NL8204108A

NL8204108A - In beeld brengen van tumor met radioactief gemerkte monoclonale antilichamen.

Info

Publication number: NL8204108A
Application number: NL8204108A
Authority: NL
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1981-10-27
Filing date: 1982-10-25
Publication date: 1983-05-16
Also published as: NO823530L; ZA827806B; LU84441A1; ES529310A0; JPS58135820A; SE8206073L; IT8223932A0; DK474182A; DK164682B; ES8505482A1; IT1153857B; FI823633L; DE3239410C2; FI82379B; BE894829A; DK164682C; JPH0564130B2; ES8404857A1; FR2515046A1; DE3239410A1

Description

S 5830-2 * - '

V

P & c

Korte aanduiding: In beeld brengen van tumor met radioactief gemerkte mono-clonale antilichamen.

De uitvinding heeft betrekking op het detecteren van tumoren. Volgens een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op monoclonale antilichamen, die gemerkt zijn met radionucliden.

Men heeft reeds lang gezocht naar een betrouwbare techniek voor het 5 specifiek op de plaats detecteren van tumoren. Er zijn werkwijzen beschre- ven voor het detecteren van bijvoorbeeld carcinoembryonaal antigeen (CEA), dat verband houdt met menselijk carcinoom, dat in de bloedsomloop circu- leert. Zie de Amerikaanse octrooischriften 3.663.684 en 3.697.638. Deze methoden kunnen uiteraard niet worden toegepast om de plaats van de tumor 10 te bepalen. Meer recent heeft men voorgesteld antilichamen, die met radio- actieve jodiumisotopen gemerkt zijn, te gebruiken om een antigene stof te detecteren, die verband houdt met een tumor. Zo beschrijft het Amerikaanse octrooischrift 3.927.193 een werkwijze, waarbij antilichamen voor CEA wor- 125 131 den gebruikt, die gemerkt zijn met I en I. Volgens dat octrooischrift 15 werd bij proeven met mannelijke Syrische hamsters, waarin menselijk zegel-ringcelcarcinoom werd ingebracht, door injectie van gemerkt gijte-anti-CEA, gevolgd door onderzoek van de organen van de dieren, aangetoond dat het radioisotoop in de tumor gelokaliseerd was. Derhalve werd voorgesteld, dat de plaats van een tumor bij een mens bepaald kon worden door toediening in 20 vivo van een parenterale oplossing van het antilichaam, gevolgd door foto-aftasting van de gastheer.

De daadwerkelijke toepassing van met radioactief jodium gemerkte antilichamen heeft niet voldaan aan de verwachtingen, die door het vroegere onderzoek gewekt waxen. Zo vermelden bijvoorbeeld Goldenberg c.s., N. Eng.

25 J. Med., 298, 1384-1388 (1978) enig succes in 1978 bij het aftasten van mensen met anti-CEA, dat met radioactief jodium gemerkt was. Wegens de resterende achtergrond-radioactiviteit was het opgegeven beperkte succes echter afhankelijk vein de toepassing van aftrekmethoden. Mach c.s. vermeld-den in N. Eng. J. Med., 303, 5-10 (1980) zelfs minder succes en bepaalden 30 dat slechts 0,1 % van de toegediende dosis gelokaliseerd werd in de tumor.

In geselecteerde gevallen was echter het in beeld brengen van de tumor nog mogelijk.

Het is bekend, dat de op grond van affiniteit uitgevoerde zuivering • van heterologe antisera ter verkrijging van de antilichamen, die toegepast 35 werden bij de bekende werkwijzen voor het in beeld brengen van een tumor, gewoonlijk tot het verlies leidt van antilichaam met grote affiniteit en dat de verkregen antilichamen, die een mengsel zijn van specifieke anti- 8204108 » * - 2 - lichamen voor verschillende determinanten op het antigeen, grotendeels ge- vormd worden door antilichamen met een geringe affiniteit en antilichamen, die niet-specifieke reacties geven. Anderzijds kunnen monoclonale anti- .

lichamen worden geselecteerd, die een grote affiniteit vertonen voor geko- 5 zen plaatsen op het antigeen en een geringe niet-specifieke binding. Ver- rassenderwijs werd echter gevonden, dat monoclonale antilichamen voor tumorantigenen, die volgens op zichzelf bekende methoden gemerkt zijn met radioisotopen van jodium, nog een slechte lokalisatie bij de plaats van de tumor vertonen ondanks het feit, dat in vitro immunoreactiviteit kan worden 10 aangetoond. Dit kan een gevolg zijn en is ook vermoedelijk een gevolg van het verlies van radioactief jodium door het gemerkte antilichaam. Derhalve bestaat er nog steeds behoefte aan een betrouwbare methode voor het in vivo detecteren van de juiste plaats van een tumor.

Volgens de uitvinding wordt een monoclonaal antilichaam of antilichaam- 15 fragment voor een tumor-antigeen direkt met een metalliek radionuclide of met een aan een chelaat gebonden radionuclide, bijvoorbeeld aan DTPA ge-111 bonden In, gemerkt door een cheleringsmiddel aan het antilichaam te conjugeren, gevolgd door vorming van een complex tussen het cheleringsmiddel en radionuclide. Wanneer het verkregen gemerkte antilichaam of fragment 20 daarvan geinjecteerd wordt in een gastheer, die een tumor draagt, wordt het snel en met grote specifiteit in de tumor zelf gelokaliseerd. In sommige gevallen kan tevens lokalisatie in verafgelegen metastasen optreden, zodat verspreiding van de tumor wordt aangetoond. De plaats van de tumor kan ge-detecteerd worden met foto-aftastingsmethoden. Men kan ook mengsels van ge-25 merkte monoclonale antilichamen gebruiken.

De uitvinding beoogt derhalve monoclonale antilichamen voor met tumor verband houdende antigenen te verkrijgen, die gemerkt zijn met metallieke radionucliden.

Verder beoogt de uitvinding een verbeterde werkwijze te verschaffen 30 voor het in beeld brengen van tumoren in een geinfecteerde gastheer.

Het bereiken van deze en verwante doeleinden zal duidelijke worden door beschouwing van de bijgevoegde tekening en de onderstaande nadere be-schrijving van de uitvinding.

Ill

Pig. 1 is een groep grafieken, die de verdeling in weefsel van In 35 en ^**1 aantoont in vergelijking met de verdeling van ^Ga als functie van de tijd nadat naakte muizen, die geinfecteerd zijn met menselijke dikke- 111 darmkanker, geinjecteerd zijn met anti-CEA, dat gemerkt is met In en 125 67 I en Ga-citraat.

