ES2206504T3 - Tiolacion de proteinas para inmunodeteccion y radioinmunoterapia basadas en radionuclidos. - Google Patents

Abstract

METODO PARA RADIOETIQUETAR UNA PROTEINA CON UN RADIONUCLIDO QUE INCLUYE LA PUESTA EN CONTACTO DE LA PROTEINA CON EL AGENTE QUELANTE BIFUNCIONAL QUE CONTIENE DIOL TERCIARIO PROTEGIDO Y QUE ES CAPAZ DE REACCIONAR CON LA PROTEINA EN UN EXTREMO DEL AGENTE Y ES CAPAZ DE COMPLEMENTARSE CON UN RADIONUCLIDO EN EL OTRO EXTREMO, PARA FORMAR UN CONJUGADO QUE CONTIENE PROTEINA-ACETIL-TDIOL. EL CONJUGADO QUE CONTIENE PROTEINA-ACETIL-T-DIOL ENTONCES SE DESPROTEGE Y SE MEZCLA CON UN AGENTE REDUCTOR DEL RADIONUCLIDO, ANDANTES EL RADIONUCLIDO EN UN PASO SIGUIENTE, PARA FORMAR UNA MEZCLA DEL AGENTE REDUCTOR Y EL CONJUGADO DE PROTEINAT-DIOL. ESTA MEZCLA REACCIONA CON UN RADIONUCLIDO QUE A SU VEZ REACCIONA CON LOS GRUPOS SULFIDRIL RESTANTES PRESENTES EN EL CONJUGADO QUE CONTIENE PROTEINA-T-DIOL. TAMBIEN SE MUESTRAN METODOS DE RADIOINMUNOTERAPIA Y EQUIPOS DE DIAGNOSTICO ADECUADOS PARA FORMAR UNA COMPOSICION PARA SER ADMINISTRADA A UN PACIENTE HUMANO.

Description

Tiolación de proteínas para inmunodetección y radioinmunoterapia basadas en radionúclidos

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos de un vial y estuches para radio marcar una proteína con un ion radiometálico de un radionúclido, que se une estrechamente a grupos sulfhidrilo, por la generación de grupos sulfhidrilo en la proteína usando un agente quelante que contiene un tiol terciario. El uso de un agente quelante que contiene un tiol terciario proporciona una proteína que contiene un derivado con t-tiol que puede desprotegerse para generar grupos sulfhidrilo libres que después se marcan con un radionúclido.

2. Descripción de la técnica relacionada

Se sabe que ciertos radiometales se unen estrechamente a ligandos de azufre, incluyendo, por ejemplo, Tc-99m de pertecnetato reducido, iones Re-186 y Re-188, iones Cu-67, iones Hg-197 e iones Bi-212. Algunos de estos radiometales se han unido a proteínas, especialmente a anticuerpos o a fragmentos de anticuerpo. El tecnecio-99m es un radionúclido ideal para la formación de imágenes escintigráficas debido a sus propiedades nucleares. El tecnecio-99m tiene un energía de un solo fotón de 140 KeV, una vida media de aproximadamente 6 horas y se puede obtener fácilmente en un generador de ^{99}Mo-^{99m}Tc.

El elemento por debajo del tecnecio en la tabla periódica, el renio, tiene propiedades químicas similares y puede marcar proteínas usando técnicas similares. Existen 34 isótopos de renio y dos de ellos en particular, el renio-186 (t_{1/2} 90 horas, gamma 137 KeV, beta 1,07, 0,93 MeV) y el renio-188 (t_{1/2} 17 horas, gamma 155 KeV, beta 2,12 MeV) son los candidatos principales para radioinmunoterapia usando estrategias de anticuerpos monoclonales.

Normalmente se usan dos métodos para marcar proteínas tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con radiometales. La primera estrategia es el método de marcaje directo en el que el radiometal se une directamente a la molécula de proteína. El marcaje directo implica reducir la proteína para generar grupos sulfhidrilo libres y, después, unir directamente un radionúclido reducido a los grupos sulfhidrilo libres. El marcaje directo de proteínas se ha logrado usando un protocolo de "preestañado", que requiere condiciones fuertes y largos tiempos de "preestañado", pero no se consiguió una incorporación del 100% de radiomarcador; Crockford et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.323.546 (véase también la Patente de Estados Unidos Nº 4.424.200). En este proceso, la presencia de cantidades extremadamente grandes de ion estannoso durante largos períodos comprometía la inmunorreactividad del anticuerpo. Generalmente, el proceso también necesitaba una columna de purificación después del marcaje. Otros métodos de marcaje directo han requerido viales separados, uno para el anticuerpo y otro para el ion estannoso complejado con un transquelante tal como un fosfato y/o fosfonato.

Otro problema asociado con el método de marcaje directo es que se ha publicado que los anticuerpos marcados directamente con ^{99m}Tc y/o renio son inestables in vivo, es decir, una proporción significativa del radionúclido se disocia del anticuerpo marcado bastante rápido tras la inyección del anticuerpo marcado en la corriente sanguínea. Cuando un anticuerpo marcado se usa para la formación de imágenes externas, esta inestabilidad conduce a la acumulación de radiactividad en localizaciones distintas de aquellas en las que se localiza el anticuerpo radiomarcado. Esto reduce la resolución del método atenuando la radiactividad localizada y aumentando la actividad de fondo debido a la distribución no específica del radioisótopo. Rhodes et al., TUMOR IMAGING, Capítulo 12, pag. 111-24 (Mason Publ., USA, 1982), describen que podrían purificarse anticuerpos inestables marcados directamente con ^{99m}Tc usando un método cromatográfico de exclusión elaborado que también complica el método de radiomarcaje directo de proteínas. Por último, la presencia de tecnecio residual es difícil de eliminar, así como los coloides que puede formar, y ambos tienden a contribuir a una radiación basal no específica indeseable.

El segundo método de radiomarcaje de proteínas es el método indirecto en el que un agente complejante se acopla a la proteína y el radiometal se une a la proteína a través de dicho agente complejante. El agente complejante típicamente contiene en un extremo grupos sulfhidrilo libres o protegidos que son capaces de formar complejos con el radionúclido reducido, y en el otro extremo grupos capaces de reaccionar con la proteína. Se conocen métodos de marcaje indirecto usando grupos quelantes conjugados tales como el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) (Khaw et al., J. Nucl Med., 23:1011-19 (1982)) o una diversidad de quelantes de azufre/nitrógeno (S_{2}N_{2}) tales como bis-tiosemicarbazonas y similares. Khaw et al., Science, 209:295-97 (1980) describen anticuerpos contra la miosina cardiaca marcados con indio-111 a través de DTPA y el uso de anticuerpos marcados para formar imágenes de infartos de miocardio. Véase también, Krejcarek et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 581-85 (1977); Childs, R.L. y Hnatowich, D.J., J. Nucl. Med. 26:293 (1985). En una estrategia mas reciente, Fritzberg et al., J. Nucl. Med. 27:957 (1986); Baidoo et al., Cancer Research (Suppl.), 50:799s-803s, (1990) describen el uso de un diamidoditiol particular y grupos diaminoditiol como agentes quelantes.

Estos agentes quelantes incluyen grupos tiol libres que pueden servir para reducir puentes disulfuro en la proteína que se va a marcar. De esta manera, de acuerdo con los métodos descritos en los documentos mencionados anteriormente, el marcaje puede producirse directamente en los enlaces disulfuro reducidos de la proteína o en los grupos sulfhidrilo libres de los agentes quelantes. Estos métodos típicamente también incluyen el uso de un transquelante tal como glucoheptonato para mantener el agente reductor en solución. Por lo tanto, los métodos descritos en Fritzberg et al. y en Baidoo et al., no son prácticos ni fáciles de usar, y pueden no marcar específicamente el agente quelante en los grupos sulfhidrilo libres colgantes del agente quelante.

