JP2002506424A - ガストリン受容体−親和性ペプチド結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 治療用または診断用放射性薬剤として使用するための化合物は、ガストリン放出ペプチド受容体に結合することができる残基に結合した医学的に有用な金属を錯化することができる基を含む。新生物疾患を有する被験体を治療するための方法は、腫瘍細胞上に発現され次に細胞内にインタナリゼーションされるガストリン放出ペプチド受容体に結合することができる残基に結合したキレート化基とキレート化した金属を有する、有効量の放射性薬剤を被験体に投与する工程を含む。治療用および診断用化合物の形成法は、金属シントンを、ガストリン放出ペプチド受容体に結合することができる残基に共有結合したキレート化基と反応させることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ガストリン受容体−親和性ペプチド結合体 技術分野 本発明は、放射性薬剤として有用な放射性核種標識化合物に関する。さらに詳 しくは本発明は、放射性核種に結合した時、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ） 受容体を発現する癌細胞の有用な治療薬およびイメージング剤であるボンベシン （ＢＢＮ）類似体と金属錯化基との結合体に関する。 発明の背景 ヒト患者の癌を選択的に標的とする放射性薬剤を使用する癌の検出と治療は、 数十年間使用されている。残念ながら、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）により認可されており日常 的に使用されている、癌細胞中またはその近くに非常に特異的なインビボ局在を 示す部位特異的放射性薬剤はほんのわずかである。腫瘍のインビボターゲティン グに高い親和性と高い特異性を有するより優れた生体分子担体の出現のため、新 しい放射性薬剤の開発に非常に大きな関心がある。モノクローナル抗体（ＭＡｂ ）、抗体断片（Ｆ_AB'および(Ｆ_AB)'₂）、受容体−親和性ペプチドを含むいくつ かのタイプの薬剤が開発されており研究されている［ブッシュバウム（Ｂｕｓｈ ｂａｕｍ）、１９９５；フィッシュマン（Ｆｉｓｃｈｍａｎ）ら、１９９３；シ ュビガー（Ｓｃｈｕｂｉｇｅｒ）ら、１９９６］。 放射性薬剤を産生するための放射能標識受容体−親和性ペプチドを使用するこ との有用性の可能性は、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ結合オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏ ｔｉｄｅ）（ＦＤＡ認可済診断イメージング剤、オクトレオスキャン（Ｏｃｔｒ ｅｏｓｃａｎ）（登録商標）、マリンクロット・メディカル・インク（Ｍａｌｌ ｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）により米国で販売されている［ ロウバーツ（Ｌｏｗｂｅｒｔｚ）ら、１９９４］）により例示する。この放射性 薬剤は、ヒトホルモンソマトスタチンの小ペプチド類似体であるオクトレオチド の¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ結合体である。この薬物は、神経内分泌癌 （例えば、カルチノイドＣａ、神経芽腫など）ならびに他の癌で過剰産生されて いるソマトスタチン受容体に特異的に結合する［クレニング（Ｋｒｅｎｎｉｎｇ ）ら、１９９４］．インジウム−１１１（¹¹¹Ｉｎ）はシンチ造影法の理想的な 放射性核種ではないため、^99mＴｃ（診断イメージングの最適な放射性核種）で 標識される他のソマトスタチン類似体や他の受容体−親和性生体分子が研究・開 発されている［エッケルマン（Ｅｃｋｅｌｍａｎ）、１９９５；バラバジョスラ （Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ）ら、１９９６］。 ボンベシン（ＢＢＮ）は、ヒトガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体に高 い特異性で結合しかつＧＲＰと同様な親和性を有する、ＧＲＰの類似体である１ ４アミノ酸ペプチドである［デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９２］。ＧＲＰ受 容体は、数種の癌細胞において過剰発現するか、またはユニークに発現すること が証明されている。ＧＲＰ受容体アゴニスト（オートクリン因子も）の結合は、 これらの癌細胞の細胞分裂の速度を上昇させる。このため、アンタゴニストであ るＢＢＮまたはＧＲＰ類似体を開発するための多くの研究がされてきたし、また 続行されている［デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９２；ホフケン（Ｈｏｆｆｋ ｅｎ）、１９９４；ムーディー（Ｍｏｏｄｙ）ら、１９９６；コイ（Ｃｏｙ）ら 、１９８８；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９４］。これらのアンタゴニストは、ＧＲ Ｐ受容体に対する内因性ＧＲＰ結合を競合的に阻害し、かつ癌細胞増殖の速度を 低下させるように設計されている［ホフケン（Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４］。 