermöglichen, daß Untersuchungen an jedem beliebigen Tag und zu jeder beliebigen Zeit des Tages durchgeführt werden können, ist es vorteilhaft, eine Quelle für das Radionuclid immer in einer Klinik verfügbar zu haben. Tc-99m ist ein bevorzugtes Radionuclid, da es Gamma-Strahlung bei 140 keV emittiert, eine physikalische Halbwertszeit von 6 h aufweist und in einfacher Weise vor Ort bei Einsatz eines Molybdän-99/Technetium-99m-Generators verfügbar ist.
Die Empfindlichkeit von Bildgebungs- bzw. Abbildeverfahren unter Verwendung radioaktiv markierter Peptide ist viel höher als bei anderen im Stand der Technik bekannten Radiopharmazeutika, da die speziellen charakteristischen Bindungseigenschaften einer speziellen Peptid-Bindungseinheit das radioaktive Signal auf den Bereich, der von Interesse ist, konzentrieren. Kleine synthetische Peptide, die sich spezifisch an Ziel-Moleküle, die von Interesse sind, binden, können in vorteilhafter Weise als Basis für Radiotracer verwendet werden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß (1) sie chemisch synthetisiert werden können (im Gegensatz zu dem Erfordernis der Produktion in einem biologischen System wie beispielsweise in Bakterien oder Sänger-Zellen oder ihrer Isolierung aus einer aus einem biologischen System abgeleiteten Substanz wie beispielsweise einem Proteinfragment); (2) sie klein sind, so daß der nicht an ein Ziel-Molekül gebundene Radiotracer schnell aus dem Körper entfernt wird und dadurch die Menge an Hintergrund-Radioaktivität (nicht an ein Ziel-Molekül gebundene Radioaktivität) reduziert wird und eine gute Definition des Ziel-Orts ermöglicht wird; und (3) kleine Peptide chemisch einfach gehandhabt werden können und dadurch ihre Affinität zu einem speziellen Bindungsort optimiert wird.
Kleine, in einfacher Weise synthetisierte, markierte Peptidmoleküle sind als routinemäßig verwendete Radiopharmazeutika bevorzugt. Es besteht klar ein Bedarf nach kleinen synthetischen, markierten Peptiden, die direkt in einen Patienten injiziert werden können und pathologische Orte durch Lokalisieren an derartigen Orten abbilden. Mit Tc-99m markierte kleine synthetische Peptide bieten klare Vorteile als Radiotracer für die Gamma-Scintigraphie, und zwar aufgrund der Eigenschaften von Tc-99m als Radionuclid zur Bildgebung bzw. zum Abbilden und die Nützlichkeit von an spezifische Stellen bindenden kleinen synthetischen Peptiden als Radiotracer-Molekülen.
Über radiomarkierte Proteine und Peptide wurde im Stand der Technik berichtet.
Im U.S. Patent Nr.4,832,940 (Ege et al.) werden radiomarkierte Peptide zum Abbilden lokalisierter T-Lymphocyten gelehrt.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 82 301 700.9 (Olexa et. al.; 1982) offenbart ein pharmazeutisch annehmbares, radiomarkiertes Peptid, das gewählt ist aus Fragment E&sub1;, isoliert aus vernetztem Fibrin, Fragment E&sub2;, isoliert aus vernetztem Fibrin, und Peptiden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zwischen den Fragmenten E&sub1; und E&sub2; liegt.
Die Druckschrift PCT/US 88/02276 (Ranby et al.; 1988) offenbart ein Verfahren zum Aufspüren von Fibrin-Ablagerungen in einem Tier, das den Schritt des kovalenten Bindens einer radiomarkierten Verbindung an Fibrin umfaßt.
Die Druckschrift PCT/US 88/03318 (Hadley et al.; 1988) offenbart ein Verfahren zum Aufspüren eines Fibrinplättchen-Gerinnsels in vivo, das die Schritte umfaßt, daß man (a) einem Patienten ein markiertes attenuiertes thrombolytisches Protein verabreicht, wobei die Markierung selektiv an einem Teil des thrombolytischen Proteins befestigt ist, die von der Fibrin-Bindungsdömäne verschieden ist; und (b) das Verteilungsmuster des markierten thrombolytischen Proteins in dem Patienten ermittelt.
Die Druckschrift PCT/US 89/01854 (Lees et. al.; 1989) lehrt radiomarkierte Peptide zur Abbildung von Arterien.
Die Druckschrift PCT/US 89/02656 (Sobel; 1989) offenbart ein Verfahren zur Lokalisierung der Position eines oder mehrerer Thromben in einem Tier unter Verwendung von radiomarkiertem, enzymatisch inaktivem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tissue plasminogen activator).
Die Druckschrift PCT/GB 90/00933 (Stuttle; 1990) offenbart radioaktiv markierte Peptide, die 3 bis 10 Aminosäuren enthalten und die Sequenz Argimn-Glycin-Asparaginsäure (RGD) umfassen und in der Lage sind, sich in vivo an einen RGD-Bindungsort zu binden.
Die Druckschrift PCT/US 90/04642 (Maraganore et al.; 1991) offenbart einen radiomarkierten Thrombus-Inhibitor, der umfaßt (a) eine Inhibitor-Einheit; (b) eine Linker(Verbindungs-)Einheit; und (c) eine Einheit mit einer anionischen Bindungsstelle.
Die Druckschrift PCT/US 91/03116 (Rodwell et al.; 1991) offenbart Konjugate von "molekularen Erkennungseinheiten" mit "Effektor-Domänen".
In "Int. J. Appl. Rad. Isot. 19 (1968) 835-840" wird von Tubis et al. das Markieren eines Peptids mit Technetium-99m beschrieben.
Die Druckschrift "Int. J. Appl. Rad. Isot. 34 (1983), 1003 (Sundrehagen)" beschreibt das Markieren von Polypeptiden mit Technetium-99m.
Obwohl Tc-99m optimal für Radio-Abbildungsverfahren ist, wurde die Chemie dieses Isotops nicht so sorgfältig studiert wie die Chemie anderer Elemente. Aus diesem Grund sind Verfahrensweisen zum Radiomarkieren mit Technetium-99m nicht in großer Zahl vorhanden. Tc-99m wird normalerweise erhalten als Tc-99m-Pertechnetat (TcO&sub4;&supmin;;
Technetium liegt in der Oxidationsstufe +7 vor), und zwar üblicherweise aus einem Molybdän-99/Technetium-99m-Generator. Pertechnetat läßt sich jedoch nicht gut an andere Verbindungen binden. Daher muß mit dem Ziel, ein Peptid mit einer Radiomarkierung zu versehen, Tc-99m-Pertechnetat in eine andere Form umgewandelt werden. Da Technetium in wäßriger Lösung kein stabiles Ion bildet, muß es in solchen Lösungen in Form eines Koordinationskomplexes gehalten werden, der eine ausreichende kinetische und thermodynamische Stabilität aufweist, um eine Zersetzung und eine daraus resultierende Umwandlung von Tc-99m entweder in unlösliches Technetiumdioxid oder zurück in Pertechnetat zu verhindern.
Für den Zweck des Radiomarkierens ist es besonders vorteilllaft, daß der Tc-99m-Komplex in Form eines Chelats gebildet wird, in dem alle Donor-Gruppen, die das Technetium-Ion umgeben, von einem einzelnen chelatisierenden Liganden gestellt werden. Dies ermöglicht es, daß das chelatisierte Tc-99m kovalent an ein Peptid über eine einzelne Verbindungs- Gruppe (Linker) zwischen dem Chelator und dem Peptid gebunden wird.
Diese Liganden werden manchmal als bifuktionelle chelatisierende Mittel bezeichnet, die einen chelatisierenden Teil und einen Bindungsteil aufweisen. Solche Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt.
Im US-Patent Nr.4,434,151 (Byrne et. al.) werden von Homocysteinthiolacton abgeleitete bifunktionelle Chelatisierungsmittel beschrieben, die Radionudide an terminale Amino- Gruppen enthaltende Verbindungen koppeln können, die in einem abzubildenden Organ oder Gewebe lokalisiert werden können.
Im US-Patent Nr. 4,444,690 (Fritzberg) wird eine Reihe von Technetium chelatisierenden Mitteln auf der Grundlage von 2,3-Bis(mercaptoacetamido-)propanoat beschrieben.
Im US-Patent Nr. 4,571,430 (Byrne et. al.) werden neue bifunktionelle Homocysteinthiolacton-Chelatisierungsmittel zum Chelatisieren von Radionudiden beschrieben, die Radionuclide an terminale Amino-Gruppen enthaltende Verbindungen koppeln können, die in einem abzubildenden Organ oder Gewebe lokalisiert werden können.
Im US-Patent Nr. 4,575,556 (Byrne et al.) werden neue bifunktionelle Homocysteinthiolacton-Chelatisierungsmittel zum Chelatisieren von Radionucliden beschrieben, die Radionuclide an terminale Amino-Gruppen enthaltende Verbindungen koppeln können, die in einem abzubildenden Organ oder Gewebe lokalisiert werden können.
Im US-Patent Nr. 4,673,562 Davison et al.) werden Technetium chelatisierende Komplexe von Bisamidobisthio-Liganden oder Salzen davon beschrieben, die primär als die Nierenfunktion überwachende Mittel verwendet werden.
Das US-Patent Nr.4,861,869 (Nicolotti et al.) beschreibt bifunktionelle Kopplungsmittel, die zur Bildung von Konjugaten mit biologischen Molekülen wie beispielsweise Antikörpern nützlich sind.
Im US-Patent Nr. 4,965,392 (Fritzberg et al.) werden verschiedene S-geschützte Chelatoren auf der Basis von Mercaptoacetylglycylglycin zum Markieren von Proteinen beschrieben.
Fritzberg et al. beschreiben in der europaischen Patentanmeldung Nr. 86 100360.6 Dithiol-, Diamino- oder Diamidocarbonsäure- oder Amin-Komplexe, die nützlich zur Herstellung von mit Technetium markierten Abbildungsmitteln sind.
In der Druckschrift PCT/US 89102634 (Dean et al.; 1989) werden bifunktionelle Kopplungsmittel zum Radiomarkieren von Proteinen und Peptiden beschrieben.
In der Europäischen Patentanmeldung Nr.90 306 428.5 beschreiben Flanagan et al. das Markieren synthetischer Peptid-Fragmente mit Tc-99m über einen Satz organischer chelatisierender Moleküle.
Albert et al. offenbaren in der Europäischen Patentanmeldung Nr. WO 91/01144 das strahlungsgebundene Abbilden (radioimaging) unter Verwendung radiomarkierter Peptide, die mit Wachstnmsfaktoren, Hormonen, Interferonen und Cytokinen in Beziehung stehen und aus einem spezifischen Erkennungspeptid bestehen, das kovalent an eine Radionuclid- Chelatisierungs-Gruppe gebunden ist.
In der parallel anhängigen US-Patentanmeldung S.N. 07/653,012 (Dean) werden Reagenzien und Verfahren zur Herstellung von Peptiden gelehrt, die eine Tc-99m-Chelatisierungs- Gruppe umfassen, die kovalent an ein spezifisches Bindungs-Peptid gebunden ist. Diese Reagenzien und Verfahren werden zum strahlungsgebundenen Abbilden (radioimaging) in vivo verwendet. Der Offenbarungsgehalt der Druckschrift wird durch die In-Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung übernommen.
Baidoo & Lever beschreiben in "Bioconjugate Chem. 1 (1990), 132 bis 137" ein Verfahren zum Markieren von Biomolekülen unter Verwendung einer Bisaminbisthiol-Gruppe, die emen kationischen Technetium-Komplex ergibt.
Es ist möglich, ein Peptid einfach dadurch radioaktiv zu markieren, daß man eine eine Thiol-Gruppe enthaltende Einheit wie beispielsweise Cystein oder Mercaptoessigsäure zusetzt. Solche Verfahrensweise wurden im Stand der Technik beschrieben.
Schochat et al. offenbaren im US-Patent Nr. 5,061,641 ein direktes Radiomarkieren von Proteinen, das aus wenigstens einer anhängenden Suifhydryl-Gruppe besteht.
Dean et al. lehren in der parallel anhängigen US-Patentanmeldung S.N. 07/807,062 das Radiomarkieren von Peptiden über freie Thiole enthaltende angehängte Gruppen; der Inhalt dieser Druckschrift wird durch die In-Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung übernommen.
In der PCT-Anmeldung Nr. WO 89/07456 beschreiben Goedemans et al. das Radiomarkieren von Proteinen unter Verwendung cyclischer Thiol-Verblndungen, insbesondere von 2-Iminothiolan und dessen Derivaten.
In der EP-Patentanmeldung Nr. 90402 206.8 (Thornback et al.) wird die Herstellung und Verwendung radiomarkierter Proteine oder Peptide unter Verwendung von Thiol-Gruppen enthaltenden Verbindungen beschrieben, insbesondere von 2-Iminothiolan.
Stuttle beschreibt in der PCT-Anmeldung Nr. WO 90/15818 das Markieren von RGD enthaltenden Oligopeptiden mit Tc-99m.
Obwohl es möglich ist, spezielle Bindungs-Peptide mit Tc-99m zu markieren (wie es offenbart ist in den parallel anhängigen US-Patentanmeldungen S.N. 07/653,012; 07/807,062; 07/871,282; 07/886,752; 07/893,981; 07/955,466; 08/019,864 und 08/044,825 und in den internationalen (PCT-) Almieldungen PCT/US 92/00,757; PCT/US 92/10,716; PCT/US 93/02,320 und PCT/US 93/04,794; der Inhalt dieser Druckschriften wird durch die In-Bezughhme in die vorliegende Beschreibung übernommen), zeigen einige derartige Peptide eine geringe Bindungsstellen-Affmität, wodurch die Festigkeit der Bindung des Peptids an die Stelle des Ziel-Moleküls nicht ausreichend dafür ist, daß eine genügende Menge des Radioisotops an der Ziel-Stelle unter Bildung eines durch radioaktive Strahlung erzeugten Bildes (Radiobildes) lokalisiert wird. In dem Bemühen, dieses Problem zu lösen, wurden Peptide im Stand der Technik beschrieben, die aus linearen Bereichen spezifischer wiederkehrender Bindungspeptid-Einheiten bestanden.
Rodwell et al. offenbaren in der Druckschrift PCT/US 91/03116 (1991) lineare Anordnungen der Peptidsequenz RGD.
Jedoch können alternative Anordnungen spezifischer Bindungspeptid-Einheiten bevorzugt sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft Reagenzien, die nützlich zur Herstellung von Radio-Abbildungsmitteln sind. Die vorliegende Erfindung schafft Reagenzien, die aus einer Vielzahl von spezifisch bindenden Peptid-Einheiten bestehen, die eine Affinität für Ziel-Orte in vivo haben, die ausreichend ist, um ein scintigraphisch nachweisbares Bild zu produzieren. Die Einbeziehung einer Vielzahl von spezifisch bindenden Peptid-Einheiten in die Reagenzien gemäß der Erfindung erlaubt die Verwendung spezifisch bindender Peptide, deren individuelle Bindungsaffinität sonst nicht ausreichend wäre, zur Erzeugung eines scintigraphisch nachweisbaren Bildes in vivo. In anderen Fällen wird eine Verbesserung der sonst annehmbaren scintigraphischen Bilder, die durch ein spezielles, spezifisch bindendes Peptid erzeugt werden, unter Verwendung der Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht.
