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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren die für die Erzeugung
von Metall-Ligand-Komplexen nützlich
sind. In einer spezifischen Hinsicht, bezieht sich die Erfindung
auf Metall-markierte Verbindungen, die als Bildgebungswirkstoffe
auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik nützlich sind.
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Stand der
Technik
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Die
Kunst der diagnostischen Bildgebung verwendet Wirkstoffe, die durch
selektives Binden oder Lokalisieren von Stellen innerhalb der Körpers helfen
das Bild von diagnostischem Interesse aufzulösen. Galliumcitrat, zum Beispiel,
hat eine Affinität
für Tumore
und infiziertes Gewebe des Körpers
und kann mit Hilfe der Scanning-Tomographie,
betroffene Körperregionen
dem Arzt offenbaren. Kernspinresonanztomographie differenziert Gewebearten
aufgrund ihrer physicochemischen Eigenschaften und kann deshalb
Gewebe, welches aufgrund von Krankheit physicochemisch verändert sind,
erkennen. Um die Erkennung zu verbessern, werden Bildgebungswirkstoffe
verwendet, welche auf die Rate der Protonenrelaxation von Wassermolekülen im Körper nach
der Bestrahlung mit einem magnetischen Feld, wirken. Typische MRI-Wirkstoffe
weisen wasserlösliche,
nicht toxischen Chelatbildner, welcher mit einem paramagnetischen
Metall, zum Beispiel Gadolinium-Ethylendiamintetraessigsäure (Gd-EDTA),
komplexiert ist. Andere Bildgebungswirkstoffe die in der diagnostischen
Bildgebung verwendet werden, enthalten auf Ziele gerichtete Moleküle, wie
z. B. Proteine, Peptide und Antikörper, welche an gewünschten
Regionen des menschlichen Körpers
lokalisieren und sind mit einem Radionuklidmetall wie z. B. Technetium
und Rhenium markiert. Die Lokalisierung dieser Bildgebungswirkstoffe wird
mit einer Gamma-Kameraanalyse ermittelt.
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Das
Markieren von Bildgebungswirkstoffen mit Metallatomen wird durch
ihre chemische Struktur schwierig gemacht. Herkömmliche Markierungstechniken
schließen
die Bildung des Metallkomplexes in Lösung von überschüssigem Ligand, was üblicherweise
in hohen Konzentrationen an unmarkiertem Ligand resultiert, ein.
Zum Beispiel, ergeben Technetium-Markierungsreaktionen ungefähr einen
markierten Ligand für jede
Tausend oder mehr unmarkierte Liganden. Für viele Bildgebungswirkstoffe,
gibt es eine endliche Anzahl von Bindungstellen, d.h. Rezeptoren,
für welche
sowohl die markierten als auch die unmarkierten Wirkstoffe konkurrieren.
Dies erfordert die Verabreicherung von höheren Dosen des Bildgebungswirkstoffes,
um ein Bild zu erhalten. Derzeit wird Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) verwendet, um. die Konzentration an markiertem Bildgebungswirkstoff
in der Lösung
zu erhöhen,
bevor es verabreicht wird. Obwohl die Konzentration erhöht wird,
erfordert dieser Trennungschritt zusätzliche Zeit und Kosten, die
es für
die klinische Verwendung unpraktisch machen.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung bereitzustellen,
die für
die Erzeugung von markiertem Bildgebungswirkstoff nützlich ist.
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Es
ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren
zum Herstellen von Zusammensetzungen, die für die Herstellung von markiertem
Bildgebungswirkstoff, welcher im Wesentlichen frei von unmarkiertem
Wirkstoff ist, bereitzustellen.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zum
Verwenden von Zusammensetzungen bereitzustellen, um Zubereitungen
an markiertem Bildgebungswirkstoff, der im Wesentlichen frei von unmarkiertem
Bildgebungswirkstoff ist, im speziellen Metall-markierte Verbindungen,
die für
die diagnostische Bildgebung nützlich
sind, herzustellen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung, wird eine Zusammensetzung bereitgestellt,
die für
die Herstellung eines Metall-markierten Bildgebungswirkstoffes nützlich ist,
wobei die Zusammensetzung aufweist: einen festen Träger; eine
Kopplungsgruppe, die an den festen Träger gebunden ist, wobei die
Kopplungsgruppe Dihydropyran oder Maleimid ist; und ein Konjugat,
welches einen Ligand und ein auf ein Ziel gerichtetes Molekül aufweist,
wobei der Ligand ein Schwefelmetall als Koordinationsatom ein schließt und über eine
durch das Metall spaltbare Bindung an die Kopplungsgruppe gekoppelt
ist.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung, wird ein Verfahren für die Herstellung
eines Metall-Ligand-Komplexes bereitgestellt, welches die folgenden
Schritte aufweist:
- (1) Erhalten einer Zusammensetzung
nach dem ersten Aspekt der Erfindung;
- (2) In Kontakt bringen der Zusammensetzung mit dem Metall, um
die Bildung einer Koordinationsbindung zwischen dem Metall und dem
Metall-Koordinationsatom
des Liganden und dadurch die Freisetzung des Metall-markierten Konjugates
von dem Träger
zu bewirken; und
- (3) Sammeln des so freigesetzten Metall-markierten Konjugates.
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Gemäß eines
weiteren Aspekts der Erfindung, wird eine Zusammensetzung bereitgestellt,
die für
die Herstellung eines Metall-markierten Bildgebungswirkstoffes nützlich ist,
wobei die Zusammensetzung aufweist: einen festen Träger; eine
Maleimid-Kopplungsgruppe,
die an den festen Träger
gebunden ist; und einen Ligand, der zumindest ein Metall-Koordinationsschwefelatom
einschließt,
das über
eine durch das Metall spaltbare Bindung an die Kopplungsgruppe gekoppelt
ist.