これらの非放射活性ペプチドとともにこれらのアンタゴニストを使用する癌の治 療には、長期の注射による投薬法を必要とする（例えば、毎日大量の薬物を使用 する）。 癌の診断薬または治療薬として使用するための有効な受容体−親和性放射性薬 剤を設計する際に、この薬物が適切なインビボターゲティング性および薬物動態 性を有することが重要である［フリッツバーグ（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ）ら、１９ ９２；エッケルマン（Ｅｃｋｅｌｍａｎ）、１９９３］。例えば、放射標識受容 体−親和性ペプチドが、癌細胞（例えば、ＧＲＰ受容体を介して）によって非常 に特異的に取り込まれることが必須である。さらに、一旦放射性核種が腫瘍部位 に局在した時、長期にそこに留まることにより非常に局在した放射線を腫瘍に送 達することが必要である。腫瘍における放射標識ＢＢＮ類似体の充分に高い特異 的な取り込みを達成するためには、有望な誘導体の結合親和性が高く（すなわち 、Ｋ_d≒１〜５nmol以下）放射活性を長期に保持することが必要である［エッケ ルマン（Ｅｃｋｅｌｍａｎ）ら、１９９５；エッケルマン（Ｅｃｋｅｌｍａｎ） ら、１９９３］。しかし¹²⁵Ｉ−ＢＢＮ誘導体による研究は、¹²⁵Ｉ−ＢＢＮ誘導 体（アゴニストであろうとアンタゴニストであろうと）を結合する癌細胞では、 放射活性は急速に細胞（インビトロ）から洗浄または排出されることを示してい る［ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら、１９９７］。すなわち、これらの型の誘導 体は、有効な治療薬または診断薬になるために充分に長く腫瘍部位（インビボ） に「捕捉（ｔｒａｐｐｅｄ）」され続ける可能性は低い。 正常組織から効率的に排除される放射標識ペプチドを開発することもまた重要 であり、かつ治療薬にとって特に重要な因子である。金属放射性核種により（キ レート結合を介して）生体分子（例えば、ＭＡｂ、Ｆ_AB’またはペプチド）を標 識するとき、通常高い割合の金属放射性核種（ある種の化学的形態）が腎臓また は肝実質のいずれかに「捕捉」される（すなわち、尿または胆汁中に排泄されな い）［ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）ら、１９９７；マッテス（Ｍａｔｔｅｓ）、１ ９９５］。これより小さい放射標識生体分子（すなわち、ペプチドまたはＦ_AB’ ）では、活性のクリアランスの主要な経路は腎臓経由であり、そのため腎臓には 高レベルの放射活性金属が残る（すなわち、普通注射用量の＞１０〜１５％）［ ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）ら、１９９７］。このため、金属放射性核種を組み込 む治療薬の開発には克服すべき大きな問題が現れる（そうしなければ、腎臓に対 する放射線量が過剰になる）。例えば、ＦＤＡ認可済診断薬の¹¹¹Ｉｎ−オクト レオチドは、患者の腎臓において高い取り込みと保持を示す［エッケルマン（Ｅ ｃｋｅｌｍａｎ）ら、１９９５］。腎臓に対する放射線量は好ましい量より高い が、これは、これが診断用放射性薬剤（これはアルファ−またはベータ−粒子を 放出しない）であるために許容しうるものであり、腎線量は臓器に対して観察可 能な放射線誘導損傷を引き起こさない。 アゴニストであるＢＢＮ誘導体を非金属化結合体に結合させることにより、親 ＢＢＮ誘導体と同等かまたはおよそ一桁程度低い、ＧＲＰ受容体に対する結合親 和性を示すことが今や見い出された［リー（Ｌｉ）ら、１９９６ａ］。我々の最 近の結果と合わせたこれらのデータは、放射性金属キレートをアゴニストである ＢＢＮ類似体に付加し、かつ有望な放射性薬剤としてのさらなる開発のために充 分に高い（すなわち、約１〜５nmol Ｋ_d）ＧＲＰ受容体結合親和性を保持する ことが可能であることを証明している。これらのアゴニスト結合体は、細胞表面 ＧＲＰ受容体への結合後に細胞内輸送されて、細胞の内側に長期に保持される。 さらに、正常マウスにおけるインビボ研究は、腎臓中の放射性金属の保持は低く （すなわち、＜５％）、放射活性の大部分は尿中に排泄されることを示している 。 本発明の１つの側面により、ＢＢＮの受容体結合領域［例えば、ＢＢＮ（８− １４）］に共有結合して、ＧＲＰ受容体との高い特異的結合親和性を有する放射 標識ＢＢＮ類似体を形成する放射性金属キレートから本質的になるＢＢＮ結合体 が提供される。これらの類似体は、ＧＲＰ発現癌細胞の内側に長時間保持される 。さらに、腎臓保持が最小である血流から尿中へのこれらのクリアランスは、効 率的である。好ましくは、放射性金属は、^99mＴｃ、^186/188Ｒｅ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁵³ Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙまたは¹⁹⁹Ａｕから選択され、そしてこれら全てが、癌患者 における診断的（すなわち、^99mＴｃ）または治療的（すなわち、^186/188Ｒｅ、¹⁰⁵ Ｒｈ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙおよび¹⁹⁹Ａｕ）用途に有望である［シュビガ ー（Ｓｃｈｕｂｉｇｅｒ）ら、１９９６；エッケルマン（Ｅｃｋｅｌｍａｎ）、 １９９５；トロウトナー（Ｔｒｏｕｔｎｅｒ）、１９７８］。 