Fig. 2 is een groep grafieken, die de door naakte muizen uitgescheiden 8204108 ί *·, - 3 - ill 125 67 hoeveelheid In en I en Ga bij toenemende tijd weergeeft na injec- 111 125 67 tie van met In en I gemerkt anti-CEA en van Ga-citraat.

Fig. 3 is een groep grafieken, die de verdeling in weefsels aantoont 111 125 , , ... ϊ 111 van In en I xn naakte muizen 48 uren na injectxe van het met In en 125 111 125 5 i gemerkte anti-CEA in vergelijking met In citraat en met I gemerkt menselijk albumine.

Fig. 4 is een groep grafieken, die de tumor/weefse1verhoudingen weer- 111 125 67 111 geeft van . In en I in vergelijking met Ga na injectie van met In 125 67 en I gemerkt anti-CEA en van Ga-citraat in naakte muizen, als een 10 functie van de tijd.

Zoals reeds vermeld, worden volgens de uitvinding monoclonale antilichamen voor met tumor verband houdende antigenen of fragmenten van deze monoclonale lichamen direkt met metallieke radionucliden of met aan chelaat gebonden radionucliden gemerkt. De monoclonale antilichamen, die geschikt 15 zijn bij de uitvinding, zijn produkten van de hydridoomtechnologie, die nu goed bekend is. Zo kan bijvoorbeeld verwezen worden naar het oorspronkelijke werk van Milstein en Kohler, gerapporteerd in Nature, 256, 495-497 (1975).

In hoofdzaak komt de werkwijze hierop neer, dat men een muis of ander geschikt dier injecteert met een immunogeen, in dit geval met een met tumor 20 verband houdend antigeen, zoals CEA. De geimmuniseerde muis wordt vervol-gens opgeofferd en uit de milt daarvan worden cellen genomen en gefuseerd met myeloomcellen, zodat men hybridecellen verkrijgt, die "hybridomen" ge-noemd worden en die in vitro gereproduceerd kunnen worden. De populatie van cellen producerende antilichamen wordt selectief gekweekt en onder-25 zocht om afzonderlijke klonen te isoleren, waarvan elk edn enkele anti-lichaamsoort afscheidt, die specifiek is voor een bepaald gebied ("determinant") op het oppervlak van het antigeenmolecuul.

De afzonderlijke klonen kunnen verder geselecteerd worden om die te vinden, welke antilichamen produceren met de grootste affiniteit voor het 30 antigeen en die een geringe niet-specifieke binding vertonen. Het voor radioactief merken gekozen antilichaam (gewoonlijk uit de asciten geiso-leerd) wordt tot reactie gebracht met het metallieke radionuclide of ge-conjugeerd met een geschikt cheleringsmiddel, dat vervolgens wordt toege-past om het radionuclide te binden. Het cheleringsmiddel kan aan het anti-35 lichaam gebonden worden onder toepassing van een grote verscheidenheid van werkwijzen. Aangezien het antilichaam in het algemeen een polypeptide is, kan men een cheleringsmiddel gebruiken met een reactieve groep van de soort, waarvan bekend is dat hij geschikt is voor het invoeren van een groep aan een eiwithoudend substraat. Onder de geschikte reactieve groepen zijn die 8204108 < * - 4 - met de formul.es (1) tot en met (12) van het formuleblad te noemen, waarin Ch de rest van het cheleringsmiddel voorstelt.

Geschikte cheleringsmiddelen omvatten een grote verscheidenheid van veeltandige cheleringsmiddelen, waarvan de liganden een complex vormen met 5 metallieke radionucliden. Onder dergelijke middelen zi.jn te noemen de poly-aminocarbonzuren met de formule (13), waarin x de waarde 0 heeft of een geheel getal voorstelt (x is bij voorkeur 0 of 1), y het getal 1 of 2 is (y = 1 verdient de voorkeur) en z een geheel getal is met een waarde van 1-7 (z is bij voorkeur 1 of 7), terwijl R waterstof of een groep, via 10 welke het cheleringsmiddel gecomhineerd is met een antilichaam, of een groep, die de bindingsconstante van het cheleringsmiddel voor het radionuclide beinvloedt, voorstelt. Onder de geschikte groepen R is in het bij-zonder de groep met de formule (14) te noemen, waarin A de groep voorstelt, waardoor de conjugatie tot stand wordt gebracht. Zo kan A bijvoorbeeld 15 “N2+ zijn, die verkregen wordt door diazotering van de groep -N^, die zelf weer verkregen kan worden door reductie van een nitrogroep (-NO^), welke op zijn beurt weer verkregen kan worden door nitrering van de fenylkern.

De groep A kan ook een groep met de formule (15) zijn, die verkregen wordt door acetylering van de groep -NH^ volgens bekende methoden, waarbij L een 20 uittredende groep is, die tijdens de conjugatie vervangen wordt, zoals een halogeenatoom, bijvoorbeeld Cl, Br of I (Br verdient de voorkeur).

In andere gevallen kan R -CH^ of -CI^CgH^OCE^a^H zijn.

In het geval van de polyaminocarbonzuren kan de conjugatie tot stand worden gebracht via de carboxylgroep zelf doordat bijvoorbeeld een zuur-25 anhydride als tussenprodukt wordt gevormd, zoals vermeld door Krejcarek en Tucker, Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 (1977).

Onder de polyaminocarbonzuren verdienen de polyaminoazijnzuren thans de voorkeur. Specifieke voorbeelden van polyaminocarbonzuren, die gebruikt kunnen worden, zijn ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en derivaten daar-30 van, zoals diethyleentriaminepentaazijnzuur (DTPA), p.broomaceetamidofenyl (ethyleendinitrolotetraazijn)zuur en 1-(p.aminofenyl)ethyleendiaminetetraazijnzuur, waarvan de laatste in een diazoniumzout wordt omgezet om conjugate mogelijk te maken. Onder deze cheleringsmiddelen wordt thans de voorkeur gegeven aan DTPA.

35 Van de andere geschikte cheleringsmiddelen zijn te noemen polyamino- (alkyleenfosfor)zuren, in het bijzonder die met de formule (16), waarin x, y, z en R de bovengegeven betekenissen hebben. Bij voorkeur heeft x de waarde 0 of 1, y = 1 en z = 1. Als specifieke polyamino(methyleenfosfor)-zuren (y = 1) zijn te noemen ethyleendiaminetetra(methyleenfosfor)zuur, 8204108 ϊ «.

- 5 - hexamethyleendiaminetetra(methyleenfosfor)zuur en diethyleentriaminepenta-(methyleenfosfor)zuur, die toegepast kunnen worden bij de uitvinding.

Verdere cheleringsmiddelen zijn de polyaminen met de formule (17), waarin X, Z en R de bovengegeven betekenissen hebben.

