LU84441A1

LU84441A1 - Perfectionnements a la detection des tumeurs

Info

Publication number: LU84441A1
Application number: LU84441A
Authority: LU
Inventors: Thomas Henry Adams; Gary Samuel David; Samuel Elliot Halphern
Original assignee: Univ California; Hybritech Inc
Priority date: 1981-10-27
Filing date: 1982-10-26
Publication date: 1983-06-13
Also published as: ES529310A0; NL8204108A; AT392004B; NO823530L; NO169947B; CA1202892A; IL67068A0; CH653040A5; SE8206073D0; ZA827806B; DK164682B; FR2515046B1; ES8505482A1; ATA391682A; DE3239410C2; JPS58135820A; FI823633A0; IT1153857B; BE894829A; ES8404857A1

Description

-¾ 2.

"Perfectionnements à la détection des tumeurs"_

La présente invention est relative à la détection de tumeurs. Sous un autre aspect, elle concerne des anticorps monoclonaux marqués avec des radionu-5 clides.

Une technique fiable pour la détection spécifique du site- des tumeurs est recher chée depuis longtemps. Des méthodes ont été décrites pour détecter, par exemple, l'antigène carcinoembryonnai-10 re (CEA) associé au cancer de l'être humain circulant dans le flux sanguin. Voir les brevets des Etats-Unis d'Amérique n° 3.663.684 et 3.697.638. Ces méthodes ne peuvent évidemment pas être utilisées pour déterminer le lieu de la tumeur. Plus récemment, on a pro-15 posé d'utiliser des antibiotiques marqués avec des isotopes radioactifs de l'iode pour détecter une substance antigénique associée à une tumeur. C'est ainsi que le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.927.193 décrit un procédé utilisant des anticorps au CEA marqués avec du 125 131 20 I et du I.. Suivant ce brevet, dans cLes expé riences réalisées en utilisant des hamsters syriens mâles chez lesquels on avait introduit des cellules cancéreuses d'être humain en forme d'anneaux à cachet, l'injection d'anti-CEA de chèvre suivie de l'examen des organes 25 des animaux montraient ’ que le radioisotope s'éta^^ f 3.

localisé dans la tumeur. Par conséquent, on a suggéré que la localisation d'une tumeur chez un être humain pouvait être déterminée par une administration in vivo d'une solution parentérale de l'anticorps suivie d'un 5 photobalayage de l'hôte.

L'utilisation effectua <3es anticorps radio-iodés n'a pas répondu aux prévisions des travaux réalisés précédemment. Par exemple, Goldenberg et coll., N.

* Eng. J. Med., 298, 1384-1388 (1978) ont obtenu un certain . 10 succès en 1978 en balayant des êtres humains avec de l'an- * ti-CEA radioiodé. Toutefois, à cause de la radioactivité de fond résiduels le succès limité rapporté dépendait de l'utilisation de techniques de soustraction.

Mach et coll., N. Eng. J. Med., 303, 5-10 (1980) ont 15 obtenu encore moins de succès et ont déterminé que seulement 0,1% de la dose administrée se localisait dans la tumeur. Toutefois, dans des cas sélectionnés, l'impression de la tumeur était encore possible.

Il est bien connu que la purification par affi- * 20 nité d’antisérums hétérologues pour obtenir les anti corps utilisés dans des procédés d’impression de tumeurs de la technique antérieure conduit ordinairement à la perte d'anticorps de haute affinité et que les anticorps obtenus, étant un mélange d’anticorps spécifiques pour 25 différents déterminants sur l’antigène, se composent principalement d’anticorps de faible affinité et d'anticorps qui donnent des réactions non spécifiques. Des : anticorps monoclonaux, d'un autre côté, peuvent être choisis de manière à montrer une affinité élevée vis-à-30 vis de sites choisis sur l'antigène et une liaison non spécifique faible. Toutefois, on a constaté d'une façon surprenante que les anticorps monoclonaux d'antigènes ............7 4.

à'iode suivant des processus bien connus montrent encore une faible localisation au site de la tumeur malgré le fait qu'une immunoréactivité in vitro puisse être montrée. Ceci peut et vraisemblablement doit condui-5 re à la perte d'iode radioactif par l'anticorps marqué.

Par conséquent, il s'avère encore nécessaire de mettre au point une technique fiable pour détecter in vivo l'emplacement précis d'une tumeur, v Suivant la présente invention, un anticorps 10 ou un fragment d'anticorps monoclonal vis-à-vis d'un antigène tumoral est marqué soit directement avec un radionuclide métallique soit avec un radionuclide lié à un chélate, par exemple du in lié à du DTPA, en faisant entrer en conjugaison un agent de chélation avec 15 l'anticorps et en formant ensuite un complexe entre l'agent de chélation et le radionuclide. L'anticorps marqué résultant, ou son fragment, lorsqu'il est injecté chez un hôte portant une tumeur, se localise rapidement et avec une spécificité élevée dans la tumeur elle-r 20 même. Dans certains cas, une localisation dans des métas tases distantes peut se produire de même que pour indiquer un étalement de la tumeur. L'endroit de la tumeur peut être décelé par des techniques de photobalayage. On peut également utiliser des mélanges d'anticorps monoclo-25 naux marqués.

„ Un but de la présente invention consiste, par conséquent, à obtenir des anticorps monoclonaux ? vis-à-vis d'antigènes associés à des tumeurs marqués avec des radionuclides métalliques.

30 Encore un autre but de l'invention consiste à

prévoir un procédé amélioré pour l'impression ou la mise en image des tumeurs chez un hôte infecté. I

5.

D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description ci-après, donnée à titre d'exemple non limitatif et en se référant aux dessins annexés, dans lesquels: 5 La figure 1 représente un groupe de graphiques illustrant la distribution dans des tissus de 111In et de 125I comparativement à la distribution de ^?Ga en fonction du temps après injection chez des souris nues - infectées avec un cancer de colon d'être humain d'anti- 111 125 10 CEA marqué au χη et au I ainsi quëda citrate de 67Ga.

La figure 2 représente un groupe de graphi- 111 125 ques illustrant la quantité de . In et de I ainsi 5 7 · ·* que de Ga excrétée par des souries nues en fonction 111 15 du temps après injection d'anti-CEA marqué au . χη et 125 57 au et de citrate de ea.

