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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Verfahren zum Einbringen von Thiol enthaltenden
Linkern in auf Krankheiten zielende Mittel, die Disulfidbindungen
enthalten, die radioaktiv markierten zielenden Mittel und Arzneistoffkonjugate,
die nach diesen Verfahren hergestellt werden und die Verwendung
der radioaktiv markierten oder Arzneistoff tragenden zielenden Mittel
für Diagnose
und Therapie.
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Beschreibung der verwandten
Techniken
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Freie
Thiole bieten ein einzigartigen chemischen Angriffspunkt für die Anlagerung
einer Vielzahl von Spezies an spezifisch zielende Mittel aufgrund
der Spezifität
der Thiolgruppe für
reaktive Gruppen, wie z.B. Haloacetate, Maleinimide und aktivierte
Sulfonylgruppen, und für
reduzierte Metallspezies, wie z.B. reduziertes Pertechnetat und
Perrhenat, und bestimmte andere thiophile Metalle, wie z.B. Zink,
Kupfer, Quecksilber, Cadmium, Platin, Palladium, Blei und Wismut.
Allerdings ist bei vielen Proteinen, Polypeptiden und Peptiden das Vorliegen
von Disulfidbindungen, die im Hinblick auf ihre strukturelle Integrität kritisch
sind, ein kompliziertes Problem. Die inhärente Reaktivität der Thiolgruppe
kann zu einem Bruch solcher Disulfidbindungen führen, was mit der Ausbildung
von gemischten Disulfiden und einer Unfähigkeit der Proteine, Polypeptide
und Peptide an ihr Zielantigen oder ihren Rezeptor zu binden, einhergehen
kann.
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Antikörperfragmente
sowie sub-Fab'-Fragmente,
Einzelketten-Antikörper,
Diabodies, Polypeptide und Peptide bieten Vorteile für das in
vivo-Zielen von Isotopen und Arzneistoffen für die Szintigraphie und die
Strahlentherapie, weil die kleineren Fragmente schneller zielen
und verschwinden werden als ein intaktes IgG oder ein größeres Protein.
Beispielsweise transportiert ein radioaktiv markiertes Antikörperfragment
eine Dosis eines therapeutischen oder bildgebenden Isotops schneller
zu einem Ziel als ein intaktes IgG, und die schnellere Entfernung
wird die radiometrische Dosis für
die Gewebe, auf die nicht gezielt wurde, minimieren. Das schnelle Zielen
ist insbesondere für
Isotope mit kurzen Halbwertszeiten wichtig, wie z.B. Tc-99 m (t1/2 = 6 Std.) oder Re-188 (t1/2 =
17 Std.). Tc- und Re-Kationen binden stark an Thiol enthaltende
Liganden, aber die Konjugation dieser Liganden an Antikörper oder
Antikörperfragmente
kann Schwierigkeiten bereiten.
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Ein
divalentes Antikörperfragment,
wie z.B. ein F(ab')2-Fragment sollte im Vergleich zu einem Fab'-Fragment insgesamt
besser zielen, weil die divalente Bindungsregion die Affinität des Proteins
zu dem Antigen erhöhen
wird. F(ab')2-Fragmente bestehen aus zwei Fab'-Fragmenten, die
miteinander über
eine oder mehrere Disulfidbindungen verbunden sind, die anfällig für die Reduzierung
durch freie Thiole sowohl während als
auch nach der Konjugation eines Thiol enthaltenden Rests sind. Daher
ist es erforderlich, einen Thiol enthaltenden Liganden mit dem Protein
zu konjugieren, indem man entweder ein geschütztes Thiol verwendet, das
anschließend
entschützt
wird, oder indem man eine niedrige Thiol-Konzentration und hydrophile
Thiole verwendet, um die Wechselwirkung der freien Thiole auf dem
Liganden mit den Disulfiden auf dem Antikörper zu minimieren.
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Ein
weiteres Problem, das während
der Konjugation mit einer nicht-spezifischen Region auf einem zielenden
Mittel auftreten kann, ist, daß das
Konjugat an der oder in der Nähe
der Antigen bindenden Region eines Antikörpers oder der Rezeptor bindenden
Region eines Peptids/Polypeptids gebunden werden kann, was die Bindungsaffinität des Antikörpers oder
Peptids für
das Antigen oder den Rezeptor verringern kann. Die Konjugation von
Haptenen mit mit Periodat oxidierten Kohlenhydratbereichen (Aldehyde
und Ketone) ist ein Verfahren, um Konjugate regiospezifisch zu bilden.
Die Kohlenhydratbereiche können
genetisch in spezifische Regionen auf Proteinen oder Peptiden umgewandelt
werden, so ist es z.B. möglich,
ein Kohlenhydrat in einem Bereich auf einem F(ab')2-Fragment
anzuordnen, das die Bindung des Antikörperfragments an das Antigen nicht
beeinträchtigen
wird.
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Das
Vorliegen von Kohlenhydratresten auf den leichten Ketten bestimmter
IgGs ist bereits etabliert worden. Solche Reste verbleiben jeweils
auf dem F(ab')2S und dem F(ab)2S nach
dem Verdau mit Pepsin oder Papain. Als solche repräsentieren
sie einen maskierten, potentiellen, regiospezifischen chemischen
Angriffspunkt für
die Haptenanlagerung. Außerdem
wurden bestimmte Maus-Antikörper rekonstruiert,
um humanisierte Versionen des komplementaritätsbestimmenden Bereichs desselben
Antikörpers
zu erhalten, während gleichzeitig
an von der Antigen-Bindestelle des Antikörpers enffernten Positionen
Glykosylierungsstellen konstruiert werden. Dies ermöglicht das
Einfügen
von Kohlenhydrat an gewünschten
Positionen innerhalb des Proteins, einschließlich das Einfügen von
Kohlenhydrat in der CH1-Domäne und in
dem variablen Bereich sowohl auf leichten wie auf schweren Ketten.
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Es
ist auch wichtig, ein Konjugat zu haben, das in vitro und in vivo
hinreichend stabil ist, damit die Biodistribution der radioaktiven
Markierung die Biodistribution des Antikörperfragments widerspiegelt.
Wenn die Verknüpfung
des Konjugats mit dem Antikörper
oder die Anlagerung des Radioisotops an das Konjugat instabil ist,
kann dies zu einer wesentlichen Verringerung an Radioisotop führen, das
das Ziel erreicht. Das Radioisotop, das sich von dem Protein abtrennt,
könnte
zu der Hintergrundaktivität
beitragen, was das Zielen weiter verdecken würde.
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WO
96/40289 betrifft Ein-Proben-Verfahren und Kits zur radioaktiven
Markierung von Peptiden mit einem radioaktiven Metallion eines Radionuklids,
das fest an Sulfhydrylgruppen bindet, wobei das Peptid mit einem
tertiären
Thiol enthaltenden chelatbildenden Mittel derivatisiert ist. Bei
den darin beschriebenen Verfahren wird ein geschützter Thiol enthaltender Rest
mit dem Peptid konjugiert, wonach das Derivat entschützt werden kann,
um freie Sulfhydrylgruppen zu erzeugen, ohne die Disulfidbindungen
zu spalten. Das Derivat kann dann mit einem Radionuklid markiert
werden.
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Es
besteht ein kontinuierlicher Bedarf, Thiol enthaltende disulfidverknüpfte zielende
Vektoren herzustellen, die leicht mit thiophilen Metallionen radioaktiv
markiert werden können,
für die
Verwendung in der Szintigraphie und der Strahlentherapie, oder die
mit Arzneistoffen für
die gezielte Chemotherapie substituiert sind. Solch eine Erfindung
muß die
vielen oben diskutierten Probleme berücksichtigen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Konjugate von Disulfld
enthaltenden zielenden Proteinen, Polypeptiden und Peptiden, z.B.
divalente Antikörperfragmente
und (sv)2S, mit Thiol enthaltenden Liganden
bereitzustellen ohne die Disulfidbindungen der zielenden Proteine
zu spalten.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die an den Disulfid enthaltenden
Proteinen oder Peptiden angelagerten substituierten Thiolgruppen
als spezifischen chemischen Angriffspunkt zu verwenden, um weitere
bestimmte Radioisotope oder chemotherapeutische Mittel anzulagern.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, radioaktiv markierte Proteine
bereitzustellen, die in vitro und in vivo stabil sind.
