ES2274517T3 - Conjugados de peptido-quelato metalico que se unen a la somatostatina. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A AGENTES DE DIAGNOSTICO Y RADIODIAGNOSTICO, INCLUYENDO AGENTES DE VISUALIZACION ESCINTOGRAFICAS RADIOETIQUETADAS, Y AGENTES TERAPEUTICOS Y RADIOTERAPEUTICOS. LA INVENCION PROPORCIONA ESTOS AGENTES Y REACTIVOS PARA PREPARAR LOS AGENTES MENCIONADOS Y METODOS PARA PRODUCIR Y USAR ESTOS REACTIVOS. ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION PROPORCIONA AGENTES DE VISUALIZACION RADIOETIQUETADOS Y AGENTES DE VISUALIZACION ETIQUETADOS NO RADIACTIVAMENTE PARA VISUALIZAR LUGARES CORPORALES DE MAMIFEROS Y REACTIVOS PARA PREPARAR ESTOS AGENTES DE VISUALIZACION. LA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA AGENTES TERAPEUTICOS RADIOETIQUETADOS, Y REACTIVOS Y METODOS PARA PREPARAR ESTOS AGENTES. LOS AGENTES Y REACTIVOS PROPORCIONADOS INCLUYEN UN PEPTIDO DE UNION ESPECIFICO, ENLAZADO COVALENTEMENTE A UNA MITAD CON UN COMPLEJO DE ION METALICO. SE MUESTRAN REACTIVOS, METODOS Y EQUIPOS PARA CONSEGUIR ESTOS REACTIVOS, METODOS PARA ETIQUETAR DICHOS REACTIVOS, Y METODOS PARA USAR ESTOS REACTIVOS.

Description

Conjugados de péptido-quelato metálico que se unen a la somatostatina.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a agentes terapéuticos, a agentes radioterapéuticos, a agentes de radiodiagnóstico, y a agentes de diagnóstico no radioactivos, y a métodos para producir tales agentes de diagnóstico y terapéuticos. La invención también se refiere a péptidos cíclicos que se unen específicamente a receptores de somatostatina expresados en la superficie de células de mamíferos, particularmente células de mamíferos neoplásicas o metastásicas. La invención, en un aspecto, se refiere a agentes formadores de imágenes grammagráficos para formar imágenes de sitios en un cuerpo de un mamífero. A este respecto, los agentes formadores de imágenes comprenden un péptido de unión específica, que se une específicamente in vivo a células que expresan el receptor de somatostatina, marcado con tecnecio-99m (Tc-99m) vía un resto de unión a marcador radioactivo, que forma un complejo con Tc-99m. En otro aspecto, la invención proporciona agentes formadores de imágenes radioyodados. La invención también proporciona agentes terapéuticos, incluyendo agentes radioyodados, complejos de metal radioactivo-reactivo y complejos de metal no radioactivo-reactivo, todos los cuales tienen utilidad terapéutica. La invención proporciona reactivos para preparar cada una de las realizaciones de diagnóstico y terapéuticas de los agentes de diagnóstico y terapéuticos de la invención, las realizaciones radiomarcadas y los complejos metálicos no radioactivos de los mismos, métodos para radiomarcar dichos reactivos, y kits que comprenden realizaciones no radioactivas de los reactivos de la invención, y otros componentes
para la preparación conveniente de agentes de diagnóstico y terapéuticos radiomarcados de la invención.

2. Descripción de la técnica anterior

La somatostatina es un tetradecapéptido que se produce endógenamente por el hipotálamo y el páncreas en seres humanos y otros mamíferos. El péptido tiene la fórmula:

Fórmula I

1

(Se pueden encontrar abreviaturas de una sola letra para aminoácidos en la publicación Biochemistry, de G. Zubay (2ª ed.), 1988, (MacMillan Publishing: Nueva York), pág. 33). Este péptido ejerce una amplia variedad de efectos biológicos in vivo. Se sabe que actúa fisiológicamente sobre el sistema nervioso central, el hipotálamo, el páncreas y el tubo digestivo.

La somatostatina inhibe la liberación de insulina y de glucagón procedentes del páncreas, inhibe la liberación de la hormona del crecimiento procedente del hipotálamo, y reduce las secreciones gástricas. Por lo tanto, la somatostatina presenta aplicaciones clínicas y terapéuticas para el alivio de cierto número de dolencias y enfermedades, tanto en seres humanos como en otros animales. La somatostatina nativa presenta una utilidad limitada, sin embargo, debido al corto tiempo de semivida in vivo, en que es degradada rápidamente por peptidasas. Por esta razón, se han desarrollado en la técnica anterior análogos de somatostatina que presentan una estabilidad mejorada in vivo.

Freidinger, en la patente U.S. nº 4.235.886, da a conocer análogos de somatostatina hexapeptídicos cíclicos que son útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.

Coy y Murphy, en la patente U.S. nº 4.485.101, dan a conocer análogos de somatostatina dodecapeptídicos sintéticos.

Freidinger, en la patente U.S. nº 4.611.054, da a conocer análogos de somatostatina hexapeptídicos cíclicos que son útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.

Nutt, en la patente U.S. nº 4.612.366, da a conocer análogos de somatostatina hexapeptídicos cíclicos que son útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.

Coy et al., en la patente U.S. nº 4.853.371, dan a conocer análogos de somatostatina octapeptídicos sintéticos.

Coy y Murphy, en la patente U.S. nº 4.871.717, dan a conocer análogos de somatostatina heptapeptídicos sintéticos.

Coy et al., en la patente U.S. nº 4.904.642, dan a conocer análogos de somatostatina octapeptídicos sintéticos.

Taylor et al., en la patente U.S. nº 5.073.541, dan a conocer un procedimiento para el tratamiento del cáncer pulmonar microcítico.

Brady, en la Solicitud de Patente Europea nº 83111747.8, da a conocer análogos de somatostatina hexapeptídicos dicíclicos que son útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.

Bauer et al., en la Solicitud de Patente Europea nº 85810617.2, dan a conocer derivados de somatostatina que son útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.

Eck y Moreau, en la Solicitud de Patente Europea nº 90302760.5, dan a conocer análogos de somatostatina octapeptídicos terapéuticos.

Coy y Murphy, en la Solicitud de Patente Internacional nº PCT/US90/07074, dan a conocer análogos de somatostatina para usos terapéuticos.

Schally et al., en la Solicitud de Patente Europea nº EPA 911048445.2, dan a conocer péptidos cíclicos para uso terapéutico.

Bodgen y Moreau, en la Solicitud de Patente Internacional nº PCT/US92/01027, dan a conocer composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades cutáneas proliferativas.

La somatostatina ejerce sus efectos uniéndose a receptores específicos expresados en la superficie celular de células que constituyen el sistema nervioso central, el hipotálamo, el páncreas y el tubo digestivo. Se ha encontrado que estos sitios de unión de somatostatina de alta afinidad están abundantemente expresados en la superficie celular de la mayoría de los tumores con actividad endocrina que surgen a partir de dichos tejidos.

Frecuentemente, es ventajoso desde el punto de vista clínico, para un médico, ser capaces de localizar el sitio de estados patológicos en un paciente, usando un medio no invasivo. Tales estados patológicos incluyen enfermedades de los pulmones, del corazón, del hígado, de los riñones, de los huesos y del cerebro, así como cáncer, trombosis, embolia pulmonar, infección, inflamación y aterosclerosis.

En el campo de la medicina nuclear, ciertos estados patológicos se localizan, o su grado se evalúa, detectando la distribución de pequeñas cantidades de compuestos trazadores marcados radioactivamente administrados internamente (denominados radiotrazadores o compuestos radiofarmacéuticos). Los métodos para detectar estos compuestos radiofarmacéuticos son conocidos generalmente como métodos formadores de imágenes o de radioimágenes.

En la formación de radioimágenes, el marcador radioactivo es un radionúclido que emite radiación gamma, y el radiotrazador se localiza usando una cámara que detecta radiación gamma (este proceso se denomina a menudo como gammagrafía). El sitio del que se toma la imagen es detectable debido a que el radiotrazador se escobe para ser localizado en un sitio patológico (denominado contraste positivo), o, como alternativa, el radiotrazador se escoge específicamente para no ser localizado en tales sitios patológicos (denominado contraste negativo). En muchas situaciones, es una ventaja particular usar, como radiofármaco, un compuesto de unión específica radiomarcado, que localiza específicamente al sitio patológico in vivo.

Por ejemplo, la expresión de sitios de unión de elevada afinidad por somatostatina es un marcador para ciertas células tumorales, y se puede explotar la unión específica con somatostatina para localizar e identificar tales células tumorales in vivo.

Se conocen en la técnica anterior procedimientos para radiomarcar análogos de somatostatina que han sido modificados con el fin de que contengan un aminoácido tirosina (Tyr o Y).

Albert et al., en la Solicitud de Patente UK 8927255.3, describe la gammagrafía utilizando derivados de somatostatina, tales como octreótido marcado con ^{123}I.

Bakker et al., 1990, en la publicación J. Nucl. Med. 31: 1501-1509, describen la yodación radiactiva de un análogo de somatostatina y su utilidad en la detección de tumores in vivo.

Bakker et al., 1991, en la publicación J. Nucl. Med. 32: 1184-1189, enseñan la utilidad de somatostatina radiomarcada para la gammagrafía in vivo.

Bomanji et al., 1992, en la publicación J. Nucl. Med. 33: 1121-1124, describen la utilización de octreótido yodado (Tyr-3) para la formación de imágenes médicas de tumores carcinoides metastásicos.

Alternativamente, se han dado a conocer en la técnica anterior procedimientos para radiomarcar somatostatina modificando covalentemente el péptido para que contenga un grupo quelante de radionúclido.

Albert et al., en la Solicitud de Patente UK 8927255.3, dan a conocer la formación de imágenes médicas utilizando derivados de somatostatina, tales como octreótido con ^{111}In por medio de un grupo quelante unido al terminal amino.

Albert et al., en la Solicitud de Patente Internacional nº WO 91/01.144, dan a conocer la formación de imágenes médicas utilizando péptidos radiomarcados relacionados con factores de crecimiento, hormonas, interferones y citoquinas, y constituidos por un péptido de reconocimiento específico covalentemente enlazado a un grupo quelante de radionúclido.

Albert et al., en la Solicitud de Patente Europea nº 92810381.1, dan a conocer péptidos de somatostatina que presentan quelantes unidos al terminal amino.

Faglia et al., 1991, en la publicación J. Clin. Endocrinol. Metab. 73: 850-856 describen la detección de receptores de somatostatina en pacientes.

Kwekkeboom et al., 1991, en la publicación J. Nucl. Med. 32: 981 Resumen Nº 305, se refiere a la radiomarcación de análogos de somatostatina con ^{111}In.

Albert et al., 1991, en el Resumen LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991, describen los usos de análogos de somatostatina derivatizados con ácido dietilen-triaminopentaacético, marcados con ^{111}In.

Krenning et al., 1992, en la publicación J. Nucl. Med. 33: 652-658 describen una centelligrafía clínica utilizando [^{111}In][DTPA]octreótido.