La figure 3 représente un groupe de graphiques illustrant la distribution dans des tissus de In et 125 de -i chez des souris nues 48 heures après injection 111 125 * 20 d / anti-CEA marqué au . In et au I comparativement à de l'albumine d'être humain marquée au citrate de 111 _ 125_

In et au I.

La figure 4 représente un groupe de graphiques 111 125 illustrant les rapports tumeur/tissu de In et de Ί 67 ~ 25 comparativement au Ga, après injection d'anti-CEA marqué 111 . 125_ ^ _ .. ^ _ 67„ *· au In et au I et de citrate de Ga chez des sou ris nues, en fonction du temps.

Ainsi qu'on l'a précisé, suivant la présente invention, des anticorps monoclonaux ou des fragments 30 de ceux-ci vis-à-vis d'antigènes associés à des tumeurs sont marqués directement avec des radionuclides métalliques ou avec des radionuclides liés à un chélate. Les anticorps monoclonaux utilisables dans le cadre àe/j/ ï 6.

l'invention sont des produits de la technologie des hybridomes qui est actuellement bien connue. On peut se référer à cet effet, par exemple, aux travaux de base de Milstein et Köhler rapportés dans Nature, 256, 495-497 5 (1975). Fondamentalement, le procédé consiste à injec ter à une souris ou à n'importe quel autre animal approprié un immunogène, dans le cas présent un antigène associé à une tumeur, tel que le CEA. La souris immunisée est ensuite tuée et les cellules extraites de 10 sa rate sont combinées à des cellules de myélomes pour donner des cellules hybrides appelées "hybridomes", qui peuvent être reproduites in vitro. La population de cellules produisant des anticorps est cultivée sélectivement et examinée pour isoler les clones individuels 15 dont chacun secrète une seule espèce d'anticorps spécifique à une région particulière ("déterminant ") sur la surface de la molécule d'antigène. Les clones individuels peuvent à nouveau être examinés pour déterminer ceux qui produisent des anticorps de l'affinité la plus s 20 élevée pour l'antigène et ceux qui montrent une faible li aison non spécifique. L·'anticorps choisi pour le marquage radioactif (normalement isolé des ascites) est amené à réagir avec le radionuclide métallique ou est conjugué avec un agent de chélation approprié que l'on 25 utilise ensuite pour lier le radionuclide. L'agent de chélation peut être lié à l'anticorps en utilisant une grande série de processus. D'une manière générale, puis-? que l'anticorps est un polypeptide, on peut utiliser un agent de chélation ayant un groupe réactif du type connu 30 comme étant intéressant pour introduire un fragment dans un substrat du type protéique. Parmi les groupes réactifs appropriés on peut mentionner les groupes suivants: / 3 7.

Ο ” /^Ν

Ch—- NCS Ch—C-N^J

5 ch—r--jr Ch SCUCl Λ / o 0 0 w

Ch—r-Ch C O N

10 \ S . // 0 F F ' 0

Ch- C —0-^~^-F Ch- N— S02-CH=CH2

^ F F

15 Ch-N j] Ch —N2+ (frcsn Ch-NH2)

K

0 0 II

Ch—NH- C- CH93r ' Ch- C- O- C—CH2CH (CH3) 2 20 0 0 o& Ch est le reste de l'agent de chélation.

Des agents de chélation appropriés sont constitués par une grande série d'agents de chélation poly-25 dentés dont les ligands se complexent avec les radionuclides métalliques. Parmi ces agents, on peut mentionner les acides polyaminocarboxyliques de la formule: /

If 8.

K02C—(CK2)V /{C-V\TC02H \ (CH2) C02K

5 \ I ' \ / · "'

N— CH (CH^-rrrN— CH-(CH,?—"N

/ ! M i 2 η / R \ R · / \

. H02C-fCH2)y Y /X. (CH2)y C02H

10 ' (1) dans laquelle x est égal à o ou est un nombre entier (de préférence x = 0 ou x = 1) , y = 1 ou 2 (de préférence y = 1) et z est un nombre entier de 1 à 7 (z est de 15 préférence égal à 1 ou 7) et ou R représente de l'hydrogène ou un groupe par l'intermédiaire duquel l'agent de chélation est entré en conjugaison avec l'anticorps ou un groupe qui modifie la constante de liaison de l'agent de chélation pour le radionuclide. Parmi les groupes R 20 intéressants, on peut mentionner, en particulier, le groupe Ay dans lequel A est le groupe par 1 ' inter médiaire duquel on réalise la conjugaison. Par exemple, A peut représenter -N2 , que l'on obtient par diazotation du groupe -NH2, qui lui-même peut être obtenu par 25 réduction d'un groupe nitro (-N02) qui, à son tour, peut être obtenu par nitration du noyau phényle. Le groupe A peut également être un groupe , obtenu par -nh-c-ch2l

acétylation du groupe -NH2 par des processus connus, oè 30 L est un groupe qui part déplacé au cours de la conjugaison, tel qu'un atome d'halogène, par exemple Cl, Br / ou I (Br étant préféré). AJ

9.

Dans d'autres cas, R peut représenter -CH3 ou -CH2C6H4OCV°2H·

Dans le cas des acides polyaminocarboxyli-ques, on peut réaliser la conjugaison par l'intermé-5 diaire du groupe d'acide carboxylique lui-même en formant, par exemple, un intermédiaire d'anhydride d'acide, comme décrit par Krejcarek et Tucker, dans Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 (1977).

Parmi les acides polyaminocarboxyliques, les 10 acides polyaminoacétiques sont actuellement préférés.

Des acides polyaminocarboxyliques spécifiques que l'on peut utiliser sont l'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) et ses dérivés, tels que l'acide diéthylèneamino-pentaacétique (DTPA), l'acide p-bromoacétamidophényl 15 (éthylènedinitrilotétraacétique) et l'acide 1-(p-amino-phényl)-éthylènediaminotétraacétique, ce dernier étant converti en un sel de diazonium pour permettre la conjugaison. Parmi ces agents de chélation, le DTPA est actuellement préféré.

