JPS5946227A - 金属キレ−ト抱合モノクロ−ン抗体の製造法および使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は−＋Ｖに金属キレート抱合モノクローン抗体に
関ｒる。本発明はまた放射性金属キレートｊ包３七ツク
ローン抗体を用いる細胞不調、特に癌の治療法に関する
。

尚のような細胞不調の処１ｄに対して効果的な治療法が
徹底的１ｉＪｆ究の目的となっている３３通常の療法は
ン１１腰放射線および化学療法を１史用する。これら方
法の各々は健康な細胞と癌性の細胞との間にそれ程選択
性がないという点で重大な欠点を蒙むる。有効となるた
めには、これら方法は大計の健康な組織を殺Ｊ−か除去
する。更に−また、化学療法は免疫系に悪影響を与える
の。、その結果真繭、細浦−またはウィルスの感染がら
しばしば死亡あるいは重度の病気が起こる。

モノクローン抗体の開発は治療剤または診断用試薬を特
別な目標細胞へ選択的に伝送する可能性を開いた。モノ
クローン抗体は十分に明らかにされた化学構造を有する
免疫グロブリンである。モノクローン抗体の顕著な特徴
は機能の再現性と高い特異性である。

モノクローン抗体へ直接固定した放射性ヨウ素が診断お
よび治療に対して使用されている。ヨウ素−１６１が大
きい腫瘍に対しては若干の治療五の成功を収めたが、放
射性ヨウ素標識抗体は小さい腫瘍の焦点′または転移に
処置に無効であった。

その上、特異的に結合した抗１本は目標細胞により比較
的迅速に異化される。それ故に、異化は排泄器官、即ち
腎臓、膀胱および胃に代謝されたヨウ素を取り込むこと
に通じる。更に−また、モノクローン抗体を経由して毒
素をｊ厘瘍測胞に送る試みは成功した治療にはならずに
１１りった。

ジエチレントリアミン五酢［（］’）’Ｉ’ＰＡ）はタ
ンパク質に付いたとき安定な金属錯体を形成しうること
が文献で示唆された。フレイカレフ（Ｋｒｅｊ−ｃａｒ
ｅｋ　）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒａｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

７７：５ｄ１（１９７７）。フレイカレフの方法に従い
調製された放射性金属−Ｄ’ｒＰＡ抱合ポリクローン抗
体を用いた生体内目標部位の像形成か−・つにより報告
された。ｆ″ルクロマトグラフイーよび透析によって遊
離金属およびギレート化金属を金属キレ−１・抱合ポリ
クローン抗体から分離したにも拘らず、この６己事に含
−まれた〃ンマー像は肝１熾に局所化したｉｕい割合の
放射性金属を示している。

本発明の一つの目的は、改良治療法を提供することにあ
る。

本発明のもう一つの目的は、モノクローン抗体を用いる
細胞不調の効果的治療法を提供することにある。

本発明の更に一つの目的は、健康な細胞の破壊を殆どあ
るいは全く起こさない放射線の致死量を病細胞へ選択的
にねらいをつける方法を提供することにある。

本発明の一つの目的は、小さい帷瘍焦点および転移を選
択的に治療する方法を提供することにちる。

本発明のもう一つの目的は、身体の雌！東な器官中への
目立った放射性遠属の取り込みをｄけで選択的に的に向
けられた放射１生抽属を生１本内に２．導入する方法を
提供することにある。

本発明は、そのいくつかの面の一つにおいて、目標細胞
を放射性金属ギレート抱８・モノクローン抗体と接触さ
せることからなり、そして前記放射性金属がアルファー
粒子放出性金祠核櫨である細胞不調の治療法を提供４−
６ものである。もう一つの具体例において、本発明は体
液中に金属キシ／−ト例自・モノクローン抗１本ｗ　ｚ
４人ｊ−ることから在る方法を企図しており、この方法
において前記の梱汗キレートはジエチレントリアミン五
酢酸の紡導雌であり、そして前記抱ａ本は前記金属の偶
然に結合したイオンを実質的にｒ４−、（−グ、かつ抗
体の実質、１′Ｊにｒべての活性と選択性を保持してい
る。このよう７＋：技術は診断Ｒよび治療の両方の目的
に適なってい６゜本尾明はまたアルファー放出性放射性
金属の遠灰ギノート抱合モノクローン抗体の製造法を提
供するものＱあり、本１去においては、イオン遅相樹脂
、原イオン文侯Ｉ＃脂、陽イオン交換樹脂世よびキレー
ト化イオン交換樹脂の群から選ばれる一つ１メにの層と
サイノング・マ）　ＩＪソックスらな乙１稜終、１４を
１了す５りロマトグラフイーカラムに金個キレート抱＆
抗木を通過させる。

本発明は治療技術（′こ７〈１シ、侍に生体内Ｃ金属キ
レート抱合ポリクローン抗体を１史用ｒる。

イ（発１男は士だその生物学的盾陛とＦ！ｆ異性乞保持
しそして偶然に１古ルした金属を友質的にざまない金属
ギレート化地訃抗体を提供する。１馬然に結片した金属
は安定Ｑなく、そし−Ｃ遊離金属が血液に入る結果とな
る。＋ｎｔ液中で解放ざＩしる金属はトランスフェリン
によって、あるいは血液中Ｖこ存在する曲の全４拘束タ
ンパク質（汐０えば、フェリチン）により固定されつる
。このような拘束された金属は相当な長時間循環器系に
保持され、細網内皮組織糸（ａｇＳ）により追い出され
る。このような排除は金属が肝臓および肺臓に磯縮され
る結果を招く。身体内の放射性金白の無秩序な長期にわ
たる循環あるいは肝臓および牌臓中の放射性金属のは縮
は極めて望−ましくない。４１″元明の実施はこれら重
大な問題を緩７Ｉ’１１することができる。

モノクローン抗体は、免疫グログリンの不均一な混合物
である。Ｉ？リクローン抗体ど著しく異なり、十分に明
確にされた化学構造を有する免役グログリンＱある。モ
ノクローン抗体の顕著な特徴は機能および特異性の再現
性であり、そしてこのような抗体は、肺膓廁胞を含めて
イ重々様々な目標抗原に対して発現させることができ、
また発現して来た。モノクローン抗体をイυる方法はこ
の分野で人混に補線されて来たしそしてよく知られてい
る。

エッチ・ケンネット、ティー・ソエイ・マツクキーン＆
ケイ・ビー・ベクトール（Ｒ，ｆＬ　Ｋｅｎｎｅｔｔ。

Ｔ、Ｊ、　　ＭｃＫｅａｎ　　＆　　Ｋ、Ｂ、　　　Ｂ
ｅｃｈｌ；ｏｌ　　）Ａ扁、　　１９８０　　　〕　　
ごある。またコノロウスギイー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　
）停米国特許第４，１９６．２６５号明細書を見よ。本
発明の実施に対する七ツクローン抗体の選択は金属キレ
ート地片モノクローン抗体を用いる最終の用途に左右さ
れるＱあろう。このような選択は技術の熟練のうちにあ
る。

抗体は一般にイオン性比訃？吻を含む水溶液中に１呆た
れる。通常の生理学的食塩浴液が非常にしばしば使用さ
れ、きして広く入手できる。他のイオン性溶液、例えば
リン酸ナトリウムまたはカリウム、炭酸ナトリウムなど
を含むものもこの分野Ｑ公知Ｑあり、そして使用するこ
ともごきる。

イ１ｌｌｋ様々な有機キレート剤−または配置＋に子２
モノクローン抗体へ抱片でざる。モノクローン抗体へ抱
合させることのできる有俵配泣子は、天然または合成ア
ミン、ポルフィリン、アミノカル・ｊζン酸、イミノカ
ル・Ｊぐン酸、エーテル類、チオール類、フェノール類
、クリコールおよびアルコール類マｆ、ニーはポリアミ
ン、ポリアミノカル＋１ぐン酸、ポリイミノカルノ１ζ
ン酸、アミノン１ゼリカル、１？ン酸、イミノポリカル
ボン酸、ニトリロカル・１ζン酸、ゾニトリロポリカル
ｊ？ン酸、ポリニトリロ、ｊｅクリルボン酸、エチレン
ノアミン四酢酸塩、ソエチレントリアミン五“または四
番酸塩、ポリエーテル、ポリチオール、クリプタンド、
ポリエーテルフェルレート。

ポリエーテルチオール、チオグリコールよたはアルコー
ルのエーテル項、ポリアミンフェノール、高度に安定な
金属キレート”またはり１７７’　７’　−）を雲する
ちらゆる非環式、大環状、環状、大二環式塘たは多環式
、または他の同様な配位子の中から選ぶことができる。

明らかに配位子の選択はキレート１ヒｒべき金属Ｃ・て
よって左右され、この分野の熱線の　う　ちンｃＪン　
る。

木兄・フｊのある具体例Ｑ用いた配ｆ−＋Ｚ子はモノク
ローン抗体への結檜に適した非金＋４が、結合した有機
官目ヒ基を有ｒる。官能基はカルボンＯＮ、基、ジアゾ
化可能なアミン基、スクシンイミドエステル、無水物、
混合無水物、ベンズイミデート、ナイトレン、イソチオ
シアネート、アシド９、スルホンアミド、グロモアセト
γミド、ヨードアセｔ・アミド、カルボゾイミ１、スル
ホニルクロリド、ヒドラノド、チオグリコール、または
二分子抱Ｂ剤またはカソノリング剤としてこの分野で知
りれる反応性官能基の中から選ぶことができる。

