ES2204954T3 - Formadores de quelatos metalicos que contienen monoamina, diamida y tiol. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES RADIOFARMACEUTICAS Y A METODO PARA LA FABRICACION Y UTILIZACION DE TALES COMPOSICIONES RADIOFARMACEUTICAS. LA INVENCION SE REFIERE EN PARTICULAR A REACTIVOS Y A UN METODO PARA SUMINISTRAR LAS COMPOSICIONES RADIOFARMACEUTICAS A PARTES SELECCIONADOS DEL CUERPO DE UN MAMIFERO PARA FORMAR IMAGENES DE TALES PARTES Y PARA QUE TENGAN UN EFECTO TERAPEUTICO EN TALES PARTES, MEDIANTE LA UTILIZACION DE AGENTES DE FORMACION DE IMAGENES RADIOMARCADOS O DE AGENTES RADIOTERAPEUTICOS RESPECTIVAMENTE. EN LA INVENCION SE PRESENTAN REACTIVOS PARA LA PREPARACION DE TALES AGENTES DE DIAGNOSTICO RADIOMARCADOS Y RADIOTERAPEUTICOS Y A LOS REACTIVOS RADIOMARCADOS PER SE A MODO DE COMPOSICIONES RADIOFARMACEUTICAS. EN LA INVENCION SE PRESENTAN ESPECIFICAMENTE TALES REACTIVOS QUE CONTIENEN MOLECULAS SELECCIONADORAS ENLAZADAS COVALENTEMENTE A AGENTES QUELANTES QUE CONTIENEN MONOAMINA, DIAMIDA Y TIOL. TAMBIEN SE PRESENTAN LOS METODOS PARA LA FABRICACION DE TALES REACTIVOS Y LOS METODOS DE UTILIZACION DE LAS COMPOSICIONES RADIOFARMACEUTICAS PRODUCIDAS A PARTIR DE LOS MISMOS.

Description

Formadores de quelatos metálicos que contienen monoamina, diamida y tiol.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a composiciones de materia que son reactivos para preparación de productos radiofarmacéuticos, métodos para preparar productos radiofarmacéuticos que utilizan dichos reactivos, los productos radiofarmacéuticos así preparados, y métodos para utilizar tales productos radiofarmacéuticos. En particular, la invención se refiere a reactivos que son formadores de quelatos metálicos que contienen monoamina, diamida y tiol (MADAT), así como a conjugados entre dichos grupos quelantes de metales y una diversidad de restos de direccionamiento específicos. Se proporcionan también en un aspecto de la invención agentes de radiodiagnóstico constituidos por los formadores de quelatos metálicos conjugados con restos de direccionamiento específicos y radiomarcados con radioisótopos emisores de radiación gamma. En otro aspecto, se proporcionan agentes radioterapéuticos constituidos por los formadores de quelatos metálicos conjugados con restos de direccionamiento específicos y radiomarcados con radioisótopos citotóxicos. Se proporcionan también estuches que comprenden los productos radiofarmacéuticos de la invención y agentes adyuvantes para la preparación de los agentes de radiodiagnóstico y radioterapéuticos de la invención. Asimismo, se proporcionan métodos de radiodiagnóstico y radioterapéuticos para utilizar los agentes de la invención.

2. Descripción de la técnica anterior

Con frecuencia es clínicamente ventajoso para un médico poder localizar el sitio de una condición patológica en un paciente utilizando medios no invasivos. Tales condiciones patológicas incluyen enfermedades de los pulmones, corazón, hígado, riñones, huesos y cerebro, así como cáncer, trombosis, embolia pulmonar, infección, inflamación y ateroesclerosis.

En el campo de la medicina nuclear, ciertas condiciones patológicas se localizan, o se evalúa su extensión, por detección de la distribución de pequeñas cantidades de compuestos trazadores marcados radiactivamente y administrados por vía interna (denominados radiotrazadores o productos radiofarmacéuticos). Los métodos para la detección de estos productos radiofarmacéuticos se conocen generalmente como métodos de formación de imágenes o de formación de radioimágenes.

En la formación de radioimágenes, el radiomarcador es un radionucleido emisor de radiación gamma y el radiotrazador se localiza utilizando una cámara detectora de radiación gamma (proceso al que se hace referencia con frecuencia como escintigrafía gamma). El sitio de la imagen es detectable debido a que el radiotrazador se elige, o bien tal que se localiza en un sitio patológico, o, alternativamente, el radiotrazador se elige específicamente tal que no se localiza en dichos sitios patológicos. En muchas situaciones, es una ventaja particular utilizar un compuesto de fijación específico radiomarcado como un producto radiofarmacéutico, que se localiza específicamente en el sitio patológico in vivo.

Se conocen una diversidad de radionucleidos que son útiles para formación de radioimágenes, con inclusión de ^{67}Ga, ^{99m}Tc (Tc-99m), ^{111}In, ^{123}I, ^{125}I y ^{169}Yb. Sin embargo, tienen que considerarse cierto número de factores para la formación óptima de radioimágenes en humanos. Para maximizar la eficiencia de detección, se prefiere un radionucleido que emita energía gamma en el intervalo de 100 a 200 keV. Para minimizar la dosis de radiación absorbida por el paciente, el radioisótopo no debería emitir radiación alguna de partículas alfa o beta, y la semivida física del radionucleido debería ser tan corta como lo permita el procedimiento de formación de la imagen. Para permitir la realización de exámenes cualquier día y en cualquier momento del día, es ventajoso disponer de una fuente del radionucleido que esté disponible siempre en el sitio clínico.

El radionucleido preferido para formación de imágenes escintigráficas es Tc-99m debido a que carece prácticamente de emisiones de radiación constituida por partículas y emite radiación gamma a aproximadamente 140 keV, tiene una semivida física de 6 horas, y está disponible fácilmente in situ utilizando un generador de molibdeno-99/tecnecio-99m.

Otros radionucleidos utilizados en la técnica anterior son menos ventajosos que Tc-99m. Esto puede ser debido a que la semivida física de tales radionucleidos es más larga, dando como resultado una mayor cantidad de dosis de radiación absorbida por el paciente (v.g. indio-111). Alternativamente, las energías de radiación gamma de tales radionucleidos alternativos son significativamente menores (v.g., yodo-125) o mayores (v.g., yodo-131) que Tc-99m y son por consiguiente inadecuadas para formación de imágenes escintigráficas de calidad. Finalmente, muchos radionucleidos desventajosos no pueden producirse utilizando un generador in situ.

Tc-99m es un metal de transición que es atrapado ventajosamente en quelatos por un quelante o resto formador de quelatos metálicos. Los restos quelantes capaces de fijar Tc-99m pueden enlazarse covalentemente a diversas moléculas de direccionamiento para proporcionar un medio para radiomarcación de dichas moléculas de direccionamiento. Esto es debido a que la especie química más comúnmente disponible de Tc-99m, el pertecnetato (TcO_{4}{}^{-}), no puede fijarse directamente a la mayoría de las moléculas de direccionamiento con suficiente fuerza para ser útil como producto radiofarmacéutico. La complejación de Tc-99m con tales restos quelantes de radiomarcación implica típicamente reducción química del pertecnetato utilizando un agente reductor tal como cloruro estannoso.

El uso de formadores de quelatos para complejación de Tc-99m se conoce en la técnica anterior.

Byrne et al., Patente U.S. No. 4.434.151, describen N_{2}S_{2}, formadores de quelatos para Tc-99m que contienen homocisteína.

Fritzberg, Patente U.S. No. 4.444.690 describe una serie de formadores de quelatos de bisamida, bistiol-tecnecio basados en 2,3-bis(mercaptoacetamido)-propanoato.

Byrne et al., Patente U.S. No. 4.571.430 describen N_{2}S_{2}, formadores de quelatos que contienen homocisteína para Tc-99m.

Byrne et al., Patente U.S. No. 4.575.556 describen N_{2}S_{2}, formadores de quelatos que contienen homocisteína para Tc-99m.

Nosco et al., Patente U.S. No. 4.925.650 describen complejos quelantes de Tc-99m.

Kondo et al., Solicitud de Patente Europea, No. de Publicación 483704 A1 describen un proceso para preparar un complejo de Tc-99m con un resto mercapto-Gly-Gly-Gly.

La Solicitud de Patente Europea No. 84109831.2 describe ligandos bisamido, bistiol-Tc99m y sales de los mismos como agentes de observación de la función renal.

Burns et al., 1985, Solicitud de Patente Europea No. 85104959.3 describen compuestos bisamino, bistiol para preparación de agentes de formación de imágenes del cerebro marcados con Tc-99m.

La Solicitud de Patente Europea No. 86100360.6 describe ácidos ditiol, diamino, o diaminocarboxílicos o complejos con aminas para producir agentes de formación de imágenes marcados con Tc-99m.

Kung et al., 1986, Solicitud de Patente Europea No. 86105920.2 describen compuestos bisamino, bistiol para fabricar pequeños agentes neutros de formación de imágenes del cerebro con Tc-99m.

Bergstein et al., 1988, Solicitud de Patente Europea No. 88102252.9 describen compuestos bisamino, bistiol para fabricar pequeños agentes neutros de formación de imágenes con Tc-99m.

La Publicación de la Solicitud de Patente Internacional PCT No. WO89/12625 describe complejos quelantes bifuncionales de ligandos bisamino, bistiol y sales de los mismos, para uso como agentes de observación de la función renal.

Davison et al., 1981, Inorg. Chem. 20, 1629-1632 describen complejos de quelatos con oxotecnecio.

Fritzberg et al., 1982, J. Nucl. Med. 23: 592-598 describen un agente quelante de Tc-99m basado en N,N'-bis(mercaptoacetil)-2,3-diaminopropanoato.

Byrne et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: P126 describen quelantes de Tc-99m que contienen homocisteína.

Bryson et al., 1988, Inorg. Chem. 27: 2154-2161 describen complejos neutros de tecnecio-99 que son inestables en exceso de ligando.

Misra et al., 1989, Tet. Lett. 30: 1885-1888, describen compuestos bisamina bistiol para propósitos de radiomarcación.

Bryson et al., 1990, Inorg. Chem. 29: 2948-2951, describen quelantes que contienen dos grupos amida, un grupo tiol y un grupo piridina sustituido, formando dichos quelantes complejos neutros con Tc-99m.

Taylor et al., 1990, J. Nucl. Med. 31: 885 (Abst.) describen un complejo neutro de Tc-99m para formación de imágenes del cerebro.

Moléculas de direccionamiento marcadas con radioisótopos han sido utilizadas como productos radiofarmacéuticos para propósitos tanto de diagnóstico como terapéuticos. Se han desarrollado cierto número de métodos para marcar moléculas de direccionamiento con radio-isótopos. Son particularmente importantes los isótopos de tecnecio para la formación de imágenes escintigráficas y los de renio y estaño para propósitos terapéuticos. A este fin, se han desarrollado muchos ejemplos de grupos agentes para marcación de moléculas de direccionamiento.

Hnatowich, Patente U.S. No. 4.668.503 describen la radiomarcación de proteínas con Tc-99m.

Tolman, Patente U.S. No. 4.732.684 describen la conjugación de moléculas de direccionamiento y fragmentos de la proteína de fijación de metales, metalotioneína.

Ege et al., Patente U.S. No. 4.832.940 describen péptidos radiomarcados para formación de imágenes de linfocitos T localizados.

