JPH09508352A

JPH09508352A - 診断及び治療のためのペプチドなしの金属結合システイン、その製造方法並びにその化合物を含有する医薬製剤

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Publication number: JPH09508352A
Application number: JP7512962A
Authority: JP
Inventors: コンラート、ユルゲン; ディンケルボルク、ルードゥガー; エルバー、セバスチアン; フレムメル、コルネリウス; ヘーネ、ヴォルフガンク; クランプ、ヴォルフガング; キュットゥナー、ガブリエレ; マリン、ラインハルト; マルチンシィアー、ハンス; シュナイダー−メルゲナー、イェンス; シュタインブレッヒァー、レナーテ
Priority date: 1993-11-01
Filing date: 1994-10-27
Publication date: 1997-08-26
Also published as: HUT75867A; NO961744D0; AU8104094A; EP0726910A1; NO961744L; CN1134159A; CN1073116C; WO1995012613A1; KR960705847A; ZA948410B; US6291639B1; HU9601139D0; DE4337599A1; CA2173845A1; AU688407B2

Abstract

(57)【要約】この発明は、直接にまたはリンカーを通じて臓器特異プローブと結合させることができ、その結果、腫瘍、臓器、組織または炎症の病巣中に接合体として特異的に蓄積する、金属と錯体を形成するシステインなしのペプチドに関する。なお前記の臓器特異プローブとしては、例えば胎児性癌抗原（ＣＥＡ）のような腫瘍関連抗原に対して用いられる抗体または部分抗体の配列があり、これらは上記のように腫瘍内に特異的に蓄積する。この発明はさらに、上記の金属と錯体を形成するシステインなしのペプチドならびにその接合体の製造方法に関する。さらにこの発明は、生体内診断法または生体内治療法に用いるキットの成分および前記接合体と放射性核種を含有する放射性医薬としての前記接合体の使用に関する。上記の臓器特異的接合体は、腫瘍、臓器または炎症の病巣を視覚化するのに使用される。

Description

【発明の詳細な説明】診断及び治療のためのペプチドなしの金属結合システイン、その製造方法並びにその化合物を含有する医薬製剤この発明の目的は、直接にまたはリンカーを通じて臓器特異的プローブと結合させることができ、その結果、特に腫瘍、臓器、組織または炎症の病巣に接合体として蓄積する金属と錯体を形成するシステインなしのペプチドであり、そして前記の臓器特異的プローブとしては、例えば胎児性癌抗原（ＣＥＡ）のような腫瘍関連抗原に対して用いられる抗体または部分抗体の配列があり、これらは上記のように腫瘍中に特異的に蓄積する。この発明はさらに、上記の金属と錯体を形成するシステインなしのペプチドおよびその接合体の製造方法に関する。さらにこの発明は、生体内診断法または生体内治療法に用いるキットの成分および前記接合体と放射性核種を含有する放射性医薬としての前記接合体の使用に関する。上記臓器特異的接合体は、腫瘍、臓器または炎症の病巣を視覚化するのに用いられる。心臓血管疾患はさておき、悪性の癌腫は、無制限に増殖するため死亡の原因になることが多い。たとえ原発腫瘍を取り除いたとしても、非常に小さい転移は探し出すことができないので除けない。手術または化学療法の後の治療検査法としては、一方ではＣＴまたはＭＲのような造影法、他方では患者の特に直腸腫瘍の患者の血清中のＣＥＡのごとき腫瘍関連抗原の含量の測定法がある。これら造影法の欠点は、瘢痕と局所再発を識別できないことである。血清中のＣＥＡ含量を測定する場合、その欠点は、腫瘍の位置確認ができないことに加えて、感度が低いことである。一方、転移の生成は、ＣＥＡ値がたとえ正常範囲内であっても排除することができず、また他方では炎症性突起のような非悪性疾患がＣＥＡ値を増大することがある。したがって、腫瘍の位置確認を早期に行うかまたは腫瘍に特異的な治療を行うことが、特に診断が信頼できない場合、治療を成功させるのに決定的なことである。この特別な方法は、免疫シンチグラフィー、すなわち同位元素で標識を付けた抗体または抗体構造体を用いることを特徴とする核医学に用いられる造影法によって容易になる。核医学の診断に今日最も多く用いられている放射性核種はI-131、I-123、In-1 11およびTc-99mであり、これらは共有結合で存在しているか（I-131、I-123）または錯化合物（In-111、Tc-99m）として存在している。ここに列挙した放射性核種は、半減期が短いために患者の放射線に対する暴露が最少になるが、I-131、I -123およびIn-111にはいくつもの欠点がある。例えばI-131はガンマエネルギーが364KeVで半減期が8dであり、著しく組織を損傷する余分のβ放射線を発する。ガンマエネルギーが172KeVと245KeVで半減期が2.8dのIn-111に関する各種研究チームの研究によって、In-111で標識を付けた臓器特異的物質は網内系中の特に肝臓内に高濃度になり、そのため肝臓の診断は不可能ではないにしても困難になることが分かった（Fairweatherら、Br．Med．J.、287巻、167〜170頁、1983年；H natowichら、J．Nucl．Med.、26巻、849〜858頁、1985年）。放射性核種I-123は半減期が13.3時間でガンマエネルギーが159KeVであるので診断を目的とする医学造影には好適であるが、その製造には多額の費用がかかる。診断を行うのに最高の選択物はTc-99mである。すなわちTc-99mは、半減期が短い６時間で放射線エネルギーが140KeVで生体内で造影するには好ましいこと、ならびにモリブデンジェネレータによって過テクネチウム酸の塩の形態で容易にかつ優れた費用効率で得ることができ、そして還元した後、臓器特異的物質と錯体を形成させるのに適切な酸化数で入手できるというような入手の容易なことを兼ね備えている。金属は、臓器特異的物質と、直接にまたは間接的に錯体を形成することができる。直接に錯体を形成させる場合、臓器特異的化合物中にそれ自体が含有されているかまたは還元によって生成させねばならない官能基がTc-99mに対してリガンドとして機能する（Schwarzら、J．Nucl．Med.、28巻、721頁、1987年）。したがって抗体は、ジスルフィド架橋を還元したのち金属と錯体を形成するが、還元する必要があるので多くの欠点がある。メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールのような有毒物質が還元剤として用いられ、そして還元を行った後、高価な洗浄法で分離しなければならない。抗体は還元によって断片化されることが非常に多いことが分かっているが、金属錯体形成によって構造の変化が起こるのと同様に、標的組織に対する抗体のアフィニティーの損失を起こす。その上に、錯体形成に関与している基が、例えば生体内での安定性を最適化する観点で変動することがないように金属の結合部位の正確な位置についての説明が全くなされていない。間接的な錯体形成法はＤＴＰＡ誘導体のような二官能キレートを使用するがこれらのキレートは活性化の後、抗体のような臓器特異的担体と共有結合を行うかまたは金属と錯体を形成することができる（Meares、Nacl．Med．Biol.、13巻、 311〜318頁、1986年）。接合体の錯体を形成するには基本的に二つの方法がある。第一に、臓器特異的物質をまず遊離リガンドと結合させ次に放射性核種と錯体を形成させる方法がある。第二に臓器特異的物質を、すでに形成されたキレートに結合させる方法がある。二官能キレート類を臓器特異的物質と化学的に結合するには、両者の方法に、高度の保護エンベロープ法と錯体を形成した接合体の洗浄が必要である。