DE69925009T2 - Lage-spezifische markierung von disulfide-enthaltenden zielgerichteten vektoren - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Einbringen von Thiol enthaltenden Linkern in auf Krankheiten zielende Mittel, die Disulfidbindungen enthalten, die radioaktiv markierten zielenden Mittel und Arzneistoffkonjugate, die nach diesen Verfahren hergestellt werden und die Verwendung der radioaktiv markierten oder Arzneistoff tragenden zielenden Mittel für Diagnose und Therapie.
  • Beschreibung der verwandten Techniken
  • Freie Thiole bieten ein einzigartigen chemischen Angriffspunkt für die Anlagerung einer Vielzahl von Spezies an spezifisch zielende Mittel aufgrund der Spezifität der Thiolgruppe für reaktive Gruppen, wie z.B. Haloacetate, Maleinimide und aktivierte Sulfonylgruppen, und für reduzierte Metallspezies, wie z.B. reduziertes Pertechnetat und Perrhenat, und bestimmte andere thiophile Metalle, wie z.B. Zink, Kupfer, Quecksilber, Cadmium, Platin, Palladium, Blei und Wismut. Allerdings ist bei vielen Proteinen, Polypeptiden und Peptiden das Vorliegen von Disulfidbindungen, die im Hinblick auf ihre strukturelle Integrität kritisch sind, ein kompliziertes Problem. Die inhärente Reaktivität der Thiolgruppe kann zu einem Bruch solcher Disulfidbindungen führen, was mit der Ausbildung von gemischten Disulfiden und einer Unfähigkeit der Proteine, Polypeptide und Peptide an ihr Zielantigen oder ihren Rezeptor zu binden, einhergehen kann.
  • Antikörperfragmente sowie sub-Fab'-Fragmente, Einzelketten-Antikörper, Diabodies, Polypeptide und Peptide bieten Vorteile für das in vivo-Zielen von Isotopen und Arzneistoffen für die Szintigraphie und die Strahlentherapie, weil die kleineren Fragmente schneller zielen und verschwinden werden als ein intaktes IgG oder ein größeres Protein. Beispielsweise transportiert ein radioaktiv markiertes Antikörperfragment eine Dosis eines therapeutischen oder bildgebenden Isotops schneller zu einem Ziel als ein intaktes IgG, und die schnellere Entfernung wird die radiometrische Dosis für die Gewebe, auf die nicht gezielt wurde, minimieren. Das schnelle Zielen ist insbesondere für Isotope mit kurzen Halbwertszeiten wichtig, wie z.B. Tc-99 m (t1/2 = 6 Std.) oder Re-188 (t1/2 = 17 Std.). Tc- und Re-Kationen binden stark an Thiol enthaltende Liganden, aber die Konjugation dieser Liganden an Antikörper oder Antikörperfragmente kann Schwierigkeiten bereiten.
  • Ein divalentes Antikörperfragment, wie z.B. ein F(ab')2-Fragment sollte im Vergleich zu einem Fab'-Fragment insgesamt besser zielen, weil die divalente Bindungsregion die Affinität des Proteins zu dem Antigen erhöhen wird. F(ab')2-Fragmente bestehen aus zwei Fab'-Fragmenten, die miteinander über eine oder mehrere Disulfidbindungen verbunden sind, die anfällig für die Reduzierung durch freie Thiole sowohl während als auch nach der Konjugation eines Thiol enthaltenden Rests sind. Daher ist es erforderlich, einen Thiol enthaltenden Liganden mit dem Protein zu konjugieren, indem man entweder ein geschütztes Thiol verwendet, das anschließend entschützt wird, oder indem man eine niedrige Thiol-Konzentration und hydrophile Thiole verwendet, um die Wechselwirkung der freien Thiole auf dem Liganden mit den Disulfiden auf dem Antikörper zu minimieren.
  • Ein weiteres Problem, das während der Konjugation mit einer nicht-spezifischen Region auf einem zielenden Mittel auftreten kann, ist, daß das Konjugat an der oder in der Nähe der Antigen bindenden Region eines Antikörpers oder der Rezeptor bindenden Region eines Peptids/Polypeptids gebunden werden kann, was die Bindungsaffinität des Antikörpers oder Peptids für das Antigen oder den Rezeptor verringern kann. Die Konjugation von Haptenen mit mit Periodat oxidierten Kohlenhydratbereichen (Aldehyde und Ketone) ist ein Verfahren, um Konjugate regiospezifisch zu bilden. Die Kohlenhydratbereiche können genetisch in spezifische Regionen auf Proteinen oder Peptiden umgewandelt werden, so ist es z.B. möglich, ein Kohlenhydrat in einem Bereich auf einem F(ab')2-Fragment anzuordnen, das die Bindung des Antikörperfragments an das Antigen nicht beeinträchtigen wird.
  • Das Vorliegen von Kohlenhydratresten auf den leichten Ketten bestimmter IgGs ist bereits etabliert worden. Solche Reste verbleiben jeweils auf dem F(ab')2S und dem F(ab)2S nach dem Verdau mit Pepsin oder Papain. Als solche repräsentieren sie einen maskierten, potentiellen, regiospezifischen chemischen Angriffspunkt für die Haptenanlagerung. Außerdem wurden bestimmte Maus-Antikörper rekonstruiert, um humanisierte Versionen des komplementaritätsbestimmenden Bereichs desselben Antikörpers zu erhalten, während gleichzeitig an von der Antigen-Bindestelle des Antikörpers enffernten Positionen Glykosylierungsstellen konstruiert werden. Dies ermöglicht das Einfügen von Kohlenhydrat an gewünschten Positionen innerhalb des Proteins, einschließlich das Einfügen von Kohlenhydrat in der CH1-Domäne und in dem variablen Bereich sowohl auf leichten wie auf schweren Ketten.
  • Es ist auch wichtig, ein Konjugat zu haben, das in vitro und in vivo hinreichend stabil ist, damit die Biodistribution der radioaktiven Markierung die Biodistribution des Antikörperfragments widerspiegelt. Wenn die Verknüpfung des Konjugats mit dem Antikörper oder die Anlagerung des Radioisotops an das Konjugat instabil ist, kann dies zu einer wesentlichen Verringerung an Radioisotop führen, das das Ziel erreicht. Das Radioisotop, das sich von dem Protein abtrennt, könnte zu der Hintergrundaktivität beitragen, was das Zielen weiter verdecken würde.
  • WO 96/40289 betrifft Ein-Proben-Verfahren und Kits zur radioaktiven Markierung von Peptiden mit einem radioaktiven Metallion eines Radionuklids, das fest an Sulfhydrylgruppen bindet, wobei das Peptid mit einem tertiären Thiol enthaltenden chelatbildenden Mittel derivatisiert ist. Bei den darin beschriebenen Verfahren wird ein geschützter Thiol enthaltender Rest mit dem Peptid konjugiert, wonach das Derivat entschützt werden kann, um freie Sulfhydrylgruppen zu erzeugen, ohne die Disulfidbindungen zu spalten. Das Derivat kann dann mit einem Radionuklid markiert werden.
  • Es besteht ein kontinuierlicher Bedarf, Thiol enthaltende disulfidverknüpfte zielende Vektoren herzustellen, die leicht mit thiophilen Metallionen radioaktiv markiert werden können, für die Verwendung in der Szintigraphie und der Strahlentherapie, oder die mit Arzneistoffen für die gezielte Chemotherapie substituiert sind. Solch eine Erfindung muß die vielen oben diskutierten Probleme berücksichtigen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Konjugate von Disulfld enthaltenden zielenden Proteinen, Polypeptiden und Peptiden, z.B. divalente Antikörperfragmente und (sv)2S, mit Thiol enthaltenden Liganden bereitzustellen ohne die Disulfidbindungen der zielenden Proteine zu spalten.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die an den Disulfid enthaltenden Proteinen oder Peptiden angelagerten substituierten Thiolgruppen als spezifischen chemischen Angriffspunkt zu verwenden, um weitere bestimmte Radioisotope oder chemotherapeutische Mittel anzulagern.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, radioaktiv markierte Proteine bereitzustellen, die in vitro und in vivo stabil sind.
  • Noch eine weitere Aufgabe ist es, stabil substituierte Disulfid enthaltende Proteine, Polypeptide und Peptide für die Radiodiagnose, die Strahlentherapie und die Chemotherapie von Krankheiten bereitzustellen.