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Noch
eine weitere Aufgabe ist es, stabil substituierte Disulfid enthaltende
Proteine, Polypeptide und Peptide für die Radiodiagnose, die Strahlentherapie
und die Chemotherapie von Krankheiten bereitzustellen.
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Diese
und andere Aufgaben werden gelöst,
indem ein Verfahren bereitgestellt wird zur Herstellung eines diagnostischen
oder therapeutischen Konjugats eines Proteins, Polypeptids oder
Peptids, das wenigstens eine Disulfidbindung enthält, welche
notwendig ist, um dessen biologische Aktivität aufrechtzuerhalten, und das
wenigstens einen Thiol enthaltenden Rest trägt, der über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung
damit verbunden ist, bei dem man das Protein, Polypeptid oder Peptid
mit einem entweder als Vorprodukt gebildeten oder in situ erzeugten,
mit Thiol reaktionsfähigen
diagnostischen oder therapeutischen Mittel in Kontakt bringt, um
ein stabiles diagnostisches oder therapeutisches Konjugat des Proteins,
Polypeptids oder Peptids ohne wesentliche Spaltung der Disulfidbindung
auszubilden.
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Bei
dem vorgenannten Verfahren wird der Thiol enthaltende Rest, der
mit dem Protein, Polypeptid oder Peptid über eine Hydrazon- oder Hydrazinverbindung
verbunden ist, verbunden, indem das die Disulfidbindung enthaltende
Protein, Polypeptid oder Peptid, das auch eine Aldehyd- oder Ketongruppe
enthält,
mit einem Thiol-Hydrazin der Formel HS-Q-NHNH2 umgesetzt
wird, wobei Q ein Bindungsrest ist, der unter Alkylgruppen, Arylgruppen,
Cycloalkylgruppen, Peptiden und Kombinationen davon ausgewählt ist,
und indem man wahlweise das hieraus hervorgehende Hydrazon zu einem
Hydrazin reduziert.
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Das
diagnostische oder therapeutische Mittel in dem Konjugat kann ein
Thiol bindendes kationisches Radioisotop oder ein Arzneistoffderivat
sein, das einen Thiol bindenden Linker umfaßt.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Protein ein glykosyliertes divalentes Antikörperfragment,
dessen teilweise oxidierter Kohlenhydratanteil über die Hydrazon- oder Hydrazinverbindung
mit dem Thiol enthaltenden Rest verbunden ist.
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Als
Vorprodukt ausgebildete, stabile Kits zur Bewirkung der radioaktiven
Markierung gemäß dem vorgenannten
Verfahren werden ebenfalls bereitgestellt.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
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Die
Erfinder dieser Erfindung haben ein Verfahren bereitgestellt für die Konjugation
eines Thiol enthaltenden Peptidlinkers oder -liganden mit einem
Disulfid enthaltenden Protein oder Peptid, z.B. einem F(ab')2, über eine
Carbonylfunktion, z.B. einen mit Periodat oxidierten Kohlenhydratanteil
des Proteins, ohne die Disulfidbindungen zu reduzieren, die die
Struktur und/oder die Konformation, die in Beziehung mit der Aktivität steht, zu
reduzieren, z.B. die Reduzierung des F(ab')2-Fragments
zu Fab' während der
Konjugation oder des Markierungsvorgangs. Es wurden Konjugate hergestellt,
bei denen die Anlagerung des Linkers oder Liganden an das die Disulfidbindung
enthaltende Protein stabil ist und die Anlagerung der radioaktiven
Markierung, z.B. Tc-99m, an den Liganden in vitro und in vivo stabil
ist. Im Falle eines glykosylierten F(ab')2-Fragments
transportieren bevorzugte Ausführungsformen
von mit Tc-99m markierten Peptidchelatbildnern einen höheren Prozentsatz der
injizierten Dosis zu einem Tumor als I-125-markiertes F(ab')2 oder
Tc-99m-markiertes Fab'.
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Überraschenderweise
haben die Erfinder herausgefunden, daß die üblicherweise für die Konjugation von
Arzneistoff- und Chelat-Nuklid-Molekülen an Antikörper über oxidierte
Kohlenhydratreste verwendeten Acylhydrazide sehr instabil sind,
sogar in vitro. Dies wurde in Stabilitätsuntersuchungen mit den mit
Tc-99m radioaktiv markierten Konjugaten IMP-126-LLZ-F(ab')
2 und
IMP-140-LL2-F(ab')
2 gezeigt. LL2 ist ein monoklonaler Anti-CD-22-Antikörper (mab),
der in dem US-Patent 5,789,554 beschrieben ist.
IMP
126 | Ac-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Ala-Gly-NHNH2 |
IMP
140 | Ac-D-Asp-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-D-Asp-NHNH2 |
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TscG
steht für
H2NCSNHN=CHC(O)-Thiosemicarbazonylglyoxyl
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Das
mit Tc-99m markierte Peptid würde
von dem Protein dissoziieren, wenn es in Lösung über längere Zeit gelagert würde. Der
Verlust des markierten Peptids in vitro wurde anhand der Größenausschluß-HPLC und
der HPLC an reverser Phase nachgewiesen. Die Stabilität der Acylhydrazid-Verbindung konnte
bis zu einem gewissen Grad überprüft werden,
indem die dem Acylhydrazid benachbarten Aminosäuren ausgetauscht wurden. Das
Peptid IMP 126 bildete eine stabilere (obwohl immer noch instabile)
Verbindung mit dem LL2-F(ab')2 aus als IMP 140: möglicherweise katalysierte der
Aspartinsäurerest
die Dissoziation des markierten Peptids.
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Es
ist eher möglich,
die Verbindung zwischen Peptidlinker und Protein zu stabilisieren,
indem man ein Hydrazin (z.B. IMP 155) für die Umsetzung mit der Carbonylfunktion,
z.B. dem oxidierten Kohlenhydrat, verwendet als ein Acylhydrazid.
Nach der in-vitro-Inkubation über
Nacht gab es keinen nachweisbaren Verlust an markiertem Peptid.
IMP
155 | H2NHN-CH2-CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-NH2 |
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Überraschenderweise
konnte das freie Thiol enthaltende Peptid ohne merkliche Reduzierung
des Disulfids im Gelenkbereich konjugiert werden.
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Es
wurde eine gleichmäßige Beladung
des Peptids beobachtet (etwa 3,8–4,3 Peptide/LL2 F(ab')2-Fragment) über einen
Bereich von Peptid-/Antikörper-Verhältnissen
(100:1, 50:1, 10:1), die für
die Konjugation verwendet wurden.
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Das
Antikörperkonjugat
konnte in ein Einzelproben-Kit formuliert werden und bei Raumtemperatur
mit Tc-99m markiert werden.
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Das
Tc-99m-markierte Konjugat wurde auf dem mit dem oxidierten Kohlenhydrat
verknüpften
Peptid regiospezifisch markiert. Dies wurde zunächst in Kontrollversuchen gezeigt,
in denen LL2-F(ab')2 dem Konjugationsprozeß unterworfen wurde, außer daß kein Periodat
während
des Oxidierungsschritts zugegeben wurde. Die Kontrolle war eine
mit Tc-99m-Glucoheptonat behandelte und bildete lediglich 6% Tc-99m-markiertes Protein
aus, wie durch ITLC gemessen wurde, während das IMP-155-LL2-F(ab')2,
das unter den gleichen Bedingungen markiert wurde, beachtliche Mengen
des markierten Antikörperfragments
(70–80%)
hervorbrachte. Der andere Beweis dafür, daß Tc-99m an das Peptid angelagert
ist, ist, daß bei
den markierten Acylhydrazid-Peptiden, welche den gleichen Tc-99m-Liganden
wie IMP 155 verwendeten, die Aktivität von dem Protein als das Tc-99m-markierte Peptid
dissoziierte, wie durch Analyse mit Größenausschluß- und reverser-Phasen-HPLC
festgestellt wurde. Der Beweis dafür, daß das Peptid an dem oxidierten
Kohlenhydrat angelagert ist, ist, daß die Konjugation mit dem mit
Periodat oxidierten LL2-F(ab')2 ein Protein hervorbringt, das freie Thiole enthält (2–3 Thiole/LL2-F(ab')2,
wie mit UV gemessen), und daß die
Konjugation mit dem nicht-oxidierten Antikörper ein Protein hervorbringt,
das keine freien Thiole enthält.