; 20 Parmi les autres agents de chélation inté ressants on citera les acides polyamino(alkylène phospho-riques), en particulier ceux de la formule: 0 0 . ? n . "

25 HO-P (CH2)y (CH2Tv~ P-OH (CH2^.?-0K

\ /| . « \ / «

»CH-tCH2^-N-CÏHG32H-N

° /1 ' \ l /v \

30 .«i-p-Hcaj), Λ J (ch2*T'-°K

-1 J

OB

OH

• . (2) \ ^ 10.

dans laquelle x, y, z et R sont tels que définis précédemment. De préférence, x est égal à O ou 1, y = 1 et z = 1. Des acides polyamino(méthylène phosphoriques) spécifiques (y = 1) utilisables dans le cadre de la 5 présente invention sont l'acide éthylènediaminotétra (méthylène phosphorique), l'acide hexaméthylènediamino-tétra (méthylène phosphorique) et l'acide diêthylène-triaminopenta (méthylène phosphorique).

D'autres agents de chélation sont les polya-10 mines de la formule:

V—:CH2*TCH2 /CH2^C!WOT1 ^CHrCS2TSH

N-ÇîHCHjW N-ÇH—«η245-4ν 15 /R R / \ · ’

H2N—ÎCH2-*yCH2 \ /X

*< • t ' · * (3) * 20 dans laquelle X, Z et R ont la sifnification donnée précédemment.

Une autre classe d'agents de chélation sont ceux répondant à la formule:

25 OH HO

Çj— C«2 CH2“0 \ /

N— CH—CH-—N

o/l 2‘. \ o 30 "' / R \

HO-P-CH, CK, P-OH

OH OH / dans laquelle R a la signification donnée précédemment, à l'exception que lorsque R ne représente pas un groupe qui permette la conjugaison, au moins l'un des groupes phénol représente un groupe répondant à la formule —^ ^

5 ... 1 OH

dans laquelle A a la signification donnée précédemment... - ...........

Les porphyrines représentent une autre classe particulièrement intéressante d'agents de chélation.

: Les porphyrines intéressantes dans le cadre de l'in- 10 vention sont des porphyrines de synthèse et d'origine naturelle, notamment les porphyrines de la formule: É W/Rl O h Λ 20 R., | R^ /~Cf\

R R

25 1 l (5) dans laquelle R a la signification donnée précédemment 30 et R^ représente de l'hydrogène ou un substituant faisant opartie d'une molécule de porphyrine d'origine naturelle ou un groupe introduit au cours de .

12.

la synthèse, par exemple, pour permettre la conjugaison ou pour modifier la constante de liaison de la porphy-rine. Des porphyrines intéressantes sont la tétra-phénylporphyrine (R = phényle, R^ = H) ou la tétra-5 pyridylporphyrine (R = 4-pyridyle, R^ = H). Un ou plusieurs des groupes phényle ou pyridyle sont substitués par ~NH9 ou C , où L a la signification

Δ II

-NH-C-CH2L . r ·- donnée précédemment,ou par d'autres groupes pour permet-10 tre la conjugaison avec l'anticorps. La substitution sera normalement en position para pour un groupe phényle et en position 2 ou en position 4 pour un groupe pyridyle.

D'autres agents de chélation que l'on peut 15 utiliser dans le cadre de l'invention sont les éthers de configuration en couronne et leurs analogues cryp-tands répondant aux formules générales suivantes:

R R

rr v ;

n 0 N N

Rv/ \>R R \ / ^X^R

T I H E

e‘t- 1 H H J^a . CT S .

" w ... w

RR·' RR

30 (6) (7) 4 13.

dans lesquelles R a la signification donnée précédemment. Ou bien, le groupe que l'on utilise pour permettre la conjugaison est directement incorporé dans la structure d*éther de configuration en couronne ou 5 de cryptand ", tel qu'illustré par la formule suivante: λλ

10 VV

O

\_/ . · · 15 dans laquelle A est tel que défini précédemment.

On peut également utiliser comme agent de chélation des dérivés de desferrioxamine B. Ces dérivés 20 répondent à la formule:

O OH 0 O OH

·* « II II I

R-CH2-C-N—tCH2^- nh-c—(οκ2^ο-ν—

25 OH O - O

1 H - >11 • E2N-ÉCH2hr-N-C—(CI^^C-NK-(CH2br—* / '9 30 / i 14.

dans laquelle R a la définition donné précédemment.

Les dérivés d'entérobactine sont également des agents de chélation intéressants. Les dérivés préférés sont ceux répondant à la formule: 5

OH OH

OH OH CH2-0- C— CH — NH— Λ—A

' 10 ^-C-NH-CH \cH2

o=c I

I 0 I ! 0-CH?:-CH- C=0

2 I

15 NH

c=o

OH

20 ^^OH

(9) dans laquelle A est tel que défini précédemment.

Les analogues carbocycliques d'entérobactine 25 sont également intéressants. Parmi ceux-ci, on peut mentionner les composés de la formule: / / 15.

OH OH

° _y\

•OH OH CK? -CEjr—CH-— CH— NH— C —(/ A

s M 5 -i 1 Λ=-Λ

4 λ— C— HN-'CH CH

Yj I | 2

CH_ CH

| 2 I 2 10 · CH-CH —CH—CK2

NH

C=0

i5 0H

OH

(10) 20 dans laquelle A est tel que défini précédemment.

D'autres systèmes carbocycliques utilisables comme agents de chélation sont ceux répondant à j la formule: /)/ ï 16.

HO HO OH OH

5 CH, o

10 ... - I

o=c /^ΐγΌΚ

kci^-c-K

15 (11) et les anilides correspondants dans lesquels A a la définition donnée précédemment.

20 Les spécialistes de la technique noteront que le cycle représenté pour les analogues d’entérobactine et carbocycliques peut être en outre substitué par des substituants qui n'altèrent pas matériellement leur capacité de liaison avec les radionuclides métalli- 25 ques et que ces substituants peuvent être introduits dans le but de créer des sites pour la conjugaison avec 11 anticorps.

Encore un autre groupe d'agents de chélation intéressants sont les siloxanes de la formule: / / 17.

OK OK' CHR CKR ·CKR OK OH

/ /)—-Si— O— Si— 0 — Si-' )> 5 2 3 I I I \_y CH3 (CH2) 3 CH3 χΛγΟΗ

OH

10 (12) dans laquelle R est tel que défini précédemment, à l'exception que lorsque R ne représente pas un groupe qui permet la conjugaison, au moins l'un des groupes 15 catéchol représente un groupe répondant à la formule —λ—A, dans laquelle A est tel que défini précé- OH OH demment.