5 Een andere klasse van cheleringsmiddelen wordt gevormd door die met de formule (18), waarin R de bovengegeven betekenis heeft, echter met dit verschil, dat als R geen groep is, die conjugatie mogelijk maakt, ten min-ste een van de fenolgroepen een groep is met de formule (19), waarin A de bovengegeven betekenis heeft.

10 De porfyrinen vormen een andere bijzonder waardevolle klasse van cheleringsmiddelen. Die, welke volgens de uitvinding geschikt zijn, omvat-ten synthetische en natuurlijk voorkomende porfyrinen, waaronder de porfyrinen met de formule (20), waarin R de bovengegeven betekenis heeft en Rj waterstof of een substituent, die als deel van een natuurlijk voorkomende 15 porfyrinemolecuul voorkomt of een groep, die tijdens synthese wordt inge-voerd, bijvoorbeeld om conjugatie mogelijk te maken of om de bindingscon-stante van het porfyrine te beinvloeden. De voorkeur verdienende porfyrinen zijn tetrafenylporfyrine (R = fenyl, R^ = H) of tetrapyridylporfyrine (R = 4-pyridyl, R^ - H). Een of meer van de fenyl- of pyridylgroepen is 20 gesubstitueerd door -NH^ of een groep met de formule (15) , waarin L de bovengegeven betekenis heeft, of door andere groepen, ten einde conjugatie met het antilichaam mogelijk te maken. De substitutie bevindt zich gewoon-lijk op de paraplaats voor een fenylgroep en op de plaats 2 of 4 van een pyridylgroep.

25 Andere cheleringsmiddelen, die volgens de uitvinding kunnen worden toegepast, zijn de kroonethers en hun cryptand-analoga met de algemene for-mules (21) en (22), waarin R de bovengegeven betekenis heeft. In plaats daarvan kan de groep, die wordt toegepast om conjugatie mogelijk te maken, direkt worden opgenomen in de kroonether of cryptandstructuur, zoals aan-30 gegeven in de formule (23), waarin A de bovengegeven betekenis heeft.

Derivaten van desferrioxamine B kunnen ook als cheleringsmiddel ge-bruikt worden. Deze bezitten de formule (24), waarin R de bovengegeven betekenis heeft.

Derivaten van enterobactine zijn ook geschikte cheleringsmiddelen. De 35 voorkeur wordt gegeven aan die met de formule (25), waarin A de bovengegeven betekenis heeft.

Carbocyclische analoga van enterobactine zijn eveneens geschikt. Hier-onder zijn te noemen verbindingen met de formule (26), waarin A de bovengegeven betekenis heeft.

8204108 V ΐ - 6 -

Andere carbocyclische systemen, die geschikt zijn als cheleringsmid-delen zijn bijvoorbeeld die met de formule (27) en de overeenkomstige ani-liden, waarin A de bovengegeven betekenis heeft.

Het is voor de deskundigen duidelijk, dat de voor enterobactine en 5 carbocyclische analoga weergegeven ring verder gesubstitueerd kan zijn door substituenten, die het vermogen van deze verbindingen voor het binden van metallieke radionucliden niet in belangrijke mate achteruit doen gaan en dat substituenten kunnen worden ingevoerd ten einde plaatsen voor conjugate aan het antilichaam te verschaffen.

10 Nog een andere groep van geschikte cheleringsmiddelen zijn de siloxanen met de formule (28), waarin R de bovengegeven betekenis heeft/ behalve dat als R geen groep is, die conjugate mogelijk maakt, ten minste een van de catecholgroepen een groep is met de formule (29), waarin A de bovengegeven betekenis heeft.

15 Het zal duidelijk zijn, dat de bovenstaande lijst van cheleringsmid delen niet uitputtend is, maar slechts illustratef is voor geschikte cheleringsmiddelen.

Het direkt merken van antlichamen met metallieke radionucliden kan worden uitgevoerd onder toepassing van bekende methoden voor het invoeren 20 van een metaalion aan een antilichaam door hechtng daarvan aan een plaats op het antilichaam zelf. In sommige gevallen kan het metallieke radionuclide worden opgenomen door het antilichaam, gewoonlijk in oplossing, bloot te stellen aan het radionuclide in zijn juiste oxidatietoestand. Zo omvat bijvoorbeeld een methode, die thans de voorkeur verdient, de direkte 25 metallering van een antlichaam met 103Ru+3 door het antlichaam in contact te brengen met een geschikt rutheniumzout, bijvoorbeeld rutheniumtrichlo-ride, in een gebufferde oplossing. Als geschikte buffermiddelen zijn hier-bij te noemen kaliumacetaat, natriumbicarbonaat en trihydroxyethylamine (Tris) .

30 Een andere geschikte methode omvat de direkte metallering van het anti lichaam met chroom. Chroom-radionucliden kunnen worden ingevoerd door een chromaatzout van het radionuclide, bijvoorbeeld natrium- of kaliumchromaat, te mengen met het antilichaam in de oplossing. ·

In andere omstandigheden kan het antilichaam eerst chemisch gewijzigd 35 worden om het radionuclide te kunnen aannemen en er daarna mee worden om-gezet. Zo kunnen bijvoorbeeld disulfidegroepen in het antilichaam geredu-ceerd worden, gevolgd door de vorming van een -S-M of -S-M-S groep, waar-bij M het radionuclide is. Disulfidegroepen kunnen bijvoorbeeld gereduceerd worden met behulp van dithiotreitol, waarbij eerst een thiolgroep gevormd 8204108 - 7 - wordt, die men kan laten reageren met geschikte metaalionen, bijvoorbeeld die van kwik, zilver, zink, lood of cadmium, in hun oxide- of zoutvorm.

Radionucliden, die volgens de uitvinding toegepast kunnen worden, zijn die, welke stabiele complexen vormen met veeltandige cheleringsmiddelen of 5 zich onder geschikte omstandigheden direkt met het antilichaam verbinden.

De radionucliden worden zodanig gekozen, dat zij een halfwaardetijd en andere stralingseigenschappen bezitten, die een veilige afvoer en veilig invoeren bij mensen mogelijk maken. Een groot aantal radionucliden is onder- zocht voor toepassing bij mensen, die geschikt kunnen zijn bij de onderha- 10 vige uitvinding. Deze kunnen als volgt gegroepeerd worden:

De cheleringsmiddelen van het porfyrinetype (formule 20), kroonether- type (formule 21) en cryptandetype (formule 22) zijn het meest geschikt voor het binden van radionucliden met een oxidatietoestand van +2. Zo 57 57 105 57 52 vormt men bijvoorbeeld 195m^ , Ni, Co, Ag, Cu en Mn stabiele 15 complexen in de oxidatiestand +2.

