DE69126124T2

DE69126124T2 - Polymere träger zur freisetzung kovalent gebundener wirkstoffe

Info

Publication number: DE69126124T2
Application number: DE69126124T
Authority: DE
Inventors: Diana Brixner; Ananthachari Srinivasan; Vivekananda Vrudhula
Original assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2011-09-28
Also published as: ATE152917T1; AU8730691A; EP0510132B1; DE69126124D1; EP0510132A4; US5549883A; WO1992005802A1; EP0510132A1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind chemisch definierte polymere Träger, die vorteilhafte Eigenschaften für in vivo-Abbildung und Therapie bereitstellen. Die polymeren Träger bestehen aus α-Aminosäuren, die Seitenketten enthalten, welche kovalent gebunden sind an (i) diagnostische und therapeutische Moleküle und (ii) chelatbildende Mittel, die in der Lage sind, diagnostische oder therapeutische Radionuclide zu binden.

2. Verwandtes Fachgebiet

Es wurden monoclonale Antikörper entwickelt, die sich aufgrund ihrer hohen Spezifität und Affinität für Antigene auf Tumorzelloberflächen in Krebsgewebe konzentrieren. Diese Entwicklung hat für den Fall, daß solche Antikörper an diagnostische oder therapeutische Agentien gebunden werden können, die Aussicht auf klinische Anwendungen erhöht. Die hohe Spezifität der Antikörper macht sie zu wünschenswerten Kandidaten als Targeting-Moleküle, die zielgerichtet diagnostische oder therapeutische Agentien zu einer Krebsstelle bringen.
Leider schwächt die direkte Bindung derartiger Agentien an einen Antikörper dessen Immunreaktivität. Jegliche Derivatisierung des Antikörpers schwächt seine Immunreaktivität. Deshalb ist ein Antikörper mit mehreren Bindungen an diagnostische oder therapeutische Agentien ein Antikörper mit niedriger Spezifität. Augenblicklich werden chelatbildende Mittel, die an diagnostische und therapeutische Radionuclide binden, direkt an Antikörper gebunden. Dies verhindert die kontrollierte Freisetzung des Radionuclides von Antikörpern. Aufgrund der großen Größe des Antikörpermoleküls ist es unter Verwendung konventioneller Nachweisverfahren schwierig, die exakte Art der Bindungen des chelatbildenden Mittels zum Antikörper zu bestimmen und die Anzahl der chelatbildenden Mittel, die an den Antikörper gebunden sind, zu bestimmen. Das Fehlen derartiger genauer Information stellt für den Erhalt einer Zulassungsgenehmigung für chelatbildende Mittel ein Problem dar. Zulassungsbehörden fordern, daß für alle Substanzen, die Gegenstand ihrer Genehmigung sind, Informationen vorhanden sein müssen, die die Struktur der Substanz, die in den Körper eingeführt werden soll, eindeutig identifizieren.
Beispiele für chelatbildende Mittel können in Journal of Controlled Release, 1(4), 1985, Amsterdam NL, W.A.R., van Heeswijk et al. und USP 4543211 gefunden werden. Der Artikel offenbart Poly(α-L-glutaminsäure) (PGA), die mit Aminosäure und Oligopeptid-Spacern verknüpft ist und deren Carboxylsäureseitenketten kovalent über eine Amidbindung oder über eine kovalente Bindung unter Verwendung eines Oligopeptid-Spacers zwischen den Seitenketten und dem Mittel an Adriamycin, ein therapeutisches Mittel, gebunden sind.
In USP 4543211 wird ein Konjugat beschrieben, umfassend ein Immunglobin, ein Targeting-Molekül und ein Peptidpolymer (Poly-L-glutaminsäure), das cytotoxische Substanzen, d.h. therapeutische Mittel, kovalent an die Polymerseitenketten gebunden hat. Das Peptidpolymer ist an das Targeting-Molekül über eine Carbonylgruppe am Aminoterminus des Peptidpolymeren gebunden.
Was benötigt wird, ist ein Ansatz, der ein Targeting-Molekül, wie z.B. einen Antikörper, an einer minimalen Anzahl an Stellen derivatisiert, um größere Mengen an diagnostischen und therapeutischen Verbindungen zu tragen. Ebenso notwendig ist ein Ansatz, mit dem die Art der Bindung des chelatbildenden Mittels an den Antikörper und die Anzahl der an den Antikörper gebundenen chelatbildenden Mittel bestimmt werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt einen chemisch definierten polymeren Träger bereit und umfaßt insbesondere einen chemisch definierten polymeren Träger, umfassend eine Reihe von α-Aminosäuren in beliebiger Kombination, die Seitenketten enthalten, an die Mittel kovalent über spaltbare Linker entweder direkt gebunden sind oder kovalent über spaltbare Linker nach chemischer Modifikation der Seitenketten gebunden sind und der durch die Formel wiedergegeben wird:
worin
PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;
AA eine α-Aminosäure ist;
SG eine Spacer-Gruppe ist, die durch eine Verhinderung der sterischen Hinderung durch am C-terminalen Ende des Trägers befestigte Mittel eine effiziente Bindung des C-terminalen Endes des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül fördert;
CG eine Konjugationsgruppe ist, die zur Bindung des C-terminalen Endes des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül nützlich ist;
MITTEL ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel oder ein chelatbildendes Mittel mit der Fähigkeit zur Bindung diagnostischer oder therapeutischer Radionuclide ist;
n einen Wert von 2 bis etwa 18 hat;
m einen Wert von 2 bis etwa 18 hat;
r den Wert 0 oder 1 hat; und
s den Wert 0 oder 1 hat.
Er umfaßt eine Reihe von α-Aminosäuren in beliebiger Kombination, die Seitenketten enthalten, an die diagnostische/therapeutische und chelatbildende Mittel kovalent über spaltbare Linker gebunden werden können. Die Mittel können kovalent an die Seitenketten durch spaltbare Linker entweder direkt gebunden werden oder kovalent an die Seitenketten über spaltbare Linker nach chemischer Modifikation der Seitenketten gebunden werden. Hydrazon, Disulfid und Esterbindungen können in jeder Kombination im polymeren Träger zwischen den Seitenketten der α-Aminosäuren und der Mittel vorhanden sein. Die Auswahl einer speziellen kovalenten Bindung zwischen der Seitenkette und dem Mittel im polymeren Träger wird durch die funktionelle Gruppe in der α-Aminosäureseitenkette und die reaktive funktionelle Gruppe im Mittel bestimmt. Die α-Aminosäuren mit Seitenketten, an die Mittel nicht kovalent binden, können als Spacer dienen, um die Interaktion zwischen den voluminösen Molekülen, die an den polymeren Träger gebunden sind, auf ein Mindestmaß zu reduzieren. Außerdem können die α-Aminosäuren mit geladenen oder hydrophilen Seitenketten, an die Mittel nicht kovalent binden, zu einer erhöhten Löslichkeit zum polymeren Träger führen.
N-terminale Schutzgruppen, die für den polymeren Träger möglich sind, schließen alle Standard-Aminschutzgruppen ein. C-terminale Konjugationsgruppen, die für die Bindung des polymeren Trägers an das Targeting-Molekül möglich sind, schließen alle Konjugationsgruppen, die dem Fachmann bekannt sind, ein. Um eine effiziente Bindung des polymeren Targeting-Moleküls zu ermöglichen, ist im polymeren Träger zwischen den α-Aminosäuren und der Konjugationsgruppe eine Spacer-Gruppe vorhanden. Die Spacer-Gruppe verhindert jegliche sterische Hinderung der Bindung durch jedes am C-terminalen Ende des Trägers befestigte Mittel. Bei diesen Spacer-Gruppen handelt es sich um terminale Aminosäuren, wie z.B. γ- Aminobuttersäure (Aba). In Abwesenheit der Konjugationsgruppe kann die Spacer-Gruppe, z.B. Aba durch seine Carboxylgruppe, den polymeren Träger an das Targeting-Molekül binden.
Die Peptide, die den polymeren Träger bilden, werden, ausgehend von α-Aminosäuren durch konventionelle Lösungsverfahren oder durch Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Diese Peptide wurden so modifiziert, daß sie derivatisierte diagnostische/therapeutische Mittel tragen sowie chelatbildende Mittel, die an diagnostische und therapeutische Radionuclide binden. Diese Mittel können entweder an der Zielstelle oder nach der Internalisierung durch die Zelle freigesetzt werden.
Aus der Erfindung folgen viele Vorteile. Der polymere Träger kann eine maximale Anzahl von Mittel tragen, während ein Targeting-Molekül an einer minimalen Anzahl an Stellen derivatisiert ist. Dadurch wird die biologische Aktivität des Targeting-Moleküls in einem hohen Maße erhalten, auch dann, wenn es an multiple Mittel gebunden ist. Als Beispiel ist bei einem Antikörper die Spezifität um so höher, je weniger Bindungen es gibt.
Die Rate, in der Mittel von dem polymeren Träger, der an das Targeting-Molekül gebunden ist, freigesetzt werden können, wird durch Manipulation der Art der kovalenten Bindungen im polymeren Träger kontrolliert. Z.B. werden durch Änderung der Stabilität der kovalenten Bindungen oder durch Verwendung unterschiedlicher Typen kovalenter Bindungen an einem polymeren Träger Mittel in gemischter Rate freigesetzt. Dies ist von besonderer Wichtigkeit, wenn die Erkrankung die Verwendung von Diagnostika oder Therapeutika während längerer Zeiträume erfordert.
Multiple Mittel, die die gleichen oder unterschiedlich sein können, werden an den polymeren Träger gebunden. Es können nicht nur die gleichen Mittel in einer gemischten Rate freigesetzt werden, sondern verschiedene Mittel können in gemischter Rate an der gleichen Zielstelle freigesetzt werden.
Der polymere Träger mit seinen kovalent gebundenen Mitteln ist ein relativ kleines Molekül im Vergleich zu dem Targeting-Molekül. Deshalb können konventionelle Nachweisverfahren die genaue Natur der Bindung des Mittels an das Targeting-Molekül vorbestimmen, bevor der polymere Träger daran gebunden wird. Zusätzlich können Radiomarkierungsverfahren die genaue Anzahl der polymeren Träger, die an das Targeting-Molekül gebunden sind, bestimmen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein Fließschema, das das allgemeine Verfahren zur Synthese eines polymeren Trägers mit gebundenen Mitteln und die Konjugation des polymeren Trägers an einen Antikörper darstellt.
Fig. 2 ist ein Fließschema, welches ein Verfahren zur Synthese eines polymeren Trägers mit gebundenen therapeutischen Mitteln und die Konjugation des polymeren Trägers an einen Antikörper zeigt.
Fig. 3 stellt die Entfernung von Schutzgruppen von Aminosäureseitenketten eines polymeren Trägers dar.
Fig. 4 und 6 sind Fließschemata, welche Verfahren zur Synthese von polymeren Trägern mit gebundenen chelatbildenden Mitteln und die Konjugation des polymeren Trägers an Antikörper zeigen.