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Das
Tc-99m-markierte IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugat
war in vitro und in vivo stabil.
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Der
mit Tc-99m markierte Antikörper
war bei 24 Std. in Mäusen,
die den Ramos-Tumor tragen, (siehe Beispiel 3 und 4 unten) tumorzielend.
Das divalente Antikörperfragment
transportierte eine höhere
Dosis zu dem Tumor als das iodierte LL2-F(ab')2 oder das
Tc-99m-Fab'.
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Die
vorangehenden Versuchsergebnisse zeigen, daß die vorliegenden Verfahren
die Einführung
eines Thiol-Liganden tragenden Peptids in den oxidierten Kohlenhydratanteil
eines Antikörpers
oder Antikörperfragments
mit einer stabilen regiospezifischen Verbindung ermöglichen.
Dieses Verfahren kann auf jedes Aldehyd oder Keton enthaltende Protein,
Polypeptid oder Peptid angewendet werden. Die herkömmlichen
Verfahren führen
ein geschütztes
Thiol ein, welches nachfolgend entschützt werden muß, um freies
Thiol hervorzubringen. Diese Linker sind oft an den oxidierten Kohlenhydratgruppen über Acylhydrazide
angelagert, für
welche nachgewiesen wurde, daß sie
eine instabile Verknüpfung
darstellen. Die freien Thiol-Konjugate, die nach dem vorliegenden
Verfahren hergestellt wurden, können
verwendet werden, um Konjugate mit anderen Resten auszubilden, wie
z.B. mit Arzneistoffen, Antikörpern,
Antikörperfragmenten,
Proteinen, Glycoproteinen, DNA, RNA, PNA, Metallkomplexen, radioaktiv
markierten Spezies (Bildgebung und Therapie), Enzymen, Toxinen und
Zuckern.
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Solche
Kohlenhydrate mit Fragment können
verwendet werden, um Haptene anzulagern, wie z.B. Thiol enthaltende
Chelatbildner, die nachfolgend mit radioaktiven Metallen, die mit
Thiol binden, radioaktiv markiert werden können. Ein Kohlenhydrat, das
vicinale Diole enthält,
kann zur Herstellung von Aldehyd- und Ketonfunktionen mit einem
Mittel, wie z.B. Periodat, oxidiert werden, und zur Bewirkung der
Konjugation mit einem Thiol enthaltenden, Hydrazin enthaltenden
Hapten, das allgemein als HS-Q-NHNH2 dargestellt
wird, vermischt werden. Wahlweise können die gebildeten Hydrazone,
die das Hapten mit dem Protein-Kohlenhydrat verknüpfen, zur
Herstellung eines Thiol-Hapten-Konjugats mit einem Reduktionsmittel,
wie z.B. Natriumcyanoborhydrtd, reduziert werden, ohne die Gelenkregions-Disulfidbindungen
zu beeinträchtigen.
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Der
Thiol enthaltende, Hydrazin enthaltende Rest HS-Q-NHNH2 kann
eine breite Spanne an Strukturen aufweisen. Die Gruppe Q kann umfassen:
Alkylengruppen, einschließlich
C2-30-Alkylengruppen
mit unverzweigten oder verzweigten Ketten, C5-8-Cycloalkylengruppen,
C6-30-Arylgruppen,
die kondensiert oder verknüpft
sind, wobei sie wahlweise von eins bis acht Heteroatomen in einem
oder mehreren der aromatischen Ringe inkorporiert haben, einschließlich, aber
ohne Beschränkung
hierauf, Phenylen, Naphthylen, Furylen, Benzofurylen, Pyridylen,
Purinylen, Piperidylen und dergleichen, Peptide und/oder Peptidyl-Nachahmungen mit
einer Länge
von eins bis 20 Aminosäuren
oder Aminosäureanaloga,
wobei vorzugsweise eine oder mehrere der Aminosäuren wegen seiner Thiolfunktion
Cystein ist, und terminal Serin oder Threonin vorliegt, das zu einem
Aldehyd oxidiert ist, welches mit Hydrazin umgesetzt wird und unter
Ausbildung des Hydrazinylsubstituenten reduziert wird. Um die Gruppe
Q zu konstruieren, können
auch Kombinationen der vorangehenden strukturellen Bestandteile
verwendet werden. Darüber
hinaus können
die vorangehenden Bestandteile einen oder mehrere Substituenten
tragen, die die Konjugationsreaktion nicht beeinträchtigen,
einschließlich,
aber nicht hierauf beschränkt,
Halogene, Hydroxyl- oder Alkoxylgruppen, einschließlich geschützte Hydroxylgruppen,
Carboxyl- und Carboxylestergruppen, Alkylgruppen, Cyanogruppen,
primäre,
sekundäre
und tertiäre
Aminogruppen, einschließlich
geschützte
Aminogruppen, Amide, Urethane, Carbamide, Nitrogruppen und dergleichen.
Die hierin offenbarten Peptide sind Beispiele für für diesen Zweck geeignete Peptide.
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Die
durch Q dargestellten Strukturen können leicht nach herkömmlichen
Verfahren synthetisiert werden. Es sind viele aliphatische und aromatische
Verbindungen mit einzelnen, mehreren oder kondensierten Ringen und
mit Substituenten, die für
die weitere Verarbeitung geeignet oder verwendbar sind, im Handel
erhältlich.
In Reagenzien-Katalogen können
Ringverbindungen gefunden werden, die eine oder zwei Carbonylverbindungen
tragen, z.B. Aldehyde, Ketone, Carboxylsäure oder -ester und Amide.
Andere Substituenten, wie z.B. Hydroxyle, Halogenalkylgruppen, Hydroxyle,
Amine, Cyangruppen, Isocyanate und dergleichen können als solche verwendet werden
oder in Angriffspunkte für
die weitere Verarbeitung umgebildet werden. Kleine Linker-Synthone,
wie z.B. Glyoxylester, Zuckerderivate, alpha-Halogenacylverbindungen,
z.B. alpha-Bromoacetylester, Säurechloride,
sind geeignet für
die Einführung
von freien oder maskierten Carbonylgruppen für die Umsetzung mit Hydrazin,
gefolgt von der Reduzierung mit z.B. Natriumcyanoborhydrid, zur
Herstellung der Hydrazinfunktion des HS-Q-NHNH2 oder
zur Einführung
von Alkylhalogenidgruppen zur Umsetzung mit Natriumsulfid oder Hydrogensulfid,
um die Thiolfunktion des HS-Q-NHNH2 herzustellen.
Peptide können
die Thiolfunktion durch den Einbau von Cysteinen einführen.
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Es
können
auch Verfahren zur Einführung
von naszierenden Aldehyd- und Ketonresten in zielende Vektoren unter
Anwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie eingesetzt
wer den. Zum Beispiel kann ein Polypeptid mit einem N-terminalen
Serin- oder Threonin-Rest konstruiert werden, der dann unter Ausbildung
von N-terminalen Carbonylgruppen spezifisch oxidiert werden kann.
Solche Derivate bilden dann spezifische chemische "Angriffspunkte" zur Anlagerung von
Thiol enthaltenden Haptenen.
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Die
bevorzugten Liganden tragenden Peptide, wie z.B. IMP 155, sind vorteilhaft,
da sie ein Hydrazin, mehrere hydrophile D-Aminosäuren und einen Metall bindenden
Liganden enthalten. Das Hydrazin wird zur Ausbildung einer Hydrazon-Verbindung
zu Aldehyden oder Ketonen an dem oxidierten Teil der Kohlenhydratgruppen
auf einem glykosylierten Antikörper
oder Antikörperfragment
verwendet. Der Ligand bildet mit dem diagnostischen, bildgebenden
Isotop Tc-99m einen stabilen Tc(V)-Oxo-Komplex aus. Ohne hierdurch
an irgendeine Theorie gebunden werden zu wollen, scheint es so,
daß die
hydrophilen Aminosäuren
das Peptid hinreichend hydrophil machen, so daß der wechselseitige Austausch
von Disulfid oder die Ausbildung von gemischtem Disulfid während der
Konjugation des freien Thiol enthaltenden Peptids mit dem Antikörper minimiert wird.
