ES2206579T3 - Tiolacion de peptidos para radiodeteccion y radioterapia basada en radionuclidos. - Google Patents
Tiolacion de peptidos para radiodeteccion y radioterapia basada en radionuclidos.Info
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Abstract
UN METODO PARA EL MARCAJE RADIACTIVO DE UN PEPTIDO, POR EJEMPLO SOMATOSTATINA O UN ANALOGO DEL MISMO O UN PEPTIDO INTESTINAL VASOACTIVO CON UN RADIOISOTOPO DE TECNECIO O RHENIO COMPRENDE LAS ETAPAS DE: (A) HACER REACCIONAR EL PEPTIDO CON UN AGENTE QUELANTE BIFUNCIONAL REACTIVO CON AMINA CONTENIENDO T IOL PROTEGIDO CON ACETILO; (B) DESPROTEGER EL GRUPO ACETILO T ZCLAR EL CONJUGADO CONTENIENDO PEPTIDO ESTANNOSA; Y (D) HACER REACCIONAR LA MEZCLA DE LA ETAPA (C) CON PERTECNETATO O PERRHENATO, O (C'') AÑADIR PERTECNETATO O PERRHENATO REDUCIDOS A DICHO CONJUGADO CONTENIENDO PEPTIDO OL, FORMANDO DE ESTE MODO UN PEPTIDO RADIOMARCADO. SE PROPORCIONAN KITS PARA PONER EN PRACTICA EL METODO DE MARCAJE Y METODOS PARA LA DETECCION/IMAGEN O TERAPIA DEL TUMOR.
Description
Tiolación de péptidos para radiodetección y
radioterapia basadas en radionúclidos.
Esta invención se refiere a métodos y kits de un
vial para marcar radiactivamente péptidos con un ion metálico
radiactivo de un radionúclido que se une fuertemente a grupos
sulfhidrilo, donde el péptido está derivatizado con un agente
quelante que contiene un tiol terciario. Un resto que contiene tiol
protegido se conjuga con el péptido, después de lo cual el derivado
puede desprotegerse para generar grupos sulfhidrilo libres sin
escindir los enlace disulfuro. El derivado después puede marcarse en
un lecho con un radionúclido.
Se sabe que ciertos metales radiactivos se unen
fuertemente a ligandos de azufre, incluyendo, por ejemplo,
Tc-99m de pertecnetato reducido, los iones
Re-186 y Re-188 de perrenato
reducido, iones Cu-67, iones Hg-197
e iones Bi-212. Algunos de estos metales radiactivos
se han unido a proteínas, especialmente anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo. El tecnecio-99m es un radionúclido ideal
para la formación de imágenes escintigráficas debido a sus
propiedades nucleares. El tecnecio-99m tiene una
energía de un solo fotón de 140 KeV, un vida media de
aproximadamente 6 horas y se puede adquirir fácilmente a partir de
un generador de ^{99}Mo-^{99m}Tc.
El elemento por debajo del tecnecio en la tabla
periódica, renio, tiene propiedades químicas similares y puede
marcar proteínas usando técnicas similares. Hay unos 34 isótopos de
renio y dos de ellos en particular, el renio-186
(t_{1/2} 90 horas, gamma 137 KeV, beta 1,07, 0,93 MeV) y el
renio-188 (t_{1/2} 17 horas, gamma 155 KeV, beta
2,12 MeV) son candidatos principales para radioterapia usando
estrategias de dirección de péptidos.
El marcaje directo de anticuerpos o de fragmentos
de anticuerpo con metales radiactivos ha sido satisfactorio, en
gran parte porque los enlaces disulfuro que unen las cadenas
pesadas se han escindido selectivamente y sirven como sitios de
unión al ligando para los iones de metales radiactivos. Esta
estrategia ha sido particularmente satisfactoria con fragmentos de
anticuerpo, especialmente fragmentos Fab y Fab'. Cuando un péptido
que se desea marcar contiene un grupo disulfuro cuya integridad
debe conservarse para retener la unión específica del péptido, es de
poca utilidad una estrategia que escinde los grupos disulfuro.
Un segundo método para radiomarcar proteínas es
el marcaje indirecto, en el que un agente complejante (quelante) se
acopla a la proteína y el metal radiactivo se une a la proteína
como un quelato. Algunos quelantes contienen grupos sulfhidrilo
libres o protegidos que pueden formar complejos con el radionúclido
reducido en un extremo y grupos capaces de reaccionar con el
péptido en el otro extremo.
Se ha descubierto que algunos receptores para
ciertos péptidos biológicos tales como somatostatina (SS) y el
péptido intestinal vasoactivo (VIP) se expresan en diferentes tipos
de sitios tumorales, así como en tejidos a lo largo de todo el
cuerpo debido a la función fisiológica normal de estos péptidos.
Virgolini et al., Cancer Res,
54:690-700, 1994; Virgolini et al., J Nucl
Med, 35:97P, 1994. Por lo tanto, el marcaje de péptidos
pequeños tales como SS y VIP sería ventajoso desde el punto de vista
de la obtención de imágenes de tumores. Estos péptidos pequeños y
sus análogos se han marcado con In-111 o
I-123 para formar imágenes. Se sabe que el
octreótido (OCT), un octapéptido con un bucle disulfuro de seis
aminoácidos y un quelante de ácido dietilentriaminapentaacético
(DTPA), marcado con In-111, puede formar imágenes
de cánceres microcíticos de pulmón por la unión a receptores de SS.
Maini et al., Nucl Med Commun,
14:962-968, 1993. Se ha demostrado que otro
análogo de tirosina del octapéptido,
Tyr^{3}-octreótido (T-OCT),
marcado en la tirosina con I-123, se une a tumores
endocrinos. Lamberts, et al., N Engl J Med,
323:1246-1249, 1990. Aunque se han examinado
algunos péptidos sintéticos marcados con Tc-99m para
la formación de imágenes de trombos o la formación de imágenes de
infecciones, no han recibido mucha atención la SS o el VIP marcados
con Tc-99m o renio para el diagnóstico y el
tratamiento de cánceres.
Las estructuras de SS, OCT, T-OCT
y VIP se muestran a continuación.
La SS, el OCT, el T-OCT y el VIP
carecen de un grupo sulfhidrilo libre. Para conseguir un marcaje
eficaz con, por ejemplo, iones de Tc o Re procedentes de
pertecnetato o perrenato reducido, deben introducirse tioles. Esto
se complica adicionalmente por el hecho de que la SS y sus análogos
contienen un bucle disulfuro, cuya conservación es esencial para
mantener una conformación que se una bien a su receptor. Por
consiguiente, se excluye cualquier reacción que implique la escisión
de enlaces disulfuro para generar tioles, e incluso el uso o la
generación de tioles puede producir una escisión intermolecular o
intramolecular del bucle disulfuro.
También sería deseable prolongar la vida media
in vivo de los péptidos marcados para permitir la
localización de un mayor porcentaje de la dosis inyectada en el
sitio diana.