  • Diese und andere Aufgaben werden gelöst, indem ein Verfahren bereitgestellt wird zur Herstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Konjugats eines Proteins, Polypeptids oder Peptids, das wenigstens eine Disulfidbindung enthält, welche notwendig ist, um dessen biologische Aktivität aufrechtzuerhalten, und das wenigstens einen Thiol enthaltenden Rest trägt, der über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung damit verbunden ist, bei dem man das Protein, Polypeptid oder Peptid mit einem entweder als Vorprodukt gebildeten oder in situ erzeugten, mit Thiol reaktionsfähigen diagnostischen oder therapeutischen Mittel in Kontakt bringt, um ein stabiles diagnostisches oder therapeutisches Konjugat des Proteins, Polypeptids oder Peptids ohne wesentliche Spaltung der Disulfidbindung auszubilden.
  • Bei dem vorgenannten Verfahren wird der Thiol enthaltende Rest, der mit dem Protein, Polypeptid oder Peptid über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung verbunden ist, verbunden, indem das die Disulfidbindung enthaltende Protein, Polypeptid oder Peptid, das auch eine Aldehyd- oder Ketongruppe enthält, mit einem Thiol-Hydrazin der Formel HS-Q-NHNH2 umgesetzt wird, wobei Q ein Bindungsrest ist, der unter Alkylgruppen, Arylgruppen, Cycloalkylgruppen, Peptiden und Kombinationen davon ausgewählt ist, und indem man wahlweise das hieraus hervorgehende Hydrazon zu einem Hydrazin reduziert.
  • Das diagnostische oder therapeutische Mittel in dem Konjugat kann ein Thiol bindendes kationisches Radioisotop oder ein Arzneistoffderivat sein, das einen Thiol bindenden Linker umfaßt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein glykosyliertes divalentes Antikörperfragment, dessen teilweise oxidierter Kohlenhydratanteil über die Hydrazon- oder Hydrazinverbindung mit dem Thiol enthaltenden Rest verbunden ist.
  • Als Vorprodukt ausgebildete, stabile Kits zur Bewirkung der radioaktiven Markierung gemäß dem vorgenannten Verfahren werden ebenfalls bereitgestellt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Die Erfinder dieser Erfindung haben ein Verfahren bereitgestellt für die Konjugation eines Thiol enthaltenden Peptidlinkers oder -liganden mit einem Disulfid enthaltenden Protein oder Peptid, z.B. einem F(ab')2, über eine Carbonylfunktion, z.B. einen mit Periodat oxidierten Kohlenhydratanteil des Proteins, ohne die Disulfidbindungen zu reduzieren, die die Struktur und/oder die Konformation, die in Beziehung mit der Aktivität steht, zu reduzieren, z.B. die Reduzierung des F(ab')2-Fragments zu Fab' während der Konjugation oder des Markierungsvorgangs. Es wurden Konjugate hergestellt, bei denen die Anlagerung des Linkers oder Liganden an das die Disulfidbindung enthaltende Protein stabil ist und die Anlagerung der radioaktiven Markierung, z.B. Tc-99m, an den Liganden in vitro und in vivo stabil ist. Im Falle eines glykosylierten F(ab')2-Fragments transportieren bevorzugte Ausführungsformen von mit Tc-99m markierten Peptidchelatbildnern einen höheren Prozentsatz der injizierten Dosis zu einem Tumor als I-125-markiertes F(ab')2 oder Tc-99m-markiertes Fab'.
  • Überraschenderweise haben die Erfinder herausgefunden, daß die üblicherweise für die Konjugation von Arzneistoff- und Chelat-Nuklid-Molekülen an Antikörper über oxidierte Kohlenhydratreste verwendeten Acylhydrazide sehr instabil sind, sogar in vitro. Dies wurde in Stabilitätsuntersuchungen mit den mit Tc-99m radioaktiv markierten Konjugaten IMP-126-LLZ-F(ab')2 und IMP-140-LL2-F(ab')2 gezeigt. LL2 ist ein monoklonaler Anti-CD-22-Antikörper (mab), der in dem US-Patent 5,789,554 beschrieben ist.
    IMP 126 Ac-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Ala-Gly-NHNH2
    IMP 140 Ac-D-Asp-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-D-Asp-NHNH2
  • TscG steht für H2NCSNHN=CHC(O)-Thiosemicarbazonylglyoxyl
  • Das mit Tc-99m markierte Peptid würde von dem Protein dissoziieren, wenn es in Lösung über längere Zeit gelagert würde. Der Verlust des markierten Peptids in vitro wurde anhand der Größenausschluß-HPLC und der HPLC an reverser Phase nachgewiesen. Die Stabilität der Acylhydrazid-Verbindung konnte bis zu einem gewissen Grad überprüft werden, indem die dem Acylhydrazid benachbarten Aminosäuren ausgetauscht wurden. Das Peptid IMP 126 bildete eine stabilere (obwohl immer noch instabile) Verbindung mit dem LL2-F(ab')2 aus als IMP 140: möglicherweise katalysierte der Aspartinsäurerest die Dissoziation des markierten Peptids.
  • Es ist eher möglich, die Verbindung zwischen Peptidlinker und Protein zu stabilisieren, indem man ein Hydrazin (z.B. IMP 155) für die Umsetzung mit der Carbonylfunktion, z.B. dem oxidierten Kohlenhydrat, verwendet als ein Acylhydrazid. Nach der in-vitro-Inkubation über Nacht gab es keinen nachweisbaren Verlust an markiertem Peptid.
    IMP 155 H2NHN-CH2-CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-NH2
  • Überraschenderweise konnte das freie Thiol enthaltende Peptid ohne merkliche Reduzierung des Disulfids im Gelenkbereich konjugiert werden.
  • Es wurde eine gleichmäßige Beladung des Peptids beobachtet (etwa 3,8–4,3 Peptide/LL2 F(ab')2-Fragment) über einen Bereich von Peptid-/Antikörper-Verhältnissen (100:1, 50:1, 10:1), die für die Konjugation verwendet wurden.
  • Das Antikörperkonjugat konnte in ein Einzelproben-Kit formuliert werden und bei Raumtemperatur mit Tc-99m markiert werden.
  • Das Tc-99m-markierte Konjugat wurde auf dem mit dem oxidierten Kohlenhydrat verknüpften Peptid regiospezifisch markiert. Dies wurde zunächst in Kontrollversuchen gezeigt, in denen LL2-F(ab')2 dem Konjugationsprozeß unterworfen wurde, außer daß kein Periodat während des Oxidierungsschritts zugegeben wurde. Die Kontrolle war eine mit Tc-99m-Glucoheptonat behandelte und bildete lediglich 6% Tc-99m-markiertes Protein aus, wie durch ITLC gemessen wurde, während das IMP-155-LL2-F(ab')2, das unter den gleichen Bedingungen markiert wurde, beachtliche Mengen des markierten Antikörperfragments (70–80%) hervorbrachte. Der andere Beweis dafür, daß Tc-99m an das Peptid angelagert ist, ist, daß bei den markierten Acylhydrazid-Peptiden, welche den gleichen Tc-99m-Liganden wie IMP 155 verwendeten, die Aktivität von dem Protein als das Tc-99m-markierte Peptid dissoziierte, wie durch Analyse mit Größenausschluß- und reverser-Phasen-HPLC festgestellt wurde. Der Beweis dafür, daß das Peptid an dem oxidierten Kohlenhydrat angelagert ist, ist, daß die Konjugation mit dem mit Periodat oxidierten LL2-F(ab')2 ein Protein hervorbringt, das freie Thiole enthält (2–3 Thiole/LL2-F(ab')2, wie mit UV gemessen), und daß die Konjugation mit dem nicht-oxidierten Antikörper ein Protein hervorbringt, das keine freien Thiole enthält.
  • Das Tc-99m-markierte IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugat war in vitro und in vivo stabil.
  • Der mit Tc-99m markierte Antikörper war bei 24 Std. in Mäusen, die den Ramos-Tumor tragen, (siehe Beispiel 3 und 4 unten) tumorzielend. Das divalente Antikörperfragment transportierte eine höhere Dosis zu dem Tumor als das iodierte LL2-F(ab')2 oder das Tc-99m-Fab'.