さらに、臓器特異的物質が二官能キレート剤と結合してタンパク質が誘導されると、分子の相互作用のため標的組織に対する特異的な結合性が損われる。腫瘍関連抗原に対する、同位元素で標識をつけたマウス抗体を用いて腫瘍の生体内の位置確認を行うことには種々の欠点がある。分子量は生体分布(biodistri bution)のパラメータである。特に充実性腫瘍の場合、高分子量(150KDa)のため、遅い血液クリアランスを伴う不均一な分布がある。その結果、最適の視覚化を妨げる高いバックグランド活性と、肝臓中の高濃度の抗体をもたらし、不可能ではないにしても腫瘍の位置確認を行うことは困難になる（Baumら、Nucl．Med．C ommun.、10巻、345〜352頁、1989年）。さらに、多くの患者はマウス抗体に対するヒト抗体を生成することによってアレルギー反応を示し（ＨＡＭＡ反応）、そのため診断または治療を目的として前記抗体を繰返し使用できなくなる（Searsら、J．Biol．Resp．Modifiers、３巻、138〜150頁、1984年）。このアレルギー反応は抗体の定常部に起因している。したがって、ＨＡＭＡ反応を低下させる方法としては、マウス起原の抗原検出可変部とヒト起原の定常部を有するキメラ抗体を製造する方法がある（LoBuglioら、Proc．Natl．Acid．Sci．USA、86巻、4220〜4224頁、1989年）。分子量を、F(ab)₂(100KDa)およびF(ab)(50KDa)のようなフラグメントを形成させることによって低下させて、アフィニティーを保持し血液クリアランス速度を増大することができるが（Andrewら、Eur．J．Nucl．Med.、12巻、168〜172頁、 1986年）、これらの抗体フラグメントは同位元素による標識付けについて上記の欠点がある。分子量のそれ以上の低下は、「一本鎖フラグメント（singlechain fragment）」（sFv）を視覚化することによって達成できる。「一本鎖フラグメント」は分子量が27KDaであり、抗体重鎖の可変部とリンカーを通じて連結されている抗体軽鎖の可変部で構成されている（Birdら、Science、242巻、423〜426 頁、1988年）。 Milenicら（Cancer Res.、51巻、6363〜6371頁、1991年）は、腫瘍関連抗原TA G-72に対するヨード化モノクローナル抗体およびそれぞれのF(ab)₂、F(ab)およびsFvフラグメントのアフィニティー、特異性および生体分布の比較説明を行った。sFvフラグメントは分子量が小さいので診断造影を行うのに適した薬物動態を示す。したがって、一価のsFvフラグメントが完全抗体と比較してアフィニティーが低いことは、このフラグメントが血液または身体からのクリアランスが非常に高いのでバックグランド活性が低くなり造影のコントラストが改善されることに対立する。しかしsFvフラグメントは、診断に最適の放射性核種のTc-99mで標識をつけることができない。国際公開第WO92/13527号によれば、一つのアミノ酸が割り込んでいるS-保護システイン残基は、臓器特異的ポリペプチドと結合させることによって蓄積と位置確認を容易にするTc-99m結合ペプチドとして作用する。この方法の欠点は、高システイン配列に標識を付けるのに高度の保護エンベロープ技術が必要なので、Tc 結合ペプチドまたは接合体を製造するのに時間がかかりかつ高い費用がかかることである。 Nedelmannら（J．Nucl．Med.、34巻、234〜241頁、1993年）は、Tc-99mと錯体を形成する二官能キレート剤に結合されているミオシンに対する「一本鎖フラグメント」を用いる、動物モデルに基づいた梗塞造影法を報告している。キレート剤とsFvフラグメントを結合することが高価でありかつ保護基の方法が酸化を防止するため必要なので、コスト効率のよい生産と容易な臨床上の取扱いが不可能である。標的組織中に蓄積する挙動、および同時に、特異的に捕捉されない部分の迅速なクリアランスのために患者にアレルギー反応を起こさないことによって傑出し、所定の放射性核種を捕捉し、生体内で安定性が高い化合物を提供することが診断上および治療面で緊急に必要である。さらに、これらの化合物を製造するのに問題があってはならず、かつその臨床面での取扱いには時間がかからず容易でなければならない。この問題は、下記の化合物を提供するこの発明で解決される。すなわち一般式Ｉ：Ｒ¹−Ｘ−Ｒ² （Ｉ）［式中、Ｘは同一もしくは異なる20個のα−、β−および／またはγ−アミノ酸残基の連鎖であり、前記連鎖はメチオニン、アルギニン、リシンおよびアスパラギンの群に属するアミノ酸を少なくとも一つ含有し、システインを含有せず、そしてそのＮ末端に自由原子価、または水素原子を置換することによってＸに結合される残基Ｒ¹を有し、そしてそのＣ末端に自由原子価、またはヒドロキシ基を置換することによってＸに結合される残基Ｒ²を有し；Ｒ¹は水素原子；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル基、アリール基、アルキルアリール基、アラルキル基、アルキルカルボニル基またはアリールカルボニル基であり；Ｒ²はヒドロキシ基；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で各々任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルコキシ基またはアリールオキシ基；アミノ基；Ｎ（Ｒ^aＲ^b）基（式中Ｒ^aとＲ^bは同一もしくは異なってもよく、ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状のアルキル残基またはアシル残基である）；またはリン酸残基である］で表される化合物；上記化合物とペプチド類、タンパク質類、生体分子類または巨大分子類との接合体；ならびに上記化合物と金属イオンとの錯体および上記化合物の水溶性塩（ hydrosoluble salt）である。Ｘが３〜15個のアミノ酸で構成されている式Ｉで表されるこの発明の化合物が好ましい。Ｘが３〜８個のアミノ酸で構成されている化合物が特に好ましい。下記配列を含有するこの発明の化合物が特に好ましい。式Ｉ：Ｒ¹−Ｘ−Ｒ² （Ｉ）で表されるこの発明の他の好ましい化合物は、Ｒ¹が単結合もしくは水素原子であり、またはＲ²が単結合、ヒドロキシ基もしくはアミノ基であることを特徴とする化合物である。さらにこの発明は、ペプチド類、タンパク質類、生体分子類または巨大分子類および受容体に結合する物質と、式Ｉで表される化合物との接合体を提供するものである。次のような接合体が好ましい。すなわちペプチド類、タンパク質類、生体分子類または巨大分子類および受容体に結合する物質が、該接合体が、罹病組織または腫瘍中に選択的に蓄積する物質とともに存在し、前記物質と式Ｉで表される化合物との間に共有結合が存在し、その結合は、ペプチド類、タンパク質類、抗体類またはそのフラグメントのようなアミノ基を含有する物質の場合はエステル様のアミド結合であり、そしてアルデヒド基を含有する物質の場合はイミド結合であることを特徴とする接合体である。罹病組織中に蓄積する物質として好ましいのは、ホルモン類、神経ホルモン類、神経伝達物質類、生長刺激因子類、植物ホルモン類、フェロモン類、酵素補助因子類、酵素基質類、受容体に特異的に結合する医薬類、またはオリゴヌクレオチド類である。罹病組織中に蓄積する物質のなかで特に好ましいのは、オキシトシン類、バソプレシン類、アンギオテンシン類、メラニン細胞刺激ホルモン類、ソマトスタチン類、チロトロピン放出ホルモン類、ゴナドトロピン放出ホルモン類、テストステロン類、エストラジオール類、プロゲステロン類、コルチゾール類、アルドステロン類、ビタミンＤ、ガストリン類、セクレチン類、ソマトロピン類、プロスタグランジン類、ニューロテンシン類、インスリン類、グルカゴン類、カルシトニン類、成長ホルモン放出ホルモン類、プロラクチン類、エンケファリン類、エンドルフィン類、ドパミン類、ノルエピネフリン類、グルタメート類、セロトニン類、アセチルコリン類、エピネフリン類、インターロイジン類、アンギオゲニン類（angiogenin）、サイモポエチン類、エリスロポエチン類、ゼアチン類、ジベレリン酸誘導体類、酵母因子類、昆虫フェロモン類、補酵素Ａ、フィブリノーゲン類、アンギオテンシノーゲン類、メカミラミン、ラニチジン、シメチジン、ロバスタチン、またはイソプロテレノール誘導体類である。