DE3889956T2 - Metall-Radionuklid-markierte Proteine und Glykoproteine zur Diagnose und Therapie. - Google Patents

Metall-Radionuklid-markierte Proteine und Glykoproteine zur Diagnose und Therapie.

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Description

    Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Radionuklid-markierte biologische Substanzen, die auf den Gebieten der Diagnose und Therapie nützlich sind, und betrifft insbesondere Metall-chelatierende Verbindung, in denen die Donoratome Stickstoff und Schwefel sind.
    • Beschreibung des Hintergrundes
  • Radioaktiv markierte Verbindungen sind wichtige Werkzeuge in der medizinischen Diagnose und Behandlung. Solche Verbindungen werden in einer Vielzahl von Techniken eingesetzt, einschließlich der Diagnose von tiefen Venenthromben, der Untersuchung von Lymphknotenpathologie und dem Nachweis, der Stadiumbestimmung und der Behandlung von Neoplasmen. Eine Anzahl dieser Verbindungen verwenden Metall-Radionuklide, wie etwa Technetium-99m. Wenn Radionuklide für in-vivo-Verabreichung eingesetzt werden, ist es wünschenswert, daß das Radionuklid sich in einem Zielorgan oder einer Krebsstelle lokalisiert. Daher werden Radionuklide üblicherweise so formuliert, daß sie eine bevorzugte Bindung an oder Absorption durch das bestimmte Organ oder Gewebe bereitstellen. Es besteht beträchtliches Interesse daran, in der Lage zu sein, ein Radionuklid genau zu einer vorher gewählten Stelle zu steuern, um Hintergrundstrahlung zu verringern, die auf umgebendes oder entferntes Gewebe gerichtet ist, die Dosierung zu verringern, den Hintergrund für in-vivo-Abbildung zu minimieren und unerwünschte Nebenwirkungen zu minimieren. Im Hinblick auf dieses Ziel sind Verfahren von Interesse, die spezifische Liganden oder Rezeptoren, an die das Radionuklid konjugiert werden kann, umfassen.
    • Beschreibung relevanter Literatur
  • Veröffentlichungen von Interesse schließen ein: Khaw et al., J. Nucl. Med. (1982) 23 : 1011; Rhodes, B.A., Sem. Nucl. Med. (1974) 4 : 281; Davison et al., Inorg. Chem. (1981) 20 : 1629; und Byrne und Tolman, J. Nucl. Med. (1983) 24 : 126. Siehe insbesondere Fitzberg et al., id. (1981) 22:258; und Fritzberg et al., id. (1982) 23 : 17 für Beschreibungen von Mercaptoacetylderivaten von Ethylendiamincarbonsäure-Derivaten. Siehe auch U.S.- Patent Nr. 4,444,690.
  • Die ebenfalls anhängige Anmeldung mit der Serial Nr. 624,098, eingereicht am 25. Juni 1984, offenbart Technetium-Derivate von Mercaptoacetylglycylglycylglycin für szintographische Verfahren und zur Bewertung der Nierenfunktion. Die ebenfalls anhängige Anmeldung mit der Serial Nr. 692,000, eingereicht am 14. Januar 1985, offenbart Metall-Radionuklid-markierte Proteine zur Diagnose und Therapie; darin sind die Metall-chelatierenden Verbindungen Dithiodiamidocarbonsäuren und Derivate derselben.
  • Die Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 173,424 von Fritzberg offenbart radioaktiv markierte Technetium-Chelate zur Verwendung bei Bestimmungen der Nierenfunktion. Die Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 188,256 von Fritzberg offenbart Diaminodimercapto-Chelatbildner und daraus gefundene Metall-Radionuklid-Chelate zur Markierung von Proteinen. Die Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 247,866 von Nicolotti und Dean offenbart bestimmte Verbindungen zur Verknüpfung eines Radionuklid-Metallions mit einem Protein.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Metall-Radionuklid-markierte Proteine, Kohlehydrate und Glykoproteine werden zur Diagnose und Behandlung einer Vielzahl pathologischer Zustände bereitgestellt. Spezifisch chelatisierte Radionuklidkomplexe, die an ein Protein, Kohlehydrat oder Glykoprotein konjugiert sind, werden zur Diagnose von physiologischen Zuständen eingesetzt, einschließlich Lymphknotenpathologie, tiefe Venenthromben und dem Nachweis der Stadiumbestimmung von Neoplasmen. Chelatisierte Radionuklide als Protein- und Glykoproteinkonjugate werden zur Radiotherapie' von Tumoren eingesetzt.
  • Insbesondere werden die Radionuklid-markierten Proteine, Kohlehydrate und Glykoproteine der vorliegenden Erfindung aus der Reaktion von funktionalen Gruppen wie etwa einer aktivierten Carbonsäuregruppe oder einer primären Amingruppe eines mehrzähnigen Chelats mit einer freien oder endständigen Aminogruppe auf einem Protein mit einer vorgeformten Aldehydeinheit eines Kohlehydrates bzw. Glykoproteins gebildet. Die Aldehydeinheit kann aus der Reaktion von Periodat oder einem anderen Oxidationsmittel mit einer Zuckereinheit eines Kohlehydrates oder eines Glykoproteins gebildet werden. Die von der vorliegenden Erfindung umfaßten Chelate werden im allgemeinen mehrzähnige organische Verbindungen mit einem Schwefelatom und drei Stickstoffatomen (N&sub3;S-Chelate) sein, die zur Bindung eines Metall-Radionuklids verfügbar sind, wie etwa z. B. 99mTcO³&spplus;, 99mTcO&sub2;&spplus;, ReO³&spplus; oder ReO&sub2;&spplus;. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung und der beigefügten Ansprüche wird der Ausdruck "Kohlehydrat" so verstanden, daß er Kohlehydrate (einschließlich Olfgosacchariden), den Kohlehydratteil eines Glykoproteins oder irgendeine andere Kohlehydrateinheit einschließt.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Die Fig. 1A bis 1I stellen die chemischen Strukturen von neun "N&sub3;S"-Chelatbildnern der Erfindung dar. Die Schwefelschutzgruppe (PG) sowie die Position der Proteinkonjugationsgruppe und anderer Substituenten variiert unter den dargestellten neun Verbindungen.
    • BESCHREIBUNG DER BESONDEREN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen werden bereitgestellt, die Chelatvorstufen und -derivate zum Konjugieren an Proteine, Kohlehydrate und Glykoproteine umfassen. Die resultierenden Peptid- und Kohlehydratkonjugate, wobei diese Konjugate mit Radionukliden komplexiert sind, sowie die Verwendung der Konjugate bei der Radioabbildung und Radiotherapie werden ebenfalls offenbart und diskutiert.
  • Die Metall-chelatierenden Verbindungen werden Thiotriaza-Chelatoren sein, in denen die Heteroatome, die Elektronen abgeben, um Bindungen mit dem Metallatom oder -ion zu bilden, durch zwei oder drei, vorzugsweise zwei, Kohlenstoffatome getrennt sind und der Schwefel substituiert oder unsubstituiert sein kann. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das endständige Donor-Stickstoffatom über eine Verknüpfungsgruppe, üblicherweise Alkylen, an eine Aminogruppe (primär oder sekundär) oder eine Nicht-Oxocarbonyl-Gruppe (Carboxyl oder Derivat desselben), üblicherweise eine Säure oder ein Aktivester, verbunden. Der Ester wird in der Lage sein, eine Amidbindung mit einer Aminogruppe in einem wäßrigen Medium zu bilden. Der Chelatbildner wird auch von 0 bis 3 Carbonylgruppen in der Kette besitzen, insbesondere nach links vom Stickstoffatom in der S → N-Richtung (d. h. an einer oder mehreren der mit "X" in der Formel unten bezeichneten Positionen, wodurch Amidbindungen gebildet werden). Der Chelator wird im allgemeinen insgesamt von 8 bis 26 Kohlenstoffatome besitzen, üblicherweise 8 bis 20 Kohlenstoffatome. Verschiedene Substituenten können dem Chelatbildner mehr Kohlenstoffatome hinzufügen.
  • Der Chelatbildner kann auf vielfältige Art und Weise an ein Polypeptid oder Kohlehydrat gebunden sein. Wenn der Chelator in einer Carboxylgruppe oder einem Derivat derselben endet, kann die Carboxylgruppe mit Carbodiimid und einem Alkohol aktiviert werden, um einen Aktivester zu bilden, oder kann bereits eine Aktivestergruppe enthalten, die mit einer verfügbaren Aminogruppe eines Polypeptids oder eines Aminozuckers zur Reaktion gebracht wird, um eine Amidbindung zu bilden. Alternativ kann, wenn der Chelator in einer Aminogruppe endet, die Aminogruppe verwendet werden, um mit einer Aldehydgruppe zu reagieren, die durch Glykolspaltung eines Zuckers mit Periodat gewonnen werden kann, um eine Schiffsche Base oder ein zyklisches Imin zu bilden oder, unter Bedingungen, die reduktive Aminierung begünstigen, um eine sekundäre oder tertiäre Amin- oder zyklische Iminbindung zu bilden.
  • Die Metall-chelatierende Verbindungen werden größtenteils die folgende Formel (I) haben:
  • wobei:
  • T H oder eine Schwefel-Schutzgruppe ist;
  • jedes X unabhängig H&sub2; oder O darstellt;
  • jedes R unabhängig einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff; Alkyl; geminalem Dialkyl; einer Nicht-Alkyl-Seitenkette einer anderen Aminosäure als Cystein (wobei Alkyl-Seitenketten abgedeckt sind, wenn R eine Alkylgruppe ist); und -(CH&sub2;)n-Z besteht;
  • Z -COOH, eine Konjugationsgruppe oder eine Anzielverbindung darstellt;
  • n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 4 ist; und
  • R' H&sub2;; -(CH&sub2;)n-Z; oder eine Alkylgruppe mit einer oder mehreren darauf substituierten polaren Gruppen ist;
  • wobei die Verbindung wenigstens einen -(CH&sub2;)n-Z-Substituenten umfaßt.