  • Die vorangehenden Versuchsergebnisse zeigen, daß die vorliegenden Verfahren die Einführung eines Thiol-Liganden tragenden Peptids in den oxidierten Kohlenhydratanteil eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit einer stabilen regiospezifischen Verbindung ermöglichen. Dieses Verfahren kann auf jedes Aldehyd oder Keton enthaltende Protein, Polypeptid oder Peptid angewendet werden. Die herkömmlichen Verfahren führen ein geschütztes Thiol ein, welches nachfolgend entschützt werden muß, um freies Thiol hervorzubringen. Diese Linker sind oft an den oxidierten Kohlenhydratgruppen über Acylhydrazide angelagert, für welche nachgewiesen wurde, daß sie eine instabile Verknüpfung darstellen. Die freien Thiol-Konjugate, die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellt wurden, können verwendet werden, um Konjugate mit anderen Resten auszubilden, wie z.B. mit Arzneistoffen, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Proteinen, Glycoproteinen, DNA, RNA, PNA, Metallkomplexen, radioaktiv markierten Spezies (Bildgebung und Therapie), Enzymen, Toxinen und Zuckern.
  • Solche Kohlenhydrate mit Fragment können verwendet werden, um Haptene anzulagern, wie z.B. Thiol enthaltende Chelatbildner, die nachfolgend mit radioaktiven Metallen, die mit Thiol binden, radioaktiv markiert werden können. Ein Kohlenhydrat, das vicinale Diole enthält, kann zur Herstellung von Aldehyd- und Ketonfunktionen mit einem Mittel, wie z.B. Periodat, oxidiert werden, und zur Bewirkung der Konjugation mit einem Thiol enthaltenden, Hydrazin enthaltenden Hapten, das allgemein als HS-Q-NHNH2 dargestellt wird, vermischt werden. Wahlweise können die gebildeten Hydrazone, die das Hapten mit dem Protein-Kohlenhydrat verknüpfen, zur Herstellung eines Thiol-Hapten-Konjugats mit einem Reduktionsmittel, wie z.B. Natriumcyanoborhydrtd, reduziert werden, ohne die Gelenkregions-Disulfidbindungen zu beeinträchtigen.
  • Der Thiol enthaltende, Hydrazin enthaltende Rest HS-Q-NHNH2 kann eine breite Spanne an Strukturen aufweisen. Die Gruppe Q kann umfassen: Alkylengruppen, einschließlich C2-30-Alkylengruppen mit unverzweigten oder verzweigten Ketten, C5-8-Cycloalkylengruppen, C6-30-Arylgruppen, die kondensiert oder verknüpft sind, wobei sie wahlweise von eins bis acht Heteroatomen in einem oder mehreren der aromatischen Ringe inkorporiert haben, einschließlich, aber ohne Beschränkung hierauf, Phenylen, Naphthylen, Furylen, Benzofurylen, Pyridylen, Purinylen, Piperidylen und dergleichen, Peptide und/oder Peptidyl-Nachahmungen mit einer Länge von eins bis 20 Aminosäuren oder Aminosäureanaloga, wobei vorzugsweise eine oder mehrere der Aminosäuren wegen seiner Thiolfunktion Cystein ist, und terminal Serin oder Threonin vorliegt, das zu einem Aldehyd oxidiert ist, welches mit Hydrazin umgesetzt wird und unter Ausbildung des Hydrazinylsubstituenten reduziert wird. Um die Gruppe Q zu konstruieren, können auch Kombinationen der vorangehenden strukturellen Bestandteile verwendet werden. Darüber hinaus können die vorangehenden Bestandteile einen oder mehrere Substituenten tragen, die die Konjugationsreaktion nicht beeinträchtigen, einschließlich, aber nicht hierauf beschränkt, Halogene, Hydroxyl- oder Alkoxylgruppen, einschließlich geschützte Hydroxylgruppen, Carboxyl- und Carboxylestergruppen, Alkylgruppen, Cyanogruppen, primäre, sekundäre und tertiäre Aminogruppen, einschließlich geschützte Aminogruppen, Amide, Urethane, Carbamide, Nitrogruppen und dergleichen. Die hierin offenbarten Peptide sind Beispiele für für diesen Zweck geeignete Peptide.
  • Die durch Q dargestellten Strukturen können leicht nach herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Es sind viele aliphatische und aromatische Verbindungen mit einzelnen, mehreren oder kondensierten Ringen und mit Substituenten, die für die weitere Verarbeitung geeignet oder verwendbar sind, im Handel erhältlich. In Reagenzien-Katalogen können Ringverbindungen gefunden werden, die eine oder zwei Carbonylverbindungen tragen, z.B. Aldehyde, Ketone, Carboxylsäure oder -ester und Amide. Andere Substituenten, wie z.B. Hydroxyle, Halogenalkylgruppen, Hydroxyle, Amine, Cyangruppen, Isocyanate und dergleichen können als solche verwendet werden oder in Angriffspunkte für die weitere Verarbeitung umgebildet werden. Kleine Linker-Synthone, wie z.B. Glyoxylester, Zuckerderivate, alpha-Halogenacylverbindungen, z.B. alpha-Bromoacetylester, Säurechloride, sind geeignet für die Einführung von freien oder maskierten Carbonylgruppen für die Umsetzung mit Hydrazin, gefolgt von der Reduzierung mit z.B. Natriumcyanoborhydrid, zur Herstellung der Hydrazinfunktion des HS-Q-NHNH2 oder zur Einführung von Alkylhalogenidgruppen zur Umsetzung mit Natriumsulfid oder Hydrogensulfid, um die Thiolfunktion des HS-Q-NHNH2 herzustellen. Peptide können die Thiolfunktion durch den Einbau von Cysteinen einführen.
  • Es können auch Verfahren zur Einführung von naszierenden Aldehyd- und Ketonresten in zielende Vektoren unter Anwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie eingesetzt wer den. Zum Beispiel kann ein Polypeptid mit einem N-terminalen Serin- oder Threonin-Rest konstruiert werden, der dann unter Ausbildung von N-terminalen Carbonylgruppen spezifisch oxidiert werden kann. Solche Derivate bilden dann spezifische chemische "Angriffspunkte" zur Anlagerung von Thiol enthaltenden Haptenen.
  • Die bevorzugten Liganden tragenden Peptide, wie z.B. IMP 155, sind vorteilhaft, da sie ein Hydrazin, mehrere hydrophile D-Aminosäuren und einen Metall bindenden Liganden enthalten. Das Hydrazin wird zur Ausbildung einer Hydrazon-Verbindung zu Aldehyden oder Ketonen an dem oxidierten Teil der Kohlenhydratgruppen auf einem glykosylierten Antikörper oder Antikörperfragment verwendet. Der Ligand bildet mit dem diagnostischen, bildgebenden Isotop Tc-99m einen stabilen Tc(V)-Oxo-Komplex aus. Ohne hierdurch an irgendeine Theorie gebunden werden zu wollen, scheint es so, daß die hydrophilen Aminosäuren das Peptid hinreichend hydrophil machen, so daß der wechselseitige Austausch von Disulfid oder die Ausbildung von gemischtem Disulfid während der Konjugation des freien Thiol enthaltenden Peptids mit dem Antikörper minimiert wird. Die hydrophile Natur des Peptids sollte das konjugierte Peptid an der Oberfläche des Proteins halten, wo es mit dem Tc-99m reagieren kann, sobald dies zugegeben wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden D-Aminosäuren verwendet, um die Verstoffwechselung des mit Metall komplexierten Peptids nach der Injektion zu minimieren. Dies wird gemacht, damit für den Fall, daß das Protein abgebaut wird, das hydrophile Metall enthaltende Peptid nicht metabolisiert wird und, da es hydrophil ist, wird jedes markierte Peptid, das aus der Zelle entweicht, schnell renal ausgeschieden werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, aber nicht beschränkend. Der Durchschnittsfachmann wird verstehen, daß anstelle der beispielhaft erwähnten auch viele andere Peptide, Antikörperfragmente und Liganden verwendet werden können, während man sich immer noch im Umfang der Erfindung befindet.
