JPH06505795A - キレート化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術分野はキレート化剤、特に二官能キレート化剤、並びに放射線療法 における治療剤として使用するための接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）であって 、部位特異的化合物、キレート化剤および放射性同位体を含む金属イオンから成 る接合体に関する。

一つの観点によれば、本発明は、モノクロナル抗体のような標的細胞結合タンパ ク質または部位特異的化合物に接合した放射性同位体のような金属イオンに対す るキレート化剤を用いることを含む、細胞疾患、特に癌の処置法に関する。

別の観点によれば、本発明は、モノクロナル抗体のような標的細胞結合タンパク 質または部位特異的化合物に接合した金属キレートを診断用に使用する方法に関 する。

背景技術 放射線療法は、癌や他の局部的疾患の処置において古（から利用されている。

放射線の魅力は、特定の小さな標的に放射性粒子のエネルギーを集束させること ができることである。化学的療法の場合には、全身が治療剤にさらされるが、放 射線療法の場合には、治療剤にさらされる部分は最小限にすることができる。放 射線療法の一つの欠点は、標的となる癌細胞を破壊する過程において、放射線が 他の組織を透過することである。従って、放射線の影響は、限定的な部位以外の より全身的な部分にも及ぼされるので、放射線療法は患者にとっては非常に危険 なものであり、衰弱した患者にとっては禁忌である。

放射線療法に関係する問題の多くは、現在の放射線送給法によっては最適なタイ プの治療用放射線を利用することができないことに起因する。利用可能な放射性 物質の物性は、加療技術に一定の制限をもたらす。例えば、外部加療の場合には 、放射線が標的に達するまでの距離が長いので、必然的にベータ線またはガンマ 線を使用しなければならない。このような長い距離を進行するのに十分なエネル ギーを有するアルファ放射線は一般的には不適当であるが、これは、アルファ放 射線が標的に達するまでに透過する組織に大きな損傷を与えるだけでなく、適当 な同位体の取扱いが格別困難だからである。それにもかかわらず、アルファ放射 線は短い透過距離と格別の殺傷効果をもたらすので、大抵の細胞毒治療に対して は、理想的なタイプの殺傷放射線とされている。その結果、非常に大きなアルフ ァ粒子を用いて透過細胞に致死的損傷を与えようとする場合には、低い線量で十 分である。しかしながら、アルファ粒子エネルギー、適当な半減期および標的設 定や取扱いの問題を適切に組み合せることが困難なため、アルファ粒子治療は、 加療技術のなかで最適な療法であることは証明されていない。

癌腫瘍の治療における放射線の外部加療とは別の方法は、内部加療法、即ち、注 射等によって、放射線を内部から特異的に標的設定する方法である。このような 治療法においては、放射線の有効な透過距離は、周囲組織の過度の被曝が回避で きる程度に短いのが好ましく、また、放射性分子の半減期は、自由循環性または 非特異的結合性の放射性治療化合物とその分解生成物による全身的な被曝が最小 限になる程度に短いのが好ましい。

この技術の最初の適用例は、甲状腺腫瘍に対する放射性ヨウ素の投与であった。

この方法は、ヨウ素が甲状腺に特異的に吸収されると共にヨウ素同位体の半減期 が適当に短いために、有効なものであった。しかしながら、この方法は非常に限 定された治療法であって、別のタイプの癌には適用できない。

部位特異的化合物または標的細胞結合タンパク質、例えば、特定の細胞に対して 高特異的に標的設定し得るモノクロナル抗体、ポリクロナル抗体、モノクロナル 抗体フラグメントおよび結合タンパク質等の開発によって、特定の標的細胞へ治 療剤を選択的に送給することが可能となった。現在一般におこなわれている内部 標的療法は、標的機構としてこの種のモノクロナル抗体を使用することによって 、これらに結合した放射性同位体を特定の標的へ送給することに主として向けら れている。例えば、ガンソウ（Ｇａｎｓｏｖ）らによる米国特許第４．４５４． １０６号明細書には、放射性金属、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴ ＰＡ）誘導体とキレートを形成したビスマス−２１２（Ｂｉ”りを、内部標的療 法に利用するためにモノクロナル抗体と接合する方法が教示されている。最も望 ましい特性を有する放射性分子は一般に金属類であるので、キレートのような適 当なケージング（ｃｏｇｉｎｇ）剤を、放射性金属を結合させるために、抗体に 結合させる。これらのタイプの化合物に関する問題は、キレートの抗体からの解 離および同位体に対する結合親和性を有するキレートの消失をもたらすキレート 結合の弱い強度に主として起因するものであり、この結果として、患者の体内を 放射性同位体が自由に循環することになる。

抗体標的療法の発展における主要な問題は、標的分子に放射性同位体を安定に結 合させることが困難なことである。この一般的な分野において最も進歩したもの は、放射性イメージング（ｉ＠ａｇｉｎｇ）用に合成された錯体である。この種 の化合物には、共有結合またはキレート結合したベータ線またはガンマ線放射性 同位体が含まれる。これらの化合物のうちで最適なものは、半減期が短くて、体 外へ速かに排出される結合安定度の非常に高い放射性同位体である。

細胞を殺傷するための標的放射性同位体錯体には、現在のところ有効な解決策が 見出されていない特有の問題がある。高エネルギーのアルファ線、ベータ線およ びガンマ線を放射する同位体は、それらの効果が遠距離まで及ぶので望ましくな い。。半減期の長い放射性同位体は、例えば、トリチウムの場合のように、速か に希釈または排出されない限り、長期間にわたって作用するので許容できない。

しかしながら、この種の分子は周囲の包囲分子と速かに交換するので、標的化さ れた状態で長期間にわたって作用を及ぼし続けることはない。適当なエネルギー と半減期を有し、アルファ粒子を放射する同位体は非常に少なく、また、該同位 体を用いて標的分子を捕捉し、両者を結合させることは極めて困難である。

最小の効能を示すものとして現在までに調製されたアルファ線のみを放射する標 的錯体は、抗体に結合したＤＴＰＡとキレート化したＢ１２Ｈの錯体である。Ｄ ＴＰＡ−ビスマスの安定度定数（Ｋｓ）は２ｏ、５であり、この値は、この種の 目的のために現在得られている最良の値である。しかしながら、この治療用錯体 を用いる治療は、キレート化剤からビスマスが急速に失われるので、あまり有効 なものではない。この欠点は、該鎖体を標的器官へ直接注射することによっであ る程度改良することができる。しかしながら、この方法は投与法としてはあまり 望ましいものではなく、標的効果は極めて低い。また、転移癌細胞を同時に治療 することは実際上不可能である。

この種の錯体を設計する場合の別の視点は、捕捉性化合物の特異性である。多く のキレート形成性化合物およびかご状体形成性化合物は種々のイオンを保有して いる。このことは、種々のタイプの一価または二価イオンを相当な濃度で含有す る体内の生理学的環境下では問題となる。これらの生理学的イオン類が捕捉性化 合物と結合しかつその速度が交換反応にとって好適であるならば、放射性同位体 のような金属イオンは速かに遊離される。従って、送給される金属イオン類に対 して高い特異性を示す捕捉性化合物を使用するのが望ましい。

適当な放射性同位体の選択は、標的放射線療法の別の重要な視点となる。外部治 療の場合には、経済的な利用から寿命の長い同位体が一般的に使用され、身体に 対する線量は照射時間によって調整される。しかしながら、放射性分子を体内へ 投与する場合には、治療用化合物の分解がおこるため、半減期の短いものを使用 する必要がある。理想的には、標的細胞を殺傷するのに十分な時間をもたらすよ うな半減期が好ましい。このような短くて正確な半減期に関する基本的な問題は 、治療用化合物の製造、投与および放射能が有効レベル以下に減衰する前の細胞 殺傷時間の確保が困難であるということである。多くの利用可能な物質の製造手 段はサイクロトロンを必要とするので、このような物質は通常の用途には利用で きない。製造にサイクロトロンを必要としない利用可能な物質のなかで、Ｂｉ２ １２とｐｂＨｌは、許容される放射エネルギーと半減期特性を有するので、かな りの注目をあつめた。しかしながら、実際に利用されているのはＢｉｔ＋！のみ である。

この理由は、これらの利用可能な物質のなかで、キレート化されて適度の有効性 を発揮したアルファ線放射体はＢｉ２１１のみだからである。現場での製造と単 離が可能であるという観点から、より利用可能性の高い物質は、７　ｈ！！ｌか ら製造されるＰｂ！ｌ！である。

