JP2599705B2

JP2599705B2 - 金属キレート抱合モノクローン抗体の製造法および使用法

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Publication number: JP2599705B2
Application number: JP58101593A
Authority: JP
Inventors: オツト・エイ・ガンソウ; メツト・ストランド
Original assignee: ミシガンステイトユニバーシティー; ザジヨンズホプキンスユニバーシティー
Priority date: 1982-06-07
Filing date: 1983-06-07
Publication date: 1997-04-16
Anticipated expiration: 2012-04-16
Also published as: GB8315483D0; DE3320560A1; JPS5946227A; GB2122641B; GB2122641A; FR2527928A1; CA1225930A; DE3320560C2; FR2527928B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は一般に金属キレート抱合モノクローン抗体に
関する。本発明はまた放射性金属キレート抱合モノクロ
ーン抗体を用いる細胞不調、特に癌の治療法に関する。

癌のような細胞不調の処置に対して効果的な治療法が
徹底的研究の目的となつている。通常の療法は外科、放
射線および化学療法を使用する。これら方法の各々は健
康な細胞と癌性の細胞との間にそれ程選択性がないとい
う点で重大な欠点を蒙むる。有効となるためには、これ
ら方法は大量の健康な組織を殺すか除去する。更にま
た、化学療法は免疫系に悪影響を与えるので、その結果
真菌、細菌またはウイルスの感染からしばしば死亡ある
いは重度の病気が起こる。

モノクローン抗体の開発は治療剤または診断用試薬を
特別な目標細胞へ選択的に伝送する可能性を開いた。モ
ノクローン抗体は十分に明らかにされた化学構造を有す
る免疫グロブリンである。モノクローン抗体の顕著な特
徴は機能の再現性と高い特異性である。

モノクローン抗体へ直接固定した放射性ヨウ素が診断
および治療に対して使用されている。ヨウ素−131が大
きい腫瘍に対しては若干の治療上の成功を収めたが、放
射性ヨウ素標識抗体は小さい腫瘍の焦点または転移に処
置に無効であつた。その上、特異的に結合した抗体は目
標細胞により比較的迅速に異化される。それ故に、異化
は排泄器官、即ち腎臓、膀胱および胃に代謝されたヨウ
素を取り込むことに通じる。更にまた、モノクローン抗
体を経由して毒素を腫瘍細胞に送る試みは成功した治療
にはならずに終つた。

ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）はタンパク質に
付いたとき安定な金属錯体を形成しうることが文献で示
唆された。クレイカレク（Krejcarek）等、Biochem.& B
iophys.Res.Commun.77:581（1977）。クレイカレクの方
法に従い調製された放射生金属−DTPA抱合ポリクローン
抗体を用いた生体内目標部位の像形成がハウ（Khaw）
等、Science 209:295（1980）により報告された。ゲル
クロマトグラフイーおよび透析によつて遊離金属および
キレート化金属を金属キレート抱合ポリクローン抗体か
ら分離したにも拘らず、この記事に含まれたガンマー像
は肝臓に局所化した高い割合の放射性金属を示してい
る。

本発明の一つの目的は、改良治療法を提供することに
ある。

本発明のもう一つの目的は、モノクローン抗体を用い
る細胞不調の効果的治療法を提供することにある。

本発明の更に一つの目的は、健康な細胞の破壊を殆ど
あるいは全く起こさない放射線の致死量を病細胞へ選択
的にねらいをつける方法を提供することにある。

本発明の一つの目的は、小さい腫瘍焦点および転移を
選択的に治療する方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、身体の健康な器官中への
目立つた放射性金属の取り込みを避けて選択的に的に向
けられた放射性金属を生体内に導入する方法を提供する
ことにある。

本発明は、そのいくつかの面の一つにおいて、目標細
胞を放射性金属キレート抱合モノクローン抗体と接触さ
せることからなり、そして前記放射性金属がアルフアー
粒子放射性金属核種である細胞不調の治療法を提供する
ものである。もう一つの具体例において、本発明は体液
中に金属キレート抱合モノクローン抗体を導入すること
からなる方法を企図しており、この方法において前記の
抱合キレートはジエチレントリアミン五酢酸の誘導体で
あり、そして前記抱合体は前記金属の偶然に結合したイ
オンを実質的に含まず、かつ抗体の実質的にすべての活
性と選択性を保持している。このような技術は診断およ
び治療の両方の目的に適なつている。本発明はまたアル
フアー放出性放射性金属の金属キレート抱合モノクロー
ン抗体の製造法を提供するものであり、本法において
は、イオン遅滞樹脂、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換
樹脂およびキレート化イオン交換樹脂の群から選ばれる
一つ以上の層とサイジング・マトリツクスからなる最終
層を有するクロマトグラフイーカラムに金属キレート抱
合抗体を通過させる。

本発明は治療技術に対し、特に生体内で金属キレート
抱合モノクローン抗体を使用する。

本発明はまたその生物学的活性と特異性を保持しそし
て偶然に結合した金属を実質的に含まない金属キレート
化抱合抗体を提供する。偶然に結合した金属は安定でな
く、そして遊離金属が血液に入る結果となる。血液中で
解放される金属はトランスフエリンによつて、あるいは
血液中に存在する他の金属拘束タンパク質（例えば、フ
エリチン）により固定されうる。このような拘束された
金属は相当な長時間循環器系に保持され、細網内皮組織
系（RES）により追い出される。このような排除は金属
が肝臓および脾臓に濃縮される結果を招く。身体内の放
射性金属の無秩序な長期にわたる循環あるいは肝臓およ
び脾臓中の放射性金属の濃縮は極めて望ましくない。本
発明の実施はこれら重大な問題を緩和することができ
る。

モノクローン抗体は、免疫グロブリンの不均一な混合
物であるポリクローン抗体と著しく異なり、十分に明確
にされた化学構造を有する免疫グロブリンである。モノ
クローン抗体の顕著な特徴は機能および特異性の再現性
であり、そしてこのような抗体は、腫瘍細胞を含めて種
々様々な目標抗原に対して発現させることができ、また
発現して来た。モノクローン抗体を得る方法はこの分野
で広汎に議論されて来たしそしてよく知られている。有
用な典拠はMonoclonal Antibodies〔アール・エツチ・
ケンネツト，テイー・ジエイ・マツクキーン＆ケイ・ビ
ー・ベクトール（R.H.Kennett,T.J.McKean ＆ K.B.Bech
tol）編、1980〕である。またコプロウスキイー（Kopro
wski）等米国特許第4,196,265号明細書を見よ。本発明
の実施に対するモノクローン抗体の選択は金属キレート
抱合モノクローン抗体を用いる最終の用途に左右される
であろう。このような選択は技術の熟練のうちにある。