  • Wenn Z -NH&sub2; ist, sollte n wenigstens 2 sein. Wenn Z von -COOH verschieden ist, ist n vorzugsweise 3.
  • Die Schwefel-Schutzgruppe kann aus Alkyl-, Aryl-, Acyl- (vorzugsweise Alkanoyl- oder Benzoyl-), Thioacylgruppen mit 1 bis etwa 7 Kohlenstoffen und Organothiogruppen mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen ausgewählt sein.
  • Bei den R-Gruppen enthalten die Alkylgruppen im allgemeinen von 1 bis 7 Kohlenstoffe, vorzugsweise von 1 bis 4 Kohlenstoffe und stellen am bevorzugtesten Methyl dar.
  • Beispiele für Substituenten Z schließen ein -NH&sub2;, NHNH&sub2;, COOH, einen Carbonsäureester, einen Imidatester, eine Isothiocyanatgruppe, eine Maleimidgruppe, andere Michael-Akzeptorgruppen,
  • in denen W&sub1; ein Polypeptid aus wenigstens zwei Aminosäuren ist und W&sub2; und W&sub3; unabhängig ein Kohlehydrat darstellen, wobei der Stickstoff an ein Kohlenstoffatom des Kohlehydrats gebunden ist, sind aber nicht hierauf beschränkt. "Kohlehydrat" umfaßt reine Kohlehydrate, die vollständig aus Zuckereinheiten bestehen, sowie Glykoprotein und andere Moleküle, die Aminosäuren, Nucleinsäuren oder andere Einheiten zusätzlich zu Kohlehydrateinheiten enthalten. Üblicherweise werden W'&sub2; und W'&sub3; ein Kohlehydrat, nämlich ein Polysaccharid, oder der Kohlehydratteil eines Glykoproteins sein. Von besonderem Interesse sind die Kohlehydratteile von Immunglobulinen und Rezeptoren. Die Bindungen an das Kohlehydrat werden gebildet, wo wenigstens eine Saccharideinheit entweder eine Oxo-, z. B. Aldehydgruppe, enthält oder oxidiert worden ist, um diese bereitzustellen.
  • Die Bindung zwischen dem Kohlehydrat und dem Chelatbildner erfolgt über ein sekundäres oder tertiäres Amin, in Abhängigkeit von der Natur des Kohlehydrats und der Stöchiometrie der Reaktion zwischen dem Chelatkomplex und dem Kohlehydrat, um die Imin- oder Aminbindung zu bilden.
  • Typischerweise wird W¹' ein Oligopeptid aus wenigstens zwei Aminosäuren oder ein Polypeptid mit einer relativen Molekülmasse von wenigstens 1000, üblicherweise einer relativen Molekülmasse von etwa 2000, im allgemeinen weniger als etwa 1,6 MDal, häufiger weniger als etwa 800 kDal, sein. Von besonderem Interesse sind Rezeptoren, z. B. Immunglobuline, entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper oder spezifische Bindungsfragmente derselben oder andere natürlich auftretende Rezeptoren, z. B. T-Zellrezeptoren. Enzyme, Hormone und andere Verbindungen, die spezifische Bindung an Substrate oder Zellen zeigen, sind ebenfalls von Interesse.
  • T stellt Wasserstoff oder eine Schwefel-Schutzgruppe dar. Jede geeignete Schwefel-Schutzgruppe kann verwendet werden, einschließlich bekannte Alkyl-, Aryl-, Acyl- (vorzugsweise AIkanoyl- oder Benzoyl-) oder Thioacylgruppen mit 1 bis etwa 7 Kohlenstoffen; oder einer Organothiogruppe mit von 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Schwefel- Schutzgruppe, wenn sie mit den zu schützenden Schwefelatomen zusammengenommen wird, eine Hemithioacetalgruppe. Geeignete Hemithioacetale schließen diejenigen mit den folgenden Formeln ein, sind aber nicht hierauf beschränkt, in denen das-Schwefelatom das Schwefelatom des Chelatbildners ist:
  • -S-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2; -S-CH&sub2;-O- (CH&sub2;) &sub2;-OCH&sub3; -SCH&sub2;OCH&sub3;
  • Bevorzugte Hemithioacetale haben im allgemeinen die folgende Formel, wobei das Schwefelatom das Schwefelatom des Chelatbildners ist:
  • wobei R³ eine Niederalkylgruppe ist, vorzugsweise mit von 2 bis Kohlenstoffatomen, und R&sup4; eine Niederalkylgruppe ist, vorzugsweise mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Alternativ können R³ und R&sup4; mit dem Kohlenstoffatom und dem Sauerstoffatom, die in der Formel dargestellt sind, zusammengenommen werden, um einen nicht-aromatischen Ring zu definieren, der vorzugsweise von 3 bis 7 Kohlenstoffatome zusätzlich zu den in der Formel dargestellten Kohlenstoff- und Sauerstoffatomen umfaßt. R&sup5; repräsentiert Wasserstoff oder eine Niederalkylgruppe, wobei die Alkylgruppe vorzugsweise von 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist. Beispiele für solche bevorzugten Hemithioacetale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf:
  • Tetrahydrofuranyl Methocymethal 2-Methyltetrahydrofuranyl
  • Tetrahydropyranyl Ethoxyethyl 2-Methyl-tetrahydrofuranyl
  • Vorteile der Verwendung von Hemithioacetal-Schwefel-Schutzgruppen schließen die Tatsache ein, daß ein separater Schritt zur Entfernung der Schwefel-Schutzgruppen nicht notwendig ist. Die Schutzgruppen werden aus der Verbindung während der radioaktiven Markierung in einer, wie man glaubt, metall-unterstützten Säurespaltung verdrängt; d. h. die Schutzgruppen werden in der Gegenwart des Metall-Radioisotops bei einem sauren pH verdrängt und das Radioisotop wird an den Chelatbildner gebunden. Das Verfahren der radioaktiven Markierung ist somit vereinfacht, was besonders vorteilhaft ist, wenn die Chelatbildner in einem Krankenhauslaboratorium kurz vor Gebrauch radioaktiv markiert werden sollen. Zusätzlich werden die basischen pH-Bedingungen und die scharfen Bedingungen, die mit bestimmten bekannten Verfahren zur radioaktiven Markierung oder Verfahren zur Entfernung anderer Schwefel-Schutzgruppen zusammenhängen, vermieden. So überleben basenempfindliche Gruppen auf dem Chelatbildner den Schritt der radioaktiven Markierung unversehrt. Solche basenlabilen Gruppen schließen jede Gruppe ein, die durch Einwirkung von basischem pH zerstört, hydrolysiert oder in anderer Weise nachteilig beeinflußt werden kann. Bestimmte Proteinkonjugationsgruppen, einschließlich u. a. Ester, Isothiocyanate, Maleimide und andere Michael-Akzeptoren, sind relativ basenlabil. So kann ein radioaktiv markiertes Chelat hergestellt werden und die Proteinkonjugationsgruppe bleibt für anschließende Bindung des Chelats an eine Anzielverbindung (z. B. einen Antikörper) intakt.
  • Alternativ kann eine Acetamidomethyl-Schwefel-Schutzgruppe verwendet werden. Diese Gruppe wird repräsentiert durch die Formel:
  • Die Acetamidomethylgruppe wird aus dem Chelatbildner während radioaktiver Markierung verdrängt, die bei etwa 50ºC in-einer Reaktionsmischung mit einem pH von etwa 3 bis 6 durchgeführt wird. Die Verwendung einer Acetamidomethylgruppe verbessert im allgemeinen die Wasserlöslichkeit des Chelatbildners, was wünschenswert ist, wenn die Verbindung vor der radioaktiven Markierung an ein Protein oder eine andere biologische Anzieleinheit gebunden werden soll. Wäßrige Reaktionsmischungen sind für Proteinkonjugationsreaktionen bevorzugt, da organische Lösungsmittel das Protein denaturieren oder in anderer Weise schädigen können.
  • Eine Vielzahl anderer Schwefel-Schutzgruppen kann verwendet werden, von denen einige in Beispiel X unten beschrieben sind.
  • Der bevorzugte Chelatbildner gemäß der Erfindung wird im allgemeinen die folgende Formel (II) haben:
  • wobei:
  • M ein Radionuklid-Ion ist, an das 1 oder 2 Sauerstoffatome gebunden sein können, insbesondere wenn das Metall Tc oder Re ist;
  • und die anderen Symbole so sind, wie für die Verbindung von Formel (I) oben beschrieben.
  • Eine Vielzahl von Metall-Ionen oder Komplex-Ionen können als das Radionuklid eingesetzt werden. Diese Metalle schliefen ein, sind aber nicht beschränkt auf Kupfer, z. B. &sup6;&sup4;Cu und &sup6;¹Cu; Technetium, z. B. 99mTc; Rhenium, z. B. ¹&sup8;&sup6;Re und ¹&sup8;&sup8;Re; Blei, z. B. ²&sup0;³Pb und ²¹²Pb; Palladium, z. B. ¹&sup0;&sup9;Pd; Bismut, z. B. ²¹²Bi, und Gold, z. B. ¹&sup9;&sup8;Au. Das Metall kann als ein Ion vorliegen, z. B. &sup6;&sup4;Cu²&spplus; und &sup6;&sup7;Cu²&spplus; (Kupfer kann in S-haltigen Liganden als Cu&spplus; enden) oder als eine oxidierte Form, z. B. 99mTcO³&spplus;, ¹&sup8;&sup6; oder ¹&sup8;&sup8;ReO³&spplus;, werden in die Chelatbildner eingebaut.
  • Die gestrichelten Linien in der Formel, die für die Chelatbildner der Erfindung angegeben sind, repräsentieren vier koordinative kovalente Bindungen zwischen dem Metall-Radionuklid M und dem Schwefel- und den zwei Stickstoffatomen, die in der Formel dargestellt sind.
