DE3781031T2 - Markierung von traegermolekuelen mit metallionen. - Google Patents
Markierung von traegermolekuelen mit metallionen.Info
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Description
- Metallionen sind sehr nützlich als Indikatorsubstanzen. Sie können in sehr niedrigen Konzentrationen durch Emission von Radioaktivität, Fluoreszenz, Elektrononspinresonanz und NMR-Relaxation detektiert werden. Bei Befestigung an ein Trägermolekül, wie einen Antikörper oder ein Antigen, können sie dessen Konzentration oder Lokalisation nachweisen. Das Trägermolekül kann eine Affinität für krankheltsassoziierte Moleküle, beispielsweise tumorassoziierte Antigene, besitzen. Somit können Trägermoleküle in Konjugation an Metallionen als in vivo und in vitro diagnostische Hilfsmittel zur Detektion auf die Anwesenheit und/oder Lokalisation von Erkrankungen im Körper verwendet werden. Bestimmte strahlenemittierende Metallionen können auch an Trägermoleküle befestigt werden, wie beispielsweise Antikörper gegen Tumorzelloberflächenantigene, um die Metallionen an einem Tumorort zu bringen, um den Tumor zu bestrahlen.
- Man traf auf Probleme bei dem Versuch, bestimmte Moleküle mit einigen Metallionen zu markieren. Bedingungen, die das Metallion stabilisieren, können möglicherweise nicht mit der Stabilität des Trägermoleküls verträglich sein und umgekehrt. Ein Beispiel für eine solche Inkompatibilität kommt bei der Markierung eines Proteins oder Polypeptids mit Indium-111 oder Gallium-67 vor. Metallionen können an ein Protein oder Polypeptid angeheftet werden, indem man ein Derivat des Proteins oder Polypeptids bildet, daß einen Rest mit einer terminalen, chelatbildenden Gruppe, die ein Chelat mit dem Metallion bilden kann, besitzt. Beispielsweise ist in der EP-A-0174853, die einen Teil des Stands der Technik nach Artikel 54(3) EPC bildet, ein Verfahren beschrieben, bei dem man ein Radioniclidmetallion an ein Antikörperfragment bindet, wobei man ein bifunktionelles Kopplungsmittel verwendet, das mit einer freien Sulfhydrylgruppe des Antikörperfragments reagiert und auch eine chelatbildende Gruppe, die ein Metallion komplexieren kann, enthält. Das entstandene Konjugat ist ein Antikörper Konjugat der Formel worin Ab für den Rest eines Fab'-Fragments eines monoklonalen Antikörpers steht, wobei der Antikörper einer ist, der die antigenblndende Aktivität nach enzymatischer Entfernung des Fc-Fragments und reduktlver Spaltung der Disulfidblndung, die die schweren Ketten verbindet, belbehält, R einen divalenten Linker bedeutet und R' für eine Gruppe steht, die ein Radionuklidmetallion chelatisieren kann. Die EP-A-0174853 beschreibt auch die entsprechenden Antikörper-Radionuklidkonjugate, die sich von einem solchen Antikörperkonjugat durch Bildung eines Chelatkomplexes zwischen der Gruppe R' und einem Radionuklidmetallion ableiten. Die EP-A-0178125 ist ebenfalls Teil des Standes der Technik nach Artikel 54(3) EPC. Darin sind Kopplungsmittel zur Anfügung eines paramagnetischen oder Radionuklidmetallions an biologisch nützliche Moleküle einschließlich Verbindungen der Formel
- beschrieben, worin R für einen divalenten organischen Rest steht und R' für eine Gruppe steht, die ein paramagnetisches oder Radionuklidmetallion chelatisieren kann. Die U.K.-Patentanmeldung GB 2109407 beschreibt ebenfalls die Verwendung von chelatderivatisierten Antikörpern unter Bildung eines Antikörper-Metallionkonjugats zur Verwendung bei der Tumorabbildung. Bei der Markierung chelatderivatisierter Proteine mit Indium-111 oder Gallium-67 trifft man auf zwei Probleme. Diese Metallionen werden in Form ihrer Chloridsalze verwendet, die in einer wäßrigen Lösung bei einem pH von weniger als 3,5 gehalten werden müssen. Werden sie nicht so gehalten, reagieren sie mit Wasser unter Bildung unlöslicher Metallhydroxide. Dieser saure pH kann die Stabilität oder die biologische Aktivität des Proteins oder Polypeptids ungünstig beeinflussen.
- Technetium zeigt eine zusätzliche Reihe von Problemen zur Proteinmarkierung. Technetium liegt in sieben Oxidationsstufen vor, von denen die stabilste die mit der Wertigkeit +7, wie sie in Pertechnetat vorkommt, ist ((TcO&sub4;&supmin;). Die Wertigkeit +5 ist sehr nützlich zur Markierung von Chelaten und chelatgekoppelten Proteinen. Diese Oxidationsstufe wird jedoch nicht leicht erreicht. Als metastabile Verbindung wird Technetium (+5) leicht zu (+4) reduziert und als reduziertes, hydrolysiertes TcO&sub2; in Gegenwart eines Überschusses am Reduktionsmittel eingefangen. Reduziertes, hydrolysiertes Technetium eignet sich nicht zur Chelatbildung oder zur Proteinmarkierung wegen seiner Tendenz zur Selbstassoziation oder wegen der nicht-spezifischen Bindung an Oberflächen. Wenn stöchiometrische Mengen des Reduktionsmittels verwendet werden, ist die Reduktion kinetisch sehr ineffizient. So gebildetes Technetium +5 neigt zur Reoxidation zu Pertechnetat, sobald das Reduktionsmittel verbraucht ist.
- Auf weitere Probleme trifft man bei der Bildung von Chelatkomplexen wegen der funktionellen Gruppen an den Protein- oder Polypeptidmolekülen. Das amino- und carboxyl-terminale Ende, das Rückgrat aus Amidbindungen und die Seitenkettenreste von Asparginsäure und Glutaminsäure, Lysin, Cystein, Tyrosin und Histidin, die in Proteinen und Polypeptiden gefunden werden, besitzen alle Chelat-Ligandcharakter. Die Aminosäuresequenz und die Tertiärstruktur des Moleküls können diese Chelatliganden zusammenbringen und so starke, vielzähnige Metallionenbindungsstellen schaffen. Somit besitzt jedes Protein ein Spektrum von metallbindenden Eigenschaften. Die schwachen Stellen können das Metallion in den Blutstrom an andere Plasmaproteine oder niedermolekulare Bestandteile abgeben. Die starken Seiten zeigen Wechselwirkung mit dem Proteinmetabolismus. Dies führt unausweichlich zu einer Retention des Radionuklids an den Hauptorten des Proteinkatabolismus, wie beispielsweise der Leber und der Niere.