Fig. 5 ist ein Fließschema, welches ein Verfahren zur Synthese eines chelatbildenden Mittels darstellt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein chemisch definierter polymerer Träger, welcher die Beladung von diagnostischen/therapeutischen und chelatbildenden Mittel an Targeting-Moleküle steigert. Der polymere Träger umfaßt eine Reihe von 2 bis etwa 18 α-Aminosäuren in jeder Kombination, die Seitenketten einschließen, die über spaltbare Linker kovalent an Mittel binden können. Die Anzahl der Mittel, die durch spaltbare Linker kovalent an den polymeren Träger gebunden sind, kann von 2 bis etwa 18 betragen. Diese Anzahl wird durch die Anzahl der α-Aminosäureseitenketten im polymeren Träger bestimmt, die für kovalente Bindungen durch spaltbare Linker an die Mittel verfügbar sind.
Der Begriff "polymerer Träger", wie er in der Erfindung verwendet wird, bedeutet einen Peptidträger. Die α-Aminosäuren, deren Seitenketten nicht kovalent an Mittel gebunden sind, können als Spacer für den polymeren Träger dienen. Diese Spacer verringern jede nichtgebundene Interaktion zwischen Mitteln, die an modifizierte α-Aminosäuren gebunden sind. Zusätzlich zur Wirkung als Spacer können diese α-Aminosäuren mit geladenen oder hydrophilen Seitenketten, die nicht kovalent an Mittel gebunden sind, eine erhöhte Löslichkeit zum polymeren Träger verleihen.
Der polymere Träger schließt ggf. eine Schutzgruppe an seinem N- terminalen Ende und ggf. eine Konjugationsgruppe an seinem C-terminalen Ende ein. Die Konjugationsgruppe ermöglicht es dem polymeren Träger sich selbst an ein Targeting-Molekül zu binden. Eine Spacer-Gruppe wird zwischen die α-Aminosäuren und die Konjugationsgruppe plaziert, um die Bindung des polymeren Trägers an das Targeting-Molekül zu erleichtern. Die Spacer-Gruppe verhindert jegliche sterische Hinderung an die Bindung durch jegliche am C-terminalen Ende des Trägers befestigte Mittel. Zusätzlich kann die Spacer-Gruppe, eine terminale Aminosäure, den polymeren Träger an das Targeting-Molekül ohne die Anwesenheit der Konjugationsgruppe binden. Das kann dadurch stattfinden, daß die Carboxylgruppe der terminalen Aminosäure mit funktionellen Gruppen des Targeting-Moleküls zur Reaktion gebracht wird; dadurch entstehen kovalente Bindungen, wie z.B. Ester- oder Amidbindungen.
In polymeren Trägern sind α-Aminosäuren, die Seitenketten besitzen, welche die Polarität und damit die Wasserlöslichkeit fördern, wünschenswert. Man nimmt an, daß die gesteigerte Wasserlöslichkeit weiterhin zu einer erniedrigten hepatobilären Aufnahme von radiomarkierten polymeren Trägerproteinen beiträgt. Die α-Aminosäuren, die Ketten enthalten, welche die Wasserlöslichkeit fördern, beinhalten solche mit geladenen Seitenketten (Lysin, Arginin, Histidin, Cystein, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Tyrosin, Tyrosin-O-SO&sub3;-) und solche mit hydrophilen Seitenketten (Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin). Standardaminschutzgruppen können für N- terminale Schutzgruppen des polymeren Trägers verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen Acetyl, Propionyl, Phenylacylsulfonyl, substituiertes Phenylacylsulfonyl und andere hydrophile Schutzgruppen.
Eine Konjugationsgruppe ist eine chemisch reaktive funktionelle Gruppe, die mit einem Targeting-Molekül reagiert, um den polymeren Träger daran zu binden. Ist das Targeting-Molekül ein Protein, ist die Konjugationsgruppe unter Bedingungen reaktiv, die das Protein nicht denaturieren oder in anderer Art und Weise negativ beeinflussen. Deshalb ist die Konjugationsgrupe mit einer funktionellen Gruppe auf einem Protein ausreichend reaktiv, so daß die Reaktion in einer im wesentlichen wäßrigen Lösung durchgeführt werden kann und nicht z.B. durch Erhitzen auf hohe Temperaturen, die das Protein denaturieren können, erzwungen werden muß. Beispiele für geeignete Konjugationsgruppen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, aktive Ester, Isothiocyanate, Amine, Hydrazine, Maleimide oder andere Michael-Typ-Akzeptoren, Thiole und aktivierte Halogenide. Unter den bevorzugten aktiven Estern sind N-Hydroxysuccinimidylester, Sulfosuccinimidylester, Thiophenylester, 2,3,5,6-Tetrafluorphenylester und 2,3,5,6-Tetrafluorthiophenylester. Die letzen drei bevorzugten aktiven Ester können eine Gruppe an der para- (d.h. 4) oder der ortho-Position des Phenylringes umfassen, die die Wasserlöslichkeit fördert. Beispiele solcher Gruppen sind CO&sub2;H, SO&sub3;-, PO&sub3;²&supmin;, OPO&sub3;²&supmin;, OSO&sub3;&supmin;, N&spplus;R&sub3;, wobei jedes R H oder eine Alkylgruppe und O(CH&sub2;CH&sub2;O)nCH&sub3;-Gruppen ist.
Terminale Aminosäuren, die als Spacer-Gruppen gemäß der Erfindung verwendet werden, schließen Aminocapronsäure, Aminopentansäure, γ-Aminobuttersäure, β-Alanin, Glycin und dgl. ein.
Mittel, die Hydrazide, R(CO)NHNH&sub2; enthalten, reagieren mit α-Aminosäureseitenketten enthaltenden Aldehyden, RCHO, oder Ketonen, R&sub2;(CO), unter Bildung polymerer Träger mit Hydrazonbindungen mit der folgenden Formel:
worin
die Anzahl der α-Aminosäuren in dem polymeren Träger 2 bis etwa 18 Einheiten beträgt;
PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;
SG eine Spacer-Gruppe ist, die durch Verhinderung der sterischen Hinderung durch an das C-terminale Ende des Trägers gebundene Mittel eine effiziente Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül fördert;
CG eine Konjugationsgruppe ist, die zur Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül nützlich ist;
MITTEL von 2 bis etwa 18 Einheiten eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels oder eines chelatbildenden Mittels mit der Fähigkeit zur Bindung diagnostischer oder therapeutischer Radionuclide im polymeren Träger ist;
R gleich H, CH&sub3;, Phenyl oder mit elektronenspendenden und/oder elektronenziehenden Gruppen substituiertes Phenyl ist;
q den Wert 0 oder 1 hat;
r den Wert 0 oder 1 hat; und
s den Wert 0 oder 1 hat.
Hydrazonbildung ist ein effektives Verfahren zur Bindung bestimmter therapeutischer Mittel an monoclonale Antikörper (King et al., Biochemistry, Bd. 25:5774, 1986). Jüngste Arbeiten anf dem Gebiet der therapeutischen Immunkonjugate wandte sich der Hydrazonfunktionalität als einem möglichen spaltbaren Linker zwischen einem chemotherapeutischen Mittel und einem monoclonalen Antikörper zu. Laguzza et al., (J. Med. Chem., Bd. 32:548, 1989) zeigten, daß ein Vinca-Alkaloid an einen Antikörper über eine Hydrazonbindung gebunden werden kann und daß eine pH-Abhängigkeit des Medikaments untersucht werden konnte. Der Hydrazonbindungsansatz beruhte auf der Voraussetzung, daß ein Konjugat, das über einen serumstabilen, jedoch säurelabilen Hydrazon-Linker gebildet wird, dem Zweck dienen würde, das Medikamentenkonjugat an die Tumorstelle zu bringen, und dieses dann langsam als Folge des Kontakts mit der sauren Tumorumgebung freizusetzen (Tannock et al., Cancer Research, Bd. 49:4373, 1989). Diese bedingte Anforderung erforderte das Durchmustern mehrerer Kleinmolekülhydrazone, um deren Stabilität in menschlichem Serum und Acetatpuffer bei einem pH-Wert von 5,6 zu bestimmen.
Das Design des polymeren Trägersystems mit einer Hydrazonbindung nimmt die beobachteten Ergebnisse einer Studie bezüglich kleiner Moleküle mit auf. Peptide bekannter Aminosäuresequenzen werden so konstruiert, daß sie primäre oder sekundäre Hydroxylgruppen tragen (die Kette kann mehr als eine Hydroxyaminosäure (primär oder sekundär)), die zu der Carbonylverbindung oxidiert werden können, tragen.
Die Ergebnisse der Untersuchung kleiner Moleküle zeigen, daß Hydrazone aus aromatischen Aldehyden zu stabil sein können, um nützlich zu sein. Hydrazone, die von aliphatischen Ketonen (in den Peptiden, ausgehend von Threonin und anderen Aminosäuren, die sekundäre -OH-Gruppen enthalten, erzeugt) abgeleitet sind, haben eine Serumhalbwertszeit von 15 bis 20 h. Hydrazone, die von aliphatischen Aldehyden abgeleitet sind (in den Peptiden, ausgehend von Serin, Homoserin und anderen Aminosäuren, die primäre -OH-Gruppen enthalten, erzeugt), haben eine Serumhalbwertszeit von 50 bis 60 h. Hydrazone, die von aromatischen Ketonen abgeleitet sind (in den Peptiden von Phenylserin und substituierten Phenylserinen erzeugt), haben eine Serumhalbwertszeit von 130 h. Durch Auswahl eines Antikörpers oder seines Fragments mit einer Halbwertszeit im menschlichen Serum, die der des Hydrazons ähnlich ist, wird eine maximale Lieferung des Antikörpers oder seines Fragments an den Tumor erwartet. Danach könnte die Freisetzung der therapeutischen Einheit in einer Rate stattfinden, die von der Halbwertszeit des gewählten Hydrazons in der sauren Umgebung des Tumors abhängig ist. Um zu verhindern, daß der polymere Träger möglicherweise vorzeitig degradiert, kann der polymere Träger ausschließlich aus D-Aminosäuren oder einem Gemisch von D- und L-Aminosäuren aufgebaut werden.
Mittel, die Thiole, SH, enthalten, reagieren mit Cysteinseitenketten unter Bildung polymerer Träger mit Disulfidbindungen, welche die folgende Formel haben:
worin
2 bis etwa 18 Einheiten an α-Aminosäuren in dem polymeren Träger sind;
PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;
SG eine Spacer-Gruppe ist, die durch Verhinderung der sterischen Hinderung durch das an das C-terminale Ende des Trägers gebundene Mittel eine effiziente Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül fördert:
CG eine Konjugationsgruppe ist, die zur Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül nützlich ist;
MITTEL von 2 bis etwa 18 Einheiten eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels oder eines chelatbildenden Mittels mit der Fähigkeit zur Bindung diagnostischer oder therapeutischer Radionuclide im polymeren Träger ist;
R H oder CH&sub3; ist;
R' H oder CH&sub3; ist; und
q den Wert 1 oder 2 hat;
r den Wert 0 oder 1 hat; und
s den Wert 0 oder 1 hat.
Die Freisetzungsrate von Mitteln, die über Disulfidbindungen an den polymeren Träger gebunden sind, kann durch das Ersetzen des Wasserstoffs mit α-Alkylgruppen (R,R'=CH&sub3;) vermindert werden.
Mittel, die Hydroxylgruppen enthalten, reagieren mit Asparagin- und Glutaminsäureseitenketten unter Bildung polymerer Träger mit Esterbindungen, wobei die polymeren Träger die folgende Formel besitzen:
worin
2 bis etwa 18 Einheiten an α-Aminosäuren in dem polymeren Träger vorliegen;
PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;
SG eine Spacer-Gruppe ist, die durch Verhinderung der sterischen Hinderung durch an das C-terminale Ende des Trägers gebundene Mittel eine effiziente Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül fördert:
CG eine Konjugationsgruppe ist, die zur Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül nützlich ist;
MITTEL von 2 bis etwa 18 Einheiten eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels oder eines chelatbildenden Mittels mit der Fähigkeit zur Bindung diagnostischer oder therapeutischer Radionuclide im polymeren Träger ist;