  • So ist das Metall-Radionuklid über relativ stabile Bindungen in den Chelatbildnern der Erfindung gebunden.
  • Die Polypeptid- und Kohlehydratverbindungen, die an den Chelator gebunden sind, können in weitem Umfang variiert werden, in Abhängigkeit von der Natur der Verwendung des an den Chelator gebundenen Radionuklids. Das Kohlehydrat kann eine Kohlehydratverbindung, wie etwa ein Polysaccharid, ein Glykoprotein oder andere Verbindungen, die eine Kohlehydrateinheit umfassen, wie oben beschrieben, sein.
  • Die Polypeptide können z. B. Liganden oder Rezeptoren sein. Liganden können eine solche Vielzahl von Verbindungen, wie Polypeptide, Hormone, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, Peptid- oder Kohlehydratsubstrate sein, insbesondere Verbindungen, die sich an Oberflächenmembran-Rezeptoren binden, wo der Komplex an die Oberfläche gebunden verbleiben kann oder endozytosiert wird. Unter Rezeptoren sind Oberflächenmembranrezeptoren, Antikörper, Enzyme, natürlich auftretende Rezeptoren, Lectine und dergleichen. Von besonderem Interesse sind immunglobulinähnliche Verbindungen oder Bindungsfragmente derselben, z. B. Fab-, F(ab')&sub2;- und Fv-Fragmente von Antikörpern und T-Zellrezeptoren.
  • So werden die Chelatbildner der vorliegenden Erfindung an eine Anzielverbindung gebunden (üblicherweise eines der oben identifizierten Polypeptide oder Kohlehydrate), die dazu dient, das Radionuklidchelat einer gewünschten Zielstelle in einem Säugetier- oder Menschenwirt zuzuführen. Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "Polypeptid" Polypeptide, Proteine oder Fragmente derselben ein. Diese Proteine und Polypeptide können so lange modifiziert werden, wie die biologische Aktivität, die für die beabsichtigte diagnostische oder therapeutische Anwendung des radioaktiv markierten Polypeptids notwendig ist, erhalten bleibt. Zum Beispiel kann ein modifizierter Antikörper oder ein Fragment desselben so lange verwendet werden, wie immer noch Bindung an das gewünschte Antigen auftritt. Modifizierte Proteine können unter Verwendung solcher Techniken wie Gentechnologie oder Proteintechnologie hergestellt werden.
  • Die Anzielverbindung bindet sich in vivo an eine gewünschte Zielstelle, wodurch das diagnostische oder therapeutische Radionuklid der Zielstelle zugeführt wird. Ein Beispiel einer Zielstelle ist eine Krebsstelle. Viele Antigene, die mit verschiedenen Typen von Krebszellen zusammenhängen, sind identifiziert worden und monoklonale Antikörper, die für eine Anzahl dieser mit Krebszellen zusammenhängenden Antigene spezifisch sind, sind ebenfalls bekannt. Solche Antikörper sind Beispiele für die vielen zur Verwendung als Anzielverbindungen geeigneten Polypeptide. Unter den monoklonalen Antikörpern, die sich an Krebszellen binden, sind anti-TAC oder andere Interleukin- 2-Rezeptor-Antikörper; 9.2.27 und NR-M1-05 zu dem 250 Kilodalton großen, mit menschlichem Melanom zusammenhängenden Proteoglykan; NR-Lu-10 zu dem 37-40 Kilodalton großen Pankarzinom- Glykoprotein; und OVB&sub3; zu einem mit einem noch nicht identifizierten Tumor zusammenhängenden Antigen.
  • Der Chelatbildner kann radioaktiv markiert sein, um das entsprechende Radionuklid-Metallchelat zu bilden, und das Chelat wird anschließend an die Anzieleinheit im dem "Verfahren des vorgebildeten Chelats" gebunden. Ein alternatives Verfahren, radioaktiv markierte Anzieleinheiten herzustellen, ist das "Verfahren des nachgebildeten Chelats", bei dem der Chelatbildner zunächst an das Protein- oder Kohlehydrat-Anzielmolekül gebunden wird. Das resultierende Konjugat wird dann mit einem Radionuklid-Metall zur Reaktion gebracht, um ein Radionuklid-Metallchelat zu bilden, das an das Anzielmolekül gebunden ist.
  • Die Konjugationsgruppe "Z" ist eine funktionale Gruppe, die mit einer Gruppe auf einer gewünschten Anzielverbindung reagieren wird, um das Chelat oder den Chelatbildner daran zu binden. Die Konjugationsgruppe, die zur Verwendung ausgewählt wird, wird entsprechend der Natur der Anzielverbindung variieren (z. B. ob die Anzielverbindung ein Protein oder ein Kohlehydrat ist).
  • Proteine enthalten eine Vielzahl von funktionalen Gruppen; z. B. Carbonsäure(COOH)- oder freie Amin(-NH&sub2;)-Gruppen, die zur Reaktion mit einer geeigneten funktionalen Gruppe "Z" auf einem Chelator zur Verfügung stehen, um den Chelator an das Protein zu binden. Zum Beispiel reagiert ein Aktivester auf dem Chelator mit freien Amingruppen auf Lysinresten von Proteinen, um Amidbindungen zu bilden. Alternativ kann das Protein und/oder der Chelator derivatisiert werden, um zusätzliche reaktive funktionale Gruppen freizulegen oder anzuhängen. Die Derivatisierung kann das Anhängen von irgendeinem aus einer Anzahl von Verknüpfungsmolekülen umfassen, wie etwa denjenigen, die von Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois erhältlich sind. (Siehe Pierce 1986-87 General Catalog, S. 313-354.) Alternativ kann die Derivatisierung chemische Behandlung des Proteins (das ein Antikörper sein kann) umfassen. Verfahren zur Erzeugung von freien Sulfhydrylgruppen auf Antikörpern oder Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt. (Siehe U.S.-Patent Nr. 4, 659, 839.) Maleimid-Konjugationsgruppen auf einem Chelator sind mit den Sulfhydryl(Thiol)-Gruppen reaktiv.
  • Alternativ kann Derivatisierung, wenn die Anzielverbindung ein Kohlehydrat ist, chemische Behandlung des Kohlehydrates umfassen, z. B. Glykolspaltung der Zuckereinheit eines Glykoproteinantikörpers mit Periodat, um freie Aldehydgruppen zu erzeugen. Die freien Aldehydgruppen auf dem Antikörper können mit freien Amin- oder Hydrazin-Konjugationsgruppen auf dem Chelator reagieren, um den Chelator daran zu binden. (Siehe U.S.-Patent Nr. 4,671,958.)
  • Unter den bevorzugten Konjugationsgruppen zur Reaktion mit Polypeptid-Anzielverbindungen befinden sich Ester. Die Ester, die als Konjugationsgruppen verwendet werden können, repräsentiert durch "Z", sind diejenigen Ester, die eine kovalente Amidbindung mit einem Polypeptid in einem wäßrigen Medium liefern. Der eine oder andere der reaktiven Ester kann bevorzugt sein, in Abhängigkeit von dem bestimmten Radionuklid, dem Protein und den Bedingungen für die Konjugation, wie dies auf dem Gebiet der Peptidchemie verstanden wird. Übliche Ester, die Verwendung finden, sind o- und p-Nitrophenyl, 2-Chlor-4-nitrophenyl, Cyanomethyl, 2-Mercaptopyridyl, Hydroxybenztriazol, N- Hydroxysuccinimid, Trichlorphenyl, Tetrafluorphenyl, Thiophenyl, Tetrafluorthiophenyl, o-Nitro-p-sulfophenyl, N-Hydroxyphthalimid und dergleichen. Größtenteils werden die Ester durch die Reaktion der Carboxylate mit einem aktivierten Phenol, insbesondere Nitro-aktivierten Phenolen, oder einer zyklischen Verbindung auf der Basis von Hydroxylamin gebildet werden. Wenn andere Hydroxylverbindungen zugänglich werden, können diese in dieser Erfindung auch Verwendung finden. Imidatester, wie etwa Methylimidat, können verwendet werden, um Amidinbindungen zu ergeben.
  • Die Chelatoren werden aus Peptiden, wie etwa Glycylglycylglycin und S-geschützten Aktivestern von Essigsäure synthetisiert. Zum Beispiel N-Hydroxysuccinimid-S-benzoylthioacetylgylcylglycylglycin (S-benzoyl-MAG&sub3;). Aminosäuren, die verschiedene Seitenketten umfassen, können in der Synthese der Verbindungen der Erfindung eingesetzt werden.
  • In Abhängigkeit von dem bestimmten Metall werden verschiedene Bedingungen und Techniken zur Herstellung des Metallchelats eingesetzt werden. Um das Technetiumchelat herzustellen, wird der Chelatbildner als ein Carboxylat, aktivierter Ester oder Amin mit einer Pertechnetat-Lösung in der Gegenwart eines Reduktionsmittels, z. B. Zinn(II)-Ion oder Dithionit, unter herkömmlichen Bedingungen kombiniert, wodurch das Technetiumchelat als ein stabiles Salz gebildet wird. Das Rheniumchelat kann auf verschiedenen Wegen gebildet werden. Zum Beispiel durch Reduzieren von Perrhenat zu Rhenium(IV)-hexachlorid unter Verwendung von Hypophosphorigsäure und konzentrierter HCl bei 95ºC wird Rheniumhexachlorid gebildet. Das Rheniumhexachlorid wird dann in das Rheniumdioxodiethylendiaminchlorid in 90% Ethylendiamin bei Raumtemperatur überführt. Bei einem basischen pH in der Gegenwart der betroffenen Chelatbildner tauscht das Rheniumdioxodiethylendiaminchlorid schnell mit dem N&sub3;S-Chelat.