抗体は一般にイオン性化合物を含む水溶液中に保たれ
る。通常の生理学的食塩溶液が非常にしばしば使用さ
れ、そして広く入手できる。他のイオン性溶液、例えば
リン酸ナトリウムまたはカリウム、炭酸ナトリウムなど
を含むものもこの分野で公知であり、そして使用するこ
ともできる。

種々様々な有機キレート剤または配位子をモノクロー
ン抗体へ抱合できる。モノクローン抗体へ抱合させるこ
とのできる有機配位子は、天然または合成アミン、ポル
フイリン、アミノカルボン酸、イミノカルボン酸、エー
テル類、チオール類、フエノール類、グリコールおよび
アルコール類またはポリアミン、ポリアミノカルボン
酸、ポリイミノカルボン酸、アミノポリカルボン酸、イ
ミノポリカルボン酸、ニトリロカルボン酸、ジニトリロ
ポリカルボン酸、ポリニトリロポリカルボン酸、エチレ
ンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五または四
酢酸塩、ポリエーテル、ポリチオール、クリプタンド、
ポリエーテルフエノレート、ポリエーテルチオール、チ
オグリコールまたはアルコールのエーテル類、ポリアミ
ンフエノール、高度に安定な金属キレートまたはクリプ
テートを生ずるあらゆる非環式、大環状、環状、大二環
式または多環式、または他の同様な配位子の中から選ぶ
ことができる。明らかに配位子の選択はキレート化すべ
き金属によつて左右され、この分野の熟練のうちにあ
る。

本発明のある具体例で用いた配位子はモノクローン抗
体への結合に適した非金属が、結合した有機官能基を有
する。官能基はカルボン酸基、ジアゾ化可能なアミン
基、スクシンイミドエステル、無水物、混合無水物、ベ
ンズイミデート、ナイトレン、イソチオシアネート、ア
ジド、スルホンアミド、ブロモアセトアミド、ヨードア
セトアミド、カルボジイミド、スルホニルクロリド、ヒ
ドラジド、チオグリコール、または二分子抱合剤または
カツプリング剤としてこの分野で知られる反応性官能基
の中から選ぶことができる。

本発明はなるべくはジエチレントリアミン五酢酸（DT
PA）の誘導体を用いるのがよい。DTPA配位子は金属イオ
ンを固く束縛すること、およびDTPA誘導体（以後はキレ
ートと呼ぶ）は、金属キレート結合に関して、またキレ
ート−抗体抱合体に関して高度に安定なキレート抱合モ
ノクローン抗体を生成することが発見された。これらの
性質は特に生体内応用に対して非常に重要である。例え
ば、もしキレートが血液中に導入後金属イオンを解放す
るならば、これらイオンはトランスフエリンなどにより
固定されそして一般に身体の循環系に分布する傾向があ
るであろう。更にまたイオンは究極的には肝臓および脾
臓といつた器官に集まりそして留まる傾向があるであろ
う。これらの効果は金属の毒性およびその放射能により
重大な結果を有しうる。更にまた、もしキレートが抗体
と高度に安定な抱合体を形成しないならば、標的部位に
運ばれる金属の量が有意に減少しそしてそれに相応した
効力減少がある。

本発明に係る金属キレート抱合モノクローン抗体の製
造においては、外部源からの金属混入を避けることが重
要である。実験器具は外因的な金属を洗浄し去つたプラ
スチツクまたはガラスにすべきである。すべての原液は
適当な樹脂を用いた、例えばカラムクロマトグラフイー
により金属をすつかり無い状態にすべきである。

説明を容易にするため、DTPAキレートに関して本発明
を記述することにする。特に適当なキレートはDTPAのア
ミン塩からつくられる。アミンは広く用いられ、そして
DTPAを完全に脱プロトンさせる第一、第二および第三ア
ミンを包含する。適当なアミンの選択は技術の熟練のう
ちにあり、どのアミン（アンモニアを含めて）の効力も
容易に決定できる。特に適当なアミンはトリエチルアミ
ンである。少なくとも約５当量のアミンをDTPAの水溶液
に加え、加温して反応を完結させる。この反応は下記の
反応式（式中、トリエチルアミンがアミンである）に従
つてペンタキス（アミン）DTPA塩を生ずる：５（CH₃CH₂）₃N＋DTPA→〔（CH₃CH₂）₃N〕₅DTPA 溶液を蒸発させるかまたは凍結乾燥させて水と過剰のア
ミンを除去することにより固体のDTPA−アミン塩を回収
できる。

実際のキレートはDTPA誘導体である。官能基がDTPAに
加えられ、そしてDTPAはそれを通してモノクローン抗体
上のアミン基へ結合される。ハロギ酸のエステルをDTPA
−アミン塩と反応させて本発明により使用されるキレー
トをつくる。ハロギ酸のエステルとは一般式XC（Ｏ）−
Ｏ−Ｒ（式中、Ｘはハロゲン、なるべくは塩化物であ
り、Ｒは適当な官能基のどれかであるか、なるべくは約
６炭素原子以下を含むものがよい）のエステルを意味す
る。ＲおよびＸの選択は、キレートをモノクローン抗体
と反応させたときのキレートの安定性と立体障害を考慮
に入れて、技術の熟練のうちにある。特に適当なエステ
ルはイソブチルクロロホルメートである。

調製の一例として、凡そ等モル量のハロギ酸エステル
とDTPA−アミン塩とを極性有機溶媒、例えば純粋な乾燥
アセトニトリルに溶かす。ハロギ酸エステルの過剰は、
それが修飾されたDTPA配位子上の金属キレート化部位を
封鎖するので避けなければならない。反応温度は一般に
特に制限がなく、部分的にまたは実質的に沈殿する塩を
与えるように選ぶことができる。この反応は、なるべく
は反応のハロアミン塩副生成物の実質的に全部を沈殿さ
せるのに十分低い温度で行なうのがよい。用いたアミン
がトリエチルアミンでありそしてエステルがクロロギ酸
のエステルであるとき、温度は約−20℃から約−70℃ま
での範囲内にすべきである。温度をこの範囲に保つと、
平衡反応が右へ動き、次式：に従つてDTPAの混合カルボキシ炭酸無水物を高収量で生
ずる。