発明の開示 この発明は、新規なキレート化剤、並びに部位特異的化合物、キレート化剤およ び放射性同位体のような金属イオンから成る治療用または診断用の新規な接合体 を開示する。

この発明はまた、癌の免疫療法やその他の用途に利用するための物質であって、 モノクロナル抗体のような部位特異的化合物に結合された放射能標識化物質の製 造方法を開示する。放射能標識化物質は、部位特異的化合物に結合されたキレー ト化剤またはケージング剤のような捕捉性化合物（ｅｎｔｒａｐｐｆｎｇ　ｃｏ 園ｐｏｕｎｄ）中に保持される。

マクロサイクル類はカチオンと結合した原子によって区画された二次元的空洞を 有しており、この種の大環状化合物は幅広く研究されている。マクロサイクル類 とマクロトリサイクル類はマクロポリサイクル類として包括的に知られており、 この種の大環状化合物は比較的最近になってから研究されるようになっている。

マクロポリサイクル類は種々の結合部位によって区画された三次元的分子内空洞 を有しており、また、包接錯体形成能を有し、球状金属カチオンと選択的に結合 する。これらの化合物は中間サイズのメソ分子であって、多くの新規特性を有し ており、超分子化学の新しい分野を開くものである。

酸素原子、硫黄原子および窒素原子の結合部位によって区画されるクリプタンド 類は市販のマクロサイクル類から合成することができ、これらのサイズ：まブ撃 ノ・ソジの長さによって決定され、下記の１から７ｉ二なる１こ従って漸増する 。

これらの配位子の錯体形成に関する研究から次のことが判明してしＸる。即ち、 これらの配位子は有機溶媒中においては塩解離し、そうでな書すれ１ｆ不溶性で あり、不溶性塩は水に溶解する。数種のクリブテートの結晶構造の決定から、カ チオンは分子空洞の内部に位置することが確認されてし）る。これらのイし合物 １ま比較的安定であって、解離速度は、マクロサイクル類または多価アニオン配 位子、例え＋ｆ。

エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ ）およびメソ−２，３−ジメルカブトコ／１り酸等から形成されるキレートの解 離速度に比べて数桁も遅い。

クリプタンドの結合における選択性は、空洞サイズ選択性の原理に基づくもので あって、好ましいカチオンは、その大きさが空洞サイズに最も近接するものであ る。酸素結合部位を窒素原子や硫黄原子で置き換えると、安定性も選択性も低下 する。クリプタンドは、ラットからの放射性ストロンチウム−８５およびラジウ ム−２２４を排出させるのに使用されており、マクロポリサイクルはアルファ線 放射体の反跳エネルギーに耐えるべきである。

タイプＣのマクロトリサイクル類２３〜２７はアルカリカチオンやアルカリ土類 カチオンの錯体形成に使用されており、対称的単核鎖体や対称的複核錯体を形成 することが判明している。

これらの錯体は１：１および２：１のカチオン：配位子化学量論比をそれぞれ有 ０３）２を用いて処理することによって、２種の等核錯体［２Ａｇ　２５］と［ ２Ｐｂ　２５］および異核錯体［Ａｇ　Ｐｂ　２５］の平衡混合物を形成する。

従って、類似のマクロトリサイクル類からは、２種のアルファ線放射体、例えば 、ｐｌ、！Ｉ！とＢｉ！＋　２との異核錯体の形成が期待される。

これらのクリプタンドとマクロトリサイクルには、低いＫｓ値と早い金属交換能 を有するキレート化剤が接合される。このようにして調製される新規なキレート 他層は、速かに金属イオンを取り込み、高い安定性を示す。

この発明の目的は、新規なキレート化剤を提供することである。

この発明の別の目的は、部位特異的化合物、キレート化剤および放射性同位体の ような金属イオンから成る新規な治療用または診断用の接合体を提供することで ある。

この発明のさらに別の目的は、部位特異的化合物、キレート化剤および放射性同 位体のような金属イオンから成る新規な治療用または診断用の接合体を使用する ことを含む、細胞疾患の有効な処置法を提供することである。

この発明のさらにまた別の目的は、健全な細胞の破壊をほとんどまたは全くもた らさないで、病変細胞に対して選択的に標的設定して致死線量の放射線を照射す る方法を提供することである。

発明の実施態様 この発明は、新規な金属キレート接合体、並びに部位特異的化合物、キレート化 剤および放射性同位体のような金属イオンから成る治療用または診断用接合体を 開示する。

キレート化剤や他のケージング剤は、鉛捕捉用の従来技術において知られている 。これらの化合物はいくつかのクラスに分類されており、各クラスには、いくつ かの特別な具体的化合物が知られている。これらの特別な化合物は、既知のコア （ｃｏｒｅ）分子の普通の誘導体または修飾体である。このような化学的変形は 好ましいので、いずれの捕捉性分子もｐｂ２１！送給錆体に要求される厳格な要 件に適合させることができる。このようなりラスに属する化合物としては次のも のが例示される。

金属カルボニル類　Ｍ（Ｃｏ）ス 上記の化学式中において、Ｙは抗体反応性基を示す。

この発明の新規性は、上記の２種またはそれ以上のキレート化剤を組み合せて新 規なキレート化剤を形成させる点にある。これらのキレート化剤のなかには、放 射性同位体を含む金属イオンに対する高い親和力および高い安定度定数（Ｋｓ） を有するものがある。この成分の特徴は、種々の金属イオンに対して間隔を置い て強く結合する金属結合配位子であって、キレート化された金属と安定に相互作 用することである。該成分は１個よりも多くの金属イオンと結合することもある 。

上述のキレート化剤の多くのクラスのうちで、チオール類似体はこのような特性 を発揮する。

このような高い親和力を有するキレート化剤には、Ｋｓ値は低いが、金属イオン を早く取込む１種または２種以上のキレート化剤、例えば、エチレンジアミン四 酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２．３−ジメル カプト−１−プロパンスルホン酸（２，３ＤＭＰＳ）またはメソ−２，３−ジメ ルカプトコハク酸（２，３ＤＭＳＡ）を反応させる。これらの成分は、早い金属 交換能を有することによって特徴づけられ、安定度は、金属がキレート化される と低下する。

本発明による新規な二官能性キレート化剤としては、ジメルカプトコハク酸２分 子と結合した１、　４．１０．１３−テトラオキサ−７，１６−シアザシクロオ クタデカン（ＴＤＣＯＤＸ実施例１参照）およびＤＴＰＡ１分子または２分子と 結合したＴＤＣＯＤが例示される。

三次元的に言えば、本発明による新規なキレート化剤は、１本または２本以上の 突出アーム（ａｒ−）　（低いＫｓ値を有するキレート化剤）を具有する二次元 的または三次元的分子内空洞（高親和性キレート化剤または結合性基）を有する マクロサイクルまたはマクロポリサイクルを含む。金属イオンは、早い取り込み 特性と突出アームを有するキレート化剤とキレート化された後、親和性の高いキ レート化剤の空洞内へ誘引される。２種または３種のキレート化剤が組み合わさ れて配位結合の様式で分子内相互作用をすることによって、高いＫｓ値を有する 安定なキレート化剤が形成される。

キレート化剤が組み合わされ、キレート化された金属がＰｂの場合、標準的なＰ ｂアッセイによれば、本発明による新規なキレート化剤からはｐｂは放出されな い。

これらの高度に安定で新規なキレート化剤は生体内において有用である。何故な らば、金属イオンは、部位特異的化合物によって所望の部位まで送給される前に キレートから放出されることがないからである。適切な部位へ送給されると、普 通の放射性崩壊が起こり、標的細胞は破壊されるが、放射線の照射範囲外の細胞 は損傷を受けない。放射性崩壊が完結した後、通常の身体処置（ｂｏｄｙ　ｐｒ ｏｃｅｓｓｅｓ）によって金属イオンおよびそのキレート化剤を排出させる。

空洞および１または２以上のアームを有するキレートは直接または挿入連結基を 介して結合させることによって２種のキレート化剤を連結させてもよい。これら のキレート化剤の連結によって本発明による新規なキレート化剤が形成されると 、部位特異的化合物、例えば、モノクロナル抗体が、構成成分であるキレート化 剤の一方または他方に結合することができる。モノクロナル抗体は金属イオンの キレート化の前または後のいずれにおいて結合させてもよい。

本発明の実用的な見地からは、２群のケージング分子、即ち、キャプテンおよび クリプテートが好ましく、これらの化合物にはＫｓ値の低いキレート化剤、例え ば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡＳＤＭＰＳまたはＤＭＳＡを結合させてもよい。キャプ テンおよびクリプテートは分子内に物理的に限定された空間内に放射性同位体を 含む金属イオンを保有する。これらの化合物における金属の捕捉力は、金属イオ ンに対するイオン結合、および合成後に単にキレート化されるよりも合成過程に おいて金属イオンの周囲に実際に配置される包囲分子の構造に由来する。クリプ テートは２つのグループの錯体であって、三次元的な分子ケージングを有する。