  • Zur Verwendung bei der Markierung großer Peptide und Proteine ist die Bildung eines Metallkomplexes mit einer eingeschlossenen Konjugationsgruppe vorzuziehen. Dieses Verfahren der Vorbildung ermöglicht, daß der Austausch des Metall-Ions zwischen dem anorganischen Komplex, in dem das Metall-Ion anfänglich zu finden ist, und dem Chelat unter kontrollierten Bedingungen eintritt. Der Austausch von radioaktivem Metall aus einem labilen anorganischen Komplex zu einem bereits an einen Antikörper konjugierten Chelator (das Verfahren der Nachbildung) führt zu variablen Mengen nicht-spezifisch gebundener Radioaktivität, bewirkt durch Elektronendonorgruppen (Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatome) auf dem Antikörper oder dem anderen großen Protein.
  • Für das Verfahren des vorgebildeten Chelats können die chelatisierten Carbonsäuren als ein Ester oder verestert gemäß herkömmlichen Mitteln vorliegen. Mit dem Ester kann ein labiler Komplex, wie etwa ein Tc-99m-Gluconat, hergestellt und verwendet werden, um mit dem aktivierten N&sub3;S-Ester zu tauschen, wodurch ein für Proteinkonjugation geeigneter Radionuklidkomplex gebildet wird. Alternativ kann die Carbonsäure durch Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids, z. B. EDCI, in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart wenigstens einer stöchiometrischen Menge, vorzugsweise eines Überschusses der veresternden Hydroxylverbindung aktiviert werden. Ein geeignetes gepuffertes wäßriges Medium kann eingesetzt werden. Alles nichtumgesetzte Carbodiimid kann durch Zugabe von Acetat in Harnstoff überführt werden. Das wäßrige Medium kann dann direkt ohne weitere Reinigung zur Konjugation des Polypeptids verwendet werden. Vorzugsweise wird Polypeptid (z. B. Protein) zum esterhaltigen wäßrigen Medium in einer geeigneten Konzentration bei einem schwach alkalischen pH, im allgemeinen größer als etwa 7,5 und niedriger als etwa 10,5, zugegeben, und man läßt die Reaktion für eine ausreichende Zeit fortschreiten, damit der gesamte Aktivester entweder mit dem Polypeptid reagiert oder im wesentlichen vollständig hydrolysiert wird. Üblicherweise wird die Zeit kürzer sein als etwa 6 Std. und länger als etwa 1 min, wobei die Temperaturen im Bereich von etwa 0 bis 50ºC liegen, üblicherweise etwa 40ºC nicht übersteigen. Die besonderen Bedingungen werden entsprechend dem besonderen aktivierten Ester, dem pH, der Aktivität des Polypeptids und dergleichen ausgewählt werden.
  • Der Kohlehydratteil von Glykoproteinen kann mit Periodat oxidiert werden, um Aldehydgruppen zu ergeben, die zur Konjugation verwendet werden können. Das Protein wird in Acetat bei pH 5,5 gepuffert und mit Natriumperiodat für etwa 1 min bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Nach Quenchen mit Glycerin wird das Protein durch Durchgang durch eine Gelfiltrationssäule gereinigt.
  • Das Amin kann mit dem Dialdehyd in der Gegenwart schwacher Säure vorzugsweise in einem wäßrigen Medium mit Natriumcyanoborhydrid kondensiert werden, um für reduktive Aminierung zu sorgen.
  • Für manche Anwendungen kann es geeigneter sein, den Chelatbildner (N&sub3;S) an das Polypeptid oder Kohlehydrat in der Abwesenheit des Metall-Ions zu konjugieren. Da einige der von der vorliegenden Erfindung betrachteten Radionuklide (z. B. 99mTc) relativ kurze Halbwertszeiten haben, kann es z. B. wünschenswert sein, die Chelatbildner-konjugierte Polypeptid- oder Kohlehydrateinheit herzustellen und dann, kurz vor Anwendung, die Chelatbildner-konjugierte Polypeptid- oder Kohlehydrateinheit mit dem interessierenden Radionuklid zur Reaktion zu bringen. Zum Beispiel würde die Carbonsäuregruppe an das Polypeptid gebunden werden, um eine Amidbindung zu bilden, gefolgt von der Zugabe des Metalls, in einer schwach komplexierten Form. Alternativ könnten die N&sub3;S-Chelatbildner, für Chelatbildner mit einer freien primären Amingruppe, an eine Kohlehydrateinheit gebunden werden, wie oben diskutiert, indem das primäre Amin an die Kohlehydrateinheit im Anschluß an die Periodatbehandlung der Kohlehydrateinheit unter milden reduzierenden Bedingungen gebunden wird, um eine sekundäre oder tertiäre Aminbindung zu bilden; diesem Verfahren würde dann die geeignete Reaktion mit dem Radionuklid folgen, um die gewünschte radioaktiv markierte Kohlehydrateinheit zu bilden.
  • Anfänglich könnte das Metall-Ion, wie zuvor erwähnt, sich sowohl nicht-spezifisch als auch spezifisch an das Polypeptid oder Kohlehydrat binden. Das N&sub3;S-Ligandenzentrum sollte jedoch Chelate höherer Stabilität bilden als die nicht-spezifischen Stellen und die Metall-Ionen würden unter Gleichgewichtsbedingungen zur N&sub3;S-Chelatierungsgruppe wandern. Diese nicht an die N&sub3;S-Chelatierungsgruppe gebundene Metall-Ionen könnten unter milden Bedingungen mit einem Chelatbildner, z. B. EDTA, oder einem nicht-ionischen Detergens ausgewaschen werden. Geeigneterweise könnte das Metall-Ion als ein schwach chelatisiertes Ion oder in der Gegenwart einer schwach chelatisierenden Gruppe, wie etwa einem Uronat, z. B. Gluconat, oder Tartrat, zugegeben werden.
  • Die betroffenen Chelate werden dem Säugetierwirt, normalerweise durch Injektion, intravenös, interarteriell, peritoneal, intratumoral oder dergleichen verabreicht, in Abhängigkeit von der bestimmten Stelle, an der das Radionuklid gewünscht ist. Im allgemeinen werden von etwa 0,1 bis 2 ml in einen Wirt injiziert werden, in Abhängigkeit von der Größe des Wirtes, mit ungefähr 0,001 bis 50 uCi/kg des Wirtes. Für menschliche Wirte wird die Dosierung üblicherweise bei etwa 10-50 mCi/70 kg Wirt, üblicherweise etwa 25-35 mCi/70 kg Wirt liegen. Für niedere Säugetiere, z. B. Mäuse, werden 1-50 uCi für Bioverteilungsstudien verwendet werden, während bis zu oder mehr als 500 uCi für Abbildungsstudien verwendet werden. Abhängig von seinem Zweck kann nach Verabreichung des Radionuklids der Wirt mit verschiedenen Arten für den Nachweis oder die Therapie durch Nachweis der radioaktiven Emissionen aus der Stelle oder den Stellen, an denen sich das Radionuklid spezifisch bindet, behandelt werden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeboten.
    • Vergleichsbeispiel I Synthese von S-geschütztem Mercapto-acetylglycylglycylglycin (RMAG&sub3;) RSCH&sub2;COOSucc + H-Gly-Gly-Gly-OH → RMAG&sub3;
  • Zu einer Lösung von Glycylglycylglycin in Acetonitril-Wasser (80 : 20), die Triethylamin enthält (10 ml Lösungsmittel und 3 Äquivalente NEt&sub3; pro mmol Gly-Gly-Gly-OH), wurde S-geschützter Thioglykolsäuresuccinimidatester (1 Äquivalent) auf einmal zugegeben. Die Lösung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Lösungsmittel wurden im Vakuum abgezogen und der Rückstand wurde in 5-10 ml Wasser gelöst und in Salzsäure (pH = 3-4) angesäuert. Das Produkt kristallisierte im Falle von (a) und (b) beim Stehenlassen aus.
  • Im Fall (c) wurde kein Niederschlag erhalten. Die wäßrige Lösung wurde zur Trockne eingedampft und das Produkt wurde durch Silicagel-Flash-Chromatographie unter Verwendung von CH&sub3;CN:H&sub2;O (95 : 5) als dem Elutionsmittel isoliert.
  • Die Reaktion wurde unter Verwendung verschiedener Schutzgruppen fünfmal durchgeführt.
    • Beispiel II Darstellung von S-Benzoyl-MAG&sub3;-tetrafluorphenylester
  • Zu einer Suspension von 1,1 g (3 mmol) S-Benzoyl-MAG&sub3; in 150 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurden 0,5 g (3 mmol) 2,3,5,6- Tetrafluorphenol und 0,68 g (3,3 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und für 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
  • Ungefähr 100 ml des Lösungsmittels wurden unter verringertem Druck abgezogen und der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wurde filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde in 50 ml warmem Acetonitril gelöst und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der kristallisierte Feststoff (hauptsächlich Dicyclohexylharnstoff zusammen mit etwas Produkt) wurde filtriert und das Filtrat wurde auf etwa 30 ml konzentriert und in einem Eisbad abgekühlt. Der kristallisierte Feststoff (etwas mehr Dicyclohexylharnstoff wurde filtriert).
  • Das Filtrat wurde auf 5 ml eingedampft und das Produkt wurde durch Zugabe von wasserfreiem Ether ausgefällt, um 0,21 g des Produktes zu ergeben, Sdp: 172-4ºC.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 3,72-3,98 (m und s, 6, gly CH&sub2;X2, S-CH&sub2;), 4,36 (d, 2, gly CH&sub2;), 7,62-8,8 (m,9, 3XNH, C&sub6;H&sub5;, p-CH(TFP).
    • Beispiel IIIa Synthese von S-Benzoyl-MAG&sub3;-tetrafluorphenyl-Aktivester øCOSCH&sub2;-CO-Gly-Gly-Gly-OH + 2,3,5,6-TFP-OH → @COSCH&sub2;COglygly-gly-o-2,3,5,6-TFP
  • Zu einer Lösung des MAG&sub3;-Derivats in wasserfreiem THF (20 ml/mmol) wurden äquimolare Mengen Tetrafluorphenol und Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf etwa 1/3 des ursprünglichen Volumens eingedampft. Der ausgefällte Feststoff wurde entfernt und das Filtrat wurde eingedampft, um den Aktivester (Ra, Rb) in 55-60% Ausbeute zu erhalten.