Nicolotti et al., Patente U.S. No. 4.861.869 describen agentes de copulación bifuncionales útiles en la formación de conjugados con moléculas biológicas tales como anticuerpos.

Fritzberg et al., Patente U.S. No. 4.965.392 describen diversos quelantes basados en mercaptoacetilglicilglicina protegidos en S para marcación de proteínas.

Morgan et al., Patente U.S. No. 4.986.979 describen métodos para formación de imágenes de sitios de inflamación.

Fritzberg et al., Patente U.S. No. 5.091.514 describen diversos quelantes basados en mercaptoacetilglicilglicina protegidos en S para marcación de proteínas.

Gustavson et al., Patente U.S. No. 5.112.953 describen quelantes de Tc-99m para radiomarcación de proteínas.

Kasina et al., Patente U.S. No. 5.175.257 describen diversas combinaciones de moléculas de direccionamiento y grupos quelantes de Tc-99m.

Dean et al., Patente U.S. No. 5.180.816 describen métodos para radiomarcación de una proteína con Tc-99m por la vía de un agente quelante bifuncional.

Flanagan et al., Patente U.S. No. 5.248.764 describen conjugados entre un quelante radiomarcado y péptidos derivados del factor natriurético atrial.

Reno y Bottino, Solicitud de Patente Europea No. 87300426.1 describen la radiomarcación de anticuerpos con Tc-99m.

Ranby et al., 1988, Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US88/02276 describen un método para detectar depósitos de fibrina en un animal, que comprende fijar covalentemente un compuesto radiomarcado a la fibrina.

Dean et al., Solicitud de Patente Internacional, No. de Publicación WO89/12625 dan a conocer agentes de copulación bifuncionales para marcación de proteínas con Tc-99m.

Schoemaker et al., Solicitud de Patente Internacional, No. de publicación WO90/06323 describen proteínas quiméricas que comprenden una región de fijación de metales.

Morgan et al., Solicitud de Patente Internacional, No. de Publicación WO90/10463, describen métodos para formación de sitios de imagen de inflamación.

Flanagan et al., Solicitud de Patente Europea No. 90306428.5 describen la marcación con Tc-99m de fragmentos de péptidos sintéticos por la vía de una serie de moléculas orgánicas formadoras de quelatos.

Gustavson et al., Solicitud de Patente Internacional, No. de Publicación WO91/09876 describen quelantes de Tc-99m para radiomarcación de proteínas.

Rodwell et al., 1991, Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US91/03116 describen conjugados de "unidades de reconocimiento molecular" con "dominios efectores".

Cox, Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US92/04559, describe derivados radiomarcados de somatostatina que contienen dos residuos cisteína.

Rhodes et al., Solicitud de Patente Internacional, No. de Publicación WO93/12819 dan a conocer péptidos que comprenden dominios fijadores de iones metálicos.

Lyle et al., Solicitud de Patente Internacional, No. de Publicación WO93/15770 describen quelantes de Tc-99m y péptidos marcados con Tc-99m.

Coughlin et al., Solicitud de Patente Internacional, No. de Publicación WO93/21151 describen quelantes bifuncionales que comprenden grupos tiourea para radiomarcación de moléculas de direccionamiento.

Knight et al., 1990, 37th Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine, Abstract #209, describen la formación de imágenes de trombos utilizando péptidos marcados con Tc-99m.

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Babich et al., 1993, J. Nucl. Med. 34: 1964-1974, describen péptidos marcados con Tc-99m que comprenden derivados de hidrazinonicotinamida.

Miembros bien estudiados de la clase de grupos quelantes utilizados para radiomarcación de moléculas de direccionamiento incluyen diamida-ditioles (DADS), conocidos también como formadores de quelatos N_{2}S_{2}, y mercaptoacetiltriglicinas (MAG_{3}), conocidos también como formadores de quelatos N_{3}S. Estos dos tipos de grupos quelantes forman formadores de quelatos estables con tecnecio, y se han desarrollado métodos para enlazar estos formadores de quelatos con moléculas de direccionamiento.

Byrne et al., Patente U.S. No. 4.434.151 describen N_{2}S_{2}, formadores de quelatos que contienen homocisteína para Tc-99m

Fritzberg, Patente U.S. No. 4.444.690 describe una serie de formadores de quelatos bisamida, bistiolato-tecnecio basados en 2,3-bis(mercaptoacetamido)-propanoato.

Byrne et al., Patente U.S. No. 4.571.430 describen N_{2}S_{2}, formadores de quelatos que contienen homocisteína para Tc-99m.

Byrne et al., Patente U.S. No. 4.575.556 describen N_{2}S_{2}, formadores de quelatos que contienen homocisteína para Tc-99m.

Nosco et al., Patente U.S. No. 4.925.650 describen complejos quelantes de Tc-99m.

Kondo et al., Solicitud de Patente Europea, No. de Publicación 483704 A1 describen un proceso para preparación de un complejo Tc-99m con un resto mercapto-Gly-Gly-Gly.

La Solicitud de Patente Europea No. 84109831.2 describe ligandos bisamido-bistiol Tc-99m y sales de los mismos como agentes de observación de la función renal.

Fritzberg, Solicitud de Patente Europa No. 853042255.4 describen complejos N/S de tecnecio.

Fritzberg et al., Solicitud de Patente Europea No. 88104755.9 describen formadores de quelatos N/S.

Davison et al., 1981, Inorg. Chem. 20: 1629-1632 describen complejos de quelatos de oxotecnecio.

Fritzberg et al., 1982, J. Nucl. Med. 23: 592-598 describen un agente quelante de tecnecio basado en N,N'-bis(mercaptoacetil)-2,3-diaminopropanoato.

Byrne et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: P126 describen formadores de quelatos de tipo N_{2}S_{2} que contienen homocisteína para Tc-99m.

En general, estos métodos requieren que el quelato se caliente brevemente (15 min) a 100ºC en solución para producir el quelato estable (véase, por ejemplo, Fritzberg et al., 1986, Solicitud de Patente Europea No. 853042255.4). Dado que muchas moléculas de direccionamiento tales como péptidos y carbohidratos son termolábiles, produciendo degradación y productos secundarios inactivos, existe necesidad de una tecnología de marcación realizada en condiciones más suaves (v.g., la temperatura ambiente), lo que evita estas condiciones de marcación convencionales severas, y pueda completarse rápidamente en la clínica hospitalaria antes de la duras administración a los pacientes. La marcación rápida en una situación clínica es particularmente importante, dado que muchos pacientes requieren información de diagnóstico rápidamente antes de la naturaleza aguda de su condición.

Otra clase de compuestos quelantes desarrollados para marcación de moléculas de direccionamiento son los bisamina-bistioles (denominados BATs).

Baidoo et al., Patentes U.S. 5.196.515 y 5.095.111 describen complejos bis-amina-bistiol.

Kung et al., Solicitud de Patente Europea No. 86105920.2 describieron ligandos bisamina-bistiol y sus complejos con tecnecio-99m.

Misra et al., 1989, Tet. Lett. 30: 1885-1888 describen compuestos bisamina-bistiol para propósitos de radiomarcación.

Baidoo et al., 1990, Bioconjugate Chem. 1: 132-137, describen un método para marcación de biomoléculas utilizando un bisamina-bistiol.

Estos compuestos son útiles cuando se fijan a moléculas de direccionamiento, dado que los mismos pueden marcarse con tecnecio a la temperatura ambiente. Dichas condiciones de marcación moderadas exponen las moléculas de direccionamiento químicamente sensibles a un mínimo de tensión química, dando como resultado menos degradación y compuestos diana radiomarcados químicamente puros. Sin embargo, los quelatos BAT presentan también varios inconvenientes. Un inconveniente de los formadores de quelatos BAT es que estos quelatos son intrínsecamente muy lipófilos. Esta propiedad puede ser causa de que estos compuestos sean retenidos en exceso en la sangre periférica, interfiriendo con la escintigrafía eficiente debido a que los agentes de formación de imágenes tienen que aclararse de la sangre periférica para reducir la radiactividad de fondo antes que pueda obtenerse una imagen diagnóstica útil. Este inconveniente puede ser por sí solo lo bastante importante para determinar si un agente de formación de imágenes escintigráficas que contiene formadores de quelatos BAT es un producto comercialmente práctico.

Otro inconveniente de los formadores de quelatos BAT es que es difícil desarrollar la química para fijar covalentemente tales quelatos a las moléculas de direccionamiento. Aunque se ha conseguido el enlace covalente satisfactorio de los formadores de quelatos BAT con moléculas de direccionamiento, el mismo ha dado también típicamente como resultado la producción de compuestos intermedios costosos y ha resultado definitivamente ser una vía cara para fabricar el producto radiofarmacéutico final.

El uso de formadores de quelatos para radiomarcación de péptidos, y métodos para marcación de péptidos con Tc-99m se conocen en la técnica anterior y se describen en las Solicitudes de Patente U.S. pendientes de tramitación, Núms. de Serie 07/653.012, 07/807.062, 07/871.282, 07/886.752, 07/893.981, 07/955.466, 08/019.864, 08/073.577, 08/210.822, 08/236.402 y 08/241.625, y péptidos radiomarcados para uso como agentes de formación de imágenes escintigráficas para la formación de imágenes de trombos se conocen en la técnica anterior y se exponen en las solicitudes de Patente U.S. también en tramitación Núms. de Serie 07/886.752, 07/893.981 y 08/044.825 y en las solicitudes de Patente Internacional Núms. de Serie PCT/US92/00757, PCT/US92/10716, PCT/US93/02320, PCT/US93/03687, PCT/US93/04794, PCT/US93/05372, PCT/US93/06029, PCT/US93/09387, PCT/US94/01984, PCT/US94/03878, y PCT/US94/05895, cada una de los cuales se incorpora por la presente por referencia en su totalidad.

Existe necesidad de productos radiofarmacéuticos para propósitos diagnósticos y terapéuticos que puedan radiomarcarse fácilmente en condiciones químicas suaves a fin de evitar la degradación química y física de las moléculas de direccionamiento biológicas lábiles. Existe necesidad de grupos quelantes de bajo coste que sean fáciles de sintetizar, moderadamente lipófilos, que puedan unirse a una molécula de direccionamiento y marcarse subsiguientemente con Tc-99m con rapidez a la temperatura ambiente.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona reactivos útiles en la preparación de agentes radiofarmacéuticos diagnósticos y terapéuticos. Específicamente, la invención proporciona reactivos que son formadores de quelatos metálicos que contienen monoamina, diamida y tiol (MADAT). La invención proporciona también formadores de quelatos de monoamida, bisamida, monotiol y complejos de tales formadores de quelatos metálicos con isótopos de tecnecio-99m, renio-186, renio-188, estaño-117m, cobre-64 y cobre-67. Se proporcionan también conjugados entre dichos grupos quelantes de metales y una diversidad de restos de direccionamiento específicos. Tales conjugados están constituidos por un grupo quelante de metales de la invención enlazado covalentemente a una molécula de direccionamiento específica. Tales conjugados radiomarcados comprenden los agentes radiodiagnósticos y radioterapéuticos proporcionados por la invención.

