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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Moleküle für die Behandlung und Diagnose
von Tumoren. Die Erfindung betrifft außerdem therapeutische Zusammensetzungen,
die eines oder mehrere dieser Moleküle umfassen und die Verwendung
beider in der Behandlung und Diagnose von Krebs.
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Die
Diagnose und Therapie von Krebs erfordert weiterhin einen großen Aufwand
der pharmazeutischen und chemischen Industrie. Obwohl eine beträchtliche
Anstrengung zur Entwicklung neuer Behandlungen erfolgt, gibt es
immer noch viele Tumortypen, für
die keine Behandlung existiert. Ein zusätzliches Problem ist die Bildung
von Mikrometastasen, die nicht diagnostiziert oder behandelt werden
können.
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Ein
wichtiges Problem bei der Behandlung ist die Ähnlichkeit zwischen normalen
Zellen und Krebszellen. Behandlungen, die das Wachstum von Tumorzellen
beeinträchtigen,
beeinträchtigen
ebenfalls das Wachstum gesunder Zellen. Radiotherapie, wie sie derzeit
bekannt ist, besteht im Wesentlichen aus einem willkürlichen
Kreuzfeuer von außerhalb
der Zelle oder des Zytoplasmas. Da dies eine ziemlich grobe Behandlung
ist, können
umgebende Zellen und Gewebe ebenfalls beschädigt werden, was zu mehr oder
weniger schweren Nebenwirkungen führt.
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Die
Bereitstellung einer verbesserten Radiotherapie und eines diagnostischen
Verfahrens für Krebs,
das sehr geringe Mengen von Radionukliden verwendet und zu einer
direkten Behandlung in der bösartigen
Zelle führt,
ist daher hoch erwünscht.
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Es
ist bekannt, dass sich der Metabolismus von Krebszellen von dem
normaler Zellen unterscheidet. Außerdem scheinen Krebszellen
verglichen mit normalen Zellen eine erhöhte Membranpermeabilität durch
eine gesteigerte Expression von Membranrezeptoren aufzuweisen. Die
Folge ist, dass Krebszellen für
biologische Vektoren, wie Proteine und Peptide, durchlässiger sind.
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Die
gesteigerte Aufnahme solcher biologischer Vektoren kann in der Diagnose
von Tumoren verwendet werden, indem ein Radionuklid an ein Protein
gebunden wird, z.B. durch Jodierung von Tyrosinfunktionalitäten im Protein
oder durch kovalente Bindung von radioaktiven Metallkomplexen. Diese Moleküle vereinen
eine tumorsuchende Funktion und eine radioaktive Funktion. Obwohl
diese Typen von Molekülen
zur Diagnose verwendet worden sind, ist ihre Verwendung in der Therapie
noch nicht beschrieben worden.
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Es
ist eine Aufgabe dieser Erfindung, die oben beschriebenen Moleküle weiter
zu verbessern, um zu einer noch besser maßgeschneiderten Behandlung
bösartiger
Zellen zu gelangen.
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Diese
Aufgabe wird durch die Erfindung durch die Bereitstellung eines
Moleküls
gelöst,
das eine interkalierende Gruppe aufweist, die an eine radioaktive
[M(CO)3]+-Gruppe
koordiniert ist, wobei M ein Metall ausgewählt aus 99mTc, 186Re, 188Re und
Mn ist, und ein tumorsuchendes Molekül, das durch eine direkte Bindung
mit einer Koordinationsstelle an dem Metall verbunden ist. Das Molekül kann durch
das tumorsuchende Molekül
spezifisch auf den Tumor gerichtet sein und durch die Zelle verinnerlicht
werden. Die interkalierende Gruppe wird sich dann in den DNA-Strang
einschieben und Brüche
hervorrufen. Außerdem
wird auch das radioaktive Metall zu Strangbrüchen der DNA führen. Der
Vorteil der neuen Moleküle
besteht darin, dass sie spezifisch auf die bösartige Zelle gerichtet sind
und von der Zelle aufgenommen werden.