  • Entfernung von tert.-Butylgruppen (im Falle von Rb) wurde erreicht, indem das obige Produkt in wasserfreier Trifluoressigsäure (5 ml TFA/1 mmol) gerührt wurde. Die Säure wurde im Vakuum abgezogen. Zugabe von kaltem Wasser (5-10 ml) ergab das Produkt, das filtriert und unter Vakuum getrocknet wurde.
  • Im Falle von Rc wurde die Reaktion in einer Mischung von CH&sub3;CN: H&sub2;O (4 : 1; 20 ml/mmol) durchgeführt. Zu einer Lösung von Rc (mmol) in CH&sub3;CN: H&sub2;O wurden 3 mmol 2',3',5',6'-Tetrafluorphenol und 3 mmol 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid zugegeben und für 8 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft, um ein Öl zu ergeben. Verreiben mit Ether ergab den Tetrafluorphenylester. Der N-Hydroxysuccinimidester von Rc wird in einer ähnlichen Reaktion hergestellt.
    • Beispiel IIIb THP-S-CH&sub2;COGly-Gly-Gly-OSuCC. → THP-S-CH&sub2;-CO-Gly-Gly-Gly-CONHNH&sub2;
  • Zu einer Lösung des obigen Succinimidatesters in THF (5 ml/mmol) werden 0,2 ml Hydrazin zugegeben und für 3-4 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Produkt wird durch Silicagel-Chromatographie isoliert. THP zeigt eine Tetrahydropyranyl-S-Schutzgruppe.
  • In einem ähnlichen Satz von Reaktionen werden andere MAG&sub3;-Derivate, in denen Schwefel als Hemithioacetale geschützt ist, hergestellt (Rd, Rc). Beispiel IIIc
  • (i) Zu einer Lösung von tBoc-Gly-Gly-Gly-NH&sub2; in (25 ml/mmol) THF werden 9 ml BH&sub3; THF zugegeben und die Lösung wird über Nacht unter Rückfluß gekocht (12-15 Stunden). 2 ml Ethanol werden zugegeben und die Lösung wird zur Trockne eingedampft. Dieses Verfahren wird noch dreimal wiederholt und das resultierende Öl wird getrocknet, um eine Pulver zu ergeben.
  • (ii) Zu einer Lösung des geschützten Amins in wasserfreiem THF (5 ml/mmol) wird eine äquimolare Menge S-Benzoylthioglykolsäuresuccinimidatester zugegeben. Die Lösung wird für 3-4 Stunden gerührt. TLC zeigt eine Hauptkomponente zusammen mit geringen Verunreinigungen. Die Hauptkomponente wird durch Silicagel- Säulenchromatographie gereinigt (EtoAc: CH&sub3;OH: NEt&sub3;).
  • (iii) Ein mmol der obigen geschützten Verbindung wird mit 5 ml wasserfreier Trifluoressigsäure gerührt. Nach 2-3 Stunden Rühren wird die Trifluoressigsäure abgedampft. Das ölige Produkt wird in Ethanol gelöst und zur Trockne eingedampft. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt. Ethanol, der 5-6 Äquivalente gelösten Chlorwasserstoff enthält, wurde zugegeben und zur Trockne eingedampft, um das Produkt als ein viskoses Öl zu ergeben, das bei Zugabe von Ether fest wird.
    • Beispiel IV Darstellung von Tc-99m-MAG&sub3;-IgG-Antikörper
  • In 0,10 ml 1,0 M Carbonatpuffer pH 12,0 wurden 25 ug S-Benzoylmercaptoglycylglycylglycin gelöst. Dann wurden 75 mCi Tc-99m-Pertechnetat in etwa 1,0 ml zugegeben, gefolgt von 1,0 mg frisch gelöstem Natriumdithionit (10 mg/ml). Die Mischung wurde bei 100ºC ± 4ºC für 3 min erhitzt, dann in einem Eisbad für 5 min abgekühlt, um 90-95% Tc-99m-MAG&sub3; zu ergeben, wie bestimmt durch ITLC (CH&sub3;CN-Lösungsmittel: 95% am Anfang; 10% Ammoniumacetat: CN&sub3;OH (1 : 1): 99% Lösungsmittelfront); Anionenaustausch-HPLC (Beckman AX, 10 Micron, 0,01 M Na&sub2;SO&sub4;/0,01 M Na&sub3;PO&sub4;, pH 7,0) Retentionsvolumen 5,4 ml; Umkehrphasen-HPLC (Beckman ODS, 5 Micron 2% CH&sub3;CN/0,01 M Na&sub3;PO&sub4; pH 7,0) Retentionsvolumen 7,6 ml).
  • Der Tc-99m-Komplex in Carboxylatform wurde dann verestert:
  • 0,20 ml 1 N HCl, 0,30 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0, 10,0 mg 2,3,5,6-Tetrafluorphenol (TFP) in 0,10 ml 90% CH&sub3;CN, 12,5 mg EDC in 0,10 ml 90% CH&sub3;CN, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur (20ºC ± 2ºC) für 1 Std. gemischt. An diesem Punkt waren 60-75% der Radioaktivität Tc-99m-MAG&sub3;-TFP-Ester, wie bestimmt durch ITLC (CH&sub3;CN-Lösungsmittel: 60-75% an Lösungsmittelfront); Anionenaustausch-HPLC (Beckman Ax, 10 Micron 0,01 M Na&sub2;SO&sub4;/0,01 M Na&sub3;PO&sub4; pH 7,0) Retentionsvolumen 3,0 ml; Umkehrphasen-HPLC (Beckman ODS, 5 Micron 34% CH&sub3;CN/0,01 M Na&sub3;PO&sub4; pH 7,0) Retentionsvolumen 6,2 ml. Das Präparat wurde unter Verwendung einer C&sub1;&sub8;-Baker-Säule gereinigt. Die Reaktionsmischung wurde in die Säule geladen, zweimal mit Wasser und dann achtmal mit 2,0 ml 10% C&sub2;H&sub5;OH/0,01 M Na&sub3;PO&sub4; pH 7,0 gewaschen. Das Produkt wurde mit CH&sub3;CN eluiert. Die radiochemischen Ausbeuten sind 50-60% in Tc-99m-MAG&sub3;-TFP. Das CH&sub3;CN wurde entfernt und das Tc-99m-MAG&sub3;-TFP war fertig für die Konjugation.
  • Die Konjugation des komplexen Aktivesters wurde durchgeführt, indem eine 1,2 mg/ml-Lösung von anti-Melanom-IgG in 0,2 M Phosphatpuffer pH 9,5 zum Rückstand, der die Tc-99m-Aktivität enthielt, zugegeben wurde. Nach 30 min waren 40-50% der Radioaktivität an den Antikörper gebunden. Durchgang durch eine PD-10-Gelfiltrationssäule ergab 97% reinen Tc-99m-MAG&sub3;-Antikörper.
    • Beispiel V Darstellung von Aktivester von MAGGG (Succinimidylbenzoylinercaptoacetylglycylglycylglycin)
  • In einen 50 ml-Rundkolben werden 0,37 g (1 mmol) Benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycin und 0,126 g (1,1 mmol) N-Hydroxysuccinimid in ungefähr 25 ml Tetrahydrofuran gelöst und in einem Eisbad auf 5-10ºC abgekühlt. Zu dieser Lösung werden 0,23 g (1,1 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Lösung läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und wird für 48 Stunden gerührt und der Verlauf der Reaktion mit TLC verfolgt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt; die filtrierte Lösung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird erneut in 50-60 ml Dichlormethan gelöst. Diese Lösung wird filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird erneut in 5-6 ml Ethanol unter Aufwärmen gelöst und 3-4 Stunden auskristallisieren gelassen. Die Kristalle des Produktes Succinimidyl-MAGGG werden durch Filtration gewonnen.
    • Beispiel VI Darstellung von Antikörper-Chelatbildner-Konjugat
  • Eine Vorratslösung von Tetrafluorphenyl-MAGGG wird hergestellt, indem 4,25 mg in 5,0 ml DMF gelöst werden. 0,060 ml dieser Lösung wurden zu 0,54 ml einer 5,5 mg/ml-Lösung von monoklonalem Antikörper in 0,10 M Phosphat, 0,15 M NaCl bei pH 7,0 zugegeben. Das Angebotsverhältnis von Ligand zu Antikörper betrug 50 : 1. Nach Rühren für 3 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung durch Durchgang durch eine PD-10- Gelfiltrationssäule gereinigt.
  • Die gesamte Reaktionsmischung wird auf Sephadex G-25 gereinigt, das zuvor mit PBS äquilibriert worden ist (1,5 cm · 5,0 cm Kunststoffsäule, eluiert mit PBS). 1,2 ml-Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen mit einer Extinktion (280 nm) von mehr als 0,1 werden kombiniert. Die kombinierten Fraktionen werden in einem Amicon-Filter mit einer Amicon-PM10-Membran bei 4 psi auf ein Endvolumen von 0,5 bis 1,0 ml konzentriert.
  • Die Menge von an den Antikörper gebundenem Chelatbildner wird geeigneterweise dadurch bestimmt, daß die Benzoylgruppe vom Liganden mit 0,1 N NaOH entfernt wird und die resultierenden freien Sulfhydrylgruppen mit Ellman-Reagenz zur Reaktion gebracht werden.