La invención proporciona agentes radiofarmacéuticos y reactivos para preparar tales agentes radiofarmacéuticos que comprenden un resto de direccionamiento enlazado covalentemente a un formador de quelatos metálicos seleccionado del grupo constituido por:

(i) un grupo que tiene la fórmula:

1

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(ii) un grupo que tiene la fórmula:

2

en las cuales n, m y p son cada uno números enteros que son independientemente 0 ó 1; cada R' es independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo C_{2}-C_{4}, o alcoxialquilo C_{2}-C_{4}, y cada R es independientemente H o R'', donde R'' es alquilo inferior sustituido o insustituido o fenilo que no comprende un grupo tiol, y uno de R o R' es L, donde L es un resto enlazador bivalente que enlaza el quelante de metales con el resto de direccionamiento y en el cual, cuando un R' es L, NR'_{2} es una amina.

En realizaciones preferidas, L es un grupo alquilo C_{1}-C_{6} lineal, de cadena ramificada o cíclico, un éster carboxílico, una carboxamida, una sulfonamida, un éter, un tioéter, una amina, un alqueno, un alquino, un anillo bencénico enlazado en posiciones 1,2, 1,3 ó 1,4, opcionalmente sustituido, o un aminoácido o péptido de 2 a aproximadamente 10 aminoácidos, o combinaciones de los mismos.

En realizaciones preferidas, R'' es un grupo alquilo C_{1}-C_{6} lineal, ramificado o cíclico; un grupo -C_{q}OC_{r}-, -C_{q}NHC_{r}- o -C_{q}SC_{r}-, donde q y r son números enteros cada uno de los cuales es independientemente 1 a 5, en los cuales la suma de q + r no es mayor que 6; (C_{1}-C_{6})-alquil-X, donde X es grupo hidroxilo, una amina sustituida, una guanidina, una amidina, un grupo tiol sustituido, o un grupo ácido carboxílico, éster, fosfato o sulfato; un grupo fenilo o un grupo fenilo sustituido con un halógeno, hidroxilo, amina sustituida, guanidina, amidina, tiol sustituido, éter, fosfato, o grupo sulfato; un grupo indol; un grupo heterocíclico C_{1}-C_{6} que contiene 1 a 3 átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre, o combinaciones de los mismos.

Formadores de quelatos metálicos preferidos de la invención incluyen formadores de quelatos que tienen la fórmula:

3

en la cual R^{1} y R^{2} son cada un independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo C_{2}-C_{4}, o alcoxialquilo C_{2}-C_{4}; R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} son independientemente H, alquilo inferior sustituido o insustituido o fenilo que no comprende un grupo tiol; R^{7} y R^{8} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo inferior o alcoxialquilo inferior; L es un grupo enlazador bivalente y Z es un resto de direccionamiento.

\newpage

Formadores de quelatos metálicos preferidos adicionales de la invención incluyen formadores de quelatos de fórmula:

4

en la cual R^{1} y R^{2} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo C_{2}-C_{4}, o alcoxialquilo C_{2}-C_{4}; R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} son independientemente H, alquilo inferior sustituido o insustituido o fenilo que no comprende un grupo tiol, y uno de R^{3}, R^{4}, R^{5} o R^{6} es Z-L-HN(CH_{2})_{n}-, donde L es un grupo enlazador bivalente, Z es un resto de direccionamiento, y n es un número entero de 1 a 6; R^{7} y R^{8} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo inferior o alcoxialquilo inferior; y X es un grupo amino, un grupo amino sustituido o -NR^{1}-Y, donde Y es un aminoácido, una amida de aminoácido, o un péptido que comprende de 2 a 10 aminoácidos.

Formadores de quelatos metálicos más preferidos de la invención incluyen formadores de quelatos que tienen la fórmula:

5

en la cual R^{1} y R^{2} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo inferior, o alquenilalquilo inferior; R^{3} y R^{4} son independientemente H, alquilo inferior sustituido o insustituido o fenilo que no comprende un grupo tiol; n es un número entero de 1 a 6; L es un grupo enlazador bivalente; y Z es un resto de direccionamiento.

Formadores de quelatos metálicos adicionales más preferidos incluyen formadores de quelatos no de fórmula:

6

en la cual L es un grupo enlazador bivalente y Z es un resto de direccionamiento.

Formadores de quelatos metálicos muy preferidos de la invención incluyen formadores de quelatos que tienen las fórmulas siguientes:

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-cisteína-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-isocisteína-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-homocisteína,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-penicilamina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-2-mercaptoetilamina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-2-mercapto-propilamina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-2-mercapto-2-metil-propilamina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-3-mercaptopropilamina-,

en los cuales (aminoácido) es un \alpha- o \beta-aminoácido primario que no comprende un grupo tiol y en los cuales el formador de quelatos está unido a un resto de direccionamiento o un grupo enlazador por la vía de un enlace covalente con el término carboxilo del formador de quelatos o una cadena lateral en uno de los grupos aminoácido.

Formadores de quelatos muy preferidos incluyen también formadores de quelatos de la fórmula anterior en la cual (aminoácido)^{1} es un \alpha,\omega- o \beta,\omega-aminoácido en el cual el grupo \alpha- o \beta-amino es una amina libre y el \alpha,\omega- o \beta,\omega-aminoácido está enlazado covalentemente por la vía del grupo \omega amino.

Otros formadores de quelatos metálicos muy preferidos incluyen los seleccionados del grupo constituido por:

-cisteína-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

-isocisteína-(aminoácido \alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

-homocisteína-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

-penicilamina-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

ácido 2-mercaptoacético-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-di-aminoácido);

ácido 2- o 3-mercaptopropiónico-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

ácido 2-mercapto-2-metilpropiónico-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

en los cuales (aminoácido) es un \alpha- o \beta-aminoácido primario que no comprende un grupo tiol y en los cuales el formador de quelatos está unido a un resto de direccionamiento o a un grupo enlazador por la vía de un enlace covalente con el término amino del formador de quelatos o una cadena lateral en uno de los grupos aminoácido.

Formadores de quelatos metálicos particularmente preferidos se seleccionan del grupo constituido por: Gly-Gly-Cys-, Arg-Gly-Cys-, -(\epsilon-Lys)-Gly-Cys-, -(\delta-Orn)-Gly-Cys-, -(\gamma-Dab)-Gly-Cys-, y -(\beta-Dap)-Gly-Cys-. (En estas fórmulas, debe entenderse que: \epsilon-Lys representa un residuo lisina en el cual el grupo \epsilon-amino, en lugar del grupo \alpha-amino típico, está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico; \delta-Orn representa un residuo ornitina en el cual el grupo \delta-amino, en lugar del grupo \alpha-amino típico, está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico; \gamma-Dab representa un residuo de ácido 2,4-diaminobutírico en el cual el grupo \gamma-amino está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico; y \beta-Dap representa un residuo de ácido 1,3-diaminopropiónico en el cual el grupo \beta-amino está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico.).

Un ejemplo de formadores de quelatos metálicos preferidos del tipo de estructura (III) anterior es el quelante Gly-Gly-Cys- que forma un resto quelante de metales que tiene la estructura:

7

Los ligandos quelantes que tienen la estructura de tipo VII forman complejos con oxotecnecio que tienen la estructura:

8

Un ejemplo de formadores de quelatos metálicos más preferidos que tienen el tipo de estructura V como se muestra anteriormente es Lys-(\omega-péptido)-Gly-Cys.amida que forma un resto quelante de metales de estructura:

9

Los ligandos quelantes que tienen estructura de tipo IX forman complejos con oxotecnecio que tienen la estructura:

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Un ejemplo de un reactivo para preparar un agente radiofarmacéutico como los proporcionados por esta invención que comprende un grupo quelante de metales que tiene el tipo de estructura II como se muestra anteriormente es (resto de direccionamiento)-Cys-Gly \alpha,\beta-diaminopropion-amida, que forma un resto quelante de metales de estructura:

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Los agentes de radiodiagnóstico que tienen el tipo de estructura XI forman complejos con oxotecnecio que tienen la estructura:

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La invención proporciona también cada uno de los formadores de quelatos metálicos de la invención como agentes radiofarmacéuticos per se, no enlazados covalentemente a una molécula de direccionamiento. Tales realizaciones de la invención son útiles como agentes radiodiagnósticos y radioterapéuticos cuando están marcados con el radioisótopo apropiado y tienen utilidad como productos radiofarmacéuticos como se describen en esta memoria para numerosas aplicaciones radiodiagnósticas y radioterapéuticas, v.g., formación de imágenes renales, hepáticas y cerebrales.

Por esta invención se proporcionan agentes radiofarmacéuticos que comprenden restos de direccionamiento que son anticuerpos monoclonales, péptidos, moléculas de fijación de receptores, moléculas de adhesión, sustratos enzimáticos, inhibidores de enzimas, carbohidratos, oligonucleótidos, oligonucleósidos y en general cualquier entidad química que tenga afinidad para algún componente de un organismo vivo. Ejemplos de restos de direccionamiento incluyen inmunoglobulinas, fragmentos F(ab')_{2} o fragmentos Fab o Fab' derivados de anticuerpos monoclonales murinos, humanos o humano-murinos quiméricos, péptidos de fijación de los receptores de somatostatina, péptidos de fijación de glicoproteínas IIb/IIIa, péptidos de fijación de la placa ateroesclerótica, péptidos derivados del factor 4 de las plaquetas, moléculas de fijación de receptores, moléculas de adhesión, sustratos enzimáticos, inhibidores de enzimas, y carbohidratos.

Pueden formarse productos radiofarmacéuticos y los reactivos para preparación de tales productos radiofarmacéuticos de la invención en los cuales el resto de direccionamiento o el formador de quelatos metálicos o ambos, están enlazados covalentemente a un resto enlazador polivalente. Restos enlazadores polivalentes de la invención están constituidos por al menos 2 grupos enlazadores idénticos capaces de unirse covalentemente a restos de direccionamiento o formadores de quelatos metálicos. Los restos enlazadores polivalentes se forman a partir de reactivos precursores en los cuales cada resto enlazador comprende un grupo enlazador funcional que es capaz de reaccionar con restos de direccionamiento o formadores de quelatos metálicos o ambos. Grupos funcionales enlazadores preferidos son aminas primarias o secundarias, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico o grupos reactivos con tiol tales como maleimidas y grupos 2-haloacetilo. En realizaciones preferidas, los restos enlazadores polivalentes están constituidos por bis-succinimido-metiléter (BSME), ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico (DMAB), tris(succinimidiletil)amina (TSEA), tris(acetamidoetil)-amina, bis-acetamidometil-éter, bis-acetamidoetil-éter, \alpha,\epsilon-bis-acetil-lisina, lisina y 1,8-bis-acetamido-3,6-dioxa-octano.

La invención proporciona agentes de formación de imágenes escintigráficas que son agentes de radiodiagnóstico constituidos por complejos con Tc-99m de los conjugados grupo quelante de metales/resto de direccionamiento de la invención. Se proporcionan también métodos para radiomarcación de tales compuestos. Los complejos radiomarcados proporcionados por la invención se forman por reacción de los reactivos conjugados de la invención con Tc-99m en presencia de un agente reductor. Agentes reductores preferidos incluyen, pero sin carácter limitante, ion ditionito, ion estannoso, e ion ferroso. Los complejos de la invención se forman también por marcación de los reactivos conjugados de la invención con Tc-99m por intercambio de ligandos con un complejo prerreducido de Tc-99m como se proporciona en esta memoria.

\newpage

La invención proporciona también estuches para preparación de los agentes radiofarmacéuticos marcados con Tc-99m de la invención. Los estuches para marcación con Tc-99m de los reactivos conjugados de la invención están constituidos por un envase herméticamente cerrado (v.g. un vial o una jeringuilla) que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo conjugado de la invención y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar el reactivo con Tc-99m.