Se sabe que una variedad de radionúclidos son útiles para la formación de radioimágenes, incluyendo ^{67}Ga, ^{99m}Tc (Tc-99m), ^{111}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{169}Yb o ^{186}Re. Se debe de considerar un número de factores para la formación óptima de radioimágenes en seres humanos. Para maximizar la eficacia de la detección, se prefiere un radionúclido que emite energía gamma en el intervalo de 100 hasta 200 keV. Para minimizar la dosis de radiación absorbida por el paciente, el período de semidesintegración física del radionúclido debe ser tan corto como lo permita el procedimiento de formación de imágenes. Para permitir que se realicen exámenes en cualquier día y a cualquier hora del día, es ventajoso tener una fuente del radionúclido que esté siempre disponible en el sitio clínico. El Tc-99m es un radionúclido preferido debido a que emite radiación gamma a 140 keV, tiene un período de semidesintegración física de 6 horas, y está fácilmente disponible en el sitio usando un generador de molibdeno-99/tecnecio-99m. Otros radionúclidos usados en la técnica anterior son menos ventajosos que Tc-99m. Esto puede ser debido a que el período de semidesintegración física de tales radionúclidos son más largos, dando como resultado una mayor cantidad de dosis de radiación absorbida por el paciente (por ejemplo, indio-111). También, muchos radionúclidos desventajosos no se pueden producir usando un generador en el sitio.

El Tc-99m es un metal de transición que se puede quelar ventajosamente mediante un resto complejante de metales. Los restos complejantes radiomarcados, capaces de unirse a Tc-99m, se pueden enlazar convenientemente a diversos compuestos de unión específica, para proporcionar un medio para radiomarcar tales compuestos de unión específica. Esto es debido a que la especie química más habitualmente disponible de Tc-99m, el pertecnetato (TcO_{4}^{-}), no se puede unir directamente a la mayoría de los compuestos de unión específica de forma suficientemente fuerte para ser útil como un radiofármaco. La complejación de Tc-99m con tales restos complejantes radiomarcados supone típicamente una reducción química del pertectenato usando un agente reductor, tal como cloruro estannoso.

En la técnica anterior se conoce el uso de agentes complejantes para complejar Tc-99m.

Byrne et al., Patente U.S. nº 4.434.151, describe agentes quelantes de Tc-99m que contienen homocisteína.

Fritzberg, Patente U.S. nº 4.444.690 describe una serie de agentes quelantes de tecnecio a base de 2,3-bis(mercaptoacetamido)propanoato.

Byrne et al., Patente U.S. nº 4.571.430, describe agentes quelantes de Tc-99m que contienen homocisteína.

Byrne et al., Patente U.S. nº 4.575.556, describe agentes quelantes de Tc-99m que contienen homocisteína.

Nosco et al., Patente U.S. nº 4.925.650, describe complejos quelantes de Tc-99m.

Kondo et al., Solicitud de Patente Europea, Publicación nº 483704 A1 describe un procedimiento para preparar un complejo de Tc-99m con un resto de mercapto-Gly-Gly-Gly.

La Solicitud de Patente Europea nº 84109831.2 describe ligandos de bisamido, bistiol Tc-99m, y sus sales, como agentes de monitorización de la función renal.

Davison et al., 1981, Inorg. Chem. 20: 1629-1632, describe complejos de quelatos de oxotecnecio.

Fritzberg et al., 1982, J. Nucl. Med. 23: 592-598 describe un agente quelante de Tc-99m a base de 2,3-diaminopropanoato de N,N’-bis(mercaptoacetilo).

Byrne et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: P126, describe agentes complejantes de Tc-99m que contienen homocisteína.

Bryson et al., 1988, Inorg. Chem. 27: 2154-2161, describe complejos neutros de tecnecio-99 que son inestables a ligando en exceso.

Misra et al., 1989, Tet. Lett. 30 1885-1888, describe compuestos de bisaminbistiol con fines de radiomarcado.

El uso de agentes quelantes para radiomarcar compuestos de unión específica es conocido en la técnica.

Gansow et al., Patente U.S. nº 4.472.509, enseña métodos para fabricar y purificar anticuerpos monoclonales conjugados con quelatos de Tc-99m.

Stavrianopoulos, Patente U.S. nº 4.943.523, enseña moléculas detectables que comprenden restos quelantes de metales.

Fritzberg et al., Solicitud de Patente Europea nº 86100360.6, describe complejos de ácido ditiol, diamino, o diamidocarboxílico o aminas útiles para obtener agentes formadores de imágenes marcados con tecnecio.

Albert et al., Solicitud de Patente UK 8927255.3, describe la formación de radioimágenes usando derivados de somatostatina, tales como octreótido marcado con ^{111}In vía un grupo quelante unido al término amino.

Albert et al., Solicitud de Patente Internacional WO 91/01144, describe la formación de radioimágenes usando péptidos radiomarcados relacionados con factores de crecimiento, hormonas, interferones y citoquinas, y que comprenden un péptido de reconocimiento específico enlazado covalentemente a un grupo quelante de radionúclidos.

Fischman et al., Solicitud de Patente Internacional WO 93/13317, describe péptidos quimiotácticos unidos a restos quelantes.

Kwekkeboom et al., 1991. J. Nucl. Med. 32: 981 Abstract #305 se refiere al radiomarcado de análogos de somatostatina con ^{111}In.

Albert et al., 1991, Abstract LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991, describe usos para análogos de somatostatina derivatizados con ácido dietilentriaminopentaacético marcado con ^{111}In.

Cox et al., 1991, Abstract, 7th International Symposium on Radiopharmacology, p. 16, describe el uso de análogos de somatostatina marcados con Tc-99m, ^{131}Iy ^{111}In en la radiolocalización de tumores endocrinos in vivo mediante gammagrafía.

En la técnica anterior se conocen métodos para marcar ciertos compuestos de unión específica con Tc-99m.

Hnatowich, Patente U.S. nº 4,668,503, describe el radiomarcado de proteína con Tc-99m.

Tolman, Patente U.S. nº 4,732,684, describe la conjugación de moléculas seleccionadoras de dianas, y fragmentos de metalotioneína.

Nicolotti et al., Patente U.S. nº 4,861,869, describe agentes de acoplamiento bifuncionales, útiles para formar conjugados con moléculas biológicas tales como anticuerpos.

Fritzberg et al., Patente U.S. nº 4.965.392, describe diversos queladores a base de mercaptoacetilglicilglicina, protegidos en S, para marcar proteínas.

Schochat et al., Patente U.S. nº 5.061.641, describe el radiomarcado directo de proteínas compuestas de al menos un grupo sulfhidrilo "colgante".

Fritzberg et al., Patente U.S. nº 5.091.514, describe diversos queladores a base de mercaptoacetilglicilglicina, protegidos en S, para marcar proteínas.

Gustavson et al., Patente U.S. nº 5.112.953, describe agentes quelantes de Tc-99m para radiomarcar proteínas.

Kasina et al., Patente U.S. nº 5.175.257, describe diversas combinaciones de moléculas seleccionadoras de dianas y grupos quelantes de Tc-99m.

Dean et al., Patente U.S. nº 5.180.816, describe métodos para radiomarcar una proteína con Tc-99m, vía un agente quelante bifuncional.

Sundrehagen, Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 85/03231, describe el radiomarcado con Tc-99m de las proteínas.

Reno y Bottino, Solicitud de Patente Europea 87300426.1, describe el radiomarcado de anticuerpos con Tc-99m.

Bremer et al., Solicitud de Patente Europea nº 87118142.6, describe el radiomarcado con Tc-99m de moléculas de anticuerpos.

Pak et al., Solicitud de Patente Internacional WO 88/07382, describe un método para marcar anticuerpos con Tc-99m.

Goedemans et al., Solicitud de Patente Internacional WO 89/07456, describe el radiomarcado de proteínas usando compuestos tiólicos cíclicos, particularmente 2-iminotiolano y derivados.

Dean et al., Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 89/12625, enseña agentes de acoplamiento bifuncionales para marcar con Tc-99m las proteínas.

Schoemaker et al., Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 90/06323, describe proteínas quiméricas que comprenden una región de unión a metal.

Thornback et al., Solicitud EP nº 90402206.8, describe la preparación y uso de proteínas o péptidos radiomarcados, usando compuestos que contienen tiol, particularmente 2-iminotiolano.

Gustavson et al., Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 91/09876, describe agentes quelantes de Tc-99m para radiomarcar proteínas.

Rhodes. 1974, Sem. Nucl. Med. 4: 281-293, enseña el marcado de seroalbúmina humana con tecnecio-99m.

Khaw et al., 1982, J. Nucl. Med. 23: 1011-1019, describe métodos para marcar macromoléculas biológicamente activas con Tc-99m.

Schwartz et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 333, describe un método para marcar proteínas con Tc-99m usando un grupo hidrazinonicotinamida.

En la técnica anterior se han dado a conocer intentos para radiomarcar péptidos.

Ege et al., Patente U.S. nº 4.832.940, enseña péptidos radiomarcados para la formación de imágenes de linfocitos T localizados.

Morgan et al., Patente U.S. nº 4.986.979, describe métodos para formar imágenes de sitios de inflamación.

Flanagan et al., Patente U.S. nº 5.248.764, describe conjugados entre un resto quelante de marcador radioactivo y péptidos derivados del factor natiurético ventricular.

Ranby et al., 1988, documento PCT/US88/02276, describe un método para detectar depósitos de fibrina en un animal, que comprende unir covalentemente un compuesto radiomarcado a fibrina.

Lees et al., 1989, documento PCT/US89/01854, enseña péptidos radiomarcados para la formación de imágenes arteriales.

Morgan et al., Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 90/10463, describe métodos para formación de imágenes de sitios de inflamación.

Flanagan et al., Solicitud de Patente Europea nº 90306428.5, describe el marcado con Tc-99m de fragmentos peptídicos sintéticos vía un conjunto de moléculas quelantes orgánicas.

Stuttle, Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 90/15818, describe el marcado con Tc-99m de oligopéptidos que contienen RGD.

Rodwell et al., 1991, documento PCT/US91/03116, describe conjugados de "unidades de reconocimiento molecular" con "dominios efectores".

Cox, Solicitud de Patente Internacional PCT/US92/04559, describe derivados de somatostatina radiomarcados, que contienen dos restos de cisteína.

Rhodes et al., Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 93/12819, enseña péptidos que comprenden dominios de unión a iones metálicos.

Lyle et al., Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 93/15770, describe queladores de Tc-99m, y péptidos marcados con Tc-99m.

Coughlin et al., Solicitud de Patente Internacional, Publicación nº WO 93/21151, describe agentes quelantes bifuncionales que comprenden grupos tiourea para radiomarcar moléculas seleccionadoras de dianas.

Knight et al., 1990, 37th Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine, Abstract #209, reivindica la formación de imágenes de trombos usando péptidos marcados con Tc-99m.

Babich et al., 1993, J. Nucl. Med. 34: 1964-1974, describe péptidos marcados con Tc-99m, que comprenden derivados de hidrazinonicotinamida.