    • Beispiel VII Analyse der Chelatbildner-Konjugation an monoklonalen Antikörper
  • Proben von Chelatbildner-konjugiertem monoklonalen Antikörper (Beispiel VI) werden hergestellt, indem bis zu 400 ul in einem Reagenzglas aufgefüllt und das Volumen mit sauerstofffreiem Wasser eingestellt wird, falls erforderlich. Falls erforderlich können die Proben, wie hergestellt gemäß Beispiel VI, mit sauerstoffreiem Wasser verdünnt werden. Phosphatpuffer (500 ul; 0,1 M Natriumphosphat, 1 mM EDT, pH 7,27) und 100 u 0,5 M Hydroxylamin-Hydrochlorid (HA: hergestellt mit sauerstofffreiem Wasser) werden zu den Reagenzgläsern zugegeben, die man dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubieren läßt. Zwanzig (20) ul einer Lösung von 5 ul Puffer und 9 ul Ellman-Reagenz (DTNB; 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)) werden zugegeben; nach 5 Minuten wird die Extinktion der Reaktionsmischung bei 413 nm bestimmt.
  • Die Menge von an monoklonalen Antikörper konjugiertem Chelatbildner kann auf eine von zwei Arten bestimmt werden. Eine Blindprobe, hergestellt wie oben unter Weglassen des Chelatbildner-konjugierten Antikörpers, kann hergestellt und bei 412 nm analysiert werden. Der veröffentlichte Extinktionskoeffizient (Riddles. et al., 94 Anal. Biochem. 75 (1979)) kann verwendet werden, um die Konzentration von freiem Thiol mit der folgenden Formel zu berechnen:
  • [Thiolkonzentration] = (A&sub4;&sub1;&sub2; (Probe)-A&sub4;&sub1;&sub2; (Blindprobe))
  • X (Verdünnungsfaktor)/14,150 M&supmin;¹
  • Alternativ kann eine Standardkurve konstruiert werden. Eine 0,25 mM-Lösung von hochreinem Cystein wird in dem für die Chelatbildner-Konjugations-Analyse verwendeten Puffer hergestellt (diese Standardlösung sollte täglich frisch hergestellt werden). Reihenverdünnungen des Cysteinstandards werden mit HA und DTNB, wie oben angegeben, zur Reaktion gebracht und eine Standardkurve von Mol Cystein gegen Extinktion bei 412 nm wird konstruiert. Die Menge von an den Antikörper konjugiertem Chelatbildrfer kann direkt aus dieser Standardkurve bestimmt werden.
    • Beispiel VIII Radioaktive Markierung von Chelatbildner-konjugiertem Antikörper a. Darstellung von Technetium-99m-tartrat
  • Zu einer Ampulle mit Zinn(II)-tartrat-Lösung, die 0,10 mg Zinn(II)-chlorid und 75 mg Natriumtartrat in 0,60 ml enthielt, wurden 0,50 ml Tc-99m-Natriumpertechnetat (2-4 mg) zugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur für 3 min äquilibriert. Falls gewünscht, kann der Umfang der Reaktion, in dem Technetium-99m-tartrat gebildet wird, mit TLC bestimmt werden.
  • Auf zwei Gelman-ITLC-SG-Streifen werden am (markierten) Anfang kleine Tropfen der oben hergestellten radioaktiven Lösung aufgebracht. Sofort wird einer der Streifen mit Kochsalzlösung entwickelt; nach Trocknen des ursprünglichen Flecks unter einem Stickstoffstrom wird der andere Streifen in Methylethylketon (MEK) entwickelt. Nachdem die Lösungsmittelfronten 75% der Länge der Streifen gewandert sind, werden die Streifen aus den Entwicklungslösungen entfernt und die Lösungsmittelfront wird markiert. Die Streifen werden auf halbem Weg zwischen dem Anfang und der Lösungsmittelfront geschnitten. Die Radioaktivität auf jedem der vier Stücke wird durch Standardzähltechniken bestimmt. Da der Rf-Wert von Natriumpertechnetat 1 im MEK-System und 1 im Kochsalzsystem ist und der Rf von Technetiumtartrat 0 im MEK-System und 1 im Kochsalzsystem ist und der Rf-Wert von Technetiumdioxid 0 in beiden Systemen ist, kann die Fraktion von Tc-99m-tartrat mit der folgenden Gleichung bestimmt werden:
  • in der C&sub1; und C&sub0; die Radioaktivitätszählungen der Lösungsmittelfront bzw. des Anfangs für die zwei Lösungsmittel sind. Das Tc-99m-tartrat kann verwendet werden, wenn die Tc-99m-tartrat- Fraktion 0,85 oder mehr ist.
    • b. Reaktion von Tc-99m-tartrat mit Chelatbildner-konjugiertem Antikörper
  • Das Antikörper-MAGGG-Konjugat in Beispiel VI (0,10 mg in 0,40 ml PBS-Puffer bei pH 8) wurde mit Tc-99m-tartrat (0, 10 ml, 0,5-2 mg) für 60 min bei 50ºC zur Reaktion gebracht. Zu diesem Zeitpunkt waren 80% der Tc-99m-Radioaktivität an den Antikörper gebunden. Immunaktivität des Präparates als bestimmte Radioaktivität, die an Melanom-Tumorzellen gebunden ist, wurde zu 84% nach Korrektur wegen nicht an Protein gebundener Radioaktivität bestimmt.
    • Beispiel IX
  • Eine Vergleichsstudie wurde bei Tieren durchgeführt, um die relative Fähigkeit von 99mTc-MAG&sub3;-NRML-05-Fab und 99mTc-N&sub2;S&sub2;- NRML-05 zu markierten Tumoren in Mäusen zu bestimmen. Diese Bezeichnungen beziehen sich auf die unterschiedlichen Chelatbildner, die an Antikörper-Fab-Fragmente gebunden sind. Die Bezeichnung NRML-05 ist eine Laborbezeichnung für einen spezifischen Antikörper zu einem Melanomtumor. MAG&sub3; ist der N&sub3;S-Chelatbildner, der in den vorangehenden Beispielen beschrieben ist. N&sub2;S&sub2; ist eine Bezeichnung für einen Vergleichschelatbildner mit zwei Schwefeln und zwei Stickstoffen als elektronenliefernde Atome. Die spezifische Verbindung ist 4,5-Bis(2'- thioacetamido)pentansäure.
  • Gruppen von vier Mäusen wurden gleiche Dosen von mit Technetium markierten Reagenzien injiziert. Nacktmäuse, die Melanom- Xenographen tragen, wurden verwendet. Die Mäuse wurden 20 Stunden nach der Injektion geopfert und Proben wurden in einem Gamma-Zähler ausgezählt. Zwei Tabellen sind unten angegeben, die die erhaltenen Daten darstellen. Die erste Tabelle zeigt Prozent Dosis/Gramm getestetes Gewebe. Die zweite Tabelle zeigt die Tumor/Gewebe-Verhältnisse (erhalten durch Teilen der Prozent Dosis/Gramm, die in einem Tumor vorliegen, durch die Prozent Dosis/Gramm der einzelnen Gewebetypen). Tabelle 1 % Dosis/Gramm Gewebe Gewebe MAG&sub3;-Markierung Mittelwert Standardabweichung N&sub2;S&sub2;-Markierung Blut Schwanz Tumor Haut Muskel Knochen Lunge Leber Milz Magen Nacken Niere Darm Tabelle 2 Tumor/Gewebe-Verhältnisse Gewebe MAG&sub3;-Markierung N&sub2;S&sub2;-Markierung Blut Schwanz Tumor Haut Muskel Knochen Lunge Leber Milz Magen Nacken Niere Darm
  • Die Daten zeigen gutes Anzielen in Tumorgewebe. Wenn MAG&sub3; als ein Chelatbildner verwendet wird, hat der Tumor die höchste prozentuale Dosis pro Gramm von allen getesteten Geweben. In dieser Vergleichsstudie führt die Verwendung des N&sub2;S&sub2;-Chelators zu einem größeren Prozentanteil der in den Lungen vorhandenen Dosis als im Tumor auf einer grammbezogenen Basis. Andere Studien vor und seit dieser Studie zeigen, daß die Lungenkonzentration in diesem Fall ungewöhnlich hoch ist. Andere Gewebekonzentrationen stehen jedoch in Übereinstimmung mit üblichen Werten. Das Exkretionsmuster des Tc-99m-MAG&sub3;-Chelat-Konjugats ist also besser als dasjenige des N&sub2;S&sub2;-Chelats. Dies wird gezeigt durch niedrigere Leber- und Milzkonzentrationen für das Tc-99m-MAG&sub3;-Chelat-Konjugat als für das N&sub2;S&sub2;-gebundene Konjugat. Zusätzlich sind die niedrigen Magengehalte für das MAG&sub3;- Material ein Anzeichen für hohe Stabilität, da Verlust von Tc- 99m als Pertechnetat als ein relativ hohes Radioaktivitätsniveau in Magengewebe zu sehen ist.
    • Beispiel X
  • Neun zusätzliche N&sub3;S-Chelatbildner der Erfindung wurden synthetisiert. Die chemischen Strukturen dieser Verbindungen sind in Fig. 1 dargestellt, wobei die Fig. 1A bis 1I den neun mit A bis I bezeichneten Verbindungen entsprechen. Die Schwefel- Schutzgruppe (PG) und die drei Substituenten, dargestellt als R, R' und R'', sind für jede Verbindung dargestellt (indem man für jede Verbindung quer über die Tabelle liest).
  • Die Abkürzungen für die Schwefel-Schutzgruppen (PG) in Fig. 1 stellen die folgenden Gruppen dar, wobei das dargestellte Schwefelatom das Schwefelatom des Chelatbildners ist: Tetrahydropyranyl Ethoxyethyl Acetamidomethyl Methoxymethyl
  • Wenn der Chelatbildner eine Methoxymethyl-S-Schutzgruppe umfaßt (wie dies Verbindung I tut) ist der Substituent -CH&sub2;COOH vorzugsweise an das Kohlenstoffatom gebunden, das unmittelbar benachbart zu dem Schwefelatom im Chelatbildner ist (der Alpha-Kohlenstoff).