Die vorliegende Erfindung schafft Reagenzien zur Herstellung scintigraphisch abbildender Mittel, die eine Vielhahl von spezifisch bindenden Peptid-Einheiten umfaßt, die kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden sind, worin Technetium-99m-Bindungseinheiten kovalent mit den spezifisch bindenden Peptiden der mehrwertigen Bindungseinheit oder sowohl mit den spezifisch bindenden Peptiden als auch mit den mehrwertigen Bindungseinheiten verknüpft sind. Die Erfindung schafft auch mit Tc-99m markierte Mittel zum scintigraphischen Abbilden, die aus derartigen Peptid-Reagenzien hergestellt werden. Die spezifisch bindenden Peptide gemäß der Erfindung bestehen aus Peptiden, die in vivo mit einem Ziel-Molekül eine spezifische Bindung eingehen.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung schafft die Erfindung Reagenzien, die in der Lage sind, für die Abbildung von Orten innerhalb eines Säugerkörpers mit Tc-99m markiert zu werden, wobei die Reagenzien eine Vielaahl von spezifisch bindenden Peptiden umfassen, wobei jedes Peptid eine Aminosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren aufweist und kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden ist, und umfaßt weiter Tc-99m- Bindungseinheiten, die kovalent an eine Mehrzhl der spezifisch bindenden Peptide, die mehrwertige Bindungseinheit oder beide gebunden ist. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen lineare und cyclische spezifische Bindungs-Peptide.
In einem zweiten Aspekt schafft die vorliegende Erfindung Reagenzien, die in der Lage sind, zum Abbilden von Orten innerhalb eines Säugerkörpers mit Tc-99m markiert zu werden, wobei die Reagenzien eine Vielzahl von spezifisch bindenden Peptiden umfassen, die eine Aminosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren aufweisen und kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden sind, und umfassen außerdem eine Tc-99m-Bindungseinheit, die kovalent an eine Mehrzahl von spezifisch bindenden Peptiden, die mehrwertige Bindungseinheit oder beide gebunden ist, worin die Tc-99m-Bindungseinheit die Formel
C(pgp)s-(aa)-C(pgp)s
aufweist, worin C(pgp)³ für ein geschütztes Cystein steht und (aa) eine Aminosäure ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäure Glycin. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Peptid zwischen 3 und 30 Aminosäuren. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen lineare und cyclische spezifisch bindende Peptide.
In einer dritten Ausführungsform schafft die Erfindung Reagenzien, die mit Tc-99m markiert werden können, zum Abbilden von Orten innerhalb eines Säugerkörpers, die eine Vielzahl von spezifisch bindenden Peptiden umfassen, die eine Amiinsosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren aufweisen und kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden sind und umfassen außerdem eine Tc-99m-Bindungseinheit, die kovalent an eine Mehrzahl der spezifisch bindenden Peptide, die mehrwertige Bindungseinheit oder beide gebunden ist, worin die Tc-99m-Bindungseinheit die folgende Formel aufweist:
A¹-Cz¹(B¹)-[CZ¹R2)]n-X¹
worin A¹ für H, HOOC, H&sub2;NOC oder -NHOC steht;
B¹ für SH oder NHR³ steht;
X¹ für H, Methyl, SH oder NHR³ steht;
Z¹ für H oder Methyl steht;
R¹ und R² unabhängig voneinander für H oder Niederalkyl stehen;
R³ für H, Niederalkyl oder -C=O steht;
n für 0, 1 oder 2 steht;
dann, wenn B¹ für NHR³ steht, X¹ für SH steht, Z¹ für H steht und n für 1 oder 2 steht;
dann, wenn X¹ für NHR³ steht, B¹ für SH steht, Z¹ für H steht und n für 1 oder 2 steht;
dann, wenn B¹ für H steht, A¹ für HOOC, H&sub2;NOC oder -NHOC steht, X¹ für SH steht, Z¹ für H steht und n für 0 oder 1 steht;
dann, wenn Z¹ für Methyl steht, X¹ für Methyl steht, A¹ für HOOC, H&sub2;NOC oder -NHOC steht, B¹ für SH und n für 0 steht; und
worin die Thiol-Einheit in der reduzierten Form vorliegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Peptid aus zwischen 3 und 30 Aminosäuren. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen lineare und cyclische spezifische Bindungs-Peptide.
In einer weiteren Ausführungsform schafft die Erfindung Peptid-Reagenzien, die in der Lage sind, zum Abbilden von Orten innerhalb eines Säugerkörpers mit Tc-99m markiert zu werden, wobei die Reagenzien eine Vielaahl von spezifisch bindenden Peptiden umfassen, die eine Aminosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren aufweist und kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden ist, und umfassen außerdem eine Technetium-99m- Bindungseinheit, die kovalent an eine Mehrzahl der spezifisch bindenden Peptide, die mehrwertige Bindungseinheit oder beide gebunden ist, worin die Tc-99m-Bindungseinheit die folgende Formel aufweist:
(Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Radiomarkierungs-Bindungseinheiten die diese Strukturen aufweisen, als Einheiten auf Basis von Picolinsäure (Pic) bezeichnet); oder
worin X für H oder eine Schutzgruppe steht; und (Aminosäure) irgendeine Aminosäure ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Radiomarkierungs-Bindungseinheiten, die diese Struktur aufweisen, als Einheiten auf Basis von Picolylamin (Pica) bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäure Glycin, und X ist eine Acetamidomethyl-Schutzgruppe. In weiteren bevorzugten Ausfhrrungsformen umfaßt das Peptid zwischen 3 und 30 Aminosäuren. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen lineare und cyclische spezifisch bindende Peptide.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Peptid-Reagenzien bereitgestellt, die zum Abbilden von Orten innerhalb eines Säugerkörpers mit Tc-99m markiert werden können, wobei die Peptide eine Vielzahl von spezifisch bindenden Peptiden umfassen, die eine Aminosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren aufweisen und die kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden sind, und die weiter eine Tc-99m- Bindungseinheit umfassen, die kovalent an die spezifisch bindenden Peptide, die mehrwertige Bindungseinheit oder beide gebunden ist, wobei die Tc-99m-Blndungseinheit die folgende Formel aufweist:
worin jeder der Reste R unabhängig vom anderen für H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; steht; jeder der Reste (pgp)s unabhängig vom anderen für eine Thiol-Schutzgruppe oder H steht; m, n und p unabhängig voneinander für 2 oder 3 stehen; A² für lineare oder cyclische Niederalkyl- Reste, Aryl-Reste, heterocyclische Reste, Kombinationen oder substituierte Derivate dieser Reste steht; und
worin jeder der Reste R unabhängig vom anderen für H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; steht; m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 bedeuten; A³ für lineare oder cyclische Niederalkyl-Reste, Aryl-Reste, heterocyclische Reste, Kombinationen oder substituierte Derivate dieser Reste steht; V für H oder -CO-Peptid steht; R&sup4; für H oder Peptid steht; und worin dann, wenn V für H steht, R&sup4; für Peptid steht, und dann, wenn R&sup4; für H steht, V für -CO-Peptid steht. (Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Radiomarkierungs-Bindungseinheiten, die diese Strukturen aufweisen, als BAT-Einheiten bezeichnet). Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen lineare und cyclische spezifisch bindende Peptide.
Es werden die Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, worin die spezifisch bindenden Peptide oder die Radiomarkierungs-Bindungseinheiten oder beide kovalent mit einer mehrwertigen Linker-Einheit verknüpft sind. Mehrwertige Linker- Einheiten gemäß der Erfindung bestehen aus wenigsten zwei identischen funktionellen Linker- bzw. Bindungs-Gruppen, die in der Lage sind, sich kovalent an spezifisch bindende Peptide oder Tc-99m-Bindungseinheiten zu binden. Bevorzugte funktionelle Linker-Gruppen sind primäre oder sekundäre Amine, Hydroxy-Gruppe, Carboxy-Gruppen oder mit Thiol reaktive Gruppen. In bevorzugten Ausführungsformen bestehen die mehrwertigen Bindungseinheiten aus einer Vielhahl mehrwertiger Bindungseinheiten, die kovalent unter Bildung einer verzweigten mehrwertigen Bindungseinheit verbunden sind. In bevorzugten Ausführungsformen bestehen die mehrwertigen Bindungseinheiten aus Lysin, Bissuccinimidylmethylether (BSME), 4-(2,2-Dimethylacetyl-)benzoesäure (DMAB), Tris(succinimidylethyl-)amin (TSEA), N-[2-N',N'-Bis(2-succinimidoethyl-)aminoethyl]- N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl-)6,9-diazanonanamid (BAT-BS), 4-(O-CH&sub2;CO-Gly- Gly-Cys.amid-)acetophenon (ETAC) und Bissuccinimidohexan (BSH).
Die Erfindung umfaßt auch scintigraphische Abblidungsmittel, die Komplexe von Reagenzien gemäß der Erfindung mit Tc-99m sind, und Verfahren zum Radiomarkieren der Reagenzien der Erfindung mit Tc-99m. Radiomarkierte Komplexe, wie sie durch die Erfindung geschaffen werden, werden gebildet durch Umsetzen der Reagenzien gemäß der Erfindung mit Tc-99m in Gegenwart eines Reduktionsmittels. Bevorzugte Reduktionsmittel schließen ein (sind jedoch nicht beschrinkt auf) Dithionit-Ionen, Zinn(II)-Ionen und Eisen(II)-Ionen. Komplexe gemäß der Erfindung werden auch gebildet durch Markieren der Reagenzien gemäß der Erfindung mit Tc-99m durch Ligandenaustausch eines gemäß der Erfindung geschaffenen Tc-99m-Komplexes.
Die Erfindung liefert auch Kits zur Herstellung scintigraphischer Abbildungsmittel, die Reagenzien gemäß der Erfindung sind, die mit Tc-99m radiomarkiert sind. Klts zur Markierung der Reagenzien gemäß der Erfindung mit Tc-99m bestehen aus einem verschlossenem Glasfläschchen, das eine vorbestimmte Menge eines Reagenz gemäß der Erfindung oder Mischungen daraus und eine ausreichende Menge eines Reduktionsmittels zum Markieren des Reagenz mit Tc-99m enthält.
Die Erfindung schafft auch Verfahrensweisen zur Herstellung von Reagenzien gemäß der Erfindung durch chemische Synthese in vitro. In bevorzugten Ausführungsformen werden Peptide durch Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert.
Die Erfindung schafft Verfahrensweisen zur Verwendung scintigraphischer Abbildungsmittel, die mit Tc-99m markierte Reagenzien sind, zum Abbilden eines Ortes innerhalb eines Säugerkörpers, indem man in vivo-Gamma-Scintigraphie-Bilder erhält. Diese Verfahrensweisen umfassen die Verabreichung einer wirksamen diagnostischen Menge eines mit Tc-99m radiomarkierten Reagenz gemäß der Erfindung und die Ermittlung der Gamma- Strahlung, die durch das Tc-99m emittiert wird, das an dem Ort innerhalb des Säugerkörpers lokalisiert ist.
Spezifische bevorzugte Ausführungsformen gemäß der Erfindung werden aus der folgenden, noch detaillierteren Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und aus den Ansprüchen offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 veranschaulicht eine Gamma-Scintigraphie-Fotografie einer Abbildung eines Venen-Thrombus in Mischrassen-Hunden unter Verwendung der mit Tc-99m markierten Scintigraphie-Abbildungsmittel gemäß der Erfindung, wie sie in Beispiel 5 beschrieben sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft ein Reagenz zur Herstellung eines Abbildungsmittels für die Scintigraphie zum Abbilden von Orten innerhalb eines Säugerkörpers, das eine Vielzahl von spezifisch bindenden Peptid-Einheiten umfaßt, wobei jedes spezifisch bindende Peptid eine Aminosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren aufweist und kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden ist, sowie eine Tc-99m-Bindungseinheit umfaßt, die kovalent an eine Mehrzahl der spezifisch bindenden Peptide, die mehrwertige Bindungseinheit oder beide gebunden ist, wobei das Reagenz gegebenenfalls mit Technetium-99m radiomarkiert ist.
Das Markieren mit Tc-99m ist ein Vorteil gemäß der vorliegenden Erfindung, da die nudearen und radioaktiven Eigenschaften dieses Isotops dieses zu einem idealen Scintigraphie-Abbildungsmittel machen. Dieses Isotop weist eine Einzelphotonen-Energie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von etwa 6 h auf, und es ist in einfacher Weise aus einem &sup9;&sup9;Mo-99mTc-Generator erhältlich. Andere Radionudide, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, haben effektive Halbwertszeiten, die viel länger sind (eispielsweise ¹¹¹In, das eine Halbwertszeit von 67,4 h aufweist) oder sind toxisch (Beispielsweise ¹²&sup5;I).
In den Radiomarkierungs-Bindungseinheiten und Peptiden, die kovalent an diese Einheiten gebunden sind, die ein Thiol enthalten, das kovalent mit Thiol-Schutzgruppen [(pgp)s] verknüpft sind, die durch die Erfindung geschaffen werden, können die Thiol-Schutzgruppen gleich oder verschieden sein und können folgende Gruppen sein (ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein):