不発１リノはなるべくはソエチレントリアミン五酢酸（
Ｄ′１”ＰＡ）の誘等本を用いるのがよい。ＤＴＰＡ　
配りγ子は金属イオンを固く束縛すること１．ＮよびＤ
’［’ＰＡ　訪導体（以麦はキレートと呼ぶ）は、金属
ギレート結訃に関して、またキレート−抗本泡会体に関
して高度に安定なキレートＩＮ合モノクローン抗本を生
成することが発見された。これらの性質は一痔に生体内
応用に対して非常に重要である。

飼えば、もしキレートが血液中に導入説金属イオン／ａ
：屏放するならば、これらイオンはトランスフェリンな
どにより固定されそして一般に身体の循環系に分布する
順向がある′Ｑちろう。更にまたイオンは究極、」りに
は肝臓および牌１以といった器官に果よりそして留まる
項内がらる′Ｑあろう。これらの効果は、、ｌ２ｗ４の
毒はおよびその放射能により重水な結果を有しうる。更
にまた、もしキレートが抗体と篩度に安定な抱訃本を形
成しないならば、標的部位に運ばれる金属の鼠が有意に
減少しそしてそれに相応した効力減少がある。

本発明に係る金属ギレート抱片モノクローン抗体の製造
においては、外部源からの金属混入を避げることが重要
Ｑある。実験器具は外因的な金属を洗浄し去ったノンス
ナックまたはガラスにｒべきである。すべてのｈｘ液は
適当な樹脂を用いた、例えばカラムクロマドグシフイー
により金Ｗ４をｒつかり無い状態にｒべき−Ｑ　Ｑ＞る
。

説明を容易にｒるため、ＤＴＰ、Ａキレートに関して本
発明を記述することにする。詩に適当なキレートはＤＴ
ＰＡのアミン塩からつくられる。アミンは広く用いらり
、そして１〕″ｆ’ＰＡを完全に脱ノロトンさせる第一
、第二および第三アミンを包きする。

適当なアミンの選択は技術の熟練のうちにあり、どのア
ミン（アンモニアを含めて）の効力も容易に決定Ｑぎる
。特に適当なアミンはトリエチルアミンＱある。少なく
とも約５当琺・ノ）アミンをＤＴＰＡ　の水浴液に加え
、加温して反応を完結させる。この反応はＦ記の反応式
（式中、トリエチルアミンがアミンであるンに従ってペ
ンタキス（アミ　ン　）　　ツクＴ））Ａ　　Ｊｌ　う
−住する　：ｂ　　（ＣＨ３０Ｈ２）　３ｉＪ　　トＤ
’ｌｌ’ＰＡ−（（ＣＨ２Ｏ）（２）　３Ｎ　　）５　
　ＤＴＰＡ浴漱を蒸発させるか”または凍結乾燥させて
水と過剰のアミ／を１窪去することにより固体のＤＴＰ
Ａ　−アミン塩を回収Ｑきる。

実際のキレートはＤＴＰＡ酵導体Ｑある１、官１ピ基カ
Ｄ′ＰＰＡに力Ｉえられ、そしてＤＴＰＡはそれを通し
てモノクローン抗体上のアミ７基−＼結合される。

ハロギ酸のエステルをＤＴＰＡ　−アミン塩と反応させ
て本発明により使用されるキレートをつくる。

ハｃＪゼ酸のエステルとは一般式　ＸＣ（０）−０−Ｒ
（式中、Ｘはハロ７９ン、なるべくは塩化物であり、Ｒ
は適当な官能基のどれかであるが、なるべくは約６炭素
原子以ドをよむものがよい）のエステルを意味する。Ｒ
およびＸの選択は、キレートをモノクローン抗体と反応
させたときのキレートの安定性と立体障害を考慮に入れ
て、技術の熟練のうちｅＣ，、！りる。特にＪ＆ｌ当な
エステルはイソジチルクロロホルメートである。

調製の一例として、凡そ尋モル量のハロイ酸エステルと
Ｉ）１’ＰＡ−アミン塩とを極性有機溶媒、例えば純粋
な乾燥アセトニトリルに溶かす。ハロギ酸エステルの過
剰は、−’すれが修飾されたＤ’ｌ°ＰＡ配位子上の謔
属ギレート化部位を封鎖すうので避けなＶすればならな
い。反応温贋は一般Ｋ特に１ｌｊｌｌ限がなく、部分的
になたは実質的に沈殿ｒ　６１Ｍを与えるように選ぶこ
とがＱざる。この反応は、なるべくは反応のハロアミン
塩副生成物の′Ａ質的に全部を沈殿させるのに十分低い
温度０行なうのがよい。

用いたアミンがトリエチルアミンで、ありそしてエステ
ルがクロ０ゼ酸のエステルＱあるとき、温度は約−２０
℃から約−７ＣＪ’０までの範囲内にすべきＣ″カる。

感度ビこの範囲に保つと、平衡反Ｊ６が右へＭＪＪＪさ
、次戊二 に−Ｃ（０）　−０−Ｒ＋（（ＣＬ（３Ｃ１（２八Ｎ〕
５Ｄ’ｌ’ＰＡだとに従つＣ、ＤＴＰＡ、　ＣＩ）　ｒ
ＪＡ倉カル・ｊぐキシ炭酸無水物な高収Ｉｉｔ′Ｑ生ず
る。

明記されたｔＭ度範囲で上記反応を行なうことにより、
高濃度のキレートがハロアミン塩副生成物を人質的にき
ますに装造Ｃきる。例えば、約０．２５　＋ｎ１７の（
／タキス（トリエチルアミンンＤ’ｒＰＡ　　塩をＱ、
５　ｒｒｒｌのアセトニトリルに溶解し、６５マイクロ
リツトルのイソグチルフルロホルメートと反応させるこ
とができる。−７０’Ｏで約４５分後、ｄ液を遠心して
沈殿を除去すると、望むキレートを約０．５　Ｍの濃反
でき有する上澄液がｉＡる。このキレートを有機溶媒中
小なくとも約０．２５　Ｍの濃度ごキレート−抗体抱合
・反応に導入することが望ましい。このようなキレート
濃度は、抱Ｕ反応混合物に比較的小社の有機溶媒を用い
ることを許す。反応混会吻における有機溶媒の過剰鼠は
、そのｄ媒が抗体の生物学的活性と特異性に関して悪影
響を生じうるので、避けるべきである。

キレート抱合モノクローン抗体は、有機溶媒中のキレー
トを抗体の−Ｊｌ−塩水溶液へカｎえることにより生成
される。修飾されたＤＴＰＡと抗体との反応を約７．２
以下の、、Ｉ　Ｑ行なうことが重要。ｂる。

キレート−抗体反応は水との反応により起こるキレート
の分解と競汗する１、シかし、１）１１が余りに１床い
とキレートは酸触媒分解を受け、抗体の生物学的活性８
よび持〕４注が減少ｒる。−１は渣ましぐは約６．０か
ら約７．２１での範囲内に、そしてなるべくは実行ｕｆ
能な限９７．ｏに近づけるのがよい。この範囲、にＲい
ては、ＤＴ’ＰＡキレートと水との反応はキレ２ト一抗
体反応に対して余り有害とはならない。

上記の論議はＤＴＰＡ　Ｋ焦点を合わせて来たが、他の
配位子２用いて抱き体をつくることも技術の参照。

抗体の最高の生物学的活性を保持するには、どのキレー
ト−抗体の調製に＋ｒ　シてもｐｌＮＪ４節に強酸また
は強Ｊｉ基の１更用を避けるべきである。強酸または強
塩基の使用は瑯液における局所変性２起こしうる。ｐｉ
（は適当な緩衝剤をさめることによりモツタローン抗体
の水溶液で調節できる。丙えば、ＮａＨＣＯ３をに＝”
Ｊ　Ｌ）、１１１イの４度で１吏用で２！る。１山の緩
１ｆｊ剤、１ンＯえ、ｆ＋、ｚ闘（２−（ｐｒ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸）がこの分野Ｑ公知−Ｑｊｉ＞
’）、これも使用Ｃぎる。ｊ［４当な緩衝剤の選択は技
術の熟練のプらにら６゜ ギレートトＩＯ’ｚｌ九体水ｔ′ｄ液へ加えるとき、両
者とも約０　’０になければなｔつない、溶液のＩＡＡ
度は一般に反応の通行の間約４　”Ｏ以１詔でト昇させ
るべきでない。約Ｏから約４°ＣまでのＩｈα四内の温
度の開用は抗体の分解Ｃ避げそしてまたキレート分子も
＋１ψ減Ｃ６ｆＬ＊向かあ５゜反応を老貼点にまＱ進め
そして溶液を冷所に一晩放１ｄｒる限り反応時：司に特
に制限はない。

キレート文寸ＪＪ′ｃ本のモルＪ七は抱介ｒ本に・１１
≧図された用途により広く〈叱しうる。ギレート対抗１
１辺のセル比は約（〕、１がら約１０オーＱまたはそれ
以上まＱ、そして７ｉ−５べくは約０．２５から約５ま
で広くわたりう６゜−〉くの揚け、キレート対抗１拉の
セル比は約ｏ、ｂかＩＺ）約６°まＱにわた６Ｑあろう
。