  • TFP stellt eine 2,3,5,6-Tetrafluorphenylgruppe dar. Die 2,3,5,6-Tetrafluorphenylester-Protein-Konjugationsgruppe liegt vorzugsweise am Ende eines -(CH&sub2;)&sub3;-Abstandshalters, wenn das Verfahren des vorgebildeten Chelats verwendet werden soll, um die Hydrolyse (oder Verdrängung) der TFP-Gruppe während der Reaktion zur radioaktiven Markierung zu minimieren. Die Verbindungen A und B, in denen TFP an einen kürzeren Abstandshalter gebunden ist, sind geeigneter für das Verfahren des nachgebildeten Chelats, da das TFP schon mit einem Protein reagiert hat und während der radioaktiven Markierung beim Verfahren der Nachbildung nicht länger der Hydrolyse unterworfen ist.
  • Bevorzugte Chelatbildner schließen diejenigen ein, in denen Substituent R'' -COOH ist.
  • Die Verbindungen werden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren radioaktiv markiert. Die Reaktionsbedingungen für die radioaktive Markierung (z. B. pH und Temperatur) werden entsprechend solchen Faktoren wie der Leichtigkeit der Verdrängung der bestimmten S-Schutzgruppe auf der Verbindung variieren, wie oben beschrieben.
  • Durch Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann man Proteine, Kohlehydrate und Glykoproteine schnell konjugieren, um Radionuklid-substituierte Reagenzien zur Verwendung in vivo bereitzustellen. Die Reagenzien können in reiner Form und in guter Ausbeute bereitgestellt werden und das Radionuklid-Metall wird als ein Chelat mit dem Protein, Kohlehydrat oder Glykoprotein zur Verwendung in vivo stabil gehalten. So kann man ein Radionuklid sicher zu einer bestimmten Stelle steuern, wo nur niedrige Radioaktivitätsniveaus nicht-spezifisch gesteuert und gebunden werden.
  • Obgleich die vorstehende Erfindung zur Veranschaulichung und als Beispiel zu Zwecken der Deutlichkeit des Verständnisses detailliert beschrieben worden ist, wird es den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen in der Praxis durchgeführt werden können. Daher sollten die Beschreibung und die Beispiele nicht als den Schutzumfang der Erfindung beschränkend angesehen werden, der durch die beigefügten Ansprüche umrissen ist.
  • Die in der vorstehenden Beschreibung, in den Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein. Verbindung

Claims (33)

1. Eine Verbindung der Formel:
wobei:
T H oder eine Schwefel-Schutzgruppe ist,
jedes X unabhängig H&sub2; oder O darstellt;
jedes R unabhängig einen Substituenten darstellt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Wasserstoff; einer Nicht- Alkyl-Seitenkette einer anderen Aminosäure als Cystein; Alkyl; geminalem Dialkyl; und -(CH&sub2;)n-Z besteht;
Z -COOH, eine Konjugationsgruppe oder eine Anzielverbindung darstellt;
n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 4 ist; und
R' H&sub2;; -(CH&sub2;)n-Z; oder eine Alkylgruppe mit einer oder mehreren darauf substituierten polaren Gruppen ist und
die Verbindung wenigstens einen -(CM&sub2;)n-Z-Substituenten umfaßt und wo Z eine Konjugationsgruppe ist, die mit einer Anzielverbindung reaktiv ist, oder eine Anzielverbindung, wobei, wenn
R' (CH&sub2;)n-Z ist und Z eine Anzielverbindung oder eine Konjugationsgruppe ist die mit einer Anzielverbindung reaktiv ist, n dann 3 oder 4 ist.
2. Die Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Schwefel-Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Thioacyl- und Organothiogruppen besteht, die von 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatome umfassen.
3. Die Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Schwefel-Schutzgruppe, wenn mit dem zu schützenden Schwefelatom zusammengenommen, eine Hemithioacetalgruppe ist.
4. Die Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Hemithioacetalgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Tetrahydrofuranyl-, 2-Methyltetrahydrofuranyl-, Tetrahydropyranyl-, 2-Methyltetrahydropyranyl-, Ethoxyethyl- und Methoxymethylgruppen besteht.
5. Die Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Schwefel-Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus:
besteht.
6. Eine Verbindung der Formel:
und wasserlösliche Salze derselben, wobei:
M ein Radionuklid ist, das chelatisiert ist;
jedes X unabhängig H&sub2; oder O darstellt;
jedes R unabhängig einen Substituenten darstellt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Wasserstoff; einer Nicht- Alkyl-Seitenkette einer anderen Aminosäure als Cystein; Alkyl; geminalem Dialkyl; und -(CH&sub2;)n-Z besteht;
Z -COOH, eine Konjugationsgruppe oder eine Anzielverbindung darstellt;
n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 4 ist; und
R' M&sub2;; -(CH&sub2;)n-Z; oder eine Alkylgruppe mit einer oder mehreren darauf substituierten polaren Gruppen ist; und
die Verbindung wenigstens einen (CH&sub2;)n-Z Substituenten umfaßt, wo Z eine Konjugationsgruppe, die mit einer Anzielverbindung reaktiv ist, oder eine Anzielverbindung ist, wobei, wenn R' (CH&sub2;)n-Z ist und Z eine Anzielverbindung oder eine Konjugationsgruppe ist, die mit einer Anzielverbindung reaktiv ist, n dann 3 oder 4 ist.
7. Die Verbindung nach Anspruch 6, wobei M ein Radionuklid ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, &sup6;&sup7;Cu, &sup6;&sup4;Cu, ²&sup0;³Pb, ²¹²Pb, ²¹²Bi und ¹&sup0;&sup9;Pd besteht.
8. Die Verbindung nach Anspruch 1 oder 6, wobei wenigstens ein Substituent X O ist.
9. Die Verbindung nach Anspruch 8, wobei alle drei Substituenten X O darstellen.
10. Die Verbindung nach Anspruch 1 oder 6, wobei die Konjugationsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Aktivestern, Imidatestern, primären oder sekundären Aminen, Hydrazinen, Isothiocyanaten, Maleimiden und anderen Michael-Akzeptorgruppen besteht.
11. Die Verbindung nach Anspruch 10, wobei die Konjugationsgruppe eine 2,3,5,6-Tetrafluorphenylestergruppe ist.
12. Die Verbindung nach Anspruch 1 oder 6, wobei die Anzielverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Proteinen, Glykoproteinen, Kohlehydraten und Fragmenten derselben besteht.
13. Die Verbindung nach Anspruch 12, wobei die Anzielverbindung ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment desselben ist.
14. Die Verbindung nach Anspruch 13, wobei der monoklonale Antikörper oder das Fragment desselben spezifisch für Krebszellen ist.
15. Die Verbindung nach Anspruch 1 oder 6, wobei besagte Verbindung wenigstens einen Substituenten -(CH&sub2;)n-Z umfaßt, in dem Z -COOH ist.
16. Die Verbindung nach Anspruch 1 oder 6, wobei besagte Verbindung einen Substituenten (CH&sub2;)n-Z umfaßt, in dem Z eine Konjugationsgruppe oder eine Anzielverbindung ist.
17. Die Verbindungen der Fig. 1A bis 1I.
18. Ein Verfahren zur Radionuklid-Markierung eines Glykoproteins, welches umfaßt:
daß besagtes Glykoprotein mit einem glykolspaltenden Agens zur Reaktion gebracht wird, um wenigstens einen Zucker abzuspalten, um ein Dialdehyd oder höheres Polyaldehyd herzustellen, um ein Polyaldehydprodukt bereitzustellen;
daß besagtes Polyaldehydprodukt mit einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Reaktion gebracht wird, wobei Z Amino, Hydrazin oder ein Aminosalz ist, um ein Glykoprotein mit einem daran konjugierten Chelatbildner herzustellen; und
daß besagtes Glykoprotein mit einem daran konjugierten Chelatbildner mit einem Radionuklid unter Bedingungen zur Reaktion gebracht wird, die ausreichend sind, um ein Glykoprotein-Radionuklid-Chelat-Konjugat zu bilden.
19. Ein Verfahren zur Radionuklid-Markierung eines Glykoproteins, welches umfaßt:
daß besagtes Glykoprotein mit einem glykolspaltenden Agens zur Reaktion gebracht wird, um wenigstens einen Zucker abzuspalten, um ein Dialdehyd oder höheres Polyaldehyd herzustellen, um ein Polyaldehydprodukt bereitzustellen; und
daß besagtes Polyaldehydprodukt mit einer Verbindung nach Anspruch 6 zur Reaktion gebracht wird, wobei Z Amino, Hydrazin oder ein Aminosalz ist, um ein Radionuklid-chelat-konjugiertes Glykoprotein herzustellen.
20. Verfahren zur Radionuklid-Markierung eines Polypeptids, welches umfaßt, daß das Polypeptid mit einer Verbindung nach Anspruch 6 zur Reaktion gebracht wird, wobei besagte Verbindung eine Konjugationsgruppe umfaßt, die mit dem Polypeptid reagiert, wodurch die Verbindung an das Polypeptid gebunden wird.
21. Ein Verfahren zur Radionuklid-Markierung eines Polypeptids, welches umfaßt:
daß das Polypeptid mit einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Reaktion gebracht wird, wobei besagte Verbindung eine Konjugationsgruppe umfaßt, die mit dem Polypeptid reagiert, wodurch die Verbindung an das Polypeptid gebunden wird,
daß die an das Polypeptid gebundene Verbindung mit einem Radionuklid-Metall zur Reaktion gebracht wird, um ein Chelat- Polypeptid-Konjugat zu bilden.
22. Das Verfahren nach Anspruch 18, 19, 20 oder 21, wobei das Glykoprotein oder Polypeptid ein monoklonaler Antikörper oder Fragment desselben ist.
23. Das Verfahren nach Anspruch 22, wobei der monoklonale Antikörper oder das Fragment desselben spezifisch für Krebszellen ist.
24. Das Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Radionuklid ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup0;³Pb, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹&sup9;&sup8;Au und ¹&sup0;&sup9;Pd besteht.