明記された温度範囲で上記反応を行なうことにより、
高濃度のキレートがハロアミン塩副生成物を実質的に含
まずに製造できる。例えば、約0.25mMのペンタキス（ト
リエチルアミン）DTPA塩を0.5mlのアセトニトリルに溶
解し、35マイクロリツトルのイソブチルクロロホルメー
トと反応させることができる。−70℃で約45分後、溶液
を遠心して沈殿を除去すると、望むキレートを約0.5Mの
濃度で含有する上澄液が残る。このキレートを有機溶媒
中少なくとも約0.25Mの濃度でキレート−抗体抱合反応
に導入することが望ましい。このようなキレート濃度
は、抱合反応混合物に比較的少量の有機溶媒を用いるこ
とを許す。反応混合物における有機溶媒の過剰量は、そ
の溶媒が抗体の生物学的活性と特異性に関して悪影響を
生じうるので、避けるべきである。

キレート抱合モノクローン抗体は、有機溶媒中のキレ
ートを抗体の食塩水溶液へ加えることにより生成され
る。修飾されたDTPAと抗体との反応を約7.2以下のpHで
行なうことが重要である。キレート−抗体反応は水との
反応により起こるキレートの分解と競合する。しかし、
pHが余りに低いとキレートは酸触媒分解を受け、抗体の
生物学的活性および特異性が減少する。pHは望ましくは
約6.0から約7.2までの範囲に、そしてなるべくは実行可
能な限り7.0に近づけるのがよい。この範囲において
は、DTPAキレートと水との反応はキレート−抗体反応に
対して余り有害とはならない。

上記の論議はDTPAに焦点を合わせて来たが、他の配位
子を用いて抱合体をつくることも技術の熟練のうちにあ
る。例えば、73Proc.Natl.Acad.Sci.USA3803（1976年11
月）参照。

抗体の最高の生物学的活性を保持するには、どのキレ
ート−抗体の調製に対してもpH調節に強酸または強塩基
の使用を避けるべきである。強酸または強塩基の使用は
溶液における局所変性を起こしうる。pHは適当な緩衝剤
を含めることによりモノクローン抗体の水溶液で調節で
きる。例えば、NaHCO₃を約0.1Mの濃度で使用できる。他
の緩衝剤、例えばMES（２−（Ｎ−モルホリノ）エタン
スルホン酸）がこの分野で公知であり、これも使用でき
る。適当な緩衝剤の選択は技術の熟練のうちにある。

キレート溶液を抗体水溶液へ加えるとき、両者とも約
０℃になければならない。溶液の温度は一般に反応の進
行の間約４℃以上に上昇させるべきでない。約０から約
４℃までの範囲内の温度の使用は抗体の分解を避けそし
てまたキレート分解も軽減する傾向がある。反応を完結
点にまで進めそして溶液を冷所に一晩放置する限り反応
時間に特に制限はない。

キレート対抗体のモル比は抱合体に企図された用途に
より広く変化しうる。キレート対抗体のモル比は約0.1
から約10までまたはそれ以上まで、そしてなるべくは約
0.25から約５まで広くわたりうる。多くの場合、キレー
ト対抗体のモル比は約0.5から約３までにわたるであろ
う。

一般に、反応にはキレートの過剰を用いるが、それは
キレートが水溶液中である程度分解するからである。抗
体１分子につき結合したキレートの数は、反応混合物に
おけるキレートの濃度および抗体の濃度の両方の関数で
あり、高い濃度は抗体当りより多くのキレートを与える
傾向がある。もし用いる抗体の量が比較的少量であり、
そして比較的希薄な溶液を用いるならば相当過剰なキレ
ートが要求されるかもしれない。例えば、約５から10mg
/mlまでのタンパク質溶液を有する抗体溶液と反応させ
るには、抗体１分子当り結合したキレート約1.5個を与
えるためには、約600:1のキレートのモル過剰が要求さ
れるかもしれない。しかし、100:1といつた低いモル過
剰を使用することもでき、それでも抗体１分子当りに結
合したキレート平均約0.5個を生じうる。抗体分子当り
余りに多くのキレート分子を加えることは、抗体の生物
学的活性と特異性を減少させることがある。

抗体へのキレートの添加が完結点まで進んだとき、実
質量の分解キレートが溶液中に存在しうる。これはどの
キレート−抗体抱合体に対しても起こりうる。分解した
キレートは、抗体の生物学的活性と特異性を保持しなが
ら除去しなければならない。例えば、透析またはクロマ
トグラフイーを使用できる。望むならば、キレートまた
はタンパク質中に存在するかもしれない残留鉄を除くた
めに、希アスコルビン酸およびEDTA溶液に対する第一の
透析を行なう。精製されたキレート抱合抗体は、透析溶
器中キレツクス（Chelex）100樹脂（バイオ−ラツド）1
mlと共に50mMのクエン酸塩および200mMの塩化ナトリウ
ムを含む約４℃、pH約６の水溶液１（三回取り換え
る）に対し48時間にわたる反応混合物の透析によつて製
造できる。MES10mMと塩化ナトリウム200mMを含む４℃、
pH6の溶液１中への最終透析によりタンパク質の精製
を完了する。透析手順の変動は公知であり、技術の熟練
のうちにある。

金属キレート化は水溶中で行なわれ、そしてこのとき
もまた強酸または強塩基の使用を避けることが望まし
い。どのキレート−抗体抱合体に対する金属キレート化
も、抗体の生物学的活性または特異性を有意に減少させ
ないpHで行なう。一般に、満足しうる範囲は約pH3.2か
ら約pH9までであるが、特別な抗体はもつと狭い範囲に
限定せねばならないかもしれない。約3.5以下のpHにお
いては、抗体への金属イオンの偶発的結合が多くの金属
に対して実質的に損なわれる。それ故に特に適当な範囲
はしばしば約pH3.2から約pH3.5までである。しかし、用
いた金属の溶液に特有の因子は3.5以上のpHを許すこと
がある。この範囲内の適当なpHの選択は技術の熟練のう
ちにある。