この発明の他の化合物は、罹病組織中または腫瘍中に蓄積する物質が、ペプチド類もしくはタンパク質類；特に抗体類；F(ab)₂、F(ab)、一本鎖抗体類もしくはＣＤＲのような抗体フラグメントであることを特徴とする化合物である。特に好ましい化合物は、罹病組織中または腫瘍中に蓄積する抗体がα−ＣＥＡ抗体（この抗体を製造するのに使用されるハイブリッド細胞クローンはCentral Institute of Molecular Biologyに登録番号B4-F/C3（1988年のリスト）で寄託されている）またはそのF(ab)₂、F(ab)（sFvフラグメントもしくはＣＤＲ）であることを特徴とする化合物である（図１参照、ハイブリッド細胞クローンB4-F/C 3号によって産生される抗体の軽鎖の可変部と重鎖の可変部の塩基とアミノ酸の配列は合成のリンカーで結合されている）。さらに、この発明の化合物は、罹病組織中に蓄積する物質がエンドセリン類（ endotheline）、部分エンドセリン配列類、エンドセリン類似体類、エンドセリン誘導体類またはエンドセリンアンタゴニスト類のようなペプチドであることを特徴とする化合物である。特にこの発明の化合物はこれらペプチドが下記配列を含有することを特徴とする化合物である。または部分配列：または環状アミノ酸配列：この発明の化合物は金属イオンとの錯体として存在する。金属イオンが放射性核種である錯体が好ましい。好ましい放射性核種は、元素Ｔｃ、Ｒｅ、Ａｔ、ＩｎまたはＧａの同位元素である。放射性核種のTc-99mが特に好ましい。この発明の他の目的は、一般式Ｉ：Ｒ¹−Ｘ−Ｒ² （Ｉ）［式中、Ｘは同一もしくは異なる20個のα−、β−および／またはγ−アミノ酸残基の連鎖であり、前記連鎖はメチオニン、アルギニン、リシンおよびアスパラギンの群に属するアミノ酸を少なくとも一つ含有し、システインを含有せず、そのＮ末端に自由原子価、または水素原子を置換することによってＸに結合される残基Ｒ¹を有し、そしてそのＣ末端に自由原子、またはヒドロキシ基を置換することによってＸに結合される残基Ｒ²を有し；Ｒ¹は水素原子；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基によって任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル基、アリール基、アルキルアリール基、アラルキル基、アルキルカルボニル基またはアリールカルボニル基であり；Ｒ²はヒドロキシ基；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基によって各々任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルコシ基またはアリールオキシ基；アミノ基；Ｎ（Ｒ^aＲ^b）基（式中、Ｒ^aとＲ^bは同一もしくは異なってもよく、ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状のアルキル残基もしくはアシル残基である）；またはリン酸残基である］で表される化合物；上記化合物とペプチド類、タンパク質類、生体分子類または巨大分子類との接合体；ならびに上記化合物と金属イオンとの錯体の製造方法である。この発明の上記方法は、ａ）アミノ酸類が所望の順序で続いて、公知の方法によってアミド結合され、そのアミノ酸類は合成樹脂に連結され、そして前記アミノ酸類はペプチド合成が完了してから合成樹脂から分離されるか、またはｂ）一般式（Ｉ）の化合物をコードするオリゴもしくはポリヌクレオチドを、これらの化合物を化学的に合成する公知の方法で、ヌクレオチドのＣ−５’のヒドロキシル基を他のヌクレオチドのリン酸基に結合させるか、または標識を付けたオリゴヌクレオチドを用いてコーディングｍＲＮＡストリングを検出し、そのｍＲＮＡを単離し、次いでそのｍＲＮＡでｃＤＮＡを形質転換し、そしてポリメラーゼ連鎖反応で該ｃＤＮＡを増殖させることによって製造し；通常の発現ベクター中に入れ次いで原核細胞もしくは真核細胞の中で発現させ；そしてこの方法によって製造される化合物を、罹病組織中または腫瘍中に選択的に蓄積する物質と任意に接合し、そして前記物質と式Ｉで表される化合物との間に共有結合が存在しその結合は、ペプチド類、タンパク質類、抗体類またはそのフラグメント類のようなアミノ基を含有する物質の場合はエステル様のアミド結合であり、アルデヒド基を含有する物質の場合はイミド結合であり；そしてこの方法で製造される化合物および接合体を、任意に還元剤もしくは補助リガンドの存在下、塩の形態の金属と任意に反応させる；ことを特徴とする方法である。この発明の他の目的は、乾燥形態もしくは溶液形態の、式Ｉで表される化合物またはこの化合物と、ペプチド類、タンパク質類、生体分子類もしくは巨大分子類および受容体結合物質類との接合体、および任意に還元剤と補助リガンド、ならびに上記化合物を、過テクネチウム酸塩もしくは過レニウム酸塩の溶液の形態のTc-99mもしくはＲｅと反応させる指示を含む使用説明書からなる、放射性医薬を製造するためのキットである。この発明の他の目的は、上記定義のこの発明の化合物を含有することを特徴とする、放射線療法および放射線診断法に用いる放射性医薬製剤である。これらの放射性医薬製剤は、通常のガレヌス補助剤および保持物質を含有しおよび／またはリポソームの形態でもよい。金属と錯体を作るのにシステインなしのペプチドを用いると大きな利点がある。したがってこの発明のペプチドは、高価な保護基の方法を使わずにかつできるだけ短い時間で、製造し臓器特異的プローブと結合させることができる。抗体類もしくは部分抗体類の配列；ペプチド構造体類、例えばエンドセリン類、エンドセリン誘導体類、部分エンドセリン配列類、エンドセリン類似体類、もしくはエンドセリンアンタゴニスト類；ホルモン類；神経ホルモン類；神経伝達物質類；成長刺激因子類；植物ホルモン類；フェロモン類；酵素補因子類；酵素基質類；受容体に特異的に結合する医薬類；またはオリゴヌクレオチド類を、臓器特異的プローブとして使用できる。上記の群から選択される化合物は、例えばオキシトシン類、バソプレシン類、アンギオテンシン類、メラニン細胞刺激ホルモン類、ソマトスタチン類、チロトロピン放出ホルモン類、ゴナドトロピン放出ホルモン類、テストステロン類、エストラジオール類、プロゲステロン類、コルチゾール類、アルドステロン類、ビタミンＤ、ガストリン類、セクレチン類、ソマトロピン類、プロスタグランジン類、ニューロテンシン類、インスリン類、グルカゴン類、カルシトニン類、成長ホルモン放出ホルモン類、プロラクチン類、エンケファリン類、エンドルフィン類、ドパミン類、ノルエピネフリン類、グルタメート類、セロトニン類、アセチルコリン類、エピネフリン類、インターロイシン類、アンギオゲニン類、サイモポエチン類、エリスロポエチン類、ゼアチン類、ジベレリン酸誘導体類、酵母因子類、昆虫フェロモン類、補酵素Ａ、フィブリノーゲン類、アンギオテンシノーゲン類、メカミラミン、ランチジン、シメチジン、ロバスタチン、またはイソプロテレノール誘導体類である。この発明のペプチド類と臓器特異的プローブとからなる接合体も、全体として遺伝子工学によって単離することができる。さらに、金属との錯体を作る結合部位は、臓器特異的プローブに生成させることができる。第一に、抗体のような臓器特異的プローブのアミノ酸配列の三次元配置を決定する。原子半径と結合角を考慮して、微分幾何学のような数学的および幾何的方法を用いて、結合する可能性がある部位を探す。これらの結合する可能性がある部位において、金属と錯体を作るアミノ酸を余り充分にコードしないかまたは全くコードしないヌクレオチドは、それに突然変異を誘発して、金属と錯体を作るアミノ酸をコードするヌクレオチドで置換することができる。