25. Die Verbindung nach Anspruch 6, wobei Z eine Anzielverbindung ist, die sich an Zielzellen bindet, und M ein therapeutisch wirksames Radionuklid ist, zur Verwendung als eine aktive therapeutische Substanz.
26. Die Verbindung nach Anspruch 6, wobei Z eine Anzielverbindung ist, die sich an Zielzellen bindet, und M ein diagnostisch wirksames Radionuklid ist, zur Verwendung als ein diagnostisches Mittel.
27. Die Verbindung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Zielzellen Krebszellen sind und die Anzielverbindung ein monoklonaler Antikörper oder Fragment desselben ist, der (das) sich an die Krebszellen bindet.
28. Eine Verbindung der Formel:
wobei:
T eine Alkyl-, Aryl-, Acyl- oder Thioacylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffen; eine Organothiogruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen; oder Wasserstoff ist;
jedes X unabhängig H&sub2; oder O darstellt;
n eine ganze Zahl von 3 oder 4 ist;
R H; Alkyl oder geminales Dialkyl, wobei besagtes Alkyl von 1 bis 7 Kohlenstoffe enthält; oder eine Nicht-Alkyl-Seitenkette einer anderen Aminosäure als Cystein ist; und
Z Amino; ein Carbonsäureester; ein Imidatester;
wobei W&sub1; ein Polypeptid mit wenigstens zwei Aminosäuren ist;
wobei W&sub2; und W&sub3; unabhängig ein Kohlehydrat darstellen und der Stickstoff an ein Kohlenstoffatom von W&sub3; gebunden ist, ist.
29. Eine Verbindung der Formel:
wobei:
M ein Radionuklid-Ion ist, das chelatisiert ist, an das ein oder zwei Sauerstoffatome gebunden sein können;
R Wasserstoff; Alkyl oder geminales Dialkyl, wobei besagtes Alkyl von 1 bis 7 Kohlenstoffe enthält; oder eine Nicht-Alkyl- Seitenkette einer anderen Aminosäure als Cystein ist;
jedes X unabhängig O oder H&sub2; darstellt;
n eine ganze Zahl von 3 oder 4 ist; und
Z Amino; ein Carbonsäureester; ein Imidatester;
wobei W&sub1; ein Polypeptid mit wenigstens zwei Aminosäuren ist;
wobei W&sub2; und W&sub3; unabhängig ein Kohlehydrat darstellen, wobei der Stickstoff an ein Kohlenstoffatom von W&sub3; gebunden ist, ist.
30. Die Verbindung nach Anspruch 29, wobei M ein Radionuklid- Ion darstellt, das ausgewählt ist aus &sup9;&sup9;mTc, ¹&sup8;&sup6;Re und ¹&sup8;&sup8;Re, wobei an jedes ein Sauerstoffatom gebunden ist.
31. Eine Verbindung der Formel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R' (CH&sub2;)n-Z ist.
32. Eine Verbindung der Formel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung wenigstens zwei -(CH&sub2;)n-Z-Substituenten umfaßt, wobei ein Z -COOH ist und ein anderes Z eine Anzielverbindung oder eine Konjugationsgruppe, die mit einer Anzielverbindung reaktiv ist, ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ohne Beschränkung ist.
33. Eine Verbindung der Formel nach Anspruch 32, wobei R' -(CH&sub2;)n-Z ist. Verbindung
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5393512A (en) * 1985-01-14 1995-02-28 Vanderheyden; Jean-Luc Stable therapeutic radionuclide compositions and methods for preparation thereof
US5059541A (en) * 1988-04-29 1991-10-22 Neorx Corporation Minimal derivatization of proteins
US4988496A (en) * 1988-05-31 1991-01-29 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5089249A (en) * 1988-06-10 1992-02-18 Neorx Corporation Conjugates for bone imaging and bone cancer therapy
US5202109A (en) * 1988-06-10 1993-04-13 Neorx Corporation Conjugates for bone imaging and bone cancer therapy
US5218128A (en) * 1988-06-15 1993-06-08 Centocor, Inc. Bifunctional coupling agents and radionuclide labeled compositions prepared therefrom
US5164176A (en) * 1989-06-16 1992-11-17 Neorx Corporation Radionuclide metal chelates for the radiolabeling of proteins
US5250666A (en) * 1989-06-16 1993-10-05 Neorx Corporation Radionuclide metal chelates for the radiolabeling of proteins
US5985240A (en) * 1989-08-09 1999-11-16 Rhomed Incorporated Peptide radiopharmaceutical applications
US5443816A (en) * 1990-08-08 1995-08-22 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical preparation and method
DE3930674A1 (de) * 1989-09-11 1991-03-21 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle chelatbildner zur komplexierung von tc- und re-isotopen, verfahren zu ihrer herstellung und darstellung von konjugaten daraus sowie deren verwendung in diagnostik und therapie
WO1991004057A1 (en) * 1989-09-22 1991-04-04 Neorx Corporation Stable therapeutic radionuclide compositions and methods for preparation thereof
DE59006132D1 (de) * 1989-10-30 1994-07-21 Verein Fuer Kernverfahrenstech Kit (nichtradioaktive Vorstufe) zur Herstellung einer enantiomeren Form des Nierenfunktionsdiagnostikums Technetium-99m-Mercaptoacetyltriglycin (99m-Tc-MAG-3) und Verfahren zur Herstellung des Kits.
US5112953A (en) * 1989-12-29 1992-05-12 Neorx Corporation Radiolabeled proteins for diagnostic or therapeutic use
US5175257A (en) * 1989-12-29 1992-12-29 Neorx Corporation Radiolabeled proteins for diagnostic or therapeutic use
US5080883A (en) * 1990-05-11 1992-01-14 Mallinckrodt, Inc. 99 mtcn3s-conjugated anti-bibrin monoclonal antibody as an in vivo diagnostic agent for imaging
AU8730691A (en) * 1990-09-28 1992-04-28 Neorx Corporation Polymeric carriers for release of covalently linked agents
US5561220A (en) * 1991-02-08 1996-10-01 Diatech, Inc. Technetium-99m labeled peptides for imaging inflammation
US5645815A (en) * 1991-02-08 1997-07-08 Diatide, Inc. Radiolabled compounds for thrombus imaging
ES2141102T3 (es) * 1991-02-08 2000-03-16 Diatide Inc Polipeptidos marcados con tecnecio-99m para la generacion de imagenes.
US7238340B1 (en) 1991-11-27 2007-07-03 Cis Bio International Monoamine, diamide, thiol-containing metal chelating agents
US5443815A (en) * 1991-11-27 1995-08-22 Diatech, Inc. Technetium-99m labeled peptides for imaging
US6019958A (en) * 1991-02-08 2000-02-01 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for imaging inflammation
US6107459A (en) * 1991-02-08 2000-08-22 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for diagnostic imaging
WO1992019274A1 (en) * 1991-05-08 1992-11-12 Mallinckrodt Medical, Inc. Technetium chelates to be used for determining the renal function
US5225180A (en) * 1991-09-10 1993-07-06 Diatech, Inc. Technetium-99m labeled somatostatin-derived peptides for imaging
US5783170A (en) * 1991-11-27 1998-07-21 Diatide, Inc. Peptide-metal chelate conjugates
US5738838A (en) * 1992-02-20 1998-04-14 Rhomed Incorporated IKVAV peptide radiopharmaceutical applications
US5643549A (en) * 1992-02-20 1997-07-01 Rhomed Incorporated Leukostimulatory agent for in vivo leukocyte tagging
US5346686A (en) * 1992-10-05 1994-09-13 Mallinckrodt Medical, Inc. Labelled interleukin-8 and medical uses thereof
US5413778A (en) * 1992-10-05 1995-05-09 The Regents Of The University Of Michigan Labelled monocyte chemoattractant protein material and medical uses thereof
US5605671A (en) * 1992-10-05 1997-02-25 The Regents Of The University Of Michigan Radiolabeled neutrophil activating peptides for imaging
AU5537994A (en) * 1992-10-22 1994-05-09 Mallinckrodt Medical, Inc. Therapeutic treatment for inhibiting vascular restenosis
US5879657A (en) * 1993-03-30 1999-03-09 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Radiolabeled platelet GPIIb/IIIa receptor antagonists as imaging agents for the diagnosis of thromboembolic disorders
JPH10504534A (ja) * 1994-06-16 1998-05-06 ネオルクス コーポレイション 放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
US6334996B1 (en) 1997-12-24 2002-01-01 Resolution Pharmaceuticals Inc. Chelators that predominantely form a single stereoisomeric species upon coordination to a metal center
EP1047708B1 (de) * 1997-12-24 2007-09-26 Bracco International B.V. Peptide chelatoren die nach der koordination mit einem metall zu einem vorherrschenden einzel-stereoisomeren führen
US6972324B2 (en) 2001-05-18 2005-12-06 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Antibodies specific for CD44v6
US20030031627A1 (en) 2001-07-31 2003-02-13 Mallinckrodt Inc. Internal image antibodies for optical imaging and therapy
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4980147A (en) * 1984-06-25 1990-12-25 University Of Utah Research Foundation Radiolabeled technetium chelates for use in renal function determinations
ATE66469T1 (de) * 1985-01-14 1991-09-15 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4861869A (en) * 1986-05-29 1989-08-29 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for joining radionuclide metal ions with biologically useful proteins

Also Published As

Publication number Publication date
EP0284071B1 (de) 1994-06-08
EP0284071A2 (de) 1988-09-28
DK165488D0 (da) 1988-03-25
NO881332D0 (no) 1988-03-25
EP0284071A3 (en) 1990-05-16
JPS6419058A (en) 1989-01-23
DK165488A (da) 1988-09-27
CN1034545A (zh) 1989-08-09
DE3889956D1 (de) 1994-07-14
ATE106898T1 (de) 1994-06-15
AU1375188A (en) 1988-09-29
CA1328147C (en) 1994-03-29
NO881332L (no) 1988-09-27
AU619738B2 (en) 1992-02-06

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