Los métodos para marcar directamente somatostatina, derivados de somatostatina, análogos de somatostatina o péptidos que se unen al receptor de somatostatina y contienen al menos 2 restos de cisteína que forman un disulfuro, o en los que el disulfuro se reduce a la forma de sulfhidrilo, se describen en la patente U.S. nº 5.225.180, presentada el 6 de julio de 1993, de propiedad conjunta, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

El uso de agentes quelantes para radiomarcar péptidos, y los métodos para radiomarcar péptidos con Tc-99m, son conocidos en la técnica anterior, y se describen en la Solicitud de Patente U.S. Series n^{os} 07/653.012, 07/807.062, 07/871.282, 07/893.981, 07/955.466, 08/092.355 y 08/095.760 en trámite junto con la presente.

Existe la necesidad de análogos sintéticos de somatostatina (para hacer practicable la fabricación habitual, y para facilitar su aceptación por parte de las Autoridades Reguladoras) que tengan una mayor estabilidad in vivo, para ser usados terapéuticamente, como agentes gammagráficos cuando se marcan radioactivamente con Tc-99m u otros radioisótopos detectables para uso en la formación de imágenes in vivo de tumores, y como agentes radioterapéuticos cuando se marcan radioactivamente con un radioisótopo citotóxico, tal como renio-188. Mediante esta invención, que satisface específicamente esta necesidad, se proporcionan análogos sintéticos pequeños de somatostatina.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona análogos de somatostatina que comprenden péptidos cíclicos para aplicaciones terapéuticas, incluyendo aplicaciones radioterapéuticas, y aplicaciones de diagnóstico, incluyendo aplicaciones de radiodiagnóstico, en particular aplicaciones de formaciones de imágenes gammagráficas. Diferentes de la somatostatina natural, los péptidos cíclicos de la invención no comprenden un enlace de disulfuro. La invención también proporciona reactivos peptídicos cíclicos que comprenden análogos de somatostatina peptídicos cíclicos en los que tales péptidos incorporan un resto de unión a ion metálico enlazado covalentemente. La invención proporciona tales péptidos cíclicos, reactivos de péptidos cíclicos y reactivos de péptidos cíclicos radiomarcados, que son agentes formadores de imágenes gammagráficas, agentes de radiodiagnóstico y agentes radioterapéuticos. Los agentes formadores de imágenes gammagráficas de la invención comprenden reactivos de péptidos cíclicos radiomarcados con un radioisótopo, preferiblemente tecnecio-99m. Los agentes radioterapéuticos de la invención comprenden reactivos de péptidos cíclicos radiomarcados con un radioisótopo citotóxico, preferiblemente renio-186 o renio-188. También se proporcionan los métodos para obtener y usar tales péptidos cíclicos, reactivos de péptidos cíclicos y sus realizaciones radiomarcadas.

La invención proporciona composiciones de materia que comprenden un péptido de unión específica que se une específicamente a receptores de somatostatina en un cuerpo de mamífero, enlazado covalentemente a un resto complejante de ion metálico. Las composiciones de materia de la invención tienen la fórmula:

ciclo(\underline{N-CH_{3})-Phe-Tyr-(_{D}-Trp)-Lys-Val-Hcy.}(CH_{2}CO.X)

en la que X es un resto complejante de metal que tiene la fórmula (aminoácido)_{n}-B-(aminoácido)_{m}-Z, en la que B es un resto que contiene tiol, esto es, cisteína, homocisteína, isocisteína, o penicilamina; (aminoácido)_{n} y (aminoácido)_{m} son, cada uno independientemente, cualquier \alpha- o \beta-aminoácido primario que no comprende un grupo tiol; Z es -OH o -NH_{2}; y n y m son, cada uno independientemente, un número entero entre 2 y 5 y 0 y 5, respectivamente.

En las fórmulas que describen las composiciones de materia de la invención, la combinación del término "ciclo" y una secuencia de aminoácidos subrayada se entenderá que significa que la secuencia de aminoácidos subrayada está cerrada en ciclo a través de un enlace peptídico que enlaza el término amino del primer aminoácido de la secuencia al término carboxilo del último aminoácido de la secuencia. Cuando le sigue un término entre paréntesis, tal como "(CH_{2}CO.X)", dicho término entre paréntesis se entenderá que significa que la secuencia entre paréntesis está enlazada covalentemente al átomo de azufre de la cadena lateral de aminoácidos del aminoácido que contiene tiol en la secuencia de aminoácidos subrayada, formando con ello un enlace de sulfuro. De este modo, en la estructura química anterior, se entenderá que el grupo -CH_{2}CO.X está enlazado covalentemente al átomo de azufre de la cadena lateral de la homocisteína. Un ejemplo de tal fórmula química se muestra en el Ejemplo 2.

Las composiciones de materia de la invención tienen utilidad para un número de fines de diagnóstico y terapéuticos.

De este modo, un aspecto de la invención proporciona reactivos para preparar agentes formadores de imágenes gammagráficos radiomarcados, para formar imágenes de sitios en un cuerpo de un mamífero que tenga una sobreabundancia de receptores de somatostatina. En tales realizaciones, el resto complejante de ion metálico comprende un resto de unión de marcador radioactivo, y el reactivo forma un complejo con el marcador radioactivo vía la formación de un complejo con dicho resto. En una realización de este aspecto de la invención, el agente formador de imágenes gammagráficas se forma complejando el reactivo con Tc-99m en condiciones reductoras.

De este modo, la invención también comprende agentes formadores de imágenes gammagráficas que son complejos de los reactivos de la invención con Tc-99m, y métodos para radiomarcar los reactivos. Los complejos radiomarcados con Tc-99m, proporcionados mediante la invención, se forman haciendo reaccionar los reactivos de la invención con Tc-99m en presencia de un agente reductor. Los agentes reductores preferidos incluyen, pero no se limitan a, ion ditionito, ion estannoso e ion ferroso. Los complejos de la invención también se forman marcando los reactivos de la invención con Tc-99m mediante intercambio de ligandos de un complejo de Tc-99m prerreducido, como se proporciona aquí.

Los agentes formadores de imágenes preferidos comprenden complejos de Tc-99m de los reactivos de la invención.

La invención también proporciona kits para preparar agentes formadores de imágenes gammagráficas, que son los reactivos de la invención radiomarcados con Tc-99m. Los kits para radiomarcar los reactivos proporcionados por la invención con Tc-99m están compuestos de un vial cerrado herméticamente que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de la invención y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar el reactivo con Tc-99m.

En un segundo aspecto de la invención, se proporcionan agentes formadores de imágenes, en los que las composiciones de materia de la invención son radiomarcadas con un radioisótopo de yodo, preferiblemente I-123, I-125, o I-131. La invención proporciona agentes de formación de imágenes radioyodados, que son complejos de los reactivos de la invención con yodo marcado radioactivamente.

Una realización preferida de los reactivos proporcionados por la invención para preparar agentes formadores de imágenes radioyodados es un compuesto que tiene la fórmula:

ciclo(\underline{\mathit{N}-metil)FYW_{D}KV.Hcy}.(CH_{2}CO.GGCK.amida).

Los agentes formadores de imágenes preferidos comprenden realizaciones radioyodadas de este reactivo.

En un tercer aspecto, se proporcionan agentes formadores de imágenes no marcados radioactivamente, que comprenden reactivos que son las composiciones de materia de la invención complejadas con un ion o partícula metálica paramagnética. En realizaciones de este aspecto de la invención, el ion metálico paramagnético está complejado con el resto complejante de ion metálico. En realizaciones en las que se usa una partícula, preferiblemente una partícula metálica superparamagnética, las composiciones de materia de la invención se enlazan a la partícula superparamagnética ya sea covalente o asociativamente, usando métodos descritos por Weissleder et al. (1992, Radiology 182:381-385). La invención proporciona tales agentes formadores de imágenes, para uso en formaciones de imágenes mediante resonancia magnética. También se proporcionan métodos para preparar estos agentes formadores de imágenes no marcados radioactivamente.

Una realización preferida de los reactivos proporcionados por la invención para preparar tales agentes formadores de imágenes no marcados radioactivamente es un compuesto que tiene la fórmula:

ciclo( N -- metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{2}CO.GGCK.amida).

Los agentes formadores de imágenes no marcados radioactivamente preferidos comprenden complejos del ion férrico de este reactivo.

También se proporcionan aquí agentes terapéuticos. En un cuarto aspecto, la invención proporciona las composiciones de materia de la invención no complejadas con un ion metálico, como un agente terapéutico per se.

En un quinto aspecto, la invención proporciona agentes terapéuticos radiomarcados, que comprenden un reactivo para preparar el agente terapeútico que es una composición de materia proporcionada por la invención. En tales realizaciones, se proporcionan las composiciones de materia de la invención en las que el resto complejante del ion metálico está complejado con una partícula \beta que emite, o un electrón de conversión que emite, un radioisótopo. Las realizaciones preferidas de partícula \beta que emite radioisótopos son renio-186 y renio-188. Un electrón de conversión preferido que emite radioisótopo es estaño-117m. La invención proporciona tales complejos de radioisótopos de las composiciones de materia de la invención, para el tratamiento radioterapéutico de células y tejidos patológicos que expresan el receptor de somatostatina, particularmente células neoplásicas y metastásicas. También se proporcionan métodos para preparar tales complejos de radioisótopos terapéuticos de las composiciones de materia de la
invención.

Una realización preferida de los reactivos de la invención, proporcionada para preparar tales agentes radioterapéuticos, es un compuesto que tiene la fórmula:

ciclo(\underline{\mathit{N}-metil)FYW_{D}KV.Hcy}.(CH_{2}CO.GGCK.amida).

Los agentes radioterapéuticos preferidos comprenden complejos de iones metálicos que emiten una partícula \beta o que emiten un electrón de conversión, con este reactivo.

\newpage

En otro aspecto de los agentes radioterapéuticos de la invención, se proporcionan agentes radioterapéuticos en los que las composiciones de materia de la invención están radiomarcadas con un radioisótopo de yodo, preferiblemente I-125 o I-131, o con astato-211. La invención también proporciona los propios agentes terapéuticos radiomarcados, así como métodos para radiomarcar los reactivos.

Realizaciones preferidas de los reactivos de la invención, proporcionadas para preparar estos agentes radioyodados y radioastatados terapéuticos, son compuestos que tienen la fórmula:

ciclo(\underline{\mathit{N}-metil)FYW_{D}KV.Hcy}.(CH_{2}CO.GGCK.amida).

Los agentes radioterapéuticos preferidos comprenden realizaciones radioyodadas y radioastatadas de este reactivo.

Se proporcionan agentes terapéuticos que son agentes complejados con átomos metálicos, no marcados radioactivamente, que comprenden reactivos que son las composiciones de materia de la invención complejados con un átomo metálico no radioactivo, tal como cobre, cinc o renio. En realizaciones de este aspecto de la invención, el ion metálico no radioactivo está complejado con el resto complejante de ion metálico. La invención proporciona tales agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de estados en los que los receptores de somatostatina son sobreexpresados en las células que comprenden ciertos tejidos, y para tratar células neoplásicas que hiperexpresan receptores de somatostatina. También se proporcionan métodos para preparar estos agentes terapéuticos complejados con átomos metálicos no marcados radioactivamente.