La invención proporciona métodos para producir los formadores de quelatos metálicos, los reactivos conjugados formador de quelatos metálicos/resto de direccionamiento y agentes radiofarmacéuticos de la invención por síntesis química in vitro. En una realización preferida, tales compuestos se sintetizan por síntesis de péptidos en fase sólida.

Esta invención proporciona también métodos para utilización de los agentes radiodiagnósticos y radioterapéuticos de la invención. En una realización, se proporcionan agentes de formación de imágenes escintigráficas de la invención que son productos radiofarmacéuticos marcados con Tc-99m para formación de imágenes de sitios en el cuerpo de un mamífero por obtención de imágenes escintigráficas gamma in vivo. Estos métodos comprenden administrar una cantidad diagnóstica eficaz de un reactivo conjugado de radiodiagnóstico radiomarcado con Tc-99m de la invención y detectar la radiación gamma emitida por el Tc-99m localizado en el sitio del cuerpo de un mamífero.

En otro aspecto, se proporcionan agentes radioterapéuticos que son productos radiofarmacéuticos marcados con Re-186, Re-188, Sn-117m o Cu-67 para localización de cantidades citotóxicas de tales radioisótopos en un sitio patológico in vivo. Estos métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un reactivo conjugado radioterapéutico radiomarcado de la invención y dejar que dicho producto radiofarmacéutico se localice en el sitio patológico apropiado para tener un efecto terapéutico por citotoxicidad en dicho sitio.

Realizaciones específicas preferidas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción más detallada que sigue de ciertas realizaciones preferidas y las reivindicaciones.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

La presente invención proporciona formadores de quelatos metálicos que contienen monoamina, diamida, y tiol (MADAT) y realizaciones de tales formadores de quelatos metálicos complejados con radioisótopos, que incluyen tecnecio-99m, renio-186, renio-188, estaño-117, cobre-64 y cobre-67. La invención proporciona agentes radiofarmacéuticos, que incluyen agentes de radiodiagnóstico y agentes radioterapéuticos, que son los formadores de quelatos metálicos de la invención complejados con radio-isótopos apropiados para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Métodos de fabricación de dichos formadores de quelatos metálicos, métodos de complejación de dichos formadores de quelatos metálicos con radioisótopos, y métodos de utilización de tales formadores de quelatos metálicos como productos radiofarmacéuticos se proporcionan también por la invención.

La presente invención proporciona también formadores de quelatos metálicos que contienen monoamina, diamida y tiol enlazados covalentemente a restos de direccionamiento para proporcionar reactivos para la preparación de productos radiofarmacéuticos capaces de fijarse a o acumularse en sitios en el cuerpo de un mamífero. En ciertas realizaciones de este aspecto de la invención, el formador de quelatos metálicos y el resto de direccionamiento están enlazados directamente por medios químicos por un enlace covalente. En otras realizaciones, el formador de quelatos metálicos y el resto de direccionamiento están enlazados por la vía de un enlazador que, en ciertas realizaciones, comprende un aminoácido o un péptido. Se proporcionan también complejos de los conjugados quelato metálico/resto de direccionamiento de la invención con radioisótopos, que incluyen tecnecio-99m, renio-186, renio-188, estaño-117m, cobre-64 y cobre-67. La invención proporciona agentes radiofarmacéuticos, que incluyen agentes radiodiagnósticos y agentes radioterapéuticos, que son los conjugados formador de quelatos metálicos/resto de direccionamiento de la invención complejados con radioisótopos apropiados para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Se proporcionan también por la invención métodos de fabricación de dichos conjugados, métodos de complejación de dichos conjugados con radioisótopos, y métodos de utilización de tales conjugados como agentes radiofarmacéuticos.

Así pues, se proporcionan también por la invención agentes radiofarmacéuticos, que comprenden los conjugados formador de quelatos metálicos/direccionamiento de la invención complejados con radioisótopos. En un aspecto, la invención proporciona agentes de radiodiagnóstico que incluyen agentes de formación de imágenes escintigráficas para formación de imágenes de sitios diana en el cuerpo de un mamífero en los cuales el agente radiofarmacéutico comprende un quelato metálico de Tc-99m. En otro aspecto, la invención proporciona agentes radioterapéuticos para dirigir cantidades citotóxicas de radioisótopos tales como Re-186, Re-188, Sn-117m, Cu-64 y Cu-67 a sitios patológicos en el cuerpo de un mamífero.

En los agentes de radiodiagnóstico tales como agentes de formación de imágenes escintigráficas como los proporcionados por esta invención, la marcación con Tc- 99m es ventajosa debido a que las propiedades nucleares y radiactivas de este isótopo hacen del mismo un agente de formación de imágenes escintigráfica ideal. Este isótopo tiene una energía fotónica simple de 140 keV y una semivida radiactiva de aproximadamente 6 horas, y está disponible fácilmente a partir de un generador ^{99}Mo-^{99m}Tc.

Para los propósitos de esta invención, el término "resto de direccionamiento" tiene por objeto significar cualquier compuesto que se fija a o se acumula en un sitio diana en el cuerpo de un mamífero, es decir, que el compuesto se localiza en mayor proporción en el sitio diana que en los tejidos circundantes. Esto es ventajoso en realizaciones radiodiagnósticas de la invención debido a que los agentes de formación de imágenes escintigráficas que comprenden tales restos de direccionamiento se distribuyen en el cuerpo de un mamífero después de su administración para proporcionar una definición visual de la diana in vivo. Esto es ventajoso en realizaciones radioterapéuticas de la invención debido a que los agentes radiocitotóxicos se localizan por consiguiente en un sitio patológico con minimización concomitante de la toxicidad sistémica inespecífica in vivo.

Se proporcionan por esta invención agentes radiofarmacéuticos y reactivos para su preparación que comprenden restos de direccionamiento que son anticuerpos monoclonales, péptidos, moléculas de fijación de receptores, moléculas de adhesión, sustratos enzimáticos, inhibidores de enzimas, carbohidratos, oligonucleótidos, oligonucleósidos y en general cualquier entidad química que tenga afinidad para algún componente de un organismo vivo. Ejemplos de restos de direccionamiento incluyen inmunoglobulinas, fragmentos F(ab')_{2} o fragmentos Fab o Fab' derivados de anticuerpos monoclonales de murino, humanos, o quiméricos humano-murinos; péptidos de fijación de receptores de somatostatina tales como ciclo(N-CH_{3})-Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy-; péptidos de fijación de glicoproteínas IIb/IIIa tales como CH_{2}CO.(D-Tyr)-Amp-Gly-Asp-Cys-Lys-Gly-Cys-Gly.amida; péptidos de fijación de la placa ateroesclerótica tales como Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Phe-Val-Thr-Gln-Ala-Glu-Gly-Ala-Lys.amida; péptidos derivados del factor 4 de las plaquetas tales como Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser; moléculas de fijación de receptores tales como espiroperidol y haloperidol; moléculas de adhesión tales como asialil-Lewis^{x}; sustratos enzimáticos tales como 2-nitroimidazol; inhibidores de enzimas tales como hirudina y D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona; y carbohidratos tales como \beta-glucanos.

En ciertas realizaciones de los reactivos de la invención, los \beta-glucanos comprenden el resto de direccionamiento. Para los propósitos de esta invención, el término \beta-glucano tiene por objeto significar oligosacáridos que comprenden residuos de \beta-D-glucosa enlazados en posición 1,3 y 1,6 en los cuales el resto \beta-glucano tiene un peso molecular de hasta aproximadamente 2000 kilodaltons. Una realización preferida de reactivo que contiene \beta-glucano de la invención tiene la fórmula:

\beta -glucano-(= NNHCO.(CH_{2})_{3}CO)(\epsilon-K)GCY.amida.

En realizaciones de esta invención en las cuales el resto de direccionamiento es un péptido, cada realización del péptido de la invención está constituida por una secuencia de aminoácidos. El término aminoácido, tal como se utiliza en esta invención, tiene por objeto incluir todos los \alpha- y \beta-aminoácidos primarios L y D, existentes naturalmente, modificados, sustituidos, alterados y de otro tipo. Los péptidos que comprenden restos de direccionamiento de la invención incluyen, pero sin carácter limitante, péptidos de las fórmulas siguientes:

(Fórmulas pasan a página siguiente)

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(Las abreviaturas de una sola letra para aminoácidos pueden encontrarse en G. Zubay, Biochemistry (2ª edición), 1988 (McMillen Publishing: Nueva York) p. 33; otras abreviaturas son como sigue: Acm es acetamidometilo; Mob es 4-metoxibencilo; Abu es ácido aminobutírico; F_{D} es D-fenilalanina; W_{D} es D-triptófano; Y_{D} es D-tirosina; Aca es ácido 6-aminohexanoico; Amp es 4-amidinofenilalanina; Apc es S-(3-aminopropil)cisteína; Hcy es homocisteína; Nal es 2-naftilalanina; Cpa es 4-clorofenilalanina; K_{D} es D-lisina; D_{D} es D-aspartato; Nal_{D} es D-2-naftilalanina; DTPA es ácido dietilenotriaminapentaacético; Trc es ácido tricarbalílico; Trc-imida es imida tricarbalílica; y Hca es hexacarboxiciclohexano. (...)_{2}K representa un enlace covalente con ambos grupos amino de la lisina. Hcy(...) representa un enlace covalente con el átomo de azufre de la cadena lateral de la homocisteína. (N-CH_{3})F representa N-\alpha-metilfenilalanina. El subrayado entre grupos (v.g., por ejemplo entre el grupo CH_{2}CO. y la cisteína (C) CH_{2}CO.Y_{D}RGDC representa un sulfuro cíclico. El subrayado entre aminoácidos (v.g., como entre las cisteínas (C) en CNPRGDC) representa un enlace disulfuro cíclico. El término "ciclo" antes de una secuencia subrayada significa una secuencia cíclica de término N a término C. El subíndice X_{D} indica que el aminoácido está en la configuración D; todos los restantes subíndices hacen referencia a grupos protectores de la cadena lateral del aminoácido. \epsilon-K representa un residuo lisina en el cual el grupo \epsilon-amino, en lugar del grupo \alpha-amino típico, está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico. \delta-Orn representa un residuo ornitina en el cual el grupo \delta-amino, en lugar del grupo \alpha-amino típico, está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico. \gamma-Dab representa un residuo de ácido 2,4-diaminobutírico en el cual el grupo \gamma-amino está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico. \beta-Dap representa un residuo de ácido 1,3-diaminopropiónico en el cual el grupo \beta-amino está enlazado covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido adyacente para formar un enlace peptídico.

Esta lista de reactivos para la preparación de productos radiofarmacéuticos proporcionados por la invención es ilustrativa y no tiene por objeto ser limitante o exclusiva, debiendo entenderse por las personas expertas en la técnica que todos los reactivos que comprenden combinaciones de los péptidos descritos en esta memoria o su equivalentes pueden estar enlazados covalentemente con cualquiera de los restos quelantes de la invención y están dentro de su alcance, con inclusión de combinaciones de diversos restos de direccionamiento y formadores de quelatos metálicos como se describen en esta memoria.

