DE3320560C2

DE3320560C2 -

Info

Publication number: DE3320560C2
Application number: DE3320560A
Authority: DE
Inventors: Otto A. Washington D.C. Us Gansow; Mette Baltimore Md. Us Strand
Original assignee: Johns Hopkins University; Michigan State University MSU
Current assignee: Michigan State University MSU
Priority date: 1982-06-07
Filing date: 1983-06-07
Publication date: 1993-09-16
Also published as: GB8315483D0; DE3320560A1; JPS5946227A; GB2122641B; JP2599705B2; GB2122641A; FR2527928A1; CA1225930A; FR2527928B1

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1, 2, 9 und 10 angegebene wäßrige Lösung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von mit monoklonalen Antikörpern von konjugierten radioaktiven Metallchelaten zur Behandlung von zellulären Störungen, insbesondere von Krebs nach Anspruch 8, sowie ein Verfahren zur Herstellung obiger Antikörper nach den Ansprüchen 3 bis 7 und 11 bis 13.

Zur Bereitstellung therapeutischer Verfahren zur Behandlung von zellulären Störungen, wie Krebs, wurden umfangreiche Forschungsarbeiten unternommen. Die herkömmliche Therapie umfaßt chirurgische Eingriffe, Bestrahlung und Chemotherapie. Alle diese Verfahren haben den entscheidenden Nachteil, daß sie zwischen gesunden und an Krebs erkrankten Zellen nicht mit ausreichender Selektivität unterscheiden. Zur Gewährleistung der Wirksamkeit dieser Methoden müssen dabei große Anteile an gesundem Gewebe abgetötet oder entfernt werden. Ferner beeinträchtigt eine chemotherapeutische Behandlung das Immunsystem, so daß es häufig zu Todesfällen oder ernsthaften Erkrankungen aufgrund von Infektionen durch Pilze, Bakterien oder Viren kommt.

Die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern hat die Möglichkeit eröffnet, selektiv therapeutische oder diagnostische Mittel zu spezifischen Zielzellen zu bringen. Monoklonale Antikörper sind Immunoglobuline von gut definierter chemischer Struktur. Eine charakteristische Eigenschaft von monokonalen Antikörpern ist ihre Reproduzierbarkeit der Funktion und ihre hohe Spezifität.

Für diagnostische und therapeutische Zwecke wurde radioaktives Jod, das direkt an monoklonale Antikörper gebunden ist, verwendet. Jod-131 führte bei großen Tumoren zu gewissen therapeutischen Erfolgen, jedoch haben sich mit radioaktivem Jod markierte Antikörper als unwirksam bei der Behandlung von kleinen Tumorherden oder Metastasten erwiesen. Ferner werden spezifisch gebundene Antikörper relativ rasch durch die Zielzellen abgebaut. Dieser Abbau führt daher zum Einbau des metabolisierten Jods in exkretorische Organe, wie Niere, Gallenblase und Leber. Versuche, Toxine durch monoklonale Antikörper zu Tumorzellen zu bringen, führten nicht zur Entwicklung von erfolgreichen therapeutischen Verfahren.

In der Literatur finden sich Hinweise darauf, daß Diäthylen- triaminpentaessigsäure (DTPA) bei Bindung an Protein stabile Metallkomplexe bilden kann; vgl. Krejcarek et al., Biochem. & Biophys. Res. Commun., Bd. 77 (1977), S. 581. Khaw et al., Science, Bd. 209 (1980), S. 295 berichten über die in vivo- Abbildung von Zielzellen mit gemäß dem Verfahren von Krejcarek hergestellten polyklonalen Antikörpern, die mit radioaktivem Metall-DTPA konjugiert sind. Trotz Trennung von freiem und cheliertem Metall von den Metallchelat-konjugierten polyklonalen Antikörpern durch Gelchromatographie und Dialyse zeigen die in dieser Arbeit enthaltenen γ-Abbildungen, daß ein hoher Anteil des radioaktiven Metalls in der Leber lokalisiert ist.

Die EP 00 38 546 betrifft ein Protein (einschließlich Antikörper), das kovalent an ein bifunktionelles chelatbildendes Mittel mit einem komplexierten radioaktiven Molekül gebunden ist. Bei dem radioaktiven Molekül handelt es sich vornehmlich um Technetium-99m. Das zur Trennung von chelatgebundenem Technetium und freiem Technetium verwendete Verfahren beruht ausschließlich auf Sephadex G-25- Gelfitrationschromatographie. Da bekannt ist, daß Technetium auch ohne die Beteiligung eines chelatbildenden Mittels stark und im hohen Maße direkt an Antikörper bindet, handelt es sich um einen direkt gekoppelten Antikörper-Tc- Komplex.

Scheinberg et al., Science Vol 215, 1511-1513 (1982) beschreibt ein Verfahren zum "Tumor-Imaging" mit radioaktiven Metallen, die an monoklonale Antikörper konjugiert sind. Es werden chelatisierbare radioaktive Metalle eingesetzt, z. B. Gallium- 67, Indium-111, Technetium-99m, Gallium-68, Scanium-47 oder α-emitierende Isotope. Die Trennung von chelatgebundenen radioaktiven Metallen von den freien Metallen erfolgt durch einen einzelnen Ionenaustauscherschritt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes therapeutisches Mittel zur Behandlung von Zellstörungen unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern bereitzustellen. Dabei sollen erkrankte Zellen selektiv eine letale Bestrahlungsdosis erhalten, während gesunde Zellen wenig oder gar nicht zerstört werden sollen. Insbesondere soll mit diesen Mitteln eine Behandlung von kleinen Tumorherden und Metastasen ermöglicht werden. Schließlich sollen die erfindungsgemäßen Mittel so beschaffen sein, daß die radioaktiven Metalle in vivo selektiv an die gewünschte Zielstelle gebracht werden, wobei ein erheblicher Einbau von radioaktivem Metall in gesunde Körperorgane vermieden werden soll.

Erfindungsgemäß werden zur Behandlung von zellulären Störungen monoklonale Antikörper, die mit einem Chelat eines radioaktiven Metalls konjugiert sind, verwendet, wobei es sich bei dem radioaktiven Metall um ein α-Teilchen emittierendes Metallnuklid handelt. Eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung besteht darin, daß man die Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper in eine Körperflüssigkeit einführt, wobei es sich bei dem konjugierten Chelat um ein Derivat von Diäthylentriaminpentaessigsäure handelt und wobei dieses Konjugat im wesentlichen frei von zufällig gebundenen Ionen dieses Metalls ist und in ihm im wesentlichen die gesamte Aktivität und Selektivität der Antikörper erhalten ist. Eine derartige Verwendungsart eignet sich sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Zwecke. Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung von mit Metallchelaten konjugierten monoklonalen Antikörpern bereitgestellt, wobei es sich bei dem Metall um ein α-emittierendes radioaktives Metall handelt. Dabei wird das mit dem Antikörper konjugierte Metallchelat über eine Chromatographiesäule gegeben, die eine oder mehrere Schichten aus der Gruppe ionenretardierende Harze, Anionenaustauscherharze, Kationenaustauscherharze und chelatbildende Ionenaustauscherharze und eine Schlußschicht, die eine größenfraktionierende Matrix aufweist, enthält.

Erfindungsgemäß werden mit Metallchelaten konjugierte monoklonale Antikörper für therapeutische Methoden, insbesondere für in vivo-Methoden, verwendet.

Wie bereits angedeutet, werden erfindungsgemäß ferner auch mit Metallchelaten konjugierte Antikörper bereitgestellt, in denen die biologische Aktivität und Spezifität der Antikörper erhalten ist und die im wesentlichen frei von auf zufällige Weise gebundenen Metallen sind. Die Bindung von auf zufällige Weise gebundenen Metallen ist nicht stabil. Dies führt dazu, daß diese Metalle frei werden und in das Blut eintreten können. In das Blut freigesetzte Metalle können durch Transferrin oder andere metallbindende Proteine (wie Ferritin), die im Blut vorhanden sind, gebunden werden. Derartige gebundene Metalle verbleiben über eine beträchtlich lange Zeit hinweg im Kreislaufsystem und werden durch das retikuloendotheliale System (RES) beseitigt. Eine derartige Clearance führt zu einer Konzentration des Metalls in Leber und Milz. Es ist offensichtlich, daß eine willkürliche, lang anhaltende Zirkulation von radioaktiven Metallen im Körper oder eine Konzentration von radioaktiven Metallen in Leber und Milz in hohem Maß unerwünscht sind. Erfindungsgemäß lassen sich diese schwerwiegenden Probleme beseitigen.