Les spécialistes de la technique comprendront 20 que la liste précédente d'agents de chélation n'est pas limitative mais qu'elle donne plutôt des exemples d'agents de chélation appropriés.

Le marquage direct d'anticorps avec des radionuclides métalliques peut être réalisé en utilisant des 25 méthodes connues pour l'introduction d'un ion métallique sur un anticorps par sa fixation à un site sur l'anticorps lui-même. Dans certairs cas, le radionuclide métallique peut être incorporé en exposant l'anticorps, ordinairement en solution, au radionuclide dans son état 30 d'oxydation approprié. Par exemple, une technique actuellement préférée consiste en la mêtallation directe d'un anticorps avec ^°^Ru+^ en mettant en contact^/

V

18.

l'anticorps avec un sel de ruthénium approprié, par exemple du trichlorure de ruthénium, dans une solution tamponnée. Parmi les agents tampons que l'on peut utiliser on citera l'acétate de potassium, le bicarbonate de so-5 dium et la trihydroxyéthylamine (Tris).

Une autre technique appropriée implique la métallation directe de l'anticorps avec du chrome. Des radionuclides de chrome peuvent être introduits en mélangeant un sel de chromâte du radionuclide, par exem-10 pie du chromate de sodium ou de potassium, avec l'anticorps en solution.

Dans d'autres circonstances, l'anticorps peut d'abord être modifié chimiquement pour accepter le radionuclide et ensuite être mis en réaction avec 15 celui-ci. Par exemple, des groupes disulfure dans l'anticorps peuvent être réduits, cette étape étant suivie de la formation d'un groupe -S-M ou -S-M-S dans lequel le M représente le radionuclide. Par exemple, on peut réduire des groupes disulfure en utilisant du dithiothréitol, 20 pour former d'abord un groupe thiol que l'on peut amener à réagir avec des ions métalliques appropriés, par exemple des ions de mercure, d'argent, de zinc, de plomb ou de cadmium, sous leur forme d'oxyde ou de sel.

25 Les radionuclides que l'on peut utiliser dans le cadre de l'invention sont ceux qui forment des complexes stables avec les agents de chélation poly-dentés ou qui, sous des conditions appropriées, se combinent directement avec l'anticorps. Les radionu-30 clides sont choisis de manière à avoir une demi-vie ou d'autres caractéristiques de rayonnement qui permettent une élimination et une introduction sans risque chez les / ¥ 19.

êtres humains. On a étudié un grand nombre de radionuclides utilisables chez les êtres humains, qui s'avéraient intéressants dans le cadre de la présente invention. Ceux-ci peuvent être groupés de la façon 5 suivante:

Les agents de chélation de porphyrine (formule 5), d'éther de configuration en couronne (formule 6) s et de cryptand (formule 7) sont les plus intéres sants pour lier les radionuclides ayant un état d'oxyda- 1Λ . . LO , 195m ^ 57__. 57„ 105Ώ 67„ 10 tion +2. Par exemple, Pt, Ni, Co, Ac, Cu - 52 et Mn forment des complexes stables dans leur état d'oxydation +2.

Les agents de chélation des formules 1 et 5 et 9-12 forment des complexes stables avec les radio-15 nuclides ayant un état d'oxydation +3. Parmi les radionuclides qui forment des complexes stables dans l'état ,3 1 -3 x.· , ». ., 52 11 113rrL 99m_ d'oxydation +3 on citera Fe, In, In, Te, 68 67 _ 169,- 57_ 167m 166m 146„. 157^

Ga, Ga, ïb, Co, Tm, Tm, Gd, Dy, 95tri. 103 97 99^ IOIbl. ^ 20lm1

Nb, Ru, Ru, Rh, Rh et Tl. Les 20 agents de chélation comportant des groupes catéchol, des formules 9- 12, s'avèrent particulièrement intéressants avec les radionuclides qui sont fortement mobiles in vivo, en particulier les radionuclides de fer, tels - 52 que le Fe.

25 Les radionuclides qui peuvent être directement . . . . . . , . 203„ 197„ 105 lies aux anticorps sont les suivants: Hg, Hg, Ag, 203 , 97„ 103_ 99 10lm. . 48„

Pb, Ru, Ru, R2, Rh et Cr.

Les radionuclides les plus appropriés sont les émetteurs gamma avec une énergie se situant entre 100 30 et 400 keV ayant des demi-vies de l'ordre de 5 heures à 5 jours.

Pour des raisons qui ne sont pas clairement / 20.

comprisent actuellement, certains anticorps monoclonaux individuels d'antigènes tumoraux résistent à la métalla-tion directe. C'est ainsi que pour incorporer le radioisotope par cette voie, il est nécessaire de choisir 5 soigneusement les anticorps spécifiques. Par conséquent, il est préférable actuellement de lier un radionuclide à un anticorps en utilisant la méthode la plus flexible qui consiste d'abord à faire entrer en conjugaison un agent de chélation avec l'anticorps et ensui- 10 te à former un complexe avec le radionuclide. A cet 111 égard, on préfère utiliser du In (T 1/2 = 2,8 jours) comme radionuclide conjointement à du DTPA comme agent de chélation.

Le procédé de la présente invention peut être 15 utilisé d'une manière générale pour la détection de tumeurs en utilisant des anticorps monoclonaux correspondant à des antigènes associés à des tumeurs. En plus du CEA, les antigènes associés aux mélanomes, l'a-foeto-protéine, la ferritine, la choriogonadotropine 20 humaine, le marqueur formé de glycinate de zinc, et la phosphatase d'acide prostatique (PAP) peuvent, par exemple, être utilisés comme immunogènes pour stimuler la production des anticorps monoclonaux désirés, comme décrit ci-dessus. Dans la présente utilisation, l'anti-25 corps marqué dans une solution parentérale appropriée est injecté au patient. Après une période de temps suffisante, le patient est soumis à un photobalayage pour détecter tout site de rayonnement localisé indicateur d'une tumeur et/ou d'une de ses métastases.

30 Les expériences suivantes réalisées avec un anticorps monoclonal correspondant à du CEA marqué avec du et du ^·*Ίη montrent l'avantage d'utiliser/ / 21.

des anticorps monoclonaux marqués avec des radionuclides liés à un chélate pour l'impression ou la mise en image de tumeurs suivant la présente invention comparativement aux procédés utilisant des anticorps mar-5 qués à l'iode.