Una realización preferida de los reactivos de la invención, proporcionada para preparar agentes terapéuticos no marcados radioactivamente, es un compuesto que tiene la fórmula:

ciclo(\underline{\mathit{N}-metil)FYW_{D}KV.Hcy}.(CH_{2}CO.GGCK.amida).

Los agentes terapéuticos no marcados radioactivamente preferidos comprenden un complejo de renio de este reactivo.

Esta invención proporciona métodos para preparar realizaciones de péptidos de los reactivos de la invención mediante síntesis química in vitro. En una realización preferida, los péptidos se sintetizan mediante síntesis peptídica en fase sólida.

Esta invención proporciona métodos para usar los agentes de diagnóstico y de radiodiagnóstico, y terapéuticos y radioterapéuticos, de la invención. Para realizaciones radiomarcadas de los agentes de la invención, por ejemplo, agentes formadores de imágenes gammagráficas marcados con Tc-99m, se administra una cantidad diagnóstica o terapéutica eficaz del agente de diagnóstico o de radiodiagnóstico, o terapéutico o radioterapéutico, de la invención. En realizaciones de radiodiagnóstico, la localización del marcador radioactivo se detecta usando metodologías convencionales, tales como gammagrafía. En realizaciones de diagnóstico no radioactivo, la localización de sitios de acumulación de los agentes de diagnóstico de la invención marcados con metales paramagnéticos se logra usando metodologías de formación de imágenes mediante resonancia magnética. Los agentes formadores de imágenes proporcionados por la invención tienen utilidad para formar imágenes de tumores, particularmente para formar imágenes de sitios neoplásicos primarios y metastásicos en los que dichas células neoplásicas expresan receptores de somatostatina (SSTR), y en particular tales células tumorales primarias y especialmente metastásicas que han sido clínicamente resistentes a la detección usando metodologías convencionales. Además, los agentes formadores de imágenes de la invención son útiles para detectar sitios de acumulación de linfocitos T asociada con una enfermedad o patología oculta, por ejemplo, como ocurre en pacientes que sufren tuberculosis.

La invención proporciona métodos para usar los análogos de somatostatina de la invención para aliviar enfermedades u otras dolencias en animales, preferiblemente seres humanos. Estas enfermedades y dolencias incluyen, pero no se limitan a, diabetes y retinopatía relacionada con diabetes, cirrosis hepática e infección por hepatitis, úlceras hemorrágicas y otras hemorragias gastrointestinales, pancreatitis, trastornos del sistema nervioso central, trastornos endocrinos, enfermedad de Alzheimer, acromegalia y otras enfermedades y trastornos relacionados con la producción de niveles inapropiados de hormona de crecimiento in vivo, y cáncer, particularmente aquellos cánceres cuyo crecimiento depende o está influido por la producción de hormona del crecimiento. Las realizaciones terapéuticas no marcadas radioactivamente también tienen utilidad para tratar enfermedades relacionadas con la hiperexpresión de SSTR, tales como diarrea provocada por gastrinoma que hiperexpresa SSTR. Las dosis de los análogos de somatostatina proporcionadas por la invención pueden ser las mismas que las dosis de somatostatina natural usada normalmente para el tratamiento de las enfermedades anteriores o de otras enfermedades, o se pueden administrar menores cantidades de los compuestos de la invención debido a su semivida in vivo más prolongada.

Los usos terapéuticos también incluyen la extirpación radioterapéutica de células cancerígenas neoplásicas y metastásicas en pacientes con tumores, cuyas células expresan el receptor de somatostatina. El uso de los agentes radioterapéuticos de la invención incluye el uso terapéutico primario para tumores resistentes a terapias más convencionales, y para tumores que son inoperables, así como incluye terapias auxiliares suplementarias de la cirugía, terapia de radiación o quimioterapia convencional.

Las realizaciones radiomarcadas de la invención también tienen utilidad como guías quirúrgicas para identificar tejido tumoral, que expresa el receptor de somatostatina, durante la cirugía. Para tal uso en cirugía guiada por radioisótopos, el tejido cancerígeno, invisible de otro modo al cirujano, se puede reconocer y extirpar durante la cirugía de otro modo convencional.

Las realizaciones preferidas específicas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones preferidas y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una imagen de P587 marcado con ^{99m}Tc en una rata con tumor, indicado por una flecha, que muestra la captación elevada en el sitio del tumor, en la pata inferior.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

La presente invención proporciona péptidos cíclicos que son análogos de somatostatina y que no comprenden un enlace de disulfuro. Tales análogos de somatostatina poseen de ese modo un aumento de la estabilidad in vivo, en comparación con la somatostatina natural. Estos péptidos cíclicos son ellos mismos agentes terapéuticos para aliviar enfermedades y otras dolencias en animales, incluyendo seres humanos.

También se proporcionan mediante la invención péptidos cíclicos que se pueden radioyodar o radioastatar, y que de ese modo son útiles en aplicaciones radioterapéuticas y de radiodiagnóstico.

Otra realización de estos péptidos cíclicos que se proporcionan mediante esta invención son reactivos de péptidos cíclicos en los que los péptidos cíclicos de la invención están enlazados covalentemente a un resto complejante de iones metálicos. Tales reactivos de péptidos cíclicos son capaces de ser radiomarcados para proporcionar agentes de radiodiagnóstico o radioterapéuticos. Un ejemplo de una aplicación de radiodiagnóstico, que usa los agentes radiomarcados de la invención, es la formación de imágenes gammagráficas, en la que se puede determinar la localización y extensión de tumores que tienen el receptor de somatostatina. Los reactivos de péptidos cíclicos de la invención también se pueden radiomarcar ventajosamente con radioisótopos citotóxicos, tales como renio-186 o renio-188, para usos radioterapéuticos.

Los reactivos de péptidos cíclicos de la invención también son útiles para preparar complejos con metales no radioactivos, siendo dichos complejos útiles terapéuticamente.

El marcaje con Tc-99m es una ventaja de la presente invención debido a que las propiedades nucleares y radioactivas de este isótopo lo hacen un agente formador de imágenes gammagráficas ideal. Este isótopo tiene una energía de fotón individual de 140 keV, y un período de semidesintegración radioactivo de alrededor de 6 horas, y está fácilmente disponible a partir de un generador de ^{99}Mo-^{99m}Tc. También se pueden usar, en la práctica de la invención, según se describe aquí, otros radionúclidos.

La expresión agente formador de imágenes gammagráficas, como se usa aquí, pretende englobar un agente marcado radioactivamente capaz de ser detectado con un medio de detección de la radioactividad (incluyendo, pero sin limitarse a, una gammacámara, un contador Geiger-Muller y una sonda detectora gammagráfica).

Por otro lado, las realizaciones radioterapéuticas de la invención se marcan ventajosamente con un radioisótopo citotóxico, incluyendo, pero sin limitarse a, cobre-67, yodo-125, yodo-131, renio-186, renio-188, y astato-211, lo más preferible ^{186}Re o ^{188}Re. Tales realizaciones son útiles en el tratamiento de enfermedades y otras dolencias relacionados con la somatostatina, en animales, preferiblemente seres humanos, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer y otras enfermedades caracterizadas por el crecimiento de tumores cancerígenos o benignos capaces de unirse a somatostatina o análogos de somatostatina vía la expresión de receptores de somatostatina sobre la superficie celular de las células que comprenden tales tumores.

La presente invención proporciona reactivos para preparar agentes de diagnóstico y de radiodiagnóstico, y agentes terapéuticos y radioterapéuticos. Los reactivos proporcionados por la invención comprenden un resto complejante de iones metálicos enlazado covalentemente a un péptido de unión específica que se une a sitios del receptor de somatostatina dentro de un cuerpo de un mamífero.

Los compuestos pequeños, que tienen preferiblemente un peso molecular menor que 10.000 daltons, son de una ventaja comercial evidente. Tales compuestos pequeños se pueden fabricar fácilmente. Además, probablemente no son inmunógenos, y se eliminan rápidamente de la vasculatura, permitiendo así una formación más rápida y mejor de las imágenes. Por el contrario, las moléculas más grandes, tales como anticuerpos o sus fragmentos, u otros péptidos derivados biológicamente mayores que 10.000 daltons, son costosos de fabricar, y probablemente son inmunógenos y se aclaran de forma más lenta a partir del torrente sanguíneo, interfiriendo de ese modo con los diagnósticos rápidos in vivo.

Es una ventaja de los análogos de somatostatina proporcionados por esta invención que el enlace cíclico contenido en ellos, que no es de disulfuro, es estable en las condiciones del marcado radioactivo del resto enlazado covalentemente y que se une al marcador radioactivo. Por el contrario, por ejemplo, la conjugación de Tc-99m a un resto que se une a Tc-99m, enlazado covalentemente a somatostatina natural, o a un análogo de somatostatina que tiene un enlace de disulfuro, puede dar como resultado la reducción del disulfuro, acompañada de una pérdida de actividad biológica. Tal pérdida de actividad biológica también puede suceder in vivo usando somatostatina natural, o cualquier análogo de somatostatina que tenga un enlace de disulfuro. La presente invención no está sometida a pérdidas similares de actividad biológica in vivo, debido a que los enlaces cíclicos que no son de disulfuro, en cada uno de los análogos de somatostatina de la invención, comprenden enlaces covalentes estables.

Para los fines de esta invención, la expresión "péptido de unión específica" pretende significar cualquier compuesto peptídico que se une específicamente a un sitio diana en un cuerpo de mamífero, definido por una sobreabundancia de moléculas del receptor de somatostatina (SSTR). "Unión específica" se entenderá, por aquellos expertos en la técnica, que significa que el péptido se localiza en gran medida en el sitio diana y no en los tejidos circundantes. Tal unión específica es ventajosa en agentes formadores de imágenes para diagnóstico, que comprenden péptidos de unión específica, debido a que se dispersan a través del cuerpo del mamífero tras la administración, y tal localización específica de la radioactividad unida al reactivo proporciona una definición visual de la diana in vivo.

Cada realización de la invención que contiene un péptido de unión específica está comprendida de una secuencia de aminoácidos. El término aminoácido, como se usa en esta invención, pretende incluir todos los aminoácidos L y D, \alpha y \beta primarios, de origen natural, modificados, sustituidos, alterados o de cualquier otro modo. Las realizaciones de péptidos de unión específica de los reactivos de la invención comprenden péptidos de unión específica que tienen un peso molecular menor que alrededor de 5.000 daltons. Las realizaciones particularmente preferidas de los péptidos de unión específica de la invención incluyen péptidos que se unen específicamente y con elevada afinidad al receptor de somatostatina (SSTR) en células que expresan el SSTR, particularmente células tumorales y células linfocíticas T activadas. Los reactivos que comprenden péptidos de unión específica provistos por la invención incluyen, pero no se limitan a, reactivos que comprenden péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos (los aminoácidos en los siguientes péptidos son L-aminoácidos, excepto que se indique de otro modo):

2

3

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(Las abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos se pueden encontrar en Zubay, ibid., p. 33; otras abreviaturas son como en la Leyenda de la Tabla I). Esta lista de reactivos proporcionada por la invención es ilustrativa y no pretende ser limitante o exclusiva, y se entenderá por aquellos expertos en la técnica que los reactivos que comprenden combinaciones de los péptidos descritos aquí, o sus equivalentes, se pueden enlazar covalentemente a cualquiera de los restos quelantes de la invención, y pueden estar dentro de su alcance.