Monoklonale Antikörper sind Immunoglobuline von gut definierter chemischer Struktur, im Gegensatz zu polyklonalen Antikörpern, die heterogene Gemische von Immunoglobulinen darstellen. Ein charakteristisches Merkmal von monoklonalen Antikörpern ist ihre Reproduzierbarkeit von Funktion und Spezifität. Derartige Antikörper lassen sich für eine Reihe von Zielantigenen, einschließlich Tumorzellen, entwickeln. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind Gegenstand ausführlicher Erörterungen; vgl. "Monoclonal Antibodies", Hrsg. R. H. Kennett, T. J. McKearn und K.B. Bechtol und US-PS 41 96 265. Die Auswahl von monoklonalen Antikörpern für die praktische Anwendung der Erfindung hängt vom Verwendungszweck der mit Metallchelaten konjugierten monoklonalen Antikörper ab. Die entsprechende Auswahl bleibt dem Fachmann überlassen.

Die Antikörper werden im allgemeinen in einer wäßrigen Lösung, die eine ionische Verbindung enthält, belassen. Sehr häufig wird physiologische Kochsalzlösung für diesen Zweck eingesetzt. Weitere ionische Lösungen, zum Beispiel solche mit einem Gehalt an Natrium- oder Kaliumphosphat, Natriumcarbonat und dergleichen, sind dem Fachmann geläufig und können ebenfalls verwendet werden.

Es können verschiedenste organische chelatbildende Mittel oder Liganden mit monoklonalen Antikörpern konjugiert werden. Organische Liganden zur Konjugation mit monoklonalen Antikörpern können aus einer Reihe von natürlichen oder synthetischen Verbindungen der folgenden Art ausgewählt werden: Amine, Porphyrine, Aminocarbonsäuren, Iminocarbonsäuren, Äther, Thiole, Phenole, Glykole, Alkohole, Polyamine, Polyamincarbonsäuren, Polyimincarbonsäuren, Aminopolycarbonsäuren, Iminopolycarbonsäuren, Nitrilcarbonsäuren, Dinitrilocarbonsäuren, Polynitrilocarbonsäuren, Äthylendiamintetraacetate, Diäthylentriaminpenta- oder -tetraacetate, Polyäther, Polythiole, Cryptanden, Polyätherphenolate, Polyätherthiole, Äther von Thioglykolen oder Alkoholen, Polyaminphenole, sowie sämtliche weitere acylischen, macrocyclischen, cyclischen, macrobicyclischen oder polycyclischen oder ähnliche Liganden, die hochstabile Metallchelate oder -cryptate bilden. Offensichtlich hängt die Wahl des Liganden von dem zu chelierenden Metall ab und bleibt dem Fachmann überlassen.

Der bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung verwendete Ligand besitzt eine nichtmetallgebundene organische funktionelle Gruppe, die zur Bindung an den monoklonalen Antikörper geeignet ist. Als funktionelle Gruppen kommen Carbonsäuregruppen, diazotierbare Amingruppen, Succinimidester, Anhydride, gemischte Anhydride, Benzimidate, Nitrene, Isothiocyanate, Azide, Sulfonamide, Bromacetamide, Jodacetamide, Carbodiimide, Sulfonylchloride, Hydrazide, Thioglykole oder beliebige reaktive funktionelle Gruppen, die in der Fachwelt als biomolekulare konjugierende oder kuppelnde Mittel bekannt sind, in Frage.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise ein Derivat von Diäthylentriaminpentaessigsäure (DTPA) verwendet. Es wurde festgestellt. daß DTPA-Liganden Metallionen fest binden und daß das DTPA- Derivat (nachstehend als Chelat bezeichnet) ein mit monoklonalen Antikörpern konjugiertes Chelat bildet, das sowohl im Hinblick auf die Metall-Chelat-Bindung als auch auf das Chelat-Antikörper-Konjugat hochstabil ist. Diese Eigenschaften sind sehr wichtig, insbesondere bei in-vivo-Anwendungszwecken. Setzt beispielsweise das Chelat nach Einbringen in das Blut Metallionen frei, so besteht bei diesen Ionen die Tendenz, eine Bindung mit Transferrin oder dergleichen einzugehen und dadurch allgemein im Kreislaufsystem des Körpers verteilt zu werden. Außerdem besteht bei diesen Ionen die Tendenz, daß sie letztlich in Organen, wie Leber und Milz, sich anreichern und dort verbleiben. Diese Effekte haben je nach Toxizität des Metalls und dessen Radioaktivität schwerwiegende Konsequenzen. Bildet das Chelat kein hochstabiles Konjugat mit dem Antikörper, so erfolgt eine beträchtliche Verringerung der Menge des an die Zielstelle gebrachten Metalls. Dadurch ergibt sich eine entsprechende Wirkungsminderung.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen mit Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper ist es wichtig, eine Kontamination des Metalls durch Quellen von außen zu vermeiden. Die Laboratoriumsgeräte sollten daher aus Kunststoff oder Glas sein, die von exogenen Metallen gereinigt sind. Sämtliche Vorratslösungen sind metallfrei zu machen, beispielsweise durch Säulenchromatographie mit einem geeigneten Harz.

Nachstehend wird die Erfindung in bezug auf das DTPA-Chelat näher beschrieben. Das bevorzugte Chelat wird aus einem Aminsalz von DTPA hergestellt. Der Ausdruck Amin ist allgemein zu verstehen und umfaßt primäre, sekundäre und tertiäre Amine, die DTPA vollständig deprotonieren. Die Auswahl eines entsprechenden Amins ist dem Fachmann überlassen. Die Wirksamkeit von Aminen (unter Einschluß von Ammoniak) läßt sich leicht bestimmen. Ein besonders bevorzugtes Amin ist Triäthylamin. Mindestens etwa 5 Äquivalente des Amins werden zu einer wäßrigen DTPA-Lösung gegeben. Sodann wird bis zur vollständigen Umsetzung erwärmt. Durch die Umsetzung wird ein Pentakis-(amin)-DTPA-Salz gemäß folgender Gleichung gebildet, wobei es sich bei dem Amin um Triäthylamin handelt:

5 (CH₃CH₂)₃N + DTPA → [(CH₃CH₂)₃N]₅DTPA

Festes DTPA-Aminsalz läßt sich durch Eindampfen oder Gefriertrocknen der Lösung zur Entfernung von Wasser und überschüssigem Amin gewinnen. Das tatsächliche Chelat ist ein DTPA-Derivat. Eine funktionelle Gruppe wird an DTPA addiert und das DTPA wird über diese Gruppe an die Amingruppen des monoklonalen Antikörpers gebunden. Zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Chelats werden Ester von Halogenameisensäure mit dem DTPA-Aminsalz umgesetzt. Unter Halogenameisensäureester ist ein Ester der allgemeinen Formel XC(O)-O-R zu verstehen, wobei X Halogen, vorzugsweise ein Chlorid, und R eine beliebige geeignete funktionelle Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe mit höchstens etwa 6 Kohlenstoffatomen, bedeutet. Die Auswahl von R und X ist dem Fachmann überlassen, wobei die Stabilität des Chelats und eine sterische Hinderung bei der Umsetzung des Chelats mit dem monoklonalen Antikörper in Betracht zu ziehen sind. Ein bevorzugter Ester ist Isobutylchlorformiat.

Beispielsweise werden etwa äquimolare Mengen an Halogenameisensäureester und DTPA-Aminsalz in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie reinem, trockenem Acetonitril gelöst. Ein Überschuß an Halogenameisensäureester ist zu vermeiden, da er eine Metallchelatbildungsstelle am modifizierten DTPA- Liganden blockiert. Die Reaktionstemperatur ist im allgemeinen nicht kritisch und kann so gewählt werden, daß ein Salz entsteht, das entweder teilweise oder im wesentlichen vollständig ausfällt. Die Umsetzung wird vorzugsweise bei Temperaturen durchgeführt, die ausreichend nieder sind, daß im wesentlichen das gesamte, als Nebenprodukt der Reaktion gebildete Halogenaminsalz ausgefällt wird. Handelt es sich beim eingesetzten Amin um Triäthylamin und beim Ester um einen Ester von Chlorameisensäureester, so sollte die Temperatur im Bereich von etwa -20 bis etwa -70°C liegen.