Die hydrophile Natur des Peptids sollte das konjugierte Peptid an
der Oberfläche
des Proteins halten, wo es mit dem Tc-99m reagieren kann, sobald
dies zugegeben wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden D-Aminosäuren verwendet,
um die Verstoffwechselung des mit Metall komplexierten Peptids nach
der Injektion zu minimieren. Dies wird gemacht, damit für den Fall,
daß das
Protein abgebaut wird, das hydrophile Metall enthaltende Peptid
nicht metabolisiert wird und, da es hydrophil ist, wird jedes markierte
Peptid, das aus der Zelle entweicht, schnell renal ausgeschieden
werden.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele sind zur Erläuterung
der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, aber nicht beschränkend. Der
Durchschnittsfachmann wird verstehen, daß anstelle der beispielhaft
erwähnten auch
viele andere Peptide, Antikörperfragmente
und Liganden verwendet werden können,
während
man sich immer noch im Umfang der Erfindung befindet.
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BEISPIEL 1 – ZUBEREITUNG
VON MARKIERTER F(ab')2-Nα-Boc-Nβ-Boc-Hydrazinessigsäure
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Eine
500 ml-Parr-Flasche wurde mit 18,00 g (1,96 × 10–1 mol)
Glyoxylsäuremonohydrat,
25,84 g (1,95 × 10–1 mol)
t-Butylcarbazat, 0,72 g 10% Palladium auf Carbon, 100 ml Methanol,
50 ml Dioxan gefüllt
und dann unter einer Wasserstoffatmosphäre (50 PSI) auf eine Parr-Hydrierungsvorrichtung
gestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur geschüttelt und
der Wasserstoffdruck wurde mehrere Male eingestellt, um den Druck
bei 50 PSI zu halten. Während
die Reaktion fortschritt, bildete sich ein Niederschlag aus. Nach
3 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und es wurden zusätzliche
100 ml Methanol zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, das dann unter
50 PSI Wasserstoff gesetzt wurde und für 21 Stunden geschüttelt wurde.
Der Inhalt der Parr-Flasche
wurde in 400 ml Methanol gelöst
und durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum am Rotationsverdampfer
konzentriert, um 36,4 (98,1%) eines weißen festen Produkts zu ergeben.
Dieses Rohprodukt 14,0 g (7,37 × 10–1 mol)
wurde in einer Lösung
gelöst,
die 130 ml Dioxan und 80 ml 1 M NaOH enthielt, und in einem Eisbad
gekühlt.
Es wurde Di-t-butyldicarbonat, 17,76 g (8,14 × 10–1 mol,
110 M%) zugegeben und man ließ die
Lösung
sich langsam auf Raumtemperatur aufwärmen und rührte für 18 Stunden. Der Inhalt der Reaktion
wurde unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer konzentriert
und mit 150 ml 1 M Zitronensäure
gemischt. Das Gemischt wurde dann mit 2 × 150 ml Ethylacetat extrahiert.
Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit 100 ml gesättigter
Natriumchloridlösung
gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in vacuo konzentriert, um
so 21,0 g (98%) des Produkts in Form eines Öls, das langsam kristallisierte,
zu erhalten.
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Peptidsynthese
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Das
Peptid IMP 155 (H2NHN-CH2-CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys-)-D-Asp-D-Lys-NH2) wurde auf einem multiplen Peptidsynthesegerät, Advanced
ChemTech 348, durch Festphasensynthese auf Fmoc-Basis synthetisiert.
Die Peptide wurden unter Verwendung von Rink-Amidharz auf einer
Platte mit 0,05 mmol/Well (48 Well-Syntheseblock) synthetisiert.
Der repetitive Koppelungsprozeß ist
der folgende:
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Fmoc-Spaltung.
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Das
Harz wird für
4 min mit 1,5 ml an 25% Piperidin in DMF auf einem Vortex gemischt.
Dann läßt man den
Block abtropfen und das Harz wird für 15 min mit 1,5 ml an 25%
Piperidin in DMF auf einem Vortex gemischt.
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Waschen nach Fmoc-Spaltung.
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Das
Harz wird mit 1,5 ml-Mengen an NMP, Isopropanol, NMP, Isopropanol
und 4 NMP-Waschgängen gewaschen.
Das Harz wird mit jeder der Waschlösungen für wenigstens eine Minute auf
einem Vortex gemischt, bevor die Flüssigkeit abgelassen wird.
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Kopplung
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Die
geschützte
Aminosäure
wird in NMP (0,5 M) gelöst,
welches 0,5 M HOBt enthält.
Das Systemfluid, NMP (300 μl),
wird zu dem Harz zugegeben, gefolgt vom Zusatz von Diisopropylcarbodiimidlösung (600 μl, 0,5 M
in NMP, 6 Äquivalente)
und 600 μl
der Aminosäurelösung (6 Äquivalente
in Bezug auf das Harz). Das Gemisch wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur
auf einem Vortex gemischt und dann wie oben beschrieben gewaschen.
Der gesamte Vorgang wird für
die Zugabe jeder Aminosäure
wiederholt.
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Periodatoxidation von
LL2-F(ab')2
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Der
Kohlenhydratteil von LL2-F(ab')2 aus der Maus (4 mg/ml) wurde mit 15 mM
NaIO4 bei 0°C für 1 Stunde im Dunkeln bei einem
pH-Wert von 5,3 oxidiert. Dann wurde eine Glycerin/Wasser-Lösung (1:1) zugegeben (50 μl für 2,5 ml
Antikörperlösung) und
die Lösung
wurde für
15 min. bei 0°C
im Dunkeln inkubiert. Der oxidierte Antikörper wurde dann durch eine
Spin-Säule
mit Sephadex G 50–80
in acetatgepufferter Salzlösung mit
einem pH-Wert von 5,3 (ABS, 50 mM Acetat) aufgereinigt.
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Konjugationsbedingungen
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Das
Peptid IMP 155 wurde mit dem mit Periodat oxidierten LL2-F(ab')
2-Fragment
(4 mg/ml, LL2-F(ab')
2) in einem molaren Verhältnis von 100:1 Peptid/Antikörper bei
einem pH-Wert von 5,3 in acetatgepufferter Salzlösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur
unter Zusatz der Antikörperlösung zu
der geeigneten Menge an Peptid in einem evakuierten und mit einem
Septum versiegelten Pro benbehälter
konjugiert. Das konjugierte Antikörperfragment wurde zweimal
durch Spin-Säulen
mit Sephadex G 50–80
(pH 5,3 ABS) aufgereinigt, um den ungebundenen Überschuß an Peptid nach Ablauf der
Konjugationszeit zu entfernen. Die Analyse des Konjugats durch MALDI-Massenspektroskopie
zeigte, daß im
Durchschnitt vier Peptide pro Antikörperfragment konjugiert waren.
Probe | MALDI-Daten
MH+ |
LL2-F(ab')2 | 103514 |
Oxidiertes
LL2-F(ab')2 | 103168 |
IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugat | 106240 |
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Für die Zubereitung
des Kits verwendete Lösungen
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αD-Glucoheptonat/Acetat-Puffer:
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Es
wurde eine Pufferlösung
zubereitet, indem eine Lösung
mit einem pH-Wert von 5,3 hergestellt wurde, die 200 mM α-D-Glucoheptonsäure-Natriumsalz
und 21 mM Natriumacetat enthielt. Diese Lösung wurde zur Hälfte mit
Wasser verdünnt,
woraus sich eine 100/10,5 mM (Glucoheptonat/Acetat) Lösung ergab,
die für die
Kit-Formulierung verwendet wurde.
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SnCl2:
-
Eine
SnCl2-Lösung
wurde en gros hergestellt, indem Zinnmetall in 6 M HCl in einer
Konzentration von 200 mg/ml gelöst
wurde. Eine 2 mg/ml Zinnlösung
wurde hergestellt, indem ein Aliquot der 200 mg/ml Zinnlösung 100-fach
in dem Glucoheptonatpuffer verdünnt
wurde.