En una realización preferida, el reactivo de la invención tiene la fórmula:

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4

Los péptidos de unión específica que comprenden los reactivos de la presente invención se pueden sintetizar químicamente in vitro. Tales péptidos se pueden preparar generalmente de forma ventajosa en un sintetizador de péptidos. Los péptidos de esta invención se pueden sintetizar de manera que el resto complejante de iones metálicos esté enlazado covalentemente al péptido durante la síntesis química in vitro, usando técnicas mostradas aquí (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2, subsección O).

En realizaciones de la invención formadoras de imágenes gammagráficas, se forma un complejo de tecnecio-99m con los reactivos de esta invención. Para lograr esto, el Tc-99m, preferiblemente como una sal de pertecnetato de Tc-99m, se hace reaccionar con los reactivos de esta invención, en presencia de un agente reductor. Los agentes reductores preferidos son ditionito, iones estannoso y ferroso; el agente reductor más preferido es una sal estannosa, tal como cloruro estannoso. En una realización adicional preferida, el agente reductor es un agente reductor en fase sólida. Los complejos y los medios para preparar tales complejos se proporcionan convenientemente en una forma de kit que comprende un vial cerrado herméticamente que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de la invención para ser marcado, y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar el reactivo con Tc-99m. Como alternativa, el complejo se puede formar haciendo reaccionar un reactivo de esta invención con un complejo lábil preformado de tecnecio y otro compuesto conocido como un ligando de transferencia (tal como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo). Este procedimiento es conocido como intercambio de ligandos, y es bien conocido por los expertos en la técnica. Entre las sales de pertecnetato de Tc-99m útiles en la presente invención, se incluyen las sales de metales alcalinos, tales como la sal de sodio, o sales de amonio o sales de alquilamonio inferior.

Los agentes formadores de imágenes gammagráficas, marcados con tecnecio-99m según la presente invención, se pueden preparar mediante adición de una cantidad apropiada de Tc-99m o de un complejo de Tc-99m en los viales, y mediante la reacción en condiciones descritas en el Ejemplo 3 a continuación. El kit también puede contener materiales auxiliares farmacéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la presión osmótica, tampones, conservantes y similares. Los componentes del kit pueden estar en forma líquida, congelada o seca. En una realización preferida, se proporcionan componentes del kit en forma liofilizada. Los reactivos de formación de imágenes gammagráficas marcados radioactivamente según la presente invención se pueden preparar mediante reacción en condiciones descritas en el Ejemplo 3 más abajo.

Se proporcionan reactivos marcados radioactivamente, proporcionados por la presente invención, que tienen una cantidad adecuada de radioactividad. A la hora de formar complejos radioactivos de Tc-99m, por ejemplo, generalmente se prefiere formar complejos radioactivos en disoluciones que contienen radioactividad en concentraciones de alrededor de 0,01 milicurie (mCi) hasta 100 mCi por ml.

Los reactivos formadores de imágenes proporcionados por la presente invención se pueden usar para visualizar órganos, tales como el riñón, para diagnosticar trastornos en estos órganos, y también se pueden formar imágenes de tumores, en particular tumores gastrointestinales, mielomas, carcinoma pulmonar microcítico y otros APUDomas, tumores endocrinos tales como carcinomas medulares de tiroide y tumores de la pituitaria, tumores cerebrales tales como meningiomas y astrocitomas, y tumores de la próstata, de mama, de colon y de ovarios. Según esta invención, los reactivos de péptidos marcados con Tc-99m se administran en una única dosis inyectable unitaria. Los reactivos de péptidos marcados con Tc-99m proporcionados por la invención se pueden administrar intravenosamente en cualquier medio convencional para inyección intravenosa, tal como un medio de disolución salina acuosa, o en un medio de plasma sanguíneo. Generalmente, la dosis unitaria a administrar tiene una radioactividad de alrededor de 0,01 mCi hasta alrededor de 100 mCi, preferiblemente 1 mCi hasta 20 mCi. La disolución a inyectar en la dosis unitaria es desde alrededor de 0,01 ml hasta alrededor de 10 ml. Después de la administración intravenosa, la formación de imágenes in vivo puede tener lugar en cuestión de unos pocos minutos. Sin embargo, la formación de imágenes puede tener lugar, si se desea, en horas o incluso más, después de que el péptido marcado radioactivamente se inyecte en un paciente. En la mayoría de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulará en el área de la que se forma su imagen, en alrededor de 0,1 horas, para tomar fotos gammagráficas. Según esta invención, se puede utilizar cualquier método convencional de formación de imágenes gammagráficas con fines de diagnóstico.

Los péptidos cíclicos que se unen al receptor de somatostatina y los complejos metálicos no radioactivos de los reactivos de péptidos cíclicos de la invención se pueden usar clínicamente como agentes terapéuticos para promover la regresión de ciertos tipos de tumores, particularmente aquellos que expresan receptores de somatostatina. Los péptidos cíclicos, análogos de somatostatina, de la invención, también se pueden usar para reducir la hipersecreción hormonal que a menudo acompaña a ciertos cánceres, tales como los APUDomas. Los péptidos de la invención usados como agentes terapéuticos se pueden administrar mediante cualquier vía apropiada, incluyendo la intravenosa, la intramuscular o por la boca, o en cualquier soporte farmacéutico aceptable, en dosis que oscilan desde alrededor de 0,1 hasta alrededor de 49 mg/kg de peso corporal/día.

Esta invención también proporciona péptidos marcados radioactivamente con radioisótopos citotóxicos, tales como renio-186 o renio-188, que se pueden usar para radioterapia de ciertos tumores como se han descrito aquí anteriormente. Para este fin, se puede administrar una cantidad de un isótopo radioactivo, desde alrededor de 10 mCi hasta alrededor de 200 mCi, vía cualquier ruta clínica adecuada, preferiblemente mediante inyección intravenosa.

Los métodos para marcar y obtener estos compuestos se ilustran de forma más completa en los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos ilustran ciertos aspectos del método descrito anteriormente y resultados ventajosos, y se muestran a título ilustrativo y no limitativo.

Ejemplo 1 Síntesis de Péptidos en Fase Sólida

Se llevó a cabo la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) a escala de 0,25 milimoles (mmoles) usando un sintetizador peptídico Applied Biosystems Modelo 431A, y usando la protección del término amino mediante 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), acoplando con diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol o hexafluorofosfato de 2-(1H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio/ hidroxibenzotriazol (HBTU/HOBT), y usando una resina Sasrin™ o p-hidroximetil-fenoximetilpoliestireno (HMP) para ácidos de término carboxílico, o una resina amídica Rink para amidas de término carboxílico.

Se prepararon Fmoc.Hcy(S-tritilo) y Fmoc.Pen(S-tritilo) a partir de aminoácido apropiado, mediante tritilación con trifenilmetanol en ácido trifluoroacético, seguido de la derivatización con Fmoc como se describe por Atherton et al. (1989, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press: Oxford) y posteriormente en el Ejemplo 2, subsección J más abajo. La Fmoc-S-(3-Boc-aminopropil)cisteína se preparó a partir de L-cisteína y bromuro de Boc-aminopropilo, en metóxido sódico metanólico, seguido del tratamiento con carbonato de O-9-fluorenilmetil-O’N-succinimidilo (FmocOSu),
a pH 10.

Los grupos 2-haloacetilo se introdujeron usando el ácido 2-haloacético apropiado como el último resto a acoplar durante SPPS, o tratando el péptido amínico libre del término N, unido a la resina, con ácido 2-haloacético/diisopropil-
carbodiimida/N-hidroxisuccinimida en NMP, o anhídrido 2-haloacétido/diisopropiletilamina en NMP.

Los péptidos que contienen tiol se hicieron reaccionar con restos complejantes de Tc-99m que contienen cloroacetilo, protegidos en el tiol, a pH 10, durante 0,5-24 horas a temperatura ambiente, opcionalmente seguido de acidificación con ácido acético y evaporación de la disolución para dar el aducto correspondiente de péptido-sulfuro, como se describe con más detalle en el Ejemplo 2, subsección O, más abajo. La desprotección y la purificación se realizaron de forma habitual como se describe, para producir el conjugado de quelante-péptido.

Los péptidos unidos a resina Sasrin^{TM} se escindieron usando una disolución de 1% de TFA en diclorometano, para producir el péptido protegido. Cuando fue apropiado, los precursores peptídicos protegidos se ciclaron entre los términos amino y carboxilo mediante reacción de la amina libre aminoterminal, protegida en su cadena lateral, y el ácido libre carboxiterminal, usando difenilfosforilazida, como se describe con más detalle en el Ejemplo 2, subsección M, más abajo.

Los productos unidos a la resina amídica Rink o a HMP se separaron habitualmente mediante escisión, y los péptidos ciclados protegidos se desprotegieron usando una disolución compuesta de ácido trifluoroacético (TFA), o TFA y cloruro de metileno, que comprende opcionalmente agua, tioanisol, etanoditiol, y triisopropilsilano en relaciones de 100:5:5:2,5:2, durante 0,5-3 horas a temperatura ambiente. Cuando fue apropiado, los productos se volvieron a S-tritilar en trifenolmetanol/TFA, y los grupos N-Boc se reintrodujeron en el péptido usando (Boc)_{2}O.

Los péptidos brutos se purificaron mediante cromatografía de líquidos a alta presión preparativa (HPLC), usando una columna C18 Waters DeltaPak, y un gradiente de elución con 0,1% de TFA en agua modificada con acetonitrilo. Después de la elución de la columna, se evaporó el acetonitrilo de las fracciones eluidas, que entonces se liofilizaron. La identidad de cada producto así producido y purificado se confirmó mediante espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos (FABMS), o mediante espectroscopía de masas por electropulverización
(ESMS).

Ejemplo 2 Síntesis de ciclo(N-CH_{3})fenilalanil-tirosil-_{D}-triptofanoil-lisil-valil-homocisteína. S-2-acetil-glicilglicil-cisteinil-lisinamida (P587) A. Síntesis de éster N-hidroxi-succinimídico de N-\alpha-carbobenzoxi-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisina

Una mezcla de N-\alpha-carbobenzoxi-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisina (23 g, 60,5 mmoles) y N-hidroxisuccinimida (7,1 g, 61,7 mmoles) en 180 ml tetrahidrofurano seco (THF) enfriado en un baño de agua fría, se añadió diisopropilcarbodiimida (9,66 ml, 61,7 mmoles). Esta mezcla de reacción se agitó toda la noche, y después se filtró, y se evaporó el filtrado. El residuo del filtrado se redisolvió entonces en acetato de etilo mínimo, 200 ml de éter y 200 ml de hexanos. El compuesto del título precipitó de esta mezcla y se recuperó mediante filtración, se lavó con hexanos fríos y se secó para dar 28,1 g (58,9 mmoles, 97% de rendimiento).