- Ein besonders lästiges Problem, auf das man bei der Technetiummarklerung mit Antikörpern während der in situ Reduktion des Pertechnetats trifft, ist die begleitende Reduktion der Proteindisulfidbindungen. Die entstandenen Sulfhydrylgruppen binden Technetium bevorzugt an gekoppelte Chelate (Paik, C.H. et al., J. Nucl. Med. Biol., 12:3 [1985]). Der entstandene, markierte Antikörper ergibt Metaboliten, die sich nicht aus der Leber oder der Niere ausscheiden. Dies ist eine ideale Eigenschaft für Technetium-markiertes, mikroaggregiertes Albumin, um die normale Leber abzubilden, aber sie ist in höchstem Maße unzweckmäßig bei markierten Antikörpern, die für in vivo diagnostische Anwendungen verwendet werden, bei denen eine Clearance des Radionuklids aus der Leber erwünscht ist.
- Die Größe dieses Clearance-Problems kann abgeschätzt werden, wenn man das metabolische Schicksal der markierten Antikörper berücksichtigt.
- Eine beständige Beobachtung bei der Verwendung von markierten Antikörpern zur Tumordetektion ist die Tatsache, daß nur ein kleiner Bruchteil der injizierten Dosis in den festen Tumor als Zeil geht (Larson, S.M., et al., J. Clin. Invest., 72:2101-2114 (1983); Buraggi, G.L., et al., Cancer Res., 45:3378:3387 (1985); Überblick in: Halpern, S.E., et al., Diagnostic Imaging, June, 40-47 (1982)). Dies ist darauf zurückzuführen, daß der Tumor einen relativ niedrigen Blutfluß und vaskuläre Permeabilität besitzt. Somit besitzt der Tumor eine sehr niedrige Extraktionseffizienz für den markierten Antikörper im Vergleich zu konkurrierenden, katabolischen Stoffwechselwegen der Aufnahme des markierten Antikörpers. Unter optimalen Bedingungen nimmt ein Zielgewebe von 3 bis 10 % der injizierten Dosis auf. Öfter beträgt die Aufnahme des Tumors weniger als 1 %. Der Rest, 90 % oder mehr, müssen in der Leber und den Nieren verstoffwechselt werden. Antikörper, die mit Radionuklidmetallion nach Verfahren nach dem Stand der Technik markiert sind, ergeben keine rapide Auswaschung der radioaktiv markierten Kataboliten aus diesen Stellen. Es gibt zwei ungünstige Folgen dieser Radionuklidretention. Die hohe Dosis an Strahlung, die aus der Leber oder den Nieren emittiert wird, verschleiert die niedrige Strahlendosis, die aus dem Zieltumor kommt. Noch wichtiger die Leber und die Nieren, die zu den radiosensitivsten Organen gehören, häufen eine unannehmbare Strahlendosis an. Die Dosimetrie ist linear abhängig von der Markerkonzentration, aber exponentiell abhängig von der Expositionszeit. Daher führt die Erniedrigung der Expositionszeit für Leber und Niere von keiner Clearance bis zu einem Bruchteil der Halbwertszeit des Radionuklid zu einer dramatischen Erniedrigung der Strahlendosis.
- Es würde in höchstem Maße zweckmäßig sein, ein Verfahren zum Markieren von Antikörpern zu entwickeln, das dazu führt, daß ein Radionnuklid an der Oberfläche der Zieltumorzellen für mindestens zwei Halbwertszeiten gehalten wird, aber markierte Metaboliten ergibt, die biologische Halbwertszeiten von weniger als 60 min in Organen mit normaler Clearance haben.
- Ein Verfahren zur Markierung eines chelatderivatisierten Protein oder Polypeptids, wie beispielsweise ein Antikörper, ist mit der Verwendung des sog. "Transferliganden" verbunden. Ein Transferligand ist eine Verbindung, die einen intermediären Komplex mit dem Metallion bindet. Der Metallionkomplex mit dem Transferliganden ist unter Bedingungen löslich, unter denen das Protein stabil ist. Der Komplex zwischen dem Transferliganden und dem Metallion ist derart, daß das Metallion nach Kontakt mit dem chelatderivatisierten Protein, das eine stärkere chelatbildende Affinität für das Metallion als der Transferligand hat, transferiert wird. Die EP-B-0083129 (europäische Patentanmeldung Nr. 82201602.8) beschreibt ein Verfahren zur Markierung von Proteinen mit Radionuklidmetallionen, bei denen ein intermediärer Komplex des Metallions in Form eines Carboxylats, Dithiocarboxylats, Enolats oder Gemisches davon verwendet wird.
- Aus verschiedenen Gründen waren die Transferliganden, die nach dem Stand der Technik verwendet wurden, nicht vollständig zufriedenstellend. Idealerweise besitzt ein Transferligand ein einzigartiges Eigenschaftsprofil. Zur Verwendung im Zusammenhang mit Radionukliden mit stabilen Oxidationsstufen, wie beispielsweise Indium-111 und Gallium-67, sind diese Eigenschaften wie folgt:
- 1. Er verhindert, daß das Radionuklidmetallion Metallhydroxide in physiologischen Puffern bei neutralem pH bildet;
- 2. er verhindert, daß das Radionuklidmetallion an mäßig starke endogene, chelatbildende Liganden von nativen oder chelatderivatisierten Proteinen bindet;
- 3. er transferiert das Radionnuklidmetallion schnell und quantitativ auf starke, chelatbildende Gruppen, die an das Protein gekoppelt worden sind;
- 4. er ist wasserlöslich, nicht-toxisch und nicht-mutagen; und
- 5. er ist leicht verfügbar und bevorzugt nicht teuer.
- Zur Verwendung bei oxidationsempfindlichen Radionukliden, wie beispielsweise Technetium, sollte der Transferligand auch die folgenden Eigenschaften besitzen:
- 6. Er fängt das Radionuklidmetallion in der geeigneten Oxidationsstufe während des Reduktionsprozesses zur anschließenden Chelatbildung quantitativ ein; und
- 7. er verhindert die Reoxidation des Radionuklidmetallions, wenn das Reduktionsmittel entfernt wird.