Beläßt man die Temperatur in diesem Bereich, wird die Gleichgewichtsreaktion auf die rechte Seite verlagert, was eine hohe Ausbeute an gemischtem Carboxycarbonsäureanhydrid von DTPA gemäß folgender Gleichung ergibt:

Führt man die vorstehende Reaktion im angegebenen Temperaturbereich durch, so kann eine hohe Konzentration an Chelat, das im wesentlichen frei an Halogenaminsalz als Nebenprodukt ist, gebildet werden. Beispielsweise können etwa 0,25 Mol Pentakis-(triäthylamin)-DTPA-salz in 0,5 ml Acetonitril gelöst werden und mit 35 µl Isobutylchlorformiat umgesetzt werden. Nach etwa 45minütiger Umsetzung bei -70°C kann die Lösung zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert werden, wobei ein flüssiger Überstand verbleibt, der das gewünschte Chelat in einer Konzentration von etwa 0,5 m enthält. Das Chelat wird vorzugsweise in die Chelat-Antikörper-Konjugationsreaktion in einer Konzentration von mindestens 0,25 m im organischen Lösungsmittel eingeführt. Derartige Chelatkonzentrationen erlauben die Verwendung von relativ geringen Mengen an organischen Lösungsmitteln im Konjugationsreaktionsgemisch. Überschüssige Mengen an organischem Lösungsmittel im Reaktionsgemisch sind zu vermeiden, da das Lösungsmittel nachteilige Wirkungen im Hinblick auf die biologische Aktivität und Spezifität des Antikörpers hervorrufen kann.

Der mit dem Chelat konjugierte monoklonale Antikörper wird gebildet, indem man das Chelat im organischen Lösungsmittel zu einer wäßrigen Kochsalzlösung des Antikörpers gibt. Es ist wichtig, die Reaktion von modifiziertem DTPA und Antikörper bei einem pH-Wert von nicht mehr als etwa 7,2 durchzuführen. Die Chelat-Antikörper-Reaktion konkurriert mit der Zersetzung des Chelats, die durch dessen Umsetzung mit Wasser hervorgerufen wird. Ist der pH-Wert jedoch zu niedrig, unterliegt das Chelat einer säurekatalysierten Zersetzung, wodurch die biologische Aktivität und die Spezifität des Antikörpers verringert werden. Der pH-Wert liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 7,2 und insbesondere möglichst nahe bei 7,0. In diesem Bereich ist die Reaktion des DTPA-Chelats mit Wasser weniger schädlich für die Chelat-Antikörper-Reaktion.

Die vorstehende Erörterung wurde auf DTPA konzentriert. Es liegt jedoch im Bereich des Fachwissens, andere Konjugate unter Verwendung anderer Liganden zu bilden; vgl. zum Beispiel Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 73 (1976), S. 3803.

Um die maximale biologische Aktivität des Antikörpers zu erhalten, ist die Verwendung von starken Säuren oder Basen zur Einstellung des pH-Werts bei der Herstellung von Chelat- Antikörper-Produkten zu vermeiden. Die Verwendung von starken Säuren oder Basen kann eine lokalisierte Denaturierung in der Lösung hervorrufen. Der pH-Wert kann in der wäßrigen Lösung des monoklonalen Antikörpers durch Zusatz eines geeigneten Puffers kontrolliert werden. Beispielsweise kann NaHCO₃ in einer Konzentration von etwa 0,1 n verwendet werden. Andere Puffer, wie MES (2-N-Morpholino)- äthansulfonsäure) sind bekannt und können ebenfalls verwendet werden. Die Wahl eines entsprechenden Puffers bleibt dem Fachmann überlassen.

Wird die Chelatlösung zur wäßrigen Antikörperlösung gegeben, sollen beide Lösungen eine Temperatur von etwa 0°C aufweisen. Die Temperatur der Lösung soll im Reaktionsverlauf im allgemeinen etwa 4°C nicht übersteigen. Bei Anwendung von Temperaturen im Bereich von etwa 0 bis etwa 4°C besteht die Möglichkeit, die Zersetzung des Antikörpers zu vermeiden und auch die Zersetzung des Chelats zu verringern. Die Umsetzungsdauer ist nicht kritisch, solange die Reaktion bis zum Ende durchgeführt wird. Die Lösung kann über Nacht in der Kälte belassen werden.

Das Molverhältnis von Chelat zu Antikörper kann je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck für das Konjugat stark variieren. Der Wert für dieses Molverhältnis kann etwa 0,1 bis etwa 10 oder mehr betrageen und liegt vorzugsweie im Bereich von etwa 0,25 bis etwa 5. In vielen Fällen beträgt das Molverhältnis von Chelat zu Antikörper etwa 0,5 bis etwa 3.

Im allgemeinen wird bei der Umsetzung ein Chelatüberschuß verwendet, da das Chelat in der wäßrigen Lösung sich bis zu einem gewissen Grad zersetzt. Die Anzahl der pro Antikörpermolekül gebundenen Chelate ist eine Funktion der Konzentration an Chelat und Antikörper im Reaktionsgemisch, wobei bei hohen Konzentrationen die Tendenz zur Bildung von mehr Chelaten pro Antikörper besteht. Ist die Menge an eingesetztem Antikörper relativ gering und wird eine relativ verdünnte Lösung verwendet, so kann ein wesentlicher Chelatüberschuß erforderlich sein. Beispielsweise kann ein molarer Überschuß an Chelat von etwa 600 : 1 zur Umsetzung mit einer Antikörperlösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 5 bis 10 mg/ml erforderlich sein, um für etwa 1,5 gebundene Chelate pro Antikörpermolekül zu sorgen. Molare Überschüsse von nur 100 : 1 können jedoch ebenfalls eingesetzt werden und bewirken noch eine durchschnittliche Bildung von etwa 0,5 gebundenen Chelaten pro Antikörpermolekül. Ein Zusatz von zu vielen Chelatmolekülen pro Antikörpermolekül kann die biologische Aktivität und Spezifität des Antikörpers verringern.

Ist der Zusatz des Chelats zum Antikörper beendet, so können wesentliche Mengen an zersetztem Chelat in der Lösung vorhanden sein. Dies kann bei beliebigen Chelat-Antikörper- Konjugaten der Fall sein. Das zersetzte Chelat sollte unter Erhaltung der biologischen Aktivität und Spezifität des Antikörpers entfernt werden. Hierfür kommen beispielsweise Dialyse oder Chromatographie in Frage. Gegebenenfalls kann einer erste Dialyse gegen eine verdünnte Ascorbinsäure- und EDTA-Lösung zur Entfernung von restlichem Eisen, das im Chelat oder Protein vorhanden sein kann, durchgeführt werden. Ein gereinigtes Produkt an mit Chelat konjugiertem Antikörper kann durch 48stündige Dialyse des Reaktionsgemisches gegen 3mal 1 Liter einer wäßrigen Lösung von etwa 54°C mit einem pH-Wert von etwa 6 mit einem Gehalt an 50 millimolar Citrat und 200 millimolar Natriumchlorid und 1 ml Chelex 100-Harz im Dialysegefäß gebildet werden. Eine letzte Dialyse in 1 Liter Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar MES und 200 millimolar Natriumchlorid bei 4°C und einem pH-Wert von 6 beendet die Reinigung des Proteins. Variationen der Dialysevorgänge sind bekannt und liegen im Bereich des Wissens eines Fachmanns.