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Gemäß eines
noch anderen Aspekts der Erfindung, wird ein Verfahren zum Herstellen
eines Metall-markierten Bildgebungswirkstoffes bereitgestellt, wobei
das Verfahren die Schritte aufweist:
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- (1) Erhalten einer Zusammensetzung, welche
aufweist: einen festen Träger;
eine Maleimid-Kopplungsgruppe, die an den festen Träger gebunden
ist; und einen Ligand, der zumindest ein Metall-Koordinationsschwefelatom
einschließt,
das über
eine durch das Metall spaltbare Bindung an die Kopplungsgruppe gekoppelt ist;
- (2) In Kontakt bringen der Zusammensetzung mit dem Metall um
die Bildung einer Koordinationsbindung zwischen dem Metall und dem
Metall-Koordinationsschwefelatom
und dadurch die Freisetzung des Metall-markierten Liganden von dem Träger zu bewirken;
und
- (3) Sammeln des so freigesetzten Metall-markierten Liganden.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 ist
ein schematisches Diagramm, welches die Ladung und Markierung eines
Liganden auf einem Maleimid-funktionalisierten festen Träger darstellt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Mit
der vorliegenden Erfindung, wird das Verfahren zum Herstellen eines
Metall-Ligand-Komplexes durch die Strategie des Koppelns des Liganden
an einen festen Träger über eine
Metall-spaltbare Kopplungsgruppe, vereinfacht. Auf diese Weise resultiert
der einzelne Schritt der Einführung
des Metalls zum immobilisierten Liganden nicht nur in der Bildung
von Metall-Ligand-Komplexen, sondern auch in der nachfolgenden Freisetzung
diese Komplexe vom Träger
für die
Sammlung in einer Form, die im Wesentlichen frei von unkomplexierten
Ligand ist.
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Gemäß eines
Aspekts der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt,
welche für
die Herstellung von Metall-markiertem Bildgebungswirkstoff, die
im Wesentlichen frei von unmarkiertem Bildgebungswirkstoff sind,
nützlich
sind, welche aufweisen: einen festen Träger; eine Kopplungsgruppe,
die an den festen Träger
gebunden ist, wobei die Kopplungsgruppe Dihydropyran oder Maleimid
ist; und ein Konjugat, welches einen Ligand und ein auf ein Ziel
gerichtetes Molekül
aufweist, wobei der Ligand ein Schwefelmetall als Koordinationsatom
einschließt
und über
eine durch das Metall spaltbare Bindung an die Kopplungsgruppe gekoppelt
ist.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung, werden Zusammensetzungen
bereitgestellt, welche für
die Herstellung von Metall-markiertem Bildgebungswirkstoff, die
im Wesentlichen frei von unmarkiertem Bildgebungswirkstoff sind,
nützlich
sind. Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung weisen auf: einen
festen Träger;
eine Maleimid-Kopplungsgruppe, die an den festen Träger gebunden
ist; und einen Ligand, der ein Metall-Koordinations-Schwefelatom,
welches and die Kopplungsgruppe über
eine Bindung gekoppelt ist, welche in der Gegenwart eines Metalls
gespalten wird, aufweist. Die Bindung zwischen der Maleimid Kopplungsgruppe
und dem Metall-Koordinationsatom
des Liganden wird bei der Bildung der Korordinationbindung zwischen
dem Koordinationsatom und dem Metal gespalten.
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Der
Ausdruck „Ligand" bezieht sich auf
eine Verbindung, welche ein Schwefelmetall-Koordinationsatom umfasst, welches in
der Lage ist, eine Koordinationsbindung mit einem gegebenen Metall
zu bilden und dabei einen stabilen Metall-Ligand-Komplex zu bilden.
Ein Ligand kann ein oder mehrere Metall-Koordinationsatome enthalten;
im Fall, wo der Ligand zwei oder mehrere Metall-Koordinationsatome
enthält,
kann er als Chelatbildner bezeichnet werden. Liganden, die zwei
oder mehrere Koordinationsatome enthalten, vielzahnig genannt, bilden üblicherweise
stabilere Metall-Ligand-Komplexe als einzahnige-Liganden und werden
aus diesem Grund bevorzugt. Viele Liganden, die an Radionuklid-Metalle
binden sind vierzahnig, und enthalten eine Kombination von vier
Stickstoff und Schwefel Metall-Koordinationsatomen d.h. N4, N3S und N2S2, können allerdings
andere Metall-Koordinationsatom wie z.B. Sauerstoff, Phosphor und
Selen enthalten. Für
die diagnostische Bildgebung ist es besonders wünschenswert, dass der Metallkomplex
in vivo sehr stabil ist, so dass das Metall nicht in wesentlichen
Mengen vom Ligand freigesetzt wird und im Gewebe akkumuliert. Die
vorliegende Erfindung kann auf eine große Vielfalt von Liganden angewendet
werden, wie z. B. N3S Chelatbildner, die
in der gleichzeitig anhängigen
Anmeldungsnr. WO 9503280, eingereicht am 18 Juli 1994 und N2S2-Chelatbildner, beschrieben
in der gleichzeitig anhängenden
PCT-Anmeldung WO9506633, eingereicht am 31 August 1994, allerdings
sind bevorzugte Liganden Peptide oder Derivate davon, welche eine
anhängende
Sulfhydryl-Gruppe für die Bindung
an ein Metall aufweisen. Geeignete peptidische Chelatoren sind jene,
die in WO9317719 beschrieben sind, welche für die Kopplung an auf Ziele
gerichtete Moleküle
zugänglich
sind, besonders wenn die auf Ziele gerichteten Moleküle ebenfalls
peptidisch sind. In einer Ausführungsform,
wird die Erfindung auf Markierungsliganden angewendet, welche intrinsische
auf Ziele gerichtete Eigenschaften aufweisen. Ein solcher Ligand,
der für
die radiodiagnostische Bildgebung verfügbar ist, ist Mercapto-acetyl-glycyl-glycyl-glycin (MAG3),
welcher in Nierengewebe lokalisiert und gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung markiert werden kann, um Nieren-Bildgebungswirkstoffe
herzustellen. MAG3 ist ein N3S-Klasse Ligand,
welcher drei Stickstoff Koordinationsatome und ein Schwefel-Koordinationsatom
hat.