- Um diese Kriterien zu erfüllen, muß ein Transferligand zwei physikalisch chemische Eigenschaften besitzen. Sein Komplex mit dem Radionuklidion muß kinetisch labil sein, was den schnellen Austausch bei Kontakt mit einem thermodynamisch stabileren vielzähnigen Liganden gewährleistet. Zusätzlich muß der Transferligand ausreichende thermodynamische Stabilität besitzen, um den Austausch mit Hydroxidionen oder endogenen, chelatbildenden Stellen auf den Proteinmolekülen in wäßrigen Puffern bei physiologischem pH zu verhindern. Während die zuerst genannte Eigenschaft im allgemeinen charakteristisch für Metallionenindikatoren, die bei komplexometrischen Titrationen mit Ethylendiamintetraessigsäure verwendet werden, ist, erfüllen nur sehr wenige der Metallionenindikatoren oder der schwachen Chelatbildner (wie beispielsweise die, die in der EP-B-0083129, europäische Patentanmeldung Nr. 82201602.8 beschrieben sind) alle sieben Kriterien, die oben für einen idealen Transferliganden aufgeführt sind.
- Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus Proteinen oder Polypeptiden (ausgenommen ein Antikörperkonjugat der Formel
- worin Ab der Rest eines Fab'-Fragments eines monoklonalen Antikörpers ist, wobei der Antikörper einer ist, der antigenbindende Aktivität nach enzymatischer Entfernung des Fc-Fragments und reduktiver Spaltung der Disulfidbindung, die die schweren Ketten verknüpft, ist, R ein divalenter Linker ist, und R' eine Gruppe ist, die in der Lage ist, Radionuklidmetallionen zu chelatisieren) mit Metallionen, ausgewählt aus Indium, Gallium, Technetium und Isotopen davon. Die Konjugate, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, sind nützlich als Indikatorsubstanzen für in vivo und in vitro diagnostische Anwendungen, und im Falle bestimmter Radionuklidmetallion zur zielgerichteten Verabreichung als therapeutische Mittel. Erfindungsgemäß wird ein Metallionentransferkomplex, umfassend ein Chelat von 4,5-Dihydroxyl-m-benzoldisulfonsäure oder ein Salz davon, und das Metallion mit einem Protein oder Polypeptid, das kovalent an eine exogene chelatbildende Gruppe gebunden ist, umgesetzt. Bei diesem Verfahren ist das Protein oder Polypeptid ein anderes als ein Antikörperkonjugat der Formel
- worin Ab der Rest eines Fab'-Fragments eines monoklonalen Antikörpers ist, wobei der Antikörper einer ist, der die antigenbindende Aktivität nach enzymatischer Entfernung des Fc-Fragements und reduktiver Spaltung der Disulfidbindung, die die schweren Ketten verknüpft, beibehält, R ein divalenter Linker ist, und R' eine Gruppe ist, die ein Radionuklidmetallion chelatisieren kann. Die exogene chelatbildende Gruppe besitzt eine größere chelatbildende Affinität als 4,5-Dihydroxyl-m-benzoldisulfonsäure für das Metallion. Die Reaktion wird in einem wäßrigen Medium bei einem pH durchgeführt, bei dem das Protein oder Polypeptid stabil ist. Es wurde gefunden, daß 4,5-Dihydroxyl-m-benzoldisulfonsäure (auch als "Tiron" bekannt) ein idealer Transferligand ist, um Metallionen an chelatderivatisierte Proteine oder Polypeptid anzufügen, insofern als er die oben aufgeführten sieben Erfordernisse erfüllt.
- Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus einem Protein oder Polypeptid (ausgenommen ein Antikörperkonjugat der Formel
- worin Ab der Rest eines Fab'-Fragments eines monoklonalen Antikörpers ist, wobei der Antikörper einer ist, der die antigenbindende Aktivität nach enzymatischer Entfernung des Fc-Fragments und reduktiver Spaltung der Disulfidbindung, die die schweren Ketten verknüpft, beibehält, R ein divalenter Linker ist, und R' eine Gruppe ist, die ein Radionuklidmetallion chelatisieren kann) und einem Technetiumion, beispielsweise Tc-99m, in dem das Technetiumion in einem reduzierten Zustand, d.h. weniger als +7, vorliegt, bereitgestellt. Gemäß dieser Ausführungsform werden 4,5- Dihydroxyl-m-benzoldisulfonsäure und Pertechnetationen in einem wäßrigen Reaktionsmedium umgesetzt, und das Pertechnetation wird elektrolytisch in dem wäßrigen Medium reduziert, wodurch ein Transferkomplex mit dem Technetiumion in reduziertem Zustand gebildet wird. Der Transferkomplex wird mit einem Protein oder Polypeptid, das kovalent an eine exogene, chelatbildende Gruppe gebunden ist, umgesetzt, wobei die exogene, chelatbildende Gruppe eine größere chelatbildende Affinität als 4,5-Dihydroxyl-m- benzoldisulfonsäure für das reduzierte Technetiumion besitzt. Die Reaktion wird in einem wäßrigen Reaktionsmedium bei einem pH durchgeführt, bei dem das Protein oder Polypeptid stabil ist. Die 4,5-Dihydroxyl-m- benzoldisulfonsäure fängt das Technetium in der reduzierten Oxidationsstufe ein und verhindert Reoxidation, wenn das Reduktionsmittel entfernt wird.
- Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines Tiron-¹¹¹-In- Komplexes und eines Tiron-¹¹¹-In-Antikörperkomplexes vor und nach Umsetzen mit EDTA.
- Fig. 2 zeigt Radiochromatogramme von: einem Tiron-TcO&sub4;-Komplex; dem gleichen Komplex nach elektrolytischer Reduktion; dem Reaktionsprodukt des reduzierten Tc-Tironkomplexes und einem F(ab')&sub2;-Antikörperfragment in Kopplung an eine chelatbildende Gruppe, MAG&sub3;; dem Reaktionsprodukt des reduzierten Tc-Tironkomplexes und eines F(ab')&sub2;-Antikörperfragments in Kopplung an eine chelatbildende Gruppe, CO&sub2;DADS; und dem Reaktionsprodukt des reduzierten Tc-Tironkomplexes und einem acetylierten F(ab')&sub2;-Antikörper.