De esta manera, existe la necesidad de
desarrollar un método para marcar péptidos pequeños tales como SS y
VIP usando un reactivo quelante (i) que sea capaz de reaccionar con
un péptido que no contiene grupos sulfhidrilo y (ii) que pueda
transformarse en un ligando que contiene sulfhidrilo después de la
conjugación con el péptido, sin la escisión de disulfuro antes o
después de la generación del grupo sulfhidrilo libre, de forma que
el conjugado pueda combinarse con iones estannosos y congelarse o
liofilizarse sin la escisión de disulfuro, y forme un quelato
estable con iones de tecnecio o renio reducido tras el contacto con
radiopertecnetato o radioperrenato, en un proceso de marcaje de una
sola etapa. También existe la necesidad de desarrollar un kit de
marcaje para preparar SS y sus análogos y VIP radiomarcados, que
sea fácil de usar y que no implique procedimientos sintéticos
complicados o múltiples recipientes para el péptido y el agente
reductor. También existe la necesidad de desarrollar un método para
radiomarcar un péptido para uso en la formación de radioimágenes o
en radioterapia, donde el péptido radiomarcado tenga una buena
absorción por el tumor, una baja absorción renal, no se elimine
totalmente en el hígado, se distribuya ampliamente a lo largo del
cuerpo, pueda diseñarse para tener una alta vida media in
vivo y proporcione una buena relación entre el tejido tumoral y
el tejido no tumoral para poder obtener imágenes.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un método y un kit útil para radiomarcar un péptido
tal como somatostatina o péptido intestinal vasoactivo con un
radioisótopo de Tc o Re, usando un agente quelante que se pueda
sintetizar fácilmente, donde el método no implique procedimientos
de reducción complicados incluyendo el uso de un exceso de agente
reductor, y no ocasione la escisión prematura del péptido durante
la incubación con el agente reductor para el radionúclido. También
es un objeto de la presente invención proporcionar un método y un
kit de un vial para radiomarcar el péptido con Tc o Re, que sea
fácil de usar por un médico o un técnico. Otro objeto adicional de
la presente invención es proporcionar un método y un kit para
radiomarcar el péptido con Tc o Re para uso en la formación de
imágenes o en terapia, donde el péptido radiomarcado tenga una buena
absorción por el tumor, una baja absorción renal, no se elimine
totalmente en el hígado, se distribuya ampliamente a lo largo del
cuerpo, pueda diseñarse para tener una alta vida media in
vivo y proporcione una buena relación entre el tejido tumoral y
el tejido no tumoral para poder obtener imágenes.
De acuerdo con estos y otros objetos de la
presente invención, se proporciona un método para radiomarcar un
péptido con un radioisótopo de tecnecio o renio, que comprende las
etapas de:
(a) hacer reaccionar un péptido que no contiene
un grupo sulfhidrilo libre con un agente quelante bifuncional que
contiene tiol terciario protegido con acetilo, que contiene un
grupo funcional reactivo con amina, para formar un conjugado que
contenga péptido-acetil-t-tiol;
(b) desproteger el grupo acetil-t-tiol
para generar un grupo t-tiol libre;
y
(c) mezclar el conjugado que contiene el
péptido-t-tiol con una sal estannosa para la reducción del
pertecnetato o perrenato, el radionúclido a añadir en una etapa
posterior, para formar una mezcla de agente reductor y conjugado
que contiene péptido-t-tiol; y
(d) hacer reaccionar la mezcla de la etapa (c)
con pertecnetato o perrenato, con lo que los cationes de Tc o Re se
unen al grupo t-tiol, formándose de esta manera un péptido
radiomarcado
o
(c') añadir pertecnetato o perrenato reducido a
dicho conjugado que contiene péptido-t-tiol, formándose de
esta manera un péptido radiomarcado.
Se proporcionan kits para realizar el método de
radiomarcaje.
Los presentes inventores han descubierto que un
péptido, por ejemplo, la somatostatina (SS) o el péptido intestinal
vasoactivo (VIP), que tiene grupos sulfhidrilo colgantes, en virtud
del uso de un agente quelante que contiene grupos tiol colgantes
protegidos que posteriormente se desprotegen para generar grupos
sulfhidrilo libres, puede unirse selectivamente a iones de metales
radiactivos para formar enlaces fuertes con los grupos sulfhidrilo.
Estos péptidos radiomarcados son muy eficaces cuando se usan en
métodos de formación de radioimágenes y radioterapéuticos debido a
su capacidad de unirse a tumores, de evitar una absorción renal
excesiva, de evitar una eliminación excesiva en el hígado, de
sobrevivir durante más tiempo in vivo y de proporcionar
buenas relaciones entre tejidos tumorales y no tumorales. Además,
el método de radiomarcaje permite el marcaje en una etapa de un
péptido cuyos enlaces disulfuro no se han escindido prematuramente,
es decir, SS, con lo que el péptido se conjuga con un agente
quelante y después se pone en contacto con un agente reductor para
el radionúclido de tal manera que el agente reductor no escinda el
péptido. Los presentes inventores también han descubierto que un
péptido puede marcarse de la forma anterior sin necesidad de
reducir el péptido, evitando de esta manera el riesgo de escindir
los enlaces disulfuro o alterar la especificidad o la afinidad de
unión del péptido. Además, los presentes inventores han descubierto
que el uso de un agente quelante que contiene tiol terciario permite
la unión a un péptido sin generar grupos sulfhidrilo libres en el
péptido o reducir el péptido, y sin escindir los grupos tiol
protegidos del agente quelante, previniendo de esta manera la
desprotección prematura y la pérdida oxidativa de los grupos tiol
libres. En el método de la presente invención, tanto los reactivos
como las condiciones están muy simplificados, y el método es
particularmente adecuado para el marcaje con tecnecio o renio
utilizando un transquelante tal como glucoheptonato o usando estaño
como agente reductor en un kit de un vial.
A lo largo de esta descripción, el término
"péptido" significa un compuesto biológico (es decir, natural)
o sintético que contiene dos o más aminoácidos unidos por el grupo
carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro. Cualquier
péptido puede marcarse de acuerdo con los presentes métodos, pero
en la práctica, típicamente se marcan los péptidos que son
biológicamente útiles. Por lo tanto, son particularmente adecuados
para uso en la presente invención péptidos que reconocen sitios
receptores que se expresan en diversos tipos de sitios tumorales y
otros tejidos a lo largo del cuerpo. De estos péptidos, se
prefieren particularmente la SS y sus análogos y el VIP.