金属と錯体をつくる部位を生成させる方法としては、金属との錯体形成に関与していないアミノ酸によって形成されている一つもしくはいくつもの「ループ」が割り込んでいる金属との錯体生成に関与している一つもしくはいくつものアミノ酸を置換する方法がある。金属と錯体をつくる部位は分子生物学の公知の方法によって生成され、例えばＴ４ポリメラーゼと選択プライマーを用いる二本鎖プラスミド−ＤＮＡ突然変異誘発法（Dengら、Anal．Bioch.，200巻、81〜88頁、1 92）またはＰＣＲを利用する二本鎖プラスミド−ＤＮＡ突然変異誘発法(Landtら、Gene、96巻、125〜128頁、1990年)がある。このようにして操作され修飾された臓器特異的プローブは次に遺伝子工学の技術を用いて発現させることができる。生体分子自体は、腫瘍、臓器、組織または炎症の病巣の同定およびそれらに結合するような生物学的特性を保持しながらその上に安定して金属を捕捉することができることを特徴とするように上記の方法で修飾することができる。したがって、前記生体分子中に、残基Ｒ¹とＲ²が適切に修飾された生体分子のそれぞれのセグメントで形成されている一般式Ｉに対応する領域が生成する。さらに、部位特異的突然変異誘発によって生体分子を変化させて、一般式Ｉのいくつもの領域を生体分子中に形成することができる。次に、部位位置が生体分子の異なるセグメントまたはセクションによって与えられる錯体製造法で金属錯体が生成され、この場合、個々の配位位置は、任意のアミノ酸連鎖もしくは他のスペーサに割り込まれていてもよい。その生体分子の元の特性、特に臓器特異的プローブとして機能する性能が保持されていることがいずれにしても重要である。この発明のペプチドは、所定の金属結合位置を有し、優れた金属錯体生成特性を示す。この発明のペプチドは生体内で安定性が高いことが特徴である。表１に、ウシ血漿中でのTc-ペプチド錯体の安定性について実施例５で測定されたデータを列挙した。これらＴｃ錯体類は４時間安定である。この時間はこの発明の化合物類を用いて治療および診断するのに充分な時間である。例えばＣＥＡに対する部分抗体配列およびこの発明のペプチドで構成されている接合体は、システインなしのペプチドを用いると、望ましくないジスルフィド架橋が生成して発現中に折りたたみが生じる欠陥接合体が生成することが防止されるので、その免疫原性を保持しながら、遺伝子工学の方法を用いて発現させることができることが発見されたのである。詳しく述べると、DD-252200と表示されているα−ＣＥＡ−抗体（B4F/C3号）またはそのフラグメント例えばFab₂、FabもしくはsFv、およびシステインなしの Tc-99m−錯体形成性ペプチドで構成されている放射能標識をつけた臓器特異的プローブは、腫瘍に対して特異的にかつ安定して結合し、腫瘍内への特異的な蓄積が非常に迅速に起こることが発見されたのである。上記抗体を製造するために使用したハイブリッド細胞クローンは、以前のＧＤＲのCentral Institute for Microbiologyに登録番号B4-F/C3で寄託した（リスト1988年）。軽鎖の可変部と重鎖の可変部の配列を決定した。前記領域および合成リンカーのヌクレオチド配列と関連アミノ酸配列を図１に示す。さらに、他の部分に存在している接合体の一部分は急速に身体から消失することが発見された。高濃度の放射能標識接合体によって、シンチレーションカメラまたは核医学に用いられる他の装置を用いて極めて優れた腫脹の位置確認を容易に行えるようになり、その造影は、Ｓ／Ｎ比に優れていることが特徴である。この発明の接合体の他の顕著な特徴は、最適に腫瘍の位置確認を行うのに要する時間が、腫瘍中に特異的に高度に蓄積しかつ薬剤動態が好ましいので、短くなり、そのため患者の暴露時間、特に放射線に対する暴露時間が最小になることである。驚くべきことには、システインなしの金属錯体形成性ペプチド類自体が肝機能の診断に用いることができることが発見された。表２、３および４は、この発明の化合物の臓器分布と排出動態を示す。これらの試験は実施例2.3、3.3および6.3に記載されているようにして行った。放射線の線量の大部分は、その後、肝臓に見出される。この作用は、肝機能を検査するのに利用できる。さらに、部分エンドセリンの配列とTc-99m-錯体形成性ペプチドで構成された放射能標識臓器特異的プローブは、血管のアテローム硬化性病変部に特異的に蓄積することが発見された。この場合もやはり、そのプローブは、アテローム硬化性病変部に特に迅速に蓄積するので早期に高コントラストの視覚化を行うことができる接合体である。図２と図３は、部分エンドセリンの配列his-leu-asp-ile-ile-trpと接合されたTc−錯体形成化合物の蓄積性を示す（実施例７参照）。この発明のペプチドおよび臓器特異的プローブと結合させて得た接合体は、キットの形態で診断または治療の手段として使用するのに特に適している。以下の実施例によってこの発明を説明する。ペプチド合成についての一般的な説明 Fmocで保護された（9-フルオレニルメトキシカルボニル）誘導体は、Ｎ保護アミノ酸として使用することが好ましい。一般式（Ｉ）で表される化合物は、合成樹脂上でカルボキシ末端からアミノ末端へと合成される。合成樹脂と共有結合している化合物は、97％トリフルオロ酢酸／２％トリイソブチルシラン／１％水を用いて室温で（２〜４ｈ）合成樹脂から分離し、次に分離ＨＰＬＣ［RP-18、0.1 ％トリフルオロ酢酸から60％アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸への勾配液使用（30分間以内）、流量10mL/min］によって洗浄する。実施例１１．１）ペプチド類 H₂N-met-gly-met-gly-his-gly-his-CONH₂（1.1.1） H₂N-met-gly-met-gly-his-gly-his-COOH（1.1.2）これらのペプチド類を上記の一般的な指示にしたがって合成し洗浄した。 C₂₈H₄₄N₁₂O₇S₂ Ｍｗ：計算値 724.8 実測値 726 (FAB-MS) C₂₈H₄₃N₁₁O₈S₂ Ｍｗ：計算値 725.8 実測値 727 (FAB-MS) １．２）下記ペプチドのテクネチウム-99m錯体（1.2） H₂N-met-gly-met-gly-his-gly-his-CONH₂（1.2.1）または H₂N-met-gly-met-gly-his-gly-his-COOH（1.2.2） 0.5mg（0.69μmol）のH₂N-met-gly-met-gly-his-gly-his-CONH₂またはH₂N-met -gly-met-gly-his-gly-his-COOHを300μLのリン酸緩衝液（Na₂HPO₄、0.5mol/L、 pH8.5）に溶解して得た溶液を、50μLの0.15molクエン酸三ナトリウム二水和物溶液および2.5μLの0.2mol塩化スズ（II）の水和物溶液と混合する。適正に混合した後、得られた反応混合物を、Mo-99/Tc-99mジエネレータ由来の過テクネチウム酸塩溶液（0.4〜0.9mCi）と混合し、室温で10分間インキュベートし、次いでろ過した（0.2μmフィルター）。標識付けは下記のＨＰＬＣを用いて分析する。MERK nucleosileカラム、125× ４mm、５μm；100％Ａから100％Ｂへの勾配液（7.5分以内）；溶離液Ａ：リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01M；pH2.0）；溶離液Ｂ：アセトニトリル／リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol；pH2.0）50:50（v/v）；流量：1.0mL/min。 Tc-99m錯体の放射化学的純度は95％以上である。実施例２２．１）ペプチド類 H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-CONH₂（2.1.1） H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-COOH（2.1.2）これらのペプチド類を上記の指示にしたがって合成し洗浄した。 