Die Metallchelatbildung wird in wäßriger Lösung durchgeführt, wobei, wie bereits erwähnt, vorzugsweise die Verwendung von starken Säuren oder Basen vermieden wird. Die Metallchelatbildung für beliebige Chelat-Antikörper-Konjugate wird bei einem pH-Wert durchgeführt, der die biologische Aktivität oder Spezifität des Antikörpers nicht merklich verringert. Im allgemeinen beträgt ein annehmbarer pH-Bereich etwa 3,2 bis etwa 9, wobei jedoch spezielle Antikörper einen engeren pH-Bereich erforderlich machen können. Bei pH-Werten unter etwa 3,5 wird bei vielen Metallen eine zufällige Bindung von Metallionen an Antikörper wesentlich behindert, so daß ein bevorzugter pH-Bereich häufig etwa 3,2 bis etwa 3,5 beträgt. Jedoch können spezielle Faktoren der Lösungen der zu verwendenden Metalle pH-Werte über 3,5 ermöglichen. Die Wahl des entsprechenden pH-Werts bleibt dem Fachmann überlassen.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine schwach chelatbildende Säure oder Base als Puffer verwendet. Citronensäure oder Glycin sind geeignete Puffer. Selbstverständlich können auch andere bekannte Puffer verwendet werden. Erfindungsgemäß kommt eine Lösung von mit Chelat konjugierten Antikörpern in Betracht, die mit einer schwach chelatbildenden Säure oder Base als Puffer und ohne Zugabe von starken Säuren oder Basen auf den gewünschten pH-Wert eingestellt ist. Diese Lösung wird mit einem Metallsalz versetzt. Ist das Metallsalz in Lösung, ist auch bei dieser Lösung der pH-Wert mit einem chelatbildenden Puffer eingestellt. Der pH-Wert der Metallösung kann jedoch vor deren Zugabe zu der Lösung des mit Chelat konjugierten Antikörpers mit starken Säuren oder Basen eingestellt werden.

Zur Herstellung der mit Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper können beliebige geeignete Metallsalze verwendet werden. Typische Salze sind Halogenide, z. B. Chloride, Nitrate, Perchlorate und dergl. Das Metallsalz wird in so hohen Konzentrationen eingesetzt, wie es praktikabel ist. Aufgrund der Strahlenbelastung für das die Präparate handhabende Personal ist im allgemeinen eine Beschränkung unter 1 Äquivalent Metall pro chelatbindende Stelle geboten.

Die Dauer der Umsetzung ist nicht kritisch, sofern der pH-Wert in der Nähe der äußeren pH-Grenzwerte der für den Antikörper annehmbaren pH-Werte ist. In der Nähe dieser pH-Grenzwerte liegen die Reaktionszeiten im allgemeinen unter etwa 1 Stunde und vorzugsweise bei etwa 30 Minuten oder darunter. Aus Gründen der Zeitersparnis sind im allgemeinen Reaktionszeiten innerhalb dieser Zeitspannen erwünscht. Ferner ist es bevorzugt, die Chelatbildung in Gegenwart eines wasserlöslichen, nicht-chelierbaren, biologisch unschädlichen Reduktionsmittels, wie Ascorbinsäure, durchzuführen, um zu verhindern, daß Eisenspuren der Chelatbildung unterworfen werden. Die Umsetzung wird im allgemeinen durch Zusatz von Trinatriumcitrat in ausreichender Menge, daß der pH-Wert der Lösung so weit erhöht wird, daß das Metallkonjugat nicht mehr labil ist, beendet. Es wurde festgestellt, daß die meisten DTPA- Komplexe bei einem pH-Wert um etwas 6 besonders stabil sind. Andere schwache Basen - oder Säuren, wenn die Umsetzung über einem pH-Wert von 6 verläuft - können verwendet werden, sofern sie die Antikörper nicht nachteilig beeinflussen. Die entsprechende Auswahl bleibt dem Fachmann überlassen.

Die Reaktionslösung macht im allgemeinen eine Reinigung vor deren in vivo-Verwendung erforderlich. Auch vor der in vitro- Verwendung kann eine Reinigung erforderlich sein. Nichtgebundenes Metall und zufällig gebundenes Metall sollten entfernt werden. Die vorliegende Erörterung bezieht sich auf zufällig gebundene Metallionen. Ein Teil des Metalls kann jedoch von den Chelaten mit unzureichender Sicherheit festgehalten werden, so daß sie in gleicher Weise wirken, wie auf zufällige Weise gebundene Metallionen.

Wird ein radioaktives Metall mit kurzer Halbwertszeit verwendet, ist es besonders wichtig, daß die Reinigungsstufe so rasch wie möglich verläuft. Erfindungsgemäß kommt eine relativ rasche Reinigung unter Anwendung von Chromatographie in Frage. Diese Ausführungsform der Erfindung ist auf Chelat- Antikörper-Konjugate allgemein verwendbar. Bei Verwendung von einem oder mehreren Ionenaustauscher-, Verzögerungs- oder chelatbildenden Harzen in Verbindung mit einer eine Größenfraktionierung bewirkenden Matrix (z. B. einem Gel) können die Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper der Erfindung rasch und gründlich gereinigt werden.

Verschiedene Ionenaustauscherharze können allein oder in Kombination mit einem Ionenverzögerungsharz, einem Kationenaustauscherharz, einem Anionenaustauscherharz oder einem chelatbildenden Ionenaustauscherharz verwendet werden. Die Auswahl von einem oder mehreren entsprechenden Harzen sowie die Auswahl dieser Harze im Hinblick auf Vernetzung, chemische Form und Mesh-Zahl bleiben dem Fachmann überlassen.

Erfindungsgemäß verwendete Kationenaustauscherharze sind häufig stark saure Harze vom Polystyrolgeltyp (z. B. Dowex 50WX8) oder andere stark saure Harze auf Nichtpolystyrolbasis, wie Zeocarb 215. Weitere geeignete saure Harze sind schwach saure Gelpolystyrolharze, makroporöse Gelpolystyrolharze oder makroretikuläre Carbonsäurekationenaustauscherharze. Anionenaustauscherharze umfassen stark basische Harze vom Polystyrolgeltyp (z. B. Dowex 1X8) oder weitere, weniger basische Harze wie solche vom Pyridiniumpolymerisattyp und vom phenolischen Polyamintyp. Als chelatbildende Harze kommen Chelex 100 oder beliebige andere Harze, bei denen es sich um ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit einem Gehalt an gepaarten Iminodiacetationen handelt (z. B. Dowex A-1), in Frage. Geeignete Verzögerungsharze sind Harze mit einem Gehalt an gepaarten Anionen- und Kationenaustauscherstellen. Diese Harze werden im allgemeinen durch Polymerisation von Acrylsäure innerhalb eines stark basischen Harzes, z. B. eines Harzes mit quaternären Ammoniumgruppen in einem Styrol-Divinylbenzol- Copolymerisat-Gitter, hergestellt. Die vorstehende Erörterung umfaßt nur repräsentative Beispiele für die jeweiligen Harze. Weitere derartige Harze sind bekannt. Eine Zusammenstellung von handelsüblichen Harzen mit kurzer Beschreibung ihrer Eigenschaften und Anwendungszwecke findet sich beispielsweise in der Preisliste H von Bio-Rad Laboratories, 1982. Die Auswahl und Kombination von Harzen hängen vom speziell vorliegenden Trennungsproblem ab und bleiben dem Fachmann überlassen. Diesbezüglich wird beispielsweise auf J. Khym, Analytical Ion-Exchange Procedures in Chemistry and Biology, 1974, verwiesen.

Matrices zur Größenfraktionierung sind ebenfalls bekannt. Beispiele hierfür sind Polyacrylamide, Agarosen, Polysaccharide und dergleichen. Besonders geeignete größenfraktionierende Matrices sind Polysaccharidgele, z. b. Sephadex G-50- Gel. Beispiele für Polyacrylamidgele sind die Gele der Reihe Bio-Gel P. Die Wahl der größenfraktionierenden Matrix hängt vom zu reinigenden Protein ab und bleibt dem Fachmann überlassen.

In der erfindungsgemäßen Praxis können verschiedene Harze als Schichten innerhalb einer Säule eingesetzt werden. Die zu reinigende Lösung kann entweder von oben nach unten oder von unten nach oben durch die Säule geleitet werden. Eine Fließrichtung von oben nach unten stellt bei Verwendung von radioaktiven Verbindungen die bevorzugte Laboratoriumstechnik dar, da bei einem durch Gravitation bedingten Durchfluß wenige oder keine zusätzlichen Ausrüstungen oder Instrumente erforderlich sind. Die Wahl der Füllungshöhe, Fließgeschwindigkeit und ähnlicher Parameter bleibt dem Fachmann überlassen.