発明の要約 本発明により、ガストリン放出ペプチド受容体に結合することができる残基に 結合した金属を錯化することができる基を含む、治療用または診断用放射性薬剤 として使用される化合物が提供される。 さらに本発明により、癌細胞上のガストリン放出ペプチド受容体に結合し、次 に細胞内で輸送および残留することができる残基に結合したキレート化基とキレ ート化した金属を含む、有効量の放射性薬剤を被験体に投与する工程を含む、新 生物疾患を有する被験体を治療するための方法が開示する。 さらに本発明により、金属シントンをガストリン放出ペプチド受容体に結合す ることができる残基と共有結合したキレート化基に反応させる工程を含む、治療 用または診断用化合物を形成する方法が開示する。 図面の簡単な説明 本発明の他の利点は、添付した図面と関連づけて以下の詳細な説明を参照する ことにより良好に理解される。 図１は、本発明の放射性金属結合体を示し； 図２は、｛Ｒｈ［１６］ａｎｅＳ₄−ｏｌＣｌ₂｝⁺のＯＲＴＥＰ図であり、ロ ジウム大環の結晶構造を示し； 図３は、スペーサー基がボンベシンアゴニスト結合残基に結合する、結合反応 を示し； 図４は、金属キレートをペプチドに結合するための結合反応を示し； 図５は、そのＩＣ₅₀を含む数種のヨウ素化ボンベシン類似体を示し； 図６は、数種のつながったボンベシン類似体を示し； 図７は、数種の［１６］ａｎｅＳ₄ボンベシン類似体を示し； 図８は、置換リガンドのモル濃度に対するＩ−１２５−ＢＢＮの総取り込み量 ％を示したＩＣ₅₀分析を示すグラフであり； 図９は、数種のロジウム−［１６］ａｎｅＳ₄ボンベシン類似体を示し； 図１０は、ロジウム−ＢＢＮ−３７のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ここで （Ａ）は¹⁰⁵ＲｈＣｌ₂−ＢＢＮ−３７を示し、そして（Ｂ）はＲｈＣｌ₂−ＢＢ Ｎ−３７を示し； 図１１は、スイス３Ｔ３細胞からの¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ボンベシンのインターナ リゼーション流出を示すグラフであり； 図１２は、Ｉ−１２５不含緩衝液中のＩ−１２５ボンベシンのインターナリゼ ーション流出を示し、ここでスイス３Ｔ３細胞からの¹²⁵Ｉ−Ｌｙｓ³−ＢＢＮの 流出に対する¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮが示され； 図１３は、スイス３Ｔ３細胞からの¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の流出を示すグラ フであり； 図１４は、そのＩＣ₅₀を含む数種の¹⁰⁵ロジウムボンベシン類似体を示し； 図１５は、スイス３Ｔ３細胞からの¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−６１の流出を示すグラ フであり； 図１６は、スイス３Ｔ３細胞からの¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７に対する¹⁰⁵Ｒｈ− ＢＢＮ−２２の流出を示すグラフであり； 図１７は、膵ＣＡ細胞結合を示すグラフであり、ここで（Ａ）はＣＦ ＰＡＣ １細胞からの流出¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮを示し、そして（Ｂ）はＣＦＰＡＣ１ 細胞からの¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の流出を示し；そして 図１８は、前立腺ＣＡ細胞結合を示すグラフであり、ここで（Ａ）はＰＣ−３ 細胞からの¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮの流出を示し、そして（Ｂ）はＰＣ−３細胞 からの¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の流出を示す。 図１９は、５［１６］ａｎｅＳ₄ボンベシン類似体を示す。 図２０は、４つのロジウム−［１６］ａｎｅＳ₄ボンベシン類似体を示す。 図２１は、３つの異なるＢＢＮ（７−１４）のＮ₃Ｓ−ＢＦＣＡ結合体を示す 。 図２２は、^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図２３は、ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３細胞）からの^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２ ２のインターナリゼーション流出を示すグラフである。 図２４は、ヒト膵腫瘍細胞（ＣＦＰＡＣ−１細胞）からの^99mＴｃ−ＢＢＮ− １２２のインターナリゼーション流出を示すグラフである。 図２５は、ＰＣ−３前立腺癌細胞における^99mＴｃ−ＲＰ−４１４−ＢＢＮ− ４２の保持を示すグラフである。 図２６は、ＣＦＰＡＣ−１膵癌細胞における^99mＴｃ−４２の保持を示すグラ フである。 発明の詳細な説明 本発明により、診断用および／または治療用放射性薬剤として使用するための 化合物は、図１に示すガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体に結合すること ができる残基に結合した金属を錯化することができる基を含む。