一般に、反応にはキレートの過剰を用いるが、それはキ
レートが水高欣中Ｑ　Ｊ）６程度分解するからである。

抗体１分子に一つき請合したキレートの数は、反応混合
物にすＪけるキレートの一度す６よび抗体の一度の両方
の１５１数でめり、高い４度は抗体尚９より多くのキレ
ートを６える順向がちる。もし用いる抗体の亀が比較１
１９少」Ｑあり、ｔして比較的希薄な溶液を用いるなら
ば相当過剰なキレートが４ポされるかもしれない。例え
ば、約５から１０キ／　１ｔｒｉまＣのタンパク質溶液
を旬′Ｊ−る抗［本４液と反応させるには、抗体１分子
当り結訃したキレート約１．５閏を与えるためには、約
６００：１のキレートのモル過剰が磨水されるかもしれ
ない。

しかし、１００：１といった低いモル過刺ケ使用するこ
ともでき、それでも抗体１分子当りに結合したキレ−１
・平均約０．５蘭を生じう６゜抗体分子当り余りに多く
のキレート分子をカ１１えることは、抗体の生物学１的
活性と特異性を減少させることがある。

抗体へのキレートの添加が光活点援で進んだとき、実質
櫨の分解キレートがｍ液中に存在しうる。

これはどのキレート−抗体抱合体に対しても起こり５る
。分解したキレートは、抗体の生物学的活性と特異性を
保持しながら除去しなければならない。例えば、透析ま
たはクロマトグラフィーを使用できる。望むならば、キ
レートまたはタンパク質中に存在ｒるかもしれない残留
鉄を除くために、希アスコルビン酸ＦｄよびＩＪ’ｌ”
Ａ　溶液に対する第一の透析を行なう。精製されたキレ
ート抱訃抗体は、透析容器中ギレツクス（Ｃｈｅｌｅｘ
）　１００樹脂（・々イオーラツド）ｌＩｌ＋Ｊと共に
５０＋ｕＭのクエン酸塩δよび２０　Ｑ　ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む約４℃、１・１１約６の水溶液１ｅ（三
面取り換える）に対し４８時間にわたる反応混合物の透
析によって製造できる。ＭＥＳ　１０　ｍＭと塩化ナト
リウム２００ｍＭ　を含む４″０、ｐＨ６の溶液１ｅ中
への最終透析によりタンパク質の精製を定了する。透析
手順の変動は公知であり、技術の熟練のうちにある。

金属キレート化は水清中で行なわれ、そしてこのときも
また強酸または強塩基の使用を避することが望ましい。

どのキレート−抗体抱合トドに対ｒる金属キレート化も
、抗体の化物学的活性または特異性を有意に減少させな
いｐｔｌ　０行なう。一般に、満足しうる範囲は約ｐＨ
６，２から約Ｐ１１９までであるが、特別な抗体はもつ
と狭い範囲に限定せねばならないかもしれない。約６．
５以ドの−１に、付いては、抗体への金属イオンの偶発
的結合が多くの金属に対して実質的に損なわれる。それ
故に特に適当な範囲はしばしば約Ｐｌ（３，２から約Ｐ
Ｈ３，５−＊でＱある。

しかし、用いた金属の溶液に特有の因子は３．５以−ヒ
のＰＨを許ノーことか、ちる。この範囲内の適当なＰＨ
の選択は技術の熟練のうちにある。

本発明においでは、弱くキレート化する酸または塩基を
緩衝剤として用いるのが望ましい。クエン酸またはグリ
シンが有用な緩衝剤である。自然のことながら、なお他
の緩腑剤がこの分野で公知Ｑある。本発明は、強酸また
は強珈基を添加せずに、弱くキレート化ｒる酸祉たは塩
基緩衝剤で望むＰＨに調節した中レート抱合抗体の溶液
を企図するものである５、この溶液へ金ｊＡ塩を添加す
る。もし金ｍｊ蓋が６液状−〇あるならば、その溶液も
またギレート化緩両剤ＣｌＡ１節された１−）１を有ｒ
る。しかし金属溶液のｐｌ’ｌは、それをキレート抱１
抗本溶液へ添ｔｓ　ｒ　６前に、強酸−または強Ｊｊｊ
ｊＬ基Ｑ調節ｒることがでざる。

容認しうる址Ｐｉ４塩はどれも金−ギレート抱肝モノク
ローン抗体をつくるのに便用できる。典型的な塩にはハ
ロケ９ン化物（例えば、ＪＭ化物）、硝酸塩、過塩素酸
塩などが言−止れる１、金属塩シま実行９吐な１奴り高
譲度′Ｑ用いる。この調製物を取扱う個人個人の放射線
暴露は一般にキレ−１−債計部位当り１当り金１叫以ド
の限界を置くＣあろう。

反応時間は、もしＰＨが抗体に対して容認し５る−の範
囲外に近いのひなければ特に制限がない。

こり）ようなＰＨ範囲において士たはその近くに拓いて
、反応時間は一般に約１時間未着々、そしてなるべくは
約３０分以ドとすべきでちる。小太、時間の経済の観点
から、一般にこれら期間以内の反応時間が沼唸れる。ま
た、痕跡這の鉄がキレート化されるのを防止するため、
水浴性の非キレート化、生物学的に無害の還元剤、例え
ばアスコルビン酸、の存在下でキレート化を行なうこと
が好゛ましい。

反応は、通常、逮Ａ＠抱合体がそれ以ヒ動き易くなくな
る点゛土Ｑ浴液１・ｒｌをトげるよ５に、クエン酸三ナ
トリウムを十分量でｌｔｒえることにより完結される。

殆どのＤ”ｌ［’ＰＡ錯体は約６のＰｌｌ　（時に安定
Ｑある。反応がＰ１１６以ヒＱあるとぎ、曲の弱Ｊｊｉ
Ｍまたは弱敵を欧州しうるが、たｒ’５　（、これら力
；抗１本に悪影＃）を及ぼさない限りＱある。この選択
は技術の熟練のうちにある。

反応４液は一般に生体内でのその使用に元立ち精製を必
四とし、ぞして−またｄ器内使用に先）′Ｌち精製する
ことも心安〇）もしれない。非結α金属目よび偶発的に
結片した遊属は除去ｒべざＣある。

ここでの論議は閂元１１勺に結♂ｉ−た金属イオンを指
す。しかし金属のあるものはキｖ−１−にょって不安定
に保持されるかもしイｔず、偶然に結片した金属イオン
と同じｄかＱ１乍ノｒｉ　Ｃ６。

短い半減助をもつ放射性金属を用い）燭片には、精製工
程をＱきる限り手早くすることが待に重要Ｑある。本発
明はりｌコマトグラフイ〜の使用に、より比較的早い精
製を企図してＫす、本発明のこの面は一般にキレート−
抗体抱合体に適用しうる。

一種以上のイオン交換、遅）帝またはギレート化樹）Ｉ
Ｉゴイノング・マトリックス（レリえば、デル）と共に
用いることにより、本発明に係る金属キンート抱計七ツ
クローン抗体を迅速にかっ徹底的に精製しうる。

種々なイオン交換樹脂を単独Ｑ用いることができ、ある
いはイオン遅ｉ樹脂、陽イオン交換＋＃　＋＆、陰イオ
ン交換樹１１「マたはキレート化イオン交換樹脂のどの
組合わせも使用できる。適当な樹脂または樹脂頑の選択
、橋かゆ結訃の程度、化学形およびメッシュザイズはＪ
支術の熟練のうちにある。

本発明に用いられる陽イオン交換樹；信はしばしば強順
性ポリスチレンデル型樹脂（例え、ｆ、、夕９ウエクス
５０ｗＸ８）あるいは他の非・Ｊ？リスナレン系強酸性
樹脂、例えばゼオカブ（Ｚｅｏｃａｒｂ　）　２１５〔
パームナツト社（Ｐｅｒｍｕｔｉｔ　Ｃｏ、　）　′Ｑ
ある。追加のＡＭ当な鹸注−指には弱酸性デル・１（リ
スチレン樹Ｉｌｌ　、マクロ多孔１％　；ｊ？リスチレ
ン樹脂、−またはマクロ網状組織のカル・１？ン酸陽イ
オン交換樹ｊ盾がき−よれる。陰イオン交換樹脂は強塩
基性、１（１Ｊステレ／デル型樹脂（ｔ＋１え、ｆ、、
りゞウエクスｌＸ１３）：または曲の塩基性の小さい樹
脂、列えばビリゾニクム厘片体型およびフェノール系ポ
リアミン型樹脂を′ざみうる。キレート化樹脂はギレツ
クス１００、あるいは対になったインミノジアセテート
イオンをｋむスナン／ジビニルベンゼンである型の樹脂
（例えば、ダウエクスＡ−１）でよい。有用な遅滞樹脂
には対をなした隘イオンおよび陽イオン交換部位を含む
ものが包含される（例え！、ペイオー２ッｔ７ＡＧ１１
−Ａ８）。これら樹脂は、スチレン−ジビニルベンゼン
共重計１本格子中に第四級アンモニウム基を有する樹脂
のような強塩基性樹ｉｊ「の内部にアクリルを貸を型片
させることにより通常はつくられる。上記の論−は名樹
１信の代表例のみを陰むが、ｙｚ　ｒｌ６曲の樹脂もこ
の分野で知られている。市販樹脂の特性および応用につ
いての部用な記述の付いた妥約が、就中、・ぐイオーラ
ツげ・う１ぐラトリイズ、１９８２年、価格表Ｈに含ま
れている。