Offensichtlich werden stark geladene Metalle gelegentlich in zufälliger Weise durch den Antikörper an den ionischen Stellen entlang der Proteinoberfläche gebunden. In anderen Fällen werden in zufälliger Weise gebundene Metalle offensichtlich innerhalb der Faltungen des Antikörperproteins eingeschlossen. Diese Metalle können in die Lösung freigesetzt werden, sie können aber auch aus der Lösung in einer Art Gleichgewichtsreaktion wieder absorbiert werden. Die erfindungsgemäß zur Reinigung eingesetzten Verzögerungs- oder Ionenaustauscherharze dienen dazu, das Gleichgewicht zu verschieben und eine Entfernung der Metalle aus dem Antikörper zu ermöglichen. Beispielsweise werden bei der Passage des Antikörpers durch ein Ionenverzögerungsharz zwar die Passage der Metallionen in der Lösung, aber nicht die Passage des Proteins verzögert. In zufälliger Weise gebundene, stark geladene (+3 oder darüber) Metallionen werden sodann in die Lösung freigesetzt, um das Gleichgewicht wieder herzustellen. Da derartige Ionen in die Lösung abgegeben werden, sie aber dann durch das Harz verzögert werden, erfolgt eine ständige Freisetzung dieser Metallionen aus dem Antikörper.

Unterhalb dem Ionenverzögerungsharz kann eine Schicht aus Ionenaustauscherharz verwendet werden, um die abgetrennten, stark geladenen Ionen fest zu binden und den Trennvorgang fortzusetzen. Da das Harz eine Verarmung der Proteinlösung an freien, stark geladenen Ionen bewirkt, wird das Gleichgewicht zwischen freien und auf zufällige Weise gebundenen Metallionen wieder hergestellt. Jedoch verbleiben während dieses Vorgangs innerhalb des Chelats befindliche Metallionen beim Antikörper.

Es wurde jedoch festgestellt, daß die bloße Verwendung eines Ionenverzögerungs- oder Ionenaustauscherharzes keine zufriedenstellende Entfernung von im wesentlichen sämtlichen auf zufällige Weise gebundenen Metallen bewirkt. Um die Reinigung zu vervollständigen, wird eine größenfraktionierende Matrix verwendet. Die Antikörperlösung, die in die Matrix gelangt, ist bereits teilweise in bezug auf freie, stark geladene Metallionen verarmt. In der größenfraktionierenden Matrix erfolgt eine weitere Verarmung. Während der Bewegung der Lösung durch die Matrix werden die Antikörper nicht verzögert, während eine verzögerte Bewegung der Ionen stattfindet. Die aus der größenfraktionierenden Matrix erhaltene Lösung ist im wesentlichen frei von auf zufällige Weise gebundenen Metallen. Der Gehalt an diesen lose gebundenen Metallen kann auf Werte von nicht mehr als 6 Prozent des gesamten Metallgehalts des Konjugats verringert werden, so daß mindestens etwa 94 Prozent des vom Konjugat beförderten Metalls stabil durch das Chelat gebunden sind. Vorzugsweise sind mindestens etwa 97 Prozent der gesamten Metalle durch das Chelat gebunden. Die Erzielung von Metallgehalten, bei denen 98 Prozent oder mehr des Metalls durch das Chelat gebunden sind, ist möglich. Die Bestimmung des Gehalts an stabil gebundenem Metall kann durch Dialyse erfolgen.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung besteht in der Verwendung eines Ionenverzögerungsharzes oberhalb eines Kationenaustauscherharzes und eines Gels. Bei der Reinigung von mit Technetiumchelat konjugierten monoklonalen Antikörpern ist die Säule vorzugsweise folgendermaßen aufgebaut: Ein Ionenaustauscherharz über einem Kationenaustauscherharz über einem Anionenaustauscherharz und einem größenfraktionierenden Matrixgel.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird der Antikörper in nicht-aggregierter Form zurückgehalten. Die Aggregation von Antikörpern durch Verklumpen oder Vernetzung führt zu einem Verlust an Antikörperspezifität, was unerwünscht ist. Die Aggregation kann durch übermäßig hohe Antikörperkonzentrationen in einem Träger oder durch Kontakt mit Chemikalien, die eine Proteinvernetzung bewirken, wie Carbodiimide, hervorgerufen werden. Standardsedimentationstests, größenfraktionierende Matrices oder dergleichen können dazu verwendet werden, um festzustellen, ob eine Aggregation der Antikörper stattgefunden hat. Bei den hier erläuterten Antikörperspezifitätstests drückt sich die Aggregation in einem Spezifitätsverlust aus.

Die Aktivität und Spezifität der erfindungsgemäßen konjugierten Antikörperprodukte wird in einem Ausmaß von mindestens etwa 80 Prozent und vorzugsweise von mindestens etwa 90 Prozent, bezogen auf die Aktivität und Spezifität des zur Herstellung des Konjugats verwendeten Antikörpers, aufrechterhalten. Besonders bevorzugte Lösungen sind durch eine Antikörperaktivität und -spezifität von mindestens etwa 95 Prozent gekennzeichnet. Es sind Produkte hergestellt worden, bei denen die Aktivität und Spezifität des ursprünglichen Antikörpers praktisch unverändert geblieben ist. Die Aktivität und Spezifität der Antikörper werden routinemäßig durch in vitro-Bindung der Antikörper an ein Epitop gemessen. Aktivität und Spezifität des endgültigen Antikörperprodukts können leicht bestimmt werden, indem man einfach den zuerst durchgeführten Test mit dem endgültigen konjugierten Produkt wiederholt.

Mit dem erfindungsgemäßen Produkt ist eine therapeutische in vivo-Behandlung möglich, bei dem die mit dem radioaktiven Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper in den Körper eingeführt werden und eine Konzentration im Zielbereich ermöglicht wird. Es gibt eine Reihe von radioaktiven Metallisotopen, die stabile DTPA-Komplexe bilden und cytotoxische α-Teilchen emittieren. Die therapeutische Wirkung tritt auf, wenn sich die Konjugate in der Nähe oder in Kontakt mit den Zielzellen befinden und mit diesen eine Bindung eingehen. Die Abtötung der Zellen wird als direktes oder indirektes Ergebnis des Bestrahlungsvorgangs durch das radioaktive Metall, das sich in unmittelbarer Nähe zur Zelle befindet, angesehen.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Produkte bietet verschiedene Vorteile. Zunächst wird durch die hohe Spezifität des konjugierten monoklonalen Antikörpers die gesamte Strahlungsdosis auf ein Minimum reduziert. Es muß nur so viel Strahlung angewandt werden, als für die Zielzellen erforderlich ist. Ferner werden Chelate mit radioaktiven Metallen im allgemeinen rasch aus dem Körper entfernt, sofern ein Auseinanderbrechen des konjugierten Antikörpers erfolgt. Es können kurzlebige Isotope angewandt werden, wobei die Affinitätskonstante, mit der das Isotop im DTPA-Chelat festgehalten wird, sehr hoch ist, was zu einer stabilen Bindung des Metalls führt. Da schließlich die Menge des verwendeten radioaktiven Metalls minimal ist, ist die Strahlungsgefahr für Personen, die die mit dem radioaktiven Metallchelat konjugierten Antikörper herstellen und verabreichen, beträchtlich verringert.

Aufgrund der Eigenschaften des erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörpers, der mit dem Chelat aus DTPA und radioaktivem Metall konjugiert ist, kann die Gewebeschädigung oder die Gesamtkörperdosis während der Therapie im Vergleich zu herkömmlichen Bestrahlungsbehandlungen, wie Isotopenimplantationen, äußere Bestrahlungsbehandlung und Immunoradiotherapie unter Verwendung von mit Jod-131 markierten polyklonalen oder autologen Antikörpern, beträchtlich verringert werden. Ferner können sowohl die biologischen als auch physikalischen Halbwertszeiten der auf ein Ziel gerichteten radiobiologischen Produkte kontrolliert werden, wodurch Gesamtkörperstrahlungseffekte auf einem Minimum gehalten werden. Da die Bestrahlung spezifisch auf Zelltypen (z. b. neoplastische Zellen) gerichtet ist, wird eine therapeutische Dosis spezifisch auf maligne Zellen, die entweder lokalisiert oder metastasiert sind, ausgerichtet. Die Fähigkeit des mit dem radioaktiven Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörpers zur Bereitstellung einer wirksamen Bestrahlungsdosis spezifisch für die metastasierten Zellen stellt eine einzigartige und zur Krebstherapie besonders wertvolle Wirkung dar.