q den Wert 0 oder 1 hat;
r den Wert 0 oder 1 hat; und
s den Wert 0 oder 1 hat.
Im allgemeinen wurde die Bindung von Radionuclidmetallen (z.B. M = 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re) an monoclonale Antikörper unter Verwendung eines bifunktionellen chelatbildenden Mittels A durch das folgende Verfahren durchgeführt. Bildung von M-Chelat enthaltendem aktiven Ester B, gefolgt durch Bindung an monoclonale Antikörper, um C zu erhalten, entsprechend dem folgenden Reaktionsschema: Ak oder Fragment
EOE bezieht sich auf eine Ethoxyethylschutzgruppe. COOTFP bezieht sich auf 2,3,5,6-Tetrafluorphenylester. Das obige Chelat ist ein N&sub3;S-Derivat, und N&sub2;S&sub2;-Derivate folgen einem ähnlichen Verfahren. Zwischen dem Chelat und dem Antikörper ist eine Kohlenstoffkette an die α-Aminogruppe des Antikörpers gebunden. Nachdem der Metabolismus in verschiedenen Organen stattfindet, wird der Hauptmetabolit D im Darm und in der Niere zurückgehalten und wird nicht ausgeschieden, entsprechend der folgenden Reaktion:
Diese Retention interferiert mit der Abbildung im unteren Abdominalbereich und führt zu hohen Dosen in der Niere während der Therapie. Es wurde gefunden, daß das Vorhandensein eines spaltbaren Linkers zwischen dem Chelat und dem Antikörper (Verbindung F, hergestellt aus E) metabolisiert wlrd und gemäß dem folgenden Reaktionsschema zur Bildung von G, das keine Retention im Darm und eine niedrige Retention in der Niere zeigt, führt:
Die Beobachtung, daß der spaltbare Linker im obigen Reaktionsschema metabolisiert wird, führt zur Anheftung der Hydroxygruppen der folgenden Verbindungen an die Asparagin- und Glutaminsäureketten unter Bildung von Esterbindungen im polymeren Träger:
Der resultierende polymere Träger kann mehr als ein Radionuclidmetall pro Bindung an den Antikörper oder des Fragment tragen und bietet den Vorteil eines Metaboliten, der über das renale System entfernt werden kann, anstatt, daß er im Darm zurückgehalten wird.
Verbindung H gehört zu den N&sub3;S-Typ-Chelaten und J und K gehören zum N&sub2;S&sub2;-Chelatsystem. Die THP- (Tetrahydropyranyl) und Acm- (Acetamidomethyl) Gruppen werden als Schwefelschutzgruppen verwendet.
Das Targeting-Molekül ist jedes Molekül, das dazu dient, den polymeren Träger mit angefügten diagnostischen/therapeutischen oder chelatbildenden Mitteln an eine gewünschte Zielstelle (z.B. Zielzelle) in vitro oder in vivo zu liefern. Ohne auf diese beschränkt zu sein, schließen Beispiele von Targeting-Molekülen Steroide, Cholesterin, Lymphokine und die Medikamente und Proteine ein, die an eine gewünschte Zielstelle binden.
Das Targeting-Molekül kann ein Targeting-Protein sein, das in der Lage ist, an eine gewünschte Zielstelle zu binden. Der Begriff "Protein", so wie er hier verwendet wird, schließt Proteine, Polypeptide und Fragmente davon ein. Das Targeting-Protein kann an einen Rezeptor, ein Substrat, eine antigene Determinante oder an eine andere Bindungsstelle auf einer Zielzelle oder einer anderen Zielstelle binden. Das Targeting-Protein dient dazu, das Mittel, das daran durch den polymeren Träger gebunden ist, an eine gewünschte Zielstelle in vivo zu liefern. Ohne auf diese beschränkt zu sein, schließen Beispiele für Targeting-Proteine Antikörper und Antikörperfragmente, Hormone, fibrinolytische Enzyme und Modulatoren biologischer Antworten ein. Zusätzlich sind in der Definition des Begriffs "Targeting-Proteine" in der hier verwendeten Weise andere Moleküle, obwohl es sich bei ihnen im strengen Sinn nicht um Proteine handelt, eingeschlossen, die sich in vivo an einer gewünschten Zielstelle konzentrieren. Z.B. können bestimmte Kohlenhydrate oder Glykoproteine erfindungsgemäß verwendet werden. Die Proteine können modifiziert werden, z.B. um Varianten und Fragmente davon herzustellen, solange die gewünschte biologische Eigenschaft (z.B. die Fähigkeit, an die Zielstelle zu binden) erhalten bleibt. Die Proteine können unter Verwendung veschiedener Verfahren aus dem Bereich des Genetic Engineering oder Protein- Engineering modifiziert werden.
Unter den bevorzugten Targeting-Proteinen sind Antikörper, am meisten bevorzugt monoclonale Antikörper. Es wurde eine Anzahl von monoclonalen Antikörpern entwickelt, die an einen spezifischen Zelltyp binden einschließlich monoclonaler Antikörper, die für tumorassoziierte Antigene im Menschen spezifisch sind. Unter den vielen derartigen monoclonalen Antikörpern, die verwendet werden können, befinden sich Anti-TAC oder andere Interleukin-2-Rezeptor-Antikörper; 9.2.27 und NR-ML-05, die mit dem 250 Kilodalton menschlichen melanom-assoziierten Proteoglykan reagieren; und NR-LU-10, der mit einem Pankarzinom-Glykoprotein reagiert. Der Antikörper, der erfindungsgemäß verwendet wird, kann ein intaktes (ganzes) Molekül, ein Fragment davon oder ein funktionelles Äquvialent davon sein. Beispiele von Antikörperfragmenten sind F(ab')&sub2;, -Fab', Fab und Fv-Fragmente, die mit Hilfe von konventionellen Verfahren oder durch Genetic oder Protein-Engineering hergestellt werden können.
Proteine enthalten eine Vielzahl von funktionellen Gruppen; z.B. Carboxylsäure (COOH) oder freie Amine (-NH&sub2;)-Gruppen, welche für eine Reaktion mit einer geeigneten Proteinkonjugationsgruppe an einen polymeren Träger für die Bindung des polymeren Trägers an das Targeting- Protein verfügbar sind. Z.B. reagiert ein aktiver Ester am polymeren Träger mit Epsilon-Aminogruppen von Lysinresten von Proteinen unter Bildung von Amidbindungen. Alternativ kann ein Targeting-Molekül und/oder ein polymerer Träger derivatisiert werden, damit zusätzliche reaktive funktionelle Gruppen exponiert oder angeheftet werden. Die Derivatisierung kann das Anheften von jeglichem Linker einer Anzahl von Linkermolekülen beinhalten, wie z.B. diese, welche von Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, verfügbar sind. (Siehe Pierce 1986-87 General Catalog, S. 313-54.) Alternativ kann die Derivatisierung die chemische Behandlung des Proteins (das ein Antikörper sein kann) beinhalten. Verfahren zur Erzeugung freier Sulfhydrylgruppen auf Antikörpern oder Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt. (Siehe US-PS Nr. 4 659 839). Maleimidkonjugationsgruppen auf polymeren Trägern sind mit den Sulfhydryl-(thiol)-gruppen reaktiv.
Alternativ kann die Derivatisierung, wenn das Targeting-Molekül ein Kohlenhydrat oder Glykoprotein ist, die chemische Behandlung des Kohlenhydrates, z.B. Glykolspaltung des Zuckerteils eines Glykoprotein-Antikörpers mit Periodat zur Erzeugung freier Aldehydgruppen beinhalten. Die freien Aldehydgruppen des Antikörpers können mit freiem Amin oder Hydrazinkonjugationsgruppen an polymeren Trägern umgesetzt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden therapeutische Mittel (z.B. ein Medikament, therapeutisches Radionuclid oder Toxin) an den chemisch definierten polymeren Träger gebunden. Vorzugsweise werden multiple therapeutische Mittel (welche gleich oder verschieden sein können) an den polymeren Träger gebunden. Beispielhafte therapeutische Mittel schließen Toxine und Medikamente ein. Erfindungsgemäß beinhalten bevorzugte Toxine Holotoxine, wie z.B. Abrin, Ricin, Modecin, Pseudomonas Exotoxin A; Diphtheria Toxin, Pertussistoxin und Shigatoxin; und A-Ketten oder "A- kettenähnliche" Moleküle, wie Ricin A, Abrin A-Kette, Modecin A-Kette, den enzymatischen Anteil des Pertussistoxins, den enzymatischen Anteil des Shigatoxins, Gelonin, Kernesbeeren-antivirales Protein, Saporin, Gerstentoxin und Schlangengiftpeptide.
Beispielhafte Medikamente beinhalten Daunomycin, Adriamycin, Vinblastin, Doxorubicin, Bleomycin, Methotrexat, 5-Fluoruracil, 6-Thioguanin, Cytarabin, Cyclophosphamid und ähnliche konventionelle Chemotherapeutika (siehe z.B. Cancer: Principles and Practices of Oncology, 2. Aufl., V.T. DeVita, Jr., S. Hellman, S.A. Rosenberg, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, 1985, Kapitel 14). Weitere andere bevorzugte Medikamente, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören zu der Tricothecenfamilie, wobei Roridin A besonders bevorzugt ist. Experimentelle Medikamente können ebenfalls für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet sein (siehe z.B. NCI Investigational Drugs Pharmaceutical Data 1987, NIH- Veröffentlichung Nr. 882141, überarbeitet November 1987).
Erfindungsgemäß werden radiomarkierte Moleküle an den chemisch definierten polymeren Träger gebunden. Vorzugsweise wird eine multiple Anzahl radiomarkierter Moleküle (die gleich oder unterschiedlich sein können) an den polymeren Träger gebunden.
Radionuclidmetallchelate sind ein Typ an radiomarkierten Molekülen, die verwendet werden können. Viele chelatbildende Verbindungen verschiedener Strukturen wie auch Verfahren für deren Synthese und Radiomarkierung zur Herstellung von Radionuclidmetallchelaten sind bekannt. Chelatbildende Verbindungen, umfassend verschiedene Kombinationen an Schwefel, Stickstoff, Sauerstoff und Phosphordonoratomen, können z.B. verwendet werden. Die chelatbildende Verbindung kann z.B. eine Gesamtzahl von vier bis sechs Donoratomen umfassen, die aus Stickstoff und Schwefelatomen ausgewählt werden. Während des Verfahrens der Radiomarkierung werden Bindungen zwischen den Donoratomen und dem Radionuclidmetall gebildet, wodurch ein Radionuclidmetallchelat hergestellt wird. (Eine) chelatbildende Verbindung(en) kann/können während des Syntheseverfahrens in den polymeren Träger inkorporiert werden. Alternativ kann die chelatbildende Verbindung/können die chelatbildenden Verbindungen getrennt synthetisiert werden und nachfolgend an den polymeren Träger gebunden werden.
Ein Typ an chelatbildender Verbindung, der verwendet werden kann, umfaßt zwei Stickstoff- und zwei Schwefeldonoratome und kann daher als eine "N&sub2;S&sub2;"-chelatbildende Verbindung bezeichnet werden. Geeignete N&sub2;S&sub2;- chelatbildende Verbindungen sind in US-PS Nr. 4 897 255 mit dem Titel "Metal Radionuclide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy" beschrieben:
Ein Beispiel von 20 einer N&sub2;S&sub2;-chelatbildenden Verbindung ist wie folgt:
wobei n einen Wert von 1 bis etwa 4 (vorzugsweise 2) hat; jeder R unabhängig von =O und H&sub2; ausgewählt ist; T eine Schwefelschutzgruppe darstellt; und Z einen aktiven Ester oder eine andere reaktive funktionelle Gruppe (welche erfindungsgemäß für die Inkorporation der chelatbildenden Verbindung in dem polymeren Träger nützlich ist) darstellt.