これらの化合物の主要な利点は、高いＫｓ値を付与し、交換速度が遅く、また、 Ｐｂ！Ｉ！やＢｉＯ２のような特殊な金属イオンに対する高い特異性を付与し得 ることである。

従来、Ｐｂ！＋！を標的分子に有効に結合させることは極めて困難であったが、 その後の研究の結果、ｐｂ！＋１を癌の放射線治療の放射性同位体として選択す ることが可能となった。例えば、ｐｉ、！１１はアルファ粒子を放出するいくつ かの崩壊経路を有するので、製造のためにサイクロトロンを必要とすることなく 、天然元素源から容易に製造することができる。癌細胞の内部的標的処置に放射 性同位体を利用する場合の基本的な２つの課題、即ち、半減期と単離の容易性を 検討することによって、ＴｈｔＨｌからｐｌ、！＋１１１の崩壊経路が放射性同 位体源として好ましいことが判明している。

安定なＰｂ２０ｓに崩壊する前のｐｂ！＋２の半減期は１０．６時間である。半 減期はどちらかと言えば短い方が理想的なので、このような半減期は、治療用錯 体の製造と精製、患者への投与および癌細胞への照射時間に関して十分に許容さ れるものである。付随的な利点として、ｐｂ２１１は局部的な細胞を死傷させる のに理想的なエネルギーを有するアルファ粒子を放出する。アルファ粒子は、約 ４〜５個の腫瘍細胞直径に相当する組織透過要約８０μｍを通過する約８．８Ｍ ｅｖのエネルギーを有する。従って、ｐｌ、Ｈ！からのアルファ粒子は、結合部 位に対して非常に局部的な細胞のみを死傷させる特性を有する。

ｐｂ！＋２は、所望の用途に利用するために簡易かつ効率よく経済的に製造精製 するのに適している。本発明による新規な二官能性キレート化剤は、標的性分子 に鉛を結合させることが困難であった従来の問題点を解消し、金属イオンとして Ｐｂ１′２を選択することを可能にする。

鉛のみを含むように設計されるこの種の化合物は、空状態（捕捉金属イオンを含 まない状態）でモノクロナル抗体に結合することができるので、Ｐｂ！＋１を捕 捉するのに利用できる。あるいは、鉛を最初に捕捉性化合物にキレート化させ、 次いでモノクロナル抗体に結合させてもよい。

Ｐｂ２Ｉ！を放射線療法における治療剤として使用する場合、本発明の一態様に よるこの種の療法には、ｐｂ！＋１を適当な抗体−キレート化錯体溶液に溶解さ せることによって、該錯体内にＰｂ！′！を捕捉する過程が含まれる。内部投与 による療法の場合、キレート化錯体は濾過処理と精製処理に付した後、投与に供 される。

特に、界面縮合や当該分野において既知の他の常套法によって抗体が接合された ｐｂＨ！抗体−キレート化錯体は、遊離の未結合同位体から最初に分離するのが 好ましい。該溶液は遠心分離処理に付してもよいが、この操作を効果的におこな う好ましい方法は、該溶液をイオン交換カラム、例えば、アンバーライト（／ｖ ｂ−ｅｒｌｉｔｅ）　Ｉ　ＲＡ　−４００、ドーヴエックス（Ｄｏｗｅｘ）１ま たはこれらと同等のイオン交換樹脂を充填したカラムを通した後、第２のイオン 交換カラム、例えば、セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５また はＧ−５０カートリツジに通すことによって、錯体を遊離の同位体から有効に分 離させる方法である。次いで、精製錯体は、濾過処理に付すことによって含有固 形分を除去した後、滅菌処理に付す。得られた物質は、放射能を有することを確 認分析した後、患者への注射投与に供される。

ｐｂ！＋２は半減期が短いので、生成後は、遅滞なく加工処理して投与するのが 好ましい。

本発明においては、Ｐｂ！＋！の使用が好ましいが、アルファ線、ベータ線、ガ ンマ線または陽電子放射性金属、オージェ電子放射体および蛍光性ランタニドを 治療および診断の目的に使用してもよい。

本発明によるキレート化剤は、金属イオンを速かに取り込むという利点を有する 。金属イオンを取り込むと、捕捉性キレート死刑自体が折りたたむので、金属イ オンは非常に安定なキレート化剤と強（結合する。金属イオンは、外来的金属イ オンとの交換がほとんどおこらないような状態で結合する。これらの化合物のう ち最良のものは、半減期が短くて非常に安定に結合した放射性同位体をもたらし 、該同位体は体外へ速かに排出される。

部位特異的化合物または標的細胞結合タンパク質、例えば、モノクロナル抗体、 ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体フラグメント、および高い選択性で特定の 細胞を標的化し得る結合タンパク質を本発明による新規な三官能キレート化剤と 併用することによって、治療剤を特定の標的細胞へ選択的に送給することが可能 となる。モノクロナル抗体と組み合せたキレート化剤は生体内または生体外にお いて、診断的評価、癌やその他の疾患の処置および放射線免疫療法等において利 用することができる。

この発明の一つの態様は、本発明による三官能キレート化剤の解毒剤としての用 途である。この態様の場合、モノクロナル抗体または他の標的化分子は不要であ る。それどころか、場合によっては、金属イオンを含まないキレート化剤を生体 内または生体外で投与してもよい。このようなキレート化剤は不必要な金属イオ ンを取り込む。その後、キレート化された金属およびキレート化剤は排出させる 。

本発明の別の態様は、金属キレート接合モノクロナル抗体を生体内へ投与し、該 接合体が局在化するのに十分な時間放置し、局在化が起こる場合にはその程度と 位置を確認することを含む生体内診断法である。本発明にはまた、キレート接合 モノクロナル抗体を用いる生体外分析法が含まれる。本発明による接合抗体は外 来金属またはキレート結合の弱い金属は実質上含有しない。

本発明による金属キレート接合抗体は、標準的な生理的食塩水を含む適当な調剤 キャリヤーと共に生体内に投与してもよい。溶液中の金属キレート接合抗体の濃 度は適宜選択すればよく、１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度は容易に達成できるが 、特定の用途に応じて変化させればよい。キャリヤー中の生物学的活性物質の適 当な濃度は、当該分野の常套基準によって決定すればよい。

使用する放射線の有効な線量または有効な金属含有量は、個々の用途の特色によ って左右される。例えば、腫瘍を処置する場合の有効な線量等は、特に、腫瘍の 苦しみや発作（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）等によって左右される。同様に、 金属キレート接合抗体を診断目的に用いる場合の使用量は、特に、使用する検出 装置や検査部位の場所等によって左右される。

以下の実施例は本発明を例示的に説明するものであって、本発明の範囲はこれら によって限定されるものではない。

以下の反応によって、対角方向に対置した原子に結合した２本のアームを有する ２次元的空洞を保有する本発明によるキレート化剤を得た。これらのアームは多 価アニオン錯化剤から形成される。１．４．１０．１３−テトラオキサ−７，１ ６−シアザシクロオクタデカン（ＴＤＣＯＤ）２３■ｇ（０，０１モル）をアセ トニトリル１園ｌ中に分散させ、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）３７ｍｇ（ ０，０２モル）を添加した。次いでジオキサン１■ｌおよびＥＣＤＩ（１−［３ −（ジメチルアミノ）プロビルコー３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド） ３８ｍｇ（０，０２モル）を添加し、黄色分散液を窒素ブランケットを用いて撹 拌した後、真空ラインによって排気した。反応を３日問おこない、濃黄色溶液を 褐色ペーストから分離し、蒸発処理に付した。

褐色の粘着性半固体状物を乾燥し、該乾燥固体１２ｍｇを水１■ｌに溶解させた 後、ＥＣＤ１５■ｇをｐＨ５の条件下で添加した。この溶液２００μｍを９．２ ．２７抗体１■ｌにｐＨ６，５の条件下で添加した。この混合物を一夜撹拌した 後、ＮＡＰ−５を用いて分離させた。ＰｂＯｚ２ｍｇを添加した混合物中のｐｂ の濃度を経時的に測定した。結果を以下の表１に示す。