  • BEISPIEL 1 – ZUBEREITUNG VON MARKIERTER F(ab')2-Nα-Boc-Nβ-Boc-Hydrazinessigsäure
  • Eine 500 ml-Parr-Flasche wurde mit 18,00 g (1,96 × 10–1 mol) Glyoxylsäuremonohydrat, 25,84 g (1,95 × 10–1 mol) t-Butylcarbazat, 0,72 g 10% Palladium auf Carbon, 100 ml Methanol, 50 ml Dioxan gefüllt und dann unter einer Wasserstoffatmosphäre (50 PSI) auf eine Parr-Hydrierungsvorrichtung gestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur geschüttelt und der Wasserstoffdruck wurde mehrere Male eingestellt, um den Druck bei 50 PSI zu halten. Während die Reaktion fortschritt, bildete sich ein Niederschlag aus. Nach 3 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und es wurden zusätzliche 100 ml Methanol zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, das dann unter 50 PSI Wasserstoff gesetzt wurde und für 21 Stunden geschüttelt wurde. Der Inhalt der Parr-Flasche wurde in 400 ml Methanol gelöst und durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum am Rotationsverdampfer konzentriert, um 36,4 (98,1%) eines weißen festen Produkts zu ergeben. Dieses Rohprodukt 14,0 g (7,37 × 10–1 mol) wurde in einer Lösung gelöst, die 130 ml Dioxan und 80 ml 1 M NaOH enthielt, und in einem Eisbad gekühlt. Es wurde Di-t-butyldicarbonat, 17,76 g (8,14 × 10–1 mol, 110 M%) zugegeben und man ließ die Lösung sich langsam auf Raumtemperatur aufwärmen und rührte für 18 Stunden. Der Inhalt der Reaktion wurde unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer konzentriert und mit 150 ml 1 M Zitronensäure gemischt. Das Gemischt wurde dann mit 2 × 150 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit 100 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in vacuo konzentriert, um so 21,0 g (98%) des Produkts in Form eines Öls, das langsam kristallisierte, zu erhalten.
  • Peptidsynthese
  • Das Peptid IMP 155 (H2NHN-CH2-CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-NH2) wurde auf einem multiplen Peptidsynthesegerät, Advanced ChemTech 348, durch Festphasensynthese auf Fmoc-Basis synthetisiert. Die Peptide wurden unter Verwendung von Rink-Amidharz auf einer Platte mit 0,05 mmol/Well (48 Well-Syntheseblock) synthetisiert. Der repetitive Koppelungsprozeß ist der folgende:
  • Fmoc-Spaltung.
  • Das Harz wird für 4 min mit 1,5 ml an 25% Piperidin in DMF auf einem Vortex gemischt. Dann läßt man den Block abtropfen und das Harz wird für 15 min mit 1,5 ml an 25% Piperidin in DMF auf einem Vortex gemischt.
  • Waschen nach Fmoc-Spaltung.
  • Das Harz wird mit 1,5 ml-Mengen an NMP, Isopropanol, NMP, Isopropanol und 4 NMP-Waschgängen gewaschen. Das Harz wird mit jeder der Waschlösungen für wenigstens eine Minute auf einem Vortex gemischt, bevor die Flüssigkeit abgelassen wird.
  • Kopplung
  • Die geschützte Aminosäure wird in NMP (0,5 M) gelöst, welches 0,5 M HOBt enthält. Das Systemfluid, NMP (300 μl), wird zu dem Harz zugegeben, gefolgt vom Zusatz von Diisopropylcarbodiimidlösung (600 μl, 0,5 M in NMP, 6 Äquivalente) und 600 μl der Aminosäurelösung (6 Äquivalente in Bezug auf das Harz). Das Gemisch wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Vortex gemischt und dann wie oben beschrieben gewaschen. Der gesamte Vorgang wird für die Zugabe jeder Aminosäure wiederholt.
  • IMP 155
    Figure 00090001
  • Periodatoxidation von LL2-F(ab')2
  • Der Kohlenhydratteil von LL2-F(ab')2 aus der Maus (4 mg/ml) wurde mit 15 mM NaIO4 bei 0°C für 1 Stunde im Dunkeln bei einem pH-Wert von 5,3 oxidiert. Dann wurde eine Glycerin/Wasser-Lösung (1:1) zugegeben (50 μl für 2,5 ml Antikörperlösung) und die Lösung wurde für 15 min. bei 0°C im Dunkeln inkubiert. Der oxidierte Antikörper wurde dann durch eine Spin-Säule mit Sephadex G 50–80 in acetatgepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 5,3 (ABS, 50 mM Acetat) aufgereinigt.
  • Konjugationsbedingungen
  • Das Peptid IMP 155 wurde mit dem mit Periodat oxidierten LL2-F(ab')2-Fragment (4 mg/ml, LL2-F(ab')2) in einem molaren Verhältnis von 100:1 Peptid/Antikörper bei einem pH-Wert von 5,3 in acetatgepufferter Salzlösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Zusatz der Antikörperlösung zu der geeigneten Menge an Peptid in einem evakuierten und mit einem Septum versiegelten Pro benbehälter konjugiert. Das konjugierte Antikörperfragment wurde zweimal durch Spin-Säulen mit Sephadex G 50–80 (pH 5,3 ABS) aufgereinigt, um den ungebundenen Überschuß an Peptid nach Ablauf der Konjugationszeit zu entfernen. Die Analyse des Konjugats durch MALDI-Massenspektroskopie zeigte, daß im Durchschnitt vier Peptide pro Antikörperfragment konjugiert waren.
    Probe MALDI-Daten MH+
    LL2-F(ab')2 103514
    Oxidiertes LL2-F(ab')2 103168
    IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugat 106240
  • Für die Zubereitung des Kits verwendete Lösungen
  • αD-Glucoheptonat/Acetat-Puffer:
  • Es wurde eine Pufferlösung zubereitet, indem eine Lösung mit einem pH-Wert von 5,3 hergestellt wurde, die 200 mM α-D-Glucoheptonsäure-Natriumsalz und 21 mM Natriumacetat enthielt. Diese Lösung wurde zur Hälfte mit Wasser verdünnt, woraus sich eine 100/10,5 mM (Glucoheptonat/Acetat) Lösung ergab, die für die Kit-Formulierung verwendet wurde.
  • SnCl2:
  • Eine SnCl2-Lösung wurde en gros hergestellt, indem Zinnmetall in 6 M HCl in einer Konzentration von 200 mg/ml gelöst wurde. Eine 2 mg/ml Zinnlösung wurde hergestellt, indem ein Aliquot der 200 mg/ml Zinnlösung 100-fach in dem Glucoheptonatpuffer verdünnt wurde.
  • Saccharoselösung:
  • Eine 1 M Saccharoselösung wurde als Zusatz für die Kits hergestellt.
  • Kit-Formulierung
  • Die aufgereinigte Konjugatlösung wurde durch eine Spin-Säule mit Sephadex-Gel G 50–80, das mit 0,1 M Phosphat mit einem pH-Wert von 7,3 gepuffert war, laufengelassen (A mg/ml LL2-F(ab')2). 1 mg des Konjugats (250 μl) wurde mit 12,5 μg SnCl2 (6,25 μl), 446 μg α-D-Glucoheptonsäure-Natriumsalz (11,7 μl Glucoheptonatpuffer + Puffer in der Zinnlösung) und 19 mg Saccharose (55,6 μl) in einem Gesamtvolumen von etwa 0,3 ml vermischt. Das Gemisch wurde sofort eingefroren, gefriergetrocknet und unter Vakuum mit einem Septum versiegelt.
  • Bedingungen für die Kit-Markierung
  • Der Inhalt des Kits wurde in 0,4 ml Salzlösung gelöst und die Lösung wurde vor dem Zusatz von Na99m-TcO4 in Salzlösung (0,4 ml) für 5 min stehengelassen. Die Kit-Lösung wurde vor der Verwendung für 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die HPLC-Analyse auf einer Größenausschlußsäule, Bio-Sil, zeigte an, daß 96% der Aktivität an das Protein angelagert waren und 4% der Aktivität in Form von Material mit kleinem Molekulargewicht vorlagen.
  • BEISPIEL 2 – IN VIVO-STABILITÄT VON MIT TC-99m MARKIERTEM IMP-155-LL2-F(ab')2-KONJUGAT, BIODISTRIBUTION UND SERUMANALYSEN IN BALB/c-MÄUSEN
  • Tc-99m-Markierung und Aufreinigung
  • Das LL2-F(ab')2-Konjugat wurde durch Austausch mit Tc-99m-Glucoheptonat bei Raumtemperatur wie folgt markiert:
    Es wurde ein Glucoheptonat-Markierungskit, GlucoscanTM (DuPont), mit 30 mCi Tc-99m in 2 ml markiert. 0,6 ml des Tc-99m-Glucoheptonats wurden zu dem Probengefäß mit dem IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugatkit (1 mg Konjugat und Saccharose enthaltend) zugegeben, das wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet war. Das Probengefäß wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das markierte Material wurde dann durch zwei aufeinanderfolgende 3-ml-Spin-Säulen mit Sephadex G 50–80 (pH-Wert 7,3, 0,1 M PBS) aufgereinigt. Das Produkt wurde mit Salzlösung in einem leeren sterilen Probengefäß auf 5 mCi/ml verdünnt.