Jede geeignete konventionelle Schwefelschutzgruppe/alle geeigneten konventionellen Schwefelschutzgruppen können an die Schwefeldonoratome der erfindungsgemäßen Verbindungen gebunden werden. Die Schutzgruppen sollten entweder vor oder während der Radiomarkierungsreaktion entfernbar sein. Unter den bevorzugten Schwefelschutzgruppen befinden sich Acm und Hemithioacetalschutzgruppen (EOE, THP), die während der Radiomarkierungsreaktion von der chelatbildenden Verbindung verdrängbar sind.
Die N&sub2;S&sub2;-chelatbildende Verbindung wird vorzugsweise nach Bindung an den polymeren Träger radiomarkiert, um ein Radionuclidmetallchelat der folgenden Formel zu erhalten:
worin P für den polymeren Träger steht, M für ein Radionuclidmetall oder ein Radionuclidmetalloxid steht, und die anderen Symbole, wie oben beschrieben, definiert sind.
Ohne darauf beschränkt zu sein, schließen Radionuclidmetalle, die diagnostisch wirksamen Radionuclide 99mTc und die therapeutisch wirksamen Radionuclide ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup8;&sup6;Re, &sup6;&sup7;Cu, &sup6;&sup4;Cu, ²¹²Pb, ²¹²Bi und ¹&sup0;&sup9;Pd ein. ¹&sup8;&sup6;Re und ¹&sup8;&sup8;Re sind Radionuclidmetalle zur Verwendung gemäß der Erfindung.
Verfahren zur Herstellung dieser Isotope sind bekannt. Molybdän/Technetiumgeneratoren zur Herstellung von &sup9;&sup9;Tc sind kommerziell verfügbar. Verfahren zur Herstellung von ¹&sup8;&sup6;Re schließen die Verfahren, die von Deutsch et al., (Nucl. Med. Biol., Bd. 13:4:465-477, 1986) und Vanderheyden et al., (Inorganic Chemistry, Bd. 24:1666-1673, 1985) beschrieben wurden ein, und ²²²Bi-Verfahren zur Herstellung von ¹&sup8;&sup8;Re wurden von Blachot et al., (Intl. J. of Applied Radiation and Isotopes, Bd. 20:467-470, 1969) und von Klofutar et al., (J. of Radioanalytical Chem., Bd. 5:3-10, 1970) beschrieben. Die Herstellung von ¹&sup0;&sup9;Pd ist in Fawwaz et al., J. Nucl. Med. (1984), 25:796, beschrieben. Die Herstellung von ²¹²Pb und ²²²Bi ist in Gansow et al., Amer. Chem. Soc. Symp. Ser. (1984), 241:215-217 und Kozah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (Januar 1986) 83:474-478, beschrieben.
Die Radiomarkierungsreaktion (für diese N&sub2;S&sub2;-Verbindung und die anderen unten bechriebenen chelatbildenden Verbindungen) wird unter Verwendung konventioneller Verfahren durchgeführt.
Zusätzliche N&sub2;S&sub2;-chelatbildende Verbindungen, umfassend Carboxylsäuresubstituenten/einen Carboxylsäuresubstituenten für verbesserte Bioverteilungseigenschaften sind in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Serial-Nr. 07/367 502 mit dem Titel "Radionuclide Metal Chelates for the Radiolabeling of Proteins" beschrieben.
Beispiele für derartige chelatbildende Verbindungen sind wie folgt:
worin die Symbole T und Z die gleiche Bedeutung, wie oben für die anderen N&sub2;S&sub2;-chelatbildenden Verbindungen beschrieben, haben.
Ein anderer Typ an chelatbildender Verbindung, der verwendet werden kann, umfaßt ein Schwefel- und drei Stickstoffdonoratome und kann daher als eine "N&sub3;S"-chelatbildende Verbindung bezeichnet werden. Geeignete N&sub3;S-chelatbildende Verbindungen schließen diejenigen ein, welche in der europäischen Patentanmeldung Nr. 284 071 und der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/172 004, die beide den Titel "Metal- Radionuclide-Labeled Proteins and Glykoproteins for Diagnosis and Therapy" tragen, beschrieben sind.
Beispiele für N&sub3;S-chelatbildende Verbindungen schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden sieben Verbindungen ein, worin "T" für eine Schwefelschutzgruppe steht und "COOTFP" für eine 2,3,5,6-Tetrafluorphenylestergruppe steht:
Der COOTFP-aktive Ester kann durch andere chemisch reaktive funktionelle Gruppen ersetzt werden.
Andere chelatbildende Verbindungen können verschiedene Kombinationen von Donoratomen haben. Derartige Verbindungen schließen u.a. die N&sub2;S&sub4;-, N&sub2;S&sub3;- und N&sub3;S&sub3;-chelatbildenden Verbindungen ein, die in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/201 134 mit dem Titel "Metal Radionuclide Chelating Compounds for Inproved Chelation Kinetics" beschrieben sind.
Zusätzlich können die oben dargestellten N&sub2;S&sub2;- und N&sub3;S-Verbindungen unterschiedliche Anzahlen an Substituenten umfassen, wie z.B. Carboxylsäuregruppen und von 0 bis 3 Sauerstoffatomen (=O), die an Kohlenstoffatome des Chelatkerns gebunden sind.
Erfindungsgemäß umfassen die chelatbildenden Verbindung spaltbare Linker oder sind daran gebunden. Eine Anzahl von Linkern, die unter definierten Bedingungen spaltbar sind (z.B. bei saurem pH, unter reduzierenden Bedingungen oder in Anwesenheit eines Enzyms, wie z.B. einer Protease) ist bekannt. Die Chelate können daher vom polymeren Träger unter den gewünschten Bedingungen freigesetzt werden.
Geeignete chelatbildende Verbindungen, die eine spaltbare Bindung umfassen, schließen diejenigen ein, die in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/457 480 mit dem Titel "Radiolabeled Proteins for Diagnostic and Therapeutic Use" beschrieben sind, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die US-Anmeldung serial number 07/457 480 beschreibt N&sub2;S&sub2;- und N&sub3;S- chelatbildende Verbindungen, die einen Linker definierter Strurtur umfassen, der in einer chemisch reaktiven funktionellen Gruppe endet. Die Bindung ist an eine Estergruppe, die darin in einer besonderen Orientierung positioniert ist, spaltbar. Beispiele für derartige chelatbildende Verbindungen umfassen die folgenden:
wobei T für eine Schwefelschutzgruppe steht, und Z für eine chemisch reaktive Gruppe (z.B. einen aktiven Ester) steht, die verwendet werden kann, um die chelatbildende Verbindung in den polymeren Träger erfindungsgemäß zu inkorporieren.
Andere Beispiele für radiomarkierte Moleküle, die erfindungsgemäß an den polymeren Träger gebunden werden können, schließen radiohalogenierte Moleküle ein. Beispiele für Moleküle, die Radiohalogene an der meta- oder para-Stellung eines Phenylrings binden, sind im US-Patent Nr. 4 855 153 mit dem Titel "Radiohalogenated Proteins" beschrieben.
Diese Verbindungen können durch die folgende Formel dargestellt werden:.
*X-Ar-R
worin
*X ein Iod-, Brom-, Fluor- oder Astat-Radioisotop ist;
Ar ein aromatischer oder heteroaromatischer Ring ist; und
R eine chemische Bindung oder ein Substituent ist, der eine unverzweigte Kette aus 1 bis 12 Kohlenstoffatomen enthält, die Ar nicht im Hinblick auf eine elektrophile Substitution in der Größenordnung, wie sie durch Hydroxy- oder Aminosubstitution des Rings erzeugt wird, aktiviert. Die Bindung oder der Substituent hat daran eine chemisch reaktive funktionelle Gruppe gebunden, die erfindungsgemäß für die Inkorporation der Verbindung (oder eines nichtradiomarkierten Vorläufers davon) an den polymeren Träger nützlich ist. *I-para-Iodphenylverbindungen (in welchen *I für ein Iodradioisotop steht) kann unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die im allgemeinen die Substitution der Organometallgruppe Sn(n-Bu)&sub3; oder SnMe&sub3; an einer halogenaromatischen Verbindung beinhalten. Durch Halogendemetalisierung wird dann die Organometallgruppe durch ein Halogenradioisotop substituiert. Beispiele für radiohalogenierte Moleküle, die unter Verwendung eines solchen Verfahrens hergestellt werden können, werden durch die folgenden Formeln dargestellt:
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist, Z für eine reaktive funktionelle Gruppe steht und *X für ein Halogenradioisotop steht.
Weitere radiohalogenierte Moleküle, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind in der US-PS Nr. 4 876 081 beschrieben.
Die radiohalogenierten Moleküle umfassen eine Vinylgruppe.
Die radiomarkierten polymeren Träger-Targeting-Moleküle gemäß der Erfindung haben eine Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Verfahren sowohl für in vitro Assays als für in vivo medizinische Verfahren. Die radiomarkierten polymeren Trägermoleküle können intravenös, intraperitonal, intralymphatisch, lokal oder durch andere geeignete Mittel, abhängig von Faktoren, wie dem Typ der Zielstelle, verabreicht werden. Die zu verabreichende Menge wird entsprechend Faktoren, wie dem Radionuclidtyp (z.B. ob es sich um ein diagnostisches oder therapeutisches Radionuclid handelt), dem Verabreichungsweg, dem Typ der Zielstelle(n), der Affinität der Targeting-Moleküle zur interessierenden Zielstelle und etwaiger Kreuzreaktivität des Targeting-Moleküls mit normalen Geweben variieren.
Geeignete Dosierungen können durch konventionelle Verfahren festgesetzt werden und ein Arzt, der auf dem die Erfindung betreffenden Gebiet Fachmann ist, wird in der Lage sein, eine geeignete Dosierung für einen Patienten zu bestimmen. Eine diagnostisch wirksame Dosis beträgt im allgemeinen von etwa 5 bis etwa 35 mCi und typischerweise von etwa 10 bis etwa 30 mCi pro 70 kg Körpergewicht. Eine therapeutisch wirksame Dosis beträgt im allgemeinen etwa 20 mCi bis etwa 300 mCi. Für die Diagnose werden konventionelle nichtinvasive Verfahren (z.B. Gamma-Kameras) verwendet, um die Bioverteilung des diagnostischen Radionuclids zu bestimmen und dadurch das Vorhandensein oder die Abwesenheit der interessierenden Zielstellen (z.B. Tumore) zu bestinmen.
Um die Ester im erfindungsgemäßen polymeren Trägermolekül gegenüber einer Spaltung in den Nieren empfänglicher zu machen, kann ebenfalls ein Mittel, das den pH im Urin anhebt, dem Patienten verabreicht werden. Solche Verbindungen schließen z.B. ein Ascorbatsalz (z.B. Natriumascorbat) oder ein Bicarbonatsalz (z.B. Natriumbicarbonat), die intravenös verabreicht werden können, ein. Das steigern des pH-Werts im Urin auf einen basischen Wert fördert die Spaltung des Esters in Konjugaten oder Kataboliten des Konjugates, die in den Nieren lokalisiert sind. Die Entfernung der freigesetzten Radionuclidmetallchelate aus dem Körper wird dadurch gefördert. Die Verabreichung derartiger Mittel zur Förderung der Ester-Linker-Spaltung in vivo wird in der US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/251 900 beschrieben.
Die vergleichsweise niedrige intestinale Lokalisierung der therapeutischen radiomarkierten polymeren Träger-Antikörper gemäß der Erfindung oder deren Kataboliten ermöglicht erhöhte Dosierungen, da intestinale Gewebe weniger Strahlung ausgesetzt sind. Die Klarheit und Genauigkeit von diagnostischen Bildern ist durch die reduzierte Lokalisierung radiomarkierter polymerer Träger-Antikörper oder deren Kataboliten in normalen Geweben ebenfalls verbessert.
Die obige Offenbarung beschreibt im allgemeinen die vorliegende Erfindung. Ein genaueres Verständnis kann unter Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele, die lediglich zum Zweck der Illustration gegeben werden, erhalten werden.