De cheleringsmiddelen met de formules (13), (16), (17), (18), (20) en (25)-(28) vormen stabiele complexen met radionucliden met een oxidatietoestand van +3. Als radionucliden, die stabiele complexen in de oxidatietoe- 52 111 113m 99m 68„ 67„ stand +3 vormen, zijn te noemen: Fe, In, In, tc, Ga, Ga, 20 16V 57co. «V 16<W 146sd, 15V 95°kj, 103eu, 97ru, 9V l01m*h 201 en Tl. De cheleringsmiddelen met catecholgroepen volgens de formule (25)-(28) zijn in het bijzonder geschikt voor toepassing met radionucliden, die sterk mobiel zijn in vivo, in het bijzonder radionucliden van ijzer, , 52* zoals Fe.

25 Als radionucliden, die direkt aan antilichamen gebonden kunnen worden, ..., . 2Q3_ 197_ 105, 203„ 97„ 103D 99_.

zijn de volgende te noemen: Hg, Hg, Ag, Pb, Ru, Ru, Rh, 101m_. 48_

Rh en Cr.

De meest geschikte radionucliden zijn gammastralers met een energie tussen 100 en 400 keV en met halfwaardetijden van circa 5 uren tot 5 dagen.

30 Door oorzaken, die thans niet volledig begrepen worden, bieden bepaal- de individuele monoclonale antilichamen voor tumerantigenen weerstand tegen direkte metallering. Zodoende is het voor het opnemen van het radioisotoop langs deze weg nodig zorgvuldig specifieke antilichamen te kiezen. Daarom verdient het thans de voorkeur een radionuclide aan een antilichaam te 35 binden onder toepassing van de flexibele benadering, waarbij men eerste een cheleringsmiddel met het antilichaam combineert en daarna een complex vormt met een radionuclide. In dit opzicht verdient het in het bijzonder 111 de voorkeur In (T h = 2,8 dagen) als radionuclide te gebruiken in com-binatie met DTPA als cheleringsmiddel.

8204108 - 8 -

De werkwijze volgens de uitvinding kan toegepast worden voor het detec-teren van tumoren onder toepassing van monoclonale antilichamen voor met tumor verband houdende antigenen in het algemeen. Behalve CEA kunnen bij-voorbeeld met melanoom verband houdende antigenen, α-fetoproteine, ferri-5 tine, menselijk choriogonadotropine, zinkglycinaat-merkstof en prostatisch zuurfisfatase (PAP) als immunogenen gebruikt worden om de produktie van de gewenste monoclonale antilichamen, die hierboven beschreven zijn, te sti-muleren. Bij de daadwerkelijke toepassing wordt het gemerkte antilichaam in een geschikte oplossing voor parenterale toediening in de patient ge-10 injecteerd. Nadat voldoende tijd verlopen is, wordt de patient aan een foto-aftasting onderworpen om een eventuele plaats van gelokaliseerde straling te detecteren, die op een tumor en/of een van zijn metastasen wijst.

De onderstaande experimenten, die werden uitgevoerd met monoclonaal 125 111 15 antilichaam voor CEA, gemerkt met I en In, tonen het voordeel aan van de toepassing van monoclonale antilichamen, die gemerkt zijn met door chelaat gebonden radionucliden, voor het in beeld brengen van tumor volgens de uitvinding, in vergelijking met werkwijzen, die berusten op met jodium gemerkte antilichamen.

20 1. Bereiding van radioactief gemerkt anti-CEA

Monovlonaal anti-CEA, verkrijgbaar bij Hybritech, Inc., La Jolla, Ca., 125 werd gemerkt met I onder toepassing van de methode van Bolton en Hunter, Biochem. J. 133, 529-39 (1973) . Het produkt werd door een Sephadex G-25-kolom gevoerd en het uiteindelijke materiaal bevatte minder dan 0,5 % vrij 25 jodide. De binding van het radioactief gemerkte monoclonale antilichaam bedroeg meer dan 80 % met paarden-antimuis-antilichaam, gebonden aan sefarose en meer dan 75 % met aan sefarose gebonden CEA.

Ill

Hetzelfde monoclonale anti-CEA werd gemerkt met In onder toepassing van geconjugeerd DTPA als cheleringsmiddel volgens de methode van 30 Krejcarek en Tucker, Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 (1977). Het reactieprodukt werd gezuiverd door het door een

Sephadex G-75-kolom te voeren. De binding van antigeen was vergelijkbaar 125 met die, welke vertoond werd door het met I gemerkte antilichaam. De voor het merken toegepaste werkwijze had geen invloed op de affiniteit-35 constante, Ka, voor het antilichaam ten opzichte van ongecheleerd antilichaam, zoals bepaald werd door tetratie met CEA.

De stabiliteiten in vitro van de gemerkt anti-CEA-antilichamen werden bepaald door een deel van het materiaal gedurende 72 uren bij 37°C te in-cuberen in een voor parenterale toediening geschikte oplossing, die steriele 8204108 ·* * - 9 - nonnale zoutoplossing, U.S.P., bevatte en chromatografisch het vrije radionuclide te bepalen. De oplossingen van antilichaam werden als vlekken op-gebracht op stroken van Baker-aluminiumoxide IB en ontwikkeld in 50 % wate-rige aceton. Het aan eiwit gebonden radionuclide blijft bij de oorsprong, 5 terwijl vrij radionuclide migreert. Na de incubatietijd vertoonde het met radioactief jodium gemerkte materiaal minder dan 3 % activiteit, die aan- wezig was als vrij jodide. Door opslag bij 4°C werd dit met 50 % vermin- 111 derd. Onder dezelfde omstandigheden vertoonde het In anti-CEA een ver-gelijkbare stabiliteit.

10 2. Verdelingsonderzoeken bij naakte muizen

Verdelingsweefselonderzoek van het radioactief gemerkte monoclonale anti-CEA van muizen werd uitgevoerd met naakte muizen, die 0,5 - 1,0 g menselijke dikkedarmtumoren droegen. De muizen liepen in gewicht uiteen van 17 tot 28 g (gemiddelde circa 23 g). De tumoren werden geinitieerd 15 door subcutane injectie van een fijngehakt materiaal, dat CEA producerende menselijke cellen van dikkedarm-adenocarcinoom bevatte. Verdelingsonderzoeken werden 3 weken later uitgevoerd. Er werden twee proeven uitgevoerd.

Bij de eerste werden 19 dieren in 4 groepen van 4-6 dieren verdeeld en deze werden intraveneus (IV) geinjecteerd met 0,1 ml van een steriele nor- 125 20 male U.S.P.-zoutoplossing, die 0,5 microcurie I anti-CEA antilichaam 67 (circa 0,3 yug antilichaam) en als controle dragervrij Ga-citraat, een bekend, niet-specifiek beeldvormingsmiddel voor menselijke dikkedarmtumor bevatte. De injecties werden zonder verdoving uitgevoerd onder toepassing van een Hamilton-injectiespuit van 100 pi om nauwkeurigheid te verzekeren.