  • Biodistributionsuntersuchung
  • Neun BALB/c-Mäusen wurden 100 μl (500 μCi) des aufgereinigten Tc-99m-LL2-F(ab')2-Konjugats injiziert. Die Tiere wurden betäubt und getötet, drei Tiere pro Zeitpunkt, nach 1 Stunde, 4 Stunden und 24 Stunden. Auch das Serum für die Analyse wurde nach 1 Stunde, 4 Stunden und 24 Stunden genommen. Die Serumproben wurden nach der Isolierung eingefroren und unmittelbar vor der HPLC-Analyse auf der Größenausschluß-HPLC-Säule (Bio-Sil SEC 250, Gelfiltrations-HPLC-Säule, 300 mm × 7,8 mm) aufgetaut. Es wurden die folgenden Gewebe und Organe entnommen und ausgezählt: Blut, Leber, Nieren, Milz, Lungen, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Muskel, Urin.
  • Die HPLC-Analyse der Serumproben zeigte an, daß die Aktivität in dem Serum zu allen Zeitpunkten primär im Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 vorlag.
  • Biodistribution von Tc-99m-LL2-F(ab')2 in BALB/c-Mäusen % der injizierten Dosis/Gramm Gewebe Standardabweichung, 3 Tiere/Zeitpunkt
    Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • BEISPIEL 3 – VERGLEICH VON TC-99m-IMP-155-LL2 F(ab')2 UND MIT I-125 MARKIERTEM LL2-F(ab')2 IN NACKTEN MÄUSEN, DIE DEN RAMOS-TUMOR TRAGEN.
  • Tc-99m-Markierung
  • Ein IMP-155-LL2-F(ab')2-Kit wurde mit 5 mCi 99m-TcO4 – in 0,3 ml Salzlösung markiert. Das Kit wurde für 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit Salzlösung auf 0,75 ml verdünnt und durch zwei aufeinanderfolgende 3 ml-Spin-Säulen mit Sephadex G 50–80 in acetatgepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 5,3 aufgereinigt.
  • I-125-Markierung
  • Das Antikörperfragment LL2-F(ab')2, 23,3 μl (5,15 mg/ml) wurde mit 50 μl 0,5 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 gemischt und zu einem Probengefäß zugegeben, das 2,5 mCi I-125 enthielt. Es wurde eine Lösung von Chloramin-T, 12 μl (0,0034 g in 2 ml PBS) zugegeben und man ließ die Reaktion für 3 min bei Raumtemperatur ablaufen, bevor sie mit 20 μl (0,0254 g in 10 ml) einer Lösung von Natriummetabisulfit gequencht wurde.
  • Gemischte Markierung
  • Das I-125-LL2-F(ab')2 befand sich in einer Lösung, die 1,6 mCi in ~3 ml enthielt. Das I-125-LL2-F(ab')2 und das Tc-99m-LL2-F(ab')2 wurden in einem Verhältnis von 5 μCi I-125 zu 25 μCi Tc-99m gemischt. Die fertige gemischte Lösung enthielt 220 μCi I-125-LL2-F(ab')2 und 1,04 mCi Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 in 2,0 ml Lösung.
  • Biodistribution
  • Eine Gruppe von fünf nackten, Ramos-Tumor tragenden Mäusen mit gleich großen Tumoren wurden pro Zeitpunkt verwendet. Jedem Tier wurden 50 μl der vorgemischten Lösung (5 μCi I-125 und 25 μCi Tc-99m) injiziert. Die Tiere wurden nach 1 Stunde, 4 Stunden und 24 Stunden betäubt und durch Halswirbel-Dislokation getötet. Die folgenden Gewebe und Organe wurden entnommen und ausgezählt: Tumor, Blut, Muskel, Leber, Nieren, Milz, Magen.
  • Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugat, das mit I-125-LL2-F(ab')2 co-injiziert wurde Ausgewählte Ergebnisse der Tc-99m-Biodistribution % ID/g SD, 5 Tiere/Zeitpunkt
    Figure 00130001
  • Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugat, das mit I-125-LL2-F(ab')2 co-injiziert wurde Ausgewählte Ergebnisse der I-125-Biodistribution % ID/g SD
    Figure 00130002
  • BEISPIEL 4 – VERGLEICH VON TC-99m IMP-155-LL2-F(ab')2 MIT TC-99m-LL2 Fab'
  • Tc-99m-Markierung des IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugats
  • Ein IMP-155-LL2-F(ab')2-Kit wurde mit 5 mCi 99m-TcO4 – in 0,3 ml Salzlösung markiert. Das Kit wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann mit Salzlösung zu 0,75 ml verdünnt und durch zwei aufeinanderfolgende 3-ml-Spin-Säulen mit Sephadex G 50–80 in acetatgepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 5,3 aufgereinigt. Die Probe wurde auf 500 μCi/ml mit Salzlösung verdünnt.
  • Tc-99m-LL2-Fab'-Markierung:
  • Ein LL2-Fab'-Kit (LymphoscanTM – Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ) wurde bei Raumtemperatur mit 31 mCi Tc-99m in 1 ml, das zu dem gefriergetrockneten Kit zugegeben wurde, radioaktiv markiert. Ein 50-μl-Aliquot (1,55 mCi) wurde entnommen und mit Salzlösung auf 3 ml (500 μCi/ml) verdünnt.
  • Biodistribution
  • Eine Gruppe von fünf nackten Mäusen, die den Ramos-Tumor tragen, mit Tumoren gleicher Größe wurden pro Zeitpunkt verwendet. Jedem Tier wurden 50 μl des markierten Antikörperfragments (25 μCi Tc-99m) injiziert. Die Tiere wurden nach 4 Stunden und 24 Stunden betäubt und durch Halswirbel-Dislokation getötet. Die folgenden Gewebe und Organe wurden entnommen und ausgezählt: Tumor, Blut, Muskel, Leber, Nieren, Milz, Magen. Das Verhältnis von Tumor zu normalem Organ ist für jedes Organ angegeben.
  • Vergleich des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugats mit Tc-99m-LL2-Fab' Biodistribution des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugats
    Figure 00140001
  • Biodistribution des Tc-99m-LL2-Fab'
    Figure 00140002
  • BEISPIEL 5 – STABILITÄTSSTUDIEN
  • Die Stabilität des mit Tc-99m markierten Konjugats wurde untersucht durch Austauschmarkierung des Konjugats mit Tc-99m-Glucoheptonat gefolgt von der Aufreinigung des markierten Proteins durch zwei aufeinanderfolgende Gelsäulen mit Sephadex G 50–80, was alle der ungebundenen Tc-99m-Spezies mit niedrigem Molekulargewicht entfernte. Das aufgereinigte Material wurde dann mit ITLC (0,1 M Citrat, pH-Wert 5), Größenausschluß-HPLC und HPLC an reverser Phase analysiert.
  • Die Stabilität der verschiedenen Konjugate wurde abgeschätzt durch Inkubation in dem Gelfiltrationspuffer oder dem Markierungspuffer bei Raumtemperatur für 24 Stunden, unter Einwirkung von 1 mM Cystein bei 37°C über 24 Stunden und durch Inkubation in Serum bei 37°C über 24 Stunden.
  • Analytische Verfahren
  • ITLC:
  • Die ITLC-Streifen wurden mit einem Aliquot (0,2 μCi) der markierten Lösung betüpfelt und mit 0,1 M Citratpuffer mit einem pH-Wert von 5 eluiert. Das markierte Protein verblieb am Startpunkt, während 99m-TcO4 – und Tc-99m-Glucoheptonat den Teststreifen aufwärts eluiert wurden.
  • Größenausschluß-HPLC:
  • Eine Gelfiltrations-HPLC-Säule von Bio-Rad, Bio-Sil SEC 250 (300 mm × 7,8 mm), wurde mit 1 ml/min eines 0,2 M Phosphatpuffers, der 0,02% Natriumazid enthielt, mit einem pH-Wert von 6,8 eluiert.
  • Analyse von mit Tc-99m markierten Spezies durch Größenausschlußchromatographie
    Figure 00150001
  • HPLC an reverser Phase:
  • Die HPLC an reverser Phase wurde auf einer Säule von Waters, Radial-Pak, C-18, Nova-Pak (4 μ, 100 × 8 mm), durchgeführt. Die Säule wurde mit einem Gradienten aus zwei Puffern eluiert (Puffer A: 0,1% wäßrige TFA, Puffer B: 90% Acetonitril, 10% Wasser, 0,1% TFA). Der Gradient war der folgende: Flußrate 3 ml/min 100% Puffer A zu 100% Puffer B über 10 min, Flußrate 5 ml/min für 5 min. Das Verfahren der HPLC an reverser Phase war geeignet für die Identifizierung der Natur der mit Tc-99m markierten Spezies mit niedrigem Molekulargewicht. Die stabilen mit Tc-99m markierten Proteine ließen sich auf der HPLC an reverser Phase nicht gut eluieren.