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Auf
Ziele gerichtete Moleküle,
die für
die Verwendung in Zusammensetzungen der Erfindung geeignet sind,
sind Verbindungen, die in der Lage sind, selektiv in vivo an Stellen
für die
Bildgebung, wie z. B. in einem bestimmten Organ, Gewebe oder Zellart
zu lokalisieren. Beispiele von auf Ziele gerichtete Moleküle schließen Steroide,
Anti körper,
Proteine, und Peptide, Nukleotide und Saccharide ein. Bevorzugte
auf Ziele gerichtete Moleküle
schließen
Proteine und Peptide, insbesondere, jene die in der Lage sind, mit
Spezifität
zu einem Zelloberflächenrezeptor
zu binden, welcher für
eine bestimmte Pathologie charakteristisch ist, ein. Vorzugsweise, sind
auf Ziele gerichtete Moleküle
Peptide oder Derivate davon, welche 3 oder mehr Aminosäurereste
aufweisen, welche an Zelloberflächenrezeptoren
wie z.B. jene die im gleichzeitig anhängenden WO 9503280 (oben) beschrieben
sind, binden. Vorzugsweise, sind auf Ziele gerichtete Moleküle Peptide,
die ungefähr
3 bis 50 Aminosäuren
und noch bevorzugter 3 bis 10 Aminosäuren aufweisen. In einer Ausführungsform,
sind auf Ziele gerichtete Moleküle
chemotaktische Peptide, die an Zelloberflächenrezeptoren binden und im
speziellen, chemotaktische Peptide, die die Aminosäuresequenz
TKPPR einschließen.
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In
dem bestimmten Verfahrensaspekt der Erfindung, wobei der an die
Kopplungsgruppe gekoppelte Ligand weiters mit dem auf ein Ziel gerichteten
Molekül
gekoppelt ist, ist es wünschenswert,
dass das auf das Ziel gerichtete Molekül selbst frei von Metallbindenden
Stellen, wie zum Beispiel anhängende
Sulfhydryl-Gruppen ist. Ein Ligand-auf ein Ziel gerichtetes Molekül-Konjugat,
welches gemäß diesem
bestimmten Verfahren markiert ist, wobei das auf das Ziel gerichtete
Molekül
Metall-Bindungsstellen wie z.B. anhängende Sulfhydryl-Gruppen darstellt,
die in Cystein-Resten gefunden werden, können 1) etwas oder alles von
seiner lokalisierende Aktivität
verlieren und 2) Metall in vivo freisetzen und dadurch das Hintergrundrauschen
erhöhen
und dadurch das Bild unklar werden lassen.
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Liganden
und/oder auf Ziele gerichtete Moleküle, welche peptidisch sind,
sind kommerziell erhältlich oder
können
de novo durch Festphasentechniken oder durch rekombinante DNA Techniken
synthetisiert werden. Festphasenpeptide-Synthese beinhaltet im Allgemeinen
die Verwendung vom automatisierten Synthesizers und einem geeigneten
Träger
als die solide Phase, an welche die C-terminale Aminosäure des
gewünschten
Peptids angehängt
ist. Die Erweiterung des Peptids in die N-terminale Richtung wird
dann durch die schrittweise Ankopplung einer geeigneten geschützten Form
der nächsten
gewünschten
Aminosäure,
unter Verwendung von üblicherweise
FMOC- oder BOC-basierenden chemischen Protokollen, erreicht, bis
die Synthese abgeschlossen ist. Die Schutzgruppen werden dann vom
Peptid abgespalten, üblicherweise
gleichzeitig mit der Abspaltung des Peptids von dem Träger, und
das Peptid wird dann isoliert. Gebräuchliche Reinigungstechniken
beinhalten Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Acetonitril als
Lösungsmittel
und Trifluoressigsäuresäure als
ein Io nen-Paarbildungsreagens. Verfahren sind in zahlreichen Publikationen
beschrieben. Es kann auf Stewart und Young, Solid Phase Peptide
Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford,
Illinois Bezug genommen werden. Alternativ, können Peptide in Lösung oder
an einer festen Phase, in kleinen Abschnitten und nachfolgende Ligation,
um die gewünschte
Sequenz zu ergeben, synthetisiert werden. Peptide, die Aminosäuren, welche
genetisch nicht kodiert sind, beinhalten, erfordern für die Herstellung synthetische
Techniken.
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Der
Ausdruck „fester
Träger" bezieht sich auf
jedes Trägermaterial,
welches in Markierungslösungen unlöslich und
inert ist und mit einer Kopplungsgruppe funktionalisiert werden
kann. Geeignete feste Träger schließen inorganisches
Silikatglass, Quarz, oder Aluminiumoxid-Kügelchen und organisches Polystyrol,
Polyacrylamid oder Zuckerpolymere wie z.B. Sephadex ein. Bevorzugte
feste Träger
der Erfindung sind kommerziell erhältliches Alkylamin-funktionalisiertes
porenkontrolliertes Glass, Agarose, Acrylic und Quarz. Die Aminogruppe
dient als reaktive Stelle für
die Kopplung der Kopplungsguppe an den Träger. Am meisten bevorzugt wird
ein langkettiger Alkylaminoporenkontrollierter Glassträger, welcher
ein weniger sterisch-beeinträchtigtes Koppeln
der Bindungsgruppen ermöglicht.
Der Träger
kann als Pulver oder als in einer Röhre enthaltener Ball oder als
eine Beschichtung innerhalb eines Gefäßes bereitgestellt werden.
Für den
Zweck zur Herstellung Metall-Ligand-Komplexe ist es bevorzugt, dass
der Träger
in einer Säule
ist, die einen einfachen Durchgang, Sammlung, und Filtration der
Komplex-Lösung
ermöglicht.
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Der
Ausdruck „Kopplungsgruppe" bezieht sich auf
eine chemische Einheit, die kovalent an einen Träger oder an funktionalisierte
Gruppen darauf, gebunden werden kann, und die eine Bindung mit einem
Koordinationsatom eines Liganden bilden kann. Die Maleimid oder
Dihydropyran Kopplungsgruppe ist eine, die in der Lage ist, den
Ligand auf einem Träger
in Abwesenheit eines Komplex-bildenden Metalls zu immobilisieren, dennoch
ermöglicht
sie die Freisetzung des Ligand bei der Bildung einer Koordinationsbindung
zwischen dem Schwefelmetall und des Koordiantionsatom des Liganden.
Ein wesentliches Merkmal der Kopplungsgruppe ist, dass sie in ihrer
Gänze an
den Träger
unter Komplex-bildenden Reaktionsbedingungen gebunden bleibt.