- Erfindungsgemäß werden Verfahren zur Herstellung von Konjugaten von Proteinen oder Polypeptiden mit Metallionen bereitgestellt. Die entstandenen Konjugate sind als Radiopharmazeutika nützlich. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß 4,5-Dihydroxyl-m-benzoldisulfonsäure, d.h. Tiron, ein idealer Transferligand zur Herstellung solcher Konjugate ist. Chelate von Tiron sind per se bekannt. Tiron wurde als chelatbildendes Mittel, beispielsweise in komplexometrischen Titrationen von Metallionen, wie beispielsweise Al³&spplus;, Ga³&spplus; und In³&spplus;, verwendet. Ebenso wurde Tiron als Antidot allein oder zusammen mit anderen Chelaten zur Behandlung von Eisenüberlastung, Blei- Antimon- und akuten Uranvergiftungen (Basinger, M.A. und Jones, M.M., Res. Comm. in Chem. Path. and Pharm., 34:351 [1981]) verwendet. In jüngster Zeit wurde gezeigt, daß der Tc-99m-Komplex von Tiron als Abbildungsmittel von Nieren wirksam ist (Cathecholate Complexes of 99mTc in Technetium Chemistry and Nuclear Medicine, Hrsg. Deutsch, E. Nicolini, H. und Wagner, H.N., S. 113, Raven Press [1983]). Es gab jedoch keine Berichte über die Verwendung von Tiron als Transferligand zur Herstellung von Radiopharmazeutika, wie beispielsweise die hierin beschriebenen.
- Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um Konjugate von Metallionen mit jedem Protein oder Polypeptid, das markiert werden soll, herzustellen. Während die Erfindung im folgenden bezüglich ihrer Verwendung im Zusammenhang mit Proteinen näher erläutert wird, ist zu verstehen, daß die erfindungsgemäßen Verfahren auch auf Polypeptide oder freie Chelate anwendbar sind. Die Proteine, die konjugiert werden können, umfassen Antigene, Antikörper und andere Proteine, die für in vitro oder in vivo diagnostische und therapeutische Anwendungen bei Konjugation an Metallionen nützlich sind. Proteinfragmente können ebenfalls verwendet werden.
- Das Protein, das mit einem Metallion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konjugiert wird, wird zuerst durch kovalente Bindung an eine exogene, chelatbildende Gruppe modifiziert. Unter "exogener, chelatbildender Gruppe" wird eine chelatbildende Gruppe verstanden, die normalerweise in dem Proteinmolekül nicht vorhanden ist. Die exogene, chelatbildende Gruppe muß eine größere chelatbildende Affinität als Tiron für das Metallion besitzen. Vielzähnige Liganden besitzen eine thermodynamische Stabilität, die größer als die von Tiron ist, und im Falle der Markierung mit Technetium können alle Liganden, die eine oder mehrere Sulfhydrylgruppen enthalten, verwendet werden.
- Jede beliebige Verbindung aus einer Vielzahl von vielzähnigen, chelatbildenden Gruppen kann geeigneterweise verwendet werden, um das Protein zu modifizieren. Die exogene, chelatbildende Gruppe kann kovalent an das Proteinmolekül durch jeden beliebigen, organischen Linkerrest, der mit einer Seitenkette einer oder mehrerer Aminosäurereste in dem Proteinmolekül reagieren kann, gebunden werden.
- Geeignete Kopplungsmittel, die verwendet werden können, um Proteine zu modifizieren, um kovalent chelatbildende Mittel daran zu binden und die bevorzugt verwendet werden, wenn man Proteine mit einem Technetiumion, beispielsweise Tc-99m, markieren möchte, können mit den allgemeinen Formeln
- beschrieben werden, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Gruppe, ausgewählt aus Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Arylen mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen und Alkarylen mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen, wobei jede dieser Gruppen mit einer oder mehreren Hydroxyl-, Alkoxy-, Carboxy- oder Sulfonatgruppen substituiert sein kann, stehen, n entweder für 1 oder 2 steht, AA unabhängig voneinander Reste von α- oder β-Aminosäuren der Formel -NH-R"-CO- sind, worin R" für einen organischen Rest steht, in Bindung aneinander durch Amidbindungen, i für eine ganze Zahl von 2 bis 6 steht, und X eine aktivierende Gruppe ist, die eine Amidbindung mit einer ε-Aminogruppe oder einem aminoterminalen Ende des Proteins oder Polypeptids bilden kann. Bevorzugt wird X aus Halogen, Natrium, Sulfosuccinimidoyl, N&sub3;,
- ausgewählt.
- Im folgenden sind beispielhaft einige Kopplungsmittel der Formel III aufgeführt, die verwendet werden können, um ein Protein zu modifizieren, um kovalent ein chelatbildendes Mittel an das Protein zu binden:
- Im folgenden sind beispielhaft Kopplungsmittel der Formel IV aufgeführt, die verwendet werden können, um ein Radionuclidmetallion an die ε-Aminogruppe des Antikörpers zu heften.
- Das Kopplungsmittel der Formel III kann durch Umsetzen einer Verbindung der Formel X-OH mit einer Carbonsäure der Formel
- R&sub1;- -S-(CH&sub2;)n- -(AA)i- OH V
- unter Bedingungen, die zur Veresterung der Carboxylgruppe führen, hergestellt werden. Die Verbindung der Formel V ihrerseits, kann aus dem Polypeptid H(AA)iCO&sub2;H hergestellt werden. Das Polypeptid wird mit einem Chloracylchlorid, beispielsweise Chloracetylchlorid, unter Bildung einer Verbindung der Formel
- Cl-(CH&sub2;)n- -(AA)i- OH VI
- umgesetzt.
- Die Verbindung der Formel VI kann mit einer Verbindung der Formel
- Na-S- -R&sub1;
- unter Bildung der Verbindung der Formel V hergestellt werden.
- Nur zur näheren Erläuterung der oben beschriebenen Reaktionssequenz zur Herstellung einer Verbindung der Formel V wird auf das folgende Schema zur Herstellung von S-Benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycin verwiesen:
- Das S-Benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycinat kann dann beispielsweise mit Natrium-N-hydroxysulfosuccinimid unter Bildung einer Verbindung der Formel III, d.h. Natriumsulfosuccinimidoyl-(S-benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycin) umgesetzt werden. Ein analoges Reaktionsschema unter Verwendung von Natriumthioacetat anstelle von Natriumthiobenzoat führt zu Natrium-sulfosuccinimidoyl-(-S-acetylmercaptoglycylglycylglycinat).