１５分間　１１ ４時間　２３ ２２時間　１０ ２２時間後の試料をＮＡＰ−５を用いて処理した後、ｐｂを分析した結果、ｐｂ 対抗体比は２．５：１であることが判明した。この試料約１膳ｌを、アセトアミ ド−ＨＣｌ発生器からのＨ，Ｓを用いて処理した。試料を１４．００　Ｏｒｐｍ の条件下で２分間回転処理に付したところ、上澄み液中のｐｂの濃度はｇｐｐ■ であった。消失した２　ｐｐｍのｐｂはＤＭＳＡに結合したものと考えられる。

実施例２ ジメルカプトコハク酸とクラウンＴＤＣＯＤおよび９．２．２７抗体との反応以 下の反応によって、対角方向に対置した原子に結合した２本のアームを有する２ 次元的空洞を保有する本発明によるキレート化剤を得た。これらのアームは多価 アニオン錯化剤から形成される。ＴＤＣＯＤ５７ｍｇを、ジメチルアセテート（ ＤＭＡｃ）２ｍｌにＤＭＳＡ８０■ｇを溶解させた溶液と窒素雰囲気下で加熱混 合し、次いで、ＥＣＤ１３８■ｇを添加して得られた鮮やかなオレンジ色の溶液 を一夜撹拌した。次いで、ＥＣＤ１１６鵬ｇを添加し、混合物を加温し、１５分 間撹拌した後、該混合物２００μｍを９．２．２７抗体１１．５■ｇ／鵬ｌに添 加した。ｐＨを６．５に調整した後、ＤＭＳＡ−クラウン１８を添加したところ 、モノクロナル抗体のｐＨは５．４に低下した。該混合物を反応させた後、反応 混合物をニック（Ｎｉｃｋ）カラムを用いて精製した。全黄色物はカラム上に保 持され、濾液は無色であった。

実施例３ ＤＴＰＡとＴＤＣＯＤおよび９．２．２７抗体との反応以下の反応によって、対 角方向に対置した原子に結合した２本のアームを有する２次元的空洞を保有する 本発明によるキレート化剤を得た。これらのアームは多価アニオン錆化剤から形 成される。ＤＴＰＡ７１ｗ＋ｇ（０，０２モル）をＴＤＣＯＤ　２６ｍｇ（０， ０１モル）と混合し、これにＤＭＡｃｌ■１を添加した。次いで、トリエチノげ ミン（ＴＥＡ）３０μｌを添加し、混合物を撹拌した。ＤＭＡｃをさらに１ｍｌ 添加し、１時間後、ＴＥＡをさらに３０μｌ（３０ｍｇ）添加した。混合物を透 明になるまで加熱した。透明溶液からアリコート１００μｌを採取し、これを９ ．２゜２７抗体１ｍ１（１１，９ｍｇ）に加えた。次いで、ＴＥＡ５μｌを添加 してｐＨを８．５にした透明溶液を２時間撹拌した。この溶液をＮＡＰ−５を用 いて精製した。得られた溶液中のタンパク質の濃度は５．８＋ｇ／票ｌであった 。Ｐｂ０２３■ｇを抗体含有溶液の一部に加え、回転処理をおこなった後、上澄 み液中のｐｂの含有量を経時的に測定したところ、０．５時間後および２．５時 間後はそれぞれ９μｇおよび２４μｇであった。

抗体含有溶液の別の一部にＰｂＮ０ｓ６０ｐｐ園を添加し、３０分後、溶液をＮ ＡＰ−５を用いて精製し、精製物を原子吸光法で分析したところ、ｐｂの濃度は １５１）ｐｌｌであり、このことはｐｂ対抗体比が３：１であることを示す。Ｎ ＡＰ−５を用いて再精製した試料中のｐｂの濃度は７ｐｐｍであった。

実施例４ 以下の反応によって、マクロサイクルが対角方向に対置した原子に、多価アニオ ン錯化剤から形成されるブリッジによって連結された本発明によるマクロ多環キ レート化剤を得た。９．２．２７抗体１１．５■ｇを溶解させ、ｐＨを８．５に 調整し、次いで、ＴＤＣＯＤ対ＤＴＰＡのモル比を１：１にする以外は実施例３ の場合と同様にして調製したＴＤＣＯＤ−ＤＴＰＡｌｌｌｇをＤＭＡｃ（ペース ト）５０μｌに加えた。無色透明混合物をＥＣＤＩａ■ｇの存在下で１時間撹拌 した後、ＮＡＰ−５を用いるゲル精製処理に付した。ＨＰＬＣにより、マルチマ ー中に接合抗体が２０％含まれることが判明した。

精製試料の一部をＰｂ０２３■ｇと１５分間混合した後、３０．０００ｒｐ■の 条件下での遠心分離処理に２分間付した。上澄み液を原子吸光法によって分析し たところ、腸Ａｂ−ＴＤＣＯＤ−ＤＴＰＡ錯体によってＰｂが１５ｐｐ飄取り込 まれたことが判明した。９．２．２７抗体とＰｂ０２３ｍ１ｇを溶解させたコン トロール試料の場合には、抗体によってｐｂがＯｐｐ■取り込まれた。

精製したｍＡｂ−ＴＤＣＯＤ−ＤＴＰＡ錯体の別の一部をＰｂ０２３■ｇと２時 間反応させた。反応混合物を遠心分離処理に付した後、低温保存した。この試料 中のｐｂの濃度は２９ｐｐｍであった。ＮＡＰ−５（２５０μｌ）を用いて精製 した試料中のｐｂの濃度は６ｐｐｍであった。

３番目の試料はＰｂ０ｚと反応させた後、３日間保存し、過剰のｐｂは遠心分離 によって除去した。上澄み液中のｐｂの濃度は９７ｐｐｍであった。

実施例５ ＤＴＰＡ−クラウン１８と９．２．２７抗体との反応ＤＴＰＡ−クラウン１８８ ｓ＋ｇを９．２．２７抗体１１．５−ｇとｐＨ７，４の条件下で１０分間反応さ せた。ＮＡＰ−５を用いて反応混合物０．５■ｌを精製しく溶離剤：　１　ｍｌ ）、精製物をＰｂＮＯｓと反応させ、反応生成物をＮＡＰ−５を用いて再び精製 した。過剰のＰｂＮＯｓはＰ　ｂ　Ｃｌ　ｔとして沈澱させ、遠心分離した。Ｎ ＡＰ−５で精製した試料中のｐｂは１０４ｐＩ）■であり、Ｐｂ対抗体比は３３ ：１であった。

実施例６ ＤＴＰＡ−クラウン１８と９．２．２７接合体およびｐｂとの反応９、２．２７ 抗体１１．５＋ｗｇ（７，４Ｘ　１０−”モル）オにヒＤＴＰＡ−’ｙ５つ：ｚ １８５．０■ｇを乾燥ＤＭＡｃ１２０μｍとＴＥＡ５μｌに溶解させ、１時間混 合した。

無色透明な液体をＧ−２５セフアデツクスを用いるゲル濾過処理に付した。

；−（Ｄ接合体１）一部（０，５ｍ１）をＰｂＯｔｌｍｇとｆｉ合Ｌ、別ｆ）一 部Ｃ０，５ｉ＋１）をｐｂＮＯ３と混合した。両方の試料をＮＡＰ−５を用いる ゲル濾過処理に付した後、３時間撹拌し、ｐｂの濃度を測定したところ、前者の 場合は２６ｐ−であり、後者の場合は６７ｐｐｍであった。

ＰｂＮＯｓ試料１００．ｃｚｌをＰＢＳ４００μ１ｍ’希釈し、ＰＢＳ４００μ ｌを用Ｌ　Ｎて溶離させるＧ−５０クロマトグラフイー処理をおこなった後、原 子吸光分析をおこなったところ、２１）ｐ■のｐｂが残存することが判明し、こ のことはｐｂ対抗体比が３：１であることを示す。

ＰｂＮＯｓ試料の場合のｐｂの濃度は翌日は３１ｐｐｍで、１週間後は４５ｐｐ ｍとなった。

これらの結合はｐＨ１０，５で安定であり、この錯体は生体内安定性にとって極 めて適したものである。

実施例８ 化合物３５を以下の反応経路に従って合成した。

ジアミンス旦の一方のアミノ基を、ベンゼンに溶解させたベンジルクロロフォー メートを用いて保護し、化合物スリを得た（ジアミン：クロロフォーメート＝１ １）。ジアシルジクロリド控、３」ゆおよび３０ｃを用いる化合物用の縮合によ ってジアミド３１ａ、１」よおよび３１ｃをそれぞれ得た。これらのジアミド、 ハ、３２ｂおよび３２ｃを得た。これらの２工程における収率は約９０％であっ た。