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Ein
kommerziell erhältlicher
Alkylamin-Glass-Träger
kann mit einer Thiol-Schutzgruppe,
wie z.B. Dihydropyran Kopplungsgruppe, funktionalisiert werden durch
die Reaktion des Trägers
mit Dihydropyran-Carbonsäure,
welche die Kopplungsgruppe an den Träger über eine Amidgruppe koppelt.
Ein ausgewählter
Ligand kann dann an den Dihydropyran-funktionalisiserten Träger gekoppelt
werden durch Reaktion des Trägers
und des Liganden in der Gegenwart von Dimethylformamid (DMF).
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In
einem besonderen Aspekt, weisen Zusammensetzungen der Erfindung
einen festen Träger,
der mit einer Maleimid Kopplungsgruppe funktionalisiert ist, welche
eine Metall-spaltbare Bindung mit dem Metall-Koordinationsschwefelatom
eines Liganden bildet. Maleimid kann auf verschiedene feste Träger geladen
werden, durch etablierte chemische Techniken, zum Beispiel, erhalten
einer Alkylamin-funktionalisierten Form des Trägers und reagieren mit einem
geeigneten Maleimid-Ester wie z.B. N-Maleimidethylformat oder Maleimidpropionsäure N-Hydroxysuccinimidester
(Sigma). Zu dem Maleimid funktionalisierten Träger kann dann ein ausgewählter Ligand,
der eine anhängende
Sulfhydryl-Gruppe umfasst, durch Reagieren des Trägers mit
dem Ligand in der Gegenwart von Natriumbicarbonat, gekoppelt werden.
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Bedingungen
und Reagenzien für
das Koppeln und Spalten von Metall-spaltbaren Schutzgruppen an Liganden
sind in Greene und Wuts (oben) beschrieben.
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Der
Ausdruck „Metall" oder „Komplex-bildende
Metalle" bezieht
sich auf jedes Metallatom, das in einem Zustand ist, der in der
Lage ist eine stabile Koordinationsbindung mit Metall-Koordinationsatomen
eines Liganden zu bilden. Metalle die in der Lage sind Komplexe
zu bilden, schließen
die Übergangsmetalle,
Lanthanidmetalle, und Actinoidmetalle ein. Für die Verwendung in der Kernspinresonanztomographie
kann das Metall ein paramagnetisches Metallatom wie z.B. zwei- und
dreiwertiges Chrom, Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer, Praseodym,
Neodym, Samarium, Ytterbium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium
und Gadolinium sein. Die noch bevorzugteren Metalle für die MRI
sind jene, die ein starkes magnetisches Moment zeigen, wie z.B.
Gadolinium und Mangan. Die Haloidsalze, im speziellen Chloridsalze,
oder Oxide dieser Metalle sind Formen, die in der Lage sind, mit
einem gewünschten
Ligand zu komplexieren und sind für die vorliegende Erfindung
geeignet. Radionuklid-markierte Bildgebungswirkstoffe verwenden
Metall-Isotope, welche β-Strahler,
wie z.B. Rhenium-186 und -188; und γ-Strahler wie z.B. Technetium-99m
beinhalten. Das am meisten für die
radiodiagnostische Bildgebung bevorzugte Metall ist Technetium-99m
aufgrund seiner vorteilhaften Halbwertszeit von 6 Stunden und seiner
preiswerten Herstellung von einem Molybdän-99-Generator. Die Technetium
und Rhenium-Markierungen werden durch in dem Fachgebiet etablierte
Verfahren erreicht. Jedes Metall kann in den Ligand in wässriger
Lösung
in Oxo, Dioxo oder Nitrido-Form, z.B. Pertechnetat (99mTcO4 –) oder Perrhenat eingeführt werden,
mit einem geeigneten Reduktionsmittel wie z. B. Zinnchlorid. Alternativ,
können
radiodiagnostische Wirkstoffe durch eine Transchelation-Reaktion
gebildet werden, welche die Verwendung des Metalls in der Form eines
schwachen Metallkomplexes zur Folge hat, wie z. B. Technetium-Gluconat,
Heptagluconat, Tartrat oder Zitrat um ein gewünschten markierten Ligand zu
ergeben. Transchelation-Reaktions werden typischerweise erhitzt
um die Umwandlung des Technetiums von dem schwächeren Komplex in einen Komplex
mit einem Ligand zu fördern,
zum Beispiel in einem kochend-heißen Wasserbad.
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Gemäß einem
Verfahren der vorliegenden Erfindung, werden Ligand-auf ein Ziel
gerichtetes Molekül-Konjugate
mit Komplex-bildenden Metallen markiert, um eine Lösung, die
im Wesentlichen frei von unmarkierten Konjugat ist, bereitzustellen.
Im Allgemeinen weist das Verfahren die Schritte auf: das Erhalten
einer Zusammensetzung, in welcher der Ligand des Konjugats kovalent
an einen festen Träger über eine
Metallspaltbare Kopplungsgruppe gekoppelt ist; Einführen eines
Komplex-bildenden Metalls an den Träger; und Sammeln des markierten
Konjugates, welches vom Träger
freigesetzt wird. In diesem Verfahren, bildet das Metall eine Koordinationsbindung
mit dem Metall-Koordinationsatom des Liganden, der an Kopplungsgruppe gekoppelt
ist, dabei wird die kovalente Bindung zwischen dem Ligandatom und
dem Träger
gespalten. Infolge wird nur markiertes Konjugat von dem Träger freigesetzt.
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Gemäß einem
anderen Verfahren der vorliegenden Verbindung, werden Liganden mit
Komplex-bildenden Metallen markiert, um eine Lösung, die im Wesentlichen frei
von unmarkiertem Liganden ist, bereitzustellen. Wie in 1 dargestellt
ist, weist das Verfahren die Schritte auf: das Erhalten einer Zusammensetzung, in
welcher eine Maleimid-Kopplungsgruppe an einen festen Träger und
ein Metal-Koordinations-Schwefelatom eines
Liganden gekoppelt ist. Während
das Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Herstellung von
verschiedenen Metallkomplexen, die ein koordinierendes Schwefelatom
eingebaut haben, verwendet werden kann, ist eine besonders nützliche
Anwendung die Herstellung von diagnostischen Bildgebungswirkstoffen.