Muchas de las técnicas convencionales de marcaje indirecto basadas en quelatos mencionadas anteriormente a menudo implican síntesis elaboradas de agentes quelantes y, frecuentemente, la necesidad de un procedimiento de "premarcaje" para conseguir el radiomarcaje del anticuerpo. Estas etapas del procesamiento ponen en peligro ciertas cualidades tales como la facilidad de uso y la practicabilidad que típicamente busca la industria de diagnóstico. Otros métodos de marcaje indirecto implican la tiolación de proteínas; Wong, S.S., en CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, pág. 17-23 (1991). Los métodos que usan la apertura del anillo de iminotiolano, tales como los descritos en McCall, M.J., Diril H., y Meares, C.F., Bioconjugate Chem., 1:222-26 (1990) y Goff, D.A. y Caroll, S.F., Bioconjugate Chem., 1:381-86 (1990), tienen el inconveniente de generar continuamente tioles, que dan como resultado la formación de agregados, siendo necesaria de ese modo la derivación simultánea de los tioles generados. Es de esperar que el uso de N-acetilhomocisteína tiolactona también cause problemas similares. A menudo se emplea anhídrido S-acetil-mercaptosuccínico como agente de tiolación, en una reacción con restos de lisina de las proteínas, convirtiéndose el tiol acetato en tiol en una etapa posterior. Sin embargo, el uso de este reactivo ocasiona una alteración de la relación de carga total de la proteína tiolada, lo cual tiene implicaciones para la conformación y farmacocinética del anticuerpo, Wong et al., supra. Otros reactivos, tales como (3-acetiltio propionil)-tiazolidina-2-tiona, generarán, después de la desprotección, un grupo mercapto que se une a un grupo metileno sin substituir.

Dean, Patente de Estados Unidos Nº 5.180.816, describe un método de radio marcaje de un anticuerpo con tecnecio en el que se usa un agente quelante que contiene un grupo tiol primario para unir los grupos sulfhidrilo libres del anticuerpo. Por lo tanto, primero se reduce el anticuerpo y se escinde en fragmentos para generar grupos sulfhidrilo libres, o como alternativa, la proteína se tiola con, por ejemplo, 2-iminotiolano, para generar grupos sulfhidrilo libres. Entonces se usa un agente quelante que contiene un grupo tiol protegido en un extremo para unir los grupos sulfhidrilo libres del anticuerpo presentes en el otro extremo, y posteriormente se desprotege y se pone en contacto con tecnecio para efectuar el radiomarcaje. El proceso de Dean implica una escisión desventajosa del anticuerpo que puede tener como resultado una fragmentación excesiva o destrucción del sitio de unión a antígenos del anticuerpo.

Greenfield et al., Bioconjugate Chemistry, vol. 1, nº 6, 1990, 400-410 describen un agente de reticulación que tiene un resto de N-[(3-acetiltio) -3-metilbutiril]-\beta-alanina. Se dice que el agente de unión es útil para generar disulfuro con una mayor resistencia a la reducción.

El documento US 5.095.111 describe un agente quelante de metales útil para modificar una proteína que comprende dos grupos tiol terciario y dos grupos amino.

El marcaje indirecto de una proteína sin la generación de grupos sulfhidrilo libres, es decir, por unión de los agentes quelantes a, por ejemplo, funcionalidades amino presentes en la proteína, no es posible con los agentes quelantes que contienen tiol primario de Dean, aunque Dean menciona que puede usarse un éster de N-hidroxisuccinimida para unir el agente quelante a las funciones amina de la proteína. La razón de esto es que los grupos amino de la proteína no sólo reaccionan con los ésteres carboxílicos de N- hidroxisuccinimida, sino que también escinden el grupo tiol primario protegido del extremo opuesto del agente quelante. Esta escisión ocasiona una desprotección prematura y oxidación de los grupos tiol libres generados e impide un marcaje eficaz y cuantitativo del anticuerpo.

Otros problemas asociados con el uso de agentes quelantes es que no es posible el marcaje en un solo recipiente cuando el conjugado de proteína-agente quelante entra en contacto con el estaño antes de la reacción con el radionúclido. La razón de esto es que la presencia del estaño reduce los enlaces disulfuro de la proteína, destruyendo de esta manera la especificidad del radio marcador por el quelante y destruyendo posiblemente la eficacia de la proteína. Además, muchos agentes quelantes, cuando se usan en inmunoterapia usando renio como radionúclido, a menudo se acumulan en cantidades tóxicas en el riñón. Para formar imágenes, muchas proteínas radiomarcadas, por ejemplo, la IgG entera radiomarcada con tecnecio, tienden a eliminarse y a acumularse en el hígado, afectando de esta modo adversamente a la eficiencia de la formación de imágenes, ya que muchos tumores pueden haberse extendido por metástasis a lo largo del cuerpo. Además, la relación tumor/no tumor para muchas proteínas radio marcadas convencionales tiende a ser demasiado baja, afectando de esta manera adversamente a la eficacia de la imagen.

De esta manera, existe la necesidad de desarrollar un método para marcar una proteína usando un agente quelante que sea capaz de formar un complejo con un sitio de unión no antigénico de una proteína que no se haya reducido o tiolado, y que sea capaz de formar un complejo con un radionúclido de forma que la proteína radiomarcada no se escinda adicionalmente cuando entre en contacto con estaño y posteriormente se congele o liofilice. También existe la necesidad de desarrollar un método para marcar una proteína mediante el uso de un agente quelante bifuncional que contenga grupos tiol protegidos colgantes, en el que los grupos reactivos de la proteína no escindan prematuramente los grupos tiol protegidos del agente quelante bifuncional. También existe la necesidad de desarrollar un método y un estuche que sea fácil de usar y no implique procedimientos de síntesis complicados ni recipientes múltiples para la proteína y el agente reductor, y que no implique el uso de un transquelante. También existe la necesidad de desarrollar un método para radiomarcar una proteína para uso en la formación de radioinmunoimágenes o en radioinmunoterapia, en el que la proteína radiomarcada tenga una buena captación por el tumor, una baja captación por el riñón, no se elimine completamente en el hígado, se extienda ampliamente por todo el cuerpo y proporcione una buena relación tumor/no tumor para propósitos de formación de imágenes. También existe la necesidad de desarrollar un método de radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal F(ab')_{2} que posteriormente no se escinda para dar un Fab' aunque esté presente estaño en el estuche de marcaje de un solo recipiente.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método y un estuche útiles para el radiomarcaje indirecto de una proteína con un radionúclido usando un agente quelante que sea fácil de sintetizar y un método que no implique procedimientos de reducción complicados, incluyendo el uso de un exceso de agente reductor. También es un objeto de la presente invención proporcionar un método de un vial y un estuche para el radiomarcaje indirecto de una proteína, que pueda usarse por un médico o por un técnico antes del uso de la proteína marcada, y que no ocasione la escisión prematura de la proteína durante la incubación con el agente reductor para el radionúclido. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método y un estuche para el radio marcaje indirecto de una proteína, en el que el radionúclido forme complejos con el agente quelante. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método y un estuche para el radiomarcaje indirecto de una proteína para uso en la formación de radioinmunoimágenes o en radioinmunoterapia, en el que la proteína radiomarcada tenga una buena captación por el tumor, una baja captación por el riñón, no se elimine completamente por el hígado, se extienda ampliamente por todo el cuerpo y proporcione una buena relación tumor/no tumor para formar imágenes.

De acuerdo con estos y otros objetos de la presente invención, se proporciona un método de radiomarcaje de una proteína con tecnecio o renio, que comprende poner en contacto una mezcla de un conjugado de dicha proteína y un agente reductor para pertecnetato o radioperrenato, donde dicho conjugado de proteína comprende un agente quelante unido covalentemente a dicha proteína, y donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato.

De acuerdo con otro objeto de la presente invención, se proporciona un método de radiomarcaje de una proteína con tecnecio, que comprende poner en contacto un conjugado de dicha proteína con radiopertecnetato reducido, donde dicho conjugado de proteína comprende un agente quelante unido covalentemente a dicha proteína, y donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un estuche de diagnóstico adecuado para formar una composición a administrar a un paciente humano, que comprende un envase estéril que contiene (i) un conjugado de proteína que comprende un agente quelante unido covalentemente a una proteína, donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato; y (ii) un agente reductor para pertecnetato o perrenato que se añadirá en una etapa posterior.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado de proteína marcado con Re-186 o Re-188, donde dicho conjugado de proteína comprende un agente quelante unido covalentemente a una proteína que se une específicamente a un tumor o a una lesión infecciosa, donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato, para uso en un método de radioinmunoterapia por medio de la administración parenteral a un paciente que padece un tumor o una lesión infecciosa.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado de proteína marcado con un radioisótopo farmacéuticamente inerte de tecnecio o renio, donde dicho conjugado de proteína comprende un agente quelante unido covalentemente a una proteína que se une específicamente a un antígeno producido o asociado con un tumor, lesión infecciosa, infarto de miocardio, coágulo, placa aterosclerótica, u órgano o tejido normal, y donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato, para uso por inyección parenteral en un paciente humano y, después de un período de tiempo suficiente para que la proteína radiomarcada se localice y para que se elimine el efecto de fondo no deseado, la detección del sitio o sitios de acumulación de la proteína radiomarcada por una cámara de formación de imágenes externa.