25 Dieren, waarbij de dosis gedeeltelijk in de staart infiltreerde, werden uit het onderzoek verwijderd. Na de injectie werden de muizen in steriele metabolismekooien geplaatst, met een verhoogde vloer van draadgaas om de urine en faeces te kunnen opvangen. Onder de vloer was steriel gaas van 4 x 4 op zodanige wijze als vulling aangebracht, dat de dieren erop konden 30 knagen. De muizen, die bij 4,4°C in een schone ruimte met steriel voedsel en water ad libitum werden gehouden, werden in groepen opgeofferd en wel 4, 24, 48 en 72 uren na de injectie van de tracer.

De muizen werden met ether verdoofd en er werden bloedmonsters ver-kregen door direkte hartpunctie. De muizen werden daarna opgeofferd door 35 dislocatie van de nek. Tijdens de daaropvolgende ontleding werden de tumor, lever, nieren, spieren, hart, longen, dij en milt verwijderd, tweemaal in water en eenmaal in 10 % formaline gewassen, met vloeipapier drooggebet en in vochtige toestand op een analytische balans gewogen. De intacte maag en ingewanden werden eveneens verwijderd en aan telling onderworpen. Voor de 8204108

+ V

- 10 - berekeningen van de totale opnamen door de organen werd aangenomen, dat bloed, spieren en beenderen resp. 7 %, 40 % en 10 % van het totale lichaams- gewicht uitmaakten. De andere organen werden in het geheel gewogen. De telling van de radioactiviteit werd uitgevoerd in een automatische gamma- 5 kokerteller ("well .counter") waarvan de vesters waren ingesteld over de 125 67 27-35 keV fotopiek van I en de 93 keV fotopiek van Ga. De teller was zo geprogrammeerd dat hij na 10 minuten of 1 moljoen tellingen niet verder werkte, ten einde statistische significantie te verkrijgen voor de monsters met de laagste activiteitsniveaus, Correcties voor achtergrondstraling en 10 reciproke bijdrage van isotopenactiviteit tussen de instellingen van het venster werden uitgevoerd door geprepareerde bronnen te gebruiken en simultane vergelijkingen op te lossen. De activiteit in de monsters werd daarna met standaards van het geinjecteerde materiaal vergeleken, waarbij de resultaten werden uitgedrukt in procent geinjecteerde dosis per gram en 15 procent geinjecteerde dosis per orgaan. De verhoudingen tussen tumor en weefsel werden berekend uit de gegevens over procent dosis per gram. De activiteit in de darm/ urine en faeces werd berekend als procent van de totaal geinjecteerde dosis.

Bij het tweede onderzoek werden 37 naakte muizen, die tumoren droegen, 20 die gekweekt waren uit dezelfde menselijke dikkedarmkanker in vijf groepen van 7-8 dieren verdeeld. Een groep diende als controle en werd tegelijker- 125 tijd IV geinjecteerd met 1 microcurie van met I gemerkt menselijk serum- 111 albumine (0,01 mg HSA) en 3 microcurie dragervrij In-citraat (0,01 mg citraat) en 48 uren na de injectie opgeofferd. In de resterende vier groe- 25 pen ontvingen de dieren gelijktijdige injecties van 3 microcurie van met 111

In gemerkt anti-CEA (1,5 p.g antilichaam) en 5 microcurie dragervrij 67

Ga-citraat, De groepen werden na resp. 4, 24, 48 en 72 uren opgeofferd.

Ontleding van de weefsels, prepareren van de monsters voor radioactiviteits- onderzoek, de telmethoden en berekeningen werden uitgevoerd als boven belli 30 schreven. In het geval van In werd de spectrometer zo ingesteld, dat de 247 keV fotopiek gemeten werd met behulp van een 40 keV venster (210-250 keV), 67 terwijl Ga geteld werd met een 30 keV venster, dat de 93 keV fotopiek overlapte. Deze instellingen leidden tot minder dan 10 % reciproke bijdra-gen van radioactiviteit.

Ill 35 Zoals weergegeven in fig. 1, namen de concentraties van In anti-CEA, die in de tumor gelokaliseerd werden, steeds toe over de gehele tijdschaal van het experiment. 23 % van de geinjecteerde dosis was na 72 uren opge-hoopt en de resultaten wijzen erop, dat dit niveau nog hoger zou zijn ge-worden, als men getracht had de monsters later te nemen. Daarentegen nam 8204108 - 11 - de bloedspiegel tijdens de metingstijd af. De lever vertoonde een snelle opname na 4 uren, gevolgd door een periode van weinig verandering, en daar- na toename tot 72 uren. De andere weefsels vertoonden weinig variaties over het bestudeerde tijdsverloop.

67 5 Het gehalte van Ga in de tumor bleef tamelijk constant tijdens het 111 verloop van de proef en bedroeg na 72 uren ongeveer 1/4 van dat van In 67 anti-CEA. De bloedspiegel van Ga nam steeds af, terwijl de concentratie in de lever een patroon vormde, dat ongeveer overeenkwam met dat van het met Indium gemerkte lichaam. De concentratie van ^^Ga in de spier nam 10 af tot 48 uren, en ging daaraa vlak verlopen, terwijl de concentratie in de beenderen gedurende de gehele periode dezelfde bleef.

De hoeveelheid jodide in de tumor vertoonde een piek na 4 uren en was aanvankelijk wat groter dan de hoeveelheden ^11Indium, waama hij op on- regelmatige wijze afnam gedurende de gehele rest van de proef en na 72 uren 111 15 slechts 1/10 bedroeg van de hoeveelheid In. Op dat tijdstip verscheen 67 125 tweemaal zoveel ea in de tumor als I. De tellingen van I in alle weefsels namen snel af vanaf hun maxima na 4 uren en in sommige gevallen bereikten ze tegen 48 uren achtergrondniveau.

De uitscheidingsgegevens (fig. 2) vertonen een regelmatige toename 111 20 van In in de urine tussen 24 en 72 uren, waarbij een maximum van 14 % 111 van de geinjecteerde dosis bereikt werd. De concentratie van In in de faeces bleef tamelijk constant bij 24 en 48 uren en nam daarna toe tot 17 % na 72 uren, terwijl de hoeveelheid in de darmen relatief constant bleef over het gehele tijdsverloop en nooit 5 % van de dosis overschreed.

67 25 Het uitscheidingspatroon van Ga kwam enigszins overeen met dat van 111

In, maar vertoonde meer tracer in de darmen en faeces dan werd waarge-111 nomen voor In en minder in de urine.