El marcaje indirecto de un péptido usando un
agente quelante que contiene tiol terciario protegido para generar
un derivado de péptido que contiene acetil-t-tiol permite la
unión a sitios de unión que no son dianas específicas en el péptido
sin una escisión prematura del tiol protegido en el otro extremo
del agente quelante que contiene tiol terciario y sin la escisión de
enlaces disulfuro del péptido. Este aspecto de la invención es
particularmente importante para radiomarcar SS, donde la estructura
de bucle debida al enlace disulfuro de cistina es importante en la
unión al receptor. Además, los presentes inventores han descubierto
que el enlace disulfuro del péptido en los conjugados de
péptido-agente quelante de la presente invención,
cuando se mezclan con un agente reductor de sal estannosa para un
pertecnetato o perrenato, en un kit de un vial, no se escinde para
producir fragmentos más pequeños que pueden no tener la
especificidad de unión requerida o para producir grupos sulfhidrilo
colgantes en el péptido. Por lo tanto, el uso de los agentes
quelantes que contienen t-tiol de la presente invención
permite marcar específicamente grupos sulfhidrilo colgantes del
agente quelante desprotegido y no cualquier grupo sulfhidrilo libre
presente en el péptido que pueda haberse generado por descuido por
medio de reducción.
El agente quelante que contiene tiol terciario
protegido tiene una mayor resistencia a reacciones de escisión de
acilo, impidiendo de esta manera que las funcionalidades reactivas
del péptido, es decir, las funcionalidades amino, desprotejan
prematuramente los grupos tiol, y el uso de los agentes quelantes
de la invención previene la reducción por descuido de los enlaces
disulfuro presentes en el péptido. El presente método evita
adicionalmente de forma substancial la formación indeseable de
coloides durante el transcurso del proceso de marcaje y, en
proporciones apropiadas de agente reductor y exclusión de oxígeno,
el presente método previene la acumulación de pertecnetato residual
como contaminante. Cuando el agente quelante que contiene
t-tiol incluye además una aminoácido no natural, el péptido
marcado resultante tiene potencialmente una mayor vida media in
vivo debido a la incapacidad del cuerpo de reconocer y unirse o
reaccionar con el aminoácido no natural.
A lo largo de esta descripción, la expresión
"aminoácido no natural" significa un aminoácido que no se
produce de forma natural por el cuerpo. Normalmente, estos
aminoácidos no naturales incluyen isómeros de aminoácidos naturales
u otras modificaciones químicas de aminoácidos naturales. Por
ejemplo, la L-fenilalanina representa un aminoácido
natural que se reconoce in vivo, y un ejemplo de un análogo
de aminoácido no natural de L-fenilalanina sería
D-fenilalanina. La D-fenilalanina
es un aminoácido no natural particularmente preferido, aunque los
especialistas en la técnica reconocen que en el contexto de la
presente invención pueden sintetizarse y utilizarse otros numerosos
aminoácidos no naturales.
Se entenderá que los péptidos, incluyendo SS y
VIP, a radiomarcar también pueden ser péptidos que se dirigen a
antígenos que incluyen, pero sin limitación, los antígenos
producidos o asociados con tumores, lesiones infecciosas,
microorganismos, parásitos, infartos de miocardio, coágulos, placas
ateroscleróticas, u órganos o tejidos normales. Ventajosamente, los
péptidos útiles en radioinmunoterapia son péptidos de dirección que
se unen a células y tejidos que están asociados con un estado de
enfermedad. Por lo tanto, al destruir estás células o tejidos, el
estado de enfermedad puede aliviarse. Esta unión típicamente tiene
lugar con moléculas complementarias y estructuras asociadas con o
expresadas en la superficie de las células o tejidos enfermos, que
preferiblemente no están asociadas con o no se expresan en la
superficie de las células sanas.
Más típicamente, los restos complementarios
estarán presentes en células sanas, pero en una menor medida que la
que se observa en el estado de enfermedad. Por ejemplo, muchos
mielomas muestran grandes aumentos de la expresión del receptor de
interleuquina 6 (IL-6) en comparación con tejidos
normales. Los péptidos marcados dirigidos al receptor
IL-6 se unirían preferentemente a células de
mieloma, conduciendo a una mayor concentración eficaz de péptido
radiomarcado y produciendo un destrucción celular preferente en el
sitio del tumor. Otro ejemplo es el antígeno carcinoembriónico (CEA)
que se expresa en gran medida en la superficie de muchos tumores.
Un fragmento peptídico radiomarcado que se dirija a CEA producirá
una destrucción celular preferente en el sitio del tumor. Los
especialistas en la técnica entenderán que se consigue una
destrucción celular preferente usando iones de metales radiactivos
que son terapéuticamente eficaces en radioinmunoterapia, tales como
iones de renio y similares.
El presente método ventajosamente marca péptidos
tales como SS, análogos de SS y VIP. Los análogos de SS incluyen
péptidos más cortos que también contienen un bucle disulfuro y
ciertos de los aminoácidos críticos presentes en SS. Como se ha
indicado anteriormente, estos péptidos se han marcado con
I-111 o I-123 para formar imágenes.
Estos radioisótopos generalmente son menos deseables en los
departamentos de medicina nuclear que el Tc-99m. Se
ha descubierto que la reacción de SS, OCT, T-OCT y
VIP con un agente quelante que contiene tiol terciario protegido,
seguida de desacetilación y reacción con pertecnetato reducido, por
ejemplo, usando un kit de glucoheptonato, produce un marcaje muy
eficaz del péptido.
El método de la presente invención incluye la
reacción del péptido con un agente quelante que contiene tiol
terciario protegido para producir un conjugado de
péptido-agente quelante que contenga al menos un
grupo tiol terciario protegido. El agente quelante que contiene tiol
terciario se une covalentemente al péptido y sirve para acoplar el
péptido y el metal radiactivo después de la desprotección. Los
especialistas en la técnica conocen bien métodos para realizar tal
unión covalente. Por ejemplo, puede usarse un éster activo (por
ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimida) o un
derivado de isotiocianato del agente quelante para unir el agente a
funciones amino presentes en el péptido; puede usarse un derivado
de 2-yodoacetilo o maleimido del agente quelante
para unir el agente a grupos sulfhidrilo del péptido; puede usarse
un derivado de hidrazida del agente para unir el agente a grupos
carbohidrato oxidados presentes en el péptido; o puede usarse un
reactivo de carbodiimida tal como
1-etil-3-(3-diaminopropil)carbodiimida
para unir un grupo carboxilo del agente quelante a un grupo amino
del péptido. Ventajosamente, el agente quelante que contiene tiol
terciario protegido de la presente invención contiene un éster
activo y se une a una función amina del péptido.
También es útil incluir un aminoácido no natural
en el quelante. Se ha descubierto que esto prolonga la vida media
in vivo del conjugado de péptido-quelante. Un
aminoácido no natural preferido es
D-fenilalanina.
Los agentes quelantes que contienen tiol
terciario protegidos útiles en la presente invención son cualquier
agente quelante que contenga (i) un grupo funcional capaz de formar
un enlace estable con una funcionalidad del péptido, como se ha
descrito anteriormente, y (ii) una porción complejante que contiene
al menos un grupo tiol terciario protegido, siendo dicha porción
capaz de formar complejos con un radionúclido deseado después de la
desprotección, y que no reaccione con la funcionalidad del péptido
para desproteger prematuramente el grupo tiol. Ventajosamente, el
agente quelante que contiene tiol terciario forma un complejo de
anillo de 5 ó 6 miembros con el radionúclido deseado.