CH&sub2;-aryl (Aryl ist Phenyl oder Alkyl oder mit Alkoxy substituiertes Phenyl);
-CH-(aryl)&sub2; (Aryl ist Phenyl oder Alkyl oder mit Alkoxy substituiertes Phenyl);
-C-(aryl)&sub3; (Aryl ist Phenyl oder Alkyl oder mit Alkoxy substituiertes Phenyl);
-CH&sub2;-(4-methoxyphenyl);
-CH-(4-pyridyl)(phenyl)&sub2;;
-C(CH&sub3;)&sub3;;
-9-phenylfluorenyl;
-CH&sub2;NHCOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CH&sub2;NHCOOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CONHR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CH&sub2;-S-CH&sub2;-phenyl.
Bevorzugte Schutzgruppen weisen die Formel -CH&sub2;NHCOR auf, worin R für Niederalkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Phenyl steht, das substituiert ist mit Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Carboxy oder Niederalkoxycarbonyl. Die am meisten bevorzugte Schutzgruppe ist eine Acetamidomethyl-Gruppe.
Jede ein spezifisch bindendes Peptid enthaltende Ausführungsform der Erfindung besteht aus einer Sequenz von Aminosäuren. Der Begriff "Aminosäure", wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, soll nach Intention der Erfinder alle L- und D- Aminosäuren einschließen, gleichgültig, ob sie natürlich vorkommende oder andere Aminosäuren sind. Reagenzien, die spezifisch bindende Peptide umfassen, wie sie durch die Erfindung geschaffen werden, schließen ein (sind jedoch nicht auf die folgenden Verbindungen beschränkt) (die Aminosäuren in den folgenden Peptiden sind L-Aminosäuren, mit Ausnahme der Fälle, in denen dies anders angegeben ist):
Ein-Buchstaben-Abkärzungen fur Aminosäuren werden gefunden in der Druckschrift "G. Zubay, Biochemistry (2. Ausgabe), 1988 (MacMillen Publishing; New York), Seite 33". Andere Abkürzungen sind solche, wie sie in den Erläuterungen zu Tabelle 1 zu finden sind). Diese Liste von durch die Erfindung geschaffenen Reagenzien ist veranschaulichend, und es nicht beabsichtigt, daß sie die Erfindung beschränkt oder bestimlnte Verbindungen ausschließt. Fachleuten in diesem technischen Bereich ist es verständlich, daß Reagenzien, die Kombinationen der Peptide umfassen, die oben offenbart wurden, oder ihre Äquivalente kovalent mit einer der chelatisierenden Einheiten der Erfindung verknüpft werden können und im Bereich des Umfangs der Erfindung liegen, einschließlich Kombinationen derartiger Peptide und chelatisierende Einheiten, die Verknüpfungsgruppen umfassen, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbart werden.
Mehrwertige Bindungseinheiten sind kovalent mit den spezifischen Peptiden gemäß der Erfindung, mit den TC-99m-Bindungseinheiten oder mit beiden verbunden. Durch die Erfindung geschaffene mehrwertige Bindungseinheiten bestehen aus wenigstens zwei fünktionellen Linker- bzw. Bindungs-Gruppen, die in der Lage sind, sich kovalent an spezifisch bindende Peptide oder Tc-99m-Bindungseinheiten zu binden. Solche funktionellen Gruppen schließen ein (sind jedoch nicht beschränkt auf) priinäre und sekundäre Amine, Hydroxy Gruppen, Carbonsäure-Gruppen und mit Thiol reaktive Gruppen. Mehrwertige Bindungseinheiten bestehen aus vorzugsweise wenigstens drei fünktionellen Gruppen, die in der Lage sind, kovalent an spezifisch bindende Peptide oder Technetium-99m-Bindungseinheiten gebunden zu werden. Bevorzugte mehrwertige Bindungseinheiten schließen Aminosäuren wie beispielsweise Lysin, Homolysin, Ornithin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, lineare und cyclische Amine und Polyamine, Polycarbonsäuren und Verbindungen ein, die Einheiten enthalten, die mit aktivierten Thiolen reagieren, beispielsweise Di- und Trimaleimide. Auch bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen die mehrwertigen Bindungseinheiten eine Vielzahl von mehrwertigen Bindungseinheiten umfassen, die kovalent miteinander unter Bildung einer verzweigten mehrwertigen Bindungseinheit verbunden sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist es beabsichtigt, daß der Begriff "verzweigte mehrwertige Bindungseinheiten" auch mehrwertige Bindungseinheiten einschließt (jedoch nicht auf diese beschränkt ist), die die folgende Formeln aufweisen:
Spezifisch bindende Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können chemisch in vitro synthetisiert werden. Derartige Peptide können allgemein vorteilhaft hergestellt werden auf emer Aminosäure-Synthesevorrichtung. Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, worin die Radiomarkierungs-Bindungseinheit kovalent mit dem Peptid während der chemischen Synthese in vitro verknüpft ist, können synthetisiert werden unter Anwendung von Verfahrensweisen, wie sie Personen mit Sachverstand in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind. Derartige Peptide, die während der Synthese kovalent mit der Radiomarkierungs-Bindungseinheit verknüpft sind, sind vorteilhaft, da spezielle Stellen der kovalenten Bindung bestimmt werden können.
Radiomarkierungs-Bindungseinheiten gemäß der Erfindung können in das spezifische Ziel- Peptid während der Peptidsynthese eingeführt werden. Für Ausfhrrungsformen [z.B. Pic- Gly-Cys(Schutzgruppe)-], die Picolinsäure (Pic-) umfassen, kann die Radiomarkierungs- Bindungseinheit als letzter (d.h. aminoterminaler) Rest in der Synthese synthetisiert werden. Außerdem kann die Picolinsäure enthaltende Radiomarkierungs-Bindungseinheit kovalent an die &epsi;-Amin-Gruppe von Lysin gebunden werden, was beispielsweise zu α-N(Fmoc)-Lys- &epsi;N[Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)] führt. Diese Gruppe kann an jeder Position der Peptidkette eingebaut werden. Diese Sequenz ist besonders vorteilhaft, da sie eine leichte Art der Einarbeitung in das Bindungs-Ziel-Peptid ermöglicht.
In ähnlicher Weise kann die Picolylamin (Pica) enthaltende Radiomarkierungs-Bindungseinheit [-Cys(Schutzgruppe)-Gly-Pica] während der Peptidsynthese hergestellt werden durch Einschließen der Sequenz [-Cys(Schutzgruppe)-Gly] am Carboxyl-Terminus der Peptid-Kette. Im Anschluß an die Abspaltung des Peptids von dem Harz wird der Carboxyl-Terminus des Peptids aktiviert und an Picolylamin gekoppelt. Dieser Syntheseweg erfordert es, daß reaktive funktionelle Gruppen an den Seitenketten maskiert (bzw. geschützt) bleiben und keine Reaktion während der Konjugation des Picolylamins eingehen.
Beispiele kleiner synthetischer Peptide, die den Pic-Gly-Cys-Chelator enthalten, werden in den nachfolgenden Beispielen bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Einarbeitung dieser Chelatoren in praktisch jedes Peptid, was zu einem radiomarkierten Peptid führt, in dem Tc-99m in Form eines neutralen Komplexes gehalten wird.
Die vorliegende Erfindung schafft auch spezifisch bindende kleine synthetische Peptide, die Bisamln-bisthiol-Chelatoren (BAT-Chelatoren) eingearbeitet enthalten, die mit Tc-99m markiert werden, was zu einem radiomarkierten Peptid führt, in dem Tc-99m als neutraler Komplex gehalten wird.
Bei der Bildung eines Komplexes von radioaktivem Technetium mit den Reagenzien der vorliegenden Erfindung wird der Technetium-Komplex, vorzugsweise ein Salz aus Tc-99m- Pertechnetat, mit den Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung in Gegenwart eines Reduktionsmittels umgesetzt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind Dithionit, Zinn(II)-Ionen und Eisen(II)-Ionen. Das am meisten bevorzugte Reduktionsmittel ist Zinn(II)-chlorid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Reduktionsmittel ein Festphasen- Reduktionsmittel. Komplexe und Mittel zur Herstellung derartiger Komplexe werden üblicherweise in Form eines Kits bereitgestellt, das ein verschlossenes Glasfläschchen, das eme vorbestimmte Menge eines Reagenz gemäß der Erfindung, das zu markieren ist, und eme ausreichende Menge an Reduktionsmitteln zum Markieren des Reagenz mit Tc-99m umfaßt. Alternativ dazu kann der Komplex gebildet werden durch Umsetzen eines Reagenz gemäß der Erfindung mit einem vorgebildeten, labilen Komplex von Technetium und einer anderen Verbindung, die unter der Bezeichnung "Transfer-Ligand" bekannt ist. Diese Verfahrensweise ist als "Ligandenaustausch" bekannt und Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Der labile Komplex kann unter Verwendung solcher Transfer- Liganden wie Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannitol gebildet werden, um nur Beispiele zu nennen. In die Tc-99m-Pertechnetatsalze, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind eingeschlossen die Alkalimetallsalze, wie beispielsweise das Natriumsalz oder Ammoniumsalze oder Niederalkylammoniumsalze.
In einer bevorzugten Ausfühungsform der Erfindung wird ein Kit zur Herstellung von mit Technetium-99m markierten Reagenzien bereitgestellt. Eine passende Menge eines Reagenz wird in ein ein Reduktionsmittel wie beispielsweise Zinn(II)-chlorid oder Festphasen- Reduktionsmittel enthaltendes Glasfläschchen in einer Menge gegeben, die ausreichend ist, um das Reagenz mit Tc-99m zu markieren. Eine passende Menge eines wie oben beschriebenen Transfer-Liganden (wie beispielsweise Tatrat, Citrat, Gluconat oder Mannitol) kann auch eingeschlossen werden. Mit Technetium-99m markierte Mittel für das scintigraphische Abbilden gemäß der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch Zusatz einer passenden Menge Tc-99m oder eines Tc-99m-Komplexes in die Glasfläschchen und Reaktion unter den in dem nachfolgenden Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen. Das Kit kann auch herkömmliche pharmazeutische Zusatzmaterialien wie beispielsweise pharmazeutisch annehmbare Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsmittel und dergleichen enthalten. Die Komponenten des Kits können in flüssiger, gefrorener oder trockener Form vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kit-Komponenten in lyophilisierter Form bereitgestellt. Radiomarkierte Reagenzien zum scintigraphischen Abbilden gemäß der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch Reaktion unter den Bedingungen, wie sie im nachfolgenden Beispiel 3 beschrieben sind.
Radioaktiv markierte Reagenzien, wie sie durch die vorliegende Erfindung geschaffen werden, werden in einer Form bereitgestellt, die eine ausreichende Menge an Radioaktivität aufweist. Bei der Bildung von radioaktiven Tc-99m-Komplexen ist es allgemein bevorzugt, radioaktive Komplexe in Lösungen auszubilden, die eine Radioaktivität in Konzentrationen von etwa 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro ml enthalten.
Mit Technetium-99m markierte Mittel zum scintigraphischen Abbilden, wie sie durch die vorliegende Erfindung geschaffen werden, können verwendet werden zum Sichtbarmachen von Orten in einem Säugerkörper. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden die mit Technetium-99m markierten Mittel zum scintigraphlschen Abbilden verabreicht in einer injizierbaren Einzeldosis. Jeder der allgemein verbreiteten Träger, die Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt sind, wie beispielsweise sterile Kochsalz- Lösung oder Plasma, können nach Radiomarkieren zur Herstellung der injizierbaren Lösung verwendet werden, um für diagnostische Zwecke verschiedene Organe, Tumore und dergleichen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung abzubilden. Allgemein weist die zu verabreichende Einheitsdosis eine Radioaktivität von etwa 0,01 mCi bis etwa 100 mCi auf, vorzugsweise von 1 mCi bis 20 mCi. Die in einer Einheitsdosierung zu injizierende Lösung umfaßt eine Menge von etwa 0,01 ml bis etwa 10 ml. Nach intravenöser Verabreichung kann das Abbilden des Organs oder Tumors in vivo innerhalb von wenigen Minuten stattfinden. Jedoch kann das Abbilden auch im Verlauf von Stunden oder sogar längeren Zeiträumen, nachdem das radiomarkierte Reagenz in einen Patienten injiziert wurde, stattfinden, sofern dies erwünscht ist. In den meisten Beispielen wird sich eine ausreichende Menge der verabreichten Dosis in dem abzubildenden Bereich innerhalb von 0,1 h ansammeln und dann das Aufnehmen von Scintigraphie-Fotographien erlauben. Jede herkömmliche Verfahrensweise zum scintigraphischen Abbilden für diagnostische Zwecke kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Die mit Technetium-99m markierten Reagenzien und Komplexe, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, können intravenös in jedem herkömmlichen Medium zur intravenösen Injektion wie beispielsweise in wäßrigem Kochsalz-Medium oder in Blutplasma-Medium verabreicht werden. Ein derartiges Medium kann auch herkömmliche pharmazeutische Zusatzmaterialien wie beispielsweise pharmazeutisch annehmbare Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen enthalten. Unter den bevorzugten Medien finden sich normale Kochsalz-Lösung und Plasma.
Die Verfahren zur Herstellung und Markierung der vorliegenden Verbindungen sind weiter im einzelnen in den folgenden Beispielen veranschaulicht. Diese Beispiele veranschaulichen bestimmte Aspekte der oben beschriebenen Verfahrensweise sowie vorteilhafte Ergebnisse. Diese Beispiele werden zu Veranschaulichungszwecken angegeben und dienen nicht der Beschränkung der Erfindung.