  • HPLC-Analyse an reverser Phase von mit Tc-99m markierten Spezies
    Figure 00150002
  • Tc-99m-IMP 126-LL2-F(ab')2
  • Das markierte Rohprotein, das analog zu dem markierten IMP-155-LL2-F(ab')2 hergestellt war, wurde auf einer Gelsäule mit Sephadex G 50–80 in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3 aufgereinigt. Es wurde ein Aliquot entnommen und fünffach in Salzlösung verdünnt. Die Salzlösung wurde für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Größenausschluß-HPLC-Anaylse zeigte, daß ungefähr 5% der Aktivität nach 1 Stunde von dem Protein dissoziiert war.
  • Die Inkubation von Tc-99m-IMP-126-LL2-F(ab')2 in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, der 1 mM Cystein enthielt, bei 37°C für 1,5 Stunden verursachte, daß 31% des markierten Proteins zu dem Tc-99m-IMP-126-Fab'-Fragment reduziert wurden. 56% des Tc-99m-IMP-126-LL2--F(ab')2 verblieben intakt und 12% der Aktivität wurden zu Spezies mit niedrigem Molekulargewicht, wie z.B. Tc-99m-Cystein, umgewandelt.
  • Die Inkubation von Tc-99m-IMP-126-LL2-F(ab')2 zehnfach verdünnt in frischem humanem Serum für 21 Stunden bei 37°C führte dazu, daß 34% der Aktivität in Form von Spezies mit niedrigem Molekulargewicht verloren gingen. Es gab drei mit Tc-99m markierte Proteinspezies, alle in etwa mit dem gleichen Prozentsatz (20%) an Aktivität. Die Peaks schienen auf Aggregat, Tc-99m-IMP-126-LL2-F(ab')2 und Tc-99m-IMP-126-LL2-Fab' zurückzuführen zu sein.
  • Tc-99m-IMP-140-LL2-F(ab')2
  • Das markierte Peptid, das analog zu dem markierten IMP-155-LL2-F(ab')2 hergestellt war, wurde aufgereinigt und über Nacht in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3 gelagert. Die Größenausschluß-HPLC-Analyse zeigte, daß ungefähr 30% der Aktivität nach 24 Stunden von dem Protein dissoziiert waren. Die HPLC-Anaylse an der reversen Phase zeigte an, daß die Masse der mit Tc-99m markierten Spezies mit niedrigem Molekulargewicht in Form des mit Tc-99m markierten Peptids vorlag, das sich von dem Protein hydrolytisch abgespalten hatte. Hieraus konnte geschlossen werden, daß die Acylhydrazon-Verbindung zu dem Antikörper instabil war.
  • Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2
  • Das markierte Peptid wurde aufgereinigt und über Nacht in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3 gelagert. Die Größenausschluß-HPLC-Anaylse zeigte nach Inkubation für 24 Stunden bei Raumtemperatur weniger als 5% Abbau zu Spezies mit niedrigem Molekulargewicht.
  • Die Inkubation von Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, der 1 mM Cystein enthielt, bei 37°C führte dazu, daß der Großteil des markierten Proteins (61,5%) zu dem Tc-99m-IMP-155-Fab'-Fragment reduziert wurde. 8% des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 verblieben intakt und 30% der Aktivität wurden in Spezies mit niedrigem Molekulargewicht umgewandelt, wie z.B. in Tc-99m-Cystein.
  • Die Inkubation von Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 zehnfach verdünnt in frischem humanem Serum für 21 Stunden bei 37°C führte dazu, daß 10% der Aktivität in Form von Spezies mit niedrigem Molekulargewicht verloren gingen. Es gab drei mit Tc-99m markierte Proteinspezies. Die Signale schienen auf Aggregat (38%), Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 (42%) und Tc-99m-IMP-155-LL2-Fab' (9%) zurückzuführen zu sein. Die Aggregatbildung könnte ein Artefakt infolge einer Disulfidausbildung sein, die durch die Einwirkung von Sauerstoff verursacht wurde.
  • BEISPIEL 6 – AGGREGATBILDUNG
  • Wie ein Peak mit hohem Molekulargewicht anzeigte, der im UV und bei der Tc-99m-Markierung des Proteins vorlag, wenn es durch Größenausschluß-HPLC analysiert wurde, wurde während des Konjugationsvorgangs etwas Proteinaggregat (2–10%) gebildet. Das Aggregat schien auf die Disulfidbildung zwischen den Peptidthiolen eines Konjugats mit den Thiolen eines anderen Konjugats zurückzuführen zu sein. Das Aggregat verschwand bei Behandlung mit einem Überschuß an Cystein. Im Verlauf von in-vitro-Stabilitätsstudien wurde im Serum etwas Aggregatbildung beobachtet. Auch dies schien auf die Disulfidbildung zurückzuführen zu sein. Im frischen Serum trat weniger Aggregation auf als in älterem Serum und der Zusatz von Cystein zum Serum verringerte die Menge an gebildetem Aggregat zu einem großen Teil. Die in-vivo-Serumproben zeigten etwas Aggregatbildung, jedoch lag die Masse der Aktivität in Form des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 vor.
  • BEISPIEL 7 – BELADEN VON OXIDIERTEM LL2-F(ab')2 MIT PEPTID
  • Die Konjugationen von IMP 155 wurden wie oben beschrieben durchgeführt und die Antikörperkonzentration wurde anhand der UV-Absorption eines Aliquots bei 280 nm gemessen. Der Thiolgehalt wurde unter Anwendung eines Ellman-Tests durchgeführt und die Thiolkonzentration im Aliquot wurde mit dem Antikörpergehalt, der durch UV bestimmt wurde, in Beziehung gesetzt, um die Thiolladung auf dem Antikörper zu erhalten. Später wurde festgestellt, daß das Verfahren der UV-Messung ungenau war, weil das Peptid eine signifikante Absorption bei der Wellenlänge aufwies, die verwendet wurde, um den Proteingehalt zu bestimmen, wodurch sich ein künstlich hoher Wert für den Proteingehalt ergab. Die Analyse wurde dann auf die Matrix-unterstützte Laser-DesorptionsIonisations- (MALDI-) Massenspektrometrie umgestellt, um die Anzahl der an das Protein angelagerten Peptide eindeutig zu bestimmen. Die Ergebnisse in den Tabellen unten zeigen, daß die Peptidladung über einen Bereich von Verhältnissen Peptid zu Antikörper während der Konjugation einheitlich war. Unter Anwendung der oben beschriebenen Oxidations- und Konjugationsbedingungen werden durchschnittlich vier Peptide pro Antikörper angebracht.
  • Konjugation von IMP 155 mit mit Periodat oxidiertem LL2-F(ab')2
    Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Daten der Massenspektrometne
    Figure 00180002
  • BEISPIEL 8 – KONTROLLVERSUCHE
  • Konjugationskontrolle
  • Es wurde ein Konjugationskontrollversuch durchgeführt, um festzustellen, ob das freies Thiol enthaltende Peptid unter Ausbildung von Proteinthiolen mit Disulfiden auf dem Antikörper reagiert oder ob das Peptid an dem Antikörper durch andere Mittel angelagert wurde als an das oxidierte Kohlenhydrat. Bei diesem Versuch wurde gleichzeitig zu einem Anteil von mit Periodat oxidiertem LL2-F(ab')2 nicht-oxidiertes LL2-F(ab')2 mit dem 50-fachen Überschuß an IMP 155 behandelt. Das mit Periodat oxidierte LL2-F(ab')2 bildete ein Konjugat aus, das 2,3 Thiole/AK enthielt, wie anhand des UV festgestellt wurde (4,3 Peptide/AK nach MALDI), und das nicht-oxidierte LL2-F(ab')2 enthielt 0,2 Thiole/AK, wie anhand des UV festgestellt wurde. Dieser Versuch zeigte, daß die Periodat-Oxidation notwendig war, um das Peptid an dem Antikörper anzubringen und daß die vorliegenden Thiole sich auf dem Peptid befanden und nicht ein Produkt gegenseitigen Disulfidaustauschs waren.