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Das
tumorsuchende Molekül
ist bevorzugt ein Biomolekül,
wie etwa ein Peptid oder ein Protein, das aktiv auf die Tumorzelle
gerichtet ist. Beispiele für
diese Biomoleküle
sind Somatostatin-, Neurotensin-, Bombesin-rezeptorbindende Moleküle, monoklonale
Antikörper,
Penetratine® und
Glykoproteine, die an GPIIb/IIIa-Rezeptoren binden. Die Erfindung ist
jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt und ist allgemeiner ebenfalls
auf ande re tumorsuchende Mittel anwendbar. Diese Kategorie umfasst
außerdem
Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie in den Kern oder die
Kernmembran transportiert werden. Beispiele dafür sind Antisense-Oligonukleotide, proliferierende
Mittel wie Deoxyuridin und kleine Moleküle wie Spermidin.
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Die
interkalierende Einheit ist bevorzugt ein aromatisches Molekül mit einer
interkalativen Bindungsaffinität
für doppelsträngige DNA.
Beispiele für solche
aromatische Verbindungen sind Verbindungen, die z.B. Akridin, Porphyrin,
Ellipticin, Phenanthrolin, Carbazol, Benzimidazol oder Verbindungen
mit bekannter zytostatischer Aktivität (Antibiotika) aus der Klasse
der Tetrazykline (Anthrazykline), wie etwa Daunorubizin, Epirubizin
oder Mixoxantron, umfassen und mit Liganden funktionalisiert sind,
welche die [M(CO)3]+-Gruppe koordinieren
können.
Beispiele für
solche Liganden sind jene, die in EP-879 606 erwähnt sind und außerdem Polyaminopolycarboxylate,
Phosphate und Phosphonate, aliphatische oder aromatische oder gemischte
Triamine und Thione.
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Die
interkalierenden und tumorsuchenden Funktionen sind manchmal in
existierenden Molekülen
kombiniert. Beispiele für
interkalierende Mittel, die eine interkalierende Gruppe und ein
Peptid kombinieren, sind Aktinomyzin und Triostin.
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Das
radioaktive Molekül
wird ausgewählt
aus 99mTc, 186Re, 188Re und Mn. Diese reinen γ-emittierenden
Nuklide werden verwendet, da ihre begleitenden Konversionselektronen
mit niedriger Reichweite zur Spaltung von Bindungen führen, die
dem zerfallenden Kern nahe sind. Die Dosisbelastung für den Patienten
bleibt daher sehr niedrig.
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Besonders
geeignete Kombinationen der drei Funktionen sind in 1 gezeigt.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
die Verwendung der Moleküle
in Therapie und Diagnose und therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen,
die eines oder mehrere dieser Moleküle umfassen.
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Therapeutische
Zusammensetzungen umfassen mindestens eine geeignete Menge des Moleküls in einem
Verdünnungsmittel
oder Hilfsstoff. Solche Zusammensetzungen können die Form von Lösungen aufweisen
und werden intravenös,
intraperitoneal oder intrathekal verabreicht. Geeignete Mengen zur
Verabreichung hängen
von der Art der Verabreichung, dem verwendeten Radionuklid und der
zu behandelnden oder diagnostizierenden Indikation ab. Geeignete
Mengen variieren zwischen 10–9 und 10–1 g
pro kg Körpergewicht.
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Hilfsstoffe
und Verdünnungsmittel
für diese Art
der Medikation sind dem Fachmann bekannt. Die vorliegenden Moleküle erfordern
jedoch bestimmte Bedingungen, um stabil zu sein. Bevorzugt sollte
der Hilfsstoff oder das Verdünnungsmittel
hydrophiler und bevorzugt organischer Natur sein.
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Für diagnostische
Zwecke besteht die Zusammensetzung mindestens aus einer geeigneten Menge
des Moleküls
in einem Verdünnungsmittel oder
Hilfsstoff Diagnostische Verfahren, die mit der Zusammensetzung
der Erfindung verwendet werden können,
sind Szintigraphie oder Magnetresonanzbildgebung (MRI).