ＧＲＰ受容体に 特異的結合をすることができる残基は、ＧＲＰアゴニストである。ＧＲＰアゴニ ストはＧＲＰ受容体と相互作用すると、ＧＲＰ受容体による応答を活性化または 発生し、次いでエンドサイトーシスにより細胞の内側にインターナリゼーション をする。これとは対照的に、ＧＲＰアンタゴニストは、アゴニストの効果を妨げ て、細胞の内側にインターナリゼーションをされることはない。 さらに具体的にはＧＲＰアゴニストは、高い親和性および選択性でＧＲＰ受容 体と結合後に細胞を活性化することが知られており、かつ金属錯化基に共有結合 することができる選択されたアミノ酸配列またはペプチドミメティックのような 化合物である。ＧＲＰ受容体に対する高いアンタゴニストおよびアゴニスト結合 親和性を有する配列を産生するために作成できるＢＢＮ（８−１４）の具体的な 修飾の多くの例は、多くの研究に報告されている［デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、 １９９２；ホフケン（Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４；ムーディー（Ｍｏｏｄｙ） ら、１９９６；コイ（Ｃｏｙ）ら、１９８８；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９４；ム ーディー（Ｍｏｏｄｙ）ら、１９９５；レバン（Ｌｅｂａｎ）ら、１９９４；カ イ（Ｃａｉ）ら、１９９２］。 本発明の好適な実施態様において、金属錯化基または残基は、¹⁰⁵Ｒｈ−、^{186 /188} Ｒｅ−、^99mＴｃ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙまたは¹⁹⁹Ａｕのような金属を錯 化するキレート化剤またはキレーターである。キレート化剤またはキレーターは 、ＧＲＰアゴニストの「結合領域」に付加または結合して、ＧＲＰ受容体への高 い親和性および特異的結合能力を保持する結合体を産生する。 本発明のさらに好適な実施態様においてＧＲＰアゴニストは、ボンベシン（Ｂ ＢＮ）類似体および／またはその誘導体である。ＢＢＮ誘導体またはその類似体 は、好ましくはＢＢＮ結合領域［すなわち、ＢＢＮ（８−１４）］の同じ１次構 造、または特異的なアミノ酸置換を有する同様な１次構造を含有し、そしてこれ は、ＢＢＮ単独（すなわち、Ｋ_d≒１〜５nmol）より良好かまたは同等な結合親 和性でＧＲＰ受容体に特異的に結合する。このＢＢＮ結合領域（または結合残基 ）を含有する化合物は、他の基（例えば、放射性金属キレート）に共有結合する と、これもＢＢＮ結合体と呼ばれる。 一般に、本発明の化合物は、一般式： Ｘ−Ｙ−Ｂ ［式中、Ｘは、金属（例えば、放射性金属）を錯化することができる基であり； Ｙは、スペーサー基上の共有結合であり；そしてＢは、ボンベシンアゴニスト結 合残基である］の構造を有する。 金属錯化基に結合した金属は、遷移金属およびγおよびβ放出同位体を含む、 特異的な治療または診断用途のために選択される任意の適切な金属であってよい 。好ましくはこの金属は、、¹⁰⁵Ｒｈ−、^99mＴｃ−、^186/188Ｒｅ、¹⁵³Ｓｍ−、¹⁶⁶ Ｈｏ、⁹⁰Ｙ、および¹⁹⁹Ａｕ−のような放射性金属であり、そしてそのキレー トは、図１に示すように１次結合配列のＮ末端（例えば、ＢＢＮ−８またはＴｒ ｐ⁸）を介して特異的なＢＢＮ結合領域に共有結合（すなわち、コンジュゲート ）することができる。 好適な実施態様において、放射性金属錯体は、スペーサー基によりアミノ酸Ｔ ｒｐ⁸から離れてまたは遠くに配置される。スペーサー基は、ペプチド（すなわ ち、長さ≧１アミノ酸）、Ｃ₁−Ｃ₁₀の炭化水素スペーサーまたはこれらの組合 せを含んでよい。好ましくは炭化水素スペーサーは、Ｃ₃−Ｃ₉基である。生じる 放射標識ＢＢＮ結合体は、ＧＲＰ受容体に対する高い結合親和性および特異性を 保持し、次に細胞の内側にインターナリゼーションされる。 ＢＢＮ結合体は、ＢＢＮ−結合残基のターゲティング機能または金属キレート 化剤の金属錯化機能に悪影響を与えることなく、さらにスペーサー基または成分 を取り込んで、金属キレーター（または金属結合基本骨格）に対する結合残基に 結合する。 「スペーサー基」または「リンカー」という用語は、ＢＢＮ結合残基のターゲ ティング機能または金属キレーターの金属錯化機能に悪影響を与えることなく、 ＢＢＮ結合残基を金属キレーターに結合させる化学基を意味する。適切なスペー サー基は、ペプチド（すなわち、一緒に結合したアミノ酸）単独、非ペプチド基 （例えば、炭化水素鎖）またはアミノ酸配列と非ペプチドスペーサーの組合せを 含む。例のセクションに後述される実験の多くに使用される型のスペーサー基は 、Ｌ−グルタミンと炭化水素スペーサーの組合せよりなるものである。純粋なペ プチドスペーサーは、ポリマー鎖中のＢＢＮ結合残基のＮ末端残基と金属キレー ターの間の原子の総数が、≦１２原子であるものであってよい、一連のアミノ酸 （例えば、ジグリシン、トリグリシン、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｕなど）よりなる であろう。 