４ＩＪ脂の選択および組み合わせは直面している特定の
分離問題により左右され、ここの記述の点からみて技術
の熟練のうちにある。一つの有用な参考文献はノエイ・
キム（Ｊ、Ｋｈｙｍ　）、　Ａｎａｌ’７ｔｉｃａ１１
ｏｎ−ｈ：ｘｃｈａｎｇｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉ
ｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ＋＊ｉｏ１ｏｇｙ　（
１９７４）である。

サイソング・マトリックスもこの分野ひよく知られてい
る。これらにはポリアクリルアミＩＦ１　アグラロース
、多ｖ１類などが含まれる１）一つの特に有用なサイジ
ング・マトリックスは多楯墳ｒル（例えば、セファデッ
クス（）−５０’／”ルＬ（１−ｂる。

、Ｊｅリアクリルア５ｐｆルの例は）々イオーｒルＰシ
リーズ（パイオーラッド・う１ぐラトリイズ）Ｑある。

サイジング、マトリックスの選択はＭＷしようとｒるタ
ンパク質に依がし、技術の熟練のうらにある。

４１：発明のＡ施に、１ｄいては、種々な樹脂をカラム
内に層として設定し、Ｎ製しようとする溶液をカラム中
にＦ向きに、あるい１・まカラム中にＥ向き馨Ｃ供給す
ることができる。下向きの供給は、放射性化合物を用い
るとき特に適当な実験室技術であるが、それは重力によ
る流れが殆どあるいは全く補助装置あるいは器具使用を
必要としないからである。床の高さ、流速、などの選択
は技術の熟練のうちで容易である。

高度に荷電した金属がタンパク質表面に沿ったイオン性
部位のところで抗体により時折偶発的に結合されるよう
である。池の場合においては、偶発的に結合した金属が
＃Ａ体タンｌぐり質のひだＱ封じ込められるようである
。これら金属は溶液中に解放されうるが、平衡型過程で
溶液から再吸収されることもできる。４１′発明に係る
精製において用いられる遅＃またはイオン交換樹脂は、
この平衡を移動させてｖｒ、体から金属を除去すること
を可能にするために用いる。例えば、抗体がイオン遅滞
樹脂を通過するにつれて、溶液中の金属イオンの通過は
遅れるが、タンパク質はそうでない。そこで偶発的にｙ
／ｉ　訃した、高度に荷電した（＋６またはそれ以上）
金属イオンは平衡を可成広させるよ５に溶液中に解放さ
れる。しかしこれらイオンが溶液中に解放されると、か
わってこれらは樹脂により遅滞し抗体による継続した金
属イオン解放を起こさせる。

分離された高度に荷電したイオンをかたく拘束しそして
分離過程を継続させるため、イオン遅滞４＃脂のドにあ
るレベルのイオン交換樹脂を用いることがＱきる。樹脂
が高度に荷電した遊離イオンのタンパク質ｄ液を消耗さ
せるにつれて再び平衡が遊離イオンと偶然の金属イオン
との間に可成＼ｒする。しかし、この過程全体を通じて
キレート内部の逮属イオンは抗体と共に留まる。

しかし、イオン遅滞＃Ｉｊ脂またはイオン交換樹脂の嚇
なる使用は、実質的にすべての偶発的に拘留された金属
を効果的に除去するには不満足でをンることが決定され
た。精製乞完結するためにサイジング・マトリックスを
使用する。マトリックスに入る抗体（４１液は、遊離の
高度に荷電した金属イオンｔｉｔが既にある種度減じら
れている。サイジング・マトリックスに８いては、それ
以上の減耗が起こる。溶液がマトリックスを通って動く
につれ、抗体は３ＭＷＩシないがイオンは遅れる。サイ
ソング・マトリックスから取り出される生成ｍ液は偶発
＋Ｊ’Ｊに拘留された金属を実質的に含まない。このよ
うなゆるく拘束された金属は１８１合体の全金属含縫の
約６パーヒント以Ｆに減らすことが亡き、その結果抱合
体によって運ばｔしる金属の少なくとも約９４−はキレ
ートにより（辻定に固定される。全金属のうち少なくと
も約９７％がキレートにより固定されることが望ましい
。金属の９８優またはそれ以上がキレートにより固定さ
ｈた金属レベｌしを得ることがｏ］′能Ｑらる。透析を
用いて安定に固定された金属含吐を決定することがＱき
る。

精製の特に適当な方決は、陽イオン交換樹脂（パイオー
ラッドＡｏ５０ｗｘ８）およびデル（ファルマシア・セ
ファデックスＧ−５０Ｌｈのイオン遅滞樹Ｉ盾（ペイオ
ーラッドＡＧ１１−Ａ８）であう。本発明に対するテク
ニシウムキレート抱合モノクローン抗体の精製において
、特に適当なカラムは、イオン遅滞樹脂（７ぐイオーラ
ッドＡＧＩＩ　−八８　）その下に陽イオン交換樹脂（
バイオ−ラッド５０ＷＸ８χその下に陰イオン交換樹脂
（パイオーラッドＡＧＩＸ８）およびサイジング・マト
リックスデル（ファルマシア・セファデックスＣｋ−５
０）を含む。

本発明方法において、抗体は非凝集形に留まっている。

クランピングによるか橋かけ結合によるかの抗体凝集は
抗体の特異性の減損を起こし、そしてこれが望ましくな
いことは云うまでもない。

凝集は担体中過度の高濃度の抗体によって起こるか、あ
るいは例えばカルボジイミドといったタンパク質橋かけ
結合を起こす化学薬品との接触によって起こりうる。標
準沈降試験、サイズ・マトリクシングなどを用いて抗体
が凝集したかどうかを決定できる。事実、ここで論議し
た抗体特異性試駆は特異性の減損としての凝集を反映し
ている。

本発明に係る抱合抗体生成物の活性と違異性は、抱合体
をつくるのに用いた抗体の活性および特異性の少なくと
も約８０％、そしてなるべくは少なくとも約９０チのレ
ベルに保たれる。特に適当な溶液は少なくとも約９５チ
の抗体活性および特異性によって特徴づけられ、最初の
抗体の活性と特異性とを実質的に未変化に留めている生
成物が製造されている。抗体の活性および特異性は、抗
体を容器内でエビトーゾに績倉することによりこの分野
で習慣的Ｋ　＋１ｌｌＪ定されている。最終抗体生成物
の活性および特異性の庇片は、最終抱合生成物について
最すの試験な謙返すことにより簡単にｄ易に決定できる
。

本発明は放射性金属キレート抱αモノクローン抗体を身
体に尋人し、目標領域に果申させるという生体内治療法
を企図している。安定なりＴＰ八へ体を形成し、かつ細
胞毒＼となるアルファー粒子を放出する種々な放射性金
属同位体がある。抱合体が目標となる細胞の近くにある
かまたはこれと接触しそして結合するとき治療効果が生
ずる。細胞の死亡は、細胞に接近して位置した放射性金
属の放射という出来事の直接または間接の結果であると
考えられる。

本発明のこの点の有利さは幾つか）ｉｊ）る。第一に、
抱合モノクローン抗体の縄い特異性は全放射線投与ｔを
最小にｒる。目標細ノ泡に対して十分なだけの放射線を
用いれば済む。その上、もし抱合抗体が分断されると、
放射性キレートは一般に身体から急速に除かれる。同位
体は短寿面Ｃよく、異性体がＤ’Ｌ’ＰＡキレートに留
まる観不日カ定故は非常に高く、安定に結訃した金属を
生ずる。最仮に、用いた放９１住金属の址は最小とされ
るので、放射性金属キノート抱含抗体を製造し投与ｒる
人に対する放射線のｉｔ、険が著しく減少ｒる。

本発明により用いられるＤＴＰＡ放射性金属キレート抱
合モノクローン抗体の時性の故に、治療中の組織損傷ま
たは全身用駿は、現在使用される放射線治療法、囲えば
同位体植え込み、外部放射線療法、およびヨウ素−１６
１で標識したン１ｅリクローンまたは同原の抗体を用い
る免疫放射線療法からのそれと比較して著しく減少して
いる。更に、目標にしている放射線生物学的な生物学的
および物理的な半減期が今は調節できるので、全身放射
線効果を最小にｒる。放射線は細胞の型（例えば、新生
細胞）へ特異的に向けられるので、治療用蓋が特異的に
悪性細胞（１４所化し−（いるか蔽移したかの何れでも
）へ供給される。放射性金属キレート抱合モノクローン
抗体のｒｔ３療用成用放射線効址を１移細廁−＼−〜異
的に供給ｔ５能力もまた癌療法に対して独特かつ著しく
有用ｃｉｉ）る。

本発明は細胞の不調を処ｉｌｒるためにアルファー線放
出放射住金：Ａをざむ金属キレ−ト抱片モノクローン抗
体４Ｉ：政用ｊ−る。大抵の応用に６いては、放射性金
属が約４日未満の半減期ぜもち、一旦アルファー粒子が
放出されると迅速に崩壊１−−（安定な同立体になるこ
とが′！ｉましい。本発明に用いられる特に適当な同心
体はビスマス−２１１、ビスマス−２１２，ビスマス−
２１３１，ｔよ＜Ｊ’ビスマス−２１４である。半減期
６０．６分のビスマス−２１２が特に適当Ｃある。