Es conveniente que el grupo tiol terciario forme
parte un ácido carboxílico, de manera que pueda unirse fácilmente
al péptido o a un enlazador corto que finalmente se une al péptido.
El documento WO 95/33495 describe varios quelantes adecuados para
uso en la presente invención. Los ejemplos preferidos de tales
quelantes incluyen, pero sin limitación, glicinato de
(N-hidroxisuccinimidil)-N-(3-metil-3-acilmercapto
butirilo) (compuesto I mostrado a continuación) y productos de
reacción de este compuesto con diglicina o triglicina. Como
alternativa, el agente quelante puede incluir, pero sin limitación,
derivados de D-fenilalanina de glicinato de
(N-hidroxisuccinimidil)-N-(3-metil-3-acilmercapto
butirilo) y productos de reacción de este compuesto con diglicina o
triglicina (compuesto II mostrado a continuación). Estos agentes
quelantes particularmente preferidos se representan por las
siguientes fórmulas.
Los grupos sulfhidrilo colgantes presentes en el
agente quelante pueden ser incompatibles con un electrófilo
selectivo por sulfhidrilo que puede formar parte del mismo agente
quelante. Lo que es más importante, cuando el péptido a conjugar con
el quelante también contiene un puente o bucle disulfuro, un grupo
sulfhidrilo libre presente en el quelante podría escindir el bucle o
puente y fragmentar el péptido o destruir una conformación esencial
para la unión al receptor. Tales casos, el grupo sulfhidrilo se
protege convenientemente durante la unión del agente quelante. El
tiol protegido después puede desprotegerse usando mecanismos bien
conocidos para los especialistas en la técnica. La expresión
"tiol protegido", como se usa en este documento, denota un
resto que contiene tiol donde el grupo tiol se modifica
reversiblemente de tal forma que el tiol se vuelve no reactivo.
Después de la unión al substrato peptídico, el resto quelante puede
desprotegerse para desenmascarar la funcionalidad quelante para la
unión del radionúclido. En particular, el tiol protegido se
desprotege para generar grupos sulfhidrilo libres colgantes capaces
de formar complejos con el radionúclido.
Los grupos que son adecuados para proteger el
tiol de la reacción son grupos orgánicos e inorgánicos que puede
retirarse fácilmente en condiciones suaves para regenerar el
sulfhidrilo libre en presencia del péptido sin alterar
substancialmente la actividad del péptido. Ventajosamente, el grupo
protector de tiol es un grupo acilo que forma un tiol éster.
Preferiblemente, el grupo acilo es un grupo acilo inferior,
especialmente un grupo acetilo.
Los especialistas en la técnica están
familiarizados con los procedimientos para proteger y desproteger
grupos tiol y está dentro del alcance del especialista habitual en
la técnica hacerlo dentro de los límites de la presente invención.
Un método preferido para escindir un grupo protector de acilo sobre
un tiol terciario es la reacción con hidroxilamina. Ésta es una
reacción suave que normalmente no afecta a otros grupos funcionales
del péptido y que tampoco escinde enlaces disulfuro.
Una vez desprotegido el tiol, se añade un
radionúclido que se une a sulfhidrilo. En particular, pertecnetato
o perrenato reducido. Como es bien conocido en la técnica, los
radioisótopos de tecnecio o renio se suministran convenientemente en
forma de "generadores", es decir, otros precursores
radiactivos que se desintegran para dar sales de pertecnetato o
perrenato solubles que pueden "extraerse" del generador usando
solución salina. Estas especies reducidas se estabilizan
convenientemente con un transquelante tal como glucoheptonato y
similares, de los que muchos están disponibles como kits
comerciales. Los quelatos estabilizados de las sales de Tc o Re se
añaden al conjugado de quelante-péptido y el
sulfhidrilo de unión más fuerte desplaza al transquelante y absorbe
el ion metálico radiactivo.
Un inconveniente del proceso anterior es que es
un proceso de dos etapas, donde primero se añade el pertecnetato o
perrenato a una mezcla de un agente reductor, típicamente una sal
de ion estannoso, y se deja que el transquelante, en un primer vial,
forme un quelato de la especie de Tc o Re reducida. A continuación,
el quelato de Tc o Re se añade a un segundo vial que contiene el
conjugado de péptido-quelante para efectuar la
reacción de transquelación/marcaje. Son inevitables pérdidas en la
transferencia de los quelatos de Tc o Re y existe riesgo de derrame
y contaminación. Seria deseable añadir el efluente del generador
directamente a un solo vial para el marcaje.
Esto se consigue de acuerdo con la invención
añadiendo al conjugado de péptido
desprotegido-agente quelante un agente reductor para
reducir un radionúclido, añadiéndose el radionúclido
posteriormente. El agente reductor preferido es una sal de ion
estannoso, por ejemplo, cloruro estannoso. La reducción de enlaces
disulfuro por iones estannosos es una reacción relativamente lenta.
El conjugado de péptido desprotegido-agente
quelante y el agente reductor típicamente se congelan o liofilizan,
impidiendo de esta manera la escisión de enlaces disulfuro en el
péptido debido a la presencia del agente reductor.
La presente invención también incluye un kit que
incluye un conjugado de péptido desprotegido-agente
quelante y, opcionalmente, un agente reductor para reducir un
radionúclido, donde el radionúclido se va a añadir posteriormente.
Es posible usar un conjugado de tiol terciario protegido y añadir
el agente desprotector antes o junto con el radionúclido. Los viales
o kits únicos de la presente invención están diseñados para
contener el péptido apropiado, complejado con el agente quelante
que contiene tiol terciario, para cualquier procedimiento particular
de inmunodiagnóstico o inmunoterapéutico.
De acuerdo con el presente método, los viales o
kits ventajosamente se cierran herméticamente y disponen de un
mecanismo para introducir o eliminar reactivos en condiciones
estériles o semiestériles. Preferiblemente, en el presente método se
usa un vial que contiene un orificio para la inyección con una
jeringa. Los reactivos de los viales o kits típicamente se
proporcionan en forma acuosa, congelada o liofilizada. En una
realización, los reactivos pueden almacenarse a baja temperatura,
por ejemplo, en el refrigerador o congelador o a las temperaturas
del hielo seco o del nitrógeno líquido, durante un período de
varios días a varias semanas, preferiblemente a un pH de
aproximadamente 3,5-5,5, más preferiblemente a pH
4,5-5,0, ventajosamente en una atmósfera de gas
inerte, por ejemplo nitrógeno o argón.
También está dentro del alcance de la presente
invención proporcionar los reactivos en forma liofilizada para
facilitar el almacenamiento y la estabilización. Esto se realiza
ventajosamente a un pH de aproximadamente 5,5, desde una solución de
un tampón volátil, por ejemplo, acetato amónico, y preferiblemente
también en presencia de un estabilizador para prevenir la
agregación, por ejemplo, un azúcar tal como trehalosa o sacarosa.