125

Bijna 60 % van de radioactiviteit van I werd in de urine uitge- scheiden tijdens de eerste 24 uren en na 48 uren was 75 % uitgescheiden.

125 30 Nog 5 % van de I ging verloren in de faeces. Zodoende was na 72 uren 125 circa 80 % van het oorspronkelijk geinjecteerde I door het dier uitge- 125 scheiden. Chromatografie van het I in de urine toonde aan, dat het grootste deel daarvan vrij jodide was, terwijl een tweede species waar-125 schijnlijk vrij I voorstelde, dat tot een complex gevormd was met iets 35 anders dan een eiwit.

Ill

Fig. 3 toont de gegevens voor met In gemerkt anti-CEA na 48 uren Hi 125 111 en vergelijkt dit met indium-citraat en iHSA. Het In-citraat werd als controle gebruikt voor eventueel Indium, dat uit het antilichaam ge- 125 dissocieerd zou kunnen zijn, terwijl het IHSA gebruikt werd als een 8204108

* V

- 12 -

HI

niet-specifieke eiwitcontrole. Het met In gemerkte anti-CEA vertoonde 111 een verdelingspatroon, dat sterk verschilde van het In-citraat, en zich met een factor 10 doelmatiger in de tumor concentreerde. De opname van de beide tracers door de andere weefsels was eveneens verschillend. De tumor-125 111 5 concentratie van IHSA bedroeg 20 % van die van In anti-CEA, maar was 125 125 nog 5 % groter dan die van I anti-CEA. De verdeling van IHSA in het 111 niet-tumorweefsel verschilt ook sterk van die van het met In gemerkte 125 anti-CEA-produkt. Het is in het bijzonder significant, dat IHSA, dat lang beschouwd werd als een stabiel gejodeerd eiwit, bijna 60 % uitschei- 10 ding vertoonde (43 % in de urine) na 48 uren, wat opmerkenswaardig consis- 125 tent is met de bovenbesproken constatering, dat I anti-CEA ook in urine gevonden werd. De fractie in de urine is vermoedelijk vrij jodide.

Ill

De tumor/weefsel-verhoudingen (fig. 4) tonen aan, dat In anti-CEA 67 superieur is aan Ga voor wat betreft alle weefsels, behalve voor bloed, 67 15 waarvoor hij in dat geval ongeveer gelijk is aan Ga. De verhoudingen van 125 I anti-CEA zijn schijnbaar te prefereren boven die, welke in sommige 111 67 weefsels vertoond worden door In en Ga, maar zij zijn misleidend, aan- 125 gezien zij een gevolg zijn van lage I-niveaus in de normale weefsels in plaats van door lokalisatie in de tumor.

125 20 Met het oog op de bovengenoemde proeven is I anti-CEA duidelijk ongeschikt als tumor-lokaliserend middel. De snelle en intensieve dehalogenering vermindert de tracerconcentratie in de tumor en verhoogt de ach-tergrondstraling van het bloed, waardoor het zijn toepassing voor de beeld-r vorming onmogelijk maakt zonder geavanceerde aftrektechnieken. In feite 25 bevat na 72 uren de tumor de dubbele hoeveelheid van het niet-specifieke 67 125

Ga, berekend per gram, in vergelijking met I. Voorts zijn de tumor/ 67 bloed-verhoudingen beter voor Ga dan voor het gejodeerde antilichaam.

67

Wanneer men in aanmerking neemt, dat Ga als inadequaat wordt beschouwd voor het in beeld brengen van adenocarcinoom van de dikke darm, zijn de 30 moeilijkheden, die door Mach c.s., N. Eng. J. Med., 303, 5-10 (1980) onder- 125

vonden werden, gemakkelijk te verklaren. Deze onder toepassing van I

verkregen gegevens tonen op ondubbelzinnige wijze aan, dat zonder goede 131 131

aftrektechnieken bij toepassing van I zeer hoge doses van het met I

gemerkte materiaal toegediend zouden moeten worden om de tumorconcentraties 35 te bereiken, die nodig zijn voor een doelmatige beeldvorming. Dit zou ertoe leiden, dat de patient een hoge stralingsdosis zou ontvangen wegens de 131 fysische halfwaardetijd van 8 dagen en de 608 keV β-component van I.

Daarentegen maken het door de tumor opgenomen hoge percentage van de 111 geinjecteerde dosis van In anti-CEA en de gunstiger fysische eigenschappen 8204108 111 - 13 - van In de injectie mogelijk van kleinere hoeveelheden radioactief farma- ceutisch middel, terwijl het beeld verbeterd wordt en de stralingsdosis voor de patient tot een minimum wordt teruggebracht. De verhoudingen tus- 111 sen tumor en achtergrond, die gevormd worden door In anti-CEA liggen 5 ruim binnen het traject, dat vereist is voor beeldvormingsdoeleinden wegens de grote mate van lokalisatie van radionuclide in de tumor. Voorts wijzen de gegevens erop, dat de tumor radioactief gemerkt materiaal opneemt, dat eenmaal in andere weefsels is opgenomen of daaraan gehecht is.

Afzonderlijke muizen werden aan een foto-aftasting onderworpen na 111 10 4, 24, 48 en 72 uren na de injectie van met In gemerkt anti-CEA onder toepassing van een Phagam Η P Anger gamma-camera. Na 48 uren werd de tumor goed gedefinieerd zonder noodzaak om zijn toevlucht te nemen tot aftrek-methoden. Na 72 uren was de definitie van de tumor zelfs nog verder verbeterd.

15 De stabiliteit in vivo en derhalve de geschiktheid voor toepassing voor het in beeld brengen van een tumor van een direkt gemerkt monoclonaal antilichaam wordt aangetoond in de volgende experimented waarbij een mono- 103 clonaal antimelanoom werd toegepast, dat gemerkt was met Ru, vergeleken 125 met hetzelfde antilichaam, gemerkt met I.

103 20 1. Bereiding van met Ru gemerkt anti-melanoom 103

Een waterige oplossing van 220 pi RuCl^ (beschikbaar van New England Nuclear, Inc.) werd toegevoegd aan 100 pi van een verzadigde kaliumacetaatoplossing. De pH werd met 70 pi 10 M NaOH op 5,3 ingesteld.

Deze oplossing van radionuclide werd toegevoegd aan 500 pi van een 0,5 yUg/pl 25 oplossing van muis-antimelanoom-antilichaam en het mengsel werd 1 uur bij kamertemperatuur geincubeerd. De pH werd op 7,2 ingesteld door toevoeging van. 20 pi 10 M NaOH en het preparaat werd gedurende een nacht bij kamertemperatuur bewaard. Het ongebonden metaal werd van het aan antilichaam ge-bonden metaal gescheiden door het reactiemengsel op een kolom Sephadex G-50 30 te brengen en te elueren met keukenzoutoplossing, die met fosfaat op pH

7,2 gebufferd was. De eiwit bevattende fracties werden verzameld en gecom-bineerd voor onderzoeken in vivo bij muizen.