B. Síntesis de éster metílico de N-\alpha-carbobenzoxi-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina

A una disolución de éster metílico de valina (8,38 g, 50 mmoles) y diisopropiletilamina (12,7 ml, 50 mmoles), en 150 ml de THF, se añadió éster N-hidroxisuccinimídico de N-\alpha-carbobenzoxi-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisina (23,9 g, 50 mmoles), seguido de 50 ml adicionales de THF. Después de 2 h, el disolvente se eliminó por evaporación y se añadieron 50 ml acetato de etilo al residuo. Esta disolución se lavó secuencialmente con 200 ml de ácido cítrico al 5%, 200 ml de bicarbonato sódico saturado y 200 ml de salmuera saturada, se secó sobre sulfato magnésico anhidro, se filtró y se evaporó. El aceite resultante se disolvió en acetato de etilo mínimo, 200 ml de éter y 200 ml de hexanos. El compuesto del título se aisló por filtración, y se secó para producir 20 g (40,5 mmoles, 81% de rendimiento).

C. Síntesis de éster metílico de N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina

A una disolución de éster metílico de N-\alpha-carbobenzoxi-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina (19 g, 38,5 mmoles) y ácido acético (1 ml), en 100 ml acetato de etilo, se añadió catalizador de paladio al 10% sobre carbón (0,19 g), y se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante toda la noche. La mezcla de reacción se filtró entonces sobre Celite, el filtrado se evaporó, y el residuo se redisolvió en 100 ml metanol que contiene 1 ml de ácido acético. A esta disolución se añadió paladio al 10% sobre carbón (0,19 g), y la mezcla se hidrogenó a una presión de 45 libras por pulgada al cuadrado, durante 2 h, usando un hidrogenador Parr. La mezcla de reacción se filtró nuevamente sobre Celite, y el filtrado se evaporó para dar 13,56 g del compuesto del título (37,7 mmoles, 98% de rendimiento).

D. Síntesis de éster N-hidroxisuccinimídico de fluorenilmetoxicarbonil-_{D}-triptófano

A una disolución de hemihidrato de N-\alpha-fluorenilmetoxicarbonil-triptófano (25 g, 82,1 mmoles) y N-hidroxisucci-
nimida (9,78 g, 85 mmoles), en 250 ml de THF seco enfriado en un baño de agua fría, se añadió diisopropilcarbodiimida (13,3 ml, 85 mmoles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche, se filtró, y el filtrado se evaporó. El residuo se redisolvió entonces en tolueno y hexanos. El compuesto del título se aisló mediante filtración, y se secó para producir 34 g (66,5 mmoles, 81% de rendimiento).

E. Síntesis de éster metílico de fluorenilmetoxicarbonil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxi-carbonil-lisil-valina

A una mezcla de éster metílico de N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina (13 g, 36,1 mmoles), en 200 ml de THF, se añadió éster N-hidroxisuccinimídico de fluorenilmetoxicarbonil-_{D}-triptófano, (18,9 g, 36,1 mmoles). Se añadió diisopropiletilamina para ajustar el pH de la mezcla de reacción hasta pH 8, y la reacción se agitó durante 2 días. El disolvente se eliminó entonces mediante evaporación, y el residuo se redisolvió en acetato de etilo, se lavó con ácido cítrico al 5%, con bicarbonato saturado, y con salmuera saturada, y después se secó sobre sulfato de sodio. La disolución se filtró entonces y se evaporó, y el residuo se redisolvió en acetato de etilo. El compuesto del título se recuperó después de varias cristalizaciones de esta disolución, para dar 17,3 g de producto (22,5 mmoles, 62% de rendimiento).

F. Síntesis de éster N-hidroxi-succinimídico de N-fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butiltirosina

A una disolución de N-\alpha-fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butiltirosina (25 g, 54,3 mmoles) y N-hidroxisuccinimida (6,62 g, 57,5 mmoles), en 250 ml de THF seco enfriado en un baño de agua fría, se añadió diisopropilcarbodiimida (9,0 ml, 57,5 mmoles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche, se filtró, y el filtrado se evaporó. El residuo se redisolvió entonces en tolueno y hexanos. El compuesto del título se aisló mediante filtración, y se secó para producir 27,7 g (49,7 mmoles, 92% de rendimiento).

G. Síntesis de éster metílico de N-fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butiltirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbo- nillisil-valina

El éster metílico de fluorenilmetoxicarbonil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina (17 g, 22,1 mmoles) se trató con 40 ml dietilamina y 40 ml de THF a temperatura ambiente durante 1,5 h. La mezcla de reacción se evaporó entonces, se resuspendió en 100 ml de THF y reevaporó tres veces. El residuo se recogió en 120 ml de THF seco, y se añadió éster N-hidroxisuccinimídico de N-fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butiltirosina (12,3 g, 22,1 mmoles), seguido de 20 ml de THF seco y 4 ml de diisopropiletilamina, dando como resultado una disolución que tiene un pH de 9. Después de agitar toda la noche, la reacción se evaporó, y el residuo se recogió en acetato de etilo. La disolución de acetato de etilo se lavó con ácido cítrico al 5%, con bicarbonato sódico saturado y con salmuera saturada, después se secó sobre sulfato magnésico y se evaporó. El residuo se recogió en acetato de etilo, éter y hexanos, y el compuesto del título precipitó. El compuesto precipitado se aisló mediante filtración, y se secó para dar 14,6 g del compuesto del título (14,8 mmoles, 67% de rendimiento).

H. Síntesis de éster N-hidroxisuccinimídico de N-fluorenilmetoxicarbonil-N-metilfenilalanina

A una disolución de N-\alpha-fluorenilmetoxicarbonil-N-metilfenilalanina (25 g, 62,3 mmoles) y N-hidroxisuccinimida (7,5 g, 65 mmoles) en 180 ml de THF seco enfriado en un baño de agua fría, se añadió diisopropilcarbodiimida (10 ml, 64,2 mmoles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche, se filtró y se evaporó el filtrado. El residuo se redisolvió entonces en tolueno y hexanos. El compuesto del título se aisló mediante filtración, y se secó para dar 28,3 g (57 mmoles, 91% de rendimiento).

I. Síntesis de éster metílico de N-fluorenilmetoxicarbonil-N-metilfenilalanin-O-terc-butil-tirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina

El éster metílico de fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butil-tirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina (14 g, 14,2 mmoles) se trató con 35 ml de dietilamina y 35 ml de THF a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se evaporó entonces, se resuspendió en 100 ml de THF, y reevaporó tres veces. El residuo se recogió en acetato de etilo y hexanos. El producto, éster metílico de O-terc-butiltirosil-D-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, precipitó, se aisló por filtración y se secó para producir 9,7 g (12,7 mmoles, 90% de rendimiento). El éster metílico de O-terc-butiltirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, se disolvió en 35 ml de THF seco, y se añadió éster N-hidroxisuccinimídico de N-fluorenilmetoxicarbonil-N-metilfenilalanina (6,35 g, 14,2 mmoles), seguido de 3 ml de diisopropil-etilamina, dando como resultado una disolución que tiene un pH de 9. Después de agitar toda la noche, la reacción se evaporó y el residuo se recogió en acetato de etilo. La disolución de acetato de etilo se lavó con ácido cítrico al 5%, con bicarbonato sódico saturado y con salmuera saturada, después se secó sobre sulfato de magnesio, y se evaporó. El residuo se recogió en acetato de etilo, éter y hexanos, y el compuesto del título precipitó. El compuesto precipitado se aisló mediante filtración y se secó para dar 12,4 g del compuesto del título (11,5 mmoles, 81% de rendimiento).

J. Síntesis de N-fluorenilmetoxicarbonil-S-tritilhomocisteína

a. A alrededor de 400 ml de amoníaco líquido, enfriado hasta -78ºC en un baño de hielo seco/etanol, se añadieron pequeñas cantidades de sodio elemental, seguido de una cantidad suficiente de homocisteína para paralizar el color azul resultante de la disolución de sodio/amoníaco hasta que se habían consumido 5,7 g (248 mmoles) de sodio y 9,75 g (36,3 mmoles) de homocisteína, y el color azul de la disolución de sodio/amoníaco persistió durante alrededor de 15 minutos. Se añadió cloruro amónico (0,5 g) para paralizar el color azul final, y después la reacción se retiró del baño de enfriamiento y se dejó que se evaporase el amoníaco en una corriente de argón. El matraz se calentó ligeramente para eliminar esencialmente todo el amoníaco residual.

Al residuo se añadió trifenilmetanol (23,6 g, 91 mmoles), y el matraz de reacción se enfrió en un baño de hielo/agua. Se añadieron 250 ml de ácido trifluoroacético (TFA), y, después de 30 minutos, la mezcla se evaporó y el residuo se redisolvió y se reevaporó tres veces con cloroformo. El residuo se redisolvió entonces en 300 ml de agua, y el pH se ajustó hasta pH 4 con ácido cítrico al 5% y KOH 1 M. El producto precipitó como una goma, y se recogió mediante filtración. El residuo se trituró entonces con éter para producir S-tritil-homocisteína (7 g, 18,6 mmoles, 26% de rendimiento). Se aisló una segunda cosecha del filtrado mediante cristalización en dimetilformamida (DMF)/agua, para dar un rendimiento combinado de 24,2 g (64 mmoles, 89%).

b. A una disolución de S-tritil-homocisteína (20 g, 53 mmoles) en 150 ml de acetona/100 ml de agua, se añadió carbonato de sodio (11,5 g, 109 mmoles), y después carbonato de O-fluorenilmetil-O’-(N-succinimidilo) (17,5 g, 52 mmoles), disuelto en 200 ml de acetona, realizándose estas adiciones durante el transcurso de alrededor de 1 h. La mezcla de reacción se agitó entonces durante alrededor de 2 días, y después se evaporaron los disolventes orgánicos. Al residuo acuoso se añadieron 300 ml de acetato de etilo, y la mezcla se acidificó con HCl 1 M. La fase orgánica se separó y se lavó secuencialmente con HCl 1 M, HCl 0,5 M y HCl 0,25 M, después se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó. El producto bruto se cromatografió sobre gel de sílice (100% de cloroformo-3% de metanol en cloroformo) para producir el compuesto del título (19,4 g, 32 mmoles, 62% de rendimiento).

K. Síntesis de éster metílico de N-fluorenilmetoxicarbonil-S-tritil-homocistein-N-metil-fenilalanin-O-terc-butilti- rosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina

El éster metílico de fluorenilmetoxicarbonil-N-metilfenilalanin-O-terc-butil-tirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxi-
carbonil-lisil-valina (9,8 g, 8,5 mol) se trató con 28 ml de dietilamina y 30 ml de THF, a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se evaporó entonces, se resuspendió en 100 ml de THF, y reevaporó tres veces. El residuo se recogió en acetato de etilo y hexanos. Se precipitó el producto, éster metílico de N-metilfenilalanin-O-terc-butiltirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, se aisló mediante filtración y se secó para producir 4,9 g (8,1 mmoles, 95% de rendimiento).