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Es
wurde nun festgestellt, dass das Verfahren zur Synthese von Tc-
und Re-Carbonylen aus Wasser, das in EP-879 606 beschrieben ist,
zur Herstellung der Moleküle
der Erfindung geeignet ist. Mit diesem Verfahren ist es insbesondere
möglich,
interkalierende Liganden einzuführen,
die sehr stabile Komplexe (in vitro und in vivo) mit den genannten Carbonylen
bilden.
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Die
in EP-879 606 beanspruchten Liganden und Akridin, Porphyrin, Ellipticin,
Phenanthrolin, Carbazol, Benzimidazol, stabilisieren die fac-[Tc(CO)3]+-Gruppe im Serum
und bilden bei sehr geringen Konzentrationen Komplexe. Diese Liganden
können
ortsspezifisch an die Biomoleküle
gekuppelt werden und nachfolgend mit z.B. Tc-99m markiert werden.
Da das Radionuklid dem interkalierenden Liganden sehr nahe ist,
wird sein Elektron mit niedriger Energie die DNA-Strängen sehr
gut durchdringen und Strangbrüche
hervorrufen. Wenn es in einer der Furchen interkaliert, ist die
Wahrscheinlichkeit eines Treffers sehr hoch, da der Kern praktisch von
DNA umgeben ist.
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Die
erfindungsgemäß derivatisierten
Biomoleküle
zeigen eine hohe Selektivität
und werden verinnerlicht. Wie von rein organischen Interkalatoren bekannt
ist, wird der Komplex die DNA insbesondere interkalieren, wenn sich
die Zelle teilt. Im Gegensatz zu anderen Therapeutika kann mit dieser
Kombination eine hohe Selektivität
erreicht werden.
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Wenn
Re-188 als das Radionuklid verwendet wird, werden die Schäden viel
schwerwiegender sein als im Falle von Tc-99m, aber folglich wird
die verabreichte Menge an Radioaktivität viel geringer sein als im
Falle einer "normalen" Radiotherapie. Daher könnten schwere
Nebenwirkungen wie etwa Knochenmarkstoxizität vermieden werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die nur
zur Verdeutlichung der Erfindung, aber in keiner Weise zur Beschränkung von deren
Schutzbereich gedacht sind, weiter erläutert.
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In
den Beispielen wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen:
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1:
Schematische Wiedergabe der Moleküle der Erfindung.
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2:
Beispiel eines Tc(I)-Komplexes mit diesem interkalierenden Liganden
und einem potentiellen Biomolekül,
das durch direkte Bindung an eine andere Koordinationsstelle gebunden
ist.
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3:
Schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung von Molekülen der
Erfindung.
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4:
Schematische Darstellung der drei Typen von Plasmidstrukturen.
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5:
Ethidiumbromid-gefärbtes
Agarosegel der drei Strukturen I, II, III der DNA (linke Spur) und
des Molekulargewichtsmarkers (rechte Spur).
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6:
Ethidiumbromid-gefärbtes
Agarosegel einer Plasmidzubereitung, die mit der Verbindung [99mTc(P1)(teta)(CO)3] behandelt wurde; Der Auftragungsort der
Probe ist am unteren Ende des Gels. Spur 1 ist die Molekulargewichtsmarkierungssubstanz;
Spur 2 ist eine Referenzlösung,
die hochverdrilltes, entspanntes (Einzelstrangbruch) und linearisiertes
(Doppelstrangbruch) Plasmid enthält,
Spur 3 ist die experimentelle Lösung,
die sowohl ein Plasmid als auch den Interkalator der Erfindung enthält, und Spur
4 ist die negative Vergleichsprobe, die nur Plasmid enthält.
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7:
Reaktionsschema für
die Herstellung bifunktionaler Modellinterkalatoren.