C₂₆H₄₈N₁₂O₈S₂ Ｍｗ：計算値 720.8 実測値 722 (FAB-MS) C₂₆H₄₇N₁₁O₉S₂ Ｍｗ：計算値 721.8 実測値 723 (FAB-MS) ２．２）下記ペプチドのテクネチウム-99m錯体（2.2） H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-CONH₂（2.2.1）または H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-COOH（2.2.2）使用した溶液は次のとおりである。 50.0mgのSnCl₂を１mLの0.5mol/L HClに溶解しH₂O bidestを加えて10mLにした溶液（22.1mmol/L）。 0.5mol/Lのリン酸水素二ナトリウム溶液（pHはNaOHを用いてpH8.5に設定）（0 .1mol/L）。 10mLのH₂O bidestに溶解した500mgのクエン酸ナトリウム（170mmol/L）。 10.4mg（14.4μmol）のH₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-CON₂またはH₂N -arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-COOHを１mL NaOHに溶解した溶液（１mol/L ）。 100μLの過テクネチウム酸Tc-99mは活性が18.4MBq（498.4μCi）であった。実施方法： 150μLのarg-gly-met-gly-met-gly-gly-glyを750μLのリン酸緩衝液、150μL のクエン酸塩溶液、7.5μLのSnCl₂溶液および150μLの過テクネチウム酸Tc-99m 溶液と混合し、室温で20分間インキュベートした。この標識付けバッチを2793μ LのＰＢＳ（pH7.4）で希釈した。全容積：4000μL（pH7.4）は全活性が6.2MBq（ 168μCi）であった。その標識付けを以下のＨＰＬＣを用いて分析した。 MERCK nucleosileカラム、125×４mm、５μm；100％Ａから100％Ｂまでの勾配液（7.5分以内）；溶離液Ａ：リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol/L、pH2.0）；溶離液Ｂ：アセトニトリル／リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol/L；pH2.0）50:50（ v/v）；流量：1.0mL/min。 Tc-99m錯体の放射化学的収率は100％であった。２．３）H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-CONH₂のテクネチウム-99m錯体（2.2.1）の臓器への分布と排出 Tc-99m-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly（製造と標識付けについては実施例 2.1.１と2.2.1を参照）の臓器への分布と排出を、マウスに一回静脈投与を行った後に検査した。実施方法：種：マウス、NMRI、Schering SPF、約20g、n=12。投与量：100μL/動物、活性が155.4KBq（4.2μCi）、比活性が2.88KBq/nmol（ 77.8nCi/nmol）である54nmolのarg-gly-met-gly-met-gly-gly-glyに相当。時間：投与後0.25時間、１時間、３時間、５時間（各時間に３頭づつの動物使用）。パラメータ：血液、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、脳、脾臓、腸、皮膚、肺臓、骨類および残余の身体、ならびに尿と大便の放射能。ＰＢＳ（pH7.4）に溶解した物質を尾の静脈に投与した。動物は排泄物の受け容器付きのかごの中に入れ、投与後、上記容器に尿と大便を集めた。所定の時間毎に３頭の動物を殺して準備した。血液、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、脳、脾臓、腸、皮膚、肺臓、骨類および残余の身体、ならびに尿と大便の放射能をγ−カウンター（プログラムルーチンNo.９）を用いて測定した。以下の値を算出した。組織１g当りの線量％；各種臓器および尿と大便の線量％（表２参照）。実施例３３．１）ペプチド類 H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-CONH₂（3.1.1） H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-COOH（3.1.2）これらのペプチド類を上記の一般的な指示にしたがって合成し洗浄した。 C₂₂H₄₂N₁₀O₆S₂ Ｍｗ：計算値 606.75 実測値 605 (FAB-MS) C₂₂H₄₁N₉O₇S₂ Ｍｗ：計算値 607.7 実測値 609 (FAB-MS) ３．２）下記ペプチドのテクネチウム-99m錯体（3.2） H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-CONH₂（3.2.1）または H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-COOH（3.2.2）使用した溶液は次のとおりである。 50.0mgのSnCl₂を１mLの0.5mol/L HClに溶解しH₂O bidestを加えて10mLにした溶液（22.1mmol/L）。 0.5mol/Lのリン酸水素二ナトリウム溶液；NaOHでpHを8.5に設定（0.1mol/L）。 500mgのクエン酸ナトリウムを10mLのH₂O bidestに溶解した溶液(170mmol/L)。 10.6mg（17.5μmol）のarg-gly-met-gly-met-glyを１mLのNaOHに溶解した溶液（１mol/L）。 100μLの過テクネチウム酸Tc-99mは活性が18.4MBq（498.4μCi）であった。実施方法： 150μLのarg-gly-met-gly-met-glyを750μLのリン酸緩衝液、150μLのクエン酸塩溶液、7.5μLのSnCl₂溶液および200μLの過テクネチウム酸Tc-99m溶液と混合し、室温で20分間インキュベートした。この標識付けバッチを2742.5μLのＰＢＳ（pH7.4）を用いて希釈した。全容積：4000μL（pH7.4）は全活性が6.2MBq （168μCi）である。標識付けを以下のＨＰＬＣを用いて分析する。 MERCK nucleosileカラム、125×４mm、５μm；100％Ａから100％Ｂまでの勾配液（7.5分以内）；溶離液Ａ：リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol/L、pH2.0）；溶離液Ｂ：アセトニトリル／リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol/L；pH2.0）50:50（ v/v）；流量：1.0mL/min。 Tc-99m錯体の放射化学的収率は100％であった。３．３）H₂N-arg-gly-met-gly-met-gly-CONH₂のテクネチウム-99m錯体（3.2.1 ）の臓器への分布と排出 Tc-99m-arg-gly-met-gly-met-gly（製造と標識付けについては実施例3.1.1と3 .1.2を参照）の臓器への分布と排出を、マウスに一回静脈投与した後検査した。実施方法：種：マウス、NMRI、Schering SPF、約20g、n=12。投与量：100μL／動物、活性が155.4KBq（4.2μCi）、比活性が2.37KBq/nmol （64nCi/nmol）である66nmolのarg-gly-met-gly-met-glyに相当。時間：投与後0.25時間、１時間、３時間、５時間（各時間に３頭づつの動物使用）。パラメータ：血液、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、脳、脾臓、腸、皮膚、肺臓、骨類および残余の身体ならびに尿と大便の放射能。