Beispiel 1

Synthese von BAT-Chelatoren

A. Synthese von N-Boc-N'-(5-carboxypentyl-)N,N'-bis(2-methyl-2- triphenylmethyl-thiopropyl-)ethylendiamin

(a) Synthese von 2-Methyl-2-(triphenylmethylthio-)propanal:

Triphenylmethylmercaptan (362,94 g; 1,31 Mol; 100 Mol%) gelöst in wasserfreiem THF (2 l) wurde in einem Eisbad unter Argon gekühlt. Natriumhydrid (60%ig in Öl; 54,39 g; 1,35 Mol, 104 Mol %) wurde in Teilmengen im Verlauf von 20 min zugegeben. 2-Brom-2- methylpropanal (206,06 g; 1,36 Mol, 104 Mol%; siehe "Stevens & Gillis; J. Amer. Chem. Soc. 79 (1957), 3448 bis 3451)" wurden dann langsam im Verlauf von 20 min zugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur kommen und rührte 12 h lang. Die Reaktion wurde mit Wasser (1 l) abgefangen, und die Reaktionsmischung wurde mit Diethylether (3 x 1 l) extrahiert. Die Ether-Extrakte wurden verelnigt, mit wäßriger NaCl- Lösung (500 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, und so ergab sich ein dickes, orangefarbenes Öl. Das rohe Öl wurde in Toluol (200 ml) gelöst und mit heißen Hexanen auf 2 l verdünnt. Die Mischung durch einen gesinterten Glastrichter filtriert und 12 h lang auf - 5ºC abgekähit. Der weiße kristalline Feststoff, der sich bildete, wurde durch Filtration entfernt, woraus sich 266,36 g (59 % Ausbeute) der Titelverbindung ergaben. Der Schmelzpunkt der resultierenden Verbindung wurde zu 83 bis 85ºC bestimmt. Charakterisierungs-Experimente mit Kernresonanz (NMR) ergaben die folgenden charakteristischen Signale:
¹H-NMR (300 MHz; CDCl&sub3;): δ 1,24 (s, 6H, 2CH3); 7,2 bis 7,35 (m, 9H); 7,59 bis 7,62 (m, 6H); 8,69 (s, H, -COH).
¹³C-NMR (75 MHz; CDCl&sub3;): δ 22,86; 55,66; 67,48; 126,85; 127,75; 129,72; 144,79; 197,31.

(b) Synthese von N,N'-Bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl-)-ethylendiamin:

Ethylendiamin (1,3 ml; 0,0194 Mol; 100 Mol%) wurde unter Argon zu 2-Methyl-2- (triphenylmethylthio-)propanal (13,86 g; 0,0401 Mol, 206 Mol %), das in Methanol (40 ml) und wasserfreiem THF (40 ml) gelöst war, gegeben, und der pH-Wert wurde dadurch auf emen Wert von 6 eingestellt, daß man tropfenweise Essigsäure zugab. Die Lösung wurde 20 min lang bei 20ºC gerührt. Natriumcyanoborhydrid (1,22 g; 0,0194 Mol, 100 Mol%) wurde zugegeben, und diese Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 3 h lang gerührt. Weiteres Natriumcyanoborhydrid (1,08 g) wurde zugesetzt, und diese Reaktionsmischung wurde bei 20ºC 17 h lang gerührt. Eine letzte Portion Natriumcyanoborhydrid (1,02 g) wurde zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde unter Argon 6 h lang aufrückflußtemperatur erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde mit 0,5 M HCl (100 ml) abgeschreckt und mit Methylacetat (2 x 100 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, nacheinander mit 2 M NaOH (60 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (60 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und flitriert. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, was 16,67 g Rohprodukt ergab, das aus Toluol/Hexane kristallisiert wurde. Dies ergab 10,20 g (73 % Ausbeute) weiße Kristalle der Titelverbindung. Der Schmelzpunkt der resultierenden Verbindung wurde zu 83 bis 86ºC bestimmt. Eine FABMS-Analyse ergab einen m/z von 721 (MH&spplus;). NMR-Charakterisierungs-Experimente ergaben die folgenden molekularen Daten:
¹H-NMR (300 MHz; CDCl&sub3;): δ 1,12 (s, 12H, 4 CH&sub3;); 1,64 (s, 4H, N-CH&sub2;-C(Me)&sub2;-S); 2,52 (s, 4H, N-CH&sub2;-CH&sub2;-N); 5,31 (s, 2H, 2-NH); 7,12 bis 7,30 (m, 18H, Ar); 7,62 bis 7,65 (m, 12H, Ar).

(c) Synthese von N-(5-Carboethoxypentyl-)N,N'-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl-)ethylendiamin:

K&sub2;CO&sub3; (1,92 g; 13,9 mMol; 100 Mol%) wurde zu N,N'-Bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl-)ethylendiamin (10,03 g; 13,9 mMol) in CH&sub3;CN (60 ml) gegeben; dem folgte die Zugabe von Ethyl-5-bromvaleriat (3,30 ml; 20,8 mMol; 150 Mol%). Die Reaktionsmischung wurde unter Argon über Nacht auf Rückflußtemperatur erhitzt. Die Lösung wurde dann zu emer Paste konzentriert und mit 0,25 M KOH (100 ml) und Ethylacetat (100 ml) ausgeschüttelt. Die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat (1 x 50 ml) extrahiert, und die vereinigten Ethylacetat-Schichten wurden mit 50 ml Wasser und NaCl-Lösung (2 x 50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem orangefarbenen Öl konzentriert. Die Reinigung mittels Flash-Chromatographie (300 g Flash-Siliciumoxid; 100 % CHCl&sub3; T 5 % MeOH/CHCl&sub3;) ergab die reine Titelverbindung (7,75 g; 66 % Ausbeute). Eine FABMS- Analyse ergab ein (MH&spplus;) von 849 (verglichen mit einem berechneten Molekulargewicht von 849,24 fär die Verbindung C&sub5;&sub5;H&sub6;&sub4;N&sub2;O&sub2;S&sub2;.

(d) Synthese von N-Boc-N'-(5-Carboxypentyl-)N,N'-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl-)ethylendiamin:

1 M KOH (25 ml; 25,0 mMol; 274 Mol %) wurde zu N-(5-Carboethoxypentyl)-N,N'-bis(2- methyl-2-triphenylmethylthiopropyl-)ethylendiamin (7,75 g; 9,13 mMol) in Dioxan (200 ml) gegeben. Dem folgte die Zugabe von Wasser (250 ml). Dioxan wurde dann tropfenweise unter Rühren zugegeben, bis eine homogene Lösung erhalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht erhitzt, so daß ein langsamer Rückfluß stattfand. Die überwiegende Menge des Dioxans wurde dann durch Verdampfung im Rotationsverdampfer entfernt, und der pH-Wert der Lösung wurde auf ungefähr 7 bis 8 unter Verwendung von 1 M KH&sub2;PO&sub4; und gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung eingestellt. Die Lösung wurde dann mit Ethylacetat (3 x 75 ml) extrahiert, und die vereimgten organischen Schichten wurden mit NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem Schaum/Feststoff konzentriert (6,35 g; 85 % Ausbeute).
Das Rohprodukt aus der obigen Reaktion wurde mit (BOC)&sub2;O (3,35 g; 15,4 mMol; 200 Mol%), CH&sub3;CN (50 ml) und Methylenchlorid (50 ml) versetzt. Es folgte eine Zugabe von Triethylamin (1,0 ml; 7,2 mMol; 93 Mol %). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur unter Argon über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann konzentriert und mit Wasser (100 ml) und Ethylacetat (50 ml) ausgeschüttelt. Die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat (1 x 50 ml) extrahiert, und die vereinigten Ethylacetat-Schichten wurden mit 5 % Citronensäure und NaCl-Lösung jeweils 50 ml) gewaschen, anschließend getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem orangefarbenen Öl konzentriert. Eine Reinigung durch Flash- Chromatographie (200 g Flash-Siliciumoxid; 100 % CDCl&sub3; T 5 % Methanol/Chloroform) ergab die reine Titelverbindung N-Boc-N'-(5-Carboxypentyl-)N,N'-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl-)ethylendiamin (2,58 g; 36 % Ausbeute). Eine FABMS-Analyse ergab einen (MH+)-Peak von 921 (verglichen mit dem berechneten Wert von 921,31 für die Verbindung C&sub5;&sub8;H&sub6;&sub8;N&sub2;O&sub4;S&sub2;).