  • Tc-99m-Markierungskontrolle
  • Es wurde ein Kontrollversuch durchgeführt, bei dem eine Charge des LL2-F(ab')2 mit Periodat behandelt wurde und wie oben beschrieben mit dem 100-fachen Überschuß des Peptids IMP 140 konjugiert wurde, außer daß nach 2 Stunden der Konjugation 10 mg/ml Natriumcyanoborhydrid zugegeben wurden und die Konjugation vor der Aufreinigung 2 Stunden länger fortgesetzt wurde. Die Kontrollcharge des LL2-F(ab')2 wurde gleich behandelt, außer daß in der Oxidationskontrolle kein Periodat vorlag. Die beiden Antikörperzubereitungen wurden durch Austausch mit Tc-99m-Glucoheptonat markiert. Der Teil, der vor der Konjugation mit Periodat behandelt wurde, brachte eine Markierungsausbeute von 60% hervor, wie anhand der ITLC in 0,1 M Citratpuffer mit einem pH- Wert von 5 gezeigt wurde, und die nicht-oxidierte Kontrolle zeigte gemäß der ITLC, daß 6% des Tc-99m an das Protein gebunden waren.
  • Darüber hinaus wurde IMP 171, ein Peptid, welches zwei Metall bindende Liganden enthält, an LL2-F(ab')2 konjugiert, indem das gleiche Verfahren angewandt wurde, das für IMP 155 beschrieben wurde. Weil die erhöhte Anzahl an Thiolen die Reduzierung von LL2-F(ab')2 zu LL2-Fab' verursachen könnte, war es erforderlich, bei diesem Peptid ein Verhältnis Peptid zu Antikörper von 50:1 oder weniger einzusetzen. Diese Reaktion brachte ein Konjugat, IMP-171-LL2-F(ab')2, mit der zweifachen Anzahl an Thiolen (5,3 Thiole/AK) hervor im Vergleich zu der IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugation (2,3 Thiole/AK), die mit der gleichen Charge an oxidiertem Antikörper durchgeführt wurde.
    IMP-171 H2NHN-CH2CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys)-D-Asp-D-Lys-D-Lys(TscG-Cys)-D-Asp-D-Lys-NH2 MH + 1412
  • BEISPIEL 9 – MARKIERUNG MIT RHENIUM
  • Rhenium-Markierung unter Verwendung eines Verfahrens zur Vorreduzierung für Re-188.
  • Diese Konjugate können mit Rhenium-Isotopen markiert werden (primär Re-186 und Re-188), die dann in der Radioimmuntherapie einsetzbar sind. Da die Reduzierung von Perrhenat mehr Zinnionen erfordert (üblicherweise über 200 μg/ml Endkonzentration) als für die Reduzierung von Technetium gebraucht wird, ist besonders Sorge zu tragen, um zu gewährleisten, daß der höhere Gehalt an Zinnionen nicht die empfindlichen Disulfidbindungen reduziert, wie z.B. diejenigen, die im Gelenkbereich des F(ab')2-Fragments vorliegen. Bei der radioaktiven Markierung mit Rhenium werden ähnliche Verfahren angewandt, wie sie bei Tc-99m angewendet werden, außer daß die Kontaktzeit zwischen MAK und Sn(II) zeitmäßig beschränkt ist, um Reduzierungen der Disulfidbindung vorzubeugen, oder das Rhenium des Perrhenats wird vor dem Vermischen mit dem Antikörperfragment-Konjugat reduziert. Dann wird eine wäßrige Lösung des Thiol-Liganden enthaltenden Substrats mit 188ReOCl3(PPh3)2 in CH2Cl2 nach dem Verfahren von Lisic et al. vermischt. Das CH2Cl2 wird dann unter einem Stickstofffluß entfernt, und es wird in 0,1 ml einer 10%-igen wäßrigen Lösung von 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD) gelöst. Die HPCD-Lösung wird dann mit 0,5 ml einer Lösung des IMP-155-LL2-F(ab')2 (4 mg/ml) vermischt, was für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wird. BEISPIEL 10 – TECHNETIUM-MARKIERUNG Tc-99m-Markierung eines Thiol enthaltenden Octreotids
    IMP 162 GDdDK(TscGC)FdCFWdKTCTol MH+ 1667
  • Das Peptid IMP 162 (0,0012 g) wurde in 30 ml einer wäßrigen Lösung gelöst, die 10% HPCD, 200 mM Glucoheptonat, 14 mM Natriumacetat und 12 mM Ascorbinsäure enthielt und einen pH-Wert von 5,29 aufwies. Eine Zinnlösung wurde hergestellt, indem 0,2 ml von 200 mg/ml SnCl2 in 6 M HCl mit 3,8 ml der HPCD-Glucoheptonatlösung vermischt wurden. Ein 0,2 ml-Aliquot der Zinn/HPCD-Lösung wurde zu der Peptidlösung zugegeben und die Lösung wurde dann durch einen Millex-GV-Filter mit 0,22 μm in Aliquots von 1,5 ml in Gefriertrocknungsbehälter filtriert. Die Probenbehälter wurden dann eingefroren, gefriergetrocknet und unter Vakuum versiegelt.
  • Tc-99m-Kit-Markierung
  • Das gefriergetrocknete Kit wurde mit 20 mCi 99mTcO4 – in 1,5 ml Salzlösung zur ursprünglichen Konzentration verdünnt und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann im kochenden Wasserbad für 15 min erwärmt. Die Markierung ist vollständig und quantitativ.
  • BEISPIEL 11 – ARZNEISTOFFKONJUGAT
  • Konjugation eines chemotherapeutischen Arzneistoffs zu einem Disulfid enthaltenden Peptid
  • Ein Analogon des Octreotids, das einen angehängten N-terminalen Serinrest aufweist, der an das ursprüngliche Octapeptid angelagert wurde, wird unter Verwendung von Natrium-m-Periodat zur Ausbildung eines N-terminalen Aldehyds oxidiert. Dieses Zwischenprodukt wird mit einer Menge an IMP-155-Peptid umgesetzt, die ausreichend ist, um alle auf dem Serin-Octreotid vorliegenden Aldehydgruppen in N-terminale Hydrazone umzuwandeln. Die Hydrazone werden unter Verwendung von Natriumcyanoborhydrid zu Alkylhydrazinen reduziert, und das intermediäre mit Thiol behaftete IMP-155-Hydrazinyl-Octreotid wird aufgereinigt und mit dem Anti-Krebsmittel Calicheamicin durch Thiolaustausch mit der Trisulfidgruppe des letzteren gekoppelt. Das Produkt Calicheamicin-Octreotid umfaßt einen Disulfid-IMP-155-Peptidyl-Hydrazinlinker.
  • BEISPIEL 12 – ARZNEISTOFFKONJUGAT
  • Regiospezifische Substitution von Doxorubicin an ein Disulfidbindung enthaltendes Polypeptid
  • a) Herstellung eines Aldehyd enthaltenden (scFv)2-Fragments
  • Eine Lösung eines humanen (scFv)2-Fragments, das eine N-terminale Serin-Aminosäure trägt, 3 mg/ml, wird für 2 Stunden im Dunkeln bei 4°C mit 10 mM Natriumperiodat behandelt. Um überschüssiges Periodat zu zerstören, wird Glycerol in einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben und das Reaktionsgemisch wird für weitere 20 min gerührt. Das N-terminal oxidierte (scFv)2 wird auf einer Säule mit G-10-Sephadex, die mit mit Argon entgastem 0,1 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,5 und 1 mM EDTA enthaltend äquilibriert und laufen gelassen wird, von Kontaminationen mit niedrigem Molekulargewicht befreit. Vor der weiteren Umsetzung wird das Produkt auf 5 mg/ml konzentriert.
  • b) Herstellung eines mit Thiol behafteten (scFv)2-Fragments
  • Das (scFv)2-Zwischenprodukt mit N-terminalem Aldehyd, das nach a) erhalten wurde, wird mit frisch zubereiteter DMSO-Lösung von p-(2-Thioethyl)-phenylhydrazin (TEPH) in einem molaren Überschuß von 20:1 behandelt, und das Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden bei 4°C gerührt. Das Produkt, TEPH-(scFv)2, das eine Hydrazon-Verbindung enthält, wird erhalten durch Aufreinigung auf einer G-10-Sephadex-Säule, die mit mit Argon entgastem 0,1 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 6,5, enthaltend 1 mM EDTA, äquilibriert und laufen gelassen wird. Wahlweise wird vor der Aufreinigung das Phenylhydrazon zu einer Phenylhydrazinverbindung reduziert durch eine zweistündige Reaktion in Anwesenheit von 10 mM Natriumborhydrid nach einer pH-Einstellung des anfänglichen Reaktionsgemischs auf von 5,5 bis 7,0 mit einer kleinen Menge an Natriumcarbonat. Das Produkt TEPH-(scFv)2 wird mit SE-HPLC auf einer Bio-Sil-GF-125-Säule, die in 0,5 M Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 6,5 äquilibriert wurde, analysiert, um das Fehlen des Abbaus in scFv-Monomere zu bestätigen. Aliquots des Produkts werden nach dem Bicinchoninsäure- (BCA-) Verfahren ebenfalls separat auf ihre Proteinkonzentration untersucht und nach der Ellman-Reaktion auf den Thiolgehalt, und auf diese Weise wird durch Ableitung die Anzahl der Thiolgruppen pro Mol TEPH-(scFv)2 bestimmt.