2. Verdelingsonderzoek bij naakte muizen

Er werden weefselverdelingsonderzoeken uitgevoerd bij naakte BALB-C- 103 35 muizen onder toepassing van het op de bovenstaande wijze bereide, met Ru 125 gemerkte anti-melanoom en van met I gemerkt anti-melanoom, dat op de-zelfde wijze bereid was als hierboven beschreven voor het merken van anti-CEA.

De muizen werden in twee groepen verdeeld, die intraveneus geinjecteerd 8204108 - 14 - 125 103 werden met resp. met I gemerkt en met Ru gemerkt antilichaam. De muizen werden na 4, 24, 48, 72 en 96 uren opgeofferd, ontleed en vervol- gens werd de radioactiviteit van de organen bepaald, zoals hierboven be- schreven voor de onderzoekingen met monoclonaal anti-CfeA. De weefselverde-125 103 5 ling van I en Ru is in de onderstaande tabel weergegeven.

8204108 * - 15 -

So ro CO P- Ifl η Ο ΙΠ in in O

ijh ο<ί n # co co h co on 10 co oh r- r- n cn n in 0i i n n - n σι n w h n o O'# no # ο o cm in '

SoKtno η -# η o no oo oo ο o oo <# o n n 3^ * +!.,« -I ο ο η η η «ο in n on η n o2 in S o a Qr-< *<n oo n no # o <no oo no co n ®\ n ' * /rf | rrs «. «*. ». ·* ». »*« w * * * * * ** H ·* If) S #H HO no oo oo oo COO oo oo no n n Λ

CJ

Ij 5 n CO rH no··-1 10 CN O LD CM n 11 d itj ri n ^ *31 n coo n in coo inn coco ο cn ο cn c § & i in co -ή ¢1 n co n n ο οσι n o ino r- m co - tri U U S - - n - - * -- -- - · -- ---- - co i 3 ο κ η o τρ <# no no oo coo oo oo 'ϊ ο n n a \ +i 0 n m * i o § ^"ίοιη # in η η η o oo η n in ^ 3 0 n co co 'in con "#io coco oo uih p- co no ο ή h q*h -co ino no η o no ιηο no η η n in * - g dp η *h vo ># n oo oo oo cn n oo no no η n +> — AS X_ u a §2 ιβοο co ίρ τ—i n no o _ φ-η «Η ΜΛ nn in *# h oo on r^ co nr- o n oncoion - -# on nn no n co no coo m <# p- - S I M 0 5 c0 O # c£> n O # O OO COn oo OO ino '-I Ή to u 3 v. +l o > I 01 fl ( m ji S ® ®w -ΨΟΟΉηοιο Μιη<:0ΐί_„2!^,Λ η 2 ο η o co p- o # -# *p p- -# m co oo con r- n jo co o ί 3 q2 >o no no oo no - ·# no coh or- - - a in - -- -- -- -- rH - -- -- -- n φ CD dp h rug ino oo oo oo -in oo oo coo ή n

n rH

a g *H a mono co nr-o ninr-n c- „ _ SC S η in f o^f <#o intn n + ^ m m^P no n ^ to co ^ oil - r- -co O'# n m no coin no corn H ® co - ο J β ο S Η H (NO ino OO con OO oo COO -η Ή η , ο ft S a in Tpon^mnin oco ή _ ftnonr-co nco n in oo a or- in'# O'# nr- η φ n co S ο! qh - - nco ino r-o ^o - n r-to η n con - - m.j ιηο -' -' -- -- n - -- -- --O'# ino OO OO OO nn OO no inn n ^ in m η Ό τΗ Τ’) wjj§8 p- •si* σ> oi cor- ·# CO co (dwnn nn coco nco nn nn cp n ^ |^ <rl cgi o>i -n -co n ># nn co n coo no o^p r-co co > c diOPinn 'pco no p-o oo p-n oo no r-o +1 cs <D !H -- o ffl i—I S 01 in « j « ffl m n mnn oo co ra S ο n ^p p- cop- r-co oco mio O'# con co·^ σι n iHO Qn -n -CO nn CTin r- n -in no int— -7 mm ico-n- -- -- --in- -- — - n - P- cn SS OPH^·'# nn no no OO nn OO ηθ η'# η n s g> > Μ Λ <B Oi > 0 ° C Ο Φ S3 A! Η H |m · lx J lx r |SX · lx · IX IX · lx J lx J Ιχ οι Φ idujidnJieRJnJ®® MM oi, oi, ”, ”, ”, ”, Ψ\ ”, 3 3 +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +l u P* r” ¢1

*H

fi — S tn > — ”>? x ΰ + +{ λ * 31 π m »rt u MO 0 d) ο) φ -p u «Μ o rQ 5* P ‘D .

0 > H <D Μ -H *n g M s5Sfl -» .n- S 3 S S & i 3 S & 8 s 8204108 0 in o m o in τη η η n * - 16 - Φ

CO

tP

β •Η * •η •Η Φ Ό Μ Φ · Φ Μ Ό 0) G -Η <ΰ Ό Ρ οι Ρ

+ 1 X

Η G G ω ω (Ο Ώ U > ο φ Επ -η -Ρ Τ3 Λ Οΐ U

Η G ·Η Ο 5 > « ® Μ Φ 0> α> > > -Ρ <ϋ \Χ Λ

, "" G

Φ Φ Ό > r-i φ Λ> 2 'Ο ο rl -3· Β Φ ft 01 Ο ft Μ Ο Φ •Η O' ft G Μ *Η X G X Φ Φ H <Χ> Ρ φ Γ" Λ ft G Ο Φ Λ X Λ Φ Φ Λ Λ Ο 01 m Φ G θ' Φ > Ό φ Φ θ' Ο φ >-Ι Ο « *-*> /-Ν X! X! X! 8204108 * 125 - 17 -

De gegevens in de tabel tonen aan, dat het met I gemerkte anti-melanoom snel gedehalogeneerd werd, wat eveneens het geval was met 125 103 het met I gemerkte anti-CEA, waartegenover het met ' Ru gemerkte anti- melanoom stabiel was. Deze waarnemingen worden bevestigd door het feit, 125 5 dat het gehalte van I in het bloed 4 uur na de injectxe zeer hoog is en daama daalt tot lage, maar constante niveaus na tijdsverlopen van 24 - 96 uren. Daarentegen wordt het gehalte aan Ru betrekkelijk snel uit het bloed afgevoerd en concentreert zich in de lever, zoals te verwachten zou zijn voor een .niet met tumor geinfecteerde gastheer. De gehalten in milt 103 10 en nier bij de muizen, die geinjecteerd zijn met het met Ru gemerkte anti-melanoom, zijn ook in overeenstemming met stabiliteit in vivo.