本発明においては、弱くキレート化する酸または塩基
を緩衝剤として用いるのが望ましい。クエン酸またはグ
リシンが有用な緩衝剤である。当然のことながら、なお
他の緩衝剤がこの分野で公知である。本発明は、強酸ま
たは強塩基を添加せずに、弱くキレート化する酸または
塩基緩衝剤で望むpHに調節したキレート抱合抗体の溶液
を企図するものである。この溶液へ金属塩を添加する。
もし金属塩が溶液状であるならば、その溶液もまたキレ
ート化緩衝剤で調節されたpHを有する。しかし金属溶液
のpHは、それをキレート抱合抗体溶液へ添加する前に、
強酸または強塩基で調節することができる。

容認しうる金属塩はどれも金属キレート抱合モノクロ
ーン抗体をつくるのに使用できる。典型的な塩にはハロ
ゲン化物（例えば、塩化物）、硝酸塩、過塩素酸塩など
が含まれる。金属塩は実行可能な限り高濃度で用いる。
この調製物を取扱う個人個人の放射線暴露は一般にキレ
ート結合部位当り１当量金属以下の限界を置くであろ
う。

反応時間は、もしpHが抗体に対して容認しうるpHの範
囲外に近いのでなければ特に制限がない。このようなpH
範囲においてまたはその近くにおいて、反応時間は一般
に約１時間未満、そしてなるべくは約30分以下とすべき
である。事実、時間の経済の観点から、一般にこれら期
間以内の反応時間が望まれる。また、痕跡量の鉄がキレ
ート化されるのを防止するため、水溶性の非キレート
化、生物学的に無害の還元剤、例えばアスコルビン酸、
の存在下でキレート化を行なうことが好ましい。反応
は、通常、金属抱合体がそれ以上動き易くなるなる点ま
で溶液pHを上げるように、クエン酸三ナトリウムを十分
量で加えることにより完結される。殆どのDTPA錯体は約
６のpHで特に安定である。反応がpH6以上であるとき、
他の弱塩基または弱酸を使用しうるが、ただしこれらが
抗体に悪影響を及ぼさない限りである。この選択は技術
の熟練のうちにある。

反応溶液は一般に生体内でのその使用に先立ち精製を
必要とし、そしてまた容器内使用に先立ち精製すること
も必要かもしれない。非結合金属および偶発的に結合し
た金属は除去すべきである。ここでの論議は偶発的に結
合した金属イオンを指す。しかし金属のあるものはキレ
ートによつて不安定に保持されるかもしれず、偶然に結
合した金属イオンと同じ仕方で作用する。

短い半減期をもつ放射性金属を用いる場合には、精製
工程をできる限り手早くすることが特に重要である。本
発明はクロマトグラフイーの使用により比較的早い精製
を企図しており、本発明のこの面は一般にキレート−抗
体抱合体に適用しうる。一種以上のイオン交換、遅滞ま
たはキレート化樹脂をサイジング・マトリツクス（例え
ば、ゲル）と共に用いることにより、本発明に係る金属
キレート抱合モノクローン抗体を迅速にかつ徹底的に精
製しうる。

種々なイオン交換樹脂を単独で用いることができ、あ
るいはイオン遅滞樹脂、陽イオン交換樹脂、陰イオン交
換樹脂またはキレート化イオン交換樹脂のどの組合わせ
も使用できる。適当な樹脂または樹脂類の選択、橋かけ
結合の程度、化学形およびメツシユサイズは技術の熟練
のうちにある。

本発明に用いられる陽イオン交換樹脂はしばしば強酸
性ポリスチレンゲル型樹脂（例えば、ダウエクス50WX
8）あるいは他の非ポリスチレン系強酸性樹脂、例えば
ゼオカブ（Zeocarb）215〔パームチツト社（Permutit C
o.）である。追加の適当な酸性樹脂には弱酸性ゲルポリ
スチレン樹脂、マクロ多孔性ポリスチレン樹脂、または
マクロ網状組織のカルボン酸陽イオン交換樹脂が含まれ
る。陰イオン交換樹脂は強塩基性ポリスチレンゲル型樹
脂（例えば、ダウエクスIX8）または他の塩基性の小さ
い樹脂、例えばピリジニウム重合体型およびフエノール
系ポリアミン型樹脂を含みうる。キレート化樹脂はキレ
ツクス100、あるいは対になつたインミノジアセテート
イオンを含むスチレンジビニルベンゼンである型の樹脂
（例えば、ダウエクスＡ−１）でよい。有用な遅滞樹脂
には対をなした陰イオンおよび陽イオン交換部位を含む
ものが包含される（例えば、バイオ−ラッドAG1−１−A
8）。これら樹脂は、スチレン−ジビニルベンゼン共重
合体格子中に第四級アンモニウム基を有する樹脂のよう
な強塩基性樹脂の内部にアルクリル酸を重合させること
により通常はつくられる。上記の論議は各樹脂の代表例
のみを含むが、なお他の樹脂もこの分野で知られてい
る。市販樹脂の特性および応用についての簡単な記述の
付いた要約が、就中、バイオ−ラツド・ラボラトリイ
ズ、1982年、価格表Ｈに含まれている。樹脂の選択およ
び組み合わせは直面している特定の分離問題により左右
され、ここの記述の点からみて技術の熟練のうちにあ
る。一つの有用な参考文献はジエイ・キム（J.Khym），
Analytical Ion-Exchange Procedures in Chemistry an
d Biology（1974）である。

サイジング・マトリツクスもこの分野でよく知られて
いる。これらにはポリアクリルアミド、アグラロース、
多糖類などが含まれる。一つの特に有用なサイジング・
マトリツクスは多糖類ゲル（例えば、セフアデツクスＧ
−50ゲル）である。ポリアクリルアミドゲルの例はバイ
オ−ゲルＰシリーズ（バイオ−ラツド・ラボラトリイ
ズ）である。サイジング・マトリツクスの選択は精製し
ようとするタンパク質に依存し、技術の熟練のうちにあ
る。

本発明の実施においては、種々な樹脂をカラム内に層
として設定し、精製しようとする溶液をカラム中に下向
きに、あるいはカラム中に上向きに供給することができ
る。下向きの供給は、放射性化合物を用いるとき特に適
当な実験室技術であるが、それは重力による流れが殆ど
あるいは全く補助装置あるいは器具使用を必要としない
からである。床の高さ、流速、などの選択は技術の熟練
のうちで容易である。