In einer besonderen Ausführungsform,
weist das Verfahren der Erfindung weiters den Schritt des Koppelns
des Metall-markierten Liganden mit einem auf ein Ziel gerichteten
Molekül
auf, um ein Konjugat zu bilden. Konjugate können durch die Reaktion eines
Liganden, welcher eine konjugierende Gruppe umfasst, mit einer entsprechenden
reaktiven Gruppe eines auf ein Ziel gerichteten Moleküls gebildet
werden, wobei eine stabile kovalente Bildung gebildet wird. Zum
Beispiel, kann eine Estergruppe des Liganden mit einer Aminogruppe
des auf ein Ziel gerichteten Moleküls oder umgekehrt rea gieren,
um eine Amidbindung zu bilden. Wenn sowohl der Ligand als auch das
auf ein Ziel gerichtete Molekül
Peptide sind, wird das Konjugat vorzugsweise über eine Peptidbindung gebildet.
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In
einer speziellen Ausführungsformn
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wurde eine Peptid Mercaptoacetyl-Glycyl-Glycyl-Glycin
(MAG3) mit Technetiumn-99m markiert, um einen radiodiagnostischen Nieren-Bildgebungswirkstoff
zu bilden. Glycyl-Glycyl-Glycin
wurde durch Festphasen-Synthese synthetisiert und nachfolgend mit
Mercaptoessigsäure
derivatisiert um MAG3 zu ergeben. Eine Lösung des Peptids bei pH 6,8
wurde dann mittels einer Spritze einem mit Maleimid funktionalisierten
porenkontrollierten Glassträger
eingeführt.
Nach mehreren Stunden wurde die Lösung abfiltriert und der beladene
Träger
mit Methanol und Dichlomethan gewaschen und getrocknet. Der Träger wurde
ursprünglich
durch Hinzufügen
von Maleimidopropionsäure
N-Hydroxysuccinimidester
in Triethylamin und Dimethylformamid zu einem kommerziell erhältlichen
langkettigen Alkylamin-Glassträger
hergestellt. Der Träger
wurde filtriert und mit Methanol gewaschen und dann getrocknet. 99mTc wurde dann zu MAG3-beladenen Träger als Pertechnetat mit Zinn
Heptagluconat hinzugefügt
und dann erhitzt um die Komplexbildung zu fördern. Nach 10 Minuten hatte
fast alles Technetium einen Komplexmit MAG3 gebildet, welch nicht
mehr länger
am Träger
immobilisiert war.
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In
einer anderen speziellen Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wurde MAG3 auf einen
Dihydropyranyl funktionalisierten Träger geladen. Der Dihydropyranyl-Träger wurde
durch Hinzufügen
von Dihydropyran-Carbonsäure-Natriumsalz in Dimethylformamid
und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethylcarbodiimidhydrochlorid
(EDCl) zu einem langkettigen Alkylamin-Glassträger unter Vakuum hergestellt.
Nach drei Stunden wurde der Träger
filtriert und mit Dichlomethan, Wasser und Ether gewaschen und dann
getrocknet. MAG3 wurde durch Hinzufügen einer Lösung des Peptids in DMF unter
Argon auf den Träger geladen.
Nach mehreren Stunden wurde der Träger filtriert und mit DMF und
Dichlormethan gewaschen und dann getrocknet.
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Beispiel 1
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Herstellung von S-geschütztem Mercaptoacetyl-Gly-Gly-Gly:
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Zu
einer gereinigten, gerührten
Lösung
von Thiobenzoesäure
(5,74 g, 41,6 mmol) in (100 ml) Ethanol bei 0°C wurde (27,8 ml, 3N, 83,2 mmol)
Kaliumhydroxid gefolgt von (7,70 g, 41,6 mmol) Iodessigsäure in (30 ml)
Ethanol hinzugefügt.
Die Lösung
wurde für
10 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Der Ethanol wurde rotationsverdampft
und das orange, feste Produkt wurde in Wasser (40 ml) aufgelöst. Die
Lösung wurde
auf pH 2,0 angesäuert,
wo sich ein oranges Präzipitat
ausbildete. Dieses wurde filtriert, mit Wasser gewaschen, und im
Vakuum getrocknet um einen orangerosa Feststoff, Benzoylmercaptoessigsäure (7,98
g, 99% Ausbeute) zu ergeben.
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Zu
einer gerührten
Lösung
von (9,20 g, 46,9 mmol) Benzoylmercaptoessigsäure und (5,41 g, 46,9 mmol)
N-Hydroxysuccinimid in (100 mL) Dioxan wurde eine Lösung von
(9,70 g, 47 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in (40 ml) Dioxan hinzugefügt. Die
Reaktion wurde für
12 Stunden gerührt,
gefolgt von einem Kühlen
auf 4°C,
filtriert, und rotationsverdampfen des Dioxans zu einem weißen Feststoff.
Dieser wurde mit kaltem Isopropanol titriert, filtriert, und im
Vakuum getrocknet (10,8g 78% Ausbeute). 200 mg des Benzoylmercaptoacetic N-Hydroxysuccinimid
wurde aus 500 mg in heißem
Etylacetat rekristallisiert.
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Zu
einer gerührten
Lösung
(945 mg, 5 mmol) Glycyl-Glycyl-Glycin (Gly-Gly-Gly), die durch Festphasen-Synthese
hergestellt wurde, und (850 mg) Natriumbicarbonat in (20 ml) Wasser
wurde tropfenweise eine Lösung
(1,47 g, 5 mmol) Benzoylmercaptoacetic n-Hydroxysuccinimidester
in (20 ml) Aceton hinzugefügt.
Die Lösung
wurde für
2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde auf 10 ml rotationsverdampft und konz. Salzsäure wurde
tropfenweise hinzugefügt
um ein weißes
Präzipitat,
N-(S-Benzoylmercaptoacetyl)Gly-Gly-Gly (N-S-Benzoyl-MAG3), zu bilden.
Dieses wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet,
(Ausbeute: 1,70 g, 92,4 %).
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Herstellung des Dihydropyranyl-Trägers:
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Zu
(3,0 g, 300 μmol)
eines langkettigen Alkylamin-Glassträgers (500 Å = 50nm Porendurchmesser, 125–177 μm Partikelgröße, Sigma)
wurde unter Vakuum eine Lösung
von (2,0 g, 3,3 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethylcarbodiimidhydrochlorid
(EDCl), (483 g, 3,3 mmol) Dihydropyrancarbonsäure-Natriumsalz in (20 ml)
Dimethylformamid hinzugeführt.