En ciertas realizaciones de la invención, los formadores de quelatos metálicos y los restos de direccionamiento están enlazados por la vía de un resto de enlace polivalente. Los restos de enlace polivalentes están enlazados covalentemente a los restos de direccionamiento de la invención, los formadores de quelatos metálicos, o ambos. Los restos de enlace polivalentes proporcionados por la invención están constituidos por al menos 2 grupos funcionales enlazadores capaces de unirse covalentemente a los restos de direccionamiento o a los formadores de quelatos metálicos. Tales grupos funcionales incluyen, pero sin carácter limitante, aminas primarias y secundarias, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico y grupo reactivos con tiol. Los restos de enlace polivalentes están constituidos preferiblemente por al menos tres grupos funcionales capaces de enlazarse covalentemente a restos de direccionamiento o formadores de quelatos metálicos. Restos de enlace polivalentes preferidos incluyen amino-ácidos tales como lisina, homolisina, ornitina, ácido aspártico y ácido glutámico; aminas y poliaminas lineales y cíclicas; ácidos policarboxílicos; y tioles activados tales como di- y tri-maleimidas. Se prefieren también realizaciones en las cuales los restos en enlace polivalentes comprenden una multiplicidad de restos de enlace polivalentes enlazados covalentemente para formar un resto de enlace polivalente ramificado. Restos de enlace polivalentes específicos preferidos incluyen bissuccinimidilmetiléter, ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico, tris(succinimidiletil)amina, 4-(O-CH_{2}CO-Gly-Gly-Cys.amida)acetofenona; bis-succin-imidohexano, tris(acetamido-etil)amina, tris(acetamido-metil)éter, bis(acetamidoetil)éter, \alpha,\epsilon-bisacetil-lisina, y 1,8-bis-acetamido-3,6-dioxa-octano.

Los restos peptídicos de direccionamiento de la invención pueden sintetizarse químicamente in vitro. Los restos peptídicos de direccionamiento de la presente invención se pueden preparar por regla general ventajosamente en un sintetizador de péptidos. Pueden sintetizarse restos peptídicos de direccionamiento de esta invención en los cuales el grupo quelante se enlaza covalentemente al péptido de fijación específica durante la síntesis química in vitro, utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. La incorporación del grupo quelante durante la síntesis del péptido es particularmente ventajosa, dado que proporciona reactivos en los cuales la localización exacta del enlace covalente entre el péptido de fijación específica y el grupo complejante es a la vez conocida y puede diseñarse en el reactivo a fin de evitar o minimizar cualquier perturbación de la afinidad de fijación específica del péptido de fijación específica.

Adicionalmente, agentes formadores de quelatos metálicos se pueden enlazar covalentemente a los grupos que comprenden las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, el grupo \epsilon-amino de la lisina para dar, por ejemplo, \alphaN(Fmoc)-Lys-\epsilonN(Gly-Gly-Cys), que se puede incorporar en cualquier posición en una cadena peptídica. Esta secuencia es particularmente ventajosa, dado que proporciona un modo fácil de incorporación en un péptido de fijación de diana. Esta invención proporciona la incorporación de estos formadores de quelatos prácticamente en cualquier péptido, dando como resultado un péptido radiomarcado enlazado covalentemente a un resto formador de complejos con Tc-99m.

En la formación de un complejo de tecnecio radiactivo con los formadores de quelatos metálicos o los conjugados quelante de metales/resto de direccionamiento de esta invención, un complejo de tecnecio, preferiblemente una sal de pertecnetato de Tc-99m, se hace reaccionar con el quelante o el conjugado en presencia de un agente reductor; en una realización preferida, el agente reductor es una sal de un ion estannoso, muy preferiblemente cloruro estannoso. Los agentes de formación de imágenes escintigráficas de la invención que son formadores de quelatos metálicos marcados con Tc-99m o conjugados quelante de metales/resto de direccionamiento se proporcionan conveniente y ventajosamente por medio de un estuche que comprende un vial herméticamente cerrado que contiene una cantidad predeterminada del reactivo y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar el reactivo con Tc-99m. Alternativamente, los agentes de formación de imágenes escintigráficas de la invención pueden formarse por reacción de un quelante de metales o conjugado quelante de metales/resto de direccionamiento de la invención con un complejo lábil preformado de tecnecio y otro Compuesto conocido como ligando de transferencia. Este proceso se conoce como intercambio de ligandos y es bien conocido por los expertos en la técnica. El complejo lábil puede formarse utilizando ligandos de transferencia tales como tartrato, citrato, gluconato, glucoheptonato o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetato de Tc-99m útiles en la presente invención se incluyen las sales de metal alcalino tales como la sal de sodio, o sales de amonio o sales de alquilo inferior-amonio. La reacción de los reactivos de esta invención con pertecnetato de Tc-99m o complejo lábil preformado de Tc-99m puede llevarse a cabo en un medio acuoso a la temperatura ambiente. Los agentes de formación de imágenes escintigráficas marcados con tecnecio-99m proporcionados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse en condiciones de reacción como las descritas en el Ejemplo 2 más adelante en esta memoria.

Se proporcionan quelantes de metales marcados radiactivamente y conjugados quelante de metales/resto de direccionamiento que tienen una cantidad adecuada de radiactividad para uso como agentes radiofarmacéuticos. Por regla general se prefiere formar complejos radiactivos en soluciones que contienen radiactividad a concentraciones que van desde aproximadamente 0,01 milicurie (mCi) a 100 mCi por ml.

Los agentes de formación de imágenes escintigráficas que son formadores de quelatos metálicos marcados con Tc-99m y conjugados quelante de metales/resto de direccionamiento de la invención pueden utilizarse para proporcionar imágenes útiles en el diagnóstico de muchos tipos de trastornos tales como cáncer, v.g. tumores gastrointestinales, mielomas, carcinoma de pulmón de células pequeñas y otros APUDomas, tumores endocrinos tales como carcinomas medulares tiroideos y tumores de hipófisis, tumores cerebrales tales como meningiomas y astrocitomas, y tumores de próstata, mama, colon y ovarios. Los agentes de formación de imágenes escintigráficas de la invención son útiles también para formación de imágenes de sitios de infección, trombosis, embolia pulmonar, inflamación, enfermedad de Alzheimer y ateroesclerosis, así como enfermedades de los pulmones, corazón, hígado, riñón, huesos y cerebro.

De acuerdo con esta invención, los agentes de formación de imágenes escintigráficas marcados con Tc-99m se administran en una dosis inyectable unitaria simple. Los agentes de formación de imágenes escintigráficas de la invención se pueden administrar por vía intravenosa en cualquier medio convencional para inyección intravenosa tal como un medio de solución salina acuosa, o en medio de plasma sanguíneo. Dicho medio puede contener también materiales adyuvantes farmacéuticos convencionales tales como, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la presión osmótica, tampones, conservantes y análogos. Entre los medios preferidos se encuentran solución salina normal y plasma. Generalmente, la dosis unitaria a administrar tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a aproximadamente 100 mCi, preferiblemente 1 mCi a 20 mCi. La solución a inyectar en la dosis unitaria es de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml. Ventajosamente, la dosis se administra por vía intravenosa, pero pueden utilizarse otras vías, v.g. la vía intraarterial. Después de la administración, la formación de imágenes de la región de interés puede tener lugar en cuestión de unos pocos minutos. Sin embargo, la formación de imágenes puede tener lugar, en caso deseado, en horas o incluso en un tiempo más largo, después de la inyección a los pacientes. En la mayoría de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulará en el área cuya imagen se desea obtener dentro de aproximadamente 0,1 de una hora para permitir la realización de fotografías escintigráficas. Cualquier método convencional de formación de imágenes escintigráficas para propósitos diagnósticos puede ser utilizado de acuerdo con esta invención.

La invención proporciona también agentes radioterapéuticos que son formadores de quelatos metálicos marcados con Re-186, Re-188 o Sn-117m o conjugados quelante de metales/resto de direccionamiento de la invención para tratamiento de condiciones patológicas en el cuerpo de un mamífero. Los complejos de estaño se preparan simplemente por reacción de un quelante de metales o conjugado quelante de metales/resto de direccionamiento de la invención con una sal estannosa radiactiva. Los complejos de renio se preparan esencialmente del mismo modo que los complejos de tecnecio-99m como se ha descrito anteriormente y en el Ejemplo 2 más adelante. Específicamente, los complejos de renio se preparan bien sea por reacción de perrenato en presencia del ligando quelante o por reacción de renio pre-reducido tal como oxotetrabromorrenato con el quelante de metales o el conjugado quelante de metales/resto de direccionamiento de la invención. Para propósitos terapéuticos, los complejos de renio-186, renio-188, o Sn-117m se proporcionan en dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mCi, preferentemente de 1 a 20 mCi.

Los métodos para fabricación y marcación de estos compuestos se ilustran más plenamente en los ejemplos que siguen. Estos ejemplos ilustran ciertos aspectos de los métodos descritos anteriormente y sus resultados ventajosos. Estos ejemplos se muestran por vía de ilustración y no con carácter de limitación.

Ejemplo 1 Síntesis de péptidos en fase sólida

La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) se llevó a cabo en una escala de 0,25 milimoles (mmol) utilizando un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 431A y empleando protección del termino amino con 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), copulación con diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol o 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluroniohexafluoro- fosfato/hidroxibenzotriazol (HBTU/HOBT), y utilizando p-hidroximetilfenoxi-metilpoliestireno (HMP) o resina Sasrin™ para los ácidos del término carboxilo o resina amídica de Rink para las amidas del término carboxilo.

Se preparó la homocisteína (Hcy) por hidrólisis alcalina de L-homocisteína-lactona o por reducción de homocistina utilizando sodio metálico en amoniaco líquido. Se prepararon Fmoc.Hcy(S-tritilo) y Fmoc.Pen(S-tritilo) a partir de los aminoácidos precursores apropiados por tritilación con trifenilmetanol en ácido trifluoroacético, seguido por derivatización con Fmoc como ha sido descrito por Atherton et al. (1989, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press: Oxford). Los derivados de tirosina con 4-piperidinil-butil-éter (Y[(CH_{2})_{4}-piperidina]) se prepararon por SPPS a partir de Fmoc-tirosina-(4-Boc-piperidina-butil-éter). Se preparó Fmoc-S-(3-Boc-aminopropil)cisteína a partir de L-cisteína y bromuro de Boc-aminopropilo en metóxido de sodio metanólico seguido por tratamiento con O-9-fluorenilmetil-O'-N-succinimidil-carbonato (FmocOSu) a pH 10. Se preparó 4-amidinofenilalanina (Amp) como se describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT, del mismo propietario y también en tramitación, No. de Serie PCT/US/94/03878, que se incorpora por referencia.

En caso apropiado, se introdujeron grupos 2-haloacetilo utilizando el ácido 2-haloacético apropiado como el último resto a copular durante la SPPS o por tratamiento del grupo amino libre en el terminal N del péptido fijado a la resina con ácido 2-haloacético/diisopropilcarbo-diimida/N-hidroxisuccinimida en NMP o anhídrido 2-halo-acético/diisopropiletilamina en NMP.

En caso apropiado, los péptidos 2-haloacetilados se sometieron a ciclación por agitación de una solución de 0,1-1,0 mg/ml en tampón de fosfato o bicarbonato o hidróxido de amonio diluido (pH 8) que contenía EDTA 0,5-1,0 mM durante 4-48 horas, seguido por acidificación con ácido acético, liofilización y purificación por HPLC.