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8:
Reaktionsschema für
die Herstellung trifunktionaler Modellinterkalatoren.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Synthese der
Moleküle
der Erfindung
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1. Einführung
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Um
für eine
starke Interkalation zu sorgen, sollte der Interkalator bevorzugt
planar und aromatisch-heterozyklisch sein. Außerdem müssen die Seitengruppen des
Interkalators stabil an das Radionuklid (d.h. 99mTc)
koordiniert sein. In diesem Beispiel ist es nicht zwingend, dass
die koordinierende Einheit ein mehrzähniger Ligand mit hoher thermodynamischer
Stabilität
sein muss, da die meisten Komplexe mit Tc(I) eine extrem hohe kinetische
Stabilität
aufweisen. Aus diesen Gründen
und wegen der bereits bekannten Prinzipien der Komplexierung mehrerer ein-
und zweizähniger
Liganden (besonders Pikolinsäure)
wurde 5,6-Benzochinolin-3-carbonsäure als Interkalator ausgewählt.
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2 zeigt
ein Beispiel eines Tc(I)-Komplexes mit diesem interkalierenden Liganden
und ein potentielles Biomolekül,
das durch eine direkte Bindung mit einer weiteren Koordinationsstelle
verbunden ist.
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2. Synthese des Beispiel-Interkalators
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2.1 3-Cyano-4-benzoyl-3,4-dihydrobenzo(f)chinolin
2
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648 μl (5,58 mmol)
Benzoylchlorid wurden zu einem Zweiphasensystem aus Wasser/Methylenchlorid
während
eines Zeitraums von zwei Stunden zugegeben. Diese zwei Phasen enthalten
500 mg (2,79 mmol) Benzo(f)chinolin in der Methylenchloridschicht
und 545 mg (8,37 mmol) KCN in Wasser. Das Rühren wurde für 6 Stunden
fortgesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser, 5%iger
Salzsäure,
Wasser, 5%iger NaOH-Lösung und
erneut mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat wurde die
Lösung
zur Trockene eingedampft.
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Das
Bromidsalz dieser sogenannten Reissert-Verbindung wurde aus 95%igem
Ethanol umkristallisiert, um die analytisch reine Substanz zu ergeben.
Ausbeute: 612 mg (71%).
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2.2 5,6-Benzochinolin-3-carbonsäure (P1)
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2
ml 48%ige Bromwasserstoffsäure
wurden zu 287 mg (0,93 mmol) der in 2 ml Essigsäure gelösten Reissert-Verbindung gegeben.
Die Lösung
wurde 24 Stunden unter Rückfluss
gekocht, gekühlt
und filtriert. Das filtrierte Produkt wurde mit Diethylether gewaschen,
getrocknet, und aus Methanol umkristallisiert, um 169 mg (0,76 mmol)
(82%) des Hydrobromids des Interkalators als gelben Feststoff zu
ergeben.
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2.3 Makroskopische Synthese
von Technetium- und Rhenium-Komplexen mit P1 (5,6-Benzochinolin-3-carbonsäure)
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2.3.1 [NEt4][ReBr(P1)(CO)3]
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Eine
Suspension von 102 mg (133 μmol) [NEt4][ReBr3(CO)3], 29,7 mg (133 μmol) P1 und 116 μl (226 mmol)
Trioctylamin wurde in Dichlormethan unter Rückfluss gekocht, bis eine klare
Lösung
erreicht wurde. Nach Eindampfen der Lösung wurde Komplex 5 in THF
extrahiert. Nach dem Verdampfen von THF wurde der Rest mit Diethylether
gewaschen, um Trioctylammoniumbromid zu entfernen. Ausbeute: 63
mg (67%) des gelben Komplexes.
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2.3.2 [Re(P1)(H2O)(CO)3]
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200,0
mg (0,26 μmol)
[NEt4]2[ReBr3(CO)3] wurden in
Gegenwart von 29,1 mg des Interkalators P1 während 4 Stunden in 1 M MES-Pufferlösung unter
Rückfluss
gekocht. Dann wurde der gelbe Niederschlag abfiltriert. Ausbeute:
114,2 mg (86%).
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2.4 Mikroskopische Synthese
von (99mTc(H2O)(P1)(CO)3)
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Die 99mTc-Komplexe wurden in einem Zweischrittverfahren
mit einem normalen Generatoreluat synthetisiert. In einem ersten
Schritt wurde der Komplex in > 97%
Ausbeute gemäß der Literatur
(R. Alberto et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 7987 (1998)) synthetisiert.