Beispiel 1

Drei Peptidträger, die 6, 12 und 18 α-Aminosäuren mit unterschiedlichen Seitenkettenhydroxylgruppen enthalten, werden synthetisiert, um die Verwendung von Hydrazonen in kovalenten Bindungen zu Mitteln zu zeigen. Die notwendigen Peptide werden unter Verwendung der Festphasenverfahren von Merrifield (G. Barany und R.B; Merrifield, "The Peptides. Analysis, Synthesis and Biology" E. Gross und J. Meinhofer, Hrg., Academic Press, New York, S. 1-284 (1980), synthetisiert.
Dieses Beispiel beinhaltet zuerst die Synthese von Peptid 1, N- Acetyl-L-seryl-L-aspartyl(β-Otce)-L-seryl-L-threonyl-L-aspartyl-(β-Otce)- L-threronyl-γ-aminobuttersäure. Auf diese folgt die Oxidation der Hydroxylaminosäuren-Seitenkettengruppen in Carbonylgruppen. Diese Carbonylgruppen werden dann mit den Hydrazidgruppen der Mittel kondensiert. Danach erfolgt die Bildung des aktiven Esters am C-Terminus des Peptides. Dieses ermöglicht es, die Peptide oder polymeren Träger mit gebundenen Mitteln mit dem Antikörper zu konjugieren. Das allgemeine Verfahren für die Synthese eines polymeren Trägers mit gebundenen Mitteln und die Konjugation des polymeren Trägers an einen Antikörper ist in Fig. 1 dargestellt. Fig. 2 stellt die Synthese eines spezifischen polymeren Trägers und ein spezifisches Konjugationsverfahren dar.
Die oben genannten Verbindungen werden als C-terminale Carboxylate unter Vewendung von PAM-Harzen, die an die erste C-terminale Aminosäure gebunden sind, synthetisiert (J.M. Stewart und J. Young, "Solid phase peptide syntheses", Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984). Die Synthese erfolgt an einem Applied Biosystems 430 A-Synthetisiergerät unter Verwendung seiner spezifischen Anleitung mit N-Methylpyrrolidon als Kupplungslösungsmittel (Betriebsanleitung. Modell 430 A synthesizer. Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)).
Die bevorzugten Schutzgruppen sind Ser(O-benzyl), Thr(O-benzyl), Glu(O-t-butyl), Glu(O-benzyl), Asp(O-t-butyl) und Tyr(Br-Cbz) (G. Barany und R.B. Merrifield, "The Peptides. Analysis, Synthesis and Biology" E. Gross und Meinhofer, Hrg., Academic Press, New York, S. 1-284 (1980). Die andere bevorzugte Schutzgruppe für Glutamin- und Asparaginsäuren (und andere carboxyltragende Seitenketten) ist der Trichlorethylestertrichlorethoxycarbonyl für Tyrosin (Tce). Die Anwesenheit dieser Schutzgruppe am Carboxyl von Asp- und Glu-Resten bietet einen Schutz durch die Sequenz der Derivatisierung der Seitenkette, die Bindung des Mittels und die letztendliche Aktivierung der terminalen Carboxylgruppe für die Konjugation an das Targeting-Molekül. Nach der Aktivierung kann(können) die Triethylgruppe(n) durch die Verwendung von Zn-HOAc oder Zn-THF-Phosphatpuffer entfernt werden (R.B. Woodward, K. Heusler, J. Gosteli, P. Naegeli, W. Oppolzer, R. Ramage, S. Ranganathan und H. Vorbruggen, J. Amer. Chem. Soc., 88, 852 (1989) und M.F. Sommelhack und G.E. Heinsohn, J. Amer. Chem. Soc., 94, 5139 (1972)). Nachdem zuerst durch Trifluoressigsäure entblockt wird, wird der N-terminale Rest unter Verwendung von Acetanhydrid acetyliert und letztendlich unter Verwendung von HF von diesem Harz gespalten (siehe Fig. 1).
Die Spaltung von Peptiden vom Harz wird unter Verwendung des Niedrig-Hoch-HF-Spaltungsverfahrens von Tam und Merrifield durchgeführt (J.P. Tam, W.F. Heath und R.B. Merrifield, "SN&sub2; deprotection of synthetic peptides with low concentration of HF in dimethyl sulfide: evidence and application in peptide synthesis." J. Amer. Chem. Soc., 105, 6442 (1983) (Verfahren A) oder in 10:1:1:2 (Volumen) an HF:Anisol:Dimethylsulfid:p- Thiocresol während 1 h bei 5º bis 0ºC. Nach der Spaltung werden die organischen Scavenger vom Harz dreimal mit Ether extrahiert, und die Peptide werden zweimal mit 5 ml Volumen von 20 bis 40 % HOAc/H&sub2;O extrahiert. Nach der Lyophilisierung werden die Peptide auf einer halbpräparativen Vydec LC4-reverse Phasensäule unter Verwendung eines Gradienten von 100 % H&sub2;O-0,1 % TFA bis 40 % H&sub2;O-0,1 % TFA+60 % CH&sub3;CN-0,1 % TFA gereinigt. Sie werden im Hinblick auf die korrekte Aminosäurezusammensetzung und das Molekulargewicht durch FAB-Massenspektroskopie untersucht (T.D. Lee, "Methods of Protein Microcharacterization" J.E. Shively, Hrg. The Humana Press, Clifton, New Jersey, S. 403 (1986)).
Zum Zwecke der Bestimmung der Stöchiometrie der Bindung von Peptiden und modifizierten Peptiden, die therapeutische Moleküle enthalten, ist es notwendig, die entsprechenden C-14-markierten Peptide am N-terminalen Acetylrest herzustellen. Der N-terminale Rest nach dem ersten Deblockieren der N-terminalen Boc-Gruppe wird unter Verwendung von markierten Acetanhydrid acetyliert. Als ein Beispiel werden 10 mg des Peptids mit C-14-Acetanhydrid (1 mCi, 11,3 mCi/mmol) acetyliert; dieses wird zugegeben und mit Harz während 2,5 h geschüttelt. Ein fünffacher molarer Überschuß an Diisopropylethylamin wurde zugegeben, und die N-Acetylierung wurde während 30 min fortgesetzt. Peptidharz, das in 1 inch² Polypropylenbeuteln verschweißt war, wurde mehrere Male mit 4 ml/Beutel Methylenchlorid, 5 % Diisopropylethylamin/Methylenchlorid und letztlich mit 10 % kaltem Acetanhydrid/Methylenchlorid gewaschen, um die Acetylierung zu vervollständigen. Ein Überschuß an markiertem Anhydrid wurde durch nachfolgende Spülschritte mit Methylenchlorid, Dimethylformamid, Isopropanol, Methylenchlorid, Methanol abgewaschen, und das Harz wurde vor der Deblockieren durch die oben beschriebenen Verfahren über Nacht getrocknet.
Um eine mögliche proteolytische Degradation des Peptids oder polymeren Trägers, der an das Targeting-Molekül gebunden ist, im Serum zu vermeiden, sind die N-terminalen Reste oder alle Reste in der D-Konfiguration. Der Konfigurationswechsel des Peptidgerüsts wird die Freisetzungsrate der therapeutischen Moleküle, die an die Seitenkette gebunden sind, nicht verändern. Jedoch kann dieser Wechsel die Immunogenität des Peptidgerüsts der Träger verringern.
Der nächste Schritt beinhaltet eine Moffatt-Oxidation des Peptids 1 in die entsprechende Carbonylverbindung 2. Die Oxidation des Peptids wird unter Verwendung von DMSO, DCC, Pyridintrifluoracetat und Benzol oder Toluol durchgeführt. Die Moffatt-Oxidation ist für die Verbindung 2 bevorzugt, da das Verfahren nicht zu einer Überoxidation der Hydroxylverbindung führt. (Für allgemeine Methoden siehe A.F. Cook und J.G. Moffatt, J. Amer. Chem. Soc., 89, 2697 (1967) und K.E. Pfitzner und J.G. Moffatt, J. Amer. Chem. Soc., 87, 5661 (1965)).
Der nächste Schritt ist die Herstellung (Modifikation) therapeutischer Moleküle durch Wechsel ihrer Alkoholgruppen in Hydrazide und dann das Kondensieren mit modifizierten Peptiden. Die interessierenden therapeutischen Moleküle sind Verrucarin A und Roridin A, die zu der Trichothecengruppe der Antibiotika gehören (B.B. Jarvis und A. Acierto in "Trichothecene Mycotoxicosis: Pathophysiological Effects" Bd. 1. V.R. Beasley, Hrg., CRC Press, Boca Raton, FL, 1989, S. 73-105). Diese Verbindungen mit einem breiten Spektrum biologischer Aktivitäten sind die stärksten C, H und O enthaltenden Syntheseinbitoren. Sie üben ihre Inhibition dadurch aus, daß sie mit dem EF2 am Ribosom interagieren (C.S. McLaughlin, M.H. Vaughen, I.M. Campbell, I.M. Wei und B.S. Hansen "Mycotoxins in Human and Animal Health", J.V. Rodericks, Hrg., Pathotox Publishers, 1977, S. 263-273). Die Strukturen dieser Verbindungen sind unten gezeigt. Verrucarin A (6) und Roridin A (8) wurden in die entsprechenden Succinylhydrazidderivate (7 von 6,9 und 10 von 8) gemäß veröffentlichter Verfahren (R.O. Kollah, "The Chemistry and Biology of Macrocyclic Trichothecenes", Ph.D. Thesis, University of Maryland, 1989; M. Zeng, "Studies in Chemical und Biological Structures of Macrocyclic Trichothecenes", Ph.D. Thesis, University of Maryland, 1989; V.M. Vrudhula, T.M. Comezoglu und A. Srinivasan, Abstract Nr. MEDI 50, ACS National Meeting, Boston, MA, April 1990) umgewandelt.
Eine ähnliche Strategie kann dazu verwendet werden, andere Moleküle von therapeutischem Interesse, die Alkoholfunktionen enthalten, in Hydrazide (nach der Inkorporation von einem Succinylteil) zur Bindung des definierten Polymeren 2 umzuwandeln. Auf ähnliche Art und Weise können Moleküle von therapeutischem Interesse, die eine Carboxylsäurefunktion enthalten, an das definierte Polymer über die Bildung eines Hydrazids gebunden werden. Y = H Verrucarin A 6 Y = CO-(CH&sub2;)&sub2;-CONHNH&sub2; 7 Verrucarin A-O-succinylhydrazid Y = Y' = OH Roridin A 8 Y = CO-(CH&sub2;)&sub2;-CONHNH&sub2;; R' = H 9 (Roridin A-2'-O-succinylhydrazid) Y = H; Y' = CO-(CH&sub2;)&sub2;-CONHNH&sub2; 10 (Roridin A-13'-O-succinylhydrazid)
Verbindung 6 T Verbindung 7
Verbindung 8 T Verbindung 9, Verbindung 10 In Fig. 2, Großring-O-CO-(CH&sub2;)&sub2; = R