Tales condiciones de liofilización son convencionales y bien
conocidas para el especialista habitual en la técnica. Los reactivos
también pueden congelarse y después descongelarse antes del uso,
pero este procedimiento lleva asociado un mayor riesgo de
reoxidación y agregación del conjugado de
péptido-agente quelante.
Cuando el kit no contiene un agente reductor, se
añaden quelatos catiónicos de Tc o Re pre-reducidos
para efectuar el marcaje. Si en el kit están presentes sales
estannosas, es suficiente añadir un efluente generador de
pertecnetato o perrenato para la reducción y el marcaje in
situ. El contenido del vial después se mezcla y se incuba
durante un período de tiempo suficiente para efectuar el marcaje de
la proteína. La duración y las condiciones de la incubación no son
críticas, pero la incubación típicamente se realiza durante un
período de tiempo suficiente para obtener una incorporación
substancialmente del 100% de ^{99m}Tc en el péptido.
"Incorporación de substancialmente el 100%", según se refiere
al marcaje con tecnecio, indica una incorporación mayor del 98%,
ventajosamente mayor del 99% y más ventajosamente una incorporación
del 100%. Normalmente, la incubación se realiza durante un período
de tiempo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60 minutos, y
ventajosamente durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a
aproximadamente 5 minutos. El péptido radiomarcado después puede
extraerse del vial y usarse inmediatamente, ya que no se requiere
separación o purificación.
El agente reductor para el radionúclido
ventajosamente es estaño (II), preferiblemente en forma de iones
estannosos. Típicamente, se añade cloruro estannoso a la mezcla que
contiene el conjugado de péptido-agente quelante.
Los especialistas en la técnica entenderán que los iones estannosos
pueden generarse in situ a partir de metal de estaño, por
ejemplo, láminas, gránulos, polvos, limaduras y similares, por
contacto con un ácido acuoso, por ejemplo HCl, y normalmente se
añaden en forma de SnCl_{2}, ventajosamente en una solución que
también es aproximadamente 0,1 mM en HCl.
En general, es ventajoso trabajar con una
concentración de péptido de aproximadamente 0,01-10
mg por ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1-5
mg/ml, de solución, generalmente en solución salina,
preferiblemente tamponada a un pH levemente ácido de aproximadamente
4,0-4,5. En tal caso, la cantidad de ion estannoso
necesaria para la reducción de una actividad de formación de
imágenes normal de pertecnetato es de aproximadamente
0,1-50 \mug/ml, preferiblemente de
aproximadamente 0,5-25 \mug/ml, en proporción con
la cantidad de péptido. Cuando se marca la cantidad anterior de
péptido, la cantidad de pertecnetato generalmente es de
aproximadamente 2-50 mCi/mg de péptido y el tiempo
de reacción es de aproximadamente 0,1-30 minutos.
Con las concentraciones preferidas de péptido e iones estannosos,
la cantidad de pertecnetato preferiblemente es de aproximadamente
5-30 mCi/mg y el tiempo de reacción preferiblemente
es de aproximadamente 1-20 minutos.
El pertecnetato generalmente se obtiene a partir
de un generador disponible en el mercado, más comúnmente en forma
de NaTcO_{4}, normalmente en solución salina. Pueden usarse otras
formas de pertecnetato, con una modificación apropiada del
procedimiento, como se sugeriría por el proveedor de una nueva
forma de generador o como sería evidente para el especialista
habitual en la técnica. El pertecnetato generalmente se usa a una
actividad de aproximadamente 0,2-10 mCi/ml en
solución salina, por ejemplo, en solución salina
("fisiológica") al 0,9%, tamponada a un pH de aproximadamente
3-7, preferiblemente de 3,5-5,5, y
más preferiblemente de aproximadamente 4,5-5,0. Los
tampones adecuados incluyen, por ejemplo, acetato, tartrato,
citrato, fosfato y similares. La reducción del pertecnetato
normalmente se realiza en una atmósfera de gas inerte, por ejemplo,
nitrógeno, argón o similares. La temperatura de reacción
generalmente se mantiene a aproximadamente la temperatura ambiente,
por ejemplo, de 18 a 25ºC.
A lo largo de esta descripción, las expresiones,
"pertecnetato reducido" o "perrenato reducido" denotan
las especies de ion tecnecio o renio formadas por reducción con ion
estannoso del pertecnetato o perrenato y queladas por el o los
grupos tiol. Generalmente se cree que el pertecnetato reducido está
en forma de Tc(III) y/o Tc(IV) y/o Tc(V) en
tales quelatos, y que el perrenato reducido está en forma de
Re(III) y/o Re(IV) y/o Re(V), pero dentro del
alcance de la presente invención se incluyen estados de oxidación
superiores o inferiores y/o estados de oxidación múltiple.
El renio se encuentra justo debajo del tecnecio
en la tabla periódica, tiene la misma configuración electrónica en
la envuelta externa y, por lo tanto, es de esperar que tenga
propiedades químicas muy similares al tecnecio, especialmente su
comportamiento con compuestos análogos. De hecho, los compuestos de
renio se comportan de una forma cualitativamente similar a los
compuestos de tecnecio por lo que respecta a la reducción y a la
quelación, pero sus velocidades de reacción son bastante diferentes
y son distintos en ciertos aspectos importantes. A pesar de estas
diferencias, el especialista en la técnica puede modificar la
presente invención basándose en la descripción del marcaje con
tecnecio para conseguir un marcaje con renio eficaz (véase, por
ejemplo, Griffiths, Patente de Estados Unidos Nº 5.128.119, cuya
descripción se incorpora en este documento como referencia en su
totalidad).
El radioisótopo Re-186 es
atractivo para terapia y también puede usarse para formar imágenes.
Tiene una vida media de aproximadamente 3,7 días, una alta emisión
beta LET (1,07 MeV) y una energía de emisión gamma conveniente
(0,137 MeV). Por analogía al tecnecio, el renio se produce a partir
de perrenato, y los iones de renio reducidos pueden unirse de forma
no específica a péptidos. Por consiguiente, sería ventajoso un
método para el marcaje de péptidos con Re-186, donde
el perrenato reducido se une a grupos sulfhidrilo en un complejo de
péptido-agente quelante. El Re-188
es un emisor beta y gamma producido por un generador con una vida
media de aproximadamente 17 horas y es adecuado para formar
imágenes y para terapia. Actualmente está en marcha el desarrollo
de generadores comerciales para renio-188; y en un
escenario preferido, se añade renio-188 sin vehículo
directamente a un vial que contiene iones estannosos y un complejo
de péptido-agente quelante, para producir un péptido
radiomarcado con renio que está listo para uso en menos de
aproximadamente 2 horas.