Die orange Lösung
wurde für
drei Stunden geschüttelt.
Der Träger wurde
filtriert und mit Dichlormethan gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Um die Dihydropyran-Beladung am Träger zu überprüfen, wurden folgende Schritte
ausgeführt:
zu (100 mg) Dihydrophyran belanden Glassträger wurde eine Lösung von
(350 μl)
Mercaptoethanol in (1.5 ml) Dichlomethan hinzugefügt. Nach
2 Stunden wurde der Träger
filtriert und mit Dichlormethan gewaschen bis der Thiol-Geruch verschwand.
(60 mg) wurden mit (800 mg) Dimethoxytritylchlorid in (2 ml, 3:1)
DMF/Pyridin über
Nacht für
16 Stunden derivatisiert. Der tritylierte Träger wurde filtriert und mehrere
Male mit Dichlormethan gewaschen. Die Dimethoxytrityl-Gruppe wurde
abgespalten von 7mg des Trägers
in (10 ml, 3:2) Perchlorsäure/Ethanol
nach 5 Minuten zu einer dunkelorangen Farbe. Nach Verdünnung und
UV-Analyse des Überstandes
wurde die Dihydropyran-Beladung indirekt mit einem Minimum von 73,1 μmol/g bestimmt.
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Beladen von MAG3 auf Dihydropyranyl-Träger:
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Schwefel
geschütztes
MAG3 (N-S-Benzoyl-MAG3) wurde durch die folgenden Schritte entschützt. Zu einer
Lösung
von (370 mg, 1 mmol) Benzoyl-Mag3 in (10ml) Wasser unter Argon wurde
(440 μl,
5N, 2.2 mmol) Natriumhydroxid-Lösung
hinzugefügt.
Nach erhitzen der Lösung
auf 60°C
für 10
Minuten, wurde die Lösung auf
pH 2,0 mit (2 N, 2,2 mmol) Salzsäure
angesäuert.
Die Lösung
wurde zu einem hellgelben Öl
rotationsverdampft. Zu (200 mg) Dihydropyran-beladenen Glassträger wurde
unter Vakuum eine Lösung
von (1 mmol roh) MAG3 in (5,0 ml) Dimethylformamid unter Argon hinzugefügt. Bei
der Zugabe wurde Hitze ermittelt. Die Lösung wurde für 16 Stunden
geschüttelt,
dann filtriert, mit Dimethylformamid, Dichlormethan gewaschen, und
dann im Vakuum getrocknet
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Beispiel 2
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Herstellung von Maleimid-funktionalisertem
CPG-Träger:
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Zu
(300 mg, 30 μmol)
einer langen Alkylkettenamin-beladenen Glasträger (Sigma) wurde unter Vakuum
eine Lösung
von (100 mg, 375 μmol)
Maleimidopropionsäure
N-Hydroxysuccinimidester
(Sigma), und (100 μl)
Triethylamin in (5 ml) Dimethylformamid hinzugefügt. Die Lösung wurde für 16 Stunden
geschüttelt,
filtriert, mit Methanol gewaschen, und im Vakuum getrocknet. Der
Ninhydrin-Test für
Amine war negative, was auf eine vollständige Reaktion hindeutet.
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Herstellen
eines Maleimid-funktionalisierten Trägers wurde ebenfalls durch
folgende Schritte erreicht. Zu (3,0 g) Glasträger wurde unter Vakuum mittels
einer Spritze eine Lösung
(558 mg, 3,3 mmol) Maleimidoproprionsäure, (2.0 g, 9.9 mmol) EDCl,
und (0,1 eq, 330 μmol)
4-Dimethylaminopyridin (DMAP) in (20 ml) DMF hinzugefügt. Die
Lösung
wurde über
Nacht rotiert, gefolgt von Filtration, mit Dichlormethan gewaschen
und im Vakuum getrocknet.
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Ein
am meisten bevorzugtes Verfahren für das Herstellen eines Maleimid-Trägers wird
durch die folgenden Schritte durchgeführt. Zu (500 mg, 50 μmol) einer
langen Alkylkettenamin-beladenen Glasträger (Sigma) wurde unter Vakuum
eine Lösung
von (50 mg, 182 μmol)
Maleimidopropionsäure
N-Hydroxysuccinimidester in (3 ml, 1:1) Wasser/Aceton, mit (10 mg)
Natriumbicarbonat auf pH 7,5 gepuffert hinzugefügt. Die Lösung wurde für 2 Stunden
geschüttelt,
wo ein negativer Ninhydrin-Test eine vollständige Reaktion anzeigt. Der
Maleimid-beladene Träger
wurde filtriert, mit Wasser gewaschen, und im Vakuum getrocknet.
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Beladen MAG3 auf Maleimid-Träger:
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- Verfahren 1. Zu (200 mg) Maleimid-beladenen Glasträger wurde
unter Vakuum eine Lösung
von (1 mmol roh) Mercaptoacetyl-Gly-Gly-Gly in (5,0 ml) Dimethylformamid
unter Argon hinzugefügt.
Bei der Zugabe wurde Hitze ermittelt. Die Lösung wurde für 16 Stunden
geschüttelt,
dann filtriert, mit Dimethylformamid, Dichlomethan gewaschen, und
dann im Vakuum getrocknet.
- Verfahren 2. Alternativ kann MAG3 auf einen Maleimid-Träger durch
folgende Schritte geladen werden. Zu eine Lösung (335 mg, 0,91 mmol) Benzoylmercaptoacetyl-Gly-Gly-Gly in (10 ml) Wasser
unter Argon wurde (400 μl,
5N, 2,0 mmol) Natriumhydroxid-Lösung hinzugefügt. Nach
Erwärmen
der Lösung
auf 50°C
für 30
Minuten wurde die Lösung
mit (2N, 2.2 mmol) Salzsäure
auf pH 6,5 angesäuert
und dann auf pH 6,8 mit Natriumbicarbonatlösung gebracht. Die Lösung wurde
filtriert und mittels Spritze zu (1,5g) evakuiertem Maleimid geladenen
Glasträger
hinzugefügt.
Die Reaktion rotierte für
mehrere Stunden, bevor sie auf einer Filterfritte mit Methanol gewaschen
wurde, dann Dichlormethan, filtriert, und im Vakuum getrocknet.