También se describe un método para formar radioinmunoimágenes de un tumor, una lesión infecciosa, un infarto de miocardio, un coágulo, una placa aterosclerótica, o un órgano o tejido normal, donde una proteína, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno producido o asociado con el tumor, etc., y radiomarcados con un radioisótopo farmacéuticamente inerte capaz de permitir su detección externa, se inyecta por vía parenteral en un paciente humano y, después de un período de tiempo suficiente para que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo radiomarcado se localice y se elimine el efecto fondo no deseado, se detecta el sitio o sitios de acumulación de la proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radio marcados por una cámara de imágenes externa; será una mejora usar como proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcados, una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcados de acuerdo con el método de la presente invención. Cuando se usan las proteínas radiomarcadas en tales métodos de formación de radioinmunoimágenes, no se sufren los inconvenientes mencionados anteriormente con respecto a la eliminación en el hígado y la relación diana/no diana, etc.

También se describe un método de radioinmunoterapia que incluye las etapas de (a) poner en contacto una proteína que se une específicamente a un antígeno producido o asociado con un tumor o una lesión infecciosa, con un agente quelante bifuncional que contiene un tiol terciario capaz de reaccionar con la proteína por un extremo sin escindir los puentes disulfuro de la proteína, y que es capaz de formar complejos con un radionúclido por el otro extremo, para formar un conjugado que contiene proteína-acetil-t-tiol. Después, el conjugado que contiene proteína-acetil-t-tiol se desprotege y se mezcla con un agente reductor de un radionúclido reducible terapéuticamente eficaz, donde el radionúclido reducible se va a añadir en una etapa posterior, para formar una mezcla de agente reductor y conjugado que contiene proteína-t-tiol. Esta mezcla después se hace reaccionar con un radionúclido reducible terapéuticamente eficaz, con lo que el radionúclido reacciona con los grupos sulfhidrilo colgantes presentes en el conjugado que contiene proteína-t-tiol para producir una solución que contiene un conjugado que contiene proteína-t-tiol radiomarcada que a su vez se administra por vía parenteral a un paciente que padece un tumor o una lesión infecciosa. Dicha proteína radio marcada no tiene los inconvenientes discutidos anteriormente con respecto a la captación excesiva por el riñón y similares.

Descripción detallada

Los presentes inventores han descubierto que una proteína, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que tiene grupos sulfhidrilo colgantes, en virtud del uso de un agente quelante que contiene grupos tiol colgantes protegidos que posteriormente se desprotegen para generar grupos sulfhidrilo libres, puede unirse selectivamente a iones de radiometales para formar enlaces estrechos con los grupos sulfhidrilo. Estas proteínas radiomarcadas son muy eficaces cuando se usan en métodos de formación de radioinmunoimágenes y radioinmunoterapéuticos debido a su capacidad de unirse a tumores, de evitar una captación excesiva por el riñón, de evitar la eliminación excesiva en el hígado y de proporciona buenas relaciones tumor/no tumor. Además, el método de radio marcaje permite el marcaje en un solo recipiente de una proteína que no se ha reducido, es decir, F(ab')_{2}, con lo que la proteína se conjuga con un agente quelante y después entra en contacto con un agente reductor para el radionúclido de tal manera que el agente reductor no escinda la proteína, es decir, F(ab')_{2} para dar Fab'. Además, los presentes inventores han descubierto que una proteína puede marcarse de la forma anterior sin necesidad de reducir la proteína, y por tanto, sin correr el riesgo de escindir demasiados puentes disulfuro o de alterar la especificidad de unión de la proteína. Además, los presentes inventores han descubierto que el uso de un agente quelante que contiene tiol terciario permite la unión a una proteína sin generar grupos sulfhidrilo libres en la proteína o reducir la proteína, y sin escindir los grupos tiol protegidos del agente quelante, previniendo de esta manera la desprotección prematura y la pérdida oxidativa de los grupos tiol libres. Los reactivos y las condiciones del presente método se han simplificado en gran medida, y el método es particularmente adecuado para marcaje con tecnecio o renio utilizando un transquelante tal como glucoheptonato o usando estaño como agente reductor en un estuche de un solo vial.

A lo largo de esta descripción, el término "proteína" indica un polipéptido que tiene dos o más aminoácidos. De forma ventajosa, "proteína" indica un anticuerpo entero (es decir, IgG), y fragmentos de anticuerpo tales como F(ab')_{2}, Fab' o Fab. Estos anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo contiene sitios de marcaje estables y no estables para iones reducidos de tecnecio o renio. El "sitio no estable" (que puede ser uno o más sitios) tiene alta capacidad pero baja afinidad por el tecnecio reducido (en lo sucesivo, se entiende que se incluyen iones de renio cuando se mencionan los iones de tecnecio usados con más frecuencia, ya que las químicas del tecnecio y del renio son substancialmente iguales para fines de marcaje, aunque las constantes de unión pueden ser un tanto diferentes). Este sitio no estable responde de aproximadamente el 85% del marcaje directo total de los fragmentos F(ab')_{2} y del 76% del marcaje total de IgG con ^{99m}Tc reducido. El segundo sitio produce un marcaje estable y responde del 15% y 24% del marcaje total de F(ab')_{2} y de IgG con ^{99m}Tc, respectivamente.

Los presentes inventores, aunque no pretenden limitarse por ninguna teoría, creen que el marcaje indirecto de proteínas usando un agente quelante que contiene un tiol terciario protegido para generar un derivado de proteína que contiene acetil-t-tiol permite la unión a sitios de unión antigénicos no específicos en un anticuerpo sin la escisión prematura del tiol protegido en el otro extremo del agente quelante que contiene el tiol terciario y sin la escisión de los puentes disulfuro de la proteína. Además, los presentes inventores han descubierto que los puentes disulfuro de la proteína de los conjugados de proteína-agente quelante de la presente invención, cuando se mezclan con un agente reductor para un radionúclido en un estuche de un solo vial, no se escinden para producir fragmentos más pequeños que pueden no tener la especificidad de unión o antigenicidad requeridas, o para producir grupos sulfhidrilo colgantes en la proteína. Por lo tanto, el uso de los agentes quelantes que contienen t-tiol de la presente invención permite marcar específicamente en los grupos sulfhidrilo colgantes del agente quelante desprotegido y no en cualquier grupo sulfhidrilo libre presente en la proteína. Aunque no se pretende limitación por ninguna teoría, los presentes inventores creen que el agente quelante que contiene tiol terciario protegido tiene una mayor resistencia a las reacciones de escisión de acilo, impidiéndose de esta manera que las funcionalidades reactivas de la proteína, es decir, las funcionalidades amino desprotejan prematuramente los grupos tiol, y el uso de los agentes quelantes de la invención previene la reducción accidental de los puentes disulfuro de la proteína. El presente método además evita substancialmente la formación indeseable de coloides durante el curso del proceso de marcaje y, en proporciones apropiadas de agente reductor y exclusión de oxígeno, el presente método previene la acumulación de pertecnetato residual como contaminante.

Se entenderá que las proteínas, incluyendo los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, a radiomarcar pueden ser anticuerpos que unen antígenos incluyendo, pero sin limitación, antígenos producidos o asociados con tumores, lesiones infecciosas, microorganismos, parásitos, infartos de miocardio, coágulos, placas ateroscleróticas, u órganos o tejidos normales. A lo largo de esta descripción, las expresiones "anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo" generalmente indican inmunoglobulinas que se unen específicamente a antígenos formando complejos inmunes. Estas expresiones incluyen las IgG, IgA, IgE e IgM convencionales, y similares, productos de digestión enzimática convencionales tales como fragmentos F(ab')_{2} obtenidos por digestión con pepsina de inmunoglobulinas intactas, fragmentos Fab obtenidos por digestión con papaína de inmunoglobulinas intactas, Fab' monovalentes convencionales y fragmentos de cadena ligera-pesada obtenidos por escisión de puentes disulfuro de fragmentos F(ab')_{2} y de anticuerpos intactos, respectivamente, así como productos que tiene propiedades substancialmente similares a las de dichas inmunoglobulinas y fragmentos. Tales proteínas similares incluyen subfragmentos de anticuerpo obtenidos por la digestión adicional o por manipulación de fragmentos mayores, anticuerpos y/o fragmentos obtenidos por ingeniería genética, y proteínas sintéticas que tienen un dominio de reconocimiento de antígenos que se unen específicamente a un antígeno de forma substancialmente análoga a una inmunoglobulina "clásica". Se entenderá que los fragmentos de las proteínas no necesitan y, preferiblemente, no deben contener grupos sulfhidrilo libres.