B. Synthese von N-Boc-N'-(5-Carboxypentyl-)N,N'-bis[2-(-methoxybenzylthio-)2-methylpropyl-]ethyleudiamin

(a) Synthese von N,N'-Bis[2-(4-methoxybenzylthio-)2-methylpropyl-]ethylendiamin:

Eine Lösung von N,N'-Bis(2-mercapto-2-methylpropyl-)ethylendiamin (11,23 g; 475 mMol; siehe: "DiZio et al.; Bioconjugate Chem. 2 (1991), 353" und "Corbin et al.; J. Org. Chem. 41(1976), 489") in Methanol (500 ml) wurde im Eis-Wasser-Bad gekählt und dann mit gasförmigem Ammoniak 45 min lang gesättigt. Dieser Lösung wurde 4-Methoxybenzylchlorid (17,0 ml; 125 mMol; 264 Mol%) zugesetzt. Man ließ sich die Reaktionsmischung über Nacht auf Raumtemperatur unter Rühren und unter Argon erwärmen. Die Lösung wurde zu einer Paste konzentriert und dann mit Diethylether (150 ml) und einer 0,5 M KOH-Lösung (200 ml) ausgeschüttelt. Die wäßrige Schicht wurde weiter mit Diethylether (2 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit NaCl-Lösung gewaschen und zu einem klaren, farblosen Öl konzentriert. Das Öl wurde in Diethylether (200 ml) gelöst und anschließend mit 4,0 M HCl in Dioxan angesäuert, bis kein weiterer Niederschlag sichtbar war. Der weiße Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und mit Diethylether gewaschen. Der weiße Feststoff wurde aus heißem Wasser bei einem pH Wert von etwa 2 umkristallisiert. Das Produkt wurde durch Filtration aufgefangen und ergab 29,94 g einer Mischung der Mono- und Di-HCl-Salze. Die HCl-Salze wurden mit 1 M KOH (100 ml) und Ethylacetat (100 ml) ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wurde mit Ethylacetat (2 x 30 ml) extrahiert, und die vereinigten organischen Schichten wurden mit einer NaCl- Lösung gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Erhalt eines reinen Produktes in Form der freien Base als hellgelbes Öl (18,53 g; 82 % Ausbeute) konzentriert. NMR-Charakertisierungs-Experimente ergaben folgende Moleküldaten:
¹H-NMR (300 MHz; CDCl&sub3;): δ 7,25 (d, 4H, J = 9); 6,83 (d, 4H, J = 9); 3,78 (s, 6H); 3,67 (s, 4H); 2,63 (s, 4H); 2,56 (s, 4H); 1,34 (s, 12H).

(13) Synthese von N-(5-Carboethoxypentyl-)N,N'-bis(2-(4-methoxybenzylthio-)2-methylpropyl-]ethylendiamin:

Zu N,N'-Bis[2-(4-methoxybenzylthio-)2-methylpropy-]ethylendiamin (4,13 g; 8,66 mMol) in CH&sub3;CN (50 ml) wurde K&sub2;CO&sub3; (1,12 g; 8,75 mMol; 101 Mol%) zugesetzt, gefolgt von Ethyl-5-bromvaleriat (2,80 ml; 17,7 mMol; 204 Mol %). Die Reaktionsmischung wurde über Nacht unter Rückflußbedingungen gerührt und wurde anschließend im Vakuum zu einer Paste konzentriert. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat (100 ml) und 0,5 M KOH (100 ml) ausgeschüttelt. Die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert (1 x 50 ml), und die vereinigten organischen Schichten wurden mit einer NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem gelben Öl konzentriert (etwa 6 g). Eine Reimgung mit präperativer Normalphasen-HPLC (100 % CHCl&sub3; 5 % Methanol/Chloroform im Verlauf von 25 min) lieferte die reine Titelverbindung (1,759 g; 34 % Ausbeute). Eine FABMS- Analyse ergab einen (MH&spplus;)-Peak von 605 (verglichen mit dem berechneten Wert von 604,90 für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub2;N&sub2;O&sub4;S&sub2;). NMR-Charakterisierungs-Expermimente ergaben die folgenden Moleküldaten:
¹H-NMR (300 MHz; CDCl&sub3;): δ 7,25 (d, 4H, J = 8,5); 6,83 (d, 4H, J = 8,5); 4,13 (q, 2H, J = 7); 3,793 (s, 3H); 3,789 (s, 3H); 3,74 (s, 2H); 3,67 (s, 2H); 2,6 (m, 10H); 2,31 (t, 2H, J 7); 1,6 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 1,34 (s, 12H); 1,28 (t, 3H, J = 7).

(c) Synthese von N-Boc-N'-(5-Carboxypentyl-)N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio-)2-methylpropyl-]ethylendiamin:

Zu N-(5-Carboethoxypentyl-)N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio-)2-methylpropyl-]ethylendiamin (586 mg; 0,969 mMol) in THF (40 ml) wurden Wasser (30 ml) und 1 M KOH (2,5 ml; 2,5 mMol; 260 Mol%) zugesetzt. Die homogene Lösung wurde über Nacht auf eine Temperatur erhitzt, bei der ein leichter Rückfluß erfolgte. Die Lösung wurde anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt, und das THF wurde unter Verdampfen in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mit H&sub2;O auf 50 ml verdünnt, der pH Wert wurde auf etwa 2 bis 3 mit 1 M HCl eingestellt. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (3 x 30 ml) extrahiert, und die vereinigten organischen Schichten wurden mit NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und konzentriert. Dies ergab die rohe Säure (422 mg; 75 % Ausbeute).
Das Rohprodukt aus der obigen Reaktion wurde mit CH&sub3;CN (40 ml) und (BOC)&sub2;O (240 mg; 1,10 mMol; 150 Mol %) versetzt, gefolgt von einer Zugabe von Triethylamin (0,200 ml; 1,43 mMol; 196 Mol %). Die homogene Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter Argon gerührt. Die Lösung wurde dann zu einer Paste konzentriert und mit Ethylacetat (25 ml) und 1 M KH&sub2;PO&sub4; (25 ml) ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde mit 5 %iger Citronensäure (2 x 25 ml) und NaCl-Lösung (25 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem gelben Öl konzentriert. Eine Reinigung durch Flash-Chromatographie (50 ml Flash-Siliciumoxid-Gel; 100 % Chloroform 15 % Methanollchloroform) ergab die reine Titelverbindung N-Boc-N'-(5-Carboxypentyl-)N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio-)2-methyl propyl-]ethylendiamin (344 mg; 70 % Ausbeute). Eine FABMS-Analyse ergab einen (MH&spplus;)- Peak von 677 (verglichen mit dem Wert von 676,97, berechnet für die Verbindung C&sub3;&sub6;H&sub5;&sub6;N&sub2;O&sub6;S&sub2;). NMR-Charakterisierungs-Experimente ergaben die folgenden Moleküldaten:
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 7,20 (d, 4H, J = 7); 6,79 (d, 4H, J = 7); 3,75 (s, 3H); 3,74 (s, 3H); 3,68 (m, 4H); 3,35 (m, 4H); 2,65 (m, 2H), 2,53 (m, 4H); 2,31 (m, 2H); 1,59 (m, 2H); 1,43 (s, 11H); 1,30 (s, 6H); 1,26 (s, 6H).

C. Synthese von BAT-BM (N-[2-(N',N'-Bis(2-maleimidoethyl-)aminoethyl-)]- N&sup6;N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenyimethyithiopropyl-)6,9-diazanonanamid)

BAT-BM wurde wie folgt hergestellt: BAT-Säure (N&sup9;-(t-Butoxycarbonyl-)N&sup6;N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl-)6,9-diazanonansäure) (10,03 g; 10,89 mMol) und 75 ml trockenes Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) wurden in einen 250 ml-Rundboden-Kolben gegeben, der mit einem Magnetrührstab und einem Argon-Ballon ausgestattet war. Dieser Lösung wurde Diisopropylcarbodiimid (3,40 ml; 21,7 mMol; 199 Mol %) zugesetzt, gefolgt von einer Zugabe von N-Hydroxysuccinimid (3,12 g; 27,1 mmol; 249 Mol%). Es wurde beobachtet, daß diese Lösung innerhalb 1 h getrübt wurde, und sie wurde weiter unter Rühren für eine Gesamtzeit von 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Lösung von Tris(2- aminoethyl-)amin (30 ml; 200 mMol; 1.840 Mol%) in 30 ml Methylenchlorid wurde anschließend zugesetzt, und die Mischung wurde weiter über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter verringertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat (150 ml) und 0,5 M Kaliumcarbonat (K&sub2;CO&sub3;; 150 ml) ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Salzlake gewaschen und konzentriert. Dies ergab das Rohprodukt N-(2-(N',N'-Bis(2-aminoethyl-)aminoethyl-)]N&sup9;-(t- butoxycarbonyl-)N&sup6;N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl-)6,9-diazanonanamid in Form eines Schaums/Öls.
Dieses Rohprodukt wurde in einen 1.000 ml-Rundboden-Kolben gegeben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet war und 30 ml THF enthielt. Anschließend wurden 30 ml gesattigte Natriumbicarbonat-Lösung (NaHCO&sub3;), 100 ml Wasser und N-Methoxycarbonylmaleimid (6,13 g; 39,5 mMol; 363 Mol %) zugesetzt. Diese heterogene Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerüut. THF wurde von dieser Mischung durch Verdampfen im Rotationsverdampfer entfernt, und der wässrige Rückstand wurde zweimal mit Ethylacetat (2 x 75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten dieser Extraktionsschritte wurden mit Salziake gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, durch eme Fritte mittlerer Feinheit filtriert und auf etwa 12 g Rohprodukt konzentriert. Eine Reinigung durch Flüssigchromatographie (250 g Siliciumoxid; Elution mit einem Gradienten aus Chloroform 2 % Methanol in Chloroform) lieferte 5,3 g reines Produkt (N-[2-(Nmu N'-Bis(2-maleimidoethyl-)aminoethyl-)]N&sup9;-(t-butoxycarbonyl-)N&sup6;, N&sup9;-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl-)6,9-diazanonanamid; Äquivalent zu 40 % Ausbeute) zusammenmit etwa 5 g Rohprodukt, das erneut zu einem Produkt gereinigt werden kann. Eine chemische Analyse des gereinigten Produktes bestatigte seme Identität mit BAT-BM wie folgt:
¹H-NMR (200 MHz; CDCl&sub3;): δ 0,91 (12H, s); 1,38 (9H, s); 1,2 bis 1,6 (4H, m); 2,06 (2H, s); 2,18 (2H, t, 3 = 7); 2,31 (4H, m); 2,55 (2H, t, J = 5); 2,61 (4H, t, J = 6); 2,99 (2H, s); 3,0 bis 3,3 (4H, m); 3,46 (4H, t, J = 6); 6,49 (-NH, t, J = 4); 6,64 (4H, 5); 7,1 bis 7,3 (18H, m); 7,6 (12H, t, J = 17).