Eine Aminosäureanalyse
zeigte eine Beladung von 7,3 μmol/g.
- Verfahren 3. Vorzugsweise wird MAG3 auf einen Maleimid-Träger durch
folgende Schritte geladen. Zu einer Lösung von (110 ng) Benzoylmercaptoacetyl-Gly-Gly-Gly
in (4ml) Wasser unter Argon wurde (5N) Natriumhydroxid-Lösung hinzugefügt. Nach
Erwärmen
der Lösung
auf 50°C
für 10
Minuten, wurde die Lösung
mit (2N) Salzlösung
auf pH 6,5 angesäuert
und dann mit Natriumbicarbonatlösung
auf pH 7 gebracht. Diese Lösung wurde
filtriert und mittels Spritze zu (500 mg) zu einem evakuiertem Maleimidbeladenen
Glasträger
hinzugefügt.
Die Reaktion wurde für
4 Stunden geschüttelt,
filtriert, mit Wasser gewaschen und dann Ether, und im Vakuum getrocknet.
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Chromatographische Standardisierung
von 99m-MAG3
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Technetium-markiertes
MAG3 und der schwache Komplex 99mTc-Gluconat,
der durch herkömmliche Lösungstechniken
hergestellt war, wurden auf drei chromatographischen Systemen für die Bestimmung
des Ausmaßes
der Transchelations-Reaktion auf dem festen Träger, standardisiert. 99mTc-MAG3 wurde durch Plazieren von 0,5
mg N-S-Benzoyl-MAG3,
200 μl Salzlösung, 100 μl Pertechnetat
und 100 μl
Zinngluconat (50 μg Zinnchlorid
und 1mg Natriumgluconat) in einem 1,5 ml Röhrchen vorbereitet. Das Röhrchen wurde
verschlossen und in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten platziert. 99mTc-Gluconat wurde aus 200 μl Salzlösung, 100 μl Pertechnetat
und 100 μl
Zinngluconat hergestellt.
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Markieren von MAG3 auf
Maleimid-Träger
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Zu
260 mg MAG3 beladenen porenkontrolliertem Glas-Maleimid Träger, der
durch das Verfahren 2 hergestellt und durch einen Wasser-Aspirateur
evakuiert wurde, wurde eine Mischung aus 300 μl Salzlösung, 200 μl Pertechnetat und 100 μl Zinnglucant
hinzugefügt.
Nach 10 Minuten wurde das Vakuum gelöst um den Reaktionsfortschritt
bei Raumtemperatur zu überprüfen. Dünnschichtchromatographie
(Whatman Nr. Papierstreifen/Acetonitril:Wasser) deutete auf die
Bildung von etwas 99mTc-MAG3 hin, jedoch
blieb viel 99mTc-Gluconat zurück.
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Die
Reaktionsmischung wurde in ein 10 ml Röhrchen überführt, verschlossen, evakuiert
und in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten platziert, um
die Komplexbildung zu fördern.
Dünnschichtchromatographie
zeigte die vollständige
Transchelation von 99mTc-Gluconat zu 99mTc-MAG3 an.
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Beispiel 3
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Herstellung von Maliemid-funktionalisiertem
Agarose-Träger:
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Zu
3 g eines aufgequellten Alkylamin-funktionalisiertem quervernetzten
Agarose-Trägers (Biorad
Affi-Gel 102) wurden bei 0°C
eine Lösung
von 100 mg N-Maleimidoethylformat
in 6 ml wässrigem
Bicarbonat hinzugegeben. Nach 30 Minuten gelegentlichem Schütteln, wurde
der Träger
dann mechanisch für
1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Träger wurde
filtriert, 3-mal mit Wasser gewaschen und erneut filtriert.
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Laden von MAG3 auf Maleimid-funktionalisiertem
Agarose-Träger
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Zu
1 g Malemido-funktionalisiertem Träger wurde eine Lösung von
15 mg MAG3 in 3 ml wässriger
Bicarbonat hinzugefügt.
Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden geschüttelt. Der
Träger
wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, dann erneut filtriert
um das überschüssige Wasser
von den aufgequellten Kügelchen
zu entfernen. Aminosäure-Analyse
ergab 6,12 μmol/g
(trocken)
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Laden von Ligand-auf ein
Ziel gerichtetes Molekül-Konjugat
auf den Maleimidfunktionaliserten Agarose-Träger:
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Zu
1 g Malemido-funktionalisiertem Träger wurde eine Lösung von
25 mg Ligand-Peptid-Konjugat Pc-Ser-Cys-Gly-TKPPR
(Pic-Ser-Cys-Ligand; Gly-TkPPR auf ein Ziel gerichtetes Peptid)
in 3 ml wässriger
Bicarbonat hinzugefügt.
Die Reaktion für
bei 0°C
für 30
Minuten geschüttelt.
Der Träger
wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, dann erneut filtriert
um das überschüssige Wasser
von den aufgequellten Kügelchen
zu entfernen. Aminosäure-Analyse
ergab 50 μmol/g
(gequellt) oder 99,5 μmol/g
(trocken).
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Markierung:
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To
(100 mg) des beladenen Agarose-Trägers in einem verpfropften
Glasspritzengefäß wurde
(3,7 × 108 Bq, 100 μl)
Natriumpertechnetat, (100 μl)
Salzlösung,
und (100 μl)
Zinn-Gluconat-Lösung
hinzugefügt.
Das Gefäß wurde
zur Mischung sachte geschüttelt
und dann 10 Minuten in einem kochenden Wasserbad erwärmt. Eluensfraktionen
wurden gesammelt durch Hinzufügen
von Salzlösungs-
oder Ethanolportion zum oberen Teil des Trägers, gefolgt vom Ziehen des
Eluens in Vacutainer-Phiolen mittels Injektion. Die Aktivität jeder
Fraktion wurde in einem Capintec-Gammazähler gemessen. Die erste Fraktion
wurde dann mittels RP-HPLC, um die Reinheit zu bewerten (markierter
Ligand vs. Markiertes Pertechnetat und andere markierte Unreinheiten),
gemessen. Das MAG3-markierte Produkt war 80,5 % rein, während das
Ligand-Peptid-Konjugat Pic-Ser-Cys-Gly-TKPPR
markierte Produkt zu 86,3% rein war.