高度に荷重した金属がタンパク質表面に沿つたイオン
性部位のところで抗体により時折偶発的に結合されるよ
うである。他の場合においては、偶発的に結合した金属
が抗体タンパク質のひだで封じ込められるようである。
これら金属は溶液中に解放されうるが、平衡型過程で溶
液から再吸収されることもできる。本発明に係る精製に
おいて用いられる遅滞またはイオン交換樹脂は、この平
衡を移動させて抗体から金属を除去することを可能にす
るために用いる。例えば、抗体がイオン遅滞樹脂を通過
するにつれて、溶液中の金属イオンの通過は遅れるが、
タンパク質はそうでない。そこで偶発的に結合した、高
度に荷電した（＋３またはそれ以上）金属イオンは平衡
を再成立させるように溶液中に解放される。しかしこれ
らイオンが溶液中に解放されると、かわつてこれらは樹
脂により遅滞し抗体による継続した金属イオン解放を起
こさせる。

分離された高度に荷電したイオンをかたく拘束しそし
て分離過程を継続させるため、イオン遅滞樹脂の下にあ
るレベルのイオン交換樹脂を用いることができる。樹脂
が高度に荷電した遊離イオンのタンパク質溶液を消耗さ
せるにつれて再び平衡が遊離イオンと偶然の金属イオン
との間に再成立する。しかし、この過程全体を通じてキ
レート内部の金属イオンは抗体と共に留まる。

しかし、イオン遅滞樹脂またはイオン交換樹脂の単な
る使用は、実質的にすべての偶発的に拘留された金属を
効果的に除去するには不満足であることが決定された。
精製を完結するためにサイジング・マトリツクスを使用
する。マトリツクスに入る抗体溶液は、遊離の高度に荷
電した金属イオン含量が既にある程度減じられている。
サイジング・マトリツクスにおいては、それ以上の減耗
が起こる。溶液がマトリツクスを通つて動くにつれ、抗
体は遅滞しないがイオンは遅れる。サイジング・マトリ
ツクスから取り出される生成溶液は偶発的に拘留された
金属を実質的に含まない。このようなゆるく拘束された
金属は抱合体の全金属含量の約６パーセント以下に減ら
すことができ、その結果抱合体によつて運ばれる金属の
少なくとも約94％はキレートにより安定に固定される。
全金属のうち少なくとも約97％がキレートにより固定さ
れることが望ましい。金属の98％またはそれ以上がキレ
ートにより固定された金属レベルを得ることが可能であ
る。透析を用いて安定に固定された金属含量を決定する
ことができる。

精製の特に適当な方法は、陽イオン交換樹脂（バイオ
−ラツドAG 50WX 8）およびゲル（フアルマシア・セフ
アデツクスＧ−50）上のイオン遅滞樹脂（バイオ−ラツ
ドAG 11−A8）である。本発明に対するテクニシウムキ
レート抱合モノクローン抗体の精製において、特に適当
なカラムは、イオン遅滞樹脂（バイオ−ラツドAG11−A
8）その下に陽イオン交換樹脂（バイオ−ラツド50WX
8）、その下に陰イオン交換樹脂（バイオ−ラツドAG IX
8）およびサイジング・マトリツクスゲル（フアルマシ
ア・セフアデツクスＧ−50）を含む。

本発明方法において、抗体は非凝集形に留まつてい
る。クランピングによるか橋かけ結合によるかの抗体凝
集は抗体の特異性の減損を起こし、そしてこれが望まし
くないことは云うまでもない。凝集は担体中過度の高濃
度の抗体によつて起こるか、あるいは例えばカルボジイ
ミドといつたタンパク質橋かけ結合を起こす化学薬品と
の接触によつて起こりうる。標準沈降試験、サイズ・マ
トリクシングなどを用いて抗体が凝集したかどうかを決
定できる。事実、ここで論議した抗体特異性試験は特異
性の減損としての凝集を反映している。

本発明に係る抱合体生成物の活性と特異性は抱合体を
つくるのに用いた抗体の活性および特異性の少なくとも
約80％、そしてなるべくは少なくとも約90％のレベルに
保たれる。特に適当な溶液は少なくとも約95％の抗体活
性および特異性によつて特徴づけられ、最初の抗体の活
性と特異性とを実質的に未変化に留めている生成物が製
造されている。抗体の活性および特異性は、抗体を容器
内でエピトープに結合することによりこの分野で習慣的
に測定されている。最終抗体生成物の活性および特異性
の度合は、最終抱合生成物について最初の試験を繰返す
ことにより簡単に容易に決定できる。

本発明は放射性金属キレート抱合モノクローン抗体を
身体に導入し、目標領域に集中させるという生体内治療
法を企図している。安定なDTPA錯体を形成し、かつ細胞
毒となるアルフアー粒子を放出する種々な放射性金属同
位体がある。抱合体が目標となる細胞の近くにあるかま
たはこれと接触しそして結合するとき治療効果が生ず
る。細胞の死亡は、細胞に接近して位置した放射性金属
の放射という出来事の直接または間接の結果であると考
えられる。

本発明のこの点の有利さは幾つかある。第一に、抱合
モノクローン抗体の高い特異性は全放射線投与量を最小
にする。目標細胞に対して十分なだけの放射線を用いれ
ば済む。その上、もし抱合抗体が分断されると、放射性
キレートは一般に身体から急速に除かれる。同位体は短
寿命でよく、異性体がDTPAキレートに留まる親和力定数
は非常に高く、安定に結合した金属を生ずる。最後に、
用いた放射性金属の量は最小とされるので、放射性金属
キレート抱合抗体を製造し投与する人に対する放射線の
危険が著しく減少する。

本発明により用いられるDTPA放射性金属キレート抱合
モノクローン抗体の特性の故に、治療中の組織損傷また
は全身用量は、現在使用される放射線治療法、例えば同
位体植え込み、外部放射線療法、およびヨウ素−131で
標識したポリクローンまたは同原の抗体を用いる免疫放
射線療法からのそれと比較して著しく減少している。更
に、目標にしている放射線生物学的な生物学的および物
理的な半減期が今は調節できるので、全身放射線効果を
最小にする。放射線は細胞の型（例えば、新生細胞）へ
特異的に向けられるので、治療用量が特異的に悪性細胞
（局所化しているか転移したかの何れでも）へ供給され
る。放射性金属キレート抱合モノクローン抗体の治療用
放射線の有効量を転移細胞へ特異的に供給する能力もま
た癌療法に対して独特かつ著しく有用である。