  • c) Aktivierung des Doxorubicins zu Maleinimid-Doxorubicin
  • Eine Lösung des Doxorubicin-Hydrochlorids (10 mM) in 5 ml 50% DMSO/0,1 M Natriumboratpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 wird mit einem zweifachen molaren Überschuß des im Handel erhältlichen Cross-Linkers m-Maleinimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS, Pierce Chem. Co., Rockford, IL) behandelt. Das Reaktionsgemisch läßt man für 3 Stunden bei Raumtemperatur rühren, bevor es mit 5% Natriumchloridlösung auf 20 ml verdünnt wird. Die Mischung wird mit 3 × 20 ml eines im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, wie z.B. Ethylacetat, extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte werden mit 3 × 20 ml 0,1 M Natriumbicarbonat mit einem pH-Wert von 8,0 gewaschen. Die organische Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und evaporiert, um das Maleinimid-Doxorubicin zu erhalten.
  • d) Kopplung des Maleinimid-Doxorubicins mit TEPH-(scFv)2
  • TEPH-(scFv)2 in mit Argon entgastem 0,1 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 6,5 und 1 mM EDTA enthaltend bei 4°C wird 15%-ig in DMSO gelöst und mit einem zweifachen molaren Überschuß (bezogen auf den Thiolgehalt) an Maleinimid-Doxorubicin in DMSO, das unter schnellem Rühren in einem Schwung zugegeben wird, behandelt. Das Rühren wird für 1 Stunde bei 4°C fortgesetzt und das Doxorubicin-(scFv)2 wird durch Säulenchromatographie auf einer Sephadex-G-10-Gelsäule, die mit 0,2 M natriumphosphatgepuffertem 0,9%-igen Natriumchlorid mit einem pH-Wert von 7,5 äquilibriert ist.

Claims (24)

  1. Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Konjugats eines Proteins, Polypeptids oder Peptids, das wenigstens eine Disulfidbindung enthält, welche notwendig ist, um dessen biologische Aktivität aufrechtzuerhalten, und das wenigstens einen Thiol enthaltenden Rest trägt, der über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung damit verbunden ist, bei dem man das Protein, Polypeptid oder Peptid mit einem entweder als Vorprodukt gebildeten oder in situ erzeugten, mit Thiol reaktionsfähigen diagnostischen oder therapeutischen Mittel in Kontakt bringt, um ein stabiles diagnostisches oder therapeutisches Konjugat des Proteins, Polypeptids oder Peptids ohne wesentliche Spaltung der wenigstens einen Disulfidbindung auszubilden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mit dem Protein, Polypeptid oder Peptid über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung verbundene, Thiol enthaltende Rest durch das Umsetzen des die Disulfidbindung enthaltenden Proteins, Polypeptids oder Peptids, das auch eine Aldehyd- oder Ketogruppe enthält, mit einem Thiol-Hydrazin der Formel HS-Q-NHNH2 verbunden wird, wobei Q ein Bindungsrest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Alkylgruppen, Arylgruppen, Cycloalkylgruppen, Peptide und Kombinationen davon umfaßt, und wobei wahlweise das erhaltene Hydrazon zu einem Hydrazin reduziert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das diagnostische oder therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die Arzneistoffe, Antikörper, Antikörperfragmente, Proteine, Glykoproteine, DNA, RNA, PNA, Metallkomplexe, radioaktiv markierte diagnostische und therapeutische Spezies, Enzyme, Toxine und Zucker umfaßt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das diagnostische oder therapeutische Mittel ein Thiol bindendes kationisches Radioisotop ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel ein Arzneistoffderivat ist, das einen Thiol bindenden Linker umfaßt.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ein glykosyliertes divalentes Antikörperfragment ist, dessen teilweise oxidierter Kohlenhydratanteil über die Hydrazon- oder Hydrazinverbindung mit dem Thiol enthaltenden Rest verbunden ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Thiol enthaltende Rest einen Chelatbildner umfaßt.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Thiol enthaltende Rest einen Chelatbildner umfaßt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der teilweise oxidierte Kohlenhydratanteil mit dem Chelatbildner verbunden wird, indem man den Kohlenhydratanteil eines glykosylierten, divalenten Antikörperfragments oxidiert, um Aldehyd- und Ketogruppen zu erzeugen, und die Aldehyd- und Ketogruppen an dem oxidierten Fragment mit einem Peptid umsetzt, das einen oder mehrere Thiol enthaltende Chelatbildner umfaßt und das eine Alkylhydrazingruppe trägt, und wahlweise das erhaltene Hydrazon zu einem Hydrazin reduziert.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid D-Aminosäuren umfaßt.
  11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Thiol enthaltende Chelatbildner ein Thiosemicarbazonylglyoxylcystein ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das diagnostische oder therapeutische Radioisotop ein Radioisotop eines Elements ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Technetium, Rhenium, Zink, Kupfer, Quecksilber, Cadmium, Platin, Palladium, Blei und Wismut umfaßt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Radioisotop Tc-99m, Re-186 oder Re-188 ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das divalente Antikörperfragment ein F(ab')2- oder F(ab)2-Fragment ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das kationische Radioisotop in situ erzeugt wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Peptid, das den Thiol enthaltenden Chelatbildner umfaßt, H2NHN-CH2-CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-NH2 ist, wobei TscG Thiosemicarbazonylglyoxyl ist und wobei das Peptid über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung mit dem teilweise oxidierten Kohlenhydratanteil des glykosylierten, divalenten Antikörperfragments verbunden ist.
  17. Kit für die Verwendung bei der Herstellung eines radioaktiv markierten, glykosylierten, divalenten Antikörperfragments, das ein glykosyliertes, divalentes Antikörperfragment umfaßt, dessen teilweise oxidierter Kohlenhydratanteil über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung mit einem Peptid verbunden ist, das wenigstens einen Thiol enthaltenden Chelatbildner umfaßt.
  18. Kit nach Anspruch 17, das weiterhin Zinnionen zur Reduzierung von radioaktiven Pertechnetat- oder radioaktiven Perrhenat-Anionen umfaßt, um kationische Technetium- oder Rhenium-Radioisotope in situ zu erzeugen.
  19. Kit nach Anspruch 17, wobei das Peptid D-Aminosäuren umfaßt.
  20. Kit nach Anspruch 17, wobei der Thiol enthaltende Chelatbildner ein Thiosemicarbazonylglyoxylcystein ist.
  21. Kit nach Anspruch 17, wobei das divalente Antikörperfragment ein F(ab')2- oder F(ab)2-Fragment ist.
  22. Kit nach Anspruch 19, wobei das Peptid, das den Thiol enthaltenden Chelatbildner umfaßt, H2NHN-CH2-CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-NH2 ist, wobei TscG Thiosemicarbazonylglyoxyl ist und wobei das Peptid über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung mit dem teilweise oxidierten Kohlenhydratanteil des glykosylierten divalenten Antikörperfragments verbunden ist.
  23. Diagnostisches oder therapeutisches Konjugat eines Proteins, Polypeptids oder Peptids, das wenigstens eine Disulfidbindung enthält, die notwendig ist, um dessen biologische Aktivität aufrechtzuerhalten, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 1.
  24. Kit zur Herstellung des diagnostischen oder therapeutischen Konjugats nach Anspruch 23 mit einem Protein, Polypeptid oder Peptid, das wenigstens eine Disulfidbindung enthält, die notwendig ist, um dessen biologische Aktivität aufrechtzuerhalten, und das wenigstens einen Thiol enthaltenden Rest trägt, der einen Chelatbildner umfaßt, der damit über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung verbunden ist, und einem mit Thiol reaktionsfähigen diagnostischen oder therapeutischen kationischen Radionuklid, das entweder als Vorprodukt gebildet oder in situ erzeugt wird.
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