De forma ventajosa, el presente método marca proteínas tales como anticuerpos enteros (IgG) o fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2}, Fab' o Fab y, de forma más ventajosa, anticuerpos monoclonales F(ab')_{2}. Los métodos típicos de marcaje directo o indirecto de F(ab')_{2} normalmente implicaban la reducción de un anticuerpo entero a F(ab')_{2.}Sin embargo, se ha descubierto que los intentos de conseguir una reducción parcial de los F(ab')_{2} obtenidos a partir de la escisión enzimática de anticuerpos intactos, a menudo producen una escisión adicional considerable para dar Fab', y que incluso los intentos posteriores de reducir el pertecnetato o perrenato con el ion estannoso, en presencia de F(ab')_{2}, van acompañados de la reducción de los puentes disulfuro y de la escisión adicional para dar Fab', haciendo que se pierda parte del marcador en el fragmento monovalente, y posiblemente ocasionando una fragmentación tan excesiva de F(ab')_{2} que destruye su eficacia. Además, el uso de agentes quelantes que incluyen grupos sulfhidrilo libres ha conducido a la reducción de los puentes disulfuro y a una escisión involuntaria que ha ocasionado la pérdida de parte del marcador en el anticuerpo o en el fragmento de anticuerpo en lugar de reaccionar con los grupos sulfhidrilo libres colgantes del agente quelante. Para mejorar la producción de conjugados de anticuerpo F(ab')_{2} con el agente quelante bifuncional, substancialmente sin productos de escisión Fab' adicionales, de forma sorprendente e inesperada se ha descubierto que la reacción de F(ab')_{2} y un agente quelante que contiene tiol terciario protegido produce un marcaje muy eficaz del F(ab')_{2}.

El método de la presente invención incluye poner en contacto la proteína con un agente quelante que contiene tiol terciario protegido para producir un conjugado de proteína-agente quelante que contenga al menos un grupo tiol terciario protegido. El agente quelante que contiene tiol terciario se une covalentemente a la proteína y sirve para acoplar la proteína y el radiometal después de la desprotección. Los especialistas en la técnica conocen bien métodos para efectuar tal unión covalente. Por ejemplo, puede usarse un éster activo (por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimida) o un derivado de isotiocianato del agente de acoplamiento para unir el agente con funciones amino de la proteína; puede usarse un derivado de 2-yodoacetilo o maleimido del agente de acoplamiento para unir el agente a los grupos sulfhidrilo de la proteína; puede usarse un derivado de hidrazida del agente para unir el agente a grupos carbohidrato oxidados de la proteína; o puede usarse un reactivo de carbodiimida tal como 1-etil-3-(3-diaminopropil)cabodiimida para unir un grupo amino del agente quelante a un grupo carboxilo de la proteína. Los anticuerpos enteros (IgG) y los péptidos tienen de forma natural grupos amina y carboxilo. De forma ventajosa, el agente quelante que contiene tiol terciario protegido de la presente invención forma un complejo con una funcionalidad amina del anticuerpo, cuando el anticuerpo no se ha reducido o tiolado para generar grupos sulfhidrilo libres. De forma más ventajosa, el agente quelante que contiene tiol terciario protegido de la presente invención forma un complejo con una funcionalidad amina de la proteína y la funcionalidad amina no reacciona con el grupo tiol protegido del agente quelante ocasionando su desprotección prematura a sulfhidrilo.

Los agentes quelantes que contienen tiol terciario protegido útiles en la presente invención son cualquier agente quelante que contenga una porción electrófila o nucleófila capaz de formar un enlace estable con una funcionalidad de la proteína, como se ha descrito anteriormente, y una porción complejante que contenga al menos un grupo tiol terciario protegido, siendo capaz dicha porción de complejar un radionúclido deseado tras la desprotección, y que no reaccione con la funcionalidad de la proteína para desproteger de forma prematura el grupo tiol. De forma ventajosa, el agente quelante que contiene tiol terciario forma un complejo de anillo de 5 o 6 miembros con el radionúclido deseado. De forma más ventajosa, el agente quelante que contiene tiol terciario de la presente invención forma un derivado que contiene acetil-t-tiol que puede desprotegerse y marcarse con tecnecio. Entre tales agentes quelantes se incluyen, pero sin limitación, el (N-hidroxisuccinimidil)-N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato y los productos de reacción de este compuesto con diglicina o triglicina.

Puesto que cualquier grupo sulfhidrilo colgante presente en el agente quelante puede ser incompatible con un electrófilo selectivo para sulfhidrilo que puede formar parte del mismo agente de acoplamiento, el grupo sulfhidrilo puede estar convenientemente protegido de la reacción con el resto electrófilo durante la unión del agente quelante. Después, el tiol protegido puede desprotegerse usando mecanismos bien conocidos por los especialistas en la técnica. La fase "tiol protegido", como se usa en la presente invención, indica un resto que contiene tiol donde el grupo tiol se modifica de forma reversible de manera que dicho tiol se vuelve no reactivo. Tras la unión al substrato proteico, el resto quelante puede desprotegerse desenmascarando la funcionalidad quelante para la unión al radionúclido. En particular, el tiol protegido se desprotege para generar grupos sulfhidrilo libres colgantes capaces de formar complejos con el radionúclido.

Los grupos adecuados para proteger el tiol de la reacción son grupos orgánicos e inorgánicos que pueden eliminarse fácilmente en condiciones suaves para regenerar el grupo sulfhidrilo libre en presencia de la proteína sin alterar substancialmente la actividad de la proteína. De forma ventajosa, el grupo protector de tiol es un tiol éster. Los especialistas en la técnica están familiarizados con los procedimientos de protección y desprotección de grupos tiol, y hacerlo dentro de los límites de la presente invención está dentro del alcance de un especialista habitual en la técnica.

El método de la presente invención incluye poner en contacto un conjugado de proteína-agente quelante desprotegido con un agente reductor para reducir un radionúclido, donde el radionúclido se añade posteriormente. El conjugado de proteína-agente quelante desprotegido y el agente reductor típicamente se congelan o liofilizan para prevenir la escisión de los puentes disulfuro de la proteína debido a la presencia del agente reductor. La presente invención también abarca un estuche que incluye un conjugado de proteína-agente quelante desprotegido y un agente reductor para reducir un radionúclido, donde el radionúclido se añade posteriormente. Tras la adición del agente reductor, la mezcla puede usarse para llevar a cabo el método de radiomarcaje de la presente invención. Se puede añadir un radionúclido al estuche para proporcionar una proteína radiomarcada. Además, si se usa un conjugado de proteína-agente quelante protegido, puede añadirse un agente desprotector antes de la adición del radionúclido no pre-reducido. Los viales individuales o estuches de la presente invención están diseñados para contener la proteína, anticuerpo, fragmento de anticuerpo o similar, apropiado, complejado con el agente quelante que contiene tiol terciario, para cualquier procedimiento particular de inmunodiagnóstico o inmunoterapia.

De acuerdo con el presente método, los viales o estuches ventajosamente se sellan y disponen de un mecanismo para introducir o sacar reactivos en condiciones estériles o semiestériles. Preferiblemente, en el presente método se usa un vial que contiene un orificio para la inyección de una jeringa. Típicamente, los reactivos de los viales o estuches se suministran en forma acuosa, congelados o liofilizados. En una realización, los reactivos pueden almacenarse a baja temperatura, por ejemplo, en el refrigerador, durante varios días a varias semanas, preferiblemente a un pH de aproximadamente 3, 5-5,5, más preferiblemente a un pH de 4,5 a 5,0, de forma ventajosa en una atmósfera de gas inerte, por ejemplo, nitrógeno o argón.