用いるモノクローン抗体は殺ｅうとする罹病、細胞に対
して特′Ａｌｔりでゐる。、１１］胞の死は放射性金属
の崩壊により起こり、ニ一つの仕方のうち一つ一〇起こ
りうる。第一に、もしアシファー粒子が病Ｉ！ＩＪ廁の
方向に放出され６ならば、１１１Ｊ胞核における−撃が
廁施毒となりつる。アルファー粒子放出後に放射・１生
柚鵠が崩壊する同位体はアルファー粒子のそれと反対の
軌道−ヒでギレートから追い出される。

それ故に拘束された細胞はたとえアルファー粒子が細胞
から離れた軌道上に放出されたとしても依然−卓されう
る。崩壊した同立体による細胞膜の一堪は回復不ｔ＋Ｂ
のハ４１Ｉ胞傷害を起こさせ細）泡の死に導くことがＱ
きる。アルファー粒子の比較的１％い有効性はより少な
い放射能・面質な用いうろことを意味する。アルファー
粒子の短い範囲（数細胞直径）とモノクローン抗体の選
択性は健康な組織の細胞レベルでの破壊を最小にする。

ビスマス−２１２は二つの異なる経路の一つにヨッて崩
ｄｔ”６ｏビスマス−２１２の凡そ６４多はベーター放
出を経て半減期０．５マイクロ秒？もつポロニウム−２
１２に崩壊する。＋ｊｅ　Ｅニウム−２１２は約９０ミ
クロンの範囲でアルファー粒子を放出後安定な鉛−２０
８に崩壊する。ビスマス−２１２の曲の３６チは約６５
から５０ミクロンの範囲でアルファー粒子を放出「るこ
とによりタリウム−２０８に崩壊する。次に、半減期６
／芳σ）タリウム−２０８はベーター放出を経て安定な
鉛−２０８に崩壊する。

Ｂ１−２１２の、猪生器はブロイ（Ｇｌｅｕ　）等、−
不、Ａｎｏｒｇ、　Ａｌｌｅｇ、　Ｃｈｅｍ。２９０　
：　２７０　（１９５７）Ｋよ’）、−１だツツ−１−
−＝　（Ｚｕｃｃｈｉｎｉ　）等、　Ｉｎｔ。

の原稿の抄碌が１９８１年８月σ〕ニューヨークにおけ
るＡＣ８学会で配布された）により文献にｄ己述されて
いる。有用な発生器は、カラム内に封じられた粗フリッ
トガラス円板−ト、−石英力ラム中にも゛まれたチタン
酵ナトリウムの６×５賜床ヒに吸収させた４価状態のＴ
ｈ−２２８からなる。チタン酸塩はＴｈ−２２８および
そのＲａ−２２４ド一ター両方を固く保持す６゜チタン
酸塩に水を通過させると、Ｒａ−２２４同位本のＲｎ−
２２０ドーター＆ま水の中にｄけ、７リツト円板を通過
し、水で満した１　０　ｃｃ−）Ｊラス貯留器に果めら
れる。Ｒｎ−２２０水躊液はこの貯留器から、ｔ４イオ
ーラツドＡＧ−５Ｑ　ＷＸ　８陽イオン交換樹脂のよう
な強酸性イオン交換樹脂約１ｍｌを含む直径１０騙のカ
ラムに流れる。Ｒｎ−２２０は貯留器内で実質的に５分
以内にＰｂ−２１２に崩壊し、そしてこのものは樹脂中
を通過するとき吸収される。樹脂巾約ｉ　、５　ｍ６７
分の流速において、生じたｐｂ−２１２の約８５≠がカ
ラム内に集められ、ここでこのものはそのｏｉ−２１２
ドーターに崩壊する。

望む−のＢ１−２１２が樹脂上に生成したとき、当業者
の熟知している手順に従いこれを酸で溶離する。ｐｂ−
２１２とＢ１−２１２両方に対する有用な浴離法は樹脂
に２　Ｎ　ＨＣＪＬ　５　ｍｌを通過させるものである
。別法として、もしＢｔ−２１２だけを嗜むなら、０．
５　Ｍ　ＨＣＩ　１．５　ｍｌを樹脂に通過させるとよ
い。

ベーター粒子あるいはオージェ４子を放出する金属は治
療に訣用ごきるが、アルファー繍放出放射１生金属のＪ
ｉ／Ｊ″−幾つかの理由のため一時に適している。第一
に、アルファーヌクレオチド放射は特徴的に組織内Ｑ３
Ｊｉい範囲とベーター−またはオージェ放射と比較して
非常に高い直線的エネルギー移動を有する。アルファー
放射は核にＡ１する唯一♀Ｑ細胞を殺すことができ、１
０打またはそれ以ドで実質的にどの細胞も殺すでめろう
。更にまた、その崩壊も細胞の死を起こさせうる同位体
（例えば、Ｂ１−２１２の場訃Ｔｌ−２０８またはｐｂ
−２０８）を放出する。アルファー粒子の範囲は通常は
組織中で約１！’−、Ｏミラ１フ未満である。これに対
し、ベーターおよびオージェ粒子は細胞の死を起こす前
に核に故１００打を必要とし、また組ｉ哉内Ｃ数ミリメ
ートルの数１０５）の１から故センナメートルまＣのオ
ータゞ−の範囲をもつ。ベーター粒子を用いる場合、よ
り高用址が磨水され、ヒして実質的に一ノー放射性標識
した抗体の崩壊が細胞死の達成に必要であろう。従って
、特異的に結会した抗体は異化されてベーター放出性放
射性雀属を血液中に解放ｒる。アルファー放出放射性位
（媚は比較的急速に殺すのでその結果より少ない抗体が
異化されることになる。

本発明に係る金属ギレート抱合抗体は適当な製薬用担体
中で生体内に投与できる。前述した通り、通常の生理＊
塩水を適当にｍｌ用Ｑざる。しばしば担体は尻１本をに
走化するために少量の担体タンパク質、し０えばヒト血
清アルジミンを跨むであろう。

溶液中の蛍属キレート抱合抗体の１度は選択の問題でＡ
＞ろう。０．５υｙ　／　ｍｌの一度が容易に得られる
が、（４度はある与えられた応用の特殊性によって相当
に変ることがありうる。担１本中の生物学的に活性な物
質の適当な濃度はこの分野で日常の仕事として決定され
る。

応用に対して利用すべき放射線“または金ｈ４き琥の有
効用址もその応用の個々の事情に左右されるでちろう。

例えば、Ｉｎ４瘍の治療にＮいて、その用鼠は就中Ｊ鑵
瘍の重荷、久手町吐さなどに１Ｎ存する。

幾分か同様に考えて、診断の目的にＸＪ　ｒ　６　ｍ　
！！！キレート抱合抗体の使用は、就中、用いた。険知
装置、・険青しようとｒる部位の位１ｄなどによって決
−まるＣあろう。患者がその部位に位ｌｌｆｆ１シたも
のに〃ｎえて循環する抗原をもつ揚重には、処置に先立
ら循環抗原を除去Ｑさる。このような抗原除去は、例え
ば未標識抗体の使用により、あるいは患者の血清を処理
して抗原を除去する血漿泳動法により達成できる（ −Ｆ記の例は本発明の実施？よりよく説明するために含
めてあ・る。これら例は説明の目的のためだげに含めた
のであって、如１６１なる仕方においても、本発明の範
囲乞制限しようとする意図はない１、例１ １００ミリグラムのＤ’ｒｌ）Ａをフラスコに秤縫し、
これに、水１ｍｌを加える。この溶液を０．１２５９の
再蒸留したトリエチルアミンと反応させる。反応清液を
加温して反応を完結させ、固体の生成物を凍結乾燥によ
り果める。

凍結乾燥した固１本を０　、５１ｌｌｌ　ｏ）純粋な乾
燥アセトニトリルに溶かし、３５ｕｅのイソグチルクロ
ロホルメートを約−２０℃の温度で加え、約−７０℃ま
で下げる。約４５分後、溶液をエラペン１ζルアびん中
で遠心する。上沿液を集める。これはＤＴＰＡ　　の望
む混合カル１？キシ炭酸無水物を約０．５Ｍのａ度で含
む。

用いたモノクローン抗体は１０３Ａ５と呼ばれ、Ｐ　６
Ｘ　６５　Ａｇ　８　　マウス−＃髄ノ虚ンｍｌ」邑乞
、エム、ストランド（Ｍ、　５ｔｒａｎｄ　）およびジ
エイ、ティー。

オーがスト（Ｊ、　Ｔ、　Ａ、ｕｇｕｓｔ　）　、　２
５　ｉ　Ｊ、　Ｂ１０１゜Ｃｈｅｍ、５５９　（１９７
６）により記述されているようにして得た７　０，００
０ダルトン（ｇｐ７０）の４＃製レトロウイルス糖タン
パク質で免疫化したｃ５６Ｂ１／６マウスの単離膵臓細
胞と融片させることにより得た。−介はエム、ストラン
ド。

７７　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ　　３２３４（１９８０）により記述されている
ように行なう。

Ｐ１１約７．２の０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３中モノクロー
ン抗体１０３　Ａ　５　（２ｒｑ　）と塩化ナトリウム
１５０　ｍＭを含むｉ　ｉ　４　ｕ（３の溶液を調製し
、ナンク（ｌ和１１ｃ）びん中にピペットＱ採る。次に
１．Ｉｎ２．０の０、１Ｍ　Ｎａ）（ＣＯ３Ｍ液、５３
＋１をびんに加える。最後に、キレートと抗体の溶液を
約０℃に冷却後、ＤＴＰＡ　の混合カルぜキシ炭酸無水
物２６．４ｕｅ（アセトニトリル中０．５　Ｍ　）を加
える。反応を一晩進行させる。