-
Saccharoselösung:
-
Eine
1 M Saccharoselösung
wurde als Zusatz für
die Kits hergestellt.
-
Kit-Formulierung
-
Die
aufgereinigte Konjugatlösung
wurde durch eine Spin-Säule
mit Sephadex-Gel G 50–80,
das mit 0,1 M Phosphat mit einem pH-Wert von 7,3 gepuffert war,
laufengelassen (A mg/ml LL2-F(ab')2).
1 mg des Konjugats (250 μl)
wurde mit 12,5 μg
SnCl2 (6,25 μl), 446 μg α-D-Glucoheptonsäure-Natriumsalz (11,7 μl Glucoheptonatpuffer
+ Puffer in der Zinnlösung)
und 19 mg Saccharose (55,6 μl)
in einem Gesamtvolumen von etwa 0,3 ml vermischt. Das Gemisch wurde
sofort eingefroren, gefriergetrocknet und unter Vakuum mit einem
Septum versiegelt.
-
Bedingungen
für die
Kit-Markierung
-
Der
Inhalt des Kits wurde in 0,4 ml Salzlösung gelöst und die Lösung wurde
vor dem Zusatz von Na99m-TcO4 in Salzlösung (0,4
ml) für
5 min stehengelassen. Die Kit-Lösung
wurde vor der Verwendung für 30
min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die HPLC-Analyse auf einer Größenausschlußsäule, Bio-Sil,
zeigte an, daß 96%
der Aktivität
an das Protein angelagert waren und 4% der Aktivität in Form
von Material mit kleinem Molekulargewicht vorlagen.
-
BEISPIEL 2 – IN VIVO-STABILITÄT VON MIT
TC-99m MARKIERTEM IMP-155-LL2-F(ab')2-KONJUGAT, BIODISTRIBUTION
UND SERUMANALYSEN IN BALB/c-MÄUSEN
-
Tc-99m-Markierung und
Aufreinigung
-
Das
LL2-F(ab')2-Konjugat wurde durch Austausch mit Tc-99m-Glucoheptonat
bei Raumtemperatur wie folgt markiert:
Es wurde ein Glucoheptonat-Markierungskit,
GlucoscanTM (DuPont), mit 30 mCi Tc-99m
in 2 ml markiert. 0,6 ml des Tc-99m-Glucoheptonats wurden zu dem
Probengefäß mit dem
IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugatkit
(1 mg Konjugat und Saccharose enthaltend) zugegeben, das wie in
Beispiel 1 beschrieben zubereitet war. Das Probengefäß wurde
für 30
min bei Raumtemperatur inkubiert. Das markierte Material wurde dann
durch zwei aufeinanderfolgende 3-ml-Spin-Säulen mit Sephadex G 50–80 (pH-Wert
7,3, 0,1 M PBS) aufgereinigt. Das Produkt wurde mit Salzlösung in
einem leeren sterilen Probengefäß auf 5
mCi/ml verdünnt.
-
Biodistributionsuntersuchung
-
Neun
BALB/c-Mäusen
wurden 100 μl
(500 μCi)
des aufgereinigten Tc-99m-LL2-F(ab')2-Konjugats injiziert.
Die Tiere wurden betäubt
und getötet,
drei Tiere pro Zeitpunkt, nach 1 Stunde, 4 Stunden und 24 Stunden.
Auch das Serum für
die Analyse wurde nach 1 Stunde, 4 Stunden und 24 Stunden genommen.
Die Serumproben wurden nach der Isolierung eingefroren und unmittelbar
vor der HPLC-Analyse auf der Größenausschluß-HPLC-Säule (Bio-Sil
SEC 250, Gelfiltrations-HPLC-Säule, 300
mm × 7,8
mm) aufgetaut. Es wurden die folgenden Gewebe und Organe entnommen
und ausgezählt:
Blut, Leber, Nieren, Milz, Lungen, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Muskel, Urin.
-
Die
HPLC-Analyse der Serumproben zeigte an, daß die Aktivität in dem
Serum zu allen Zeitpunkten primär
im Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 vorlag.
-
Biodistribution
von Tc-99m-LL2-F(ab')
2 in BALB/c-Mäusen % der injizierten Dosis/Gramm
Gewebe Standardabweichung, 3 Tiere/Zeitpunkt
-
-
BEISPIEL 3 – VERGLEICH
VON TC-99m-IMP-155-LL2 F(ab')2 UND MIT I-125 MARKIERTEM LL2-F(ab')2 IN NACKTEN
MÄUSEN,
DIE DEN RAMOS-TUMOR TRAGEN.
-
Tc-99m-Markierung
-
Ein
IMP-155-LL2-F(ab')2-Kit wurde mit 5 mCi 99m-TcO4 – in
0,3 ml Salzlösung
markiert. Das Kit wurde für
30 min. bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit Salzlösung auf
0,75 ml verdünnt
und durch zwei aufeinanderfolgende 3 ml-Spin-Säulen mit Sephadex G 50–80 in acetatgepufferter
Salzlösung
mit einem pH-Wert von 5,3 aufgereinigt.
-
I-125-Markierung
-
Das
Antikörperfragment
LL2-F(ab')2, 23,3 μl
(5,15 mg/ml) wurde mit 50 μl
0,5 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 gemischt und zu einem
Probengefäß zugegeben,
das 2,5 mCi I-125
enthielt. Es wurde eine Lösung
von Chloramin-T, 12 μl
(0,0034 g in 2 ml PBS) zugegeben und man ließ die Reaktion für 3 min
bei Raumtemperatur ablaufen, bevor sie mit 20 μl (0,0254 g in 10 ml) einer
Lösung
von Natriummetabisulfit gequencht wurde.
-
Gemischte Markierung
-
Das
I-125-LL2-F(ab')2 befand sich in einer Lösung, die 1,6 mCi in ~3 ml
enthielt. Das I-125-LL2-F(ab')2 und
das Tc-99m-LL2-F(ab')2 wurden in einem Verhältnis von 5 μCi I-125
zu 25 μCi
Tc-99m gemischt.
Die fertige gemischte Lösung
enthielt 220 μCi
I-125-LL2-F(ab')2 und 1,04 mCi Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 in 2,0 ml
Lösung.
-
Biodistribution
-
Eine
Gruppe von fünf
nackten, Ramos-Tumor tragenden Mäusen
mit gleich großen
Tumoren wurden pro Zeitpunkt verwendet. Jedem Tier wurden 50 μl der vorgemischten
Lösung
(5 μCi I-125
und 25 μCi
Tc-99m) injiziert. Die Tiere wurden nach 1 Stunde, 4 Stunden und
24 Stunden betäubt
und durch Halswirbel-Dislokation getötet. Die folgenden Gewebe und
Organe wurden entnommen und ausgezählt: Tumor, Blut, Muskel, Leber, Nieren,
Milz, Magen.
-
Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')
2-Konjugat,
das mit I-125-LL2-F(ab')
2 co-injiziert wurde Ausgewählte Ergebnisse der
Tc-99m-Biodistribution % ID/g SD, 5 Tiere/Zeitpunkt
-
Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')
2-Konjugat,
das mit I-125-LL2-F(ab')
2 co-injiziert wurde Ausgewählte Ergebnisse der
I-125-Biodistribution % ID/g SD
-
BEISPIEL 4 – VERGLEICH
VON TC-99m IMP-155-LL2-F(ab')2 MIT TC-99m-LL2 Fab'
-
Tc-99m-Markierung des
IMP-155-LL2-F(ab')2-Konjugats
-
Ein
IMP-155-LL2-F(ab')2-Kit wurde mit 5 mCi 99m-TcO4 – in
0,3 ml Salzlösung
markiert. Das Kit wurde für
30 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann mit Salzlösung zu
0,75 ml verdünnt
und durch zwei aufeinanderfolgende 3-ml-Spin-Säulen mit Sephadex G 50–80 in acetatgepufferter
Salzlösung
mit einem pH-Wert von 5,3 aufgereinigt. Die Probe wurde auf 500 μCi/ml mit
Salzlösung
verdünnt.