Erfindungsgemäß werden die mit dem Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper, die ein α-emittierendes radioaktives Metall enthalten, zur Behandlung von zellulären Störungen verwendet. Bei den meisten Anwendungszwecken ist es erwünscht, daß das radioaktive Metall eine Halbwertszeit von weniger als etwa 4 Tage aufweist und rasch nach Emittierung der α-Teilchen in ein stabiles Isotop zerfällt. Erfindungsgemäß gemäß bevorzugte Isotope sind Wismuth-211, Wismuth-212, Wismuth-213 und Wismuth-214. Wismuth-212 mit einer Halbwertszeit von 60,6 Minuten wird besonders bevorzugt.

Der verwendete monoklonale Antikörper wirkt spezifisch auf die abzutötende, erkrankte Zelle. Der Zelltod wird durch den Zerfall des radioaktiven Metalls verursacht und kann auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Zuerst kann bei Emittierung des α-Teilchens in die Richtung der erkrankten Zelle ein einziger Zusammenprall mit dem Zellkern cytotoxisch sein. Das Isotop, in das das radioaktive Metall nach Emission des α-Teilchens zerfällt, wird aus dem Chelat auf einer Schußbahn, die zu der Bahn des α-Teilchens entgegengesetzt liegt, emittiert. Die gebundene Zelle kann daher noch getroffen werden, auch wenn das α-Teilchen auf einer von der Zelle entfernten Schußbahn emittiert wird. Ein einzelner Treffer durch das zerfallene Isotop in der Zellmembran kann eine irreparable Zellschädigung hervorrufen, die zum Zelltod führt. Aufgrund der relativ hohen Wirksamkeit des α-Teilchens kann weniger stark radioaktives Material verwendet werden. Die Selektivität des monoklonalen Antikörpers und die kurze Reichweite (wenige Zelldurchmesser) der α-Teilchen hält die Zerstörung von gesundem Gewebe in einem zellulären Bereich auf einem Minimum.

Wismuth-212 zerfällt auf zwei verschiedenen Wegen. Etwa 64 Prozent von Wismuth-212 zerfällt durch β-Emission zu Polonium- 212, das eine Halbwertszeit von 0,3 Mikrosekunden hat. Polonium-212 zerfällt nach Emission eines α-Teilchens mit einer Reichweite von etwa 90 µm in stabiles Blei-208. Die restlichen 36 Prozent des Wismuths-212 zerfallen zu Thallium-208 unter Emission eines α-Teilchens mit einer Reichweite von etwa 35 bis 50 µm. Thallium-208 mit einer Halbwertszeit von 3 Minuten zerfällt dann unter β-Emission zu stabilem Blei-208.

Generatoren für Bi-212 sind in der Literatur beschrieben; vgl. Gleu et al, Z. Anorg. Allgem. Chem., Bd 290 (1957), S. 270 und Zucchini et al., Int. J. Nucl. Med. & Biol. (Juni 1982) (eine Zusammenfassung des Manuskripts wurde beim ACS-Meeting im August 1981 in New-York verteilt). Ein geeigneter Generator besteht aus Th-228 in vierwertigem Zustand, das in einem 3×5 mm-Bett aus Natriumtitanat absorbiiert ist, welches sich in einer Quarzsäule oberhalb einer groben Glasfrittenscheibe, die in die Säule eingearbeitet ist, befindet. Das Titanat hält sowohl Th-228 als auch dessen Zerfallprodukt Ra-224 fest. Wird Wasser über das Titanat gegeben, so löst sich das Rn-220-Zerfallsprodukt des Ra-224-Isotops im Wasser, gelangt durch die Frittenscheibe und wird in einem mit Wasser gefüllten, 10 ml fassenden Glasbehälter gesammelt. Die wäßrige Rn-220-Lösung fließt aus dem Behälter in eine Säule von 10 ml Durchmesser, die etwa 1 ml eines stark sauren Ionenaustauscherharzes, wie Bio-Rad AG-50 WX8-Kationenaustauscherharz, enthält. Rn-220 zerfällt im wesentlichen innerhalb von 5 Minuten im Behälter zu Pb-212, das bei Passage durch das Harz absorbiert wird. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1,5 ml/min durch das Harz werden etwa 85 Prozent des gebildeten Pb-212 in der Säule gesammelt, wo es zum Bi-212 Zerfallsprodukt zerfällt.

Wenn die gewünschte Menge an Bi-212 am Harz gebildet ist, kann es gemäß üblichen Verfahren mit Säure eluiert werden. Ein brauchbares Elutionsverfahren für Pb-212 und Bi-212 besteht darin, 5 ml 2n HCl über das Harz zu geben. Ist nur Bi-212 erwünscht, besteht eine andere Möglichkeit darin, 1,5 ml 0,5 m HCl über das Harz zu geben.

Während Metalle, die β-Teilchen oder Auger-Elektronen emittieren, für die Therapie verwendet werden können, sind α-emittierende radioaktive Metalle aus mehreren Gründen bevorzugt. Zunächst weist die α-Nucleotidstrahlung im Vergleich zur β- oder Auger-Strahlung charakteristischerweise eine kurze Reichweite im Gewebe und eine sehr hohe lineare Energieübertragung auf. Durch α-Strahlung kann eine Zelle bei nur einem Zusammenstoß mit dem Kern abgetötet werden, wobei im wesentlichen alle Zellen bei 10 oder weniger Stößen abgetötet werden. Ferner wird bei dem Zerfall ein Isotop emittiert (z. B. Tl-208 oder Pb-208 im Fall von Bi-212), das ebenfalls zum Zelltod führen kann. Die Reichweite der α-Teilchen im Gewebe liegt im allgemeinen unter etwa 150 µm. Im Gegensatz dazu erfordern β- und Auger-Teilchen Hunderte von Kerntreffern, bevor der Zelltod eintritt. Ferner liegen die Reichweiten dieser Teilchen im Gewebe in der Größenordnung von einigen 10 mm bis cm. Bei Verwendung von β-Teilchen sind eine höhere Dosis und der Zerfall von wesentlich mehr radioaktiv markierten Antikörpern erforderlich, um den Zelltod zu erreichen. Somit werden spezifisch gebundene Antikörper dem Stoffwechselabbau unterworfen, wobei β-emittierende, radioaktive Metalle in das Blut abgegeben werden. α-emittierende radioaktive Metalle bewirken dagegen eine relativ rasche Abtötung, so daß weniger Antikörper durch Stoffwechselvorgänge abgebaut werden.

Die erfindungsgemäßen Metallchelat-konjugierten Antikörper können in vivo in einem beliebigen geeigneten pharmakologischen Träger verabreicht werden. Wie bereits erwähnt, kann normale physiologische Kochsalzlösung verwendet werden. Häufig umfaßt der Träger eine untergeordnete Menge eines Trägerproteins, wie Humanserumalbumin, um den Antikörper zu stabilisieren. Die Konzentration der mit dem Metallchelat konjugierten Antikörper in der Lösung wird entsprechend den Bedürfnissen gewählt. Konzentrationen von 0,5 mg/ml sind leicht erreichbar. Jedoch können die Konzentrationen je nach den spezifischen Anwendungsbedingungen beträchtlich variieren. Geeignete Konzentrationen an biologisch aktiven Materialien in einem Träger lassen sich nach Routineverfahren bestimmen.

Die wirksame Strahlungsdosis oder der Metallgehalt, die für einen Anwendungszweck eingesetzt werden, hängen auch von den speziellen Gegebenenheiten der Anwendung ab. Bei der Behandlung von Tumoren hängt die Dosis unter anderem von der Tumorgröße, dessen Zugänglichkeit und ähnlichen Faktoren ab. In entsprechender Weise hängt die Verwendung von mit Metallchelat konjugierten Antikörpern für diagnostische Zwecke unter anderem von der verwendeten Nachweisvorrichtung, dem Ort der zu untersuchenden Stelle und ähnlichen Faktoren ab. Für den Fall, daß der Patient zusätzlich zu den an der entsprechenden Stelle lokalisierten Antigenen zirkulierende Antigene aufweist, können die zirkulierenden Antigene vor der Behandlung entfernt werden. Eine derartige Entfernung von Antigenen kann beispielsweise durch Verwendung von unmarkierten Antikörpern oder durch Plasmaphorese, bei dem das Serum des Patienten zur Entfernung von Antigenen behandelt wird, erreicht werden.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen, die jedoch keinerlei Beschränkung der Erfindung darstellen sollen, näher erläutert.