次の工程は、前述のマクロポサイクルック系の合成に用いた手順と非常に類似を 、テトラヒドロフランに溶解させたジボランと１０時間還流させることによって 還元した。得られた生成物を、５Ｎ　ＨＣＩと約１０時間還流させることによっ て加水分解し、次いで該水溶液を、水酸化物形態の第４級アンモニウム樹脂カラ 基を、液体アンモニアとエチルアミンの１：１混合物中でのナトリウム処理によ って本発明によるキレート化剤が得られる。

実施例９ 実施例８記載の方法によって合成される種々の化合物は、モノクロナル抗体に結 合させるのに適した他の化合物およびＰｂ２＋！を速かに取り込む化合物に変換 することができる。このような応用例を以下に示す。以下に示す反応によって、 マクロサイクリック系セグメントを連結するブリッジに結合したアームを有する 三次元的空洞を保有するマクロポリサイクルを含む本発明によるキレート化剤が 得られる。該アームがポリアニオン錯化剤から形成される同族体も同様にして合 成することができるが、これらについては以下に示さない。

↓■＾ｂ 上記の成長において、ｎは１，２または３等の数を示し、ＹはＣＨ８、ＯＳＮま たＳ等を示し、Ｄは０ＳＮＨまたはＳ等を示し、Ｅは０ＳＮＨまたはＳ等を示し 、ＸはＣＨ，、Ｏ，Ｓ、−Ｚ−ＥＤＴＡ、−Ｚ−ＤＴＰＡｔたｌｔ−Ｚ−ＤＭＳ Ａ等を示し、ＺはＥＤＴＡやＤＴＰＡ等の多価アニオン錯化剤とＸとの間のスペ ーサーを示す。

化合物３２ｂを高希釈条件下、塩基としてのトリエチルアミンの存在下において 、二酸りロリド控と反応させることによって化合物３６を得た。テトラカルボキ サミド官能基の還元を、テトラヒドロフラン溶媒中、水素化アルミニウムリチウ ムと還流させることによっておこない、これによって化合物旦ユを得た。

液体アンモニアとエチルアミンの１：１混合物を用いる脱保護処理によって化合 物３９を得た。次いで、ジシクロへキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシコハ ク酸イミドで処理することによって酸官能基を易脱離性基に変換させ、これによ って、モノクロナル抗体旦との反応に適合する化合物４０を得た。得られた生成 物は部位特異的送給特性およびｐｂ２１２のようなアルファ線放射体に対するレ セプ多価アニオン錯化剤（ＥＤＴＡ）−マクロサイクリック系（１８−クラウン −６）−モノクロナル抗体接合体４６の合成経路の概要を以下に示す。以下の反 応によって、１本のアームを有する二次元的空洞を保有する本発明によるキレー ト化剤を得た。このアームは多価アニオン錯化剤から形成される。

ＥＤＴＡのエチルトリエステルを水性条件下でＥＤＣＩ（カップリング剤）を用 いてそのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体に変換させた後、１８−クラウン −６の単−保護誘導体用と反応させることによって化合物■を得た。該エチルエ ステルとベンジルクロロフォーメート官能基の加水分解をＨＢｒ（４８％）を用 いて一段階でおこなった後、生成物を適当な溶媒の存在下でブロモアセチルプロ ミドと反応させることによって化合物見を得た。この化合物４５をモノクロナル 抗体と反応させることによって、鉛と錆化して放射性免疫接合体を形成し得る接 合体並を得た。

この合成法を応用することによって、ＤＴＰＡやＤＭＳＡ等の他の錆化剤を使用 することができる。モノクロナル抗体と反応する官能基とマクロサイクル間のア ームの長さは変化させることができるので、モノクロナル抗体のリジンのアミノ 基と反応する官能基も変化させることができる。従って、α−ブロモアセテート の代りにアジド、ジアゾ、イソチオシアネート、イソシアネート、チオールおよ びヒドラジド等を合成することが可能である。

実施例１１ １８−クラウン−６およびＤＭＳＡ（時化剤）から成る放射性免疫接合体の調製 法を以下に示す。以下の反応によって、対角方向に対置した原子に結合した２本 のアームを有する二次元的空洞を保有する本発明によるキレート化剤を得た。こ れらのアームは多価アニオン錯化剤から形成される。

化合物λ旦を２倍モルのアクリロニトリルと反応させた後、ジポランで還元させ ることによってジアミンＵを得た。このジアミンを、メソ−２，３−ジメルカプ ト無水コハク酸から誘導された化合物見と反応させることによって化合物Ｕを得 た。化合物見を試薬５０と反応させて得られた化合物見１をヒドラジン水和物で 処理することによってヒドラジド旦７を得た。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用い て炭水化物セグメントからアルデヒド官能基を形成させる酸化反応に用いたモノ クロナル抗体を化合物５２と反応させることによって、ｐｂ！１１と錆化して所 望の放射性免疫接合体を形成し得る接合体を得た。

実施例１２ マクロサイクルユニットがＤＴＰＡユニットと環化した錯化剤の合成法を以下に 示す。マクロサイクルが、多価アニオン錯化剤から形成されるブリッジによって 、対角方向に位置した原子に結合した本発明によるマクロポリサイクリック系の キレート化剤を以下の反応によって得た。

１８−クラウン−６ユニツトはアジド官能基を有するアームを保有しており、該 官能基は光分解によってモノクロナル抗体と反応し、生成する免疫接合体はアル ファ線放射体と錆化する。

化合物５４は高希釈条件下でＤＴＰＡと反応し、環化によって化合物５５を生成 する。トンレートをアジ化ナトリウムで置換させて得られるアジド基含有化合物 ５６をモノクロナル抗体の存在下で光分解させることによって、アルファ線放射 体と錆化し得る接合体５７を得た。

実施例１３ 別の接合体の合成法を以下に示す。Ｋｓ値の低いキレート化剤、例えば多価アニ オン錯化剤を化合物６３に結合させることによって本発明によるキレート化剤を 得た。

マクロビサイクル５８の芳香族ニトロ基が出発物質として作用する。触媒として Ｐｄ／Ｃ（１０％）を用いる水素化によって芳香族アミン５９が得られる。塩酸 と硝酸ナトリウムの反応によって発生する亜硝酸にょるジアゾ化によってジアゾ ニウム塩スリが得られる。このジアゾニウム塩をモノクロナル抗体のチロシンと カップリングさせることによって化合物見１を得るが、または、アジ化ナトリウ ムとの反応によってアジド且に変換させた後、モノクロナル抗体の存在下での光 分解によって所望の接合体６３を得る。化合物見１と６３はいずれも放射性免疫 療法に利用可能である。

実施例１４ 修飾されたモノクロナル抗体と反応するキレート化剤の合成法を以下に示す。

マクロサイクリック系セグメントを連結するブリッジ上に結合したアームを有す る三次元的分子間空洞を保有するマクロポリサイクルを含む本発明によるキレー ト化剤を以下の反応によって調製した。

化合物６４を市販の無水物６５と反応させて対応するアミド川を得た。ヒドロキ シルアミン塩酸塩を用いて保護基を除去することによって得られるチオール本発 明による新規キレート化剤の安定性、特に結合した鉛を逆境下で保持する機能を 調べる試験をおこなった。

この実施例においては、実施例３に示すような構造を有するかご状体に結合した アミノへキシルセファロースのスラリーを使用した。硝酸鉛を該ゲルに全体で約 ２００μｇ添加したところ、はとんど全部がかご状体に吸収された。脱イオン水 で十分に洗浄したゲルを１ｍｌの懸濁液とし、洗浄液に対する吸収物に基づくＰ ｂ量を測定した。洗浄水中のｐｂはＯｐｐ■であり、約２００μｇがゲル中に保 持された。

最初の一連の試験においては、かご状体を水（コントロール）、かご状体中の鉛 を置換させるＭｎＣ１、またはかご状体中の鉛を引き抜くキレート化剤ＤＴＰＡ を用いて処理した後に残存する結合鉛の量を測定した。錯体形態のＰｂ４０μｇ を脱イオン水を用いて８０℃で１ｍｌに希釈した。また、錯体形態のＰｂ４０μ ｇとＭｎ０１８０μｇを脱イオン水を用いて８０℃で１腸ｌに希釈した。さらに 、錯体形態のＰｂ４０μｇとＤＴＰＡ８０μｇを脱イオン水を用いて８０℃で１ ｍｌに希釈した。

０時間後、１時間後、３時間後、および２４時間後にアリコートを採取した。各 試料を回転処理に付すことによって、Ｐｂと結合したかご状体を含むかご状体を 除去し、上澄み液中のｐｂの含有量（μｇ）を原子吸光法によって測定した。結 果を以下の表２に示す。