本発明は細胞の不調を処置するためにアルフアー線放
出放射性金属を含む金属キレート抱合モノクローン抗体
を使用する。大抵の応用においては、放射性金属が約４
日未満の半減期をもち、一旦アルフアー粒子が放出され
ると迅速に崩壊して安定な同位体になることが望まし
い。本発明に用いられる特に適当な同位体はビスマス−
211、ビスマス−212、ビスマス−213およびビスマス−2
14である。半減期60.6分のビスマス−212が特に適当で
ある。

用いるモノクローン抗体は殺そうとする罹病細胞に対
して特異的である。細胞の死は放射性金属の崩壊により
起こり、二つの仕方のうち一つで起こりうる。第一に、
もしアルフアー粒子が病細胞の方向に放出されるなら
ば、細胞核における一撃が細胞毒となりうる。第二にア
ルフアー粒子放出後に放射性金属が崩壊する同位体はア
ルフアー粒子のそれと反対の軌道上でキレートから追い
出される。それ故に拘束された細胞はたとえアルフアー
粒子が細胞から離れた軌道上に放出されたとしても依然
一撃されうる。崩壊した同位体による細胞膜の一撃は回
復不能の細胞障害を起こさせ細胞の死に導くことができ
る。アルフアー粒子の比較的高い有効性はより少ない放
射能物質を用いうることを意味する。アルフアー粒子の
短い範囲（数細胞直径）とモノクローン抗体の選択性は
健康な組織の細胞レベルでの破壊を最小にする。

ビスマス−212は二つの異なる経路の一つによつて崩
壊する。ビスマス−212の凡そ64％はベーター放出を経
て半減期0.3マイクロ秒をもつポロニウム−212に崩壊す
る。ポロニウム−212は約90ミクロンの範囲でアルフア
ー粒子を放出後安定な鉛−208に崩壊する。ビスマス−2
12の他の36％は約35から50ミクロンの範囲でアルフアー
粒子を放出することによりタリウム−208に崩壊する。
次に、半減期３分のタリウム−208はベーター放出を経
て安定な鉛−208に崩壊する。

Bi−212の発生器はグロイ（Gleu）等、Z.Anorg.Alle
g.Chem. 290:270（1957）により、またツツチーニ（Zu
cchini）等，Int.J.Nucl.Med.& Biol.（1982年６月）
（その原稿の抄録が1981年８月のニユーヨークにおける
ACS学会で配布された）により文献に記述されている。
有用な発生器は、カラム内に封じられた粗フリツトガラ
ス円板上、石英カラム中に含まれたチタン酸ナトリウム
の３×5mm床上に吸収させた４価状態のTh−228からな
る。チタン酸塩はTh−228およびそのRa−224ドーター両
方を固く保持する。チタン酸塩に水を通過させると、Ra
−224同位体のRn−220ドーターは水の中に溶け、フリツ
ト円板を通過し、水で満した10ccガラス貯留器に集めら
れる。Rn−220水溶液はこの貯留器から、バイオ−ラツ
ドAG−50 WX 8陽イオン交換樹脂のような強酸性イオン
交換樹脂約1mlを含む直径10mmのカラムに流れる。Rn−2
20は貯留器内で実質的に５分以内にPb−212に崩壊し、
そしてこのものは樹脂中を通過するとき吸収される。樹
脂中約1.5ml/分の流速において、生じたPb−212の約85
％がカラム内に集められ、ここでこのものはそのBi−21
2ドーターに崩壊する。

望む量のBi−212が樹脂上に生成したとき、当業者の
熟知している手順に従いこれを酸で溶離する。Pb−212
とBi−212両方に対する有用な溶離法は樹脂に2N HCl5ml
を通過させるものである。別法として、もしBi−212だ
けを望なら、0.5M HCl 1.5mlを樹脂に通過させるとよ
い。

ベーター粒子あるいはオージエ電子を放出する金属は
治療に使用できるが、アルフアー線放出放射性金属の方
が幾つかの理由のため特に適している。第一に、アルフ
アーヌクレオチド放射は特徴的に組織内で短い範囲とベ
ーターまたはオージエ放射と比較して非常に高い直線的
エネルギー移動を有する。アルフアー放射は核に対する
唯一撃で細胞を殺すことができ、10打またはそれ以下で
実質的にどの細胞も殺すであろう。更にまた、その崩壊
も細胞の死を起こさせうる同位体（例えば、Bi−212の
場合Tl−208またはPb−208）を放出する。アルフアー粒
子の範囲は通常は組織中で約150ミクロン未満である。
これに対し、ベーターおよびオージエ粒子は細胞の死を
起こす前に核に数100打を必要とし、また組織内で数ミ
リメートルの数10分の１から数センチメートルまでのオ
ーダーの範囲をもつ。ベーター粒子を用いる場合、より
高用量が要求され、そして実質的に一層放射性標識した
抗体の崩壊が細胞死の達成に必要であろう。従つて、特
異的に結合した抗体は異化されてベーター放出性放射性
金属を血液中に解放する。アルフアー放出放射性金属は
比較的急速に殺すのでその結果、より少ない抗体が異化
されることになる。

本発明に係る金属キレート抱合抗体は適当な製薬用担
体中で生体内に投与できる。前述した通り、通常の生理
食塩水を適当に使用できる。しばしば担体は抗体を安定
化するために少量の担体タンパク質、例えばヒト血清ア
ルブミンを含むであろう。溶液中の金属キレート抱合抗
体の濃度は選択の問題であろう。0.5mg/mlの濃度が容易
に得られるが、濃度はある与えられた応用の特殊性によ
つて相当に変ることがありうる。担体中の生物学的に活
性な物質の適当な濃度はこの分野で日常の仕事として決
定される。