1. Préparation d'anti-CEA marqué radioactivement.

De l'anti-CEA monoclonal, délivré par Hybritech, 125

Inc., La Jolla, Ca#, est marqué avec du I en uti-; lisant la méthode de Bolton et Hunter, Biochem. J., 10 133, 529-539 (1973). On fait passer le produit dans une colonne de Sephadex G-25 et la matière finale contient moins de 0,5%d'iodure libre. La liaison d'anticorps monoclonal marqué radioactivement est supérieure à 80% avec un anticorps d'anti-souris de cheval lié 15 à du sépharose et supérieure à 75% avec du CEA lié à , du sépharose.

Le même anti-CEA monoclonal est marqué avec „ 111 . .

du In en utilisant du DTPA conjugue comme agent de chélation suivant le processus de Krejcarek et Tucker, » 20 Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 (1977). Le produit de réaction est purifié en le faisant passer dans une colonne de Sephadex G-75. La liaison d'antigène est comparable à celle montrée par 125 l'anticorps marqué au I. Le procédé de marquage ne 25 modifie pas la constante d'affinité, Ka, pour l'anticorps par rapport à l'anticorps non chélaté, tel que déterminé par titrage avec du CEA.

Les stabilités in vitro des anticorps anti-CEA marqués sont déterminéesen incubant une portion de la 30 matière dans une solution parentérale comprenant une solution saline normale stérile U.S.P., à 37°C pendant 72 heures et en déterminant par voie chromatographique la quantité de radionuclide libre. Les solutions d'anticorps^/ 22.

sont réparties en gouttes sur des bandes d'alumine IB

de Baker et développées dans de 1'acétone aqueux a 50%.

Le radionuclide lié à la protéine reste à son point de départ tandis que le radionuclide libre émigre. Après 5 la période d'incupation, la matière radioiodée montre moins de 3% d'activité présente en tant qu'iodure libre.

Une conservation à 4°C réduit cette valeur de 50%. Sous 111 les mêmes conditions, le In anti-CEA montre une stabilité comparable.

10 2. Etudes de distribution chez des souris nues.

Des études de distribution dans des tissus de 1'anti-CEA de souris monoclonal marqué radioactivement sont réalisées chez des souris nues portant 0,5-1,0 g de tumeurs de colon d'être humain. Le poids des souries 15 varie entre 17 et 28 g (moyenne d’environ 23 g). Les tumeurs sont induites au moyen d'une injection sous-cutanée d'un hachis contenant des cellules d'adénocarcinomes de colon humain produisant du CEA. Des études de distribution sont entreprises trois semaines 20 plus tard. Deux expériences sont réalisées. Dans la première, on divise 19 animaux en quatre groupes de 4-6 animaux et on leur injecte par la voie intraveineuse (IV) 0,1 ml d'une solution U.S.P. saline normale stérile contenant 0,5 microcurie d'anticorps anti-CEA 125 25 marqué au I (environ 0,3 microgramme d'anticorps) et, 0 *7 à titre de témoin, du citrate de ea exempt de support, un agent d'impression de tumeur du colon humain ^on spécifique connu. Les injections sont effectuées sans anesthésie en utilisant une seringue d'Hamilton de 30 100 microlitres pour assurer la précision. Les ani maux chez lesquels la dose s'est partiellement infiltrée dans la queue sont écartés de l'étude. Après l'injection, / îf 23.

les souris sont placées dans des cages métaboliques stériles ayant un fond en treillis métallique surélevé pour la récolte de l'urine et des fèces. En dessous du fond, on a entassé de la gaze 4x4 stérile de manière à ce 5 qu'il ne puisse pas être rongé par les animaux. Les souris, maintenues dans une chambre propre à 4,5°C avec des aliments stériles et de l'eau à volonté, sont tuées par groupes 4, 24, 48 et 72 heures après l'injection du traceur.

10 On anesthésie les souries avec de l'éther et l'on obtient des échantillons sanguins par une ponction cardiaque directe. Les souris sont ensuite tuées par une dislocation cervicale. Au cours de la dissection ultérieure, la tumeur, le foie, les reins, les muscles, 15 le coeur, les poumons, les fémurs et la rate sont prélevés, rincés deux fois dans de l'eau, une fois dans de la formaline à 10%, essuyés au papier buvard et pesés à l'état sec et humide sur une balance analytique. L'estomac et les intestins intacts sont également enlevés et soumis à ; 20 un comptage. On estime que le sang, les muscles et les os représentent respectivement 7%, 40% et 10% du poids * corporel total pour la totalité des calculs de prélève ment d'organes. Les autres organes sont pesés dans leur totalité. Le comptage de la radioactivité est réalisé 25 dans un compteur à canal pour échantillons gamma automatique avec des fenêtres réglées sur le pic photo- 125 électrique de 27-35 keV du I et du pic photo- g η électrique de 93 keV du /Ga. Le compteur est programmé pour rejeter en dix minutes 1 million de coups de maniè-30 re à obtenir une signification statistique pour les échantillons pourvus des niveaux d'activité les plus / faibles. Les corrections relatives au fond et à la conr / f 24.

tribution réciproque de l'activité isotopique entre les réglages de fenêtres sont réalisées en utilisant des sources préparées et en résolvant des équations simultanées. L'activité des échantillons est ensuite com-5 parée à des standards de la matière injectée, les résultats étant exprimés en fonction du pourcentage de dose injectée par gramme et du pourcentage de dose injectée par organe. Les rapports tumeur/tissu sont calculés à partir des résultats dose en %/gramme. L'ac-10 tivitê dans les intestins, l'urine et les fèces est calculée en pourcentage de la dose injectée totale.

Dans la seconde étude, 37 souris nues portant des tumeurs se développant au départ du même cancer de colon humain sont divisées en cinq groupes de 7-8 ani-15 maux. Un groupe sert de témoin et on lui injecte simultanément par voie intraveineuse 1 microcurie d'albumi- 125 ne de sérum humain marquée au I (0,01 mg de HSA) 111 et 3 microcuries de citrate de In sans support (0,01 mg de citrate) et on les tue 48 heures après l'injection.