Die Lösung
wurde dann mit Phosphatpuffer im Reaktionsgefäß neutralisiert, und eine Lösung des
entsprechenden Liganden wurde zugegeben. Die Endkonzentration betrug
zwischen 10–4 und 10–5.
Es wurde für
30 Minuten bei 75°C
stehen gelassen. Die radiochemische Reinigung und die Ausbeute wurden
durch HPLC-Chromatographie bestimmt, und es wurde entdeckt, dass [99mTc(HPO4)(P1)(CO3)]2– (Verbindung
10) mit einer Ausbeute von 80–95%
(abhängig
von der Ligandenkonzentration und der Reaktionsdauer) gebildet wurde.
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2.5 Synthese von trifunktionalen
Modellmolekülen der
Erfindung
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Dies
ist ein Beispiel, wie ein trifunktionales Molekül aufgebaut werden kann. Die
Vorschrift basiert auf bekannten Synthesemethoden für die entsprechenden
Kupplungsverfahren. Das schematische Verfahren ist in 3 gezeigt.
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1. Synthesen der bifunktionalen
Liganden, die einen Interkalator und eine koordinierende Funktionalität haben
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Ein
bifunktionaler Ligand wurde gemäß der in 3 beschriebenen
Strategie hergestellt. 7 zeigt das spezifische Reaktionsschema
der Reaktion, das im Folgenden beschrieben wird.
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2-Methylchinolin (1)
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2-Methylchinolin
(1) wurde von Fluka gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet.
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Chinolin-2-carbaldehyd
(2)
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Eine
Mischung von 5,5 g Selendioxid (49,5 mmol) in 50 ml Dioxan und 2
ml Wasser wurde in kleine Portionen während 10 Minuten zu einer kochenden
Lösung
von 4,4 g (30,7 mmol) 2-Methylchinolin (1) in 20 ml Dioxan hinzugegeben.
Nach 6 Stunden kochen wurde die warme Reaktionsmischung filtriert. Das
Filtrat wurde eingedampft, in Dichlormethan gelöst und durch Alox filtriert.
Das gelb-braune feste Produkt, das nach Verdamp fung des Lösungsmittels erhalten
wurde, wurde aus Dichlormethan umkristallisiert. Ausbeute: 3,76
g (78%).
1H-NMR (DMSO): δ, 10,12s,
8,61d, 8,22d, 8,12d, 7,99d, 7,91t, 7,79t
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Verbindung 3a
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Eine
Mischung aus 500 mg Chinolin-2-carbaldehyd (2) (3,2 mmol) und 330
mg N-(2-Aminoethyl)-acetamid (3,23 mmol) in 15 ml Methanol wurde für 2 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt.
Das erhaltene hellbraune feste Produkt wurde direkt für die nächste Reaktion
verwendet. Ausbeute: ~770 mg (~100%).
1H-NMR
(CDCl3): δ,
8,57s, 8,21d, 8,13d, 8,10d, 7,85d, 7,75t, 7,59t
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Verbindung 3b
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Eine
Lösung
von 175 mg (4,62 mmol) NaBH4 in 10 ml Ethanol
wurde langsam während
2 Stunden zu einer gerührten
Lösung
von 500 mg (2,07 mmol) von 3a in 30 ml Ethanol bei 0°C zugegeben.
Diese Mischung wurde dann über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Die nach Verdampfung des Lösungsmittels
erhaltene feste Substanz wurde mit einer 3 M Na2CO3-Lösung
verrieben. Das gewünschte
hellbraune Produkt (3b) wurde dann mit Dichlormethan extrahiert.
Ausbeute: 382 mg (76%)
1H-NMR (CDCl3): δ,
8,15d, 8,05d, 7,81d, 7,71t, 7,54t, 7,35d, 6,84br, 4,21s, 3,50q,
3,02t, 2,02s
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Verbindung 3c
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Eine
Lösung
von 200 mg 3b (0,82 mmol) in 20 ml 2 N HCl wurde für 6 Stunden
unter Rückfluss gekocht.