En general, la concentración de péptido no
complejado, por ejemplo SS o VIP, los tiempos de reacción, las
actividades de perrenato y otras condiciones serán substancialmente
las mismas que para el marcaje con Re-186 o
Re-188, con la excepción de que se usa una mayor
cantidad de ion estannoso. Cuando el radioisótopo en el
radioperrenato es Re-188 substancialmente sin
vehículo, la concentración de péptido en la solución ventajosamente
es de aproximadamente 1-20 mg/ml, preferiblemente
de aproximadamente 10-20 mg/ml y la cantidad de ion
estannoso es de aproximadamente 500-10.000
\mug/ml, preferiblemente de aproximadamente
500-5.000 \mug/ml. Cuando el radioisótopo en el
radioperrenato es Re-186 al que se le ha añadido un
vehículo, a la misma concentración de anticuerpo o fragmento de
anticuerpo, la cantidad de ion estannoso es de aproximadamente
5-1.000 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente
50-500 mg/ml.
Los iones de cobre también se quelan fuertemente
por quelantes de azufre. El Cu-67 es otro
radionúclido atractivo para formar imágenes y para terapia. Tiene
una vida media de aproximadamente 2,6 días, una emisión beta (0,57
MeV) y una emisión gamma (0,185 MeV), aunque la energía beta es
relativamente baja. El Cu-67 es relativamente caro y
no se puede adquirir fácilmente en el momento actual, aunque tales
condiciones pueden cambiar según aumente la demanda. El
Cu-67 tiene la ventaja de que forma quelatos
fuertes con tioles, el marcaje es sencillo y rápido, y no requiere
agentes reductores para el metal radiactivo.
Otros radionúclidos con un comportamiento de
quelación similar al cobre, por ejemplo, el mercurio, la plata y el
plomo, también podrían unirse a compuestos que contienen tiol de
acuerdo con el método de la presente invención.
Hg-197 tiene una vida media de aproximadamente 1,5
días y emite radiación gamma en un intervalo de energía de
78-268 KeV, y Pb-203 es un emisor
gamma fuerte de aproximadamente 275 KeV con una vida media de
aproximadamente 51 horas, lo cual hace que el mercurio y el plomo
sean adecuados para la escintigrafía gamma. Ag-111
tiene una vida media de 7 días y emite radiación beta a
aproximadamente 1,02 MeV, y Bi-212 es un emisor alfa
con una vida media de aproximadamente 1 hora y una energía de 6,09
MeV, lo cual hace que tengan un interés considerable para la
terapia in vivo. Bi-212 se produce in
situ a partir de un precursor de Pb-212 con
emisión de radiación gamma de 239 KeV, con una vida media de
aproximadamente 10,6 horas. De esta manera, los conjugados de
péptido-agente quelante que contiene tiol terciario
para la terapia con Bi-212 serán conjugados marcados
con Pb-212, y en este documento se usa la notación
abreviada plomo/bismuto o Pb/Bi para indicar esto. Se entenderá que
la invención no se limita al radionúclido ilustrado, sino que, en
general, se puede aplicar a iones que se unen fuertemente a grupos
sulfhidrilo.
Las condiciones de marcaje mencionadas
anteriormente típicamente dan como resultado una incorporación
substancialmente del 100%, o una incorporación substancialmente
cuantitativa, del marcador en el complejo de
péptido-agente quelante. A lo largo de esta
descripción, la expresión "incorporación cuantitativa
substancial", en relación con el marcaje con renio, denota una
incorporación mayor que aproximadamente un 80%, ventajosamente mayor
que aproximadamente un 85% y más ventajosamente mayor que
aproximadamente un 90%. Por ejemplo, ahora es posible marcar
consistentemente el péptido, complejado con un agente quelante que
contiene tiol terciario, con una cantidad de 5 a 200 microgramos de
Sn(II) por miligramo de péptido, con un rendimiento
esencialmente cuantitativo. Además, la inmunorreactividad de este
péptido marcado apenas se reduce después de esta incubación del
suero, lo que demuestra que los conjugados de péptido
radiomarcado-agente quelante siguen siendo agentes
de formación de imágenes completamente viables después de al menos
24 horas.
En las condiciones de reacción mencionadas
anteriormente, para el marcaje con tecnecio, no se requiere ningún
transquelante tal como fosfonato, tartrato, glucoheptonato u otro
agente quelante de Sn(II) bien conocido para mantener el
estaño en solución, sin embargo, pueden usarse tales transquelantes
de acuerdo con la presente invención. Para uso en el presente método
se prefieren compuestos de Sn(II) tales como cloruro
estannoso, aunque también son eficaces otras sales de Sn(II)
convencionales y fácilmente adquiribles. Sólo hay tres ingredientes
esenciales; el conjugado de péptido
desprotegido-agente quelante, el ion estannoso
acuoso y la solución de pertecnetato. En las condiciones de
reacción descritas en este documento, puede conseguirse fácilmente
una incorporación substancialmente del 100% de
Tc-99m en el péptido.
El péptido radiomarcado resultante es adecuado
para uso en la formación de imágenes escintigráficas de, por
ejemplo, tumores, lesiones infecciosas, microorganismos, coágulos,
infartos de miocardio, placas ateroscleróticas, u órganos y tejidos
normales. Tales métodos de formación de imágenes son bien conocidos
en la técnica. Las soluciones de péptido radiomarcado como se han
preparado anteriormente están listas para la inyección inmediata si
se hacen reaccionar en un vial sin pirógenos esterilizado de forma
apropiada. Además, no se necesita el bloqueo de los grupos
sulfhidrilo libres después de la unión del tecnecio para conseguir
la estabilización.
El conjugado de péptido-agente
quelante-ion de metal radiactivo preferido de la
presente invención se representa por la siguiente fórmula I
Fórmula I[PÉPTIDO] -
X_{n} - [I] -
M
donde:
n es cero o 1;
x representa un aminoácido no natural tal como
D-fenilalanina;
I representa el agente quelante representado por
el compuesto I, donde el grupo tiol protegido se ha desprotegido;
y
M representa un ión de metal radiactivo tal como
tecnecio-99m reducido.
Preferiblemente, el péptido se une a X (o
directamente a I cuando n es cero) a través del grupo amino del
extremo N del péptido, aunque dentro del contexto de la presente
invención también se incluye la unión a través del grupo amina
libre de restos de lisina o arginina presentes en el cuerpo del
péptido.
Esquema de reacción
I
Esquema de reacción
II
El esquema general para el radiomarcaje de un
péptido tal como SS, OCT, T-OCT o VIP normalmente
implica primero hace reaccionar el péptido con el agente quelante: I
en el caso del uso del compuesto I, o X-I en el
caso del uso del compuesto II. El grupo tiol protegido después se
desprotege y el conjugado de péptido-agente quelante
desprotegido resultante se incuba con un ion metálico radiactivo
tal como tecnecio. La síntesis del conjugado de
péptido-agente quelante desprotegido de acuerdo con
la presente invención puede realizarse de acuerdo con el esquema de
reacción I (para el compuesto I) y con el esquema de reacción II
(para el compuesto II) indicados anteriormente. Se proporcionan más
detalles en el documento WO 95/33495.