スペーサーは、炭化水素鎖［すなわち、Ｒ₁−（ＣＨ₂）_n−Ｒ₂］（式中、ｎ は０〜１０であり、好ましくはｎ＝３〜９であり、Ｒ₁はリガンド基本骨格また は前もって形成された金属キレーターまたは金属錯化基本骨格を共有結合するた めの部位として使用することができる基（例えば、Ｈ₂Ｎ−、ＨＳ−、−ＣＯＯ Ｈ）であり；そしてＲ₂は、ＢＢＮ結合残基のＮ末端ＮＨ₂基に共有結合するため に使用される基である（例えば、Ｒ₂は、活性化ＣＯＯＨ基である）も含むこと ができる。リガンド（すなわち、キレーター）を結合させるための数種の化学的 方法、または生体分子に対する好ましい金属キレートは、文献に詳しく記載され ている［ウィルバー（Ｗｉｌｂｕｒ）、１９９２；パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、 １９９０；ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、１９９６；フリッツバーグ（ Ｆｒｉｚｂｅｒｇ）ら、１９９５］。これらの方法の１つまたはそれ以上を使用 して、錯化していないリガンド（キレーター）または放射性金属キレートをスペ ーサー基に結合するか、またはスペーサー基をＢＢＮ（８−１４）誘導体に結合 することができる。これらの方法は、酸無水物、アルデヒド、アリールイソチオ シアネート、活性化エステル、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの形成を含 む［ウィルバー（Ｗｉｌｂｕｒ）、１９９２；パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、１９ ９０；ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、１９９６；フリッツバーグ（Ｆｒ ｉｚｂｅｒｇ）ら、１９９５］。 「金属錯化キレーター」という用語は、生理学的条件下で安定な金属原子と錯 体を形成する分子を意味する。すなわち、金属はインビボでキレーター基本骨格 と錯化したままである。さらに詳細には、金属錯化キレーターは、放射性核種金 属と錯化して、生理学的条件下で安定であり、かつＢＢＮアゴニスト結合残基と 結合体形成するための少なくとも１つの反応性官能基を有する、金属錯体を形成 する分子である。金属錯化キレーターは、単座および多座キレーターを含んでよ い［パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、１９９０；フリッツバーグ（Ｆｒｉｚｂｅｒｇ ）ら、１９９５；リスター−ジェイムズ（Ｌｉｓｔｅｒ−Ｊａｍｅｓ）ら、１９ ９７；リー（Ｌｉ）ら、１９９６ｂ；アルバート（Ａｌｂｅｒｔ）ら、１９９１ ；ポラック（Ｐｏｌｌａｋ）ら、１９９６；デジョング（ｄｅ Ｊｏｎｇ）ら、 １９９７；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９９７］。金属錯化キレーターは、マク ロサイクリックであってよくかつ４個の窒素および ／または硫黄金属-配位原子の組合せを有する四座金属キレーターを含み［パー カー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９０；リー（Ｌｉ）ら、１９９６ｂ］、そして図 ２に示すようにＮ₄、Ｓ₄、Ｎ₃Ｓ、Ｎ₂Ｓ₂、ＮＳ₃などと称される。タンパク質お よび受容体−親和性分子を結合するのに使用されてきた多くの適切な多座キレー ターが報告されている［フリッツバーグ（Ｆｒｉｚｂｅｒｇ）ら、１９９５；リ スター−ジェイムズ（Ｌｉｓｔｅｒ−Ｊａｍｅｓ）ら、１９９７；リー（Ｌｉ） ら、１９９６ｂ；アルバート（Ａｌｂｅｒｔ）ら、１９９１；ポラック（Ｐｏｌ ｌａｋ）ら、１９９６；デジョング（ｄｅ Ｊｏｎｇ）ら、１９９７］。これら の多座キレーターはまた、種々の組合せで酸素およびリンのような他の金属配位 原子を組み込んでもよい。金属結合錯化残基はまた、「３＋１」キレーターを含 んでよい［サイフェルト（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら、１９９８］。 診断目的には、金属錯化キレーターは、好ましくは放射性核種金属^99mＴｃを 錯化するためのキレーター基本骨格を含む。治療目的には、金属錯化キレーター は、好ましくは放射性核種金属¹⁰⁵Ｒｈ、^186/188Ｒｅ、¹⁵³Ｓｍ、⁹⁰Ｙ、¹⁶⁶Ｈｏ 、および¹⁹⁹Ａｕを錯化するキレーター基本骨格を含む［シュビガー（Ｓｃｈｕ ｂｉｇｅｒ）ら、１９９６；ホフケン（Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４］。 上に簡単に述べたように、「ボンベシンアゴニスト」または「ＢＢＮアゴニス ト」という用語は、ＧＲＰ受容体に高い特異性と親和性で結合し、そしてＧＲＰ 受容体に結合すると、細胞内にインターナリゼーションされる化合物を意味する 。適切な化合物は、ペプチド、ペプチドミメティックおよびこれらの類似体およ び誘導体を含む。詳細には、以前の研究により、ＧＲＰ受容体に結合するのに必 要なＢＢＮペプチド構造上の領域は残基８〜１４に及ぶことが証明されている［ デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９２；ホフケン（Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４ ；ムーディー（Ｍｏｏｄｙ）ら、１９９６；コイ（Ｃｏｙ）ら、１９８８；カイ （Ｃａｉ）ら、１９９４］。