-
Tc-99m-LL2-Fab'-Markierung:
-
Ein
LL2-Fab'-Kit (LymphoscanTM – Immunomedics,
Inc., Morris Plains, NJ) wurde bei Raumtemperatur mit 31 mCi Tc-99m
in 1 ml, das zu dem gefriergetrockneten Kit zugegeben wurde, radioaktiv
markiert. Ein 50-μl-Aliquot
(1,55 mCi) wurde entnommen und mit Salzlösung auf 3 ml (500 μCi/ml) verdünnt.
-
Biodistribution
-
Eine
Gruppe von fünf
nackten Mäusen,
die den Ramos-Tumor tragen, mit Tumoren gleicher Größe wurden
pro Zeitpunkt verwendet. Jedem Tier wurden 50 μl des markierten Antikörperfragments
(25 μCi Tc-99m)
injiziert. Die Tiere wurden nach 4 Stunden und 24 Stunden betäubt und
durch Halswirbel-Dislokation getötet.
Die folgenden Gewebe und Organe wurden entnommen und ausgezählt: Tumor,
Blut, Muskel, Leber, Nieren, Milz, Magen. Das Verhältnis von
Tumor zu normalem Organ ist für
jedes Organ angegeben.
-
Vergleich
des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')
2-Konjugats mit Tc-99m-LL2-Fab' Biodistribution
des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')
2-Konjugats
-
Biodistribution
des Tc-99m-LL2-Fab'
-
BEISPIEL 5 – STABILITÄTSSTUDIEN
-
Die
Stabilität
des mit Tc-99m markierten Konjugats wurde untersucht durch Austauschmarkierung
des Konjugats mit Tc-99m-Glucoheptonat gefolgt von der Aufreinigung
des markierten Proteins durch zwei aufeinanderfolgende Gelsäulen mit
Sephadex G 50–80,
was alle der ungebundenen Tc-99m-Spezies mit niedrigem Molekulargewicht
entfernte. Das aufgereinigte Material wurde dann mit ITLC (0,1 M
Citrat, pH-Wert 5), Größenausschluß-HPLC und
HPLC an reverser Phase analysiert.
-
Die
Stabilität
der verschiedenen Konjugate wurde abgeschätzt durch Inkubation in dem
Gelfiltrationspuffer oder dem Markierungspuffer bei Raumtemperatur
für 24
Stunden, unter Einwirkung von 1 mM Cystein bei 37°C über 24 Stunden
und durch Inkubation in Serum bei 37°C über 24 Stunden.
-
Analytische Verfahren
-
ITLC:
-
Die
ITLC-Streifen wurden mit einem Aliquot (0,2 μCi) der markierten Lösung betüpfelt und
mit 0,1 M Citratpuffer mit einem pH-Wert von 5 eluiert. Das markierte
Protein verblieb am Startpunkt, während 99m-TcO4 – und
Tc-99m-Glucoheptonat den Teststreifen aufwärts eluiert wurden.
-
Größenausschluß-HPLC:
-
Eine
Gelfiltrations-HPLC-Säule
von Bio-Rad, Bio-Sil SEC 250 (300 mm × 7,8 mm), wurde mit 1 ml/min eines
0,2 M Phosphatpuffers, der 0,02% Natriumazid enthielt, mit einem
pH-Wert von 6,8 eluiert.
-
Analyse
von mit Tc-99m markierten Spezies durch Größenausschlußchromatographie
-
HPLC an reverser Phase:
-
Die
HPLC an reverser Phase wurde auf einer Säule von Waters, Radial-Pak,
C-18, Nova-Pak (4 μ, 100 × 8 mm),
durchgeführt.
Die Säule
wurde mit einem Gradienten aus zwei Puffern eluiert (Puffer A: 0,1%
wäßrige TFA,
Puffer B: 90% Acetonitril, 10% Wasser, 0,1% TFA). Der Gradient war
der folgende: Flußrate
3 ml/min 100% Puffer A zu 100% Puffer B über 10 min, Flußrate 5
ml/min für
5 min. Das Verfahren der HPLC an reverser Phase war geeignet für die Identifizierung
der Natur der mit Tc-99m markierten Spezies mit niedrigem Molekulargewicht.
Die stabilen mit Tc-99m markierten Proteine ließen sich auf der HPLC an reverser
Phase nicht gut eluieren.
-
HPLC-Analyse
an reverser Phase von mit Tc-99m markierten Spezies
-
Tc-99m-IMP 126-LL2-F(ab')2
-
Das
markierte Rohprotein, das analog zu dem markierten IMP-155-LL2-F(ab')2 hergestellt
war, wurde auf einer Gelsäule
mit Sephadex G 50–80
in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3 aufgereinigt.
Es wurde ein Aliquot entnommen und fünffach in Salzlösung verdünnt. Die
Salzlösung
wurde für
1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Größenausschluß-HPLC-Anaylse
zeigte, daß ungefähr 5% der
Aktivität
nach 1 Stunde von dem Protein dissoziiert war.
-
Die
Inkubation von Tc-99m-IMP-126-LL2-F(ab')2 in 0,1 M
Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, der 1 mM Cystein enthielt,
bei 37°C
für 1,5
Stunden verursachte, daß 31%
des markierten Proteins zu dem Tc-99m-IMP-126-Fab'-Fragment reduziert
wurden. 56% des Tc-99m-IMP-126-LL2--F(ab')2 verblieben intakt und 12% der Aktivität wurden
zu Spezies mit niedrigem Molekulargewicht, wie z.B. Tc-99m-Cystein,
umgewandelt.
-
Die
Inkubation von Tc-99m-IMP-126-LL2-F(ab')2 zehnfach
verdünnt
in frischem humanem Serum für 21
Stunden bei 37°C
führte
dazu, daß 34%
der Aktivität
in Form von Spezies mit niedrigem Molekulargewicht verloren gingen.
Es gab drei mit Tc-99m markierte Proteinspezies, alle in etwa mit
dem gleichen Prozentsatz (20%) an Aktivität. Die Peaks schienen auf Aggregat,
Tc-99m-IMP-126-LL2-F(ab')2 und Tc-99m-IMP-126-LL2-Fab' zurückzuführen zu
sein.
-
Tc-99m-IMP-140-LL2-F(ab')2
-
Das
markierte Peptid, das analog zu dem markierten IMP-155-LL2-F(ab')2 hergestellt
war, wurde aufgereinigt und über
Nacht in 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3 gelagert.
Die Größenausschluß-HPLC-Analyse
zeigte, daß ungefähr 30% der
Aktivität
nach 24 Stunden von dem Protein dissoziiert waren. Die HPLC-Anaylse
an der reversen Phase zeigte an, daß die Masse der mit Tc-99m
markierten Spezies mit niedrigem Molekulargewicht in Form des mit
Tc-99m markierten Peptids vorlag, das sich von dem Protein hydrolytisch
abgespalten hatte. Hieraus konnte geschlossen werden, daß die Acylhydrazon-Verbindung
zu dem Antikörper
instabil war.
-
Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2
-
Das
markierte Peptid wurde aufgereinigt und über Nacht in 0,1 M Phosphatpuffer
mit einem pH-Wert von 7,3 gelagert. Die Größenausschluß-HPLC-Anaylse zeigte nach
Inkubation für
24 Stunden bei Raumtemperatur weniger als 5% Abbau zu Spezies mit
niedrigem Molekulargewicht.
-
Die
Inkubation von Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 in 0,1 M
Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, der 1 mM Cystein enthielt,
bei 37°C
führte
dazu, daß der
Großteil
des markierten Proteins (61,5%) zu dem Tc-99m-IMP-155-Fab'-Fragment reduziert
wurde. 8% des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 verblieben
intakt und 30% der Aktivität
wurden in Spezies mit niedrigem Molekulargewicht umgewandelt, wie
z.B. in Tc-99m-Cystein.
-
Die
Inkubation von Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 zehnfach
verdünnt
in frischem humanem Serum für 21
Stunden bei 37°C
führte
dazu, daß 10%
der Aktivität
in Form von Spezies mit niedrigem Molekulargewicht verloren gingen.
Es gab drei mit Tc-99m markierte Proteinspezies. Die Signale schienen
auf Aggregat (38%), Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 (42%) und
Tc-99m-IMP-155-LL2-Fab' (9%)
zurückzuführen zu
sein. Die Aggregatbildung könnte
ein Artefakt infolge einer Disulfidausbildung sein, die durch die
Einwirkung von Sauerstoff verursacht wurde.