- Die Kopplungsmittel der Formel IV können durch Umsetzen einer Verbindung der Formel X-OH mit einer Carbonsäure der Formel
- hergestellt werden.
- Die Herstellung einer Carbonsäure der Formel VII wird anhand des folgenden beispielhaften Reaktionsschemas näher erläutert:
- Ein Kopplungsmittel der Formel III oder IV kann mit einer ε-Aminoseitenkette jedes Proteins, wie beispielsweise eines Antikörpers oder eines Fragments davon, umgesetzt werden, um ein chelatmodifiziertes Protein, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, zu ergeben.
- Weitere Verfahren zur Modifizierung von Proteinen durch Einführen exogener, chelatbildender Gruppen über kovalente Bindung sind in der veröffentlichten U.K.-Patentanmeldung GB 2 109 407 beschrieben.
- Die oben beschriebenen Kopplungsmittel dienen nur der näheren Erläuterung von solchen, die verwendet werden können, um exogene, chelatbildende Gruppen an Proteine zu binden, um modifizierte Proteine zu ergeben, die erfindungsgemäß nützlich sind.
- Jedoch kann jedes andere Protein (ausgenommen ein Antikörperkonjugat der Formel
- worin Ab für den Rest eines Fab'-Fragments eines monoklonalen Antikörpers steht, wobei der Antikörper einer ist, der die antigenbindende Aktivität nach enzymatischer Entfernung des Fc-Fragments und reduktiver Spaltung der Disulfidbindung, die die schweren Ketten verknüpft, beibehält; R ein divalenter Linker ist; und R' eine Gruppe ist, die ein Radionuklidmetallion chelatisieren kann), das eine kovalent gebundene, exogene, chelatbildende Gruppe enthält, verwendet werden, jedoch mit der Maßgabe, daß die exogene, chelatbildende Gruppe eine stärkere Affinität für das Metallion als Tiron besitzt.
- Das Metallion, mit dem das Protein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konjugiert werden kann, kann aus Indium, Gallium, Technetium und Isotopen davon ausgewählt werden.
- Das spezielle Metallion, das verwendet wird, hängt von der gewünschten Endverwendung des Metallion/Proteinkonjugats ab. Radioisotope verschiedener Metalle sind nützlich für diagnostische und therapeutische Anwendungen. Beispielsweise sind γ-strahlende Radionuklidmetallionen, wie beispielsweise Indium-111, Gallium-67 und Technetium-99m bevorzugt, wenn das entstandene Konjugat in der diagnostischen Szintigrafie zur Tumordetektion verwendet werden soll.
- Wenn das Metallion/Proteinkonjugat für die in vivo Detektion oder Behandlung von Tumoren verwendet werden soll, ist das verwendete Protein üblicherweise ein Antikörper (oder ein Fragment davon) gegen eines der Antigene, die als Tumormarker bekannt sind, wie beispielsweise das carcinoembryonale Antigen (CEA), das α-Fetoprotein, das Humanchoriongonadotropin oder dessen β-Untereinheit, das colonspezifische Antigen-p und das tumorspezifische Glycoprotein.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das chelatderivatisierte Protein mit einem Metallionentransferkomplex einschließlich Tiron und des Metallions umgesetzt. Der Transferkomplex wird durch Umsetzen von Tiron üblicherweise in Form dessen Dinatriumsalzes mit dem Metallion in einem wäßrigen Medium unter Bedingungen gebildet, unter denen Metallionen bekanntlich in Lösung stabil sind, d.h. sie präzipitieren nicht aus der Lösung als ihre Hydroxide. Für Indium-111 und Gallium-67 beispielsweise wird das Chloridsalz des Metalls in einem wäßrigen Medium bei einem pH < 3,5 umgesetzt.
- Die Reaktion zwischen dem Protein, das kovalent an das exogene, chelatbildende Mittel gebunden ist, und dem Metallionentransferkomplex wird in einem wäßrigen Reaktionsmedium bei einem pH, bei dem das Protein stabil ist, durchgeführt. Unter "stabil" wird verstanden, daß das Protein löslich bleibt und seine biologische Aktivität beibehält. Normalerweise ist der bevorzugte pH-Wert für die Reaktion der physiologische pH, d.h. von etwa 5 bis 8. Der Metallionentransferkomplex und das Protein werden inkubiert, bevorzugt bei Raumtemperatur von etwa 20ºC bis etwa 60ºC, am bevorzugtesten von etwa 20º C bis etwa 37º C, eine ausreichende Zeitspanne lang, um den Transfer des Metallions von dem Tiron auf die exogene, chelatbildende Gruppe auf dem Protein zu erlauben. Im allgemeinen ist eine Reaktionszeit von weniger als 1 h ausreichend, um die Reaktion zu beenden. Das mit dem Metallion markierte Protein kann nach üblichen Techniken zur Proteingewinnung, wie beispielsweise Hochdruckflüssigkeitschromatografie, wiedergewonnen werden.
- Im Falle von Tc-99m ist es vorteilhaft, eine elektrolytische Reduktion des Metallions, begleitend mit der Bildung des Metallionentransferkomplexes, durchzuführen. Technetium liegt bekanntlich in sieben Oxidationsstufen vor, wobei +7 wie in Pertechnetat (TcO&sub4;&supmin;) am stabilsten ist. Die Stufe +5 ist sehr nützlich zum Markieren von chelatderivatisierten Proteinen, die in der diagnostischen Szintigrafie verwendet werden sollen. Jedoch ist Tc&spplus;&sup5; metastabil und wird leicht zu Tc&spplus;&sup4; reduziert und als reduziertes/hydrolysiertes TcO&sub2; in Gegenwart eines Überschusses an Reduktionsmittel eingefangen. Reduziertes/hydrolysiertes Technetium ist zur Markierung von Proteinen nicht nützlich, weil es eine Tendenz zur Selbstassoziation oder zur unspezifischen Bindung an Oberflächen besitzt. Wenn stöchiometrische Mengen an Reduktionsmittel verwendet werden, ist die Reduktion kinetisch sehr ineffizient. Das so gebildete Tc&spplus;&sup5; besitzt eine Tendenz, zu Pertechnetat, sobald das Reduktionsmittel verbraucht ist, zu reoxidieren..