応用に対して利用すべき放射線または金属含量の有効
用量もその応用の個々の事情に左右されるであろう。例
えば、腫瘍の治療において、その用量は就中腫瘍の重
荷、入手可能さなどに依存する。幾分か同様に考えて、
診断の目的に対する金属キレート抱合抗体の使用は、就
中、用いた検知装置、検査しようとする部位の位置など
によつて決まるであろう。患者がその部位に位置したも
のに加えて循環する抗原をもつ場合には、処置に先立ち
循環抗原を除去できる。このような抗原除去は、例えば
未標識抗体の使用により、あるいは患者の血清を処理し
て抗原を除去する血漿泳動法により達成できる。

下記の例は本発明の実施をよりよく説明するために含
めてある。これら例は説明の目的のためだけに含めたの
であつて、如何なる仕方においても、本発明の範囲を制
限しようとする意図はない。

例１ 100ミリグラムのDTPAをフラスコに秤量し、これに水1
mlを加える。この溶液を0.125gの再蒸留したトリエチル
アミンと反応させる。反応溶液を加温して反応を完結さ
せ、固体の生成物を凍結乾燥により集める。

凍結乾燥した固体を0.5mlの純粋な乾燥アセトニトリ
ルに溶かし、35ulのイソブチルクロロホルメートを約−
20℃の温度で加え、約−70℃まで下げる。約45分後、溶
液をエツペンドルフびん中で遠心する。上澄液を集め
る。これはDTPAの望む混合カルボキシ炭酸無水物を約0.
5Mの濃度で含む。

用いたモノクローン抗体は103A5と呼ばれ、P3X63Ag8
マウス骨髄腫細胞を、エム・ストランド（M.Strand）お
よびジエイ．テイー．オーガスト（J.T.August）,251J.
Biol.Chem.559（1976）により記述されているようにし
て得た70,000ダルトン（gp70）の精製レトロウイルス糖
タンパク質で免疫化したC56B1/6マウスの単離脾臓細胞
と融合させることにより得た。融合はエム．ストラン
ド,77Proc.Natl.Acad.Sci.USA3234（1980）により記述
されているように行なう。

pH約7.2の0.1M NaHCO₃中モノクローン抗体103A5（2m
g）と塩化ナトリウム150mMを含む114ulの溶液を調製
し、ナンク（Nunc）びん中にピペツトで採る。次にpH7.
0の0.1M NaHCO₃溶液33ulをびんに加える。最後に、キレ
ートと抗体の溶液を約０℃に冷却後、DTPAの混合カルボ
キシ炭酸無水物26.4ul（アセトニトリル中0.5M）を加え
る。反応を一晩進行させる。

生成物を先ず30mMアスコルビン酸、5mM EDTA、200mMN
aClおよび20mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）の１に対
し４℃で透析する。得られた溶液を50mMクエン酸塩、20
0mM塩化ナトリウム200mM（pH6.0）および1mlのキレツク
ス100樹脂（Bio−Rad）の１に対して48時間にわたり
三回取り換えて４℃で透析する。最後に、生じた溶液を
MES10mMおよび塩化ナトリウム200mMの濃度を有するpH6.
0の溶液１に対して８時間透析する。約1.7mgのキレー
ト抱合モノクローン抗体が採取された。Ｃ−14標識した
DTPAを用いる同様な実験をシンチレーシヨン計数により
分析し、抗体１分子当り約1.5キレートを含むことが示
された。

インジウム−111塩化物溶液〔ニユー・イングランド
・ヌクリアー・コーポ（New England Nuclear Cor
p.）〕40マイクロリツトルを、pH5.0の0.4Mクエン酸11.
4ulの添加によりpH3.0に調節する。全量21.6マイクロリ
ツトル中にキレート抱合モノクローン抗体250マイクロ
グラムを含む別個の溶液をつくる。この溶液はpH6.0に
おいて塩化ナトリウム200mMとMES10mMの濃度を有する。
この溶液を3.0のpHの0.25Mクエン酸6ulの添加によりpH
4.6に調節する。

金属キレート抱合モノクローン抗体は塩化インジウム
とキレート抱合抗体溶液とを合わせ、それを室温で約30
分間反応させることによりつくられる。反応はクエン酸
三ナトリウムの飽和溶液25ulを加えてpHを約６に調節す
ることにより停止させる。

キレート抱合抗体は、セフアデツクスＧ−50ゲル（フ
アルマシア）7mlの上に陽イオン交換樹脂（AG−50−WX
8、H⁺形、200〜400メツシユ、バイオ−ラツドから入手
可能）1.0ml、その上にイオン遅滞樹脂（AG−11−A8、
バイオ−ラツドから入手可能）1.0mlを含む長さ9cmのカ
ラム上でのクロマトグラフイーにより精製される。塩化
ナトリウム200mMおよびMES10mMの濃度をもつpH6.0の溶
液を溶離剤として使用し、またカラムを予備平衡させる
のに用いた。

溶離液を0.5mlフラクシヨンずつ集めた。タンパク質
の大部分を含む二つのフラクシヨンは157.1マイクロキ
ユリーインジウム−111で標識されたモノクローン抗体1
50ugを含むことが示された。MES20mMと塩化ナトリウム2
00mMのpH6.0における水溶液１に対して４℃での透析
は６％未満のインジウム損失を示した。この抗体はその
生物学的活性と特異性の実質的に100％を保持すること
が容器内試験により示された。白血病マウスにおける生
体内像形成は脾臓の腫瘍部位を目立たせた。正常マウス
に投与したときは脾臓による吸収がなかつた。

例２ P3 653マウス骨髄腫細胞をヒト脾臓から単離され精製
された腫瘍関連フエリチンで免疫化したC56B1/6マウス
の単離脾臓細胞と融合することによりハイブリドーマを
得た。263D5と称する抗フエリチン抗体を生ずるハイブ
リドーマが単離された。その抗体はヒトフエリチンに対
して特異的であり、他の哺乳動物種のフエリチンとは反
応しなかつた。

例２の手順を繰り返してインジウム−111含有DTPA抱
合モノクローン抗体を得た。金属キレート抱合モノクロ
ーン抗体を含む通常の生理食塩溶液を正常マウスおよび
白血病マウスに注射する。白血病マウスと正常マウスの
両方において、放射能像形成は放射能標識金属の集中が
ないことを示した。これら試験はキレートがキレート−
抗体抱合に関してまた放射性金属の保持に関して生体内
で安定であることを実証した。脾臓も肝臓も像で目立た
なかつた。