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Beispiel 4
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Herstellung von Maleimid-funltionalisiertem
Quarz:
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Zu
1,0 g von evakuiertem 3-Propylamin funktionalisiertem Quartz-Träger (Aldirch
36,425-8) wurde eine Lösung
von 50 mg N-Maleimidoethylformat in 4 ml wässrigem Bicarbonat bei 0°C hinzugefügt. Nach
45 Minuten gelegentlichem Schütteln,
wurden 16 ml Wasser hinzugefügt.
Der Träger
wurde bei Raumtemperatur für
15 Minuten geschüttelt
und dann filtriert und mit Wasser gewaschen.
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Laden von MAG3 auf den
Maleimid-funktionalisierten Quarz-Träger:
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Zu
1 g von Malemimido-funktionalisiertem Quarz-Träger wurde eine Lösung von
20 mg MAG3 in 3 ml wässrigem
Bicarbonat hinzugefügt.
Die Reaktion wurde in einem Eis wasserbad für 12 Stunden geschüttelt und dann
auf Raumtemperatur erwärmen
lassen. Der Träger
wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, dann erneut filtriert
um überschüssiges Wasser
von den gequellten Kügelchen
zu entfernen. Aminosäureanalyse
ergab 78,4 μmol/g
(trocken)
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Markieren von MAG3 auf
den Maleimid-funktionalisierten Quarz-Träger:
-
Zu
(100 mg) des beladenen Trägers
in einem verpfropften Glasspritzengefäß wurde (3,7 × 108 Bq, 100 μl)
Natriumpertechnetat, (100 μl)
Salzlösung,
und (100 μl)
Zinn-Gluconat-Lösung hinzugefügt. Das
Gefäß wurde
zur Mischung sachte geschüttelt
und dann 10 Minuten in einem kochenden Wasserbad erwärmt. Eluensfraktionen
wurden gesammelt durch Hinzufügen
von Salzlösungs-
oder Ethanolportionen zum oberen Teil des Trägers, gefolgt vom Ziehen des
Eluens in Vacutainer-Phiolen. Die Aktivität jeder Fraktion wurde in einem
Capintec-Gammazähler
gemessen. Die erste Fraktion wurde dann mittels RP-HPLC analysiert,
und mit 97,1 % Reinheit bewertet (markierter MAG3 vs. markiertes
Pertechnetat und andere markierte Unreinheiten).
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Beispiel 5
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Herstellung von Maleimido-funktionalisiertem
acrylischen Träger:
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Zu
1.5 g evakuiertem Alkylamin funktionalisiertem acrylischen Träger (Sigma)
wurde ein Lösung
von 10 ml wässrigem
Bicarbonat bei 0°C
hinzugefügt,
gefolgt von 155 mg, gepulvertes N-Maleimidoethylformat. Nach 20
Minutem gelegentlichem Schütteln,
wurde der Träger
mechanisch für
1,5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Träger wurde
filtriert und mit Wasser, dann Methanol gewaschen, dann filtriert
und im Vakuum getrocknet.
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Laden von MAG3 auf Maleimid-funktionalisiertem
acrylischen Träger:
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Zu
1 g Maleimido-funktionalisiertem acrylischen Träger wurde eine Lösung von
20 mg MAG3 in 3 ml wässrigem
Bicarbonat hinzugefügt
und die Reaktion bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt. Der
Träger
wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, dann erneut filtriert,
um überschüssiges Wasser
von den gequellten Kügelchen
zu entfernen. Aminosäure-Analyse
ergab 17,4 μmol/g
(trocken).
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Laden von Ligand-Peptid-Konjugat
auf Maleimid-funktionalisiertem acrylischen Träger:
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Zu
1 g Maleimido-funktionalisiertem acrylischen Träger wurde eine Lösung von
25 mg eines Ligand-Peptid-Konjugats Pic-Ser-Cys-Gly-TKPPR in 3 ml
wässrigem
Bicarbonat hinzugefügt.
Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden geschüttelt. Der
Träger
wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, dann erneut filtriert,
um überschüssiges Wasser
von den gequellten Kügelchen
zu entfernen. Aminosäure-Analyse ergab
29 μmol/g
(trocken).
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Markierung:
-
To
(100 mg) des beladenen Agarose-Trägers in einem verpfropften
Glasspritzengefäß wurde
(3,7 × 108 Bq, 100 μl)
Natriumpertechnetat, (100 μl)
Salzlösung,
und (100 μl)
Zinn-Gluconat-Lösung
hinzugefügt.
Das Gefäß wurde
zur Mischung sachte geschüttelt
und dann 10 Minuten in einem kochenden Wasserbad erwärmt. Eluensfraktionen
wurden gesammelt durch Hinzufügen
von Salzlösungs-
oder Ethanolportion zum oberen Teil des Trägers, gefolgt vom Ziehen des
Eluens in Vacutainer-Phiolen mittels Injekti on. Die Aktivität jeder
Fraktion wurde in einem Capintec-Gammazähler gemessen. Die erste Fraktion
wurde dann mittels RP-HPLC, um die Reinheit zu bewerten (markierter
Ligand vs. Markiertes Pertechnetat und andere markierte Unreinheiten),
gemessen. Das MAG3-markierte Produkt war 97 % rein, während das
Ligand-Peptid-Konjugat Pic-Ser-Cys-Gly-TKPPR
markierte Produkt zu 85% rein war.
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Beispiel 6
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Markierung von Liganden
auf Maleimide-funktionalisiertem porenkontrollierten Glasträgern:
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Maleimide-funktionalisierter
porenkontrollierter Glasträger,
der wie in der in Beispiel 2 beschriebenen Art hergestellt wurde,
wurde mit MAG3 und Ligand-Peptid-Konjugat Pic-Ser-Cys-Gly-TKPPR
beladen. Die immobilisierten Liganden wurden gemäß den in den Beispielen 3 bis
5 beschriebenen Verfahren markiert. Die Aktivität der ersten Fraktion des Eluens
wurde in einem Capintec-Gammazähler
gemessen und mittels RP-HPLC,
um die Reinheit zu bewerten, analysiert. Das MAG3-markierte Produkt
war 93% rein, während
das Ligand-Peptid-Konjugat Pic-Ser-Cys-Gly-TKPPR zu 59,7% rein war.