También está dentro del alcance de la presente invención proporcionar los reactivos en forma liofilizada para facilitar el almacenamiento y la estabilización. Esto se efectúa de forma ventajosa a un pH de aproximadamente 5,5, a partir de una solución de un tampón volátil, por ejemplo acetato amónico, y preferiblemente también en presencia de un estabilizador para prevenir la agregación, por ejemplo, un azúcar tal como trehalosa o sacarosa. Tales condiciones de liofilización son convencionales y bien conocidas para el especialista habitual en la técnica. Los reactivos también pueden congelarse y después descongelarse antes de su uso, pero este procedimiento conlleva un mayor riesgo de reoxidación y agregación del conjugado de proteína-agente quelante.

Entonces, el procedimiento de marcaje de la presente invención puede llevarse a cabo simplemente añadiendo el radioisótopo, por ejemplo, en forma de pertecnetato sódico acuoso, al vial que contiene el agente reductor y el conjugado de proteína-agente quelante desprotegido. Además, si se usa un conjugado de proteína-agente quelante protegido, puede añadirse un agente desprotector antes o durante la adición del radioisótopo para conseguir una incorporación substancialmente del 100%. Después se mezcla el contenido del vial y se incuba durante un tiempo suficiente para conseguir el marcaje de la proteína. La duración y las condiciones de incubación no son cruciales, pero típicamente la incubación se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para obtener una incorporación substancialmente del 100% de ^{99m}Tc en la proteína. "Una incorporación substancialmente del 100%" en relación con el marcaje con tecnecio, indica una incorporación mayor del 98%, de forma ventajosa mayor del 99% y de forma más ventajosa una incorporación del 100%. Normalmente, la incubación se realiza durante un período de tiempo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60 minutos, y de forma ventajosa durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos. Después, la proteína radiomarcada puede sacarse del vial y usarse inmediatamente, ya que no se requiere separación o purificación

De forma ventajosa, el agente reductor del radionúclido es estaño(II), preferiblemente en la forma de iones estannosos. Típicamente, se añade cloruro estannoso a la mezcla que contiene el conjugado de proteína-agente quelante. Los especialistas en la técnica entenderán que los iones estannosos puede generarse in situ a partir de metal de estaño, por ejemplo, papel de aluminio, gránulos, polvo, limaduras y similares, por contacto con ácido acuoso, por ejemplo HCl, y normalmente se añade en forma de SnCl_{2}, de forma ventajosa en una solución que también es aproximadamente 0,1 M en HCl.

En general, es ventajoso trabajar con una concentración de proteína de aproximadamente 0,01 a 10 mg por ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 5 mg/ml, de solución, generalmente en solución salina, preferiblemente tamponada a un pH débilmente ácido de aproximadamente 4,0 a 4,5. En tal caso, la cantidad de ion estannoso necesaria para reducir una actividad normal de formación de imágenes de pertecnetato es de aproximadamente 0,1 a 50 \mug/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 25 \mug/ml, en proporción con la cantidad de proteína. Cuando se marca la cantidad de proteína anterior, la cantidad de pertecnetato generalmente es de aproximadamente 2 a 50 mCi/mg de proteína, y el tiempo de reacción es de aproximadamente 0,1 a 30 minutos. Con las concentraciones preferidas de proteína e iones estannosos, la cantidad de pertecnetato preferiblemente es de aproximadamente 5 a 30 mCi/mg, y el tiempo de reacción preferiblemente es de aproximadamente 1 a 20 minutos.

Generalmente, el pertecnetato se obtiene en un generador disponible en el mercado, la mayoría de las veces en forma de NaTcO_{4}, normalmente en solución salina. Se pueden usar otras formas de pertecnetato, con la modificación apropiada del procedimiento, como sugeriría el proveedor de una nueva forma de generador o como sería evidente para el especialista habitual en la técnica. El pertecnetato generalmente se usa a una actividad de aproximadamente 0,2 a 10 mCi/ml en solución salina, por ejemplo, en solución salina al 0,9% ("fisiológica"), tamponada a un pH de aproximadamente 3 a 7, preferiblemente de 3,5-5,5, más preferiblemente de aproximadamente 4,5-5,0. Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, acetato, tartrato, citrato, fosfato y similares. La reducción de pertecnetato normalmente se realiza en una atmósfera de gas inerte, por ejemplo, nitrógeno, argón o similares. La temperatura de reacción generalmente se mantiene a aproximadamente la temperatura ambiente, por ejemplo, de 18º a 25ºC.

A lo largo de esta descripción, las frases "pertecnetato reducido" o "perrenato reducido" indican la especie de ion tecnecio o renio formada por la reducción de pertecnetato y perrenato con el ion estannoso y quelada por el o los grupos tiol. Generalmente se cree que el pertecnetato reducido está en forma de Tc(III) y/o Tc(IV) y/o Tc(V) en tales quelatos, y que el perrenato reducido está en forma de Re(III) y/o Re(IV) y/o Re(V), pero dentro del alcance de la presente invención se incluyen estados de oxidación mayores o menores y/o estados de oxidación múltiple.

El renio se encuentra justo debajo del tecnecio en la tabla periódica, tiene la misma configuración electrónica de la capa exterior y, por lo tanto, es de esperar que tenga propiedades químicas muy similares al tecnecio, especialmente su comportamiento con compuestos análogos. De hecho, los compuestos de renio se comportan de una forma cualitativamente similar a los compuestos de tecnecio por lo que respecta a la reducción y a la quelación, pero sus velocidades de reacción son bastante diferentes y son distintos en ciertos aspectos importantes. A pesar de estas diferencias, el especialista en la técnica puede modificar la presente invención basándose en la descripción del marcaje de tecnecio para conseguir un marcaje eficaz de renio (véase, por ejemplo, Griffiths, Patente de Estados Unidos Nº 5.128.119, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente invención como referencia).

El radioisótopo Re-186 es atractivo para terapia y también puede usarse para formar imágenes. Tiene una vida media de aproximadamente 3,7 días, una alta emisión beta LET (1,07 MeV) y una energía de emisión gamma conveniente (0,137 MeV). Por analogía con el tecnecio, el renio se produce a partir de perrenato, y los iones de renio reducidos pueden unirse de forma no específica a proteínas. Por consiguiente, sería ventajoso un método de marcaje de proteínas con Re-186, donde el perrenato reducido se uniera a los grupos sulfhidrilo de un complejo de proteína-agente quelante. El Re-188 es un emisor gamma y beta producido por un generador con una vida media de aproximadamente 17 horas y es adecuado para formar imágenes y para terapia. Actualmente está en marcha el desarrollo de generadores comerciales de renio-188; y en un escenario preferido, se añade directamente renio-188 sin vehículo a un vial que contiene iones estannosos y un complejo de proteína-agente quelante, para producir una proteína radiomarcada con renio que estará lista para el uso en menos de aproximadamente dos horas.

En general, la concentración de proteína no complejada, por ejemplo, anticuerpo, los tiempos de reacción, las actividades del perrenato y otras condiciones serán substancialmente las mismas para el marcaje con Re-186 o Re-188, con la excepción de que se usa una mayor cantidad de ion estannoso. Cuando el radioisótopo en el radioperrenato es substancialmente Re-188 sin vehículo, la concentración de anticuerpo o de fragmento de anticuerpo en la solución es, de forma ventajosa, de aproximadamente 1 a 20 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 10 a 20 mg/ml y la cantidad de ion estannoso es de aproximadamente 500 a 10.000 \mug/ml, preferiblemente de aproximadamente 500 a 5.000 \mug/ml. Cuando el radioisótopo en el radioperrenato es Re-186 con vehículo añadido, para la misma concentración de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, la cantidad de ion estannoso es de aproximadamente 5-1.000 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 50-500 mg/ml.

Los iones de cobre también se quelan fuertemente por quelantes de azufre. El Cu-67 es otro radionúclido atractivo para la formación de imágenes y terapia. Tiene una vida media de aproximadamente 2,6 días, emisión beta (0,57 MeV) y emisión gamma (0,185 MeV), aunque la energía beta es relativamente baja. El Cu-67 es relativamente caro y actualmente no se puede adquirir fácilmente, aunque tales condiciones puede cambiar como demande el desarrollo. El Cu-67 tiene la ventaja de que si forma estrechos quelados con tioles, el marcaje es simple y rápido, y no requiere de agente reductor para el radiometal.