El método de la presente invención es
particularmente atractivo para marcar SS, OCT,
T-OCT y VIP, aunque también pueden marcarse péptidos
que funcionan como fármacos, citoquinas, enzimas, hormonas,
inmunomoduladores, péptidos receptores y similares. Los péptidos
pueden contener uno o más enlaces disulfuro que forman puentes o
bucles dentro de la estructura del péptido. Se conocen métodos que
implican la escisión de estos enlaces disulfuro destinados
típicamente para escindir selectivamente sólo los enlaces disulfuro
que no juegan un papel significativo en la unión al receptor.
Desafortunadamente, algunas veces estos métodos, si no se realizan
con precaución, pueden producir una escisión indeseable de los
enlaces disulfuro que juegan un papel significativo en la unión a
los receptores, haciendo de esta manera que el péptido sea
esencialmente inútil. Además, el uso de agentes quelantes que tienen
grupos tiol libres también puede ocasionar una escisión indeseable
similar de enlaces disulfuro en el péptido. El presente método
evita específicamente tal escisión indeseable usando el agente
quelante que contiene tiol terciario protegido o un agente quelante
que contiene tiol terciario protegido que contiene un aminoácido no
natural, y complejando el agente quelante con un grupo funcional del
péptido, preferiblemente un grupo amino, permaneciendo intactos de
esta manera los enlaces disulfuro del péptido.
El método de la presente invención también
incluye el uso de un ligando de transferencia soluble en agua que
forma complejos con el radionúclido reducido. En general, los
ligandos de transferencia útiles en una realización alternativa de
la presente invención son quelantes solubles en agua (o pueden
hacerse solubles en agua) que son capaces de formar complejos con
tecnecio-99m o con cualquiera de los radioisótopos
de renio en el estado reducido o con otros radioisótopos conocidos
para formar un complejo estable de ion metálico/ligando. El complejo
además es capaz de intercambiar el radioisótopo con los grupos
sulfhidrilo colgantes presente en el conjugado de
péptido-agente quelante, después de la
desprotección del o de los grupos tiol. Los ejemplos de ligandos de
transferencia adecuados incluyen glucoheptonato, tartrato, DTPA,
EDTA, di, tri o polialquilfosfonatos, pirofosfato o glicina y sus
derivados. Los especialistas en la técnica reconocen que cualquier
agente quelante capaz de complejar con radionúclidos reducidos y
posteriormente transferir el radionúclido reducido a grupos
sulfhidrilo colgantes es útil de acuerdo con la presente invención
(véase, por ejemplo, Dean, Patente de Estados Unidos Nº 5.180.816
y/o Shochat et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.061.641,
cuyas descripciones se incorporan en este documento como referencia
en su totalidad).
La presente invención también incluye una
realización alternativa en la que el metal radiactivo unido al tiol
está "protegido terminalmente" con uno o más ligandos exógenos
(véase, Shochat et al., supra). Estos ligandos
generalmente están diseñados para completar la esfera de
coordinación del ion y complementar el o los grupos sulfhidrilo ya
proporcionados por el conjugado de péptido-agente
quelante. Debe romperse el equilibrio entre los ligandos que se unen
al ion tan fuertemente que debilitan el o los enlaces de
azufre-metal con el o los grupos reactivos del
péptido y reducen la estabilidad del marcador de metal radiactivo
en suero, y los que proporcionan una potencia quelante insuficiente
de forma que el ion se extraiga fácilmente del péptido por otros
ligandos exógenos en el suero o en la médula ósea, o en órganos
tales como el hígado, el bazo o los riñones, donde se produce
aclaramiento. Los especialistas en la técnica pueden romper este
equilibrio usando principios químicos conocidos, y pueden diseñar un
ligando de protección terminal exógeno adecuado.
Un kit para uso en el radiomarcaje de un péptido,
por ejemplo, SS, OCT, T-OCT o VIP, con
Tc-99m, usando pertecnetato producido por un
generador, incluiría aproximadamente 0,01-10 mg por
dosis unitaria de un péptido que se dirige específicamente a un
antígeno asociado con un tumor, una lesión infecciosa, un
microorganismo, un infarto de miocardio, un coágulo, una placa
aterosclerótica o un tejido u órgano normal, y que además está
conjugado con un agente quelante que contiene tiol terciario
protegido para formar un derivado de
péptido-acetil-t-tiol protegido que se
desprotege para formar un derivado de péptido-t-tiol. Como
alternativa, el agente quelante puede incluir un aminoácido no
natural tal como D-fenilalanina o similares. El kit
también incluiría de aproximadamente 0,1 a 50 \mug por dosis
unitaria de iones estannosos. Los constituyentes del kit se combinan
justo antes del uso con aproximadamente 2-50 mCi de
pertecnetato Tc-99m por mg de péptido. El derivado
de péptido-t-tiol y el agente reductor de Sn(II)
ventajosamente se combinan en una sola solución en un vial que puede
almacenarse, por ejemplo, en un baño de nitrógeno líquido, o
liofilizarse, preferiblemente añadiendo azúcar como es bien conocido
en la técnica, antes de la adicción del pertecnetato. Ciertas
variaciones que incluyen la adicción de reactivos convencionales de
los kits anteriores están bien dentro de la experiencia rutinaria de
los especialistas en la técnica.
Si se usa el derivado de
péptido-acetil-t-tiol, puede desprotegerse
antes de la mezcla con el agente reductor o después de la mezcla.
Sin embargo, el derivado de péptido
protegido-acetil-t-tiol debe desprotegerse
antes de la reacción con el radionúclido. Aunque el agente de
desprotección y el radionúclido pueden añadirse a la solución
simultáneamente, la secuencia de reacción generalmente es (i)
desprotección del derivado protegido de
péptido-acetil-t-tiol y reducción del
radionúclido, y (ii) marcaje del conjugado. Sin embargo,
ventajosamente, el derivado de
péptido-acetil-t-tiol se desprotege antes de
la mezcla con el agente reductor y del almacenamiento en un kit.
Tras la lectura de la presente memoria descriptiva, los
especialistas en la técnica serán capaces de diseñar un método y kit
usando un derivado de péptido-acetil-t-tiol
protegido o desprotegido.
Los péptidos de los kits de la presente invención
ventajosamente se congelan o se liofilizan, en recipientes
estériles, y en un atmósfera de gas inerte, ventajosamente se
enfrían y se almacenan en un baño de nitrógeno líquido y se
descongelan suavemente justo antes del uso. Los kits
convenientemente se suplementan con viales estériles de tampones,
solución salina, jeringas, filtros, columnas y auxiliares similares
para facilitar la preparación de preparaciones inyectables listas
para el uso por el médico o el técnico.