表２の結果から明らかなように、実験条件下では、非常に微量の鉛がかご状体か ら脱離された。

かご状体のｐＨ安定性を調べるため、ｐｂ錯体１４μｇをｐＨが７．８．９．１ ０．１１．１２、または１３の水溶液（１ｍｌ）に添加した。０時間後、１時間 後、および２４時間後にアリコートを採取した。各試料を回転処理に付すことに よって、ｐｂと結合したかご状体を含むかご状体を除去し、上澄み液中のｐｂの 含有量（μｇ）を原子吸光法によって測定した。ｐＨが１２と１３のときには鉛 の放出が即座に観測されたので、その後はこれらのｐＨ値での測定はおこなわな かった。得られた結果を以下の表３に示す。

表３の結果から明らかなように、かご状体はｐＨ７〜１０までは非常に安定であ るが、ｐＨ１１になると安定性は約５０％低下し、ｐＨが１２以上になると安定 性はほとんど１００％低下する。

最後に、競合的なキレート化剤ＤＭＳＡを使用してかご状体の経時的な安定性を 調べた。錯体形態のＰｂ１２μｇとジメルカプトコハク酸６０μｇを脱イオン水 を用いて１璽１に希釈した。０時間後、１時間後、および５日後にアリコートを 採取した。各試料を回転処理に付すことによって、ｐｂと結合したかご状体を含 むかご状体を除去し、上澄み液中のｐｂの含有量（ｐｐ■）を原子吸光法によっ て測定した。得られた結果を以下の表４に示す。

０時間後　３ １時間後　３ ５日後　５ 表４の結果から明らかなように、かご状体の経時的安定性は相当に高く、ｐｂは ほとんど離脱しなかった。

実施例１６ ９．２．２７モノクロナル抗体（ｍＡｂ）１１．５ｓ＋ｇ（７，４ｘｌＯ−”モ ル）を２−１のエツペンドルフガラスびんに入れ、ＤＴＰＡｌ、４ｍｇ（３，７ ｘｌＯ−＠モル）（５０モル過剰）を添加した。系のｐＨを７．８〜９．２の範 囲に調整した。１０分後、試料０゜５■ｌをＮＡＰ−５を用いて精製した。０Ｄ ２８０は５．３ｍｇ／ｍｌであった。

３０分後に別の試料０．５脂ｌをＮＡＰ−５を用いて精製した（ＯＤ２８０＝４ ゜２　ｍｇ／■ｌ）。第２の試料を過剰の酸化鉛（ｒＶ）と２０分間反応させた 後、３０，００Ｑｒｐ■での遠心分離処理に８分間性した。上澄み液中のｐｂの 濃度は１８ｐｐＨ（８−８Ｘ１０−’モル／■ｌ）であり、これはｐｂ対抗体比 ３：１に相当する。

試料Ｑ、５ｍｌを再び遠心分離に付した後、次の試験のために保存した。３時間 保存した後の上澄み液中のｐｂの濃度は１７〜１ｇｐｐ■であった。５時間保存 後の試料をＮＡＰ２．７−ｇ／■ｌを用いて精製したところ、ｐｂの濃度は５ｐ ｐ■（２，４１ＸＩＯ−８モル／■１）であり、これはｐｂ対抗体比２：１に相 当する。この試料を冷蔵原内で週末にかけて保存した後、ＮＡＰ−５カラムを通 し、ｐｂの濃度を原子吸光分析によって測定したところ２ｐｐ−であった。

９、２．２７モノクロナル抗体（■Ａｂ）２■ｌをエラペンドルツガラスびんに 入れ、ＤＴＰＡを添加して上記の操作を繰り返し、ｐＨを７．８〜９゜２の範囲 に調整した。

試料をＰｂＮＯｓの飽和溶液１０μｌと２０分間反応させた後、３０，０００ｒ ｐ■での遠心分離処理に８分間性した。上澄み液中のｐｂの濃度は４７ｐｐ−（ ２，３５ｘｌｏ−７モル／■ｌ）であり、これはｐｂ対抗体比７：１に相当する 。この試料は安定であり、数日後のｐｂの濃度は４７ｐｐ腸のままであった。

実施例１７ ４．７．１３．１６．２１．２４−へキサオキサ−１，１０−ジアザビンクロ［ ８，８゜８］ヘキサコサンおよびベンゾ誘導体とＰｂ０ｚとの錆化速度クリブチ −ドア腸ｇを水５論ｌに溶解させ、該溶液にＰｂ０ｚ５鵬ｇを撹拌下で添加した 。３．００　Ｏｒ−での遠心分離処理に１０分分間性た後、上澄み液２００μｍ を経時的に採取し、ｐｂの濃度を原子吸光法によって測定した。結果を以下の表 ６以下の表７に、種々のキレート化剤を用いて鉛をキレート化した場合の結果を 示す。キレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレ ントリアミン五酢酸（ＥＤＰＡ）、２．３−ジメルカプト−１−プロパンスルホ ン酸（２，３ＤＭＰＳ）およびメソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（２，３Ｄ ＭＳ　Ａ）を使用した。すべての鉛の濃度はｐ一単位である。７０ｐｐｍよりも 高い値はオフスケールとみなされるので正確ではない。酸化鉛の量が１ｍｇの場 合においても鉛の濃度にはほとんど差がなく、このことは、鉛の取り込み量がキ レート化剤の反応性によって決定されることを示す。

１ｍｇ　６．００　４．００　２１５．ＯＱ　７２．ＯＱ　１６１．００２＋＊ ｇ　１，００　２．００　２４０．００　７３．００　１ｇ４．００３ｍｇ　１ ．００　３．００　２４０．００　７３．００　１８５．００４＋ａｇ　１．０ ０　３．００　２４３．００　？３．００　１８６．００５ｍｇ　１．００　３ ．００　２４１．００　７３．００　１８８．００ＰｂＩＩ酸化物 １ｍｇ　１２６．００　２３２．００　２１４．００　？４．００　２４．００ ２ｍｇ　２０４．００　２３５．００　２２９．００　７３．００　４０．００ ３ｍｇ　２２８．００　２３７．００　２３３．００　７３．００　５０．００ ４■ｇ　２２８．００　２３０．００　２４１．００　７３．００　４１．００ ５ｍｇ　２３１．００　２４２．００　２４４．００　７３．００　２０．００ 実施例３で調製した接合体の生体外での細胞毒活性を以下の手順によって評価し た。

ウェルあたり１０４個のＭ２１−ＵＣＬＡ黒色腫細胞を９６−ウェルプレート内 において、１０％ＣＯ２雰囲気下（３７℃）、ＲＰＭ１１６４０［牛胎児血清（ ＦＢＳ）１０％含有接地〕１００μｍ中で培養した。２４時間後、栄養素を除去 し、金属キレート免疫接合体を種々の濃度で含有するＲＰＭＩ１００μｌで置き 換えた。金属キレート免疫接合体は、実施例３に記載したように、ＴＤＣＯＤ− ＤＴＰＡ、ｐｂｏｚおよび９．２．２７モノクロナル抗体から調製した。金属キ レート免疫接合体含有栄養素を３０分後に除去し、ウェルを元の培地を用いて３ 回すすいだ後、元の培地中で細胞の培養を続行した。２４時間後、１μＣｉの３ Ｈ−チミジンを含有する培地１０μｊを添加し、チミジンの取り込み量を測定し た。チミジンはＤＮＡな取り込まれるので、チミジンの取り込みを利用すること によって、細胞の生存度に関係するＤＮＡ合成を調べることができる。さらに１ 日培養をおこなった後、培養プレートをショック凍結させ、次いで解凍させ、個 々のウェル中の内容物をガラス繊維フィルターを通過させた。放射能を測定し、 細胞の生存度の尺度とした。

生体外アッセイの結果から、接合体に関しては高い細胞毒活性が示された。

実施例２０ 生体内での結合特異性と親和性に関するアッセイ実施例３で調製した接合体に関 する生体内での結合特異性と親和性を以下の手順によって評価した。

胸腺欠損ＢＡＬＢｃ（ヌード／ヌード）マウスに、２Ｘ１０＠個のＭ２１−ＵＣ ＬＡ黒色腫細胞を皮下注射した。２週間後、金属キレート免疫接合体３５μｇを 尾静脈に注射した。４８時間後、被験マウスを死亡させ、個々の器官内の放射能 を測定した。金属キレート免疫接合体はＴＤＣＯＤ　ＤＴＰＡ、Ｐｂ０ｚおよび ９゜２．２７モノクロナル抗体を使用し、実施例３記載の方法に従って調製した 。