Otros radionúclidos con un comportamiento de quelación similar al cobre, por ejemplo mercurio, plata y plomo, también pueden unirse a los compuestos que contienen tiol de acuerdo con el método de la presente invención. El Hg-197 tiene una vida media de aproximadamente 1,5 días, y emite radiación gamma en un intervalo de energía de 78-268 KeV, y el Pb-203 es un fuerte emisor gamma a aproximadamente 275 MeV, con una vida media de aproximadamente 51 horas, lo que hace que el mercurio y el plomo sean adecuados para la escintigrafía gama. Ag-111 tiene una vida media de 7 días y emite radiación beta a aproximadamente 1,02 MeV, y el Bi-212 es un emisor alfa con una vida media de aproximadamente 1 hora y una energía de 6,09 MeV, lo que hace que tengan un interés considerablemente para terapia in vivo. El Bi-212 se produce in situ a partir de un precursor Pb-212 con emisión de radiación gamma de 239 KeV, con una vida media de aproximadamente 10,6 horas. De esta manera, los conjugados de anticuerpo-agente quelante que contiene tiol terciario para terapia con Bi-212 serán conjugados marcados con Pb-212, y en el presente documento se usa la notación abreviada plomo/bismuto o Pb/Bi para indicar esto. Se entenderá que la invención no se limita a los radionúclidos ejemplificados sino que, en general, se puede aplicar a iones que se unan estrechamente a grupos sulfhidrilo.

Las condiciones de marcaje mencionadas anteriormente típicamente tienen como resultado una incorporación de substancialmente el 100% o una incorporación substancialmente cuantitativa del marcador en el complejo de proteína-agente quelante. A lo largo de esta descripción, la frase "incorporación cuantitativa substancial", en relación con el marcaje con renio, indica una incorporación mayor que aproximadamente el 80%, de forma ventajosa una incorporación mayor que aproximadamente el 85% y de forma más ventajosa mayor que aproximadamente el 90%. Por ejemplo, ahora es posible marcar F(ab')_{2} de forma consistente, complejado con un agente quelante que contiene tiol terciario, con una cantidad de 5 a 200 micro gramos de Sn(II) por miligramo de F(ab')_{2}, con un rendimiento esencialmente cuantitativo. Además, la inmunorreactividad de esta proteína marcada apenas se reduce después de esta incubación del suero, lo que demuestra que los conjugados de proteína-agente quelante radiomarcados siguen siendo agentes de formación de imágenes completamente viales después de al menos 24 horas.

En las condiciones de reacción mencionadas anteriormente, para el marcaje con tecnecio, no se requiere transquelantes tales como fosfonato, tartrato, glucoheptonato u otro agente quelante de Sn(II) bien conocido, para mantener el estaño en solución, sin embargo, dichos transquelantes pueden usarse de acuerdo con la presente invención. Para uso en el presente método se prefiere usar compuestos de Sn(II) tales como cloruro estannoso e iones estannosos, aunque también son eficaces otras sales de Sn(II) fácilmente adquiribles y convencionales. Sólo hay tres ingredientes esenciales; el conjugado de proteína-agente quelante desprotegido, el ion estannoso acuoso y la solución de pertecnetato. En las condiciones de reacción descritas en la presente invención, se puede conseguir fácilmente una incorporación de Tc-99m en la proteína de substancialmente el 100%.

La proteína radiomarcada resultante es adecuada para su uso en la formación de imágenes escintigráficas de, por ejemplo, tumores, lesiones infecciosas, microorganismos, coágulos, infartos de miocardio, placas ateroscleróticas, u órganos y tejidos normales. Tales métodos de formación de imágenes son bien conocidos en la técnica. Las soluciones de proteínas radio marcadas preparadas como se ha indicado anteriormente están listas para la inyección inmediata, si se realizan en un vial sin pirógenos esterilizado de manera apropiada. Además, no es necesario bloquear los grupos sulfhidrilo libres después de la unión con el tecnecio para conseguir la estabilización.

El método de la presente invención es particularmente atractivo para el marcaje de anticuerpos enteros y fragmentos de anticuerpo, aunque también pueden marcarse proteínas tales como albúmina, fármacos, citoquinas, enzimas, hormonas, inmunomoduladores, proteínas receptoras y similares. Los anticuerpos contienen uno o más puentes disulfuro que unen las cadenas pesadas, así como puentes disulfuro que unen las cadenas ligeras y pesadas entre sí. Se conocen métodos que implican la escisión de estos puentes disulfuro típicamente dispuestos para escindir selectivamente sólo los puentes disulfuro que unen las cadenas pesadas y no los puentes disulfuro que unen las cadenas pesadas y ligeras entre sí. Desafortunadamente, algunas veces, si estos métodos no se realizan con precaución, pueden causar la escisión indeseable de los puentes disulfuro que unen las cadenas ligeras y pesadas entre sí, haciendo que el anticuerpo no sea útil. Además, el uso de agentes quelantes que tienen grupos tiol libres también puede ocasionar la escisión de puentes disulfuro de la proteína. El presente método evita específicamente tales escisiones indeseables por medio del uso del agente quelante que contiene tiol terciario protegido y por medio de la formación de complejos de este agente quelante con un grupo funcional del anticuerpo entero o del fragmento de anticuerpo, preferiblemente un grupo amina, dejando intactos de ese modo los puentes disulfuro.

El método de la presente invención también incluye el uso de un ligando de transferencia soluble en agua que forma complejos con el radionúclido reducido. En general, los ligandos de transferencia útiles en una realización alternativa de la presente invención son quelantes solubles en agua (o pueden hacerse solubles en agua) capaces de formar complejos con el tecnecio-99m, cualquiera de los radioisótopos de renio en estado reducido u otros radioisótopos conocidos, para formar un complejo de ion metálico estable/ligando. Adicionalmente, el complejo es capaz de intercambiar el radioisótopo con los grupos sulfhidrilo colgantes presentes en el conjugado de proteína-agente quelante, después de la desprotección del o los grupos tiol. Entre los ejemplos de ligandos de transferencia adecuados se incluyen glucoheptonato, tartrato, DTPA, EDTA, di, tri o polialquilfosfonatos, pirofosfato o glicina y sus derivados. Los especialistas en la técnica reconocen que, de acuerdo con la presente invención, es útil cualquier agente quelante capaz de formar complejos con el radionúclido reducido y posteriormente transferir el radionúclido reducido a grupos sulfhidrilo colgantes (véase, por ejemplo, Dean, Patente de Estados Unidos Nº 5.180.816 y/o Shochat et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.061.641, cuyas descripciones se incorporan en este documento en su totalidad como referencia).

La presente invención también incluye una realización alternativa en la que el radiometal unido al tiol está "protegido terminalmente" con uno o más ligandos exógenos (véase, Shochat et al., supra). Estos ligandos generalmente están diseñados para completar la esfera de coordinación del ion y para complementar el o los grupos sulfhidrilo ya proporcionados por el conjugado de proteína-agente quelante. Debe encontrarse un equilibrio entre los ligandos que unen el ion tan fuertemente que debilitan el o los puentes de azufre-metal del grupo o grupos reactivos de la proteína y reducen la estabilidad del marcador radiometálico en el suero, y los que proporcionan un poder quelante insuficiente, de forma que el ion se extraiga fácilmente de la proteína por otros ligandos exógenos en el suero o en médula ósea, o en órganos tales como el hígado, el bazo y los riñones donde se produce la eliminación. Los especialistas en la técnica pueden encontrar este equilibrio usando principios químicos conocidos, y pueden diseñar un ligando exógeno adecuado de protección terminal.

Un estuche para uso en el radiomarcaje de una proteína, por ejemplo, un fragmento Fab' o F(ab')_{2}, o un anticuerpo intacto, con Tc-99m, usando pertecnetato producido por generador, incluiría aproximadamente 0,01-10 mg por dosis unitaria de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno asociado con un tumor, una lesión infecciosa, un microorganismo, un infarto de miocardio, un coágulo, una placa aterosclerótica o un órgano o tejido normal, y que adicionalmente se conjuga con un agente quelante que contiene tiol terciario protegido para formar un derivado de anticuerpo-acetil-t-tiol que se desprotege para formar un derivado de anticuerpo-t-tiol. El estuche también incluiría aproximadamente 0,1-50 \mug por dosis unitaria de iones estannosos. Los constituyentes del estuche se mezclan justo antes del uso con aproximadamente 2-50 mCi de pertecnetato Tc-99m por mg de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. De forma ventajosa, el derivado de anticuerpo/fragmento de anticuerpo-t-tiol y el agente reductor Sn(II) se mezclan en una sola solución en un vial que puede almacenarse, por ejemplo, en un baño de nitrógeno líquido, o liofilizarse, preferiblemente con azúcar añadido como es bien conocido en la materia, antes de la adición del pertecnetato. Las variaciones, incluyendo la adición de reactivos convencionales de los estuches anteriores, están bien dentro de la experiencia rutinaria de los especialistas en la técnica.