Das nächste Verfahren ist die Herstellung des Hydrazons 3 aus der Verbindung 2 und Verrucarin A-hydrazid 7. Zu einer Lösung des Peptids (1 mmol) in Isopropanol werden 5 mmol Verrucarin A-hydrazid (7; 10 mmol) zugegeben, und man läßt die Lösung bei Raumtemperatur während mehrerer Stunden stehen. Die Bildung von Hydrazon wird chromatographisch verfolgt, und Hydrazon wird entweder durch Kristallisation oder durch C-18-Säulenchromatographie isoliert. Das Produkt wird durch NMR und FAB-Massenspektrometrie charakterisiert.
Das Hydrazon, welches sich von Peptid 4 ableitet und die Roridin A- Derivate 9 und 10 werden in ähnlicher Weise hergestellt.
Die nächste Synthese ist die Herstellung des aktiven Esters 4 des Peptids 3 (siehe Fig. 3). Zu einer Lösung des Peptids 3 in DMF aus der obigen Reaktion werden 3 Äquivalente an 2,3,5,6-Tetrafluorphenol und 3 Äquivalente an DCC zugegeben, und die Lösung wird bei Raumtemperatur während 10 bis 12 h gerührt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtration entfernt, und der Rückstand wird chromatographisch aufgetrennt, um das Produkt zu isolieren.
Das Produkt wird in einem Phosphatpuffer, der 10 % Tetrahydrofuran enthält, gelöst, und die Trichlorethylgruppen werden entsprechend dem Verfahren von M.F. Sommelhack und G.E. Heinsohn (J. Amer. Chem. Soc., 94 5139 (1972)) entfernt, um das Peptid oder den polymeren Träger 4 zu erhalten, der die therapeutischen Moleküle und einen aktiven Ester für die Bindung an das Targeting-Molekül enthält.
Der letzte Schritt ist die Konjugation des aktiven Esters 4 an NR- LU-10, um das Konjugat 5 zu erhalten. Der aktive Ester wird mit NR-LU-10 Mäuse-monoclonalem Antikörper kondensiert, der ein Pankarzinom-Antigen erkennt. Der NR-LU-10-Antikörper kann durch andere Proteine oder Fragmente ersetzt werden. Zu einer Lösung des Antikörpers bei einem pH-Wert von 9 bis 9,5 wird eine Lösung des aktiven Esters in 250 mM Bicarbonatpuffer bei einem pH-Wert von 9,3 zugegeben und vorsichtig durch Schütteln gemischt und bei Raumtemperatur während 30 min inkubiert, um die Konjugation des Peptidträgers an den Antikörper zu ermöglichen. Das Konjugat wird in einer Säule gereinigt, die einen DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex- Anionenaustauscher enthält. Alle obigen Reaktionen sind in Fig. 2 gezeigt.
Auf eine ähnliche Weise werden Konjugate aus längerkettigen Peptiden, N-Acetyl-[L-seryl-L-aspartyl(β-Otce)-L-seryl-L-threonyl-L-aspartyl-(β-Otce)-L-threonyl]&sub2;-γ-aminobuttersäure, Peptid 11 und N-Acetyl-L-seryl- L-aspartyl(β-Otce)-L-seryl-L-threonyl-L-aspartyl(β-Otce)-L-threonyl-γ- aminobuttersäure, Peptid 12, hergestellt.
Allgemeine Verfahren zur Ermittlung der Stabilität von Hydrazonen folgen. Vor der Bestimmung der Konjugate werden die Hydrazone, die von den Peptiden 1, 11 und 12 abgeleitet sind, in die freien Säuren 13 bis 15 (siehe Fig. 3) umgewandelt. Für Experimente bezüglich der Stabilität im menschlichen Serum wird das betreffende Hydrazon in frischem menschlichem Serum bei 37ºC in einer Konzentration von 1 mg/ml inkubiert. Aliquots (100 µl) werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (2 bis 150 h) mit gleichen Volumen an Acetonitril verdünnt. Die Suspension wird zentrifugiert, und das Zentrifugat wird durch HPLC im Hinblick auf das Vorhandensein des freigesetzten therapeutischen Medikaments untersucht. Auf eine ähnliche Art und Weise werden die Verbindungen im Hinblick auf ihre Stabilität bei einem pH-Wert von 5,6 getestet.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Bindung von bifunktionellen Chelatligaten an die gewünschte Peptid- oder Polymerkonjugation des Trägers an den Antikörper, gefolgt durch Radiomarkierung.
Die Verfahren in diesem Beispiel sind die Synthese von N-Acetyl-L- tyrosyl (O-CO-CH&sub2;-CCl&sub3;)-L-Asp(β-OtBu)-Glu(γ-OtBu)Gly-Glu(γ-OtBu)-γ-Aba- PAM-Harz 16, die Beseitigung der Schutzgruppen von den Carboxylgruppen in Asp und Glutamylresten unter Verwendung von Trifluoressigsäure, um Peptid 17 zu synthetisieren, die Kondensation eines bifunktionellen Chelats, S- Ethoxyethylmercapto-acetylglycylglycylserintrichlorethylester 24, um 25 zu erhalten, die Spaltung dieses Peptids vom Harz, um 26 zu erhalten, die Aktivierung der terminalen Carboxylsäure, um 27 zu erhalten, die Entschützung (in 28) und die Radiomarkierung, um das Chelat 29 zu erhalten, gefolgt von der Konjugation des Antikörpers, um das Konjugat 30 (siehe Fig. 4) zu erhalten.
Das erforderliche Peptid, N-Acetyl-L-tyrosyl (O-CO-CH&sub2;-CCl&sub3;)-L-Asp- (β-OtBu)-Glu(γ-OtBu)Gly-Glu(γ-OtBu)-γ-Aba-PAM-Harz 16, wird unter Verwendung des Festphasenverfahrens von Merrifield (G. Barany und R.B. Merrifield, "The Peptides. Analysis, Synthesis and Biology" E. Gross und J. Meinhofer, Hrg., Academic Press, New York, S. 1-284 (1980)) synthetisiert. Die Schutzgruppe in jeder Stufe ist eher 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) als die in der Synthese von 1 verwendete N-tBoc-Gruppe. Dieses Verfahren erhält die Schutzgruppe des Glu und Asp (und anderer Aminosäurereste, die eine Carboxylseitenkette tragen). Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe in jeder aufeinanderfolgenden Stufe wird unter Verwendung wäßrigen Piperidins bewerkstelligt. Die Acetylierung wird entsprechend des früher beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Herstellung von am N-terminalen Acetylrest C-14 markierter Peptide. Zum Zwecke der Bestimmung der Stöchiometrie der Bindung von Peptiden und modifizierten Peptiden, die therapeutische Moleküle enthalten, ist es notwendig, die entsprechenden C-14-markierten Peptide herzustellen. Der N-terminale Rest nach der ersten Deblockierung der N-terminalen Fmoc- Gruppe wird unter Verwendung von markiertem Acetanhydrid acetyliert. Als Beispiel werden 10 mg des Peptids mit N-14-Acetanhydrid acetyliert (1 mCi, 11,3 mCi/mmol); dieser wird zugegeben und während 2,5 h mit dem Harz geschüttelt. Ein 5facher molarer Überschuß an Diisopropylethylamin wird zugegeben, und die N-Acetylierung wird während 30 min weitergeführt. Peptidharz, das in 1 inch² Polypropylenbeuteln eingeschweißt war, wurde mehrfach mit 4 ml/Beutel Methylenchlorid, 5 % Diisopropylethylenamin/Methylenchlorid und schließlich mit 10 % kaltem Acetanhydrid/Methylenchlorid gewaschen, um die Acetylierung zu vervollständigen. Überschüssiges markiertes Anhydrid wird vom Harz durch aufeinanderfolgendes Spülen mit Methylenchlorid, Dimethylformamid, Isopropanol, Methylenchlorid, Methanol gewaschen, und das Harz wurde über Nacht vor der Entfernung der t-Boc- Schutzgruppen getrocknet.
Um den möglichen proteolytischen Abbau des Peptidträgers, der an das biologische Makromolekül gebunden ist, im Serum zu vermeiden, liegt der N-terminale Rest oder alle Reste in der D-Konfiguration vor. Der Wechsel der Konfiguration im Peptidgrundgerüst wird die Freisetzungsrate der therapeutischen Moleküle, die an die Seitenkette gebunden sind, nicht ändern. Dieser Wechsel kann auch die Immunogenität des Peptidgrundgerüsts dieser Träger verringern.
Synthese von N-Acetyl-L-Tyr-L-Asp-Glu-Gly-Glu-γ-Aba-PAM-Harz 17. Das Peptid, das immer noch an das Harz gebunden ist, wird unter Verwendung von Trifluoressigsäure (Konversion von t-Butylestern von Glu- und Asp-Resten) in -COOH entschützt, entsprechend dem allgemeinen Verfahren (G. Barany und R.B. Merrifield, "The Peptides. Analysis, Synthesis and Biology" E. Gross und J. Meinhofer, Hrg., Academic Press, New York, S. 1- 284 (1980)).
Die Synthese von S-Ethoxyethylmercaptoacetylglycylgycylserintrichlorethylester 24 (siehe Fig. 5) beinhaltet zuerst die Synthese von N-t- Boc-Serin-O-benzyltrichlorethylester 18. Zu einer Lösung von N-t-Boc- Serin-O-benzylether (5 mmol) in Methylenchlorid, enthaltend 5 mmol Triethylamin, 5 mmol N,N-Dicyclohexylcarbodiimid wurde zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde filtriert, und das Filtrat wurde mit 1 % HCl und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreier Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und verdampft, um den Trichlorethylester zu ergeben, der über einer Silicagelsäule gereinigt wurde.
Serintrichlorethylestertrifluoracetat 19 wird auf die folgende Art und Weise hergestellt. Eine 4 mmol Lösung der obigen Verbindung 18 in 50 ml Eisessig, enthaltend 200 mg Palladium auf Aktivkohle wurde bei 60 psi in einem Paar-Apparat während 10 bis 12 h hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration über Celit entfernt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um N-t-Boc-Serintrichlorethylester, ein Öl, zu erhalten, das über Nacht getrocknet wurde und ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Das Öl wurde mit 10 ml 50 % Trifluoressigsäure-CH&sub2;Cl&sub2; während 3 h bei Raumtemperatur gerührt, um die Boc-Gruppe zu entfernen. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft, mehrfach mit Methylenchlorid zusammen eingedampft und getrocknet, um 19 zu ergeben. Die Verbindung war, wie durch Dünnschichtchromatographie gezeigt wurde, homogen und wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.