D. Synthese von [BAT]-konjugiertem(&epsi;N) Lys(αN-Fmoc) [N-&epsi;-(N&sup9;-t- Butoxycarbonyl-)N&sup6;,N&sup9;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl-]6,9-diazanonanoyl-)N-α-Fmoc-lysin]

Ein 100 ml Einhals-Rundboden-Kolben, der mit einem Rührstab und einem Argon-Ballon ausgerüstet war, wurde mit N&sup9;-(t-Butoxycarbonyl-)N&sup6;,N&sup9;-bis[2-methyl-2(triphenylmethylthio-)propyl-]6,9-diazanonansäure (BAT-Säure; 3,29 g; 3,57 mMol) in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; bei Raumtemperatur befüllt. Dem wurde Düsopropylcarbodiimid (DIC; 580 µl; 3,70 mMol; 104 Mol%) zugesetzt, unmittelbar gefolgt von N-Hydroxysuccinimid (HOSu; 432 mg; 3,75 mMol; 105 Mol %). Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt; während dieser Zeit entwickelte sich ein weißer Niederschlag. Die Mischung wurde filtriert, und das Filtrat wurde zu einem festen Schaum konzentriert. Der rohe Schaum wurde in einem 100 ml-Rundboden-Kolben in 50 ml einer 2:1-Mischung aus Dimethoxyethan und Wasser gelöst. Dieser homogenen Lösung wurde N-α-Fmoc-lysin-hydrochlorid (1,52 g; 3,75 mMol; 105 Mol%) zugesetzt, gefolgt von K&sub2;CO&sub3; (517 mg; 3,74 mMol; 105 Mol%), und die gelbe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde dann in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen, der 100 ml Ethylacetat und 100 ml Wasser enthielt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, und die wäßrige Schicht wurde weiter mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden zweimal mit Satzlake (100 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem gelben Feststoff konzentriert. Dieses Rohprodukt wurde durch Niederdruck-Flüssigchromatographie (150 g SiO&sub2;; Elution mit CHCl&sub3; T 10 % Methanol in CHCl&sub3;) gereinigt. Auf diesem Wege wurde 3,1 g des benannten Produktes hergestellt (69 % Ausbeute). Eine chemische Analyse des gereinigten Produktes bestätigte seine Identität wie folgt:
¹H-NMR (300 MHz; CDCl&sub3;): δ 0,88 (12H, s, breit); 1,05 bis 1,45 (19H, m); 1,8 bis 2,1 (4H, m); 1,8 bis 2,47 (4H, m); 2,75 bis 3,2 (6H, m); 3,9 bis 4,3 (4H, m) 7,2 (22H, m); 7,6 (16H, s, gebunden).
Es wurde vorausgesagt, daß bei der FABMS der (MH&spplus;)-Peak 1.270,6 betrug; es wurde gefimden, daß er bei 1.272 lag.

E. Synthese von BAM (N¹-(t-Butoxycarbonyl-)-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio-)propyl-]1,4,10-4riazadecan)

Ein 250 ml-Einhals-Rundboden-Kolben, der mit einem Rührstab, einem Rückflußkühler und einem Argon-Ballon ausgestattet war, wurde mit N¹,N&sup4;-Bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio-)propyl-]ethylendiamin (BAT-I; 10,0 g; 14,01 mMol) in 50 ml CH&sub3;CN und 30 ml Dioxan befüllt. Dem wurde N-(5-Brompentyl-)phthalimid (8,04 g; 27,1 mMol; 194 Mol %) zugesetzt, gefolgt von K&sub2;CO&sub3; (2,95 g; 21,3 mMol; 152 Mol %). Die Mischung wurde zwei tage lang unter Argon auf Rückflußtemperatur erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde dann konzentriert, und der Rückstand wurde mit 150 ml Wasser und 150 ml Ethylacetat geschüttelt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, die wäßrige Schicht (bei einem pH Wert von etwa 10) wurde weiter mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden eimnal mit Salzlake (75 ml) gewaschen, über Na&sub2;CO&sub3; getrocknet und zu einem Öl konzentriert. Eine Reinigung durch Niederdruck-Flüssigchromatographie (300 g SiO&sub2;; CHCl&sub3; T2 % Methanol in CHCl&sub3;) lieferte 9,20 g 9- Phthalimido-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio-)propyl-]1,4-diazanonan in Form eines gelben Schaums (70 % Ausbeute). Eine chemische Analyse des gereinigten Produktes dieser Zwischenstufe bestätigte seine Identität wie folgt:
¹H-NMR (300 MHz; CDCl&sub3;): δ 1,01 (6H, s); 1,03 (6H, s); 1,15 bis 1,4 (2H, t); 1,98 (2H, s); 2,10 (2H, s); 2,28 (2H, m); 2,45 (3H, m); 3,68 (2H, t); 7,15 bis 7,35 (18H, m); 7,62 (12H, t); 7,72 (2H, m); 7,85 (2H, m).
Bei FABMS wurde für den (MH&spplus;)-Peak vorausgesagt, daß dieser bei 935,4 liege, und es wurde gefunden, daß er 936 ist.
Ein 500 ml Einhals-Rundboden-Kolben, der mit einem Rührstab ausgerüstet war, wurde mit 9-Phthalimido-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio-)propyl-)1,4-diazanonan (8,83 g; 9,43 mMol) in 75 ml CH&sub3;CN und 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; befüllt. Dem wurde K&sub2;CO&sub3; (1,30 g; 9,41 mMol; 100 Mol %) zugesetzt, gefolgt von Di-tert-butyldicarbonat (2,15 g; 9,85 mMol; 104 Mol%). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerüt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend konzentriert und mit je 100 ml Wasser und Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, und die wäßrige Schicht wurde weiter mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die verelnigten organischen Schichten wurden einmal mit Salzlake (75 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet uhd konzentriert. Dies ergab 9,69 g rohen 9-Phthalimido-N¹-(t-butoxycarbonyl-)N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2- (triphenylmethylthio-)propyl-]1,4-diazanonans in Form eines gelben Schaums (99 % Rohausbeute). Dieses Produkt wurde ohne weitere Reüiigung eingesetzt.
Ein 250 ml-Einhals-Rundboden-Kolben, der mit einem Rührstab und einem Rückflußkühler ausgestattet war, wurde befüllt mit 9-Phthalimido-N¹-(t-butoxycarbonyl-)N¹,N&sup4;-bis[2- methyl-2-(triphenylmethylthio-)propyl-]1,4-diazanonan (5,50 g; 5,31943 mMol) in 25 ml THF. Dem wurden 100 ml Ethanol und 5 ml Wasser zugesetzt. Der Zusatz von Wasser führte dazu, daß das Ausgangsmaterial aus der Lösung ausfiel. Hydrazinhydrat (1,2 ml; 24,7 mMol; 466 Mol%) wurde zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde für die Zeit von 2 Tagen auf Rückflußtemperatur erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und mit jeweils 100 ml Wasser und 0,25 M K&sub2;CO&sub3; ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und einmal mit Salzlake (75 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem festen Schaum konzentriert. Die Reinigung des Rohproduktes durch Niederdruck- Flüssigchromatographie (100 g SiO&sub2;; CHCl&sub3; T 5 % Methanol in CHCl&sub3;; die Säule wurde mit 200 ml 2% igen Triethylamins in CHCl&sub3; vorbehandelt) lieferte 3,27 g der reinen Verbindung N¹-(t-Butoxycarbonyl-)N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio-)propyl]- 1,4,10-triazadecan in Form eines gelben Schaums (68 % Ausbeute). Die chemische Analyse des gereinigten Produktes bestätigte dessen Identität wie folgt:
¹H-NMR (300 MHz; CDCl&sub3;): δ 0,9 (12H, s); 1,2 (6H, s); 1,36 (9H, s); 2,05 (4H, m); 2,24 (2H, t); 2,31 (2H, t); 2,62 (3H, t); 3,0 (2H, s, breit); 3,1 (2H, s, breit); 7,2 (18H, m); 7,6 (12H, t).
Bei der FABMS wurde vorhergesagt, daß der (MH+)-Peak 905,5 sei; es wurde gefunden, daß er 906,5 war.

Beispiel 2

Synthese von mehrwertigen Bindungseinheiten

1. Synthese von TMEA [Tris(2-maleimidoethyl-)amin]:

Tris(2-aminoethyl-)amin (1,49 ml; 10 mMol), das in 50 ml gesättigter wäßriger Natriumbiocarbonat-Lösung gelöst und in einem Eisbad gekühit worden war, wurde mit N-Carbomethoxymaleimid (4,808 g, 31 mMol) behandelt. Die Mischung wurde 30 min lang auf Eis und anschließend weitere 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde dann mit Dichlormethan und Wasser ausgeschüttelt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedanipft. Dies ergab 3,442 g des Produktes. Eine Umkehrphasen-Dünnschicht-Chromatographie (RP-TLC) lieferte im wesentlichen einen Fleck (Rf = 0,63 in 1:1 Acetonitril/ 0,5 M Natriumchlorid). 3,94 mMol (1,817 g) dieses Produktes wurden gelöst in 20 ml Tetrahydrofuran und 20 ml gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung und 2 h lang gemischt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit Ethylacetat und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Die Ethylacetat-Lösung wurde mit Hexanen verdünnt und abgekühlt. Festes TMEA wurde durch Filtration gewonnen und auf eine Ausbeute von 832 mg getrocknet. Die chemische Analyse des Produktes bestätigte die Identität mit TMEA wie folgt:
¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,65 (tr, 2 H); 3,45 (tr, 2 H); 6,64 (s, 2 H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;): 35,5; 51,5; 133,9; 170,4.

2. Synthese von TMEB (4-[1-(2-Tolylsulfonylmethyl-)ethenylcarbonyl-]benzoesäure)

4-(Bis(2-Toluolthiomethyl-)acetyl-)benzoesäure wurde hergestellt aus 2-Thiokresol unter Anwendung der Verfahrensweisen von Lawton und Mitarbeitern (Bioconjugate Chemistry 1 (1990), 36). Die Identität der resultierenden Verbindung wurde durch chemische Analyse wie folgt bestätigt:
FABMS: (MH&spplus;) = 436.
¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,62 (s, 6H); 3,2 bis 3,4 (m, 4H); 3,94 (d tr, 1H); 7,10 bis 7,26 (m, 8H); 7,64 (d, 2H); 8,07 (d, 2H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;): 20,2; 34,9; 45,4; 126,5; 126,8; 128,1; 129,9; 130,3; 130,4; 132,9; 133,9; 138,9; 140,5.
Einer Lösung von 4-(Bis(2-toluolthiomethyl-)acetyl-)benzoesäure (1,865 g; 4,27 mMol) in 50 % Methanol/Wasser (12,5 ml) wurde Essigsäure (2,69 ml) zugesetzt, gefolgt von einer 30%igen Wasserstoffperoxid-Lösung (2,61 ml) und Dinatriumtungstat-Dihydrat (0,187 g; 0,56 mMol). Die Mischung wurde über Nacht gerührt, und das Rohprodukt wurde abfiltriert. Eine Umkristallisation aus Methanol/Wasser sowie Umkehrphasen-HPLC (0,1 % CF&sub3;COOH/Acetonitril/Wasser) ergab TMEB (178 mg). Die Identität der resultierenden Verbindung wurde durch chemische Analyse wie folgt bestätigt:
¹H-NMR (DMSO-d6): 2,68 (s, 3H); 4,56 (s, 2H); 5,95 (s, 1H); 6,27 (s, 1H); 7,37 bis 8,05 (m, 8H).