ＢＢＮ−１４位のメチオニン（Ｍｅｔ）の存在は、 一般にアゴニスト性を与え、一方ＢＢＮ−１４のこの残基の欠如は、一般にアン タゴニスト性を与える［ホフケン（Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４］。 ＢＢＮ（８−１４）結合領域における少数の選択数の特異的アミノ酸置換（例 えば、Ｌ−Ｇｌｙ¹¹をＤ−Ａｌａ¹¹に、またはＬ−Ｔｒｐ⁸をＤ−Ｔｒｐ⁸に）が 、当該分野においては充分に報告されているが、これらは、結合親和性を低下さ せることなく調製することができる［レバン（Ｌｅｂａｎ）ら、１９９４；キン （Ｑｉｎ）ら、１９９４；ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら、１９９３］。さらに 、ＢＢＮ−８位のＮ末端アミン基（すなわち、Ｔｒｐ⁸残基）に幾つかのアミノ 酸鎖または他の基を結合すると、ＧＲＰ受容体へのＢＢＮ類似体の結合親和性を 劇的に低下させることができる［デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９２；ホフケ ン（Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４；ムーディー（Ｍｏｏｄｙ）ら、１９９６；コ イ（Ｃｏｙ）ら、１９８８；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９４］。少数の例において は、結合親和性を低下させることなく追加のアミノ酸または化学残基を付加する ことができる。したがってＢＢＮ−８へ種々の側鎖を結合することの結合親和性 に及ぼす影響は、予測できない。 本発明のＢＢN結合体は、選択したキレーターに応じて種々の方法により調製 することができる。結合体のペプチド部分は、ペプチド合成の分野において一般 に確立されかつ知られている方法（例えば、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法） により調製することが最も便利である。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では、不 溶性支持体またはマトリックス（例えば、ポリスチレン）に結合した伸長するペ プチド鎖にアミノ酸残基を段階的に付加する。ペプチドのＣ末端残基は、最初に 市販の支持体に、そのアミノ基をＮ保護剤［例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニ ル基（ｔＢｏｃ）またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基］で保 護して固定する。このアミノ保護基を適切な脱保護剤（例えば、ｔＢＯＣの場合 のＴＦＡまたはＦＭＯＣにはピペリジン）で脱離して、次のアミノ酸残基（Ｎ保 護型）を結合剤（例えば、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ））により付加する 。ペプチド結合が形成されれば、試薬を支持体から洗浄する。最後の残基の付加 後、ペプチドを支持体から適切な試薬（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ま たはフッ化水素（ＨＦ））により切断する。 次にスペーサー基とキレーター成分を、ＢＢＮ結合残基のＴｒｐ⁸残基の遊離 アミノ基を、キレーター、金属キレーターまたはスペーサー基の適切な官能基（ 例えば、カルボキシル基または活性化エステル）と反応させることにより、結 合させて結合体を形成する。 ＢＢＮ結合体はまた、ペプチド性であって固相ペプチド合成に適応する金属錯 化キレーター基本骨格を組み込んでもよい。この場合には、キレーター基本骨格 は、上述の方法と同様にＢＢN結合残基に付加することができるか、またはさら に便利には、ＢＢN結合残基に結合した金属錯化キレーター基本骨格は、ペプチ ドのＣ末端残基から開始し、そして金属錯化キレーター構造のＮ末端残基で終了 して全体として合成することができる。 本発明により使用されるキレーター基本骨格は、市販されているか、またはこ れらは、文献に略述される方法と同様に調製することができる［フリッツバーグ （Ｆｒｉｚｂｅｒｇ）ら、１９９５；リスター−ジェイムズ（Ｌｉｓｔｅｒ−Ｊ ａｍｅｓ）ら、１９９７；リー（Ｌｉ）ら、１９９６ｂ；アルバート（Ａｌｂｅ ｒｔ）ら、１９９１；ポラック（Ｐｏｌｌａｋ）ら、１９９６；デジョング（ｄ ｅ Ｊｏｎｇ）ら、１９９７；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９９７；サイフェル ト（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら、１９９８］。リガンド基本骨格に付加された官能基化 可能な原子へのスペーサー基の結合は、当業者に既知の標準法により実施するこ とができる。例えば、５−アミノ吉草酸（５−ＡＶＡ）上のＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ 活性化ＣＯＯＨ基をＧｌｎ⁷上のＮ末端アミンと反応させて図３に示すようにア ミド結合が生成した。