S-(1-Ethoxylethyl)mercaptoessigsäure 20 wird wie folgt hergestellt. Eine Lösung von Mercaptoessigsäure (17,4 ml, 250 mmol) in 125 ml Dichlormethan, enthaltend p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,24 g, 1,26 mmol) wurde unter Rühren auf -18 bis -25ºC abgekühlt. Ethylvinylether (23,9 ml, 250 mmol) in 125 ml Dichlormethan wurde zu der kalten Lösung während eines Zeitraums von 90 min tropfenweise zugegeben. Während zusätzlicher 30 min wurde das Rühren weitergeführt, während der die Temperatur im Bereich von -18 bis -25ºC gehalten wurde. Dann wurden 200 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 zugegeben, und man ließ das Reaktionsgemisch unter Rühren während 10 bis 15 min erwärmen. Das Gemisch wurde dann in einen Kolben gegossen, der 900 ml Theylacetat und 200 ml Wasser enthielt. Die Phasen wurden getrennt, und der wäßrige Teil wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert, mit Sole gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Nach der Entfernung des Lösungsmittels verblieben 31,4 g S-(1-Ethoxyethyl)mercaptoessigsäure 20 als farbloses Öl (77 % Ausbeute): ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1,15 (t, J=7, 0 Hz, 3H), 1,52 (d, J=6,4 Hz, 3H), 3,36 (s, 2H), 3,60 (m, 2H), 4,84 (q, J=6,4 Hz, 1H), 11, 65 (s, 1H). Das Material wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
Succinimidyl-S-(1-ethoxyethyl)mercaptoacetat 21 wird gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt. Eine Lösung an S-(1-Ethoxyethyl)mercaptoessigsäure (5,76 g, 35,1 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (4,85 g, 42,1 mmol) wurde in 100 ml wasserfreiem THF hergestellt. Dazu wurde eine Lösung von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (8,70 g, 42,1 mmol) in 65 ml wasserfreiem THF zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 h oder bis die dünnschichtchromatographische Analyse eine vollständige Bildung des Succinimidylesters anzeigte, gerührt. Das Gemisch wurde dann filtriert, und das Filtrat wurde in Vakuum bis zu einem viskosen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, mit Wasser und Sole gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Nach der Entfernung des Lösungsmittels verblieb der rohe Succinimidylester als Öl, das weiter durch Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat- Hexan als Säulenelutionsmittel gereinigt wurde, um 5,1 g an S-(1-Ethoxyethyl)mercaptoessigsäuresuccinimidylester als farbloses Öl zu erhalten (56 % Anubeute): ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1,21 (t, J=7,0 Hz, 3H), 1,58 (d, J=6,4 Hz, 3H), 2,83 (s, 4H), 3,60 (m, 4H), 4,88 (q, J=6,4 Hz, 1H).
Die Synthese von 22 ist wie folgt. Festes NaHCO&sub3; (1,09 g, 13,0 mmol) wurde zu einer Lösung an Glycylglycin (1,22 g, 9,3 mmol) in 10 ml Wasser gegeben. Nachdem die Gasbildung aufhörte, wurde eine Lösung an (2,66 g, 10,2 mmol) in 12 ml an CH&sub3;CN zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Das Gemisch wurde während 22 h bei Raumtemperatur gerührt, dann in Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie auf Silicagel (85:10:5 CH&sub3;CN:H&sub2;O:HOAc) gereinigt, um 2,2 g (86 %) an 22 als viskoses Öl zu erhalten. ¹H NMR (DMSO) 8,26 (t, 1H), 8,08 (t, 1H), 4,80 (q, 1H), 3,73 (m, 4H), 3,52 (m, 2H), 3,24 (s, 2H), 1,43 (d, 3H), 1,10 (t, 3H).
Im folgenden werden Details zu dieser Synthese von 23 angegeben. 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (0,66 g, 3,2 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung von 22 (0,81 g, 2,9 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (0,37 g, 3,2 mmol) in 10 ml CH&sub3;CN zugegeben. Nach Rühren während 2 h wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie auf Silicagel (96:4 EtOAc:HOAc) gereinigt, um 0,80 g (73 %) an 23 als viskoses Öl zu ergeben. ¹H NMR (DMSO) 8,54 (t, 1H), 8,29 (t, 1H), 4,80 (q, 1H), 4,27 (d, 2H), 3,78 (d, 2H), 3,53 (m, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,81 (s, 4H), 1,43 (d, 3H), 1,09 (t, 3H).
Die Synthese von S-Ethoxyethylmercaptoacetylglycylglycylserintrichlorethylester 24 wird auf die folgende Art und Weise (siehe Fig. 5) durchgeführt. Triethylamin (2 mmol) wurde zu einer Lösung an 19 (1,7 mmol) und 23 (1,7 mmol) in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid zugegeben. Nach Rühren während 2,5 h bei Raumtemperatur wurde das Gemisch im Vakuum eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde in Ethylacetat (20 ml) aufgenommen und mit Wasser, gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde über eine C-18-Säulie gereinigt, um reines 24 zu ergeben, das in der Kondensation verwendet wurde.
Die Kondensation von 24 mit den -COOH-Resten von Glu und Asp in 17 erfolgt auf die folgende Art und Weise. Die Feststoffspaltung der Peptide vom Harz wird unter Verwendung des Niedrig-Hoch-HF-Spaltungsverfahrens von Tam und Merrifield (J.P. Tam, W.F. Heath und R.B. Merrifield, "SN&sub2; deprotection of synthetic peptides with low concentration of HJ in dimethyl sulfide: evidence and application in peptide synthesis." J. Amer. Chem. Soc., 105, 6442 (1983)) (Verfahren A) oder in 10:1:1:2 (bezogen auf das Volumen) an HF:Anisol:Dimethylsulfid:p-Thiocresol während 1 h bei 5º bis 0ºC bewerkstelligt. Nach der Spaltung werden die organischen Scavenger vom Harz dreimal mit Ether extrahiert, und die Peptide werden zweimal mit einem Volumen von 5 ml an 20 bis 40 % HOAc/H&sub2;O extrahiert. Nach dem Gefriertrocknen werden die Peptide auf einer halbpräparativen Vydec LC4-reverse-phasen-Säule unter Verwendung eines Gradienten an 100 % H&sub2;O-0,1 % TFA bis 40 % H&sub2;O-0,1 % TFA+60 % CH&sub3;CN-0,1 % TFA gereinigt. Sie werden im Hinblick auf die korrekte Aminosäurezusammensetzung und das Molekulargewicht mittels FAB-Massenspektrometrie analysiert (Ref: T.D. Lee, Methods of Protein Microcharacterization" J.E. Shively, Hrg. The Humana Press, Clifton, New Jersey, S. 403 (1986)).
Im folgenden wird die Herstellung des aktiven Esters 27 der Verbindung 26 gezeigt. Zu einer Lösung des Peptids 26 in DMF aus der obigen Reaktion werden 3 Äquivalente 2,3,5,6-Tetrafluorphenol und 3 Äquivalente DCC gegeben, und die Lösung wird bei Raumtemperatur während 10 bis 12 h gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtration entfernt, und der Rückstand wird chromatographisch aufgetrennt, um das Produkt 27 zu isolieren.
Das Produkt 27 wird in einem Phosphatpuffer, der 10 % Tetrahydrofuran enthält, gelöst, und die Trichlorethylgruppen werden gemäß dem Verfahren von M.F. Sommelhack und G.E. Heinsohn (J. Amer. Chem. Soc., 94, 5139) entfernt; es erfolgt eine Filtration, und der Rückstand wird chromatographisch aufgetrennt, um das Produkt 27 zu isolieren.
Das Produkt 27 wird in einem Phosphatpuffer, der 10 % Tetrahydrofuran enthält, gelöst, und die Trichlorethylgruppen werden gemäß dem Verfahren von M.F. Sommelhack und G.E. Heinsohn (J. Amer. Chem. Soc., 94, 5139 (197Z)) entfernt, um den Peptidträger 28 zu erhalten, der den Chalatbildner, der in der Lage ist, metabolisch stabile Komplexe mit Radionucliden zu bilden, und einen aktiven Ester zur Bindung an das Targeting- Molekül enthält.
Im folgenden wird das Radiomarkierungsverfahren mit ¹&sup8;&sup6;Re gezeigt. Das Peptid, welches den Chelatbildner enthält, wird mit ¹&sup8;&sup6;Re gemäß dem folgenden Verfahren radiomarkiert. Natriumperrhenat, das mit einem W/Re- Generator erzeugt wurde, wird mit Citronensäure (ein bevorzugter Komplexbildner für ¹&sup8;&sup6;Re) und einem Reduktionsmittel (gewöhnlicherweise SnCl&sub2;) kombiniert. Der entstehende ¹&sup8;&sup6;Re-Citrat-Austauschkomplex wird mit der chelatbildenden Verbindung 28 während 10 bis 15 min bei 75º bis 100ºC erhitzt und dann auf ein 0ºC-Eisbad während einiger Minuten gegeben, um das Peptid 29, das ¹&sup8;&sup6;Re-Komplexe an den Seitenketten enthält, zu erhalten.
Die obige Lösung, welche den Chelatbildner enthält, wird aus dem Eisbad entfernt, 2,0 ml 250 mM Natriumbicarbonatpuffer (pH 9 bis 10) werden zugegeben, und das Gefäß wird geschüttelt, um eine Mischung zu erreichen. Sofort wird der Antikörper (ein gesamter Antikörper oder Fragmente) zugegeben und während 10 bis 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Konjugation an den Antikörper zu vervollständigen. Das auf diese Art und Weise hergestellte Konjugat wird unter Verwendung einer Anionenaustauschsäule (DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex), die unter aseptischen Bedingungen hergestellt wurde, gereinigt, um 30 zu erhalten.
In einem ähnlichen Ansatz werden die Peptide 31 und 32 durch ein Festphasenverfahren synthetisiert, und die Antikörperkonjugate 37 und 38 werden hergestellt. Die Zwischenstufen im Falle dieser Oligomersynthesen sind in Fig. 6 gezeigt.