- Während die elektrolytische Reduktion von Technetium bevorzugt ist, kann die Reduktion auch unter Verwendung chemischer Reduktionsmittel, wie sie üblicherweise im Zusammenhang mit Technetium verwendet werden, wie beispielsweise SnCl&sub2; oder Na&spplus;BH&sub4;&submin; durchgeführt werden.
- Es wurde gefunden, daß wenn Tiron als Transferligand mit reduziertem Technetium verwendet wird, das Technetium leicht in der Oxidationsstufe +5 gehalten werden kann und bei Entfernung des Reduktionsmittels nicht reoxidiert. Ein technetiumhaltiger Transferkomplex kann dadurch hergestellt werden, daß man eine Pertechnetatverbindung, beispielsweise Na99mTcO&sub4; und Tiron als das Dinatriumsalz in ein wäßriges Medium in einem geschlossenen Gefäß gibt. Der Kopfraum in dem Gefäß wird dann mit einem inerten Gas, wie beispielsweise Argon gespült, und das Technetium wird elektrolytisch, begleitend mit der Bildung des Transferkomplexes, reduziert. Die elektrolytische Reduktion kann durch Einführen einer Zirconiumelektrode in das wäßrige Medium und Leiten einer ausreichenden Menge an Strom durch das Medium zur Durchführung der Reduktion, typischerweise etwa 100 Milliampere für 2 min erzielt werden. Der entstandene Transferkomplex kann zur Markierung eines chelatderivatisierten Proteins mit Technetium in der Oxidationsstufe +5 verwendet werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur hochwirksamen und selektiven Markierung des Proteins an der Stelle der exogenen, chelatbildenden Gruppe. Tiron transferiert das Metallion nicht auf schwächere, endogene, chelatbildende Gruppen an dem Protein.
- Die folgenden Beispiele sollen die Durchführung der vorliegenden Erfindung näher erläutern und ihren Umfang in keiner Weise beschränken. Beispiele I und II sind Vergleichsbeispiele. Die in den Beispielen verwendeten Materialen wurden wie folgt hergestellt.
- Ein monoklonaler Anti-CEA-Maus-Antikörper wurde aus Ascitisflüssigkeit durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Präzipitation und Ionenaustauschchromatografie gereinigt. Enzymatische Fragmentierung des intakten Antikörpers unter Bildung von F(ab')&sub2; wurde durch Verwendung eines thiolfreien, voraktivierten Papains gemäß Parham, et al., J. Immunol. Methods, 53:133-173 (1982) erzielt. Das gereinigte F(ab')&sub2;- Fragment wurde durch schrittweise Säulenchromatografie über Whatman DE-52 und Sephadex G-100-Harze erhalten. Denaturierende Gelelektrophorese (SDS- PAGE) zeigte, daß das isolierte Protein reiner als 95 % war.
- Es wurde bestimmt, daß das F(ab')&sub2;-Fragment, das durch Papainspaltung des monoklonalen Anti-CEA-Antikörpers erzeugt worden war, eine Disulfidbindung zwischen den Ketten hatte, welche die zwei schweren Ketten verknüpfte. Diese Bestimmung wurde durch Reduktion des F(ab')&sub2;-Antikörperfragments mit Dithiothreit (DTT) unter milden Reduktionsbedingungen zur Aufbrechung der Disulfidbindung zwischen den Ketten, welche die zwei schweren Ketten verknüpfen, ebenso wie der Disulfidbindungen zwischen den Ketten, welche die schweren und leichten Ketten verknüpfen, während die Disulfidbindungen in den Ketten intakt gelassen wurden, durchgeführt. Die reduzierten Fragmente wurden dann mit ³H-NEM umgesetzt - ³H-NEM reagiert mit den freien Sulfhydrylgruppen - und auf SDS-Polyacrylamidgel laufengelassen, was zu Banden entsprechend den schwerden und leichten Ketten jeweils mit tritiierten freien Sulfhydrylgruppen führte. Das Gel wurde auf Protein angefärbt, mit einem Fluorophor getränkt, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt, um die relative Intensität in den Banden der schweren und leichten Kette zu bestimmen. Die fluorgetränkten Banden wurden ausgeschnitten und auf einen Szintillationszähler gelegt. Unter Verwendung der Counts pro Minute für die Bande der leichten Kette als Maßeinheit für eine Sulfhydrylgruppe wurde gefunden, daß die schwere Kette zwei Sulfhydryle enthält, wovon eines der Disulfidbindung mit der leichten Kette zwischen den Ketten entspricht6. Folglich entspricht die andere Sulfhydrylgruppe einer einzelnen Disulfidbindung zwischen den Ketten zwischen den schweren Ketten des F(ab')&sub2;-Fragments, das mittels Papainspaltung des ganzen CEA-Antikörpers gebildet wurde.
- Die F(ab')&sub2;-Fragmente, die durch Papainspaltung des ganzen monoklonalen Anti-CEA-Antikörpers gebildet worden waren, wurden 1 bis 2 h bei Raumtemperatur in einem Puffer mit einem pH von etwa 7,4 mit einer Endkonzentration von 5 bis 20 mM DTT reduziert.
- Das reduzierte Anti-CEA-Fab'-Protein, das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erzeugt worden war, wurde von überschüssigem Thiolreagenz unter N&sub2;-Atmosphäre durch erschöpfenden Pufferwechsel in 50 mM MES, 2 mM Na&sub2;EDTA, pH 6,5 bis 6,8, unter Verwendung einer Diafiltration mit einer PM10-Membran befreit. Ein Aliquot der entstandenen Lösung wurde mit ³H-NEM mit bekannter spezifischer Aktivität zur Bestimmung, der Anzahl der freien SH-Gruppen pro Fab'-Molekül, die durch das Reduktionsverfahren gebildet worden waren, titriert. Der Rest wurde mit 10 bis 25 mM des Kopplungsmittels, das nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, d.h. [((7-Maleimidoheptyl)-imino)bis-(ethylennitrilo)]- tetraessigsäure 2 bis 4 h bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4ºC umgesetzt.