-
BEISPIEL 6 – AGGREGATBILDUNG
-
Wie
ein Peak mit hohem Molekulargewicht anzeigte, der im UV und bei
der Tc-99m-Markierung
des Proteins vorlag, wenn es durch Größenausschluß-HPLC analysiert wurde, wurde
während
des Konjugationsvorgangs etwas Proteinaggregat (2–10%) gebildet.
Das Aggregat schien auf die Disulfidbildung zwischen den Peptidthiolen
eines Konjugats mit den Thiolen eines anderen Konjugats zurückzuführen zu
sein. Das Aggregat verschwand bei Behandlung mit einem Überschuß an Cystein.
Im Verlauf von in-vitro-Stabilitätsstudien
wurde im Serum etwas Aggregatbildung beobachtet. Auch dies schien
auf die Disulfidbildung zurückzuführen zu
sein. Im frischen Serum trat weniger Aggregation auf als in älterem Serum
und der Zusatz von Cystein zum Serum verringerte die Menge an gebildetem
Aggregat zu einem großen
Teil. Die in-vivo-Serumproben zeigten etwas Aggregatbildung, jedoch
lag die Masse der Aktivität
in Form des Tc-99m-IMP-155-LL2-F(ab')2 vor.
-
BEISPIEL 7 – BELADEN
VON OXIDIERTEM LL2-F(ab')2 MIT PEPTID
-
Die
Konjugationen von IMP 155 wurden wie oben beschrieben durchgeführt und
die Antikörperkonzentration
wurde anhand der UV-Absorption eines Aliquots bei 280 nm gemessen.
Der Thiolgehalt wurde unter Anwendung eines Ellman-Tests durchgeführt und
die Thiolkonzentration im Aliquot wurde mit dem Antikörpergehalt,
der durch UV bestimmt wurde, in Beziehung gesetzt, um die Thiolladung
auf dem Antikörper
zu erhalten. Später
wurde festgestellt, daß das
Verfahren der UV-Messung
ungenau war, weil das Peptid eine signifikante Absorption bei der
Wellenlänge
aufwies, die verwendet wurde, um den Proteingehalt zu bestimmen,
wodurch sich ein künstlich
hoher Wert für
den Proteingehalt ergab. Die Analyse wurde dann auf die Matrix-unterstützte Laser-DesorptionsIonisations-
(MALDI-) Massenspektrometrie umgestellt, um die Anzahl der an das Protein
angelagerten Peptide eindeutig zu bestimmen. Die Ergebnisse in den
Tabellen unten zeigen, daß die Peptidladung über einen
Bereich von Verhältnissen
Peptid zu Antikörper
während
der Konjugation einheitlich war. Unter Anwendung der oben beschriebenen
Oxidations- und Konjugationsbedingungen werden durchschnittlich
vier Peptide pro Antikörper
angebracht.
-
Konjugation
von IMP 155 mit mit Periodat oxidiertem LL2-F(ab')
2
-
-
Daten
der Massenspektrometne
-
BEISPIEL 8 – KONTROLLVERSUCHE
-
Konjugationskontrolle
-
Es
wurde ein Konjugationskontrollversuch durchgeführt, um festzustellen, ob das
freies Thiol enthaltende Peptid unter Ausbildung von Proteinthiolen
mit Disulfiden auf dem Antikörper
reagiert oder ob das Peptid an dem Antikörper durch andere Mittel angelagert
wurde als an das oxidierte Kohlenhydrat. Bei diesem Versuch wurde
gleichzeitig zu einem Anteil von mit Periodat oxidiertem LL2-F(ab')2 nicht-oxidiertes
LL2-F(ab')2 mit dem 50-fachen Überschuß an IMP 155 behandelt. Das
mit Periodat oxidierte LL2-F(ab')2 bildete ein Konjugat aus, das 2,3 Thiole/AK
enthielt, wie anhand des UV festgestellt wurde (4,3 Peptide/AK nach
MALDI), und das nicht-oxidierte LL2-F(ab')2 enthielt
0,2 Thiole/AK, wie anhand des UV festgestellt wurde. Dieser Versuch
zeigte, daß die
Periodat-Oxidation
notwendig war, um das Peptid an dem Antikörper anzubringen und daß die vorliegenden
Thiole sich auf dem Peptid befanden und nicht ein Produkt gegenseitigen
Disulfidaustauschs waren.
-
Tc-99m-Markierungskontrolle
-
Es
wurde ein Kontrollversuch durchgeführt, bei dem eine Charge des
LL2-F(ab')2 mit Periodat behandelt wurde und wie oben
beschrieben mit dem 100-fachen Überschuß des Peptids
IMP 140 konjugiert wurde, außer
daß nach
2 Stunden der Konjugation 10 mg/ml Natriumcyanoborhydrid zugegeben
wurden und die Konjugation vor der Aufreinigung 2 Stunden länger fortgesetzt
wurde. Die Kontrollcharge des LL2-F(ab')2 wurde gleich
behandelt, außer
daß in
der Oxidationskontrolle kein Periodat vorlag. Die beiden Antikörperzubereitungen
wurden durch Austausch mit Tc-99m-Glucoheptonat markiert. Der Teil, der
vor der Konjugation mit Periodat behandelt wurde, brachte eine Markierungsausbeute
von 60% hervor, wie anhand der ITLC in 0,1 M Citratpuffer mit einem
pH- Wert von 5 gezeigt
wurde, und die nicht-oxidierte Kontrolle zeigte gemäß der ITLC,
daß 6%
des Tc-99m an das
Protein gebunden waren.
-
Darüber hinaus
wurde IMP 171, ein Peptid, welches zwei Metall bindende Liganden
enthält,
an LL2-F(ab')
2 konjugiert, indem das gleiche Verfahren
angewandt wurde, das für
IMP 155 beschrieben wurde. Weil die erhöhte Anzahl an Thiolen die Reduzierung
von LL2-F(ab')
2 zu LL2-Fab' verursachen könnte, war es erforderlich,
bei diesem Peptid ein Verhältnis
Peptid zu Antikörper
von 50:1 oder weniger einzusetzen. Diese Reaktion brachte ein Konjugat,
IMP-171-LL2-F(ab')
2, mit der zweifachen Anzahl an Thiolen (5,3
Thiole/AK) hervor im Vergleich zu der IMP-155-LL2-F(ab')
2-Konjugation (2,3
Thiole/AK), die mit der gleichen Charge an oxidiertem Antikörper durchgeführt wurde.
IMP-171 | H2NHN-CH2CO-D-Asp-D-Lys(TscG-Cys)-D-Asp-D-Lys-D-Lys(TscG-Cys)-D-Asp-D-Lys-NH2 MH
+ 1412 |
-
BEISPIEL 9 – MARKIERUNG
MIT RHENIUM
-
Rhenium-Markierung unter
Verwendung eines Verfahrens zur Vorreduzierung für Re-188.
-
Diese
Konjugate können
mit Rhenium-Isotopen markiert werden (primär Re-186 und Re-188), die dann in
der Radioimmuntherapie einsetzbar sind. Da die Reduzierung von Perrhenat
mehr Zinnionen erfordert (üblicherweise über 200 μg/ml Endkonzentration)
als für
die Reduzierung von Technetium gebraucht wird, ist besonders Sorge
zu tragen, um zu gewährleisten,
daß der
höhere
Gehalt an Zinnionen nicht die empfindlichen Disulfidbindungen reduziert,
wie z.B. diejenigen, die im Gelenkbereich des F(ab')
2-Fragments
vorliegen. Bei der radioaktiven Markierung mit Rhenium werden ähnliche
Verfahren angewandt, wie sie bei Tc-99m angewendet werden, außer daß die Kontaktzeit
zwischen MAK und Sn(II) zeitmäßig beschränkt ist,
um Reduzierungen der Disulfidbindung vorzubeugen, oder das Rhenium
des Perrhenats wird vor dem Vermischen mit dem Antikörperfragment-Konjugat
reduziert. Dann wird eine wäßrige Lösung des
Thiol-Liganden enthaltenden Substrats mit
188ReOCl
3(PPh
3)
2 in
CH
2Cl
2 nach dem
Verfahren von Lisic et al. vermischt. Das CH
2Cl
2 wird dann unter einem Stickstofffluß entfernt,
und es wird in 0,1 ml einer 10%-igen wäßrigen Lösung von 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
(HPCD) gelöst.