En una realización particularmente preferida de
la presente invención, el radiomarcaje de un péptido se realiza
conjugando glicinato de (N-hidroxisuccinimidil)
N-(3-metil-3-acilmercapto
butirilo) ("agente quelante") con SS, OCT,
T-OCT o VIP por reacción del péptido con al menos un
equivalente molar, y más preferiblemente con un exceso molar de
agente quelante a temperatura ambiente y a un pH dentro del
intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0. El número de
tioles añadidos a los péptidos puede alterarse variando el exceso
molar del agente quelante empleado. El conjugado de
péptido-agente quelante después preferiblemente se
purifica por medios convencionales (es decir, HPLC de fase inversa)
y en el conjugado purificado puede desprotegerse el tiol como y
cuando sea necesario, y una vez desprotegido el tiol, el producto
resultante se formula inmediatamente con cloruro estannoso y se
almacena como un kit en forma de un liofilizado, en viales cerrados
herméticamente, en una atmósfera de argón o al vacío. Este kit
entonces está listo para mezclarse con el radionúclido.
Será evidente para un especialista habitual en la
técnica que los péptidos radiomarcados, especialmente SS, OCT,
T-OCT y VIP, preparados de acuerdo con el método de
la invención, serán adecuados, y de hecho particularmente eficaces
y convenientes, en métodos de formación de imágenes escintigráficas
no invasivos y para radioterapia de tumores y lesiones. En
particular, será una mejora con respecto al uso como péptido
radiomarcado de un péptido marcado obtenido de acuerdo con el
método de la presente invención, un método para formar imágenes de
un tumor, una lesión infecciosa, un infarto de miocardio, un
coágulo, placas ateroscleróticas o un órgano tejido normal, donde a
un paciente humano se le inyecta por vía parenteral un péptido que
se dirige específicamente a un antígeno producido o asociado con el
tumor, etc., y radiomarcado con un radioisótopo farmacéuticamente
inerte que puede detectarse externamente y, después de un periodo
de tiempo suficiente para que el péptido radiomarcado pueda
localizarse y para eliminar el efecto de fondo indeseado, se detecta
el sitio o sitios de acumulación del péptido radiomarcado por una
cámara de formación de imágenes externa. Tal péptido radiomarcado
no se eliminará significativamente en el hígado, proporcionará una
buena relación entre el tejido tumoral y no tumoral, y
proporcionará una excelente dirección in vivo al tumor.
Otra aplicación importante será para la detección
directa de márgenes de tumores en un examen intraoperatorio,
intravascular o endoscópico y en cirugía. El péptido pequeño
radiomarcado puede usarse solo o en combinación con un anticuerpo o
un fragmento de anticuerpo radiomarcado, como se describe, por
ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 4.932.412.
Además, un método de radioterapia para un
paciente que padece un tumor o una lesión infecciosa, donde al
paciente humano que padece el tumor o la lesión infecciosa se le
inyecta por vía parenteral un péptido que se dirige específicamente
a un antígeno producido por o asociado con el tumor o la lesión
infecciosa, y radiomarcado con un radioisótopo terapéuticamente
eficaz, representará una mejora con respecto al uso como péptido
radiomarcado de un péptido radiomarcado con renio obtenido de
acuerdo con el método de la presente invención.
Se cree que un especialista en la técnica, sin
elaboración adicional, usando la descripción anterior, puede
utilizar la presente invención en su mayor extensión. Por lo tanto,
las realizaciones específicas preferidas anteriores deben
considerarse simplemente ilustrativas y no limitantes de la
descripción de manera alguna.
Claims (13)
1. Un método para radiomarcar un péptido con un
radioisótopo de tecnecio o renio, que comprende las etapas de:
(a) hacer reaccionar un péptido que no contiene
un grupo sulfhidrilo libre con un agente quelante bifuncional que
contiene tiol terciario protegido con acetilo, que contiene un
grupo funcional reactivo con amina, para formar un conjugado que
contenga péptido-acetil-t-tiol;
(b) desproteger el grupo acetil-t-tiol
para generar un grupo t-tiol libre;
y
(c) mezclar el conjugado que contiene el
péptido-t-tiol con una sal estannosa para la reducción del
pertecnetato o perrenato, el radionúclido a añadir en una etapa
posterior, para formar una mezcla de agente reductor y conjugado
que contiene péptido-t-tiol; y
(d) hacer reaccionar la mezcla de la etapa (c)
con pertecnetato o perrenato, con lo que los cationes de Tc o Re se
unen al grupo t-tiol, formándose de esta manera un péptido
radiomarcado,
o
(c') añadir pertecnetato o perrenato reducido a
dicho conjugado que contiene péptido-t-tiol, formándose de
esta manera un péptido radiomarcado.
2. El método de la reivindicación 1, donde la
etapa de desprotección (b) se realiza con hidroxilamina.
3. El método de la reivindicación 1, donde dicho
agente quelante bifuncional que contiene tiol terciario protegido
con acetilo es glicinato de N-hidroxisuccinimidil
N-(3-metil-3-acilmercaptobutirilo).
4. El método de la reivindicación 3, donde dicho
agente que contiene tiol terciario protegido con acetilo es un
éster de N-hidroxisuccinimidilo de la
N-(3-metil-3-acilmercaptobutiril)glicilamida
de un aminoácido no natural.
5. El método de la reivindicación 4, donde dicho
aminoácido no natural es D-fenilalanina, y dicho
agente quelante bifuncional que contiene tiol terciario protegido
con acetilo es
N-(3-metil-3-acilmercaptobutiril)glicil-D-fenilalaninato
de N-hidroxisuccinimidilo.
6. El método de la reivindicación 1, donde dicho
péptido es: somatostatina o un análogo de la misma; o un péptido
intestinal vasoactivo.
7. El método de la reivindicación 1, donde dicho
radionúclido es Tc-99m; Re-186; o
Re-188.
8. Un kit adecuado para formar un péptido
radiomarcado con tecnecio o renio a administrar a un paciente
humano, que comprende un recipiente estéril que contiene una
cantidad eficaz de un conjugado que contiene péptido-t-tiol
preparado de acuerdo con las etapas (a) y (b) de la reivindicación
1 y radiopertecnetato reducido o radioperrenato reducido
respectivamente a añadir en una etapa posterior.
9. Un kit adecuado para formar un péptido
radiomarcado con tecnecio o renio a administrar a un paciente
humano, que comprende un recipiente estéril que contiene (i) una
cantidad eficaz de un conjugado que contiene péptido-t-tiol
preparado de acuerdo con las etapas (a)-(c) de la reivindicación 1,
y (ii) una cantidad suficiente para reducir de una forma
sustancialmente completa el radiopertecnetato o radioperrenato
añadidos respectivamente, de una sal estannosa, siendo dicho
radiopertecnetato o radioperrenato respectivamente para añadirse en
una etapa posterior.
10. El kit de la reivindicación 8 o la
reivindicación 9, donde el contenido de dicho recipiente estéril
está liofilizado.
11. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, donde dicho péptido es somatostatina o un
análogo de la misma o el péptido intestinal vasoactivo.
12. Somatostatina o un análogo de la misma
marcado con Tc-99m, o péptido intestinal vasoactivo
marcado con Tc-99m, producidos por el método de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la detección o
en la formación de imágenes de tumores.
\newpage
13. Somatostatina o un análogo de la misma
marcado con Re-186 o Re-188, o
péptido intestinal vasoactivo marcado con Re-186 o
Re-188, producidos por el método de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en una terapia tumoral.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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