A una disolución de N-fluorenilmetoxicarbonil-S-tritil-homocisteína, en 50 ml de THF seco enfriado en un baño de enfriamiento a -15ºC, se añadió cloruro de N,N’-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BOP-Cl; 2,47 g, 9,7 mmoles) y 1,7 ml de diisopropiletilamina (9,7 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos. Se añadió éster metílico de N-metilfenilalanin-O-terc-butiltirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina (7,48 g) en 50 ml de THF seco, seguido de 1,7 ml adicionales de diisopropiletilamina. La El volumen de reacción se redujo un 50% mediante evaporación, y después se agitó durante 2 días a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó por evaporación, y el residuo se redisolvió en acetato de etilo, se lavó con ácido cítrico al 5%, con bicarbonato sódico saturado y con salmuera saturada, y se secó sobre sulfato de magnesio. El residuo se recogió en acetato de etilo, éter y hexanos, y se precipitó el compuesto del título. El compuesto precipitado se aisló mediante filtración para dar 10,2 g (6,77 mmoles, 84% de rendimiento).

L. Síntesis de S-tritil-homocistein-N-metilfenilalanin-O-terc-butil-tirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina

Una disolución de éster metílico de N-fluorenilmetoxicarbonil-S-tritil-homocistein-N-metilfenil-alanin-O-terc-
butil-tirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, (10 g, 6,6 mmoles) y LiOH.2H_{2}O, en 50 ml de THF y 4 ml de agua, se agitó durante 3 días. Se añadieron 25% en moles adicionales de LiOH.2H_{2}O, y dos horas después el disolvente se evaporó, y el residuo se redisolvió en acetato de etilo. Esta disolución se lavó entonces con ácido cítrico al 5%, con bicarbonato sódico saturado, y con salmuera saturada, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó. El residuo se redisolvió en acetato de etilo, éter y hexanos, y el compuesto del título precipitó y se aisló mediante filtración y se secó. El producto impuro resultante se cromatografió de forma ultrarrápida en gel de sílice, usando cloroformo/10% de metanol en cloroformo, para producir 3,46 g del compuesto del título puro (47 mmoles, 41% de rendimiento).

M. Síntesis de ciclo-N-metilfenilalanin-O-terc-butiltirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil-valil-S-tritil-homocisteína

Una disolución de S-tritil-homocistein-N-metilfenilalanin-O-terc-butil-tirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbo-
nil-lisil-valina (3,42 g, 2,69 mmoles) disuelta en 1740 ml DMF, se enfrió en un baño de agua con hielo, y se añadieron 1,16 ml de diisopropiletilamina y difenilfosforilazida (DPPA; 5,4 g, 1,16 mmoles). La reacción se incubó -20ºC durante 5 días, y se añadieron 25% en moles adicionales de DPPA, seguido de 100% en moles adicionales de diisopropiletilamina. El disolvente DMF se eliminó entonces por evaporación, y el compuesto del título bruto se cristalizó en acetato de etilo, éter y hexanos, para producir 2,43 g (1,9 mmoles, 69%).

N. Síntesis de ciclo-N-metilfenilalanil-tirosil-D-triptofanoil-lisil-valil-S-tritil-homocisteína

La ciclo-S-tritil-homocistein-N-metilfenilalanin-O-terc-butil-tirosil-_{D}-triptofanoil-N-\varepsilon-terc-butoxicarbonil-lisil- valina (2,34 g, 1,9 mmoles) se trató con 18,7 ml de TFA, 2 ml de diclorometano, 0,94 ml de agua, 0,47 ml de etanoditiol y 0,37 ml de triisopropilsilano durante 1 h a temperatura ambiente. El TFA se eliminó por evaporación, y el residuo se redisolvió y reevaporó en cloroformo tres veces. Después, el residuo se redisolvió en 10 ml cloroformo, y se vertió en 400 ml de éter frío. El precipitado del producto bruto se recogió por filtración y se purificó mediante HPLC de fase inversa preparativa en C18 (usando un gradiente de 30% de acetonitrilo \rightarrow 60% de acetonitrilo en agua, conteniendo todos los disolventes 0,1% de TFA), para dar el compuesto del título (1 g, 1,2 mmoles, 62% de rendimiento). El análisis mediante espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos (FABMS) dio un MH^{+} de 855, en comparación con el valor teórico (medio) predicho de 855,09.

O. Síntesis de ciclo-N-metilfenilalanil-tirosil-D-triptofanoil-lisil-valil-S-tritil-homocisteína, S-2-acetil-glicil-glicil-cisteinil-lisinamida (P587)

La ciclo-N-metilfenilalanil-tirosil-_{D}-triptofanoil-lisil-valil-homocisteína (250 mg, 0,29 mmoles) y la 2-cloroacetil-glicil-glicil-S-tritil-cisteinil-lisilamida (preparada mediante SPPS como se describe en el Ejemplo 1: 238 mg, 0,35 mmoles) se disolvieron en 7 ml de acetonitrilo y 7 ml de una disolución de 100 mM carbonato de sodio/0,5 mM de EDTA, pH 10, y se agitó toda la noche. La mezcla de reacción se evaporó entonces hasta sequedad, y se desprotegió en TFA que contiene triisopropilsilano, como se describe antes en el Ejemplo 1. El compuesto del título se purificó entonces mediante HPLC de fase inversa, para producir 92,4% del rendimiento teórico esperado. El análisis mediante espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos (FABMS) dio un MH^{+} de 1258, en comparación con el valor predicho (medio) teórico de 1257,70. La estructura de este producto, denominado P587, se representa mediante la fórmula:

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Ejemplo 3 Métodos Generales para el Marcaje Radioactivo

Se disolvieron 0,1 mg de un reactivo peptídico preparado como en el Ejemplo 1 en 0,1 ml de agua, o 0,9% de cloruro de sodio, o 10% de hidroxipropilciclodextrina (HPCD), o etanol:agua 50:50, o disolución salina tamponada con fosfato (PBS), o 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH = 5, 6 ó 7,4). El gluceptato de Tc-99m se preparó reconstituyendo un vial Glucoscan (E.I. DuPont de Nemours, Inc., Wilmington, DE) con 1,0 ml de pertecnetato de sodio Tc-99m que contiene hasta 200 mCi, y se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron 25 \mul de gluceptato de Tc-99m al reactivo, y se dejó que la reacción transcurriese a temperatura ambiente, o a 100ºC durante 5-30 minutos, y después se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum.

La pureza del reactivo peptídico marcado con Tc-99m se determinó mediante HPLC, usando las siguientes condiciones: se cargó una columna analítica Waters Delta-Pak RP-18, que tiene dimensiones de 5 \mum x 4,6 mm x 220 mm, con cada péptido marcado radioactivamente, que entonces se eluyeron a un caudal de disolvente de 1 ml/min. El gradiente de elución se realizó durante 10-20 minutos, usando un gradiente lineal, comenzando con 100% de disolvente A (0,1% de TFA/agua) y terminando con 100% de disolución B (0,1% de TFA/90% de acetonitrilo/agua). Los componentes radioactivos se detectaron mediante un detector radiométrico en línea, conectado a un registrador integrador. El gluceptato de Tc-99m y el pertecnetado de sodio Tc-99m eluyen entre 1 y 4 minutos en estas condiciones, mientras que el péptido marcado con Tc-99m eluyó después de una cantidad de tiempo mucho mayor.

La siguiente Tabla ilustra el marcaje exitoso con Tc-99m de péptidos preparados según el Ejemplo 1, usando el método descrito aquí.

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TABLA I

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La radioyodación y radioastatización se realizaron como se describe por Seevers et al. (1982, Chem. Rev. 82: 575-590).

Los complejos de renio no radioactivos se prepararon codisolviendo cada uno de los reactivos de péptidos de la invención con alrededor de un equivalente molar de oxotetrabromorrenato (+5) de tetrabutilamonio, preparado como se describe por Cotton et al. (1966, Inorg. Chem. 5: 9-16) en dimetilformamida o acetonitrilo/agua, y se agitó durante 0,5-5 días. Los complejos de renio se aislaron mediante HPLC de fase inversa, como se describe anteriormente para péptidos marcados con Tc-99m, y se caracterizaron mediante FABMS o ESMS.

Los complejos de renio radioactivos, usando, por ejemplo, Re-186 o Re-188, se prepararon a partir de las sales de perrenato apropiadas, usando el mismo protocolo que para el marcaje con Tc-99m, o añadiendo un agente reductor a una disolución del péptido y perrenato, o usando opcionalmente un agente de transferencia de ligando tal como citrato, e incubando la reacción a una temperatura entre la temperatura ambiente y 100ºC, durante un tiempo entre 5 y 60 minutos.

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Ejemplo 4 Inhibición de la Unión de [^{125}I-Tyr^{11}]Somatostatina-14 a Membranas de Células Tumorales Pancreáticas de Rata AR42J

La capacidad de diversos reactivos de la invención que se unen al receptor de somatostatina para unirse a receptores de somatostatina in vitro se demostró en un ensayo de inhibición de la unión, mediada por el reactivo de péptido, de un análogo de somatostatina marcado radioactivamente a membranas celulares que contienen el receptor de somatostatina.

La estirpe celular tumoral pancreática AR42J de rata, que expresa el receptor de somatostatina, se cultivó en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y 8 mM de glutamina, en una atmósfera de 5% de CO_{2} humidificada, a 37ºC. Las células cosechadas se homogeneizaron en tampón frío (50 mM de Tris-HCl, pH 7,4), y el homogenado se centrifugó entonces a 39.000 g durante 10 minutos a 4ºC. Los peletes se lavaron una vez con tampón, y después se resuspendieron en 10 mM de tampón Tris-HCl (pH 7,4) enfriado con hielo. Después se incubaron alícuotas iguales de esta preparación de membrana celular con [^{125}I-Tyr^{11}]somatostatina-14 (Amersham, Arlington Heights, IL), a una concentración final de 0,5 nM a 750.000 cpm/ml de actividad específica 2000 Ci/mmol, y con un péptido o con un complejo de péptido-renio de la invención (a una concentración final que oscila desde 10^{-11} M hasta 10^{-6}M en 50 mM de tampón HEPES, pH 7,4, que contiene 1% de seroalbúmina bovina, 5 mM de MgCl_{2}, 0,02 mg/ml de bacitracina, 0,02 mg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y 200.000 UI de Trasylol durante 25 minutos a 30ºC.

Después de la incubación, esta mezcla de membrana se filtró a través de un filtro GC/F (Whatman Ltd., Maidstone, Inglaterra), lavado con polietilenimina, usando un colector de filtración, y el residuo que queda en el filtro se lavó tres veces con 5 ml de tampón HEPES frío. El filtro y una muestra de los lavados del filtro se contaron entonces en un contador gamma. Para evaluar la unión no específica, el ensayo también se realizó esencialmente como se describe, en presencia de 200 nM de somatostatina-14 no marcada. El análisis de datos incluye gráficas de Hill de los datos, para producir las constantes de inhibición como se describe mediante Bylund y Yamamura (1990, Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis, Yamamura et al., eds., Raven Press: N.Y.). Los resultados obtenidos usando este ensayo con los reactivos de la invención fueron los siguientes:

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TABLA II

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Estos resultados demuestran que los reactivos peptídicos de la invención se unen con una afinidad elevada a receptores de somatostatina in vitro.