Het is bekend, dat CEA en enkele andere met tumor verband houdende antigenen door de tumor worden uitgescheiden of afgegeven. In dergelijke gevallen kan het optreden van achtergrondstraling, die veroorzaakt wordt 15 doordat het in het bloed of ander weefsel circulerende antigeen zich ver-bindt met gemerkt antilichaam, verminderd worden door eerst ongemerkt anti-lichaam toe te dienen, dat zich met circulerend antigeen kan combineren.

Dit heeft dan ook de neiging de grote opname van gemerkt antilichaam door de lever te verminderen. Na een geschikt tijdsverloop wordt gemerkt anti-20 lichaam toegevoegd en het individu aan foto-aftasting onderworpen om de plaats van de gelokaliseerde straling te bepalen.

Hoewel in de bovenstaande bespreking nadruk is gelegd op de toepassing van een enkel monoclonaal antilichaam, dat gemerkt is met een radionuclide, kan men binnen het raam van de uitvinding ook twee of zelfs meer gemerkte 25 monoclonale antilichamen voor verschillende antigeen-determinanten gebrui-ken. De verschillende antilichamen worden zodanig gekozen, dat zij de binding van een ander antilichaam aan het antigeen niet storen. Door toepassing van een aantal, elkaar niet storende gemerkte antilichamen kan het beeId van tumor versterkt worden, aangezien het antigeen een groter vermogen 30 bezit voor gemerkt antilichaam. De toepassing van een aantal antilichamen is in het bijzonder geschikt voor het in beeld brengen van een tumor, waar-van het bijbehorende antigeen in een lage concentratie aanwezig is.

De bovenstaande beschrijving van de uitvinding heeft betrekking op thans de voorkeur verdienende uitvoeringsvormen en uiteraard kunnen andere 35 variaties daarvan duidelijk zijn voor de deskundige.

8204108

Claims

1. Monoclonaal antilichaam voor een met een tumor verband houdend anti-geen, waaraan een metalliek radionuclide direkt of via een met het antilichaam gecombineerd cheleringsmiddel gebonden* is.

2. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het cheleringsmiddel gekozen is uit polyaminocarbonzuren, polyamino(alky-leenfosfor)zuren, polyaminen, porfyrinen, kroonethers, cryptanden, desferri-oxamine B en derivaten daarvan en enterobactinen en carbocyclische analoga daarvan.

3. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het cheleringsmiddel een polyaminocarbonzuur is met de formule (13), waarin x de waarde 0 heeft of een geheel getal voorstelt, y het getal 1 of 2 is, z een geheel getal met een waarde van 1 - 7 is en R waterstof of een groep, via welke het cheleringsmiddel met het antilichaam geconjugeerd is, of een 15 groep die de bindingsconstante van het cheleringsmiddel voor het radionuclide beinvloedt, voorstelt.

4. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het polyamino(alkyleenfosfor)zuur de formule (16) heeft, waarin X de waarde 0 heeft of een geheel getal is, y het getal 1 of 2 is, z een geheel getal 20 is met een waarde van 1 - 7 en R waterstof of een groep, via welke het cheleringsmiddel met het antilichaam geconjugeerd is, of een groep, die de bindingsconstante van het cheleringsmiddel voor het radionuclide beinvloedt, voorstelt.

5. Monoclonaal antilichaam volgens conclusies 3 en 4, met het kenmerk, 25 dat R waterstof, een methylgroep, een groep -CE^C^E^OCS^CO^E of een groep -CLH -A voorstelt, waarbij A een diazoniumzout of een voorprodukt daarvan 6 4 of een groep met de formule (15) voorstelt, waarbij L een groep is, die tijdens de conjugatie verdrongen wordt.

6. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat 30 X = 0 en R een groep met de formule -CgH^-NH-CO-GH^Br voorstelt.

7. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het cheleringsmiddel een polyaminocarbonzuur is, waarin X = 1 en R een groep met de formule -CgH^-NH-CO-CH^Br voorstelt.

8. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat 35 het cheleringsmiddel gekozen is uit: ethyleendiaminetetraazijnzuur, p.broom-aceetamidodifenyl(ethyleendinitrilotetraazijnzuur), 1-(p.aminofenyl)ethyleendiaminetetraazijnzuur en diethyleentriaminepentaazijnzuur.

9. Monoclonaat antilichaam volgens conclusies 1-8, met het kenmerk, dat het radionuclide een garoma-straler is met een halfwaardetijd van 5 uren 8204108 A * - 19 - tot 5 dagen en waarvan de gamma-emissies een energie hebben van 100 - 400 keV.

10. Monoclonaal antilichaam volgens conclusies 1-9, met het kenmerk, dat het radionuclide gekozen is uit 195mPt, 5 ^Ni, "^Co, ^^Ag, ^Cu, ^Mn, c? Ill 113m 99in · 67 68 _ 169,- 166 ^67 146 _ 157 5dFe, In, In, ^c, Q Ga, Ga, Yb, Tm, Tm, Gd, Dy, 95nr 103 97 99 , 101me, 201-,- 203 197 105 203 97 5 lib, Ru, Ru, Bh, Bh, Tl, Hg, Hg, Ag, Pb, Ru „ 48rv en cr.

11. Monoclonaal antilichaam volgens conclusies 1-10, met het kenmerk, dat het met tumor verband houdende antigeen een van de volgende is: carci-noembryonaal antigeen, α-fetoproteine, ferritine, menselijk choriogonado- 10 tropine, zinkglycinaat-markeerder, prostatisch zuurfosfatase en met melanoom verband houdende antigenen.

12. Preparaat, met het kenmerk, dat het een voor parenterale toediening geschikte oplossing is van een monoclonaal antilichaam voor een met tumor verband houdend antigeen volgens conclusies 1-11. 15

13, Preparaat volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het een mengsel van twee of meer van deze monoclonale antilichamen hevat.

14. Werkwijze voor het in beeld brengen van een tumor, met het kenmerk, dat men: a) aan een mens een parenteraal preparaat toedient, dat een monoclonaal 20 antilichaam voor een met de tumor verband houdend antigeen bevat, waarbij het monoclonale antilichaam een radionuclide bevat, dat direkt of via een met het antilichaam geconjugeerd cheleringsmiddel aan het antilichaam ge-bonden is; en b) de patient aan foto-aftasting onderwerpt om de plaats te bepalen, 25 waarbij het antilichaam zich in de persoon lokaliseert, zoals blijkt door de uitzending van straling door het radionuclide.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men een monoclonaal antilichaam gebruikt als gedefinieerd in conclusies 1-13. 8204108