Das nach Verdampfung des Lösungsmittel erhaltene Öl wurde
mit Ethanol gewaschen und ergab das gewünschte hellbraune feste Hydrochloridsalz
3c. Ausbeute: 203 mg (90%)
1H-NMR (D2O): δ,
8,40d, 7,95t, 7,76t, 7,59t, 7,49d, 4,57s, 3,46t, 3,34t
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N-BOC-diethylentriamin
(4)
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Eine
Lösung
von 500 mg (2,29 mmol) Di-tert-butyldicarbonat ((BOC)2O)
in 30 ml Dioxan wurde langsam zu einer Lösung von 1,49 ml (1,42 g) (13,74
mmol) Diethylentriamin in 80 ml Dioxan bei 10°C zugegeben. Die Mischung wurde
dann 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gewünschte Produkt
schlug sich als ein Öl
nieder, das dann vom Rest der Lösung
abgetrennt wurde, in Wasser gelöst wurde,
filtriert wurde und mit Dichlormethan extrahiert wurde und schließlich das
gewünschte
Produkt als hellgelbes Öl
ergab. Ausbeute: 260 mg (56%).
1H-NMR
(CDCl3): δ,
5,15br, 3,25br, 3,18t, 2,77t, 2,69t, 2,63t, 1,76br, 1,41s, 1,19t
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Verbindung 5a
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Eine
Mischung von 140 mg Chinolin-2-carbaldehyd (2) (0,89 mmol) und 200
mg N-BOC-diethylentriamin (0,99 mmol) in 30 ml Methanol wurde 3 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt.
Der nach Verdampfung des Lösungsmittels
erhaltene Feststoff wurde dann mit Wasser gewaschen und ergab das gewünschte hellbraune
Produkt. Ausbeute: 304 mg (94%).
1H-NMR
(DMSO): δ,
8,32d, 7,97t, 7,73t, 7,71d, 7,57t, 6,65t, 4,33s, 3,08t, 2,97t, 2,85t,
1,28s, 1,09t
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Verbindung
5b
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Eine
Lösung
von 41 mg (1,08 mmol) NaBH4 in 10 ml Ethanol
wurde langsam während
2 Stunden zu einer gerührten
Lösung
von 148 mg (0,43 mmol) 5a in 30 ml Ethanol bei 0°C zugegeben. Diese Mischung
wurden dann über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das nach Verdampfung des Lösungsmittels
erhaltene feste braune Öl
wurde mit einer 3 M Na2CO3-Lösung verrieben.
Das gewünschte
hellbraune Produkt (3b) wurde dann mit Dichlormethan extrahiert.
Ausbeute: 136 mg (92%)
1H-NMR (DMSO): δ, 8,29d,
7,94d, 7,92d, 7,71t, 7,61d, 7,54t, 6,71t, 3,95s, 2,96q, 2,59s, 1,33s,
1,22t
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Verbindung
5c
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Eine
Lösung
von 100 mg 5b (0,29 mmol) in 3 N HCl wurde für 2 Stunden unter Rückfluss
gekocht. Das nach Verdampfung des Lösungsmittels erhaltene Öl wurde
mit Diethylether gewaschen und gab das gewünschte hellbraune feste Hydrochloridsalz
5c. Ausbeute: 102 mg (94%)
1H-NMR (D2O): δ,
8,44d, 7,95t, 7,77t, 7,6t, 7,51d, 4,51s, 3,44s, 3,34t, 3,27t
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2. Synthese von trifunktionalen
Modellinterkalatoren
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Trifunktionale
Modellinterkalatoren wurden ausgehend von 5a und 3b von Teil 1 oben
hergestellt. 8 zeigt das spezielle Reaktionsschema.