Beispiel 1

100 mg DTPA werden in einem Kolben ausgewogen und mit 1 ml Wasser versetzt. Die Lösung wird mit 0,125 g redestilliertem Triäthylamin umgesetzt. Die Reaktionslösung wird zur vollständigem Umsetzung erwärmt. Durch Gefriertrocknen wird ein festes Produkt gewonnen.

Der gefriergetrocknete Feststoff wird in 0,5 ml reinem, wasserfreiem Acetonitril gelöst und bei etwa -20°C mit 35 µl Isobutylchlorformiat versetzt und sodann auf eine Temperatur von etwa -70°C gebracht. Nach etwa 45 Minuten wird die Lösung in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt. Sie enthält das gewünschte gemischte Carboxycarbonsäureanhydrid von DTPA in einer Konzentration von etwa 0,5 m.

Der verwendete monoklonale Antikörper hat die Bezeichnung 103A5. Er wurde durch Fusion von P3X63Ag-8-Mäusemyelomzellen mit isolierten Milzzellen von C56B1/6-Mäusen, die mit gereinigtem Retrovirusglykoprotein mit 70 000 Dalton (gp70) (erhalten gemäß M. Strand und J. T. August, J. Biol. Chem., Bd. 251 (1976), S. 559) immunisiert waren, erhalten. Die Fusion erfolgte gemäß M. Strand, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 3234.

114 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 2 mg monoklonalem Antikörper 103A5 in 0,1 m NaHCO₃ mit einem pH-Wert von etwa 7,2 und einem Gehalt an 150 millimolar Natriumchlorid wird hergestellt und in ein Nunc-Gefäß pipettiert. Anschließend werden 33 µl einer 0,1 m NaHCO₃-Lösung vom pH-Wert 7,0 in das Gefäß gegeben. Schließlich werden 26,4 µl des gemischten Carboxycarbonsäureanhydrids von DTPA (0,5 m in Acetonitril) zugesetzt, nachdem die Chelat- und Antikörperlösung auf etwa 0°C gekühlt worden ist. Die Reaktion wird über Nacht durchgeführt.

Das Produkt wird zunächst bei 4°C gegen 1 Liter 30 millimolar Ascorbinsäure, 5 millimolar EDTA, 200 millimolar NaCl und 20 millimolar Natriumcitrat (pH-Wert 7,0) dialysiert. Die erhaltene Lösung wird 48 Stunden bei 4°C 3mal gegen 1 Liter 50 millimolar Citrat, 200 millimolar Natriumchlorid (pH-Wert 6,0) und 1 ml Chelex 100-Harz dialysiert. Schließlich wird die erhaltene Lösung 8 Stunden gegen 1 Liter einer Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar MES und 200 millimolar Natriumchlorid (pH-Wert 6,0) dialysiert. Es werden etwa 1,7 mg an mit Chelat konjugiertem monoklonalem Antikörper gewonnen. Analoge Versuche unter Verwendung von mit C-14 markiertem DTPA werden durchgeführt und durch Scintillationszählung analysiert. Es ergibt sich ein Gehalt von etwa 1,5 Chelaten pro Antikörpermolekül.

40 µl Indium-111-chloridlösung werden durch Zusatz von 11,4 µl 0,4 m Citronensäure vom pH- Wert 5,0 auf den pH-Wert 3,0 eingestellt. Eine getrennte Lösung mit einem Gehalt an 250 µg mit Chelat konjugiertem monoklonalem Antikörper in einem Gesamtvolumen von 21,6 µl wird hergestellt. Die Lösung weist eine Konzentration an 200 millimolar Natriumchlorid und 10 millimolar MES bei einem pH-Wert von 6,0 auf. Die Lösung wird durch Zugabe von 6 µl 0,25 m Citronensäure vom pH-Wert 3,0 auf den pH-Wert 4,6 eingestellt.

Mit Metallchelat konjugierter monoklonaler Antikörper wird hergestellt, indem man die Lösungen von Indiumchlorid und mit Chelat konjugiertem Antikörper vereinigt und etwa 30 Minuten bei Umgebungstemperatur reagieren läßt. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 25 µl einer gesättigten Trinatriumcitratlösung unter Einstellung des pH-Wertes auf etwa 6 beendet.

Der mit Chelat konjugierte Antikörper wird chromatographisch an einer 9 cm langen Säule mit einem Gehalt an 1,0 ml eines Ionenverzögerungsharzes über 1,0 ml Kationenaustauschharz (AG-50-WX8, H⁺-Form, 200 bis 400 mesh) über 7 ml Sephadex G-50-Gel gereinigt. Eine Lösung mit einem Gehalt an 200 millimolar Natriumchlorid und 10 millimolar MES vom pH-Wert 6,0 wird als Elutionsmittel und zur vorherigen Äquilibrierung der Säule verwendet.

Das Eluat wird in Fraktionen von 0,5 ml gesammelt. Die beiden Fraktionen mit dem größten Proteingehalt enthalten 150 µg monoklonalen Antikörper, der mit 157,1 µCi Indium-111 markiert ist. Die Dialyse bei 4°C gegen 1 Liter einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 20 millimolar MES und 200 millimolar Natriumchlorid vom pH-Wert 6,0 ergibt einen Indiumverlust von weniger als 6 Prozent. Der Antikörper behält bei in vitro-Tests im wesentlichen 100 Prozent seiner biologischen Aktivität und Spezifität. Die in vivo-Abbildung von leukämischen Mäusen ergab, daß sich die Tumorstelle in der Milz befand. Bei Verabreichung an normale Mäuse erfolgte keine Aufnahme durch die Milz.

Beispiel 2

Ein Hybridom wird durch Fusion von P3 653-Mäusemyelomzellen mit den isolierten Milzzellen von C56B1/6-Mäusen, die mit gereinigtem, tumorassoziiertem Ferritin (isoliert aus menschlicher Milz) immunisiert worden sind, erhalten. Ein Hybridom wird isoliert, das einen Antiferritin-Antikörper der Bezeichnung 263D5 bildet. Der Antikörper ist spezifisch für Humanferritin und reagiert nicht mit Ferritin anderer Säugetierspezies.

Das Verfahren von Beispiel 1 wird zur Bildung eines Indium- 111 enthaltenden mit DTPA konjugierten monoklonalen Antikörpers wiederholt. Eine normale physiologische Kochsalzlösung, die den mit dem Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper enthält, wird normalen und leukämischen Mäusen injiziert. Sowohl bei den leukämischen als auch bei den normalen Mäusen ergibt die radiographische Abbildung, daß keine Konzentration des radioaktiv markierten Metalls erfolgt. Diese Tests zeigen, daß das Chelat in vivo sowohl im Hinblick auf die Chelat-Antikörper-Konjugation als auch auf die Retention des radioaktiven Metalls stabil ist. Weder Milz noch Leber treten in diesen Abbildungen hervor.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird ein γ-Teilchen emittierendes Isotop verwendet, um die selektive Lokalisation von radioaktiven Metallen (unter Einschluß von α-Teilchen emittierenden Isotopen), die erfindungsgemäß erzielt wird, zu erläutern.

Mit Indium-111-Chelat konjugierte monoklonale Antikörper werden aus einem für menschlichen Brusttumor spezifischen Antikörper hergestellt. Das Hybridom, das den Antikörper bildet, wird durch eine Fusion von Mäusemyelom- und Mäusemilzzellen erhalten. Hybridom und Antikörper sind in Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, (1981), S. 3199 beschrieben.

Das angewandte Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie in den Beispielen 1 und 2, mit Ausnahme der nachstehenden Abänderungen. Zunächst wird die Stufe der Dialyse des mit dem Chelat konjugierten monoklonalen Antikörpers gegen Ascorbat-EDTA weggelassen. Ferner werden 10 µl 0,1 m Ascorbat vom pH-Wert 4 zu der Indium-111-Lösung gegeben, bevor diese zur wäßrigen Kochsalzlösung des mit dem Chelat konjugierten monoklonalen Antikörpers gegeben wird.

Gegenüber den Verfahren von Beispiel 1 und 2 ergibt sich eine 3fache Steigerung der Markierungswirkung. Das fertige Produkt ist mit etwa 2,1 µCi/µg markiert.