生成物を先ず５０ｍＭアスコルビン峡、５ｍばＥＤＴＡ
　、　　２００　ｍＭ　Ｎａｃｌおよび２０　ｍＭ　、
外エン酸ナトリウム（ｐＨ４７，０）の１．６　Ｋ対し
４℃Ｑ透析する。

得られた溶液を５０　ｍＭクエン酸Ｊ盆、２００　ｍＭ
塩化ナトリウム２００　ｍＭ　（ｐＨ６，０）：ｔｖよ
びｉ　ｔｎｌのギレツクス１００樹ｄ’ｔｌ　（Ｂｉｏ
　−Ｒａｄ　）の１ｅに対して４８時１１にわたり五目
取り戻えて４°Ｃで透析する。最後に、生じた溶液をＭ
ｇｓ　ｌ　ＯｍＭ　、ｔｓよび塩化ナトリウム２Ｑ　Ｑ
　ｍＭの４興を有するＰ１１６．０の溶液１ｅに対して
８時間透析する。約１．７９のキレート抱含モノクロー
ン抗体が採取された。Ｃ−１４標識したＤＴＰＡ　　を
用いる同様な実験をシンナレーション計数により分析し
、抗体１分子当り約１．５キレートを含むことが示され
た。

インジウム−１１１塩比ｑ勿陪ン戊〔二ニー・イングラ
ンド・ヌクリアー・コーホ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮ
ｕｃｌｅａｒ　Ｃｏｒｐ、　）　）’４．０　マイクロ
リットルを、−１５，０ノ０．４　Ｍクエ７１８１１．
４　ｕｅ　（７）添／ＩＩＩ　Ｋ　Ｊ：　９ｐ１１３．
０に、、１４節する。全′ｋｋ２１．６マイクロリツト
ル中にキレート抱合モノクローン抗体２５０マイクログ
ラムを含む別個の浴液會つくる。この溶液は…６．０に
おいて厘比六トリクム２００　ｍｈｌとＭｇ８１０　ｍ
Ｍの一度を有する。この溶液を６．０のｐＨの０．２５
　Ｍクエン酸６　ｕＩ３の添加によりｐｔ１４．６に調
節ｒる。

ｌｉｆ祠ギレート抱汗モノクローン抗体は塩化インジウ
ムとキレート摺合抗体溶液とをよりせ、それを室温Ｑ約
３０分間反応させることによりつくられる。）Ｘ応はク
エン酸三ナトリウムの飽刊暦液２５１１ｇを加えてＰＪ
ｌを約６に調節「ることにより１苧止させる。

ギレート抱片抗１本は、セファデックスＧ−５０ｒル（
ファルマシア）７ｍｌの上に陽イオン交換樹脂（Ａ（）
−５０−ＷＸ８、Ｈ＋形、２００〜４００メツシユ゛、
パイオーラッドから入手可能）　１．　Ｑ　、ＩＩｋそ
の上にイオン遅滞樹脂（ＡＧ−１１−八８、）ぐイオー
ラツドから入手可能）１．０Ｉｎｌを含む長さ９　ｃｕ
ｉＯカラム上でのクロマトグラフィーにより精製される
。塩化ナトリウム２００ｍＭおよびＭｇｓ　１０ｍＭ　
　（１）一度をもつ−６，０の溶液な溶離剤として・防
用し、またカラムを予備平衡させるのに用いた。

溶離液をＱ、５ｍｌフラクションずっ集めた。タンパク
質の大部分を含む二つの７ラクシヨンは’＋　５７．１
−ｒイク巳キュリーインジウム−１１１で標識されたモ
ノクローン抗体１５０ｕｇを含ムコとが示された。Ｍｌ
　２０　ｍＭと塩化ナトリウム２００ｍＭの−１６，０
における水浴液１ｅに対して４℃での透析は６％未満の
インジウム損失を示した。この抗体はその生物学的活性
と特べ性の−Ｊ！、賀的に１００％を保持ｒることが容
器内試験により示された。白血病マウスにＮゆる生体内
１象形成はＳ臓の腫瘍部位を目Ｘ’ｌたせた。正常マウ
スに投与したときは膵臓による吸収がなかった。

例２ Ｐ６６５５マウス骨ｉ！ｌ＆腫細胞をヒト膵臓から単離
されｄｊＪＡＪ、された腫瘍関連フエＩＪチンで免疫化
したＣ５６Ｂ１／６マウスの単離膵臓細胞と融すするこ
とによりハイグリげ−マを得た。２６６Ｄ５と称する抗
フェリチン抗体を生ずるハイシリドーマが単離された。

その抗体はヒトフェリチンに対して特異的であり、他の
哺乳動物種の７エリチン・とは反応しなかった。

闇２０手順を繰り返してインジウム−１１１含有ＤＴＰ
Ａ抱片モノクローン抗体を得た。金属キレート剤まモノ
クローン抗体を含む通常の生理食塩溶成を１Ｅ常マウス
および白血病マウスに注射する。

白血病マウスと正常マウスの両方において、放射能鐵形
成は放射能ｍ識金属の集中がないことを示した。これら
試験はキレートがキレート−抗体抱合に関して−また放
射性金属の保持に関して生体内ご安定Ｃらることを東証
した。膵臓も肝臓も蹟で目ケだなかった。

例６ 下記の列は、本＃、ψｊにより達成された放射性金属（
アルファー粒子放出同位体を含めて）の選択的局所化を
証明するため、がンマー粒子放出同位体を用いる。

インジウム−１１１キレート抱合上ツクローン抗体はヒ
ト乳腫瘍に対して特異的な抗体から潤製される。この抗
体を生ずるハイグリげ−マはマウス骨髄腫、細胞とマウ
ス膵臓細胞との融合からつくられる。ハイグリドーマ丁
６よび抗「本は７３　Ｐｒｐｃ。

されている。

用いた手順は次の点を除き１５’ｔｌ　１１６よび２の
手順と実質的に同じである。第一に、アスコルビン酸塩
−ＥＤＴＡに対して七し−ト抱合七ツクローン抗１本を
透析する工程を省いた。第二に、キレート抱訃モノクロ
ーン抗体の食塩水浴液へ添加するのに先立ちインジウム
−１°１１溶液へｐｆｆ４の０．１Ｍアスコルビ７Ｕ塩
１０マイクロリットルを加えた。

標識づけＬり効果は間１および２の方法よりも３倍の増
〃■を示した。最終生成物は約２．１マイクロキユリー
／マイクロダラムＱ標識された。

精製カラムから果められたインジウム−１１１キレ一ト
化抱片七ツクμｍン抗体の１０マイクログラムをリン酸
塩Ｃ緩衝した食塩水溶液で１００マイクロリツトルに希
釈する。希釈したインジウム−１１１抱合抗本を、ヒト
乳１鑵瘍を発育させた＃ＩＭ欠如ヌー＋Ｓマウスの尾の
血・０に注入する。ヒト乳腫瘍＃ｌ胞は抗体に対する抗
原を示した。注射してから７２時間後、きれいな輪郭の
はっきりしたＩンマーカメラはかｔｌｍ　ｍ織における
インゾクム−，１１１０局い局所比乞＃ｉＥ　１９Ｊし
た。ＭｆＢｌ）４またはノ樺＋Ｊにはげるインノウノ、
−１１１の同様な局所化は硯り；（さ　オしな　かで）
４二。

丙４ ド、ｊ己の戒（ま、改幇１１・ｈ　、？　ｖＡ−ＤＴＰ
Ａキレートが１、改。

離放耐性金属と×を照ｒる・も（うとして、肝臓厄よび
肺臓に局所ｒヒせｒ、胃＋Ｊ　：ｌｄ　、ｊ：び４を経
て迅泳にＪノドγｆｉｔされることを火、正、している
。正Ｉ片マウス枯よび白血病マウスの器官中への放射性
硬縞の取り込みはｒ記手順により立証された。６適齢の
正常マウスおよびラウシエル（Ｒａｕｓｃｂθｒ）白血
病ライｌレスの注射により前以て８日）用白血病にした
マウスに、’ａｘｆｆｌ　Ｂｉ　−２０７、ＤＴｐ八　
＋　ｖ−）　比Ｂ１−２０　７　ｕよびＤＴＰＡギレー
ト比５ｃ−４６の５マイクログラム（５７・イクロキュ
リー／マイクログラム）を腹腔内注射した。１８時間は
よび４２時＋ｉｊｊ　ｔｆ）ｆ、マウスを殺してその器
官を秤薦し、器官に吋ｐ毒した放射能のＩｉｔをイ則定
した。ｐＥ射にｌする差異、体重の差、および器官Ｌｊ
Ｊ除の時Ｉ…の差を標準１ヒするために、組織１グラム
当りの放射能の址を血液１グラム当りの放射能祉で割り
、結果をこの比として表わした。、これらの゛結果を表
１．２＃よび６に示した。