腫瘍を有するヌードマウスを用いて得られた生体内での生分布データから、接合 体が高い結合特異性と親和性を有することが示された。また、血液、肝臓、腎臓 、膵臓および腸内での接合体の濃度が低いことから明らかなように、未結合接合 体は体外へ排出される。

産業上の利用分野 本発明による二官能性キレート化剤は放射線療法における治療剤として有用であ る。

この種のキレート化剤は、部位特異的化合物または標的細胞結合タンパク賀（例 えば、モノクロナル抗体）に接合した金属イオン（例えば、放射性同位体）用キ レート化剤を投与することによって細胞疾患、特に癌を治療する場合に利用でき るだけでなく、生体外または生体内での診断的な目的にも利用できる。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１分子成分と第２分子成分を含有し、該第１分子成分が、金属イオンに対 する高い親和性と高いＫｓ値を有しかつ該第２分子成分の少なくとも１つに結合 したキレートであり、該第２分子成分が、低いＫｓ値と早い金属交換能を有する キレートである金属イオンキレート化剤。 ２．１または２以上の金属イオンと結合後に高い安定性を示す請求項１記載の金 属イオンキレート化剤。 ３．第１分子成分が２つの第２分子成分に結合した請求項１記載の金属イオンキ レート化剤。 ４．第２分子成分が金属イオンとキレートを形成し、該金属イオンが、第２分子 成分が折りたたまれて第１分子成分と配位結合を形成する分子間相互作用をする ような状態で第１分子成分とキレートを形成する請求項１記載の金属イオンキレ ート化剤。 ５．第２分子成分が、金属有機物、金属カルボニル、ポリチオールおよび錯体か ら成る群の成分である請求項１記載の金属イオンキレート化剤。 ６．第２分子成分が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリア ミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（２ ，３ＤＭＰＳ）およびメソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（２，３ＤＭＳＡ） から成る群の成分である請求項５記載の金属イオンキレート化剤。 ７．第１分子成分が、クラウンエーテル、クラウンアゾ、ポリポルフィリン、か ご状化合物およびクリプテートから成る群の成分である請求項１記載の金属イオ ンキレート化剤。 ８．第１分子成分が１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシク ロオクタデカン（ＴＤＣＯＤ）、かご状化合物およびクリプテートから成る群の 成分である請求項７記載の金属イオンキレート化剤。 ９．遷移金属、アルカリ土類金属およびランタニドから成る群の金属イオンとキ レートを形成する請求項１記載の金属イオンキレート化剤。 １０．アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ線または陽電子放射体、オー ジェ電子放射体および蛍光性ランタニドから成る群の放射性同位体とキレートを 形成する請求項１記載の金属イオンキレート化剤。 １１．放射性同位体がＰｂ２１２とＢｉ２１２から成る群の放射性同位体である 請求項１０記載の金属イオンキレート化剤。 １２．金属イオンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートである第１ 分子成分および低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである第２分子成 分を含み、該第１分子成分が少なくとも１つの該第２分子成分に結合し、１また は２以上の金属イオンとキレートを形成し、かつ標的細胞結合タンパク質に結合 した金属イオンキレート化剤の接合体であって、該標的細胞に対する結合特異性 と結合親和性およびキレート化剤活性を有する接合体を含有する、標的細胞での 局部的細胞毒効果誘発用組成物。 １３．キレート化剤が１または２以上の金属イオンと結合した後で高い安定性を 示す請求項１２記載の組成物。 １４．第１分子成分が２つの第２分子成分に結合した請求項１２記載の組成物。 １５．第２分子成分が金属イオンとキレートを形成し、該金属イオンが、第２分 子成分が折りたたまれて第１分子成分と配位結合を形成する分子間相互作用をす るような状態で第１分子成分とキレートを形成する請求項１２記載の組成物。 １６．第２分子成分が、金属有機物、金属カルボニル、ポリチオールおよび錯体 から成る群の成分である請求項１２記載の組成物。 １７．第２分子成分が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリ アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ ２，３ＤＭＰＳ）およびメソ−２，３−ジメカプトコハク酸（２，３ＤＭＳＡ） から成る群の成分である請求項１２記載の組成物。 １８．第１分子成分が、クラウンエーテル、クラウンアゾ、ポリポルフィリン、 かご状化合物およびクリプテートから成る群の成分である請求項１２記載の組成 物。 １９．第１分子成分が１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシ クロオクタデカン（ＴＤＣＯＤ）、かご状化合物およびクリプテートから成る群 の成分である請求項１８記載の組成物。 ２０．金属イオンキレート化剤が、遷移金属、アルカリ土類金属およびランタニ ドから成る群の金属イオンとキレートを形成する請求項１２記載の組成物。 ２１．金属イオンキレート化剤が、アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ 線または陽電子放射体、オージェ電子放射体および蛍光性ランタニドから成る群 の放射性同位体とキレートを形成する請求項１２記載の組成物。 ２２．放射性同位体がＰｂ２１２とＢｉ２１２から成る群の放射性同位体である 請求項２１記載の組成物。 ２３．標的細胞結合タンパク質が、モノクロナル抗体、ポリクロナル抗体、抗体 フラグメントおよび結合タンパク質から成る群の成分である請求項２２記載の組 成物。 ２４．標的細胞結合タンパク質がモノクロナル抗体である請求項１２記載の組成 物。 ２５．標的細胞結合タンパク質がモノクロナル抗体のフラグメントである請求項 １２記載の組成物。 ２６．（ｉ）金属イオンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートであ る第１分子成分および低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである第２ 分子成分を含み、該第１分子成分が少なくとも１つの該第２分子成分に結合し、 １または２以上の金属イオンとキレートを形成し、かつ標的細胞結合タンパク質 に結合した金属イオンキレート化剤の接合体であって、該標的細胞に対する結合 特異性と結合親和性およびキレート化剤活性を有する接合体を含有し、該標的細 胞に局部的細胞毒効果を誘発するのに有効な量の組成物、並びに薬理学的に許容 され得るキャリヤーを配合し、（ｉｉ）該配合物を該標的細胞に投与することを 含む、標的細胞での局部的細胞毒効果誘発方法。 ２７．標的細胞が哺乳類のホストに寄生された請求項２６記載の方法。 ２８．組成物とキャリヤの配合物を、局所投与、静脈内投与、皮下投与または腹 腔内投与によって投与する請求項２６記載の方法。 ２９．キレート化剤が１または２以上の金属イオンと結合した後で高い安定性を 示す請求項２６記載の方法。 ３０．第１分子成分が２つの第２分子成分に結合した請求項２６記載の方法。 ３１．第２分子成分が金属イオンとキレートを形成し、該金属イオンが、第２分 子成分が折りたたまれて第１分子成分と配位結合を形成する分子間相互作用をす るような状態で第１分子成分とキレートを形成する請求項２６記載の方法。 ３２．第２分子成分が、金属有機物、金属カルボニル、ポリチオールおよび錯体 から成る群の成分である請求項２６記載の方法。 ３３．第２分子成分が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリ アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ ２，３ＤＭＰＳ）およびメソ−２，３−ジメカプトコハク酸（２，３ＤＭＳＡ） から成る群の成分である請求項３２記載の方法。 ３４．第１分子成分が、クラウンエーテル、クラウンアゾ、ポリポルフィリン、 かご状化合物およびクリプテートから成る群の成分である請求項２６記載の方法 。 ３５．第１分子成分が１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシ クロオクタデカン（ＴＤＣＯＤ）、かご状化合物およびクリプテートから成る群 の成分である請求項３４記載の方法。 ３６．遷移金属、アルカリ土類金属およびランタニドから成る群の金属イオンと キレートを形成する請求項２６記載の方法。 ３７．金属イオンキレート化剤が、アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ 線または陽電子放射体、オージェ電子放射体および蛍光性ランタニドから成る群 の放射性同位体とキレートを形成する請求項２６記載の方法。 ３８．放射性同位体がＰｂ２１２とＢｉ２１２から成る群の放射性同位体である 請求項３７記載の方法。 ３９．標的細胞結合タンパク質が、モノクロナル抗体、ポリクロナル抗体、抗体 フラグメントおよび結合タンパク質から成る群の成分である請求項２６記載の方 法。 ４０．標的細胞結合タンパク質がモノクロナル抗体である請求項２６記載の方法 。 ４１．標的細胞結合タンパク質がモノクロナル抗体のフラグメントである請求項 ２６記載の方法。 ４２．