En caso apropiado, los péptidos que contenían tiol se hicieron reaccionar con restos formadores de complejos con Tc-99m que contenían cloroacetilo y protegidos en el grupo tiol a pH 10 durante 0,5-4 horas a la temperatura ambiente, seguido por acidificación con ácido acético y evaporación de la solución para dar el aducto péptido-sulfuro correspondiente. La desprotección y purificación se realizaron rutinariamente como se ha descrito para producir el conjugado formador de quelato-péptido.

Los péptidos fijados a la resina Sasrin™ se escindieron utilizando una solución de TFA al 1% en diclorometano para dar el péptido protegido. En caso apropiado, los precursores de los péptidos protegidos se sometieron a ciclación entre los términos amino y carboxilo por reacción de la amina libre del terminal amino y el ácido libre del terminal carboxilo utilizando difenilfosforilazida en péptidos nacientes en los cuales las cadenas laterales de aminoácido están protegidas.

Los productos fijados con HMP o resina amídica de Rink se escindieron rutinariamente y los péptidos ciclados que contenían cadenas laterales protegidas se desprotegieron utilizando una solución constituida por ácido trifluoroacético (TFA), o TFA y cloruro de metileno, que comprendía opcionalmente agua, tioanisol, etanoditiol y trietilsilano o triisopropilsilano en relaciones de 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2 durante 0,5-3 horas a la temperatura ambiente. En caso apropiado, los productos se sometieron de nuevo a tritilación en S en trifenolmetanol/TFA, y los grupos N-Boc se reintrodujeron en el péptido utilizando (Boc)_{2}O.

Los péptidos brutos se purificaron por cromatografía líquida preparativa a alta presión (HPLC) utilizando una columna Waters Delta-Pak C18 y elución en gradiente con TFA al 0,1% en agua modificada con acetonitrilo. Después de la elución de la columna, se evaporó el acetonitrilo de las fracciones eluidas, las cuales se liofilizaron a continuación. La identidad de cada producto así producido y purificado se confirmó por espectroscopia de masas con bombardeo por átomos rápidos (FABMS) o espectroscopia de masas por pulverización electrónica (ESMS).

Ejemplo 2 Método general para radiomarcación con Tc-99m

Se disolvió una muestra 0,1 mg de un agente formador de quelatos metálicos o conjugado agente formador de quelatos metálicos/resto de direccionamiento en 0,1 ml de agua, o etanol:agua 50:50, o solución salina tamponada con fosfato (PBS), o tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH = 5, 6 ó 7,4) o 10% (p/v) de hidroxipropilciclo-dextrina (HPCD) en agua. Se preparó gluceptato de Tc-99m por reconstitución de un vial Glucoscán (E.I. DuPont de Nemours, Inc., Wilmington, DE) con 1,0 ml de pertecnetato de Tc-99m-sodio que contenía hasta 200 mCi y se dejó en reposo durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Se añadieron luego 25 \mul de gluceptato de Tc-99m al agente formador de quelatos metálicos o conjugado agente formador de quelatos metálicos/resto de direccionamiento y se dejó que transcurriera la reacción a la temperatura ambiente durante 5-30 min y se filtró luego a través de un filtro de 0,2 \mum.

La pureza radioquímica del reactivo marcado con Tc-99m se determinó por HPLC utilizando las condiciones siguientes: una columna analítica Waters Delta-Pak RP-18, que tenía dimensiones de 5 \mum x 4,6 mm x 220 mm, se cargó con cada uno de los péptidos radiomarcados, los cuales se eluyeron luego a una velocidad de flujo del disolvente de 1 ml/min. La elución en gradiente se realizó a lo largo de 10-20 min utilizando un gradiente lineal que comenzaba con 100% de Disolvente A (0,1% TFA/agua) y terminaba con 100% de Solución B (0,1% TFA/90% acetonitrilo/agua). Los componentes radiactivos se detectaron por medio de un detector radiométrico en línea conectado a un registrador de integración. El gluceptato de Tc-99m y el pertecnetato de Tc-99m-sodio se eluyen entre 1 y 4 minutos en estas condiciones, mientras que el péptido marcado con Tc-99m se eluía al cabo de un tiempo mucho mayor.

Se prepararon complejos de renio no radiactivos por co-disolución de cada uno de los reactivos de la invención con aproximadamente un equivalente molar de oxotetra-bromorrenato de tetrabutilamonio (+5), preparado como ha sido descrito por Cotton et al. (1966), Inorg. Chem. 5: 9-16) en dimetilformamida o acetonitrilo/agua y se agitaron durante 0,5-5 días. Los complejos de renio se aislaron por HPLC en fase inversa como se ha descrito anteriormente para los péptidos marcados con Tc-99m, y se caracterizaron por FABMS o ESMS.

Los complejos de renio radiactivos, utilizando por ejemplo Re-186 o Re-188, se preparan a partir de las sales perrenato apropiadas utilizando el mismo protocolo que para marcación con Tc-99m, o por adición de un agente reductor a una solución del péptido y perrenato, o bien opcionalmente, utilizando un agente de transferencia de ligandos tal como citrato y sometiendo la reacción a incubación a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y 100ºC durante un tiempo comprendido entre 5 y 60 minutos.

La tabla siguiente ilustra la marcación eficaz con Tc-99m de péptidos preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 utilizando el método descrito en esta memoria.

(Tabla pasa a página siguiente)

16

17

18

19

20

** Los exponentes hacen referencia a las condiciones de marcación siguientes:

^{1} = en agua

^{2} = en HPCD al 10%

^{3} = en 50/50 etanol/agua

^{4} = en NaCl al 0,9%

^{5} = en agua llevada a pH 9 con NaHCO_{3}.

*** Métodos HPLC (indicados por el exponente después de R_{T}):

Disolvente A = TFA al 0,1% en agua

Disolvente B = TFA al 0,1%/CH_{3}CN en agua

Columna Waters-1 = Waters DeltaPak C18, 5 \mum, 39 mm x 150 mm (caudal: 1,2 ml/min)

Columna Waters-2 = Waters NovaPak Radial Compression C18, 4 \mum, 8 mm x 100 mm (caudal: 3 ml/min)

Columna Vydac = Vydac 218TP54 RP18, 5 \mum, 4,6 mm x 220 mm (caudal: 1 ml/min)

Método 1 = columna Waters-1, 100% solución A \rightarrow 100% solución B en 10 min

Método 2 = columna Vydac, 100% solución A \rightarrow 100% solución B en 10 min

Método 3 = columna Waters-2, 100% solución A \rightarrow 100% solución B en 10 min

Las abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos pueden encontrarse en G. Zubay, Biochemistry (segunda edición), 1988 (MacMillen Publishing: Nueva York) p. 33. El subrayado indica la formación de un enlace amida o tiol entre los aminoácidos o grupos derivados enlazados. Acm es acetamidometilo; Orn es ornitina; F_{D} es D-fenilalanina; Y_{D} es D-tirosina; W_{D} es D-triptófano; K_{D} es D-lisina; D_{D} es D-aspartato; Amp es 4-amidinofenil-alanina; Apc es L-(S-(3-aminopropil)cisteína); Hcy es homocisteína; Nal es 2-naftilalanina; Nal_{D} es D-2-naftilalanina; DPTA es ácido dietilenotriamina-pentaacético; Cpa es 4-clorofenilalanina; Aca es ácido 6-aminohexanoico; Abu es ácido aminoisobutírico; Trc es ácido tricarbalílico; Trc-imida es imida tricarbalílica; y Hca es hexacarboxiciclohexano. (...)_{2}K representa enlace covalente a ambos grupos amino de la lisina; Hcy(...) representa enlace covalente al átomo de azufre de la cadena lateral de homocisteína. (N-CH_{3})F representa N-\alpha-metil-fenilalanina. El subrayado entre grupos (v.g., como entre el grupo CH_{2}CO. y la cisteína (C) en CH_{2}CO.Y_{D}RGDC) representa un sulfuro cíclico. El subrayado entre aminoácidos (v.g., como entre las cisteínas (C) en CNPRGDC) representa un enlace disulfuro cíclico. El término "ciclo" antes de una secuencia subrayada significa una secuencia cíclica del término N al término C. El subíndice X_{D} indica que el aminoácido está en la configuración D; todos los restantes subíndices hacen referencia a grupos protectores de la cadena lateral de los aminoácidos.

Ejemplo 3 Ensayos de inhibición de la agregación plaquetaria

Se realizaron estudios de la agregación plaquetaria esencialmente como ha sido descrito por Zucker (1989, Methods in Enzymol. 169: 117-133). Resumidamente, se ensayó la agregación plaquetaria con o sin compuestos inhibidores de la agregación plaquetaria supuestos utilizando plasma humano reciente rico en plaquetas, que contenía 300.000 plaquetas por microlitro. La agregación plaquetaria se indujo por la adición de una solución de adenosina-difosfato a una concentración final de 10 a 15 micromolar, y se observó la extensión de la agregación plaquetaria utilizando un agregómetro Bio/Data (Bio/Data Corp., Horsham, PA). Las concentraciones de los compuestos inhibidores de la agregación plaquetaria utilizadas variaban desde 0,1 a 500 \mug/ml. La concentración de inhibidor que reducía la extensión de la agregación plaquetaria en un 50% (definida como el valor CI_{50}) se determinó a partir de gráficas de concentración de inhibidor frente a extensión de la agregación plaquetaria. Se determinó una curva de inhibición para el péptido RGDS para cada lote de plaquetas ensayado como control positivo.

Se ensayaron los reactivos peptídicos siguientes en el ensayo anterior:

21

Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla II (RGDS se da como un control positivo):

TABLA II

Péptido		CI_{50}*
P688		0,026
P748		0,029
P747		0,052
P687		0,079
P681		0,110
P667		0,110
* = \muM

(Las abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos pueden encontrarse en G. Zubay, Biochemistry (2ª edición), 1988 (MacMillen Publishing: Nueva York) p. 33 como se expone en la leyenda de la Tabla I.

Estos resultados demuestran que los reactivos peptídicos de la invención se fijan con alta afinidad a los receptores específicos GPIIb/IIIa in vitro.

Ejemplo 4 Formación de imágenes in vivo de trombosis venosa profunda utilizando un péptido de direccionamiento hacia trombos marcado con Tc-99m en un modelo canino

Perros cruzados [de 25-35 lb (11,3-15,9 kg), mantenidos en ayunas durante una noche] se sedaron con una combinación de quetamina y aceprozamina por vía intramuscular y se anestesiaron luego con pentobarbital sódico por vía intravenosa. Se insertó en cada animal un angiocatéter de calibre 18 en la mitad distal de la vena femoral derecha y se colocó una espiral de embolización de acero inoxidable entrelazada con Dacron® de 5 mm u 8 mm (Cook Co., Bloomington, IN) en la vena femoral aproximadamente hacia la mitad del fémur. Se retiró el catéter, se suturó la herida y se documentó la colocación de la espiral por rayos X. Se dejó luego que los animales se recuperaran durante una noche.

Al día siguiente de la colocación de la espiral, se anestesió de nuevo cada animal, se aplicaron goteos intravenosos de solución salina en cada pata delantera y se insertó un catéter en la vejiga urinaria para recoger la orina. Se colocó el animal en posición supina bajo una cámara gamma equipada con un colimador universal de baja energía y ajustada a la sensibilidad máxima para Tc-99m. Los péptidos de direccionamiento hacia trombos marcados con Tc-99m [185-370 mBq (5-10 mCi) Tc-99m, 0,2-0,4 mg de reactivo] se inyectaron cada uno en una línea intravenosa en la pata delantera en su punto de inserción. La segunda línea se mantuvo para la recogida de la sangre.