Beispiel 3

Festphasen-Peptidsynthese

Eine Festphasen-Peptidsynthese (solid phase peptide synthesis; SPPS) wurde im 0,25 mMol- Maßstab unter Verwendung einer Peptidsynthese-Vorrichtung der Firma Applied Biosystems (Modell 431A) und Verwendung einer 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc- Schutzgruppe) am Aminoterminus sowie unter Kopplung mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1H-Benzotriazol-1-yl-)1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphatlhydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT) sowie unter Verwendung eines p-Hydroxymethylphenoxymethylpolystyrol-Harzes (HMP-Harzes) für Carboxyl-Terminus-Säuren oder eines Ring-Amid-Harzes für Carboxyl-Terminus-Amide durchgeführt. An das Harz gebundene Produkte wurden in üblicher Weise bei Raumtemperatur über eine Zeit von 1,5 bis 3 h unter Verwendung einer Lösung abgespalten, die aus Trifluoressigsäure bestand und gegebenenfalls Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triethylsilan in Mengenanteilen von 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2 enthielt.
Wo dies passend war, wurden N-terminale Acetyl-Gruppen dadurch eingeführt, daß man das an das Harz gebundene freie N-terminale Amino-Gruppen aufweisende Peptid mit 20 % (v/v) Essigsäureanhydrid in NMP (N-Methylpyrrolidinon) für die Zeit von 30 min behandelte. Wo dies passend war, wurden 2-Chloracetyl-Gruppen und 2-Bromacetyl- Gruppen eingeführt entweder unter Verwendung der jeweils passenden 2-Halogenessigsäure als dem letzten Rest, der während der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) anzukoppeln war, oder durch Behandeln des an das Harz gebundene, freie N-terminale Amino-Gruppen aufweisenden Peptids entweder mit 2-Halogenessigsäure/Diisopropylcarbodiimid/N- Hydroxysuccinimid in NMP oder 2-Halogenessigsäureanhydrid/Diisopropylethylamin in NMP. Wo dies passend war, wurden 2-Halogen-acetylierte Peptide cyclisiert durch Rühren emer 0,1 bis 1,0 mg/ml enthaltenden Lösung in Phosphatpuffer oder Bicarbonatpuffer (pH- Wert: 8), der 0,5 bis 1,0 mM EDTA enthielt, für die Zeit von 4 bis 48 h, gefolgt von einer Ansäuerung mit Essigsäure, einer Lyophilisierung und einer Reimgung mittels HPLC. Wo dies passend war, wurden Cys-Cys-Disulfidbindungs-Cyclisierungen durchgeführt durch Behandeln der Cystein mit freien Thiol-Gruppen aufweisenden Vorstufen-Peptide in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in einem auf einen pH-Wert von 7 eingestellten Puffer mit Aliquots einer 0,006 M K&sub3;Fe(CN)&sub6;-Lösung, bis eine stabile gelbe Farbe bestehen blieb. Der Überschuß von Oxidationsmittel wurde mit einem Überschuß-Cystein reduziert, und die Mischung wurde lyophilisiert und anschließend durch HPLC gereinigt.
Wo dies passend war, wurde die "Peak"-Gruppe eingeführt, indem man Picolinsäure als letzten Rest bei der Peptidsynthese verwendete. Wo dies passend war, wurde die "Pica"- Gruppe eingeführt durch Konjugieren von Picolylamin an ein Vorstufenpeptid unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid. Wo dies passend war, wurden BAT-Liganden eingeführt entweder durch Verwendung der passenden BAT-Säure als letztem Rest, der während der Festphasen-Peptidsynthese anzukoppeln war, oder durch Behandeln des an das Harz gebundenen, freie, N-terminale Amino-Gruppen aufweisenden Peptids mit BAT-Säure/Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP. Wo dies passend war, wurde die Gruppe [BAM] an das Peptid konjugiert, indem man zuerst das Peptid-Carboxylat mit einer Mischung aus Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid oder HBTU/HOBT in DMF, NMP oder CH&sub2;Cl&sub2; aktivierte, gefolgt von einem Vorgang des Koppelns in Gegenwart von Diisopropylethylamin. Nach dem Vorgang des Koppelns wurde das Konjugat in der oben beschriebenen Weise von Schutzgruppen befreit.
Wo dies passend war, wurden BSME-Addukte hergestellt durch Umsetzen von einzelnen, Thiol-Gruppen enthaltenden Peptiden (in einer Konzentration von 5 bis 50 mg/ml in 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert: 8)) mit 0,5 Mol äquivalenten BMME (Bismaleimidomethylether), der in Acetonitril vorgelöst war, bei Raumtemperatur für die Zeit von etwa 1 bis 18 h. Die Lösung wurde konzentriert, und das Produkt wurde durch HPLC gereinigt. Wo dies passend war, wurden BSH-Addukte hergestellt durch Verwendung von Bismaleimidohexan anstelle von BMME.
Wo dies passend war, wurden TSEA-Addukte hergestellt durch Umsetzen eines einzelnen Thiol-Gruppen enthaltenden Peptids (in Konzentrationen von 10 bis 100 mglml Peptid in DMF oder 5 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert: 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,33 Mol Äquivalenten TMEA (Tris(2-maleimidoethyl-)amin; vergleiche US-A 509,542 und EP-A 453,012), das in Acetonitril oder DMF vorgelöst war, mit oder ohne ein molares Äquivalent Triethanolamin bei Raumtemperatur für etwa 1 bis 18 h. Solche Reaktionsmischungen, die Addukte enthalten, wurden konzentriert, und die Addukte wurden dann unter Anwendung von HPLC gerelnigt.
Wo dies passend war, wurden BAT-BS-Addukte hergestellt durch Umsetzen des einzelnen Thiol-Gruppen enthaltenden Peptids (in Konzentration von 2 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert: 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,5 Mol Äquivalenten BAT-BM (N-[2-(N',N'-Bis(2-maleimidoethyl-)aminoethyl-)]N&sup9;-(t-butoxycarbonyl-)N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl 2-triphenylmethylthiopropyl-)6,9-diazanonanamid: siehe WO 93/21962), vorgelöst in Acetonitril oder THF, bei Raumtemperatur für eine Zeit von etwa 1 bis 18 h. Die Lösung wurde anschließend zur Trockene eingedampft, und die [BAT-BS]-Peptid-Konjugate wurden durch Behandlung mit 10 ml TFA und 0,2 ml Triethylsilan für die Zeit von 1 h von den Schutzgruppen befreit. Die Lösung wurde konzentriert, und die Produkt-Addukte wurden mit Ether gefallt und anschließend mittels HPLC gereinigt.
Wo dies passend war, wurden DMAB-Addukte hergestellt durch Umsetzen von einzelne Thiol-Gruppen enthaltenden Peptiden (in Konzentration von 10 bis 100 mg/ml in DMF) mit 0,5 Mol Äquivalenten TMEB (beschrieben in Beispiel 2) und 1 Mol Äquivalent Triethanolamin bei Raumtemperatur für die Zeit von etwa 12 bis 18 h. DMF wurde anschließend im Vakuum entfernt und das Produkt wurde durch HPLC gereinigt.
Rohpeptide wurden gereinigt durch präparative Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Bedingungen, die in den Fußnoten zu Tabelle I beschrieben sind. Eluierte Fraktionen, die anschließend lyophilisiert wurden, und die Identität jedes Produktes wurden bestätigt durch Schnellatom-Schuß-Massenspektroskopie (fast atom bombardment mass spectroscopy; FABMS) oder Elektrospray-Massenspektroskopie (electrospray mass spectroscopy; ESMS).

Beispiel 4

Allgemeines Verfahren zum Radiomarkieren mit Tc-99m

0,1 mg eines Peptid-Reagenz, das wie in Beispiel 3 hergestellt worden war, wurden in 0,1 ml Wasser oder einer 50 : 50-Mischung Ethanol: Wasser oder in mit Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung (phosphate buffered saline; PBS) oder in 50 mM Kaliumpbosphat-Puffer (pH-Wert = 5,6 oder 7,4) gelöst. Tc-99m-Gluceptat wurde hergestellt durch Rekonstituieren eines Glucoscan-Fläschchen (Herstellung: Firma E.I. Dupont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99m-Natriumpertechnetat, das bis zu 200 mCi enthielt; man ließ die Mischung 15 min lang bei Raumtemperatur stehen. 25 µl Tc-99m-Gluceptat wurden dann dem Reagenz zugesetzt, und man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur oder bei 100ºC für die Zeit von 15 bis 30 min ablaufen; das Produkt wurde anschließend durch ein 0,2 µm-Filter flitriert.
Die Reinheit des mit Tc-99m markierten Peptid-Reagenz wurde bestimmt durch HPLC unter den Bedingungen, die in den Fußnoten zu Tabelle I beschrieben sind. Radioaktive Komponenten wurden ermittelt durch einen In-line-Radiometer-Detektor, der mit einem Integrations-Aufzeichnungsgerät verbunden war. Tc-99m-Gluceptat und Tc-99m-Natriumpertechnetat werden unter diesen Bedingungen zwischen 1 und 4 min eluiert, während das mit Tc-99m markierte Peptid erst nach einer viel längeren Zeit eluiert wurde.
Die folgende Tabelle veranschaulicht das erfolgreiche Markieren von Peptiden, die gemäß Beispiel 3 hergestellt worden waren, mit Tc-99m unter Verwendung der in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verfahren. Tabelle I Tabelle I (Fortsetzung)

Anmerkungen zu Tabelle I:

N.D.: nichtbestimmt
z: Molekulargewicht, bestimmt durch Elektrospray-Massenspektroskopie (ESMS)
*: die Indices beziehen sich auf die folgenden Bedingungen für das Markieren:
1. Das Peptid wurde in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4) gelöst und bei 100ºC markiert.
2. Das Peptid wurde in Wasser gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
3. Das Peptid wurde in Wasser gelöst und bei 100ºC markiert.
4. Das Peptid wurde in einer 50:50-Mischung gelöst, die 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4) und absolutes Ethanol umfaßte, und bei 100ºC markiert.
**: HPCL-Verfahren (angezeigt durch hochgestellte Indices nach RT):
allgemein: Lösungsmittel A = 0,1 % CF&sub3;COOH/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub9;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/90% CH&sub3;CN/H&sub2;
Strömungsgeschwindigkeit Lösungsmittel = 1 ml/min
Vydak-Säule: Analysesäule Vydak 218TP54 RP-18; 5µ x 220 mm x 4,6 mm, mit Schutzsäule
Waters-Säule: Waters Delta Pack-Säule C18; 5µ x 150 mm x 3,9 mm
Bedingungen: 1.100% A zu 100% B&sub9;&sub0; in 10 min; Waters-Säule
2.100% A zu 100% B&sub9;&sub0; in 20 min; Waters-Säule
3.100% A zu 100% B&sub9;&sub0; in 10 min; Vydak-Säule.
Ein-Buchstaben-Abkürzungen für die Aminosäuren sind zu finden in "G. Zubay; Biochemistry (2. Ausgabe), MacMillen Publisliing, New York (1988) Seite 33".
Eine Unterstreichung zeigt die Bildung einer ibiol-Bindung zwischen den verbundenen Aminosäuren der Derivat-Gruppen an. Die Peptide werden an die BSH-, DMAB-, BSME-, TSEA- oder [BAT-BS]-Linker über die freie Thiol-Einheit des ungeschützten Cystein-Restes (C) in jedem derartigen Peptid gebunden.
Pic steht für Picolinoyl (Pyridin-2-carbonyl); Acm steht für Acetamidomethyl; Apc steht für L-(S-(3-Aminopropyl-)cystein); FD steht für D-Phenylalanin; YD steht für D-Tyrosin; K(N&epsi;- BAT) steht für ein Lysin, das kovalent an eine BAT-Einheit über die E-Amino-Gruppe der Seitenkette gebunden ist; ma steht für 2-Mercaptoessigsäure; BAT steht für N&sup6;,N&sup9;-Bis(2- mercapto-2-methylpropyl-)6,9-diazanonansäure; [BAT-BS] steht für N-[2-N',N'-Bis(2- succinimidoethyl-)aminocthyl-]N&sup6;,N&sup9;-bis(2-mercapto-2-methylpropyl-)6,9-diazanonanamid; BSME steht für Bissuccinmidomethylether; TSEA steht für Tris(2-succinimidoethyl-)amin; BSH steht für 1,6-Bissuccinimidohexan; und DMAB steht für 4-(2,2-Dimethylacetyl-)benzoesäure. Chemische Struturen der Reagenzien gemäß der Erfindung sind die folgenden:

Beispiel 5

In vivo-Abbilden einer Venen-Thrombose unter Verwendung eines niit Tc-99m markierten Peptids in einem Hunde-Modell