（ｉ）金属イオンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートであ る第１分子成分および低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである第２ 分子成分を含み、該第１分子成分が少なくとも１つの該第２分子成分に結合しか つ１または２以上の金属イオンとキレートを形成した金属イオンキレート化剤の 接合体であって、該標的細胞に対する結合特異性と結合親和性およびキレート化 剤活性を有する接合体を含有し、体内の標的細胞に結合し得る有効量の組成物、 並びに許容され得るキャリヤーを配合し、（ｉｉ）該配合物を該標的細胞に投与 し、（ｉｉｉ）該金属イオンキレート化剤を検出することを含む、生体内診断法 。 ４３．（ｉ）金属イオンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートであ る第１分子成分および低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである第２ 分子成分を含み、該第１分子成分が少なくとも１つの該第２分子成分に結合しか つ１または２以上の金属イオンとキレートを形成した金属イオンキレート化剤の 接合体であって、該標的細胞に対する結合特異性と結合親和性およびキレート化 剤活性を有する接合体を含有し、試験媒体内の標的細胞に結合し得る有効量の組 成物、並びに許容され得るキャリヤーを配合し、（ｉｉ）該配合物を該標的細胞 に投与し、（ｉｉｉ）該金属イオンキレート化剤を検出することを含む、生体外 診断法。 ４４．（ｉ）金属イオンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートであ る第１分子成分を、低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである少なく とも１つの第２分子成分と反応させ、（ｉｉ）反応生成物を回収することを含む 金属イオンキレート化剤の製造方法。 ４５．以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の工程を含む、少なくとも１つの活性結合部位 を有する標的細胞結合タンパク質に結合した金属イオンキレート化剤の接合体を 含有する標的細胞での局部的細胞毒効果誘発性組成物の製造方法：（ｉ）金属イ オンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートである第１分子成分を、 低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである少なくとも１つの第２分子 成分と反応させ、 （ｉｉ）反応生成物（金属イオンキレート化剤）を回収し、（ｉｉｉ）標的細胞 結合タンパク質の水溶液で水性相を形成させ、（ｉｖ）該水性相と不混和性の相 中に金属イオンキレート化剤を供給して界面を形成させ、 （ｖ）１種または２種以上の標的細胞結合タンパク質と１種または２種以上の金 属イオンキレート化剤との界面縮合反応をおこなって標的細胞結合タンパク質と 金属イオンキレート化剤との間に１または２以上の共有結合を形成させることに よって、これらの化合物の接合体を形成させ（但し、該標的細胞結合タンパク質 の活性結合部位は縮合反応から保護する）、（ｖｉ）該接合体の金属イオンキレ ート化剤を金属イオンと反応させることによって、金属イオンキレートー標的細 胞接合体を形成させ、（ｖｉｉ）該金属イオンキレートー標的細胞接合体を回収 する。 ４６．以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の工程を含む、少なくとも１つの活性結合部位 を有する標的細胞結合タンパク質に結合した金属イオンキレート化剤の接合体を 含有する標的細胞での局部的細胞毒効果誘発性組成物の製造方法：（ｉ）金属イ オンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートである第１分子成分を、 低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである少なくとも１つの第２分子 成分と反応させ、 （ｉｉ）反応生成物（金属イオンキレート化剤）を回収し、（ｉｉｉ）該金属イ オンキレート化剤に金属イオンを反応させることによって金属イオンキレートを 形成させ、 （ｉｖ）標的細胞結合タンパク質の水溶液で水性相を形成させ、（ｖ）該水性相 と不混和性の相中に金属イオンキレート化剤を供給して界面を形成させ、 （ｖｉ）１種または２種以上の標的細胞結合タンパク質と１種または２種以上の 金属イオンキレート化剤との界面縮合反応をおこなって標的細胞結合タンパク質 と金属イオンキレート化剤との間に１または２以上の共有結合を形成させること によって、これらの化合物の接合体を形成させ（但し、該標的細胞結合タンパク 質の活性結合部位は縮合反応から保護する）、（ｖｉｉ）該接合体を回収する。 ４７．（ｉ）金属イオンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートであ る第１分子成分および低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである第２ 分子成分を含有し、キレート化剤活性を有する金属イオンキレート化剤の接合体 を許容され得るキャリヤーに有効量配合し、（ｉｉ）該配合物を投与することを 含む金属イオンの除去方法。 ４８．キレート化剤が１または２以上の金属イオンと結合した後で高い安定性を 示す請求項４７記載の方法。 ４９．第１分子成分が２つの第２分子成分に結合した請求項４７記載の方法。 ５０．第２分子成分が金属イオンとキレートを形成し、該金鋼イオンが、第２分 子成分が折りたたまれて第１分子成分と配位結合を形成する分子間相互作用をす るような状態で第１分子成分とキレートを形成する請求項４７記載の方法。 ５１．第２分子成分が、金属有機物、金属カルボニル、ポリチオールおよび錯体 から成る群の成分である請求項４７記載の方法。 ５２．第２分子成分が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリ アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ ２，３ＤＭＰＳ）およびメソ−２，３−ジメカプトコハク酸（２，３ＤＭＳＡ） から成る群の成分である請求項４７記載の方法。 ５３．第１分子成分が、クラウンエーテル、クラウンアゾ、ポリポルフィリン、 かご状化合物およびクリプテートから成る群の成分である請求項４７記載の方法 。 ５４．第１分子成分が１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシ クロオクタデカン（ＴＤＣＯＤ）、かご状化合物およびクリプテートから成る群 の成分である請求項５３記載の方法。 ５５．金属イオンキレート化剤が、遷移金属、アルカリ土類金属およびランタニ ドから成る群の金属イオンとキレートを形成する請求項４７記載の方法。 ５６．金属イオンキレート化剤が、アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ 線または陽電子放射体、オージェ電子放射体および蛍光性ランタニドから成る群 の放射性同位体とキレートを形成する請求項４７記載の方法。 ５７．放射性同位体がＰｂ２１２とＢｉ２１２から成る群の放射性同位体である 請求項５６記載の方法。 ５８．金属イオンに対する高い親和性と高いＫｓ値を有するキレートである第１ 分子成分および低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである第２分子成 分を含有し、該第２分子成分が該第１分子成分と２つの位置で結合することによ って、該第１分子成分の２つのセクション間にブリッジが形成された金属イオン キレート化剤。 ５９．キレート化剤が１または２以上の金属イオンと結合した後で高い安定性を 示す請求項５８記載の金属イオンキレート化剤。 ６０．第２分子成分が金属イオンとキレートを形成し、該金属イオンが、第２分 子成分が折りたたまれて第１分子成分と配位結合を形成する分子間相互作用をす るような状態で第１分子成分とキレートを形成する請求項５８記載の金属イオン キレート化剤。 ６１．第２分子成分が、金属有機物、金属カルボニル、ポリチオールおよび錯体 から成る群の成分である請求項５８記載の金属イオンキレート化剤。 ６２．第２分子成分が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリ アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ ２，３ＤＭＰＳ）およびメソ−２，３−ジメカプトコハク酸（２，３ＤＭＳＡ） から成る群の成分である請求項６１記載の金属イオンキレート化剤。 ６３．第１分子成分が、クラウンエーテル、クラウンアゾ、ポリポルフィリン、 かご状化合物およびクリプテートから成る群の成分である請求項５８記載の金属 イオンキレート化剤。 ６４．第１分子成分が１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシ クロオクタデカン（ＴＤＣＯＤ）、かご状化合物およびクリプテートから成る群 の成分である請求項６３記載の金属イオンキレート化剤。 ６５．金属イオンキレート化剤が、遷移金属、アルカリ土類金属およびランタニ ドから成る群の金属イオンとキレートを形成する請求項５８記載の金属イオンキ レート化剤。 ６６．金属イオンキレート化剤が、アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ 線または陽電子放射体、オージェ電子放射体および蛍光性ランタニドから成る群 の放射性同位体とキレートを形成する請求項５８記載の金属イオンキレート化剤 。 ６７．放射性同位体がＰｂ２１２とＢｉ２１２から成る群の放射性同位体である 請求項６６記載の金属イオンキレート化剤。 ６９．第２分子成分によって形成されたブリッジに、１または２以上の第３分子 成分を結合させた請求項５８記載の金属イオンキレート化剤。 ６９．第３分子成分が、低いＫｓ値と早い金属交換能を有するキレートである請 求項６８記載の金属イオンキレート化剤。 ７０．第３分子成分が金属イオンとキレートを形成し、該金属イオンが、第３分 子成分が折りたたまれて第１分子成分と配位結合を形成する分子間相互作用をす るような状態で第１分子成分とキレートを形成する請求項６８記載の金属イオン キレート剤。