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1. Alkylierung eines Amins
mit Bromessigsäureethylester
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Amin
I (7; 547 mg, 2,83 mmol) und Triethylenamin (0,510
ml, 3,08 mmol) wurden in Methanol gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und Ethylbromacetat
II (0,313 ml, 2,83 mmol) wurde innerhalb von 5 Minuten tropfenweise
zugegeben. Nach Rühren
der Lösung
bei Raumtemperatur für
18 Stunden wurde das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Der Rückstand
wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst und dreimal mit Wasser (20
ml) gewaschen. Die wässrigen
Phasen wurden zweimal mit Dichlormethan (50 ml) gewaschen. Die organischen
Phasen wurden über
MgSO4 getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, so dass III als gelbes Öl erhalten
wurde. Ausbeute: 590 mg (2,11 mmol, 74,6%).
DC (Kieselgel,
Ethanol) RF 0,4
1H
NMR (200 MHz, d6-Aceton) δ = 8,44 (m,
1H, Picolin), 7,65 (m, 1H, Picolin), 7,45 (m, 1H, Picolin), 7,21 (m,
1H, Picolin), 4,12 (q, 2H, J = 7,2 Hz, CH2 Ester), 3,94
(s, 2H, CH2), 3,64 (s, 2H, CH2),
3,32 (m, 2H, N-CH2-CH2-N),
2,82 (m, 2H, N-CH2-CH2-N),
1,84 (s, 3H, CH3-CO), 1,21 (t, 3H, J = 7,2
Hz, CH3 Ester).
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2. Entschützung
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Amin
III (576 mg, 1,94 mmol) wurde in Ethanol (4 ml) und Wasser (8 ml)
gelöst.
2 M NaOH (2 ml) wurde zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur
1,5 Stunden gerührt.
Analytische HPLC zeigten einen einzigen Peak, was darauf hindeutet, dass
die Estergruppe quantitativ gespalten wurde.
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Das
Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand
wurde in Wasser (8 ml) gelöst, und
2 N HCl (1 ml) wurde zugegeben, um die Lösung zu neutralisieren. 33%-ige
HCl (1,0 ml) wurde zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei
90°C 48
Stunden gerührt.
NaHCO3 wurde zugegeben, um die Reaktionsmischung
zu neutralisieren, das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Ethanol gewaschen.
Entfernen des Lösungsmittels
ergab das entschützte
Produkt V als gelbes Öl.
Ausbeute: 352 mmol (1,68 mmol, 68,6%).
1H
NMR (300 MHz, D2O) δ = 8,44 (m, 1H, Picolin), 7,85
(m, 1H, Picolin), 7,45 (m, 1H, Picolin), 7,39 (m, 1H, Picolin),
3,78 (s, 2H, CH2), 3,35 (m, 2H, N-CH2-CH2-N), 3,22 (s,
2H, CH2), 3,32), 2,79 (m, 2H, N-CH2-CH2-N).
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BEISPIEL 2
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Strangbruch mit Molekülen der
Erfindung in einem Modellsystem
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1. Einführung
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1.1 Die Verwendung von
Plasmiden
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Um
die Fähigkeit
der interkalierenden Komplexe mit 99mTc
zum Hervorrufen von DNA-Strangbrüchen zu
untersuchen, wurden Plasmide als Modellsystem verwendet. Plasmide
sind sehr geeignet, da elektrophoretische Analysen es ermöglichen,
zwischen doppelten und einfachen Strangbrüchen zu unterscheiden. Außerdem können großen Mengen von
Plasmiden sehr einfach unter Verwendung zellbiologischer Verfahren
hergestellt werden.
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Ein
Plasmid ist ein ringförmiges,
doppelsträngiges
DNA-Molekül,
wobei die Doppelhelixachse zu einer Superhelix verdrillt sein kann.
Diese Form der Superhelix wird als Typ I beschrieben. Dieser Typ kann
seine Superhelixstruktur durch einen einzelnen Strangbruch verlieren
und liegt dann als entspannte ringförmige DNA (Typ II) vor. Durch
einen doppelten Strangbruch beider Typen wird eine lineare Form (Typ
III) des Plasmids erzeugt. 4 zeigt
ein Beispiel für
die Struktur dieser drei DNA-Typen.
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Da
diese drei DNA-Typen unterschiedliche Strukturen aufweisen, können sie
aufgrund ihrer Größe und besonders
ihrer Form durch Elektrophorese auf Agarosegel gut getrennt werden.