Ejemplo 5 Localización y Formación de Imágenes In Vivo de Tumores que Expresan el Receptor de Somatostatina (SSTR) en Ratas

La formación de imágenes in vivo de receptores de somatostatina expresados por células tumorales de rata se realizó esencialmente como se describe por Bakker et al. (1991, Life Sciences 49: 1593-1601).

Las células tumorales pancreáticas de rata CA20948, descongeladas a partir de pasta de tumor cosechada congelada, se implantaron intramuscularmente en una suspensión de 0,05 a 0,1 ml/animal, en el muslo trasero derecho de ratas Lewis de 6 semanas. Se dejó que los tumores creciesen hasta aproximadamente 0,5 a 2 g, se cosecharon, y la pasta tumoral se usó para implantar en un segundo conjunto de ratas Lewis que no se ha sometido previamente a experimentación. El paso de esta manera se repitió para generar generaciones sucesivas de animales con tumores. Los animales con tumores usados para los estudios in vivo fueron habitualmente los del tercer a quinto paso, y tenían tumores de 0,2 a 2 g.

Para estudios de la especificidad de la localización del radiotrazador en los tumores, se administró a animales seleccionados una dosis subcutánea que bloquea SSTR (4 mg/kg) de octreótido, 30 minutos antes de la inyección del radiotrazador. (Bakker et al. han demostrado que este protocolo da como resultado una reducción de la captación de ^{111}In-[DTPA]octreótido por parte del tumor en un 40%.

Las ratas Lewis que tienen tumores CA20948 de tercer a quinto paso se inmovilizaron, y se les inyectó intravenosamente, vía la vena de la cola dorsal, una dosis de 0,15-0,20 mCi de péptido marcado con ^{99m}Tc, correspondiente a 3 hasta 8 \mug de péptido en 0,2 a 0,4 ml.

En tiempos seleccionados, los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical, y se realizó la necropsia seleccionada. Las muestras de tejido cosechadas se pesaron y se contaron junto con una alícuota de la dosis inyectada, en un contador gamma de pocillos.

En la Tabla 3 se presentan los resultados de la biodistribución de 90 minutos de péptidos seleccionados marcados radioactivamente. Notablemente, ^{99m}Tc-P587, ^{99m}Tc-P617, ^{99m}Tc-P726, y ^{99m}Tc-P736 mostraron una captación tumoral muy elevada y relaciones de tumor/sangre que demuestran su captación específica elevada en el tejido (tumoral) diana.

La Figura 1 muestra una imagen de ^{99m}Tc-P587 en una rata con tumor. La captación elevada en el tumor, en la pata inferior (flecha), es claramente visible.

La captación de ^{99m}Tc-P587 en tumores en ratas se comparó con y sin tratamiento de inyección previa con octreótido, un análogo de somatostatina que se sabe que se une al receptor de somatostatina in vivo. En estos experimentos, el bloqueo del receptor mediante la administración de octreótido, antes de la administración de ^{99m}Tc-P587, redujo en un 76% la captación tumoral específica del péptido marcado radioactivamente. Estos resultados confirmaron que la unión de ^{99m}Tc-P587 in vivo fue específica de SSTR.

TABLA III

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Ejemplo 6 Formación de Imágenes In Vivo de Tumores que Expresan el Receptor Humano de Somatostatina (SSTR), con P587 Marcado con Tc-99m

En un ensayo clínico, se lograron formaciones de imágenes gammagráficas de pacientes humanos que tienen tumores que expresan SSTR, usando el reactivo P587 marcado con Tc-99m.

Un total de 10 pacientes, cuatro hembras y seis varones, que oscilan desde 27 hasta 69 años de edad, han sido diagnosticados previamente con adenoma de la pituitaria que segrega hormona de crecimiento (4 pacientes), con melanoma (1 paciente), cáncer medular de tiroide (1 paciente), carcinoma pulmonar microcítico (SCLC; 1 paciente), linfoma que no es de Hodgkin (1 paciente) o con carcinoide gástrico (1 paciente). A cada uno de estos pacientes se les administró P587 marcado con Tc-99m, a una dosis de 10-22 mCi por 0,2-0,5 mg, mediante inyección intravenosa. Después, se realizó la formación de imágenes gammagráficas como se describe aquí, en cada paciente, durante 4 horas tras la inyección.

La formación de imágenes mediante cámara gamma comenzó simultáneamente con la inyección. Se adquirieron imágenes anteriores como un estudio dinámico (adquisiciones de imágenes de 10 segundos) durante los primeros 10 minutos, y después como imágenes estáticas a 1, 2, 3 y 4 h después de la inyección. Las imágenes anteriores se adquirieron para 500.000 recuentos o 20 min. (lo que sea más corto), a aproximadamente 10-20 min., y a aproximadamente 1, 2, 3 y 4 h después de la inyección.

Se encontró que el agente formador de imágenes gammagráficas se aclara rápidamente del torrente sanguíneo, dando como resultado una permanencia en la circulación de menos de 10% de la dosis inyectada dentro de los 30 minutos de la inyección. Esto permitió la adquisición de imágenes de sitios tumorales tan pronto como 15-30 minutos después de la inyección del agente formador de imágenes gammagráficas. Todos los tumores conocidos se detectaron en este estudio, así como dos lesiones metastásicas no detectadas previamente, que fueron confirmadas posteriormente usando tomografía asistida por ordenador (barrido de CAT).

Estos resultados demostraron que los agentes de la invención formadores de imágenes gammagráficas fueron muy eficaces detectando tumores primarios y metastásicos que expresan SSTR en seres humanos in vivo.

Se debe de entender que la descripción anterior enfatiza ciertas realizaciones específicas de la invención, y que todas las modificaciones o alternativas equivalentes a ellas están dentro del espíritu y del alcance de la invención, como se expone en las reivindicaciones anejas.

Claims (15)

1. Una composición de materia que comprende un péptido de unión específica enlazado covalentemente a un resto complejante de ion metálico, en la que el péptido se une específicamente a receptores de somatostatina, teniendo el reactivo la fórmula:

ciclo\underline{(N-CH_{3})-Phe-Tyr-(}D\underline{-Trp)-Lys-Val-Hcy.}(CH_{2}CO.X)

en la que X es un resto complejante de ion metálico que tiene la fórmula

-(aminoácido)_{n}-B-(aminoácido)_{m}-Z,

en la que B es un resto que contiene tiol, que es, cisteína, homocisteína, isocisteína, o penicilamina;

(aminoácido)_{n} y (aminoácido)_{m} son, cada uno independientemente, cualquier \alpha- o \beta-aminoácido primario que no comprende un grupo tiol;

Z es -OH o -NH_{2};

n es un número entero entre 2 y 5; y

m es un número entero entre 0 y 5;

con la condición de que el reactivo no tenga ninguna de las siguientes fórmulas:

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2. Un reactivo para preparar un agente formador de imágenes gammagráficas, para formar imágenes de un sitio en un cuerpo de un mamífero, opcionalmente un sitio de un tumor primario o metastásico, que expresa el receptor de somatostatina, que comprende una composición de materia según la reivindicación 1.

3. Un agente formador de imágenes gammagráficas que comprende un reactivo según la reivindicación 2, en el que el resto de unión al marcador radioactivo está unido a tecnecio-99m.

4. Un complejo formado haciendo reaccionar un reactivo de la reivindicación 2 con tecnecio-99m en presencia de un agente reductor, por ejemplo ion estannoso, o marcando un reactivo de la reivindicación 2 con tecnecio-99m mediante intercambio de ligando de un complejo de tecnecio-99m reducido previamente.

5. Un kit para preparar una preparación radiofarmacéutica, comprendiendo dicho kit un vial cerrado herméticamente que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de la reivindicación 2 y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar el reactivo con tecnecio-99m.

6. Un método para marcar un reactivo según la reivindicación 2, que comprende hacer reaccionar el reactivo con tecnecio-99m en presencia de un agente reductor, por ejemplo ion estannoso.

7. Una composición de materia que comprende un péptido de unión específica enlazado covalentemente a un resto complejante de iones metálicos, en la que el péptido se une específicamente a receptores de somatostatina, teniendo el reactivo la fórmula:

ciclo\underline{(N-CH_{3})-Phe-Tyr-(}D\underline{-Trp)-Lys-Val-Hcy.}(CH_{2}CO.X)

en la que X es un resto complejante de ion metálico que tiene la fórmula

-(aminoácido)_{n}-B-(aminoácido)_{m}-Z,

en la que B es un resto que contiene tiol, que es, cisteína, homocisteína, isocisteína, o penicilamina;

(aminoácido)_{n} y (aminoácido)_{m} son, cada uno independientemente, cualquier \alpha- o \beta-aminoácido primario que no comprende un grupo tiol;

Z es -OH o NH_{2};

n es un número entero entre 2 y 5; y

m es un número entero entre 0 y 5;

en la que el resto complejante de ion metálico está unido a un ion metálico, por ejemplo renio, cinc o estaño; opcionalmente, siendo el ion metálico un ion metálico que emite partículas \beta, por ejemplo renio-186 o renio-188, o un ion metálico que emite electrones de conversión, por ejemplo estaño-117m;

con la condición de que, cuando el ion metálico es tecnecio-99m, el reactivo no tenga ninguna de las siguientes fórmulas:

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8. Una composición de materia según la reivindicación 7, en la que el reactivo tiene la fórmula:

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9. Una composición de materia según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que está marcada radioactivamente, preferiblemente está marcada con yodo-123, yodo-125, yodo-131, o astato-211.

10. Una composición de materia según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que el resto complejante de ion metálico está unido a un ion metálico paramagnético, por ejemplo hierro o cobre, opcionalmente en la que el reactivo está unido a una partícula superparamagnética.

11. Un agente formador de imágenes para diagnóstico, que comprende la composición según la reivindicación 9 o la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende la composición de materia de la reivindicación 1, la reivindicación 7, la reivindicación 8, la reivindicación 9 o la reivindicación 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. El uso de una composición de materia de la reivindicación 1, la reivindicación 7, la reivindicación 8, la reivindicación 9 o la reivindicación 10, un reactivo de la reivindicación 2, un agente de la reivindicación 3, o un complejo de la reivindicación 4, en la preparación de un medicamento para formar imágenes de un sitio en un cuerpo de un mamífero.

14. El uso de una composición de materia de la reivindicación 1, la reivindicación 7, la reivindicación 8, la reivindicación 9 o la reivindicación 10, o una composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la preparación de un medicamento para tratar un animal que tiene un tumor cancerígeno o benigno, o que tiene células neoplásicas o metastásicas que expresan un receptor de somatostatina.

15. El uso de un agente formador de imágenes de la reivindicación 3, o una composición de materia de la reivindicación 9, para la preparación de un medicamento para la cirugía guiada mediante radioisótopos, en la que se extirpa el tejido que contiene células neoplásicas o metastásicas identificadas mediante localización de radioactividad a partir de la composición de materia administrada.