Mischlingshunde (25 bis 35 lb; diese hatten über Nacht nichts zu Fressen bekommen) wurden mit einer Kombination aus Ketamin und Aceprozamin intramuskulär sediert und anschließend intravenös mit Natriumpentabarbital anästhesiert. Jedem Tier wurde ein 18 gauge starkes Angiocath (Gefaßkatheter) in die distale Hälfte der rechten Femoralvene eingesetzt, und eine 8 mm starke, mit DacronR umwickelte Embolisierungsspule aus nichtrostendem Stahl (Firma Cook Co., Bloomington, IN) wurde in der Femoralvene etwa auf halber Höhe des Oberschenkels angeordnet. Das Katheter wurde entfernt, die Wunde vernäht, und die Plazierung der Spule wurde durch Röntgen dokumentiert. Man ließ sich die Tiere dann über Nacht erholen.
Am Tag nach dem Einsetzen der Spule wurde jedes Tier erneut anästhesiert, und es wurden intravenöse Kochsalz-Tropfinfusionen in jedem Vorderlaüf installiert, und es wurde ein Harnblasen-Katheter zum Auffangen von Urin eingeführt. Das Tier wurde in Rückenlage unter eine Gamma-Strahlen-Kamera gelegt, die mit einem Niederenergie-Allzweck- Kollimator ausgerüstet und hinsichtlich der Photo-Peaks auf Tc-99m ausgerichetet war.
Mit Tc-99m markiertes Peptid [185 bis 370 mBq (5 bis 10 mCi) Tc-99m] wurde danach in eine im Vorderlauf verlegte intravenöse Infüsionslinie am Punkt der Einhrung injiziert. Die zweite Leitung wurde zum Abnehmen von Blut beibehalten.
Der Abbildevorgang mit der Gamma-Strahlen-Kamera wurde gleichzeitig mit der Injektion gestartet. Von vorne aufgenommene Bilder des Herzens wurden nach Art einer dynamischen Studie (Aufnahmen im Abstand von 10 Sekunden) über die ersten 10 min hinweg aufgenommen, anschließend als statische Bilder zum Zeitpunkt 1, 2, 3 und 4 h nach der Injektion. Von vorne aufgenommene Bilder der Läufe wurden über 500.000 Counts oder 20 min (welcher Zeitraum kürzer war) zum Zeitpunkt von etwa 10 bis 20 min und etwa 1, 2, 3 und 4 h nach der Injektion aufgenommen. Die Bilder der Läufe wurden aufgenommen mit einer Bleiabschirmung über der Blase.
Im Anschluß an die letzte Aufnahme wurde jedes Tier mit Pentabarbital tief anästhesiert. Zwei Blutproben wurden durch Herzpunktion unter Verwendung einer heparinisierten Spritze abgenommen. Anschließend folgte eine euthanisierende Dosis einer gesättigten Kochsalz-Lösung, die durch Injektion in das Herz oder Injektion eines intravenösen Bolus verabreicht wurde. Die den Thrombus enthaltende Femoralvene, ein ähnlicher Abschnitt der Vene des (Kontroll-)Laufs auf der anderen Seite, Abschnitte des zum Thrombus proximalen Gefäßes und Proben eines Oberschenkel-Muskels wurden dann sorgfältig herausseziert. Der Thrombus, die Spule und die DacronR-Fasern der Spule wurden dann aus dem Gefäß frei herausgeschnitten. Der Thrombus, mit Kochsalz-Lösung gewaschene Proben der Gefäße, die Spule und die Dacron-Fasern der Spule wurden getrennt, und jede Probe wurde in ein vorgewogenes Teströhrchen gegeben. Die Proben wurden gewogen und in einem Gamma- Zählrohr-Kanal im Tc-99m-Kanal zusammen mit bekannten Teilmengen der injizierten Dosen gezählt.
Es wurden das Gewicht des frischen Thrombus, die prozentuale injizierte Dosis (% ID)/g im Thrombus und im Blut, das unmittelbar vor der Abtötung erhalten worden war, sowie die Verhältnisse Thrombus/Blut und Thrombus/Muskel bestimmt. Aus den im Computer gespeicherten Bildern wurden die Verhältnisse Thrombus/Hintergrund durch Analyse der Counts/Pixel bestimmt, die in den Bereichen von Interesse (regions of interest; ROI) über dem Thrombus und dem benachbarten Muskel gemessen worden waren. Die für das maßgebenden Daten aus diesen Experimenten sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Scintigraphische Bilder, die den Locus des Venen-Thrombus in vivo zeigen, der unter Verwendung des mit Tc-99m markierten Peptids P357 detektiert worden war, sind in Figur 1 gezeigt. Jedes der Bilder stellt ein Scinti-Photo dar, das zu den folgenden Zeitpunkten nach der Injektion aufgenommen wurde: A = 23 min; B = 1 h 11 min; C = 2 h 19 min; D = 3h 28 min und E = 3h 42 min.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Venen-Thromben schnell und effizient in vivo unter Verwendung von mit Tc-99m markierten Reagenzien gemäß der Erfindung lokalisiert werden können. Die Lokalisierung erfolgte klar innerhalb 1 h nach der Injektion und blieb mit steigendem Kontrast und fokaler Definition über nahezu 4 h nach der Injektion bestehen.
Es versteht sich, daß die vorangehende Offenbarung bestimmte spezifische Ausführungsformen der Erfindung betont und daß alle Modifikationen oder Alternativen, die zu diesen Ausführungsformen äquivalent sind, im Geist und Umfang der Erfindung liegen, wie er sich aus den nachfolgenden Patentansprüchen ergibt. Tabelle II
Die angegebenen Werte sind das Mittel 1 Standardabweichung vom Mittel; [n = Zahl der Experimente, die mit diesem Peptid durchgefülut wurden] (a = n = 2 für diesen Wert)

Claims

1. Reagens zur Herstellung eines Abbildungsmittels für die Scintigraphie zum Abbilden von Orten innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend eine Vielzahl von spezifisch bindenden Peptid-Einheiten, wobei jedes spezifisch bindende Peptid eine Aminosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren aufweist und kovalent an eine mehrwertige Bindungseinheit gebunden ist, und eine Technetium-99m-Bindungseinheit, die kovalent an eine Mehrzahl der spezifisch bindenden Peptide, die mehrwertige Bindungseinheit oder beide gebunden ist, wobei das Reagens gegebenenfalls mit Technetium-99m radiomarkiert ist.

2. Reagens nach Anspruch 1, worin die Technetium-99m-Bindungseinheit gewählt ist aus

worin C(pgp)s ein Cystein ist, das eine geschützte Thiol-Gruppe aufweist, und (aa) eine Aminosäure ist;

worin A¹ für H, HOOC, H&sub2;NOC oder -NHOC steht;

B¹ für SH oder NHR³ steht;

X¹ für H, Methyl, SH oder NHR³ steht;

Z¹ für H oder Methyl steht;

R¹ und R² unabhängig voneinander für H oder für Niederalkyl stehen;

R³ für H, Niederalkyl oder -C=O steht;

n für 0, 1 oder 2 steht; und

dann, wenn B¹ für NHR³ steht, X¹ für SH steht, Z¹ für H steht und n für 1 oder 2 steht;

dann, wenn X¹ für NHR³ steht, B¹ für SH steht, Z¹ für H steht und n für 1 oder 2 steht;

dann, wenn B¹ für H steht, A¹ für HOOC, H&sub2;HOC oder -NHOC steht, X¹ für SH steht, Z¹ für H steht und n für 0 oder 1 steht;

dann, wenn Z¹ für Methyl steht, X¹ für Methyl steht, A¹ für HOOC, H&sub2;NOC oder -NHOC steht, B¹ für SH und n für 0 steht; und

worin die "hiol-Einheit in der reduzierten Form vorliegt;

worin X² für H oder eine Schutzgruppe steht; und (Aminosäure) irgendeine Aminosäure ist;

worin jeder der Reste R unabhängig vom anderen für H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; steht; jeder der Reste (pgp)s unabhängig vom anderen eine Thiol-Schutzgruppe oder H bedeutet;

m, n und p unabhängig voneinander für 2 oder 3 stehen;

A² für lineare oder cyclische Niederalkyl-Reste, Aryl-Reste, heterocyclische Reste, Kombinationen oder substituierte Derivate dieser Reste steht; und

worin jeder der Reste R unabhängig vom anderen für H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; steht;

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 bedeuten;

A² für lineare oder cyclische Niederalkyl-Reste, Aryl-Reste, heterocyclische Reste, Kombinationen oder substituierte Derivate dieser Reste steht;

V für H oder -CO-Peptid steht;

R&sup4; für H oder Peptid steht; und

worin dann, wenn V für H steht, R&sup4; für Peptid steht, und dann, wenn R&sup4; für H steht, V für -CO-Pepdd steht;

worin jeder der Reste R unabhängig vom anderen für H, einen Niederalkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Phenyl-Rest oder einen mit einem Niederalkyl-Rest oder Niederalkoxy-Rest substituierten Phenyl-Rest steht, und worin jeder Index n unabhängig 1 oder 2 bedeutet.

3. Reagens nach Anspruch 2, worin entweder

(a) das geschützte Cystein eine Schutzgruppe der Formel

-CH&sub2;-NH-CO-R

aufweist, worin R für einen Niederalkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, 2-,3-,4- Pyridyl, Phenyl oder Phenyl, das mit einem Niederalkyl-Rest, Hydroxy-Rest, Niederalkoxy-Rest, Carboxy-Rest oder Niederalkoxycarbonyl-Rest substituiert ist, steht; oder

(b) C(pgp)s-(aa)-C(ggp)s die folgende Formel aufweist:

4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die mehrwertige Bindungseinheit aus wenigstens zwei funktionellen Linker-Gruppen besteht, die sich kovalent an spezifisch bindende Peptide oder Technetium-99m-Bindungseinheiten binden können, und worin wenigstens zwei der funktionellen Linker-Gruppen identisch sind; und gegebenenfalls worin die funktionellen Linker-Gruppen primäre oder sekundäre Amine, Hydroxy-Gruppen, Carbonsäure-Gruppen oder mit Thiol reaktive Gruppen sind, wobei die mit Thiol reaktiven Gruppen gewählt sind unter Maleimid-Gruppen und Chloracetyl-Gruppen, Bromacetyl- Gruppen und Iodacetyl-Gruppen.

5. Reagens nach Anspruch 4, worin die mehrwertige Bindungseinheit eine Vielzahl von mehrwertigen Bindungseinheiten umfaßt, die kovalent miteinander unter Bildung einer verzweigten mehrwertigen Bindungseinheit verknüpft sind.

6. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die mehrwertige Bindungseinheit ist: Bissuccinimidylmethylether, 4-(2,2-Dimethylacetyl-)benzoesaure, N-[2-(N',N;-Bis(2- succinimidoethyl-)aminoethyl-)N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl-)6,9-diazanonan amid, Tris(succinimidylethyl-)amin, Bissuccinimidohexan, 4-(O-CH&sub2;CO-Gly-Gly- Cys.amid)-acetophenon oder ein Derivat davon.

7. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das spezifisch bindende Peptid aus linearen oder cyclischen Peptiden besteht.

8. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der abgebildete Ort innerhalb des Säugerkörpers ein Ort mit einem Thrombus oder ein Ort einer Infektion ist.

9. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das spezifisch bindende Peptid chemisch in-vitro synthetisiert wird, sofern erwünscht durch Festphasen-Peptidsynthese, wobei gegebenenfalls die Radiomarkierungs-Bindungseinheit kovalent mit dem spezifisch bindenden Peptid während der chemischen in-vitro-Synthese verknüpft wird.

10. Komplex, gebildet durch Umsetzung eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit Technetium-99m in Gegenwart eines reduzierenden Mittels, gegebenenfalls von Dithionit-Ionen, Zinn(II)-Ionen oder Eisen(II)-Ionen, oder durch Markieren des Reagens mit Technetium-99m durch Ligandenaustausch eines vorreduzierten Technetium-99m-Komplexes.

11. Kit zur Herstellung einer radiopharmazeutischen Zubereitung, bestehend aus einer verschlossenen Ampulle, die eine vorbestimmte Menge eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und eine ausreichende Menge eines reduzierenden Mittels zum Markieren des Reagens mit Technetium-99m enthält.

12. Verfahren zum Markieren eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das den Schritt umfaßt, daß man das Reagens mit Technetium-99m in Gegenwart eines reduzierenden Mittels umsetzt, gegebenenfalls in Gegenwart von Dithionit-Ionen, Zinn(II)-Ionen oder Eisen(II)-Ionen.

13. Verwendung eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zum Abbilden eines Ortes innerhalb eines Säugerkörpers.

14. Reagens mit einer Formel, gewählt aus den folgenden Formeln, und gegebenenfalls radiomarkiert mit Technetium-99m:

15. Gegenstand&sub7; umfassend eine verschlossene Ampulle, die eine vorbestimmte Menge eines Reagens nach Anspruch 14 und eine ausreichende Menge eines reduzierenden Mittels zum Markieren der Zubereitung mit Technetium-99m enthält.

16. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine diagnostisch wirksame Menge eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

17. Verwendung eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Abbildungsmittel für die Scintigraphie zum Abbilden eines Ortes innerhalb des Säugerkörpers.