La formación de imágenes con la cámara gamma se inició simultáneamente con la inyección. Se adquirieron las imágenes anteriores del corazón como un estudio dinámico (adquisiciones de imagen cada 10 s) durante los 10 primeros minutos, y luego como imágenes estáticas al cabo de 1, 2, 3 y 4 h post-inyección. Se adquirieron imágenes anteriores de las patas para 500.000 recuentos o 20 min (lo que sea más corto), a aproximadamente 10-20 min, y a aproximadamente 1, 2, 3 y 4 h post-inyección. Las imágenes de las patas se recogieron con una pantalla de plomo situada sobre la vejiga.

Después de la recogida de la imagen final, cada animal se anestesió profundamente con pentobarbital. Se recogieron dos muestras de sangre utilizando una jeringa heparinizada, seguido por una dosis de solución saturada de cloruro de potasio que provocó la eutanasia, administrada por inyección intercardiaca o de bolo intravenoso. La vena femoral que contenía el trombo, una sección similar de vena de la pata contralateral (control), secciones del vaso proximales al trombo y muestras del músculo del muslo se sometieron luego a disección cuidadosamente. El trombo, la espiral y las fibras de Dacron® de la espiral se sometieron luego a disección para liberarlos del vaso. Se separaron el trombo, las muestras de vaso lavadas con solución salina, la espiral y las fibras de Dacron® de la espiral, y se puso cada muestra en un tubo de ensayo previamente pesado. Se pesaron las muestras y se sometieron a recuento en un contador gamma de pocillo en el canal de Tc-99m, junto con fracciones conocidas de las dosis inyectadas.

Se determinaron el peso del trombo reciente, el porcentaje de dosis inyectada (% DI)/g en el trombo y la sangre obtenida inmediatamente antes de la eutanasia, así como las relaciones trombo/sangre y trombo/músculo. A partir de las imágenes almacenadas en el ordenador, se determinaron las relaciones trombo/ruido de fondo por análisis de los cómputos/píxel medidos en regiones de interés (ROI) trazadas a lo largo del trombo y el músculo adyacente.

Los resultados representativos se muestran en la tabla III. Los péptidos se identifican por un número, correspondiente a la estructura química que se muestra en la Tabla II. Estos resultados muestran que todos y cada uno de estos péptidos representativos son útiles como agentes de formación de imágenes escintigráficas eficientes in vivo cuando se marcan con Tc-99m, se administran y se utilizan en la formación de imágenes como se describe en esta memoria.

TABLA III

Péptido	% DI/g Trombo	Trombo/Sangre	Trombo/Músculo
P748	0,034	5,8	90
P747	0,043	15	70
P667	0,006	5,9	30

Ejemplo 5 Localización y formación de imágenes in vivo de la placa ateroesclerótica utilizando agentes de formación de imágenes escintigráficas marcados con Tc-99m en un modelo de conejo hipercolesterolémico

Conejos Blancos de Nueva Zelanda (NZW) de ambos sexos y que pesan 2-3 kg se dividen en dos grupos. El grupo de control está constituido por 6 conejos que se alojan y alimentan con comida comercial para conejos (Purina). El grupo HC se alimenta con una dieta estándar, rica en colesterol (comida para conejos mezclada con una concentración de 1% p/p de colesterol) desde las siete semanas a las 28 semanas de edad. Todos los animales reciben agua ad libitum.

Se preparan agentes de formación de imágenes de la placa ateroesclerótica marcados con Tc-99m como se ha descrito anteriormente. Se marcan aproximadamente 1000 \mug de péptido con 100-200 mCi de Tc-99m y se preparan en dosis unitarias de 5-10 mCi (12,5-20,0 \mug/conejo; 6-7 \mug/kg) en un volumen de 0,5-2 ml. Los conejos adultos se dosifican con cada uno de los agentes de formación de imágenes marcados con Tc-99m por vía intravenosa en una vena lateral de la oreja por infusión de bolus lenta (aproximadamente 0,1 ml/min). Se adquieren las fotografías escintigráficas utilizando una cámara gamma provista de un colimador de orificio pequeño (abertura de 5 mm) y ventana de energía ajustada para Tc-99m y programada para acumular 500.000 cómputos o escaneo durante un tiempo deseado. Poco tiempo antes de la obtención de las imágenes, se anestesian los animales con una mezcla de quetamina y xilazina (5:1, 1 ml/kg por vía intramuscular).

Las imágenes de la cámara gamma se recogen a 40º-45º inmediatamente por encima del corazón (vista oblicua anterior izquierda [LAO]) para delinear el arco aórtico y examinar la aorta descendente. Se adquieren imágenes al cabo de 15 min y 2 h después de la inyección. Se inyecta anestesia suplementaria en caso necesario antes de cada recogida de imagen.

Al cabo de 2,5 h (después de un barrido de 2 h), se sacrifican los animales con una dosis intravenosa de pentobarbital sódico. En la necropsia, se extirpa la aorta y se efectúa luego la disección de los vasos de ramificación para dejarlos libres desde la válvula aórtica a la región medio-abdominal. Utilizando un colimador de aberturas paralelas, se obtiene la imagen de la aorta ex corpora. Como control, se abren las aortas longitudinalmente y se tiñen con Sudan IV, con lo que la placa ateroesclerótica se vuelve de un color rojo ladrillo intenso. En contraste, el endotelio aórtico exento de lípidos y no lesionado retiene su aspecto normal, blanco-rosado y brillante en estas condiciones. Así pues, este protocolo puede utilizarse para confirmar inequívocamente la presencia de placa ateroesclerótica detectada utilizando los agentes de formación de imágenes escintigráficas de la invención.

Ejemplo 6 Formación de imágenes escintigráficas y biodistribución de los agentes de direccionamiento hacia infección Tc-99m en un modelo de infección animal

Conejos Blancos de Nueva Zelanda (NZW) de ambos sexos y que pesaban 2-3 kg se inocularon por vía intramuscular en la parte superior de la pata izquierda con una cepa potente de Escherichia coli. Después de 24 horas, se sedaron los animales por inyección intramuscular de quetamina y xilazina y se inyectaron luego con el agente de direccionamiento hacia la infección marcado con Tc-99m (2-10 mCi, \leq 150 \mug). Los animales se colocaron luego en posición supina en el campo visual de una cámara gamma (colimador LEAP/ajustado a la sensibilidad máxima para Tc-99m) para la obtención de las imágenes. Se sometieron los animales a la formación de imágenes a lo largo de la primera hora post-inyección, y luego a intervalos de aproximadamente 1 hora durante las tres horas siguientes. Se dejó que se recuperaran los animales entre las adquisiciones de imágenes y se anestesiaron de nuevo en caso necesario.

Una vez completada la formación final de las imágenes, se sacrificó cada animal con una sobredosis intravenosa de pentobarbital sódico, y se efectuó luego la disección para obtener muestras de sangre y de tejido infectado y tejido de control. Se pesaron las muestras de tejido y se sometieron a recuento utilizando un contador de radiación gamma; una cantidad estándar de la dosis inyectada se sometió a recuento en paralelo con cada muestra como control. A partir de estos datos se determinó el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido que quedaba en cada muestra de tejido. Se calcularon luego para cada péptido las relaciones de porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido infectado frente a tejido muscular no infectado, y de tejido muscular infectado frente a sangre, a fin de demostrar la localización específica de los agentes radiomarcados de formación de imágenes escintigráficas de la invención.

\newpage

Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla IV. Estos resultados demuestran que estos agentes representativos son útiles como agentes de formación de imágenes escintigráficas para detectar sitios de inflamación en el cuerpo de un mamífero.

22

Ejemplo 7 Inhibición de la fijación de [^{125}I-Tyr^{11}]somatostatina-14 a las membranas de células de tumor pancreático AR42J de la rata

Se demostró la capacidad de diversos análogos de somatostatina de la invención para fijarse a receptores de somatostatina in vitro en un ensayo de inhibición mediada por los reactivos peptídicos de la fijación de un análogo de somatostatina radiomarcado a membranas de células que contienen receptores de somatostatina.

La línea de células del tumor pancreático AR42J de rata que expresaba receptores de somatostatina se cultivó en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) y glutamina 8 mM en una atmósfera con 5% CO_{2} humidificada a 37ºC. Las células recogidas se homogeneizaron en tampón frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4), y el homogeneizado se centrifugó luego a 39.000 g durante 10 min a 4ºC. Los sedimentos se lavaron una sola vez con tampón y se resuspendieron luego en tampón Tris-HCl 10 mM enfriado en hielo (pH 7,4). Partes alícuotas iguales de esta preparación de membranas celulares se incubaron luego con [^{125}I-Tyr^{11}]somatostatina-14 (Amersham, Arlington Heights, IL) a una concentración final de 0,5 nM a 750.000 cpm/ml, actividad específica 2000 Ci/mmol y un péptido o complejo péptido-renio de la invención (a una concentración final comprendida entre 10^{-11} y 10^{-6} M en tampón HEPES 50 mM, pH 7,4, que contenía 1% de seroalbúmina bovina, MgCl_{2} 5 mM, 0,02 mg/ml de bacitracina, 0,02 mg/ml de fluoruro de fenilmetil-sulfonilo y 200.000 UI de Trasylol) durante 25 min a 30ºC.

Después de la incubación, esta mixtura de membrana se filtró a través de un filtro GC/F lavado con polietilenimina (Whatman Ltd., Maidstone, Inglaterra) utilizando un distribuidor de filtración, y el residuo que quedaba en el filtro se lavó tres veces con 5 ml de tampón HEPES frío. El filtro y una muestra de los lavados del filtro se sometieron luego a recuento en un contador gamma. Para evaluar la fijación inespecífica, el ensayo se realizó también esencialmente como se ha descrito en presencia de 200 mg de somatostatina-14 sin marcar. El análisis de los datos incluía gráficas Hill de los datos para obtener las constantes de inhibición como ha sido descrito por Bylund y Yamamura (1990, Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis, Yamamura et al., eds., Raven Press, N.Y.).

Se ensayaron los péptidos siguientes:

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Los resultados obtenidos utilizando este ensayo con los reactivos de la invención son como sigue:

TABLA V

Péptidos		K_{i} (nM)
P487		0,65
P498		1,3
P398		1,4
P524		2,0
P468		2,0
P545		2,6
P544		2,7
P548		3,6
P591		4,2

Estos resultados demuestran que los reactivos peptídicos de la invención se fijan con alta afinidad a los receptores de somatostatina in vitro.

Ejemplo 8 Localización y formación de imágenes in vivo de tumores que expresan receptores de somatostatina (SSTR) en ratas

La formación de imágenes in vivo de receptores de somatostatina expresados por células tumorales de rata se realizó esencialmente como ha sido descrito por Bakker et al. (1991, Life Sciences 49: 1593-1601).

Células de tumor pancreático de rata CA20948, descongeladas a partir de una papilla de tumor recogido congelada, se implantaron por vía intramuscular en el muslo posterior derecho de ratas Lewis de 6 semanas de edad en una suspensión de 0,05 a 0,1 ml/animal. Se dejaron crecer los tumores hasta aproximadamente 0,5 a 2 g, se recogieron, y se utilizó la papilla de tumor para implantar una segunda serie de ratas Lewis que no habían recibido tratamiento alguno. Se repitió el sometimiento a pasos de esta manera para producir generaciones sucesivas de animales portadores del tumor. Los animales portadores del tumor utilizados para los estudios in vivo se seleccionaron usualmente del paso tercero al quinto y eran portadores de tumores de 0,2 a 2 g.