- Ein Antikörper-Radionuklidkonjugat wurde durch Zugabe von 10 ul ¹¹¹InCl&sub3; (etwa 50 bis 100 uCi) in 50 mM HCl (Rad-Pharm) zu 5 ul 10 mM Tiron, 4 mM HCl, pH 2,4, und 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur hergestellt. Danach wurden dann 10 ul 200 mM MES, pH 6,0 und 10 ul 2 bis 15 mg/ml des Konjugats des Anti-CEA-Fab' und des Chelatkopplungsmittels, welches gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, zugesetzt. Der End-pH betrug zwischen 5,0 und 5,5. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur inkubiert; danach wurden 2 bis 5 ul auf einem Celluloseacetatstreifen zur elektrophoretischen Analyse getüpfelt. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 50 mM Hepes, pH 7,0, als Elektrodenpuffer durchgeführt. In dem elektrophoretischen Feld blieb das ¹¹¹-In-chelatisierte Anti-CEA-Fab'-Konjugat am Ursprung und nicht-umgesetztes Indium-111 wanderte als separater Peak. In einer separaten Elektrophorese wurden 7 ul des chelatkonjugierten Reaktionsgemisches zuerst mit 2 ul 200 mM Na&sub2;EDTA, pH 6,0, vor der Elektrophorese inkubiert. Die Zugabe der EDTA verursachte einen Shift des nicht-umgesetzten Tiron- Indium-111-Peaks, aber beeinflußte den Chelatkonjugatpeak nicht, was anzeigte, daß das chelatisierte Antikörperkonjugat stabiler als das ¹¹¹In-Tironchelat war. Eine Zusammenstellung dieser Ergebnisse ist in Fig. 1 dargestellt.
- Das Anti-CEA-Fab'/Indium-111-Konjugat kann intravenös in Form einer physiologisch annehmbaren, gepufferten Lösung zur Verwendung als tumorabbildendes Mittel, beispielsweise zur Abbildung von Tumoren des Kolons unter Verwendung bekannter Fotoscanningtechniken verabreicht werden.
- 10 ul Ga-67 (10 mCi/ml in 50 mM HCl) wurde mit 5 ul 10 mM Tiron in je sechs metallfreien Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Der pH des Gemisches wurde mit 10 ul 200 mM MES-Puffer, pH 6,0, gepuffert. In die drei Röhrchen wurden dann entweder (a) 10 ul 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, (b) 10 ul 7,7 mg/ml ganzer monoklonaler Anti-CEA-Antikörper oder (c) 10 ul 6 mg Anti-CEA-Fab' kovalent gebunden an [5-Maleimidopentyl-(ethylendinitrilo)]-tetraessigsäure gegeben. Die Inhalte der Röhrchen wurden bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert. Nach der Inkubationsspanne wurden 7 ul aus dem jeweiligen Röhrchen entnommen und mit 2 ul 0,2 M Ethylendiamintetraessigsäure bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert. Die Proben wurden dann mittels Celluloseacetatelektrophorese, wie in Beispiel I beschrieben, analysiert.
- Die Wanderungsmuster nach der Elektrophorese zeigten, daß das Ga-67 durch Tiron an das Anti-CEA-Fab', welches eine kovalent gebundene, chelatbildende Gruppe enthält, transferiert worden war. Ferner wurde das Ga-67, das an das Anti-CEA-Fab' auf diese Weise gebunden worden war, durch EDTA nicht extrahiert. Zum Vergleich zeigten die Elektrophoresemuster, daß Ga-67 durch EDTA aus dem Tiron/Ga-67-Transferkomplex extrahiert wurde; kein Ga-67 wurde auf den ganzen Antikörper (ohne die kovalent gebundene, chelatbildende Gruppe) transferiert, der mit Tiron/Ga-67 inkubiert worden war.
- Die Verwendung von Tiron als Transferligand für Tc-99m wurde mit der Verwendung von carboxylierten Zuckern, d.h. Glucoheptonat, Gluconat und Saccharat, verglichen. Carboxylierte Zucker waren die am häufigsten verwendeten Transferliganden für Tc-99m. Drei Parameter wurden untersucht: die Fähigkeit des Transferliganden Technetium als einzelnen, homogenen Komplex einzufangen, die Stabilität des Transferkomplexes gegen die Inkubationszeit und die Transferierbarkeit von Technetium von dem Liganden auf einen chelatsubstituierten Antikörper.
- Tabelle 1 zeigt die Fähigkeit mehrerer carboxylierter Zucker und Tiron Technetium in einem transferierbaren Oxidationszustand während der elektrolytischen Reaktion einzufangen. Glasröhrchen zur elektrolytischen Reduktionsreaktion enthielten je 50 mg eines jeweiligen Testliganden, 1 ml Wasser, das mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung auf pH 7,0 eingestellt war und 1 ml Pertechnetat aus einem Technetiumgenerator. Die Röhrchen wurden versiegelt und mit Argon 5 min lang gespült. Zwei Zirkoniumelektroden (2,0 mm Durchmesser) wurden in das Röhrchen eingeführt, das Röhrchen umgekehrt, und eine Stromstärke von 100 mA bei 10 Volt wurde durch die Lösung 2 min lang geleitet. Die Bildung des Tc-99m-Ligandenkomplex wurde unter Verwendung der aufsteigenden Papierchromatografie in Acetonitril, Wasser (60:40) und anschließendes Scanning des Radiochromatogramms überwacht. Jeder der drei carboxylierten Zucker konnte die kontinierliche Reduktion von Technetium nicht verhindern, so daß zwischen 24 bis 30 % der Radioaktivität in den TcO&sub2;-Radiochromatogramm-Peak erschien. Tiron fing 78 % des Technetiums als homogenen Peak ein, und nur 5,3 % der Radioaktivität wurden weiter zu TcO&sub2; reduziert. Die fortgesetzte, elektrolytische Reduktion des Tiron-Technetiumkomplexes führte zu keiner weiteren Akkumulation von TcO&sub2;. Tabelle 1 Relative Effizienz verschiedener Transferliganden, reduziertes Technetium einzufangen Ligand Komplex Reduziert-Hydrolysiert Glucoheptonat Gluconat Saccharat Tiron * % der Gesamtradioaktivität des Radiochromatogramms