ＰＢＳ（pH7.4）に溶解した物質を尾の静脈に投与した。動物は排泄物の受け容器付きのかごの中に入れ、投与後に尿と大便を収集した。所定の時間毎に３頭づつ動物を殺して準備した。血液、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、脳、脾臓、腸、皮膚、肺臓、骨類および残余の身体ならびに尿と大便の放射能をγ−カウンター（プログラムルーチンNo.９）を用いて測定した。以下の値を算出した。組織１g当りの線量％；各種臓器ならびに尿と大便の線量％（表３参照）。実施例４４．１）H₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-CONH₂（4.1）上記ペプチドを上記の一般的指示にしたがって合成し洗浄した。 C₂₃H₃₈N₈O₁₁S Ｍｗ：計算値 634.7 実測値 636（FAB-MS）４．２）H₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-CONH₂のテクネチウム-99m錯体（4.2） 300μLのリン酸緩衝液（Na₂HPO₄、0.5mol/L、pH8.5）に0.5mg（0.8μmol）のH₂ N-glu-met-gly-asn-gly-glu-CONH₂（4.1）を溶解して得た溶液を、50μLの0.15 molクエン酸三ナトリウム二水和物溶液および2.5μLの0.2mol塩化スズ（II）二水和物溶液と混合する。その反応混合物を、Mo-99/Tc-99mジェネレータ由来の過テクネチウム酸塩溶液（0.4〜0.9mCi）と混合し、充分混合してから、室温で10 分間インキュベートし、次いでろ過する（0.2μmフィルター）。標識付けを下記のＨＰＬＣを用いて分析する。 MERCK nucleosileカラム；125×４mm、５μm；100％Ａから100％Ｂまでの勾配液（7.5分以内）；溶離液Ａ：リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01M、pH2.0）；溶離液Ｂ：アセトニトリル／リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol；pH2.0）50:50（v/v）；流量：1.0mL/min。 Tc-99m錯体の放射化学的純度は95％以上である。実施例５Ｔｃ−ペプチド錯体類の生体外での安定性タンパク質に結合していないＴｃ−ペプチド錯体の安定性を次のようにして測定した。ペプチドは上記の一般的な指示にしたがって合成し洗浄し、次いで実施例１に記載したようにして標識を付けた。0.5mL（0.5mCiに相当）の標識付けバッチを各々4.5mLのウシ血漿（Fa．Kraeber）またはＰＢＳと混合する。１mLの試料を混合してから１時間、２時間および４時間の後ただちに二つのバッチ各々から採取し、そのタンパク質を限外ろ過（Fa．AmiconによるCentricon30,000）によって分離する。そのろ液を下記のＨＰＬＣを用いて分離する。 MERCK nucleosileカラム、125×４mm、５μm；100％Ａから100％Ｂまでの勾配液（7.5分以内）；溶離液Ａ：リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01M、pH2.0）；溶離液Ｂ：アセトニトリル／リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol；pH2.0）50:50（v/v）；流量：1.0mL/min。 Tc-ペプチド錯体のタンパク質結合を、ウシ血漿およびＰＢＳとともにインキュベートした錯体のピーク面積の差から算出した。安定性は、ピーク面積の合計を100％として錯体のピーク面積の百分率を計算することによって求めた。検査されたペプチド錯体は４時間安定である（表１参照）。実施例６６．１）H₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-il e-ile-trp-COOH（6.1）上記ペプチドを上記の一般的な指示にしたがって合成し洗浄した。Ｍｗ：計算値 2029.31 実測値 2030（FAB-MS）６．２）H₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-il e-ile-trp-COOHのテクネチウム-99m錯体（6.2）使用した溶液は次のとおりである。 50mgのSnCl₂を10mLの0.1mol/L HClに溶解した溶液（22.1mmol/L）。 0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム溶液、NaOHを使ってpH7.5に設定（0.1mol/ L）。グルコン酸ナトリウム溶液（0.01mol/L H₂O bidest）。 500μLのH₂O（bidest）および100μLのリン酸緩衝液に0.5mg（0.272μmol）の H₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp- COOHを溶解して得た溶液。 100μLの過テクネチウム酸Tc-99mは活性が1.8MBq（48μCi）であった。実施方法：グルコン酸塩のTc-99mによる標識付け２mLのグルコン酸ナトリウムの溶液を、0.5mLの過テクネチウム酸Tc-99m溶液（37MBq／１mCi）と混合し次に15μLのSnCl₂溶液と２回混合する。上記グルコン酸塩が完全に標識付けがなされているかをＴＬＣ（シリカゲル60、溶離液アセトン）を用いて検査した。 H₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-tr p-COOHのグルコン酸Tc-99mによる標識付け。 120μLのH₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-il e-ile-trp-COOHを２mLのグルコン酸Tc-99m溶液と混合し、室温で15分間インキュベートした。全容積：2120μL（pH7.0）の全活性は7.1MBq（193.2μCi）である。標識付けを下記ＨＰＬＣを用いて分析する。 MERCK nucleosileカラム、125×４mm、５μm；100％Ａから100％Ｂまでの勾配液（８分間以内）；溶離液Ａ：リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01M、pH7.5）；溶離液Ｂ：アセトニトリル／リン酸緩衝液（Na₂HPO₄；0.01mol/1;pH7.5）50:50（v/v ）；流量：1.0mL/min。 Tc-99m錯体の放射化学的収率は95％であった。６．３）H₂N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-il e-ile-trp-COOHのテクネチウム-99m錯体（6.2）の臓器への分布と排出 Tc-99m-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile- ile-trp（製造と標識付けについては実施例6.1と6.2を参照）の臓器への分布と排泄を、マウスに一回静脈投与した後検査した。実施方法：種：マウス、NMRI、Schering SPF、約20g、n=12。投与量：100μL/動物、活性が111KBq（３μCi）、比活性＝459KBq/nmol（12.4 μCi/nmol）である242pmolのglU-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-hi s-leu-asp-ile-ile-trpに相当。時間：投与後0.25時間、１時間、３時間、５時間（各時間毎に３頭づつの動物を使用）。パラメータ：血液、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、脳、脾臓、腸、皮膚、肺臓、骨類および残余の身体ならびに尿と大便の放射能。ＰＢＳ（pH7.4）に溶解した物質を尾の静脈に投与した。