Para estudios de la especificidad de localización del radiotrazador en los tumores, los animales seleccionados recibieron una dosis subcutánea bloqueante de los SSTR (4 mg/kg) de octreotide, 30 minutos antes de la inyección del radiotrazador. (Ha sido demostrado por Bakker et al. que este protocolo da como resultado una disminución de un 40% de la absorción de ^{111}In-[DPTA]octreotide en el tumor).

Se aislaron ratas Lewis portadoras del tumor CA20948 del tercero al quinto paso y se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena dorsal del rabo con una dosis de 0,15-0,20 mCi de un agente de formación de imágenes de direccionamiento hacia SSTR marcado con ^{99m}Tc (correspondiente a 3 a 8 \mug de péptido en 0,2 a 0,4 ml).

Al cabo de tiempos seleccionados, se sacrificaron los animales por dislocación cervical y se realizó una necropsia seleccionada. Las muestras de los tejidos recogidos se pesaron y se sometieron a recuento junto con una parte alícuota de la dosis inyectada en un contador gamma de pocillo.

Los resultados de biodistribución durante 90 minutos de los péptidos radiomarcados seleccionados se presentan en la Tabla VI. Particularmente, ^{99m}Tc-P832, ^{99m}Tc-P829, y ^{99m}Tc-P773 exhibían una absorción en el tumor y relaciones tumor/sangre muy altas que demostraban su alta absorción específica en el tejido diana (tumor). Estos resultados demuestran que pueden utilizarse agentes de formación de imágenes escintigráficas representativos de la invención para localizar el sitio de células neoplásticas que expresan los receptores de somatostatina in vivo, y por consiguiente tienen eficacia como agentes radiodiagnósticos y radioterapéuticos del cáncer.

Debe entenderse que la descripción que antecede resalta ciertas realizaciones específicas de la invención, y que todas las modificaciones o alternativas equivalentes a ellas están dentro del espíritu y alcance de la invención como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

(Tabla pasa a página siguiente)

24

Claims (21)

1. Un reactivo para preparar un agente radiofarmacéutico que es un formador de quelatos metálicos que contiene monoamina, diamida y tiol enlazado covalentemente a un resto de direccionamiento, con la salvedad de que el reactivo no es ninguna de las estructuras siguientes:

25

2. Un reactivo de la reivindicación 1, en el cual el formador de quelatos metálicos se selecciona de:

(i) un grupo que tiene la fórmula:

26

y

(ii) un grupo que tiene la fórmula:

27

en las cuales

n, m y p son cada uno independientemente 0 ó 1,

cada R' es independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo (C_{2}-C_{4}), o alcoxialquilo (C_{2}-C_{4});

cada R es independientemente H o R'', donde R'' es alquilo inferior sustituido o insustituido o fenilo que no comprende un grupo tiol;

uno de R o R' es L, en el cual, cuando un R' es L, -NR'_{2} es una amina; y

L es un grupo enlazador bivalente que enlaza el formador de quelatos metálicos al resto de direccionamiento, y opcionalmente L comprende un aminoácido o un péptido que contiene de 2 a aproximadamente 20 aminoácidos.

3. Un reactivo de la reivindicación 2 en el cual, o bien

(a) el formador de quelatos metálicos tiene la fórmula:

28

en la cual:

R^{1} y R^{2} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo (C_{2}-C_{4}) o alcoxialquilo (C_{2}-C_{4});

R^{3}, R^{4}, R^{5}, y R^{6} son independientemente H, alquilo inferior sustituido o insustituido, o fenilo que no comprende un grupo tiol;

R^{7} y R^{8} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo inferior o alcoxialquilo inferior;

L es un grupo de enlace bivalente; y

Z es un resto de direccionamiento; o

(b) el formador de quelatos metálicos tiene la fórmula:

29

en la cual:

R^{1} y R^{2} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo (C_{2}-C_{4}), o alcoxialquilo (C_{2}-C_{4});

R^{3}, R^{4}, R^{5}, y R^{6} son independientemente H, alquilo inferior sustituido o insustituido, o fenilo que no comprende un grupo tiol; y uno de R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} es Z-L-(CR_{2})_{n}-, donde n es un número entero de 1 a 6 y cada R es independientemente H, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido;

R^{7} y R^{8} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo inferior o alcoxialquilo inferior;

L es un resto de enlace bivalente;

Z es un resto de direccionamiento; y

X es -NH_{2}, -NR^{1}R^{2}, o -NR^{1}-Y, donde Y es un aminoácido, una amida de aminoácido, o un péptido de 2 a aproximadamente 20 aminoácidos; o

(c) el formador de quelatos metálicos tiene la fórmula:

30

en la cual:

R^{1} y R^{2} son cada uno independientemente H, alquilo inferior, hidroxilo (C_{2}-C_{4}) o alcoxialquilo (C_{2}-C_{4});

R^{3}, R^{4}, R^{5}, y R^{6} son independientemente H, alquilo inferior sustituido o insustituido, o fenilo que no comprende un grupo tiol;

n es un número entero de 1 a 6;

L es un resto formador de enlace bivalente; y

Z es un resto de direccionamiento; o

(d) el formador de quelatos metálicos tiene la fórmula:

31

en la cual:

L es un grupo enlazador; y

Z es un resto de direccionamiento.

4. Un reactivo de la reivindicación 2 en el cual, o bien:

(a) el formador de quelatos metálicos se selecciona de:

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-cisteína-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-isocisteína-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-homocisteína,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-penicilamina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-2-mercaptoetil-amina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-2-mercaptopropil-amina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-2-mercapto-2-metil-propilamina-,

(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-3-mercaptopropil-amina-,

en los cuales:

(aminoácido) es un \alpha- o \beta-aminoácido primario que no comprende un tiol, y en el cual el grupo quelante está unido a un resto de direccionamiento por la vía de un enlace covalente con el término carboxilo del grupo quelante o una cadena lateral en uno de los grupos aminoácidos; en los cuales opcionalmente (aminoácido)^{1} es un \alpha,\omega- o \beta,\omega-diaminoácido en el cual la \alpha- o \beta-amina es un amina libre; o

(b) el formador de quelatos metálicos se selecciona de:

-cisteína-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

-isocisteína-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

-homocisteína-(aminoácido)-(\alpha,\beta-o \beta,\gamma-diaminoácido);

-penicilamina-(aminoácido)-(\alpha,\beta-o \beta,\gamma-diaminoácido);

ácido 2-mercaptoacético-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-di-aminoácido);

ácido 2- o 3-mercaptopropiónico-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

ácido 2-mercapto-2-metilpropiónico-(aminoácido)-(\alpha,\beta- o \beta,\gamma-diaminoácido);

en los cuales

(aminoácido) es un \alpha o \beta aminoácido primario que no comprende un tiol; y en los cuales el grupo quelante está unido a un resto de direccionamiento por la vía de un enlace covalente con el término amino del grupo quelante o una cadena lateral en uno de los grupos aminoácido que comprenden el grupo quelante; o

(c) el grupo quelante tiene una fórmula seleccionada de:

Gly-Gly-Cys-

Arg-Gly-Cys-

-(\epsilon-Lys)-Gly-Cys-

-(\delta-Orn)-Gly-Cys-

-(\gamma-Dab)-Gly-Cys-

y

-(\beta-Dap)-Gly-Cys-

5. Un reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el resto de direccionamiento es un péptido de fijación específica constituido por aproximadamente 3 a aproximadamente 45 aminoácidos, opcionalmente en el cual el péptido de fijación específica está fijado a un receptor de somatostatina o a un receptor GPIIb/IIIa.

6. Una composición de la reivindicación 5 seleccionada de:

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7. Un agente de formación de imágenes escintigráfica para formación de imágenes de sitios en el cuerpo de un mamífero, que es una composición de materia de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 radiomarcada con un radioisótopo seleccionado de tecnecio-99m y cobre-64.

8. Un método para preparar un agente de formación de imágenes escintigráfica para formación de imágenes de sitios en el cuerpo de un mamífero, que comprende o bien hacer reaccionar un reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 con tecnecio-99m en presencia de un agente reductor, v.g. ion estannoso, o bien hacer reaccionar el reactivo con Tc-99m en el cual Tc-99m se encuentra en forma reducida.

9. Un método para preparar un reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual el reactivo se sintetiza por síntesis de péptidos en fase sólida.

10. Un estuche para preparar una preparación radiofarmacéutica, comprendiendo dicho estuche un vial herméticamente cerrado que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar dicho reactivo con Tc-99m.

11. El uso de un reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un agente de la reivindicación 7 en la fabricación de un medicamento para formación de imágenes de un sitio diana en el cuerpo de un mamífero.

12. Un agente radioterapéutico que comprende un reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 radiomarcado con un radionucleido seleccionado del grupo constituido por Re-186, Re-188, Sn-117m, y Cu-67.

13. Una composición de materia que comprende un formador de quelatos metálicos que contiene monoamina, diamida, y tiol, seleccionado de:

(i) un grupo que tiene la fórmula:

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o

(ii) un grupo que tiene la fórmula:

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en las cuales

n, m y p son cada uno independientemente 0 ó 1,

cada R' es independientemente H, alquilo inferior, hidroxialquilo (C_{2}-C_{4}), o alcoxialquilo (C_{2}-C_{4});

cada R es independientemente H o R'', donde R'' es alquilo inferior sustituido o insustituido o fenilo que no comprende un grupo tiol;

uno de R o R' es L, en el cual, cuando un R' es L, -NR'_{2} es una amina; y

L es un grupo enlazador bivalente que enlaza el formador de quelatos al resto de direccionamiento.

14. Una composición de materia de acuerdo con la reivindicación 13, en la cual el formador de quelatos metálicos está complejado con un metal seleccionado de renio-186, renio-188, cobre-67, estaño-117m, tecnecio-99m o cobre-64.

15. Un agente radiofarmacéutico que comprende la composición de materia de la reivindicación 14.

16. Una composición de materia que comprende, en combinación, un formador de quelatos metálicos que contiene monoamina, diamida y tiol enlazado covalentemente con un resto de direccionamiento,

con la salvedad de que el formador de quelatos enlazado covalentemente al resto de direccionamiento no forma ninguna de las estructuras siguientes:

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17. Una composición de materia de acuerdo con la reivindicación 16, en la cual el formador de quelatos metálicos está complejado con un metal que, o bien se selecciona de renio, cinc, cobre, estaño, opcionalmente renio-186, renio-188, cobre-67 o estaño-117m, o bien dicho metal es tecnecio-99m o cobre-64.

18. Un agente radiofarmacéutico que comprende una composición de materia de la reivindicación 17.

19. El uso de un reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un agente de la reivindicación 12 en la fabricación de un medicamento radioterapéutico.

20. El uso de una composición de materia de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, o de un agente de la reivindicación 15, o de una composición de materia de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, o de un agente de la reivindicación 18, en la fabricación de un medicamento radiofarmacéutico.

21. Un reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un agente de la reivindicación 7, un agente de la reivindicación 12, una composición de materia de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, o una composición de materia de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, para uso en cada caso como producto farmacéutico.