表　１ 遊離２０７　Ｂ　１ｔ・の注射後１８および４２時間に
ｔ、５ける１４日白血病マウスおよび正常マウスの５器
官の比／血液の平均の平均１直と標準偏差ＪＩＴ−臓　
３１．６±７．５００２９．０±ｏ、６５４３．３±２
，６５牌臓　７．１８±２．０３ｄ２１．１±０．６５
　８．７叶０，６６胃１１！！　　　６９．４±４３．
７　　６１２．６±４７．８　８９．ｓ±９．１８青　
　　１．６５±０．３５　　６．９５±０．＜５５　５
．０１±０．４３ａ−注射ｔ−＝７　Ｘ　ｉ　Ｏ’　ｃ
ｐｍ　／　マウスｂ−心ｔｄ４おける全ｃｐｍの約０．
１３　％Ｃ＝肝臓における全ｃｐｍの約４０価 ｄ＝膵臓における全ｃｐｍの約１２チ 表　　２ ２０７Ｂｉ　−Ｄ’ｌ’ＰＡ　　キレート注射後１８時
間における白血病マウスおよびｉＥ正常マウス５器官の
比／血液の平均の平均値および標準偏差Ｂｉ　−Ｄ’ｒ
ＰＡａ 心Ｍ　　　　２．６Ｏｆ　０．６３ｂ２．４５Ｊｌ：　
Ｑ、２１肝臓　　　　　１９．１２Ｆ６．６２°　　　
　　１０．９３−ト　１．２４牌Ｈ１３，１−ｉ：　２
．６”　　　　１°２．４１：　２．０胃ノ威　　　２
９４．０±３７゜０　　　　　２８１．０±２６．０４
　　　　７．５２１：　２．４４　　　　７．２０±２
．９０ａ＝＝注射ｕｋ６−Ｂ　Ｘ　１０’　ｃｐｍ　／
　−ｒ　ウ２１）＝＝心誠における全ｃｐｍの約□、０
０３　ｔ１６Ｃ＝：肝臓に投ける全Ｃｐｍの約０．２１
鋒ｄ＝牌臓における全ｃｐｍの約０．０６％表・３ ４６Ｂｃ−ＤＩＰＡ　キレート注射後１８時間にはける
白血病マウスおよび正常マウスの５器官の比／血液の平
均の平均ｒｉおよび標準閥差４６８ｃ　−１：１ＴＰＡ
ａ 肝臓　　　　９．９６±０．５７°　　　７．２６±１
．０４牌臓　　　　６．１７±０．３９”　　　　５．
６９±０．２８″痔ｊ臓　　　　　　４２．１　±０．
９　　　　　２９．５±５．５肖　　　　　　　　　１
２．４５±５．４５　　　　　　　７．７６七２．０６
ａ−注射ｔ５．４　Ｘ　１０’　ｃｐ＋ｎ／−ｒクスｂ
−心臓における全ｃｐｍの約肌００６％Ｃ＝肝臓におけ
る全ｃｐｍの約０．１４チｄ＝牌臓における全ｃｐｍの
約０．０８％上記表中の結果はＤＴＰＡキレート化ビス
マスおよびスカンジウムが遊離ビスマスと対照的にマウ
スの肝＃ｉまたは肺臓に寒中しないことを示す。ｇ臓に
おけるキノート化金属の高い濃縮はそれが尿を経て排泄
されつつあることを示す。白血病マウスと正常マウスと
の間のｖｔｐｉ４ａ度における変動は、ストレスにより
白血病マウスが頻繁に排泄することに帰せられる。

例５ 唾乳動物細胞に対ｒるビスマスアルファー放射の効果を
決定するための試験を行なった。１０襲の熱不后性化牛
脂児血清を含むダル・マコ（Ｄｕｌｂａｃｃｏ’ｓ　）
改良イーグル培地中６　器内ＱＦ−４６白血球細ｊ厄を
発育させ谷くぼみにＩ　Ｘ　１０５の細ノ１ｉ！１果団
を得る。この細胞朶ｌ」を、発育培地中に系タリ希釈（
表４に記載の通り）をカロえることによりビスマス−２
１２に暴露する。次に細胞を９６時間培誉し、生存Ａ；
ＩＩＩ胞数を測定した。結果をＦｄ己表４に示す。

表　　４ ０　　　　　　　６．９　　　　　　　１，４　　　　
　　　１０００．２　　　　　８．０　　　　　　　０
．５　　　　　　　１１６０．４　　　　　６．Ｉ　　
　　　　　　Ｌ７　　　　　　　８８０．８　　　　　
６．７　　　　　　　１．４　　　　　　　９７１．５
　　　　　６．０　　　　　　　２．ｄ　　　　　　　
　８７５．１　　　　　６．０　　　　　　　Ｌ］、６
８７６．２５．Ｏｏ、６７２ １２．５　　　　　２．９　　　　　　　ＣＪ、４　　
　　　　　４２２４．６　　　　　２．２　　　　　　
　０．４　　　　　　　３２４９．２．　　　　　１．
１　　　　　　　ｃｌ、４　　　　　　　１＜Ｓ９Ｂ、
４　　　　　０．６　　　　　　　０．’＋　　　　　
　　　　９表４の上記ｒ−夕ろ・ら、標準のば１°Ａ°
去を用いると、Ｄｏ（生存率６７％）は６８．５ランド
となる。このことはビスマス−２１２が高度に細胞毒な
密にイオンｆしする放射線を放出すること？示ｒ０比横
によれば、同じ結果を１成ｆるのにコペル）−６０源か
らの粗にイオン化する放射ＪＪ　９００ラツド必”ｄと
ｒる。放射線の論議に対してはｎｌｎ／マーＶ・パンフ
Ｖットの！、４￥１号（改訂ンおよび１０号を見よ。

当業考にとって疹正が明白でちるので、本発明は心許請
求の＋ｌ＋ｌＪ囲によってのみ制限されるものとする。

代理人　　浅　村　　皓 手続補正書（自発） 昭１１６Ｂ年７　月／Ｊ１０ 特許庁長官殿 １、小（／１の表示 昭（ｌ’Ｄ　８＋１１．’ｊ、□′ｌ結１ｉ）ｌ　Ｄ　
１５９３　　＋ｊ２゛ざと＋１１０）（、仔１゛　　金
属ギレート抱合モノク・−ン抗体の製造法一つよひ使用
法 ３、袖１１−をする者 ｌｆｌ″１との関１１　　持１．′ｌ出ト：↓１１入１
１１すｉ 上代理人 ５、袖１１゛命令の［１１」 昭和　　１１　　月　　１１ ８、補正の内容　　別紙のとおり 明細書の浄書（内容（こ妾更なし） 手続浦正書　　　　（１） 昭和５８年７　月ＱＤ゛［１ 特１：′１庁長官殿 １、・１１１牛の表引 ｌ１１＋Ｉｌ　５８年特ｆｌ’Ｋ（ｌ第１０１”　９”
　　１号：Ｌ　ｔ）ｌｉ＋ＩをずＺ・者 中１’ｌとの関（系　１．’＋：ｔ’ｌ出ト、１Ｊ１人
１１所 氏　　名　　　　Ａツト　エイ、ガンソウ（＞’＋　　
（’＋、） １１、代理人 ５−　Ｍｉ＋１ｇ命令の１旧」 昭和　　イｌ　　月　　１１ ６、１ｌｌｉ正ににり増加する発明の数７、　ｔ＋ｌ１
ｉｌ二の対象 ＩＵＪＩＩＩＩＩ　ｉ！Ｆノ４Ｖｒｌ！’ｌ’ｔｌｌｆ
ｆ求ノｌｉｊ囲ノ１ａｉｄ８、　ｔｌｌｉｉｌ・の内容
　　５ｊ肘Ｊ（のとおり特許１１’７求の範囲を別ＡＪ
（の通りＮＪ圧する。

「２．特許ｆ１′Ｉ求の１１ｉＩ′！囲（１）　　体液
中に目標細胞に対して特８４的ｌｔ放射性金属キレート
抱合モノクローン抗体の溶液を導入′１〜ることからな
り、そして前記放射性金１１」５がアルファー線放出体
であることを特徴とする、４１１１　ＩＩｌ！　ノ不Ｉ
ｉｌ！Ｊ　ノ処ｌｉ′を方法。

（２）　　放ＵＪ性金（・ＪｌがＢ１−２１１、Ｂ１−
２１２およびＢｊ、　−２１３からなる１洋から選（ず
れる、第１項記載の方法。

（３）放射性金（・ｊＳがＢｉ　−２１２である、第２
項記載の方法。

（４）　キレ−１・かジエチレントリアミン五ｌ’！ｉ
１．（’＋’ｔから誘導される、第１項記載の方法。

（５＋　　キレ−１・地合モノクローン抗１．Ｉｊをゾ
エナレントリアミン五酢酸のカルボキシ炭酸無水物とモ
ノクローン抗ｆ４Ｃどからつくる、第１項記載の方法。

（６）　　カルボキシ炭酸無水物をイソゾチルクロロホ
ルメートトジエチレントリアミン五酢ｒルのアミン墳と
からつくる、第５項記載、の方法。

（力　放射性金（」ムキレート抱合モノクローン抗トド
溶液がギｌ、−１・により結合された放射性金１・」８
の少なくとも約９４％を含み、抱合体が抗体の生物学的
活性おＪ：び特異性の少なくとも約８０％全保持する、
第１項記載の方θ（。

（８）　放射１＝’ｌｉ金Ｊ・」、ｌ　／ノ１Ｄ１−２
１２であり、金（」１キレ一ト抱合七ツクローン抗体溶
液がキト−１・により結合されｌこ放射性金１・」４の
少ｌｃ　＜ども約９４％を有し、抱合体７）ｓ抗ｔ、１
にの生物学的活性４５ｊ：び特異性の少ｊ（（ども約８
０φを保持する、第１項記載の方法。