Die HPCD-Lösung
wird dann mit 0,5 ml einer Lösung
des IMP-155-LL2-F(ab')
2 (4 mg/ml) vermischt, was für 30 min
bei Raumtemperatur inkubiert wird. BEISPIEL
10 – TECHNETIUM-MARKIERUNG Tc-99m-Markierung
eines Thiol enthaltenden Octreotids
IMP
162 | GDdDK(TscGC)FdCFWdKTCTol MH+ 1667 |
-
Das
Peptid IMP 162 (0,0012 g) wurde in 30 ml einer wäßrigen Lösung gelöst, die 10% HPCD, 200 mM Glucoheptonat,
14 mM Natriumacetat und 12 mM Ascorbinsäure enthielt und einen pH-Wert
von 5,29 aufwies. Eine Zinnlösung
wurde hergestellt, indem 0,2 ml von 200 mg/ml SnCl2 in 6
M HCl mit 3,8 ml der HPCD-Glucoheptonatlösung vermischt wurden. Ein
0,2 ml-Aliquot der Zinn/HPCD-Lösung
wurde zu der Peptidlösung
zugegeben und die Lösung
wurde dann durch einen Millex-GV-Filter mit 0,22 μm in Aliquots
von 1,5 ml in Gefriertrocknungsbehälter filtriert. Die Probenbehälter wurden
dann eingefroren, gefriergetrocknet und unter Vakuum versiegelt.
-
Tc-99m-Kit-Markierung
-
Das
gefriergetrocknete Kit wurde mit 20 mCi 99mTcO4 – in 1,5 ml Salzlösung zur
ursprünglichen
Konzentration verdünnt
und für
10 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann im kochenden Wasserbad
für 15
min erwärmt.
Die Markierung ist vollständig
und quantitativ.
-
BEISPIEL 11 – ARZNEISTOFFKONJUGAT
-
Konjugation eines chemotherapeutischen
Arzneistoffs zu einem Disulfid enthaltenden Peptid
-
Ein
Analogon des Octreotids, das einen angehängten N-terminalen Serinrest
aufweist, der an das ursprüngliche
Octapeptid angelagert wurde, wird unter Verwendung von Natrium-m-Periodat
zur Ausbildung eines N-terminalen Aldehyds oxidiert. Dieses Zwischenprodukt
wird mit einer Menge an IMP-155-Peptid umgesetzt, die ausreichend
ist, um alle auf dem Serin-Octreotid vorliegenden Aldehydgruppen
in N-terminale Hydrazone umzuwandeln. Die Hydrazone werden unter
Verwendung von Natriumcyanoborhydrid zu Alkylhydrazinen reduziert,
und das intermediäre
mit Thiol behaftete IMP-155-Hydrazinyl-Octreotid wird aufgereinigt
und mit dem Anti-Krebsmittel Calicheamicin durch Thiolaustausch
mit der Trisulfidgruppe des letzteren gekoppelt. Das Produkt Calicheamicin-Octreotid
umfaßt
einen Disulfid-IMP-155-Peptidyl-Hydrazinlinker.
-
BEISPIEL 12 – ARZNEISTOFFKONJUGAT
-
Regiospezifische Substitution
von Doxorubicin an ein Disulfidbindung enthaltendes Polypeptid
-
a) Herstellung eines Aldehyd
enthaltenden (scFv)2-Fragments
-
Eine
Lösung
eines humanen (scFv)2-Fragments, das eine
N-terminale Serin-Aminosäure
trägt,
3 mg/ml, wird für
2 Stunden im Dunkeln bei 4°C
mit 10 mM Natriumperiodat behandelt. Um überschüssiges Periodat zu zerstören, wird
Glycerol in einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben und das Reaktionsgemisch wird
für weitere
20 min gerührt.
Das N-terminal oxidierte (scFv)2 wird auf
einer Säule
mit G-10-Sephadex, die mit mit Argon entgastem 0,1 M Natriumacetat
mit einem pH-Wert von 5,5 und 1 mM EDTA enthaltend äquilibriert
und laufen gelassen wird, von Kontaminationen mit niedrigem Molekulargewicht
befreit. Vor der weiteren Umsetzung wird das Produkt auf 5 mg/ml
konzentriert.
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b) Herstellung eines mit
Thiol behafteten (scFv)2-Fragments
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Das
(scFv)2-Zwischenprodukt mit N-terminalem
Aldehyd, das nach a) erhalten wurde, wird mit frisch zubereiteter
DMSO-Lösung
von p-(2-Thioethyl)-phenylhydrazin (TEPH) in einem molaren Überschuß von 20:1 behandelt,
und das Reaktionsgemisch wird für
2 Stunden bei 4°C
gerührt.
Das Produkt, TEPH-(scFv)2, das eine Hydrazon-Verbindung
enthält,
wird erhalten durch Aufreinigung auf einer G-10-Sephadex-Säule, die
mit mit Argon entgastem 0,1 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von
6,5, enthaltend 1 mM EDTA, äquilibriert
und laufen gelassen wird. Wahlweise wird vor der Aufreinigung das
Phenylhydrazon zu einer Phenylhydrazinverbindung reduziert durch
eine zweistündige
Reaktion in Anwesenheit von 10 mM Natriumborhydrid nach einer pH-Einstellung
des anfänglichen
Reaktionsgemischs auf von 5,5 bis 7,0 mit einer kleinen Menge an
Natriumcarbonat. Das Produkt TEPH-(scFv)2 wird
mit SE-HPLC auf einer Bio-Sil-GF-125-Säule, die in 0,5 M Natriumphosphat
mit einem pH-Wert von 6,5 äquilibriert
wurde, analysiert, um das Fehlen des Abbaus in scFv-Monomere zu
bestätigen.
Aliquots des Produkts werden nach dem Bicinchoninsäure- (BCA-)
Verfahren ebenfalls separat auf ihre Proteinkonzentration untersucht
und nach der Ellman-Reaktion auf den Thiolgehalt, und auf diese
Weise wird durch Ableitung die Anzahl der Thiolgruppen pro Mol TEPH-(scFv)2 bestimmt.
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c) Aktivierung des Doxorubicins
zu Maleinimid-Doxorubicin
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Eine
Lösung
des Doxorubicin-Hydrochlorids (10 mM) in 5 ml 50% DMSO/0,1 M Natriumboratpuffer
mit einem pH-Wert von 8,3 wird mit einem zweifachen molaren Überschuß des im
Handel erhältlichen
Cross-Linkers m-Maleinimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS,
Pierce Chem. Co., Rockford, IL) behandelt. Das Reaktionsgemisch
läßt man für 3 Stunden
bei Raumtemperatur rühren,
bevor es mit 5% Natriumchloridlösung auf
20 ml verdünnt
wird. Die Mischung wird mit 3 × 20
ml eines im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren organischen
Lösungsmittels,
wie z.B. Ethylacetat, extrahiert und die vereinigten organischen
Extrakte werden mit 3 × 20
ml 0,1 M Natriumbicarbonat mit einem pH-Wert von 8,0 gewaschen.
Die organische Lösung
wird über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und evaporiert,
um das Maleinimid-Doxorubicin zu erhalten.
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d) Kopplung des Maleinimid-Doxorubicins
mit TEPH-(scFv)2
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TEPH-(scFv)2 in mit Argon entgastem 0,1 M Natriumacetat
mit einem pH-Wert von 6,5 und 1 mM EDTA enthaltend bei 4°C wird 15%-ig
in DMSO gelöst
und mit einem zweifachen molaren Überschuß (bezogen auf den Thiolgehalt)
an Maleinimid-Doxorubicin in DMSO, das unter schnellem Rühren in
einem Schwung zugegeben wird, behandelt. Das Rühren wird für 1 Stunde bei 4°C fortgesetzt
und das Doxorubicin-(scFv)2 wird durch Säulenchromatographie
auf einer Sephadex-G-10-Gelsäule, die
mit 0,2 M natriumphosphatgepuffertem 0,9%-igen Natriumchlorid mit
einem pH-Wert von 7,5 äquilibriert
ist.