- Tabelle 2 vergleicht die Stabilität des Technetiumkomplexes von Tiron oder Saccharat gegen die Inkubationszeit. Tc-99m-Tiron und Tc-99m- Saccharat wurden, wie oben gezeigt, hergestellt. Saccharat zeigt einen progressiven Verlust des komplexierten Technetiums von 69,8 % auf 51,1 % mit begleitendem Ansteigen an reduziertem, hydrolysiertem Technetium von 15,9 % auf 30,4 % im Verlauf der 5-stündigen Inkubationsperiode. Der Tironkomplex zeigte nur geringe Veränderungen im Verlauf der gleichen Zeitspanne. Tabelle 2 Relative Stabilität von Tc-Tiron und Tc-Saccharat gegen Zeit Saccharat Zeit (h) Komplex Tiron
- Fig. 2 zeigt die Transferierbarkeit von Technetium von einem Tironkomplex auf Antikörperfragmente in Kopplung mit entweder S-Acetylmercaptoglycylglycylglycinat (Ac-MAG&sub3;) oder 2,3-Bis-(Acetylmercaptoacetamido)-propionat (Ac-CO&sub2;DADS). Die elektrolytische Reduktion von Pertechnetat in Anwesenheit von Tiron, wie oben bezeichnet, führte zu einer nahezu quantitativen Komplexbildung (89,2 %). Aussetzung dieses Komplexes gegenüber entweder Ac-MAG&sub3; oder Ac-CO&sub2;DADS substituierter F(ab')&sub2;-Fragmente führte zum Transfer von 86,3 % und 88,2 % des Technetiums auf die jeweiligen Antikörper. Jedoch bei Aussetzung gegenüber acetylsubstituiertem F(ab')&sub2; erschienen nur 6 % des Technetiums am Ursprung des Radiochromatogramms. Somit überführt der Tiron-Technetiumkomplex Technetium nur auf Antikörper mit starken Chelaten und nicht auf Antikörper, die in ähnlicher Weise mit nicht-chelatbildenden Gruppen acyliert sind.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus einem
Protein oder Polypeptid (ausgenommen ein Antikörperkonjugat
der Formel
worin Ab für den Rest eines Fab'-Fragments eines
monoklonalen Antikörpers steht, wobei der Antikörper einer ist, der
nach enzymatischer Entfernung des Fc-Fragments und
reduktiver Spaltung der Disulfidbindung, die die schweren Ketten
verbindet, die antigenbindende Aktivität beibehält; R für
einen divalenten Linker steht; und R' für eine Gruppe steht,
die ein Radionuklidmetallion chelatieren kann) und einem
Metallion, ausgewählt aus Indium, Gallium, Technetium und
Isotopen davon, dadurch gekennzeichnet, daß man
einen Metallionentransferkomplex, umfassend ein Chelat von
4,5-Dihydroxy-m-benzoldisulfonsäure oder einem Salz davon
und dem Metallion mit dem Protein oder Polypeptid umsetzt,
wobei das Protein oder Polypeptid kovalent an eine exogene
chelatbildende Gruppe gebunden ist, wobei die exogene
chelatbildende Gruppe eine größere chelatbildende Affinität
als 4,5-Dihydroxy-m-benzoldisulfonsäure für das Metallion
besitzt, wobei die Reaktion in einem wässrigen Medium bei
einem pH, bei dem das Protein oder Polypeptid stabil ist,
durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein oder Polypeptid ein
Antikörper oder ein Fragment davon (ausgenommen ein
Fab'-Fragment davon) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein oder Polypeptid ein
Antikörper davon gegen ein tumorassoziiertes Antigen oder ein
Fragment eines solchen Antikörpers (ausgenommen ein Fab'-
Fragment davon) ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein oder Polypeptid ein
Antikörper gegen ein karzinoembryonales Antigen oder ein
Fragment eines solchen Antikörpers (ausgenommen ein
Fab'-Fragment davon) ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Metallion aus In-111,
Ga-67 und Tc-99m ausgewählt wird.
6. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats eines
Proteins oder Polypeptids (ausgenommen ein Antikörperkonjugat
der Formel
worin Ab für den Rest eines Fab'-Fragments eines
monoklonalen Antikörpers steht, wobei der Antikörper einer ist, der
nach enzymatischer Entfernung des Fc-Fragments und
reduktiver
Spaltung der Disulfidbindung, die die schweren Ketten
verbindet, die antigenbindende Aktivität beibehält; R für
einen divalenten Linker steht; und R' für eine Gruppe steht,
die ein Radionuklidmetallion chelatieren kann) und einem
Technetiumion, dadurch gekennzeichnet, daß
man
(a) 4,5-Dihydroxy-m-benzoldisulfonsäure und
Pertechnetationen in einem wässrigen Reaktionsmedium umsetzt;
(b) elektrolytisch die Pertechnetationen in dem
Reaktionsmedium von Stufe (a) auf eine Oxidationsstufe unter +7
reduziert; und
(c) das Chelat des reduzierten Technetiums, welches in den
Stufen (a) und (b) gebildet worden ist, mit dem Protein
oder Polypeptid umsetzt, wobei das Protein oder
Polypeptid kovalent an eine exogene chelatbildende Gruppe
gebunden ist, wobei die exogene chelatbildende Gruppe eine
größere chelatbildende Affinität als 4,5-Dihydroxy-m-
benzoldisulfonsäure für die Technetiumionen besitzt,
wobei die Reaktion in einem wässrigen Medium bei einem pH,
bei dem das Protein oder Polypeptid stabil ist,
durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Technetiumion Tc-99m ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein oder
Polypeptid kovalent an eine exogene chelatbildende Gruppe durch
Umsetzen mit einem Kopplungsmittel der Formel
oder
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und jeweils
für eine Gruppe ausgewählt aus Alkylen mit 1 bis 6
Kohlenstoffatomen, Arylen mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen und
Aralkylen mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen stehen, wobei jeder
dieser Reste durch eine oder mehrere Hydroxyl-, Alkoxy-,
Carboxy- oder Sulfonatgruppen substituiert sein kann; n
entweder 1 oder 2 bedeutet; AA unabhängig voneinander Reste von
α- oder β-Aminosäuren der Formel -NH-R"-CO- bedeuten, worin
R" für einen organischen Rest, der jeweils durch
Amidbindungen gebunden ist, steht; i für eine ganze Zahl von 3 bis 6
steht; und X eine aktivierende Gruppe bedeutet, die eine
Amidbindung mit einer ε-Aminogruppe oder einem
aminoterminalen Ende des Proteins oder Polypeptids bilden kann, gebunden
worden ist.
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