同様に、［１６］ａｎｅＳ₄マクロサイクルに付加したＨ ＯＢｔ／ＨＢＴＵ活性化カルボキシル基と、５−ＡＶＡ上の末端アミン基との反 応によって、図４に示すＢＢＮ−３７を形成することにより、特徴ある［１６］ ａｎｅＳ₄リガンドに結合した−ＣＯＯＨ基を炭化水素スペーサー上のアミン基 に結合した（後述）。アミン基と共有結合を生成する他の標準的結合反応体も使 用することができる［ウィルバー（Ｗｉｌｂｕｒ）、１９９２；パーカー（Ｐａ ｒｋｅｒ）、１９９０］。 Ｔｒｐ⁸を介して結合したキレート化フレームワークは、放射性金属を錯化す るが、１：１のキレーター対金属比を形成する。^99mＴｃは半減期が短く（６時 間）かつ診断用放射性核種であるため、^99mＴｃ−ＢＢＮ類似体を形成する方法 は、１段階の高収率反応（以下の例の項に例示す）で結合したキレート化フレー ムワークへの^99mＴｃの錯化（直接または金属交換反応により）を可能とする。 対照的に、治療用放射性核種（例えば、¹⁰⁵Ｒｈ、^186/188Ｒｅ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶⁶ Ｈｏ、⁹⁰Ｙ、または¹⁹⁹Ａｕ）の長い半減期は、１段階の高収率錯化工程により 、または¹⁰⁵Ｒｈ−、^186/188Ｒｅ−、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙまたは¹⁹⁹Ａｕキ レートシントンを前もって形成し、続いて前もって形成した錯体をＢＢＮ結合残 基のＮ末端に結合させることにより、対応する放射標識ＢＢＮ類似体の形成を可 能にする。全ての場合に、生じる最終放射標識ＢＢＮ誘導体の比活性は高いこと が必要である（すなわち、＞１Ci/μmol）。Ｒｅ−およびＴｃ−結合体 ＲｅおよびＴｃは、両方とも周期表のVIIＢ列にあり、そしてこれらは化学的 同族体である。すなわち、大体は、高いインビトロおよびインビボ安定性を示す リガンドフレームワークとのこれら２つの金属の錯化化学は同じである［エッケ ルマン（Ｅｃｋｅｌｍａｎ）、１９９５］。ペプチドおよびタンパク質と安定な 放射性金属錯体を形成するのに使用される多くの^99mＴｃまたは^186/188Ｒｅ錯体 は、これらの金属をその＋５酸化状態でキレート化する［リスター−ジェイムズ （Ｌｉｓｔｅｒ−Ｊａｍｅｓ）ら、１９９７］。この酸化状態によって、^99mＴ ｃ−または^186/188Ｒｅを、すでに生体分子に結合した、種々の^99mＴｃ（Ｖ）お よび／または^186/188Ｒｅ（Ｖ）の弱いキレート（例えば、^99mＴｃ−グルコヘプ トネート、サイトレート、グルコネートなど）から構成されたリガンドフレーム ワーク中に選択的に配置することが可能になる［エッケルマン（Ｅｃｋｅｌｍａ ｎ）、１９９５；リスター−ジェイムズ（Ｌｉｓｔｅｒ−Ｊａｍｅｓ）ら、１９ ９７；ポラック（Ｐｏｌｌａｋ）ら、１９９６］。四座リガンドフレームワーク は、少なくとも１つのチオール基または少なくとも１つのヒドロキシメチレンホ スフィン基がリガンド基本骨格に存在するとき、充分に明確な単一の化学種を高 い特異的活性で形成することが証明された［スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９９７ ］。 特に問わないが、アミノＮ原子、アミド−Ｎ原子、カルボキシ−Ｏ原子および チオエーテル−Ｓ原子を含有する、安定なＴｃ（Ｖ）またはＲｅ（Ｖ）四座錯体 を形成するリガンドは、存在してもよいドナー原子である［エッケルマン（Ｅｃ ｋｅｌｍａｎ）、１９９５；フリッツバーグ（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ）ら、 １９９２；パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、１９９０；フリッツバーグ（Ｆｒｉｔｚ ｂｅｒｇ）ら、１９９５；ポラック（Ｐｏｌｌａｋ）ら、１９９６；サイフェル ト（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら、１９９８］。ドナー原子（基）の混合に応じて、錯体 全体の電荷は普通は−１〜＋１の範囲である。 結合体内の金属の取り込みは、配位化学の分野において普通に知られている種 種の方法により達成することができる。金属がテクネチウム−９９ｍであるとき 、下記一般法を使用してテクネチウム錯体を形成することができる。ペプチド− キレーター結合体溶液は、最初に結合体をエタノールなどのアルコール水溶液に 溶解することにより生成される。次にこの溶液を脱気して酸素を除去する。ペプ チドに−ＳＨ基が存在するとき、チオール保護基は、適切な試薬、例えば水酸化 ナトリウムで脱離し、そして次に酢酸（ｐＨ６．０〜６．５）などの有機酸によ り中和する。標識工程において、モリブデンジェネレーターから得られた過テク ネチウム酸ナトリウムを、充分な量の還元剤（例えば、塩化第１スズ）と共に結 合体の溶液に加え、テクネチウムを還元して次に加熱する。標識結合体は、混入^99m ＴｃＯ₄ ^-とコロイド^99mＴｃＯ₂から（例えば、Ｃ−１８セップパック（Ｓｅ ｐ Ｐａｋ）カートリッジで）クロマトグラフィーにより分離することができる ［ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウォーターズ ・クロマトグラフィーディビジョン（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ ｈｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、メープル通り３４（３４Ｍａｐｌｅ Ｓｔｒｅｅｔ ）、ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州０１７５７］。 