例３下記の例は、本発明により達成された放射性金属（ア
ルフアー粒子放出同位体を含めて）の選択的局所化を証
明するため、ガンマー粒子放出同位体を用いる。

インジウム−111キレート抱合モノクローン抗体はヒ
ト乳腫瘍に対して特異的な抗体から調整される。この抗
体を生ずるハイブリドーマはマウス骨髄腫細胞とマウス
脾臓細胞との融合からつくられる。ハイブリドーマおよ
び抗体は78Proc.Natl.Acad.Sci.3199（1981）に記述さ
れている。

用いた手順は次の点を除き例１および２の手順と実質
的に同じである。第一に、アスコルビン酸塩−EDTAに対
してキレート抱合モノクローン抗体を透析する工程を省
いた。第二に、キレート抱合モノクローン抗体の食塩水
溶液へ添加するのに先立ちインジウム−111溶液へpH4の
0.1Mアスコルビン酸塩10マイクロリツトルを加えた。

標識づけの効果は例１および２の方法よりも３倍の増
加を示した。最終生成物は約2.1マイクロキユリー／マ
イクログラムで標識された。

精製カラムから集められたインジウム−111キレート
化抱合モノクローン抗体の10マイクログラムをリン酸塩
で緩衝した食塩水溶液で100マイクロリツトルに希釈す
る。希釈したインジウム−111抱合抗体を、ヒト乳腫瘍
を発育させた胸腺欠如ヌードマウスの尾の血管に注入す
る。ヒト乳腫瘍細胞は抗体に対する抗原を示した。注射
してから72時間後、きれいな輪郭のはつきりしたガンマ
ーカメラ像が腫瘍組織におけるインジウム−111の高い
局所化を証明した。肝臓または脾臓におけるインジウム
−111の同様な局所化は観察されなかつた。

例４下記の表は、放射性金属−DTPAキレートが、遊離放射
性金属と対照するものとして、肝臓および脾臓に局所化
されず、腎臓および胃を経て迅速に排泄されることを実
証している。正常マウスおよび白血病マウスの器官中へ
の放射性金属の取り込みは下記手順により立証された。
６週齢の正常マウスおよびラウシエル（Rauscher）白血
病ウイルスの注射により前以て８日間白血病にしたマウ
スに、遊離Bi−207、DTPAキレート化Bi−207およびDTPA
キレート化Sc−46の５マイクログラム（５マイクロキユ
リー／マイクログラム）を腹腔内注射した。18時間およ
び42時間の後、マウスを殺してその器官を秤量し、器官
に付随した放射能の量を測定した。注射における差異、
体重の差、および器官切除の時間の差を標準化するため
に、組織１グラム当りの放射能の量を血液１グラム当り
の放射能量で割り、結果をこの比として表わした。これ
らの結果を表１、２および３に示した。

上記表中の結果はDTPAキレート化ビスマスおよびスカ
ンジウムが遊離ビスマスと対照的にマウスの肝臓または
脾臓に集中しないことを示す。腎臓におけるキレート化
金属の高い濃縮はそれが尿を経て排泄されつつあること
を示す。白血病マウスと正常マウスとの間の腎臓濃度に
おける変動は、ストレスにより白血病マウスが頻繁に排
泄することに帰せられる。

例５哺乳動物細胞に対するビスマスアルフアー放射の効果
を決定するための試験を行なつた。10％の熱不活性化牛
胎児血清を含むダルバコ（Dulbacco's）改良イーグル培
地中容器内でＦ−46白血球細胞を発育させ各くぼみに１
×10⁵の細胞集団を得る。この細胞集団を、発育培地中
に系列希釈（表４に記載の通り）を加えることによりビ
スマス−212に暴露する。次に細胞を96時間培養し、生
存細胞数を測定した。結果を下記表４に示す。

表４の上記データから、標準の計算法を用いると、D
₀（生存率37％）は38.5ラツドとなる。このことはビス
マス−212が高度に細胞毒な密にイオン化する放射線を
放出することを示す。比較によれば、同じ結果を達成す
るのにコバルト−60源からの粗にイオン化する放射線90
0ラツド必要とする。放射線の論議に対してはnm/マード
・パンフレツトの第１号（改訂）および10号を見よ。

当業者にとつて修正が明白であるので、本発明は特許
請求の範囲によつてのみ制限されるものとする。

フロントページの続き (72)発明者メツト・ストランドアメリカ合衆国メリ−ランド州バルテイモア−・ハ−パ−・ハウス807

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】金属キレート抱合モノクローン抗体の製造
法において、（イ）キレート抱合モノクローン抗体を用意し、（ロ）緩衝剤中の前記キレート抱合モノクローン抗体の
水溶液へ金属塩を添加することにより金属キレート抱合
抗体を形成させ、（ハ）前記金属キレート抱合モノクローン抗体を含む水
溶液をクロマトグラフィーカラムに通過させ、前記カラ
ムはイオン遅滞樹脂、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換
樹脂、およびキレートイオン交換樹脂から成る群から選
ばれる一つ以上の層を有し、最終層はサイジングマト
リックスからなり、そして、（ニ）前記カラムから、前記キレート抱合モノクローン
抗体のキレート部分により錯体形成された前記溶液中に
含まれる前記金属の少なくとも約80％を有する金属キレ
ート抱合抗体の溶液を回収することからなる、上記方
法。
【請求項２】キレート抱合モノクローン抗体を、ジエチ
レントリアミン五酢酸のカルボキシ炭酸無水物とモノク
ローン抗体の水溶液とを接触させることによりつくる、
第１項記載の方法。
【請求項３】前記金属が放射性金属である第１項又は第
２項記載の方法。
【請求項４】前記金属はアルファー線放出放射性金属で
ある第１項記載の方法。
【請求項５】ジエチレントリアミン五酢酸のカルボキシ
炭酸無水物がジエチレントリアミン五酢酸アミン塩とハ
ロギ酸エステルとの有機溶媒中約−20℃未満の温度にお
ける反応生成物である、第２項記載の方法。
【請求項６】ハロギ酸のエステルがイソブチルクロロホ
ルメートである、第５項記載の方法。
【請求項７】アルファー線放出放射性金属がBi−211、B
i−212およびBi−213からなる群から選ばれる、第４項
記載の方法。
【請求項８】アルファー線放出放射性金属がBi−212で
ある、第７項記載の方法。