• 20 Dans les quatre groupes restants, les animaux reçoivent des injections simultanées de 3 microcuries d'anti-CEA 111 marqué au in (1,5 microgramme d'anticorps) et 5 mi- 67 crocuries de citrate de Ga sans support. Les groupes sont tués respectivement après 4, 24, 48 et 72 heures.

25 La dissection des tissus, la préparation des échantillons pour les essais de radio-activité, les techniques de comptage et les calculs sont réalisés comme décrit ci-dessus. Dans le cas du In, le spectromètre est ajusté pour compter le pic photo-électrique de 247 keV 30 en utilisant une fenêtre de 40 keV (210-250 keV) tan- g η dis que le Ga est compté avec une fenêtre de 30 keV recouvrant le pic photo-électrique de 93 keV. Ces ré- / 25.

glages mènent à des contributions réciproques de radioactivité inférieures a 10%.

Comme indiqué sur la figure 1, les concentra- 111 tions d'anti-CEA marqué au In se localisant dans la 5 tumeur s'élèvent constamment en fonction de l'échelle du temps de l'expérience. 23% de la dose injectée se sont accumulés après 72 heures et les résultats laissent supposer que le pourcentage aurait été même supérieur si l'on avait réalisé la prise d'échantillons plus 10 tard. Le pourcentage dans le sang, au contraire, diminue en fonction du temps. Le foie montre une absorption rapide après 4 heures, cette période étant suivie d'une période de changement mineure, et ensuite d'une augmentation jusqu'à 72 heures. Les autres tissus ne mon-15 trent que de petites variations sur la période de temps étudiée.

6 7

La teneur en 'Ga dans la tumeur reste plutôt constante au cours de l'expérience, étant d'environ 1/4 de la teneur d'anti-CEA marqué au "^^In après 72 0 η 20 heures. La teneur dans le sang en 'Ga chute régulièrement, tandis que la concentration dans le foie montre un schéma général quelque peu similaire à l'anticorps marqué au ^^indium. La concentration dans les muscles de 6 7 XGa chute au cours des 48 premières heures et se stabi- 25 lise ensuite, tandis que la concentration dans les os reste pratiquement la même tout au long de l'expérience.

La quantité d'iodure dans la tumeur prélevée après 4 heures, étant initialement légèrement supérieure 111 aux quantités de indium, diminue ensuite irrégulière-30 ment pendant le restant de l'expérience, n'étant que de 1/10 de celle de ^^in après 72 heures. A ce moment, il apparaît dans la tumeur deux fois plus de 6^Ga que de / ? 26.

125 125 I. Le taux de comptage de I dans tous les tissus diminue rapidement à partir de leur valeur maximale atteinte après 4 heures, et dans certains cas, atteint des niveaux de fond après 48 heures.

5 Les résultats d'excrétion (figure 2) montrent 111 une augmentation constante de In dans les urines entre la 24ème et la 72ème heures, atteignant un maximum 111 de 14¾ de la dose injectée. La concentration de In - dans les fèces reste assez constante entre la 24ème 10 et la 48ème heures, et augmente ensuite jusqu'à 17% après 72 heures, tandis que la quantité dans l'intestin reste relativement constante sur la période entière, n'excédant jamais 5% de la dose.

0 η

Le diagramme d'excrétion de xGa est quelque 15 peu similaire à celui du ^'11ln, encore qu'il montre une plus grande quantité de traceur dans les intestins et les fèces que celle observée pour le et une moindre quantité dans les urines.

125

Presque 60% de la radio-activité due au I

i 20 sont éliminés dans l'urine au cours des 24 premières heures, et 75% après 48 heures. 5% supplémentaires du 125 I sont perdus dans les fèces. C'est ainsi qu'après 72 125 heures, environ 80% du I initialement injecté ont 125

été excrétés par l'animal. Une chromatographie du I

25 dans!farine montre que la majeure partie de celui-ci est sous la forme d'iodure libre avec une seconde espèce 125 représentant probablement du I libre complexé a autre chose qu'une protéine.

La figure 3 donne les résultats relatifs à 30 l'anti-CEA marqué au ^^In après 48 heures et les com- m 125 pare au citrate d' indium et au IHSA. Le ci-träte de In est utilisé comme témoin pour toute quan- / 27.

tité éventuelle d'indium qui pourrait s'être dissociée 125 de l'anticorps, tandis que le IHSA est utilisé comme ί témoin protéique non spécifique. L'anti-CEA marqué au 1 111

In montre un diagramme de distribution très different 111 5 de celui du citrate de In, se concentrant dix fois plus efficacement dans la tumeur. Les fixations des deux traceurs par les autres tissus sont également 125 différentes. Les concentrations de . IHSA dans la tu- ' meur sont de 20% des concentrations d'anti-CEA marqué 111 10 au In, mais encore de 50% supérieures aux concen- 125 trations d'anti-CEA marqué au I. La distribution 125 de IHSA dans le tissu ne comportant pas de tumeur est également très différente de celle du produit 111 d'anti-CEA marque au in. Il est particulièrement 125 15 significatif que le IHSA, considéré depuis longtemps comme une protéine iodée stable, montre presque 60% d'excrétion (33% dans l'urine) après 48 heures, ce qui corrobore très bien le fait ci-dessus que l'on ait „ 125 également trouve de l'anti-CEA marqué au I dans ’ 20 les urines. La fraction urinaire représente probable ment l'iodure libre. Les rapports tumeur/tissu (figure

4) montrent que la quantité d'anti-CEA marqué au 111ln est supérieure à la quantité de 'Ga dans tous les tissus mais que dans le sang, la quantité d'anti-CEA

25 marqué au 111In est dans ce cas à peu près la même que 6 7

• la quantité de Ga. Les rapports concernant l'anti-CEA

125 marqué au I, bien qu'étant apparemment préférables à ceux montrés par le ^^In et le ^Ga dans certains tissus, sont trompeurs puisqu'ils ;se produisent au départ de 125 30 faibles teneurs en I dans les tissus normaux plutôt qu'à partir d'une localisation dans la tumeur.

Compte tenu des expériences précédentes, il est / ' / 28.