（９）　　金（・」１キレ−１・抱合モノクＩＪ−ン＃
ｔ’＋：　Ｆ（’の製造法において、 （イ）キレ−１−地合モノクローン１ノ’ｘ：　Ｒｋ谷
ご用：ｔ’ｄ　Ｉ、、（ロ）採取されたキレ−１・抱Ｇ
−モノクローン抗雌および緩術剤の水溶液へ金（・Ｊｌ
地を添加１−ることにｊ：り金Ｊｖｉキｌ／　−１−抱
合抗ｆ４　ｋ形成ざ′ｕ１前記金属はアルファー線ｈｋ
出放射イＩミ金属とし、（ハ）ｆｌｆｌ　記ｆ７２　ｋ
Ｊｉ　キレ−１・Ｊ’１１１合モノクローンｈ１、体な
含む水溶液をクロマトグラフィーカラムに１ｆＩＪ　３
１Ｕさゼ、前ｄ己カラムはイオン遅ｒ１１ｆｔ　４υＩ
ＩｔＪ１１貌イイ゛ン交挟樹脂、賜イオン交換樹脂、′
８Ｊ：びキレートイオン交換（１１Ｊ脂からなる群から
選ばれる一つ以」二のｈｉを有し、最終層はヴイジング
　マトリックスＩ／）らひり、そして （ニ）前記カラムから、前記モノクローン抗体へ抱合さ
れた＋ｊｔＪ記キレー１・によりρ１ν【ｌ形成された
前記溶１α中に３まれる前記金属の少なくとも約８０係
を有する金目キレ−１−抱合抗１！！・の溶液を回収す
ることから′ｆ、ｒる、上記方法。

＋１１１１　　キレ−１・Ｊ’【！！！合モノクローン
抗ｆｉｌｃを、ジエチレントリアミン五酢醗のカルボキ
シ炭ｒソ無水物とモノクローン抗体の水溶液とを接触さ
せることによりつくる、第９項記載の方法。

圓　ジエチレントリアミン五酢ｒＩシのカルボキシＬｊ
ｊ　削／ｉｆ水物がジエチレントリアミン五酢Ｎ（アミ
ンＪ１．ｆとハｐギ酸エステルとの有機溶４（（中給−
２０’Ｏ未ｈシシの温度にお１−］る反応生成物である
、第１０４日記載の方法。

（１２）　　ハロヤ鼠のエステルがイソプチルク四ロホ
ルメ−１・である、第１１梢１１１３載の方法。

（１３１アルファー線放出放射′］り：金属がｎｌ−２
１１、Ｂ、１．−２１２およびＢ１．−２１３からなる
群から選ばれる、第９項記載の方法。

（１，１１アルファー線放出ｈ（射性金、ｌｒＳ　’り
’　Ｎ　ｕｉ　−２１１である、第１６項記１１ｉＱ、
の方法。

（１５１ｔ４合ｆ７にのキレ−１・部分と金ゎＳにより
！１７体形成された金属の少ｔｃくとも約９４％がアル
ファー新ｆｈｋ出放射性金田である、金１す１キレート
抱合モノクローン抗体の水溶液。

（１（ｉ）　　金属の少′ｆ、ｒくとも約９７矛が地合
１．１このキレート部分によりＡｉ９体形成された、第
１５項Ｈ１！桶の溶液。

（１′０　　抱合抗体がぞの活イ・１ミおよび特異’［
ｇｌ＋の少なくとも糸’１８ｎｑ６を１）ｉｊ　Ｊｉ７
　ｉ−る、シー１５項賄シ載の溶も（１８）　　地合’
ｈ’＋’、　ｊｉｌ、ノｒ’その活性および’）＆異”
性の少なくとも約９５φを保留する、第１５項記載の溶
液。

（１ω　抱合抗体がその活ｔｌ：　ａよび特異性の少な
くとも約９７条を保持１−る、兜１６　、！’ｅｔ記載
の溶液。

（’２＋１＋　　アルファー線放出放射Ｗ’に−＆属が
ｎｉ、−２１１、Ｅｌ−２１２、ｎｌ−２１３からなる
静ｈ）ら選ばれる１第１５項記載の溶？＋ｋ　。

（２ｊ）　　アルファー線放出放射性金属がＢｉ　−２
１２であるＸ′Ｍ２０項記載の溶液。」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１）　　体１０す４コに目標細胞に対して特異的な放
   射性金属ギＶ−）抱片七ツクローン抗体の溶液を導入す
   ることからなり、そして前記放射１生金属がアルファー
   線放出１本でめることを特徴とする。細胞の不調の処＋
   Ｉｔ、　Ｊｊ法。 （２）　　放射性金属がＢ１−２１１、Ｂｔ−２１２お
   よびＢ１−２１３かりなる群から選ば＃する。第１項記
   載の方法。 （３）　　放射性金属がＢ１−２１２である。第２項記
   載の方法。 １１）　　キレートがクエチレントリアミン五酢酸から
   誘導される。第１項記載の方法。 （５）　　キレート抱含モノクローン抗体なりエチレン
   トリアミン五酢［Ｉのカル・１ぐキシ炭酸無水物とモノ
   クローン抗体とからつくる。　ｄＸ１項記載の方法。 １６）　　カルボキシ炭酸無水物をイングチルクロロホ
   ルメートとクエチレントリアミン五酢酸のアミン埴とか
   らつくる。第５項記載の方法。 （力　放射性金属キレート抱合モノクローン抗体溶液が
   キレートにより結陰された放射性金属の少なくとも約９
   ４％を含み、抱合体が抗体の生物学的活性および特異性
   の少なくとも約８０％を保持する１Ｍ１項記載の方法。 （８）放射性金属がＢ１−２１２であり、金属ギレート
   抱片モノクローン抗体溶液がキレートにより結合された
   放射性金属の少なくとも約９４チを有し、抱合体が抗体
   の生物学的活性および特異性の少なくとも約８０チを保
   持する。第６項記載の方法。 （９）　　金属キレート抱合モノクローン抗体の製造法
   において、 （イ）キレート抱含モノクローン抗体を用意し、（ロ）
   採取されたキレート抱合モノクローン抗体および緩衝剤
   の水尋液へ金属塩を添加することにより金属キレート抱
   合抗体を形成させ、前記金属はアルファー線放出放射性
   金属とし、 ←９前記金属キレー１・抱合モノクローン抗体を含む水
   溶液をクロマトグラフィーカラムに通過させ、＋３ｕ　
   ｇ己カラムはイオン遅滞樹脂、函イオン交換樹脂、陽イ
   オン交換樹脂、１６よびキレートイオン交ｍ　４１ｔｊ
   脂からなる群から選ばれる一つ以上の層乞有し、最終層
   は丈イノング　マトリックスからなり、そし−Ｃ ←）前記カラムから、前記モノクローン抗体へ抱合され
   た［）「ｉ己キＶ−ｌ・により錯体形成された前記溶液
   中にゴまれる前記金属の少なくとも約８０饅を有する金
   属キレート抱自・抗体の溶液を回収することからなる。 ヒｉ己方を去。 ＋＋０１　　キレート抱合モノクローン抗体を、ジエチ
   レン）’Ｊ’／ミ／ｉｉ、酢酸のカル、ｌぐキシ炭酸無
   水物とモノクローン抗体の水ｄ液と乞接触させることに
   よりつくる。第９項記載の方法。 （１υ　ノエチレントリｆミン五酢酸のカルボキシ炭酸
   無水物がゾエテレントリアミ／五酢酸アミン塩と−・ロ
   ギ酵エステルとの有機溶媒中約−２０’０未溝の温度に
   Ｍげイ）反応生成物である。第１０項記載の方法。 ＋ＩＪ　　ハロギ酸のエステルがインプナルクロげホル
   メートである。Ｍ１１ｒｊ４記載の方法。 （ｆａｔ　　アルファー線放出放射性金属がＢ１−２１
   １．５ｉ−７１２石よびｂｌ−２１６からなる群から選
   ばれる。第９項記載の方法。 （１荀　アルファー線放出放射性金属が、Ｂ１−２１１
   である。第１６項記載の方法。 （Ｉ５）　　抱訃体のキレート部分と金属により錯体形
   成された金属の少なくとも約９４俤がアルファー線放出
   放射性釡属ごある。金属キレート抱合モノクローン抗体
   の水イｄ液。 （１６）　　金属の少なくとも約９７％が抱合体のキレ
   ート部分により錯体ｉｇ成された。第１５項記載の溶液
   。 （１′６　　抱合抗体がその活性および特異性の少なく
   とも約８０％馨保′ｄｒる。第１５項記載の溶液。 （１ω　抱合抗体、Ｊ′−その活性および特異性の少な
   くとも約９５斧を・保ｄ−ｒる。ｉＪｌ　５項記載の４
   故。 ｔｌｌ　　抱合ｖｒ、不が５の后・注および特異性の少
   なくとも約９７％を保持する。第１６項記載の溶液。 （２１アルファー線放出放射性金属がＢ１−２１１．５
   ｉ−２１２、Ｂニー２１３からなる解から選ばれる。 第１５項記載の方法。 ＣＤ　アルファー線放出放射殴金属がＢ１−２１２−’
   （−ある、第２０項記載の方法。