10 µg des mit Indium-111-Chelat konjugierten monoklonalen Antikörpers, die aus der Reinigungssäule erhalten werden, werden mit wäßriger, phosphatgepufferte Kochsalzlösung auf 100 µl verdünnt. Der verdünnte mit Indium-111 konjugierte Antikörper wird in die Schwanzvene einer nackten, athymischen Maus, in der ein menschlicher Brusttumor gezüchtet worden ist, injiziert. Die menschlichen Brusttumorzellen exprimieren ein Antigen für den Antikörper. 72 Stunden nach der Injektion zeigt ein klares und gut definiertes mit der γ-Kamera aufgenommenes Bild die starke Lokalisation von Indium-111 im Tumorgewebe. Weder in der Leber noch in der Milz läßt sich eine ähnliche Lokalisation von Indium-111 beobachten.

Beispiel 4

Die nachstehenden Tabellen zeigen, daß ein Chelat aus radioaktivem Metall und DTPA im Gegensatz zu einem freien radioaktiven Metall sich nicht in Leber und Milz lokalisiert und rasch durch Nieren und Magen ausgeschieden wird. Die Aufnahme von radioaktivem Metall in Organe von normalen und leukämischen Mäusen wird nach folgendem Verfahren bestimmt. 6 Wochen alte normale Mäuse und 8 Tage vorher durch Injektion von Rauscher-Leukämievirus leukämisch gemachte Mäuse erhalten eine intraperitoneale Injektion von 5 µg (5 µCi/µg) an freiem Bi-207, mit DTPA cheliertem Bi-207 und mit DPTA cheliertem Sc-46. 18 und 24 Stunden später werden die Mäuse getötet. Das Gewicht der Organe wird ermittelt. Die in den Organen enthaltene Radioaktivität wird bestimmt. Um eine Normalisierung in bezug auf Unterschiede bei der Injektion, auf Körpergewicht und auf die Zeitpunkte der Organentnahme zu erreichen, wird die Menge an Radioaktivität pro Gramm Gewebe durch die Menge an Radioaktivität pro Gramm Blut dividiert. Diese Verhältnisse sind als Ergebnisse angegeben. Die Ergebnisse sind in den Tabelle I, II und III zusammengestellt.

Tabelle I

Durchschnittswerte und Standardfehler der Verhältniswerte/ Blut von 5 Organen von 14 Tage alten leukämischen und normalen Mäusen 18 und 42 Stunden nach der Injektion von freiem ²⁰⁷Bia

Tabelle II

Durchschnittswerte und Standardfehler der Verhältniswerte/ Blut von 5 Organen von leukämischen und normalen Mäusen 18 Stunden nach Injektion von ²⁰⁷Bi-DTPA-Chelat

Tabelle III

Durchschnittswerte und Standardfehler der Verhältniswerte/ Blut von 5 Organen von leukämischen und normalen Mäusen 18 Stunden nach Injektion von ⁴⁶Sc-DTPA-Chelat

Die Daten der vorstehenden Tabellen zeigen, daß mit DTPA cheliertes Wismuth und Scandium sich im Gegensatz zu freiem Wismuth in der Leber oder Milz von Mäusen nicht anreichern. Hohe Konzentrationen von cheliertem Metall in den Nieren, zeigen, daß dieses über den Urin beseitigt wird. Die Unterschiede in den Nierenkonzentrationen bei leukämischen und normalen Mäusen sind darauf zurückzuführen, daß leukämische Mäuse aufgrund von Streß häufig Urin ausscheiden.

Beispiel 5

Untersuchungen werden durchgeführt, um die Wirkung von Wismuth- α-Strahlung auf Säugetierzellen zu untersuchen. F-46- leukämische Zellen werden in vitro in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit einem Gehalt an 10 Prozent durch Wärmeeinwirkung inaktiviertem fötalem Kälberserum bis zu einer Zellpopulation von 1×10⁵ in jeder Vertiefung gezüchtet. Die Zellpopulationen werden Wismuth-212 ausgesetzt, indem Serienverdünnungen (gemäß Tabelle IV) im Wachstumsmedium zugesetzt werden. Die Zellen werden sodann 96 Stunden gezüchtet. Die Anzahl der überlebenden Zellen wird ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Aus den Daten von Tabelle IV ergibt sich unter Anwendung üblicher Berechnungsmethoden ein D₀-Wert (Überlebensrate 37%), von 38,5 rad. Dies zeigt, daß Wismuth-212 stark cytotoxische, dicht ionisierende Strahlung emittiert. Vergleichsweise waren 900 rad einer schwach ionisierenden Strahlung einer Kobalt-60-Quelle zur Erzielung der gleichen Ergebnisse erforderlich. Bezüglich einer Erläuterung der Bestrahlungsdosen wird auf die nm/mird-Schriften Nr. 1 (revidiert) und 10 verwiesen.

Claims

1. Wäßrige Lösung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern, bei der mindestens etwa 94 Prozent des Metalls durch den Chelatanteil des Konjugats komplexiert und es sich bei dem Metall um ein α-emittierendes radioaktives Metall handelt, wobei in den konjugierten Antikörpern mindestens etwa 80 Prozent ihrer Aktivität und Spezifität erhalten sind.

2. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem α-emittierenden radioaktiven Metall um ein Metall aus der Gruppe Bi-211, Bi-212 und Bi-213 handelt.

3. Verfahren zur Herstellung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Chelat-konjugierte monoklonale Antikörper bereitstellt,
(b) zu einer wäßrigen Lösung der gewonnenen Chelat-konjugierten monoklonalen Antikörper ein Metallsalz und einen Puffer zur Bildung von Metallchelat-konjugierten Antikörpern zusetzt, wobei es sich bei dem Metall um ein α-emittierendes radioaktives Metall handelt,
(c) die die Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper enthaltende wäßrige Lösung über eine Chromatographiesäule gibt, wobei die Säule eine oder mehrere Schichten aus der Gruppe ionenretardierende Harze, Anionenaustauscherharze, Kationenaustauscherharze und chelatbildende Ionenaustauscherharze und eine Schlußschicht, die eine eine Größenfraktionierung bewirkende Matrix enthält, aufweist, und
(d) von der Säule eine Lösung von Metallchelat-konjugierten Antikörpern gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Chelat- konjugierten monoklonalen Antikörper durch Kontakt eines Carboxy carbonsäureanhydrids von Diäthylentriaminpentaessigsäure mit einer wäßrigen Lösung von monoklonalen Antikörpern hergestellt worden sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Carboxycarbonsäureanhydrid von Diäthylentriaminpentaessigsäure um das Reaktionsprodukt handelt, das durch Umsetzung eines Aminsalzes von Diäthylentriaminpentaessigsäure mit einem Ester einer Halogenameisensäure in einem organischen Lösungsmittel bei Temperaturen unter etwa -20°C erhalten worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Halogenameisensäureester um Isobutylchlorformiat handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem α-emittierenden radioaktiven Metall um ein Metall aus der Gruppe Bi-211, Bi-212 und Bi-213 handelt.

8. Verwendung einer Lösung gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von zellulären Störungen.

9. Wäßrige Lösung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens etwa 94% des Metalls durch den Chelatanteil des Konjugats komplexiert sind und in den konjugierten Antikörpern mindestens etwa 80% ihrer Aktivität und Spezifität erhalten sind.

10. Lösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Metall um ein radioaktives Metall handelt.

11. Verfahren zur Herstellung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Chelat-konjugierte monoklonale Antikörper bereitstellt,
(b) zu einer wäßrigen Lösung der gewonnenen Chelat-konjugierten monoklonalen Antikörper ein Metallsalz in einem Puffer zur Bildung von Metallchelat-konjugierten Antikörpern zusetzt;
(c) die die Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper enthaltende wäßrige Lösung über eine Chromatographiesäule gibt, wobei die Säule eine oder mehrere Schichten aus der Gruppe ionenretardierende Harze, Anionenaustauscherharze, Kationenaustauscherharze und chelatbildende Ionenaustauscherharze und eine Schlußschicht, die eine eine Größenfraktionierung bewirkende Matrix enthält, aufweist, und
(d) von der Säule eine Lösung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern gewinnt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Chelat-konjugierten monoklonalen Antikörper durch Kontakt eines Carboxycarbonsäureanhydrids von Diäthylentriaminpentaessigsäure mit einer wäßrigen Lösung von monoklonalen Antikörpern hergestellt worden sind.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Metall des Metallsalzes um ein radioaktives Metall handelt.