動物は排泄物の受け容器付きのかごの中に入れ、投与後に尿と大便を収集した。上記の時間毎に３頭づつ動物を殺して準備した。血液、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、脳、脾臓、腸、皮膚、肺臓、骨類および残余の身体ならびに尿と大便の放射能をγ−カウンター（プログラムルーチンNo.９）を用いて測定した。以下の値を算出した。組織１g当りの線量％；各種臓器ならびに尿と大便の線量％（表４参照）。実施例７ WHHLウサギのアテローム硬化性血管病変部の検出 Tc-99m-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile -trpをWHHLウサギに１回静脈投与した後、アテローム硬化性血管病変部をγ−カメラで目視可能にした。製造と標識付けは実施例6.1および6.2に記載したのと同様に行った。実施方法：種：フロックスフィールド（Froxfield）ウサギHH047560、Emsicon-Jung、雌4 .3kg、1992年10月15日出生。1993年５月３日における血清中のコレステロールのレベルは24.6mmol/Lであった。麻酔法：Rompun/Ketavet（１：２）、約３ml筋肉内投与（初期）、100μL/min 静脈投与。投与量：１mL、活性が37MBq（１mCi）で比活性＝681kBq/nmol（18.4μCi/nmol ）である54.3nmolのglu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-as p-ile-ile-trpに相当。記録パラメータ：ガンマカメラ：Elcint SP4HR、エネルギー：140KeV、レイトモード（rate mode）：標準、コリメータ：４、モード：ワード、フレームサイズ：128、ズーム：１、回転180°。測定パラメータ：各種の臓器と大動脈内の相対強さ；観察期間：Tc-99m-glu-m et-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trpの静脈投与後の０〜５時間。異なる長さでかつ各種の位置からの平面的（二次元の）記録を全試験期間を通じて行った。ウサギはT-61（１mL）を使って５時間後に殺し、大動脈を取出し、スダンIIIで染色し、大動脈のオートラジオグラム(phosphorus imager)を作製した。発見事項：１mLのTc-99m-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-i le-ile-trpを、WHHLウサギに耳の静脈を通じて投与した。WHHLウサギは、ＬＤＬ受容体を欠いているかまたは不全であるため血液中のＬＤＬの濃度が高いので、自発的にアテローム硬化性血管病変が発生する。左側腹部の0.5h p.i.の記録は、心臓、肝臓、腎臓および膀胱に高い活性を示し骨類では活性が低かった。腹部大動脈領域におけるアテローム硬化性病変部が目視可能になっている（図２参照）。ウサギは投与してから５時間後に殺し、次にスダンIIIによる染色と大動脈のオートラジオグラムの作製を行った（図３参照）。比活性はプラークで353cpm/m m²であり、正常な大動脈壁で42cpm/mm²であった［強化係数（enrichment factor ）＝８］。実施例８Ｔｃ−結合ペプチドを有する一本鎖Fvフラグメント標準プロトコルにしたがって、マウス抗ＣＥＡを産生するハイブリッド細胞培養物からｍＲＮＡを単離し、適切なプライマーの組合わせでＰＣＲを行うための鋳型として働く前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを産生させて、抗体の完全なV_LとV_Hのコーディング領域を生成させるのに用いた。合成オリゴヌクレオチドを、(GGGGS)₃をコードするリンカーペプチドのために用い、そして他の合成オリゴヌクレオチドを、PPMGMGHG配列をコードするＴｃ− 結合ペプチド（Ｔｃペプチド）のために用いた。ＴＡＱポリメラーゼを用い標準プロトコルによるアセンブリングＰＣＲによって、V_H−リンカーV_L−T_c−ペプチドまたはV_L−リンカーV_H−T_c−ペプチドの配列をコードする構造体が得られた。イー・コリ（E．coli）のＴＧ１菌株での発現は、細胞周辺腔で可溶性の一本鎖Fvフラグメントとして発現させるためエルウイニア・カロディボラム(Erwinia carotivorum)由来のペクチン酸リアーゼのシグナルペプチドで集大成して、修飾ベクター（pHEN誘導体）内でクローン化した後に行った。発現は、リンカーペプチドまたはＴｃ−結合ペプチドに対するポリクロナール血清を用いウエスタンブロット法で確認した。細胞周辺腔の画分を浸透ショック法で得て次にその可溶性の一本鎖Fvフラグメントを、抗イデオタイプ抗体、リンカーペプチドに対する抗体、または金属キレートカラムによるＴｃ−ペプチドの金属イオンアフィニティーに基づいたアフィニティークロマトグラフィーで洗浄した。実施例９枠組み構造領域にＴｃ−結合位置を有する一本鎖Fvフラグメント一本鎖Fvフラグメントの構造体は実施例１に記載されているようにして製造したが、Ｔｃ−結合変異体を、合成プライマーを用いて、V_Lの枠組み構造領域（位置L:36〜L:43のループ）またはV_Hの枠組み構造領域（位置H:38〜H:45のループ）において部位特異的突然変異を起こさせて製造した。なおこれら変異体は、V_H領域もしくはV_L領域、またはＴｃ標識付けを改善するため両方の領域にMGMGHGのループ配列を有している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/32 8615−4ＣＡ６１Ｋ 43/00 // Ｃ０７Ｋ 103:00 9454−4Ｃ 49/02 Ａ 105:00 (72)発明者ディンケルボルク、ルードゥガードイツ連邦共和国デー・13585 ベルリンエムデンツァイレ５ (72)発明者エルバー、セバスチアンドイツ連邦共和国デー・84030 エァゴルディングリンデンシュトラーセ 82 (72)発明者フレムメル、コルネリウスドイツ連邦共和国デー・15738 ツォイテンマキシム―ゴーリキ―シュトラーセ 17 (72)発明者ヘーネ、ヴォルフガンクドイツ連邦共和国デー・12683 ベルリンイルマシュトラーセ５ (72)発明者クランプ、ヴォルフガングドイツ連邦共和国デー・13503 ベルリンダムヴィルトスタイグ 41アー (72)発明者キュットゥナー、ガブリエレドイツ連邦共和国デー・10405 ベルリンクリストブルガーシュトラーセ 41 (72)発明者マリン、ラインハルトドイツ連邦共和国デー・10965 ベルリンヨルクシュトラーセ 70 (72)発明者シィアー、ハンスマルチンドイツ連邦共和国デー・15344 シュトラウスベルクベルリナーシュトラーセ 34 (72)発明者シュナイダー−メルゲナー、イェンスドイツ連邦共和国デー・10717 ベルリンホーエンツォレルンダム７ (72)発明者シュタインブレッヒァー、レナーテドイツ連邦共和国デー・12247 ベルリンカウルバッハシュトラーセ 31