Claims

1. Chemisch definierter polymerer Träger, umfassend eine Reihe von α-Aminosäuren in beliebiger Kombination, die Seitenketten enthalten, an die Mittel kovalent über spaltbare Linker entweder direkt gebunden sind oder kovalent über spaltbare Linker nach chemischer Modifikation der Seitenketten gebunden sind, der durch die Formel:

wiedergegeben wird:

worin PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;

AA eine α-Aminosäure ist;

SG eine Spacer-Gruppe ist, die durch eine Verhinderung der sterischen Hinderung durch am C-terminalen Ende des Trägers befestigte Mittel eine effiziente Bindung des C-terminalen Endes des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül fördert;

CG eine Konjugationsgruppe ist, die zur Bindung des C-terminalen Endes des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül nützlich ist;

MITTEL ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel oder ein chelatbildendes Mittel mit der Fähigkeit zur Bindung diagnostischer oder therapeutischer Radionuklide ist;

n einen Wert von 2 bis etwa 18 hat;

m einen Wert von 2 bis etwa 18 hat;

r den Wert 0 oder 1 hat; und

s den Wert 0 oder 1 hat.

2. Polymerer Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine α-Aminosäure mit einer Seitenkette umfaßt, an die ein Mittel nichtkovalent gebunden ist, das als Spacer funktioniert, um die Wechselwirkung zwischen den an den polymeren Träger kovalent gebundenen Mitteln zu minimieren.

3. Polymerer Träger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine α- Aminosäure mit einer geladenen oder hydrophilen Seitenkette umfaßt, an die ein Mittel nichtkovalent gebunden ist, das dem polymeren Träger eine erhöhte Löslichkeit verleiht.

4. Polymerer Träger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäure mit einer geladenen oder hydrophilen Seitenkette aus Serin, Threonin, Lysin, Arginin, Histidin, Cystein, Asparginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Tyrosin oder Tyrosin-O-SO&sub3; ausgewählt ist.

5. Polymerer Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die N-terminale Schutzgruppe PG aus Acetyl, Propionyl, Phenacylsulfonyl oder substituiertem Phenacylsulfonyl ausgewählt ist.

6. Polymerer Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Spacer-Gruppe SG aus Aminocapronsäure, Aminopentansäure, γ-Aminobuttersäure, β-Alanin oder Glycin ausgewählt ist.

7. Polymerer Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konjugationsgruppe CG aus aktiven Estern, Isothiocyanaten, Aminen, Hydrazinen, Maleimiden oder anderen Akzeptoren vom Michael- Typ, Thiolen oder aktivierten Halogeniden ausgewählt ist.

8. Polymerer Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäuren alle in der L-Konfiguration vorliegen.

9. Polymerer Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäuren alle in der D-Konfiguration vorliegen.

10. Polymerer Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäuren in einer beliebigen Kombination aus D- und L-Konfiguration vorliegen.

11. Polymerer Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäuren kovalent an Mittel durch Hydrazonbindungen, Disulfidbindungen, Esterbindungen oder eine beliebige Kombination davon gebunden sind.

12. Polymerer Träger nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäure AA kovalent über eine Hydrazonbindung an ein Mittel gebunden ist, und daß er durch die Formel:

wiedergegeben wird,

worin PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;

SG eine Spacer-Gruppe ist, die durch Verhinderung der sterischen Hinderung durch an das C-terminale Ende des Trägers gebundene Mittel eine effiziente Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting- Molekül fördert;

CG eine Konjugationsgruppe ist, die zur Bindung des polymeren Trägers an ein Targeting-Molekül nützlich ist;

R H, CH&sub3;, Phenyl oder mit Elektronen spendenden und/oder Elektronen ziehenden Gruppen substituiertes Phenyl ist;

q den Wert 0 oder 1 hat;

r den Wert 0 oder 1 hat; und

s den Wert 0 oder 1 hat.

13. Polymerer Träger nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäure AA kovalent über eine Disulfidbindung an ein Mittel gebunden ist, wiedergegeben durch die Formel:

worin PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;

R H oder CH&sub3; bedeutet;

R' H oder CH&sub3; bedeutet;

q den Wert 1 oder 2 hat;

r den Wert 0 oder 1 hat; und

s den Wert 0 oder 1 hat.

14. Polymerer Träger nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminosäure AA kovalent über eine Esterbindung an ein Mittel gebunden ist, wiedergegeben durch die Formel:

worin PG eine N-terminale Schutzgruppe ist;

q den Wert 0 oder 1 hat;

r den Wert 0 oder 1 hat; und

s den Wert 0 oder 1 hat.

15. Verwendung eines Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Abgabe eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels an einen Patienten.