Die zu untersuchende Mischung (Typ I–III nach dem Experiment) wird
auf ein Agarosegel geladen. Dann wird eine Konstantspannung angelegt,
und die negativ geladenen DNA-Fragmente wandern in Richtung der
Kathode. Je größer die
Form des Fragments, desto langsamer ist die Wanderung entlang des
Gels. DNA des Typs I (am kompaktesten) bewegt sich am schnellsten,
Typ II am langsamsten. Das Gel wird dann in eine Lösung gegeben,
die sehr wenig Ethidiumbromid enthält. Die DNA-Fragmente werden
durch Interkalation und Bestrahlung mit UV-Licht von 300 nm, das
rot-orangefarbige Fluoreszenz (590 nm) zeigt, sichtbar gemacht.
Dieses Verfahren ist so empfindlich, dass weniger als 5 ng DNA pro
Bande detektiert werden kann. In der fotografischen Aufnahme der Gele
in 5 ist die Wanderungsrichtung vom oberen Ende nach
unten.
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1.2 Herstellung der Plasmide
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Das
Plasmid Bluescript KS® mit einer Größe von 2958
Basenpaaren wurde gemäß dem Standardprotokoll
des Unternehmens QIAGEN hergestellt. Üblicherweise liegt dieses Plasmid
in der Superhelixform (Typ I) vor. Mit dem Restriktionsenzym KpnI kann
die linearisierte Form der Plasmid-DNA (Typ III) hergestellt werden.
Ein einzelner Strangbruch, der zur entspannten ringförmigen Form
des Plasmids (Typ II) führt,
kann durch das Enzym DNAase I induziert werden. 5,
rechte Spur, zeigt die Elektrophorese auf Agarosegel einer Mischung
dieser drei Typen von DNA. Für
die Elektrophorese ist eine Markierungssubstanz mit mehreren Größen von DNA-Stücken als
Vergleichssubstanz verwendet worden (linke Spur).
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Wie
durch die drei Banden der rechten Spur gezeigt wird, wurden die
drei Typen von DNA eindeutig getrennt und können nach Visualisierung unterschieden
werden. Wenn Einzel- oder Doppelstrangbrüche auf Konversionselektronen
zurückzuführen sind,
sollten sie durch dieses Verfahren leicht detektierbar sein.
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2. Untersuchung der Fähigkeit
von [99mTc(P1)(Teta)(CO)3] zur Erzeugung von Strangbrüchen
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5 μl einer Lösung, die
ungefähr
0,3 mCi/ml von [99mTc(P1)(Teta)(CO)3] und 100 ng von Typ-I-Plasmid (~ = 3·10–5 M
in Basenpaaren) enthielt, wurde 18 Stunden stehen gelassen. Dann
erfolgte eine Elektrophorese dieser Mischung und der drei Vergleichssubstanzen
(6).
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Es
eindeutig sichtbar, dass die Plasmide in der Messlösung (Spur
3) langsamer wandern als in der Vergleichslösung. Der Grund für diese
Beobachtung liegt darin, dass eine kleine Änderung der Struktur der Plasmide
vermutlich durch Interkalation des Komplexes in dem Doppelstrang
hervorgerufen wird. Diese Veränderung
in der Tertiärstruktur
des Plasmids erlaubte dann eine bessere Interkalation des Ethidiumbromids,
so dass sich die stärkere
Intensivität
der Bande der Probelösung
erklärt.
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Außerdem ist
im Vergleich mit der negativen Vergleichslösung (Spur 4) offensichtlich,
dass eine oder möglicherweise
zwei neue Banden (Pfeile) in der Spur der mit dem 99mTc-Komplex behandelten
Lösung
erschienen. Die stärkere
dieser beiden Banden entspricht ungefähr der Position von Typ II
der Bande der Vergleichslösung
in Spur 2, welche die drei Typen enthielt. Dies bedeutet, dass der
Komplex einen Einzelstrangbruch im Plasmid hervorgerufen hat.