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式Ｉ：Ｒ¹−Ｘ−Ｒ² （Ｉ）［式中、Ｘは同一もしくは異なる20個のα−、β−および／またはγ−アミノ酸残基の連鎖であり、前記連鎖はメチオニン、アルギニン、リシンおよびアスパラギンの群に属するアミノ酸を少なくとも一つ含有し、システインを含有せず、そしてそのＮ末端に自由原子価、または水素原子を置換することによってＸに結合される残基Ｒ¹を有し、そしてそのＣ末端に自由原子価、またはヒドロキシ基を置換することによってＸに結合される残基Ｒ²を有し；Ｒ¹は水素原子；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル基、アリール基、アルキルアリール基、アラルキル基、アルキルカルボニル基またはアリールカルボニル基であり；Ｒ²はヒドロキシ基；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で各々任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルコキシ基またはアリールオキシ基；アミノ基；Ｎ（Ｒ^aＲ^b）基（式中、Ｒ^aとＲ^bは同一もしくは異なってもよく、ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状のアルキル残基もしくはアシル残基である）；またはリン酸残基である］で表される化合物；上記化合物とペプチド類、タンパク質類、生体分子類または巨大分子類との接合体；ならびに上記化合物と金属イオンとの錯体および上記化合物の水溶性塩。２．連鎖Ｘが３〜15個のアミノ酸で構成されていることを特徴とする請求項１記載の化合物。３．連鎖Ｘが３〜８個のアミノ酸で構成されていることを特徴とする請求項１記載の化合物。４．Ｒ¹が単結合または水素原子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の化合物。５．Ｒ²が単結合、ヒドロキシ基またはアミノ基であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の化合物。６．下記の配列を含有することを特徴とする請求項１記載の化合物。７．接合体が罹病組織中または腫瘍中に選択的に蓄積する物質との接合体であり、それらの物質と式Ｉで表される化合物との間に共有結合が存在し、その結合は、ペプチド類、タンパク質類、抗体類またはそのフラグメントのようなアミノ基を含有する物質の場合はエステル様のアミド結合であり、そしてアルデヒド基を含有する物質の場合はイミド結合であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の化合物。８．罹病組織中に蓄積する物質が、ホルモン類、神経ホルモン類、神経伝達物質類、生長刺激因子類、植物ホルモン類、フェロモン類、酵素補助因子類、酵素基質類、受容体に特異的に結合する医薬類、またはオリゴヌクレオチド類であることを特徴とする請求項７記載の化合物。９．罹病組織中に蓄積する物質が、オキシトシン類、バソプレシン類、アンギオテンシン類、メラニン細胞刺激ホルモン類、ソマトスタチン類、チロトロピン放出ホルモン類、ゴナドトロピン放出ホルモン類、テストステロン類、エストラジオール類、プロゲステロン類、コルチゾール類、アルドステロン類、ビタミンＤ、ガストリン類、セクレチン類、ソマトロピン類、プロスタグランジン類、ニューロテンシン類、インスリン類、グルカゴン類、カルシトニン類、成長ホルモン放出ホルモン類、プロラクチン類、エンケファリン類、エンドルフィン類、ドパミン類、ノルエピネフリン類、グルタメート類、セロトニン類、アセチルコリン類、エピネフリン類、インターロイシン類、アンギオゲニン類、サイモポエチン類、エリスロポエチン類、ゼアチン類、ジベレリン酸誘導体類、酵母因子類、昆虫フェロモン類、補酵素Ａ、フィブリノーゲン類、アンギオテンシノーゲン類、メカミラミン、ラニチジン、シメチジン、ロバスタチン、またはイソプロテレノール誘導体類であることを特徴とする請求項８記載の化合物。 10．罹病組織中または腫瘍中に蓄積する物質が、ペプチド類もしくはタンパク質類；特に抗体類；F(ab)₂、F(ab)、一本鎖抗体類もしくはＣＤＲのような抗体フラグメントであることを特徴とする請求項７記載の化合物。 11．罹病組織中または腫瘍中に蓄積する抗体がα−ＣＥＡ−抗体（この抗体を製造するのに使用されるハイブリッド細胞クローンは、Central Institute of M olecular Biologyに登録番号B4-F/C3（1988年のリスト）で寄託されている）またはそのF(ab)₂、Ｆ(ab)（sFvフラグメントもしくはＣＤＲ）であることを特徴とする請求項10記載の化合物。 12．罹病組織中に蓄積する物質が、エンドセリン類、部分エンドセリン配列類、エンドセリン類似体類、エンドセリン誘導体類またはエンドセリンアンタゴニスト類のようなペプチド類であることを特徴とする請求項７記載の化合物。 13．ペプチド類が、下記の配列：または部分配列：または環状アミノ酸配列：を含有することを特徴とする請求項12記載の化合物。 14．錯体の金属イオンが放射性核種であることを特徴とする請求項１〜13のいずれか一つに記載の化合物。 15．放射性核種が、元素：Ｔｃ、Ｒｅ、Ａｔ、ＩｎまたはＧａの同位元素であることを特徴とする請求項14記載の化合物。 16．放射性核種がTc-99mであることを特徴とする請求項14記載の化合物。 17．一般式Ｉ：Ｒ¹−Ｘ−Ｒ² （Ｉ）［式中、Ｘは同一もしくは異なる20個のα−、β−および／またはγ−アミノ酸残基の連鎖であり、前記連鎖はメチオニン、アルギニン、リシンおよびアスパラギンの群に属するアミノ酸を少なくとも一つ含有し、システインを含有せず、そしてそのＮ末端に自由原子価、または水素原子を置換することによってＸに結合される残基Ｒ¹を有し、そしてそのＣ末端に自由原子価、またはヒドロキシ基を置換することによってＸに結合される残基Ｒ²を有し；Ｒ¹は水素原子；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル、アリール、アルキルアリール、アラルキル、アルキルカルボニルまたはアリールカルボニルの基であり；Ｒ²はヒドロキシ基；ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で各々任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状もしくは直鎖状のアルコキシ基またはアリールオキシ基；アミノ基；Ｎ（Ｒ^aＲ^b）基（式中、Ｒ^aとＲ^bは同一もしくは異なってもよく、ヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシ基で任意に置換されている、炭素数10以下の分枝鎖状のアルキル残基もしくはアシル残基である）；またはリン酸残基である］で表される化合物；上記化合物とペプチド類、タンパク質類、生体分子類もしくは巨大分子類との接合体；ならびに上記化合物と金属イオンとの錯体類；の製造方法であって；ａ）アミノ酸類が所望の順序で続いて公知の方法によってアミド結合され、そのアミノ酸類は合成樹脂に結合され、そして前記アミノ酸類はペプチド合成が完了してから合成樹脂から分離されるか、またはｂ）一般式（Ｉ）の化合物をコードするオリゴもしくはポリヌクレオチドを、これらの化合物を化学的に合成する公知の方法で、ヌクレオチドのＣ−５’のヒドロキシル基を他のヌクレオチドのリン酸基に結合させるか、もしくは標識を付けたオリゴヌクレオチドを用いてコーディングｍＲＮＡストリングを検出し、そのｍＲＮＡを単離し、次いでそのｍＲＮＡでｃＤＮＡを形質転換し、そしてポリメラーゼ連鎖反応で該ｃＤＮＡを増幅させることによって製造し；通常の発現ベクター中に入れ次いで原核細胞もしくは真核細胞の中で発現させ；そしてこの方法で製造された化合物を、罹病組織中または腫瘍中に選択的に蓄積する物質と必要に応じて接合し、そして前記物質と式Ｉで表される化合物の間に共有結合が存在し、その結合は、ペプチド類、タンパク質類、抗体類またはそのフラグメント類を含有する物質の場合はエステル様のアミド結合であり；アルデヒド基を含有する物質の場合はイミド結合であり；そしてこの方法で製造される化合物および接合体を、任意に還元剤もしくは補助リガンドの存在下、塩の形態の金属と任意に反応させる；ことを特徴とする方法。 18．乾燥形態もしくは溶液の形態の、請求項１〜13のいずれか一つに記載の化合物および還元剤および任意に補助リガンド、ならびに上記化合物を、過テクネチウム酸塩もしくは過レニウム酸塩の溶液の形態のTc-99mもしくはＲｅと反応させる指示を含む使用説明書からなる、放射性医薬を製造するためのキット。 19．請求項１〜16のいずれか一つに記載の化合物を含有することを特徴とする、放射線療法または放射線診断法に用いる放射性医薬製剤。 20．請求項１〜16に記載の化合物をリポソームの形態で含有することを特徴とする請求項19記載の放射医薬製剤。