Si se usa el derivado de anticuerpo/fragmento de anticuerpo-acetil-t-tiol, se puede desproteger antes de la mezcla con el agente reductor, o después de la mezcla. Sin embargo, el derivado de anticuerpo/fragmento de anticuerpo-acetil-t-tiol protegido debe desprotegerse antes de la reacción con el radionúclido. Aunque el agente de desprotección y el radionúclido pueden añadirse a la solución simultáneamente, la secuencia de la reacción generalmente es (i) desprotección del derivado de anticuerpo/fragmento de anticuerpo-acetil-t-tiol protegido y reducción del radionúclido, y (ii) marcaje del conjugado. De forma ventajosa, sin embargo, el derivado de anticuerpo/fragmento de anticuerpo-acetil-t-tiol se desprotege antes de mezclarse con el agente de reducción y de almacenarse en un estuche. Tras la lectura de la presente memoria descriptiva, los especialistas en la técnica son capaces de diseñar un método y un estuche usando derivado de anticuerpo/fragmento de anticuerpo acetil-t-tiol protegido o desprotegido.

Ventajosamente, las proteínas de los estuches de la presente invención están congeladas o liofilizadas, en recipientes estériles y en una atmósfera de gas inerte, de forma ventajosa se enfrían y se almacenan en un baño de nitrógeno líquido y se descongelan suavemente justo antes del uso. Los estuches convenientemente se complementan con viales estériles de tampones, solución salina, jeringas, filtros, columnas y auxiliares similares para facilitar la preparación de preparaciones inyectables listas para el uso por el médico o el técnico.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, el radiomarcaje de una proteína se efectúa por conjugación de (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato ("agente quelante") con anticuerpos (enteros o fragmentos) por reacción de la proteína con un exceso molar del agente quelante a pH 7,5. El número de tioles añadidos a los anticuerpos puede cambiarse variando el exceso molar del agente quelante empleado. Entonces, el conjugado de proteína-agente quelante preferiblemente se purifica por medios convencionales y el conjugado purificado puede desprotegerse en el tiol como y cuando sea necesario, y una vez desprotegido en el tiol, el producto resultante se formula inmediatamente con cloruro estannoso, y se almacena liofilizado como un estuche, en viales sellados, en una atmósfera de argón o al vacío. Entonces, este estuche está listo para mezclarse con el radionúclido.

Será evidente para un especialista habitual en la técnica que las proteínas radiomarcadas, especialmente anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, preparadas de acuerdo con el método de la invención, serán adecuadas, y de hecho particularmente convenientes y eficaces, en métodos de formación de imágenes escintigráficas no invasivos y para terapia de tumores y lesiones con radioanticuerpos. En particular, un método de formación de imágenes de un tumor, una lesión infecciosa, un infarto de miocardio, un coágulo, placa aterosclerótica, o un órgano o tejido normal, en el que una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno producido o asociado con el tumor, etc., y radiomarcado con un radioisótopo farmacéuticamente inerte capaz de ser detectado externamente, se inyecta por vía parenteral en un paciente humano y, después de un período de tiempo suficiente para que se localice la proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radio marcado y para que se elimine el efecto de fondo no deseado, se detectan el sitio o sitios de acumulación de la proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcado por una cámara de formación de imágenes externa, será una mejora usar como proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radio marcado una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcado de acuerdo con el método de la presente invención. Dicha proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcado no se eliminará significativamente en el hígado, proporcionará una buena relación entre tumor y no tumor y proporcionará una excelente dirección in vivo al tumor.

Además, en un método de terapia con radioanticuerpo de un paciente que sufre un tumor o una lesión infecciosa, en el que una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno producido o asociado con un tumor o una lesión infecciosa, y radiomarcado con un radioisótopo terapéuticamente eficaz, se inyecta por vía parenteral en un paciente humano que padece dicho tumor o lesión infecciosa, representará una mejora usar como proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcado una proteína. anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcado con renio obtenido de acuerdo con el método de la presente invención.

Sin elaboración adicional, se cree que un especialista en la técnica puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos, utilizar la presente invención en su mayor alcance. Por lo tanto, las siguientes realizaciones específicas preferidas deben considerarse solamente ilustrativas y no limitantes en absoluto del resto de la descripción. Además, todos los documentos mencionados previamente en esta descripción se incorporan en su totalidad como referencia en la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato

Se agitó una solución de 1,68 g (10 mmol) de clorhidrato de t-butil éster de glicina y 1,4 ml de trietilamina en 50 ml de cloruro de metileno, y el cloruro de trietilamonio precipitado se retiró por filtración. El filtrado se diluyó en aproximadamente 100 ml, se mezcló con 1,4 ml de trietilamina y se añadió gota a gota a una solución de cloruro de dimetilacroílo (10 mmol) en cloruro de metileno (10 ml), en una atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas, se lavó con agua (3 x 10 ml) y con salmuera (10 ml), y se secó (Na_{2}SO_{4} anhidro). La cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (malla 230-400) usando elución en gradiente con una mezcla de acetato de etilo/hexano produjo 1,0 g (50%) de t-butil éster de N-(3, 3-dimetilacroil)glicina en forma de un líquido amarillo.

El t-butil éster de N-(3,3-dimetilacroil)glicina después se disolvió en un exceso (5 ml) de ácido tiolacético y se calentó a reflujo (temperatura del baño 95ºC) durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió, se diluyó con éter dietílico, se lavó con ácido acético acuoso al 5%, agua y salmuera, y después se secó (Na_{2}SO_{4} anhidro). La evaporación de los solventes produjo un residuo que se agitó con 10 ml de ácido trifluoroacético (TFA) durante 2 horas. La evaporación del TFA dio un residuo que se purificó por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 230-400; gradiente de metanol/cloruro de metileno). El producto (un sólido ceroso amarillo), N-(3-acetilmercapto-3-metilbutiril)glicina se caracterizó por los espectros de IR y de RMN de protón. El espectro de RMN de protón (400 mHz; CDCl_{3}) mostró señales a 1,52 (s, 6H), 2,26 (s, 3H), 2,87 (s, 2H), 4,06 (d, 2H, J = 5,6) y 6,42 (s a., 1H).

El producto sólido ceroso amarillo obtenido anteriormente (363 mg) se disolvió en 10 ml de cloruro de metileno, y se trató con N-hidroxisuccinimida (180 mg; 1 equivalente) y diciclohexilcarbodiimida (322 mg; 1 equivalente). La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas en una atmósfera de argón. La diciclohexilurea precipitada se retiró por filtración y el filtrado se concentró. El residuo se cristalizó en isopropanol para obtener (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato en forma de un sólido blanquecino (rendimiento, 335 mg).

Ejemplo 2 Conjugación de (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato con F(ab)_{2} murino

Una solución de un anticuerpo monoclonal murino contra CEA preparado convencionalmente, F(ab)_{2} Immu-14 (885 \mul; 6,26 mg), preparado a partir de IgG purificada de líquido ascítico y digerida con papaína en ausencia de cisteína, en hepes 50 mM/solución salina 150 mM (pH 7,5), se mezcló por agitación vorticial con 25 \mul de DMF. A esta solución se le añadieron, con mezcla por agitación vorticial, 11 \mul de una solución en DMF de (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato (2,3 mg en 345 \mul de DMF; relación molar entre agente quelante y anticuerpo de 4). La solución transparente resultante se mantuvo a 4ºC durante 18 horas, o a temperatura ambiente durante 2 horas, para producir un conjugado de anticuerpo-agente quelante. El conjugado se purificó mediante cromatografía de exclusión molecular con centrifugación en sephadex 50/80 en fosfato sódico, 0,1 M y a pH 7. Este material se almacenó en un refrigerador y se desprotegieron los grupos tiol (ejemplo presentado a continuación) cómo y cuándo se requirió.