125 clair que l'anti-CEA marqué au I n'est pas approprié pour être utilisé comme agent de localisation de tumeur. La déshalogénation rapide et intense diminue la concentration en traceur dans la tumeur et élève le 5 fond de rayonnement dans le sang, empêchant son utilisation pour l'impression ou la mise en image sans techniques de soustraction sophistiquées. En effet, à la 72ème heure la tumeur contient une quantité en grammes deux fois plus élevée de xGa non spécifique que de 125 10 I. De plus, les rapports tumeur/sang sont meilleurs 67 pour le Ga que pour l'anticorps iodé. Lorsque l'on envisage le fait que le zGa est considéré comme étant inapproprié pour l'impression ou la mise en image de l'adénocarcinomedu colon, les difficultés rencontrées 15 par Mach et coll. , N. Eng. J. Med. , 303, 5-10 (1980) , sont aisément expliquées. Ces résultats obtenus en utilisant du 125 I montrent d'une manière non équivoque qu'en l'ab- 131 sence de techniques de soustraction, si du I était utilisé, de très grandes doses de la matière marquée au 20 I devraient être administrées pour réaliser les concentrations nécessaires dans la tumeur de manière à obtenir une impression efficace. Ceci impliquerait que le patient reçoive une dose de rayonnement élevée à cause de la demi-vie physique de 8 jours et du composant 131 25 bêta de 608 keV du I.

Par contre, le pourcentage important de la dose injectée d'anti-CEA marqué au 1:L1In acquis par la tumeur, et les caractéristiques physiques plus favorables du ^·*Ίη permettent l'injection de plus petites 30 quantités de produit pharmaceutique radio-actif, tout en améliorant l'image et en utilisant la dose de rayonnement au patient. Les rapports tumeur/fond de rayonnement cony 111 29.

férés par l'anti-CEA marqué au In sont bien dans la gamme requise pour des applications d'impression à cause de la quantité importante de radionuclide se localisant dans la tumeur. De plus, les résultats lais-5 sent supposer que la tumeur acquiert le marquage radio-actif qui autrefois avait été incorporé dans d'autres tissus ou fixé à ceux-ci.

Des souris individuelles sont soumises à un photobalayage 4, 24, 48 et 72 heures après l'injec- 111 10 tion de l'anti-CEA marqué au In en utilisant une caméra gamma Phogam H P Anger. Après 48 heures, la tumeur est bien délimitée sans qu'il soit nécessaire de recourir à des techniques de soustraction. Après 72 heures, la délimitation de la tumeur est même encore 15 améliorée.

La stabilité in vivo et, par conséquent, l'aptitude à utiliser pour l'impression des tumeurs un anticorps monoclonal directement marqué sont montrées par les expériences suivantes dans les- ; 20 quelles on utilise un anti-mélanome monoclonal marqué 103 . t au Ru comparativement au meme anticorps marque avec , 125_ du I.

103 1. Préparation d'anti-mélanome marqué au Ru. On ajoute une solution aqueuse de 220 μΐ de 103 25 RuClg (délivréepar New England Nuclear, Inc.) à 100 μΐ d'une solution saturée d'acétate de potassium.

Le pH est ajusté à 5,3 avec 70 μΐ de NaOH 10 M. On ajoute cette solution de radionuclide à 500 μΐ d'une solution de 0,5 pg/pl d'anticorps anti-mélanome de 30 souris et le mélange est incubé pendant 1 heure à la température ambiante. Le pH est ajusté à 7,2 par l'addition de 20 μΐ de NaOH 10 M et la préparation est conser- / / 30.

vée pendant la nuit à la température ambiante. Le métal non lié est séparé du métal lié à l'anticorps par application du mélange de réaction dans une colonne de Sephadex G-50 et par une élution avec du phosphate 5 tamponné par une solution saline à pH 7,2. Les fractions contenant de la protéine sont recueillies et rassemblées pour des études in vivo sur des souris.

2. Etudes de distribution sur des souris nor- > males.

10 Des études de distribution dans les tissus sont effectuées sur des souris BALB-C normales en 103 utilisant l'anti-mélanome marqué au Ru préparé suivant le processus précédent et l'anti-mélanome marqué 125 au i préparé de la même manière que le processus 15 décrit ci-dessus pour le marquage de l'anti-CEA.

Les souris sont séparées en deux groupes auxquels on injecte par voie intraveineuse respectivement l'anticorps marqué au I et l'anticoips marqué au ^^Ru.

Les souris sont tuées après 4, 24, 48, 72 et 96 heures, 20 disséquées et la radio-activité des organes est déterminée comme décrit précédemment pour les études avec 125 l'anti-CEA monoclonal. La distribution du I et du ^°^Ru dans les tissus est donnée dans le Tableau ci-// après.

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Les résultats dans le Tableau montrent que 125 1'anti-mélanome marqué au I est rapidement déshalo- géné, juste comme cela se produit avec l'anti-CEA marqué au ^^1, tandis que l'anti-mélanome marqué au ^°^Ru est 5 stable. Ces observations sont confirmées par le fait 125 que la teneur en I dans le sang est très élevée 4 heures après l'injection et chute à des niveaux faibles mais constants entre la 24ème et la 96ème heure. Par 103 , contre, la quantité de Ru est relativement rapidement 10 éliminée du sang et se concentre dans le foie, comme on s'y serait attendu chez un hôte infecté par une "non- tumeur". Les teneurs dans la rate et dans les reins pour les souris auxquelles on a injecté l'anti-mélanome 103 marqué au Ru sont également compatibles avec la sta-15 bilité in vivo.

Il est bien connu que le CEA et certains autres antigènes associés à une tumeur sont sécrétés ou répandus par la tumeur. Dans de tels cas, l'incidence du rayonnement de fond s'élève parce que l'antigène 20 circulant dans le sang et dans les autres tissus combiné à l’anticorps marqué peut être réduit en administrant initialement de l'anticorps non marqué pour se combiner avec l'antigène en circulation. Ceci aurait tendance à réduire la fixation élevée d'anticorps mar-25 qué dans le foie. Après une période appropriée, on ajoute l'anticorps marqué et le sujet est soumis à un photobalayage pour déterminer le site de rayonnement localisé.

Bien que ce qui précède mette en évidence 30 l'utilisation d'un seul anticorps monoclonal marqué avec un radionuclide, il entre dans le cadre de la présente invention d'utiliser deux ou même plus de deux anti-/ 34.

corps monoclonaux marqués pour différents déterminants antigéniques. Les différents anticorps sont choisis de manière à ne pas perturber la liaison à l'antigène d'un autre anticorps. Lorsque l'on utilise plusieurs 5 anticorps marqués non perturbants, l'image de la tumeur peut être renforcée puisque l'antigène aura une capacité supérieure pour l'anticorps marqué. L'utilisation de plusieurs anticorps s'avère particulièrement intéressante pour 1'impression ou la mise en image 10 d'une tumeur dont l'antigène associé est présent en une faible concentration.

Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peu-15 vent y être apportées sans sortir du cadre du présent / brevet. / Jf i

Claims

35.

1. Anticorps monoclonal correspondant à un antigène associé à une tumeur auquel un radionuclide métallique est lié directement ou par l'intermédiaire 5 d'un agent de chélation conjugué à l'anticorps.

2. Anticorps monoclonal suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de chélation est choisi parmi les acides polyaminocarboxyliques, les “· acides polyamino(alkylène phosphoriques), les polyamines, 10 les porphyrines, les éthers de configuration en couronne, les cryptands, la desférrioxamine B et ses dérivés, les entérobactineset les analogues carbocycliques de celles-ci.

3. Anticorps monoclonal suivant la revendi-15 cation 2, caractérisé en ce que l'agent de chélation est un acide polyaminocarboxylique de la formule: H09C (CH2) /(CH2'hrC02H \ lcs2^v C°2K » · V . .Il-L-A/ ' / i \ i. 1 \ . a02C tCS2)y V (CK25y C02H 25 « dans laquelle x est égal à 0 tier, y est égal à 1 ou 2, z est un nombre entier de 1 à 7 et R représente de l'hydrogène ou un groupe par l'intermédiaire duquel l'agent de chélation est conjugué 30 à l'anticorps ou un groupe qui modifie la constante de liaison de l'agent de chélation pour le radionuclide.

4. Anticorps monoclonal suivant la revendi- / * f ' 36. cation 2, caractérisé en ce que l'agent de chélation est un acide polyamino(alkylène phosphorique) de la formule: 0 · ' - HO-F-rCH2)y . (CH27y?"°H OH ° / 1 i - · 10 " / Ä \ ^ HO-?-ïCn2)v \ . • ! » ... OH · ” . ' O II . (CH2t—-?-OH- Λ / - • -y \ ? J tCH27ÿ-ï-OH 20 OH dans laquelle X est égal à 0 ou est un nombre entier, y est égal à 1 ou 2, z est un nombre entier de 1 à 7 et 25 R représente de l'hydrogène ou un groupe par l'intermédiaire duquel l'agent de chélation est conjugué à l'anticorps ou un groupe qui modifie la constante de liaison de l'agent de chélation pour le radionuclide.

5. Anticorps monoclonal suivant l'une ou 2q l'autre des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que R représente de l'hydrogène, du méthyle, un groupe j-CH^CgH^OCH^CO^H ou C^H^-A, où. A représente un sel de J 37. diazonium0ou un précurseur de celui-ci, ou bien un groupe -NH-C-CH^L, dans lequel L représente un groupe déplacé au cours de la conjugaison.

6. Anticorps monoclonal suivant la revendication 5, caractérisé en ce que.X représente 0 et R re~ . π 5 presente un groupe -CgH^-NH-C-C^Br .

7. Anticorps monoclonal suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent de chélation est un acide polyaminocarboxyliqug, X est égal à 1 et - Vï R représente un groupe -CgH^-NH-C-CE^Br .

8. Anticorps monoclonal suivant la revendi cation 2, caractérisé en ce que l'agent de chélation est choisi dans le groupe comprenant l'acide éthylène-diaminotétraacétique, l'acide p-bromoacétamidodiphényl (éthylènedinitrilotétraacétique), l'acide 1-(p-aminophényl)- y 15 éthylènediaminotétraacétique et l'acide diéthylènetriami-nopentaacétique.

9. Anticorps monoclonal suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le radionuclide est un émetteur gamma ayant une demi- 20 vie allant de 5 heures à 5 jours et dont les émissions gamma ont une énergie de 100 à 400 keV.

10. Anticorps monoclonal suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le radionuclide est choisi parmi les radionuclides sui- . I95m_, 57„. 57„ 105* 67„ 52__ 52_ 25 vants; Pt, Ni, Co, Ag, Cu, Mn, Fe, 111T 113m 99HU 67- 68_ 169 , 166_ 167„ In, In, Te, Ga, Ga, yb, Tm, Tm, 146 15 7_ 95m 103„ 97„ 99Ώ lOlrn, 201. Gd, Dy, Nb, Ru, Ru, Ru, Rh, Tl, 203^ 197^ 105* 203n. 99B. , 48_ Hg, Hg, Ag, Pb, Rh et Cr.

11. Anticorps monoclonal suivant l'une quel-30 conque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'antigène associé à la tumeur est choisi dans le groupe comprenant l'antigène carcinoembryonnaire, l'a- / r( V 38. foeto-protéine, la ferritine, la choriogonadotropine humaine, le marqueur formé de glycinate de zinc, la phosphatase d'acide prostatique et les antigènes associés aux mélanomes.

12. Composition comprenant une solution pour l'administration parentérale d'un anticorps monoclonal correspondant à un antigène associé à une tumeur suivant l'une quelconque des revendications 1 à 11.

13. Composition suivant la revendication 12, 10 comprenant un mélange de deux ou de plusieurs de ces anticorps monoclonaux.

14. Procédé pour l'impression ou la mise en image d'une tumeur comprenants a) l'administration à un sujet humain d'une 15 composition parentérale comprenant un anticorps monoclonal correspondant à un antigène associé à la tumeur, l'anticorps monoclonal comportant un radionuclide lié directement ou par l'intermédiaire d'un agent de chélation conjugué à l'anticorps; et t 20 h) le photobalayage du sujet pour déterminer le site auquel l'anticorps se localise dans le sujet tel qu'indiqué par l'émission de rayonnement par le radionuclide.

15. Procédé suivant la revendication 14, carac-25 térisé en ce que l'anticorps monoclonal est tel que défini par l'une quelconque des revendications 1 à 13.

16. Anticorps monoclonal, composition le comprenant et procédé pour l'impression d'une tumeur, tels que décrits ci-dessus. Dessins :......jfc........planches „_3.IL.. pages dont ...^.........pape de garde jÂ......pages ds description .......ί.......pages de revendications ......abrégé descriptif Luxembourg, le 2 6 OCT. 1982