Ejemplo 3 Desprotección de tiol del conjugado

Se mezclaron cien micro litros (100 \mul) del conjugado, preparado como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2, con 20 \mul de hidroxilamina acuosa 1 M (pH 8) en un vial eppendorf de 0,6 ml, con agitación vorticial, y la mezcla se purgó con argón durante 1 minuto. Después de 10 minutos de reposo a temperatura ambiente, el producto se purificó en una columna de exclusión molecular (sephadex 50/80, acetato 50 mM/solución salina 150 mM, pH 5,3). Se analizó la concentración del eluato y el contenido de tiol libre. El ensayo de Ellman, usando 5,5-ditiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) 10 mM en PBS 0,1 M, pH 7, dio un valor de 1,1 grupos tiol/anticuerpo, que indica un promedio de 1,1 equivalentes de (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato por anticuerpo.

La reacción de conjugación se repitió usando seis equivalentes de (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato para obtener un conjugado con un promedio de 1,8 a 2,2 grupos tiol por anticuerpo.

Ejemplo 4 Formulación, liofilización y marcaje con tecnecio-99m del conjugado del ejemplo 3 con los grupos tiol desprotegidos

El conjugado F(ab')_{2} con los grupos tiol desprotegidos (200 \mug, 1,1 tiol por anticuerpo) recién preparado de acuerdo con el ejemplo 3, se mezcló con una solución de 25 \mug de estaño (II) en 150 \mul de tampón tartrato (9,2 mM)-acetato (50 mM)-solución salina (150 mM), y se liofilizó en un vial de vidrio de 2 ml. El liofilizado se almacenó al vacío en un vial sellado.

El radiomarcaje con Tc-99m se realizó mediante la adición de 1 ml de eluato de un generador de (Tc-99m)pertecnetato para conseguir una actividad específica de 5 mCi/mg. El marcaje se realizó sobre el conjugado de anticuerpo-agente quelante con y sin liofilización. El análisis por radio-HPLC, realizado aproximadamente 30 minutos después del marcaje, reveló una incorporación de radiactividad del 100% en el conjugado de anticuerpo-agente quelante. Un marcaje similar del liofilizado mostró una incorporación del 97%.

Ejemplo 5 Biodistribución de F(ab)_{2} Immu-14 marcado con Tc-99m en ratones desnudos portadores del xenoinjerto de tumor de colon humano LS174T

Se marcó el conjugado recién preparado de anticuerpo-agente quelante con los grupos tiol desprotegidos (200 \mul, 1,89 grupos tiol por anticuerpo) con 2 mCi de Tc-99m-glucoheptonato en un volumen total de 1 ml. El análisis por HPLC realizado sobre el material radiomarcado, así como sobre el complejo de anticuerpo-antígeno formado por una corta incubación del fragmento radio marcado con CEA, reveló que el producto era satisfactorio en términos de pureza radioquímica e inmunorreactividad.

El conjugado marcado se administró por vía intravenosa a diez ratones desnudos hembra portadores del tumor LS-174T de 11 semanas de edad. Se sacrificaron cinco ratones a las 4 horas y los otros cinco a las 24 horas después la inyección. Se extrajeron los órganos y se obtuvieron el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido, el porcentaje de dosis inyectada por órgano y las relaciones entre tumor y órganos no diana. La captación del tumor fue del 4,2 y del 4,4% ID/g a las 4 horas y 24 horas, respectivamente. La relación entre tumor y sangre se elevó desde 1,2 a las 4 horas a 9,4 a las 24 horas. Estos resultados indican la retención de la capacidad de dirección in vivo, una eliminación más rápida que la IgG entera y relaciones entre tumor y sangre similares a Tc-Fab'.

Ejemplo 6 Preparación del conjugado de F(ab')2 Immu-14 humanizado y marcaje con Tc-99m

Una solución de 2,12 mg (5,5 mg/ml) de un anticuerpo monoclonal humano contra CEA preparado convencionalmente, F(ab`)2 Immu-14 humanizado en tampón hepes 50 mM/solución salina 150 mM (pH 7,5) se incubó con un exceso de seis veces de (N-hidroxisuccinimidil)N-(3-metil-3-acilmercapto butiril)glicinato durante 2 horas a 30ºC. Como codisolvente se usó DMF (5% v/v). La purificación por cromatografía de exclusión molecular con centrifugación (sephadex 50/80 equilibrada en fosfato sódico 0,1 M, pH 7) produjo un conjugado puro que se sometió a desprotección de los grupos tiol con hidroxilamina acuosa 0,16 M (concentración final) (pH 8) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Dos purificaciones sucesivas (en sephadex 50/80, acetato sódico 0,1 M, pH 6,5) proporcionaron el conjugado con tiol desprotegido que se purgó minuciosamente con argón y se almacenó en hielo. El ensayo de Ellman para tioles usando DTNB 10 mM proporcionó un valor de 2,2 grupos tiol por molécula de anticuerpo.

Se mezclaron aproximadamente 200 \mug del conjugado preparado anteriormente, tamponado adicionalmente con 1/10 de su volumen de acetato sódico a pH 6, con 1 mCi de Tc-99m-glucoheptonato (recién preparado como se ha indicado anteriormente). El análisis por radio-HPLC a los 20 min del marcaje reveló >95% de radiactividad asociada con el anticuerpo humanizado, de la cual sólo el 5,5% estaba en forma de material de mayor peso molecular.

La invención se ha descrito haciendo referencia a realizaciones particularmente preferidas descritas anteriormente.

Claims (17)

1. Un método de radiomarcaje de una proteína con tecnecio o renio, que comprende poner en contacto una mezcla de un conjugado de dicha proteína y un agente reductor para pertecnetato o perrenato con radiopertecnetato o radioperrenato, donde dicho conjugado de proteína comprende un agente quelante unido covalentemente a dicha proteína, y donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato.

2. Un método de radiomarcaje de una proteína con tecnecio, que comprende poner en contacto un conjugado de dicha proteína con radiopertecnetato reducido, donde dicho conjugado de proteína comprende un agente quelante unido covalentemente a dicha proteína, y donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato.

3. El método de la reivindicación 2, donde dicho radiopertecnetato reducido se quela con glucoheptonato antes de entrar en contacto con dicha proteína.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha proteína es un fragmento de anticuerpo F(ab')_{2} o F(ab)_{2}.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente quelante se une covalentemente a una función amino de dicha proteína.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho agente quelante se une covalentemente a dicha proteína por medio de un enlace amida.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho agente quelante se une covalentemente a dicha proteína por medio de un enlace de diglicina o triglicina.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato se prepara por desprotección de un resto de N-(3-metil-3-acilmercaptobutiril)glicinato usando hidroxilamina.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho agente quelante se compleja con Tc-99m, Re-186 o Re-188.

10. Un estuche de diagnóstico adecuado para formar una composición a administrar a un paciente humano, que comprende un envase estéril que contiene (i) un conjugado de proteína que comprende un agente quelante unido covalentemente a una proteína, donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato; y (ii) un agente reductor para pertecnetato o perrenato que se añadirá en una etapa posterior.

11. Un conjugado de proteína que comprende un agente quelante unido covalentemente a una proteína, donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato.

12. El estuche o conjugado de la reivindicación 10 o de la reivindicación 11, donde dicha proteína es un fragmento de anticuerpo F(ab')_{2} o F(ab)_{2}.

13. El estuche o conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde dicho conjugado de proteína está liofilizado.

14. un conjugado de proteína marcado con un radioisótopo farmacéuticamente inerte de tecnecio o renio, donde dicho conjugado de proteína comprende un agente quelante unido covalentemente a una proteína y donde dicho agente quelante comprende un resto de N-(3-metil-3-mercaptobutiril)glicinato, para uso en radioinmunoterapia.

15. El conjugado de proteína para uso de la reivindicación 14, para uso por inyección parenteral en un paciente humano y, después de un período de tiempo suficiente para que la proteína radiomarcada se localice y para que se elimine el efecto de fondo no deseado, la detección del sitio o sitios de acumulación de la proteína radiomarcada por una cámara de formación de imágenes externa.

16. El conjugado de proteína para uso de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, donde la proteína se une específicamente a un antígeno producido o asociado con un tumor, lesión infecciosa, infarto de miocardio, coágulo, placa aterosclerótica u órgano o tejido normal.

17. El conjugado de proteína para uso de la reivindicación 14, donde el radioisótopo farmacéuticamente inerte es Re-186 o Re-188, y donde el conjugado de proteína se une específicamente a un tumor o lesión infecciosa, para uso en un método de radioinmunoterapia por administración parenteral a un paciente que padece un tumor o una lesión infecciosa.