別の方法では、標識はキレート交換反応により達成することができる。テクネ チウム供給源は、選択されるキレーターとのリガンド交換を促進する不安定なリ ガンドと錯化したテクネチウムの溶液である。キレート交換のための適切なリガ ンドの例は、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、およびヘプタグルコン酸を含む。 結合体は、上述の方法を利用して標識することができるか、あるいはキレーター 自体を標識し、次いでペプチドに結合して結合体を形成してもよい（「前標識キ レート」法と呼ばれる方法）ことを認識されたい。 診断用および／または治療用に有用な金属で標識されると、ペプチド−キレー ター結合体または本発明の薬剤学的に許容しうる塩、エステル、アミド、および プロドラッグを使用して、放射性診断薬および放射性治療薬の分野において確立 した方法により、腫瘍を含む癌を治療および／または検出することができる［ブ ッシュバウム（Ｂｕｓｈｂａｕｍ）、１９９５；フィッシュマン（Ｆｉｓｃｈｍ ａｎ）ら、１９９３；シュビゲル（Ｓｃｈｕｂｉｇｅｒ）ら、１９９６；ロウベ ルツ（Ｌｏｗｂｅｒｔｚ）ら、１９９４；クレニング（Ｋｒｅｎｎｉｎｇ）ら、 １９９４］。テクネチウム−９９ｍのような放射性核種金属で標識した結合体は 、薬剤学的に許容しうる担体および／または溶液（例えば、等張性食塩水のよう な塩溶液）中の静脈内注射または腹腔内注射により、ヒト患者または被験体を含 む哺乳動物に投与することができる。急速に排除される結合体はさほど急速に排 除されない結合体よりも高用量で投与されるため、投与に適した標識結合体の量 は、選択された結合体の分布特性に依存する。炎症のＴｃ−９９ｍイメージング 放射性薬剤に関して許容しうる単位用量は、７０kgの個体について約５〜４０mC iの範囲である。インビボ分布および局在は、投与後の適切な時点（典型的には 、非標的組織のクリアランスの速度に対する標的部位の蓄積の速度に依存して、 ３０分と１８０分の間）の標準的シンチグラム法により追跡することができる。 本発明の化合物は、単独または賦形剤、希釈剤、および担体のような他の成分 （これらは全て当該分野において周知である）を含有する組成物の一部として患 者に投与することができる。本化合物は、静脈内または腹腔内のいずれかにより 患者に投与することができる。 本発明に関して多くの利点が存在する。本発明により調製される化合物は、安 定で明確なＢＢＮアゴニストの^99mＴｃまたは^186/188Ｒｅ結合体類似体を形成す る。同様なＢＢＮアゴニスト類似体はまた、各放射性金属の適切なキレーターフ レームワークを使用して、¹⁵³Ｓｍ、⁹⁰Ｙ、¹⁶⁶Ｈｏ、¹⁰⁵Ｒｈまたは¹⁹⁹Ａｕで標 識された安定で明確な生成物を形成することにより調製することができる。放射 標識ＢＢＮアゴニスト結合体は、ＧＲＰ受容体を発現する新生物細胞に選択的に 結合し、インターナリゼーションされ、そして長期間腫瘍細胞内に保持される。 金属キレーターとＢＢＮアゴニスト結合残基の間にスペーサー基 を組み込むと、新生物または癌細胞の内側への放射活性金属の取り込みと保持が 最大になる。癌細胞に到達しない（すなわち、結合しない）放射活性物質は、尿 中に効率的に選択的に排泄され腎臓における放射性金属保持は最短になる。 以下の例は、具体例を例示するために与えられ、かつ本発明の有用性を証明す る。実験の項 例Ｉ：炭化水素鎖スペーサーを使用する合成ＢＢN類似体の合成とインビトロ結 合評価 Ａ．合成： 多くのＢＢＮ類似体は、固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅ ｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＰＰＳ）により合成した。各ペプチドは 、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モ デル４３２Ａペプチド合成機を使用してＳＰＰＳにより調製した。トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）を使用して樹脂から各ＢＢＮ類似体を切断後、ペプチドは、ヴァ イダック（Ｖｙｄａｃ）ＨＳ５４カラムと移動相として０．１％ ＴＦＡを含有 するＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏを使用するＣ₁₈逆相ＨＰＬＣにより精製した。目的のＢＢ Ｎペプチドを含有する画分の回収後（多くの場合、収率約８０〜９０％）、溶媒 を留去した。各ＢＢＮペプチドの本体は、ＦＡＢ−質量分析（化学科−ワシント ン大学（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、セントルイス、ミズーリ州）により確認した。 種々のアミノ酸配列（ある場合には異なる化学残基を含む）をＢＢＮ結合領域 のＮ末端に（すなわち、ＢＢＮ−８またはＴｒｐ⁸）に結合させた。図５に示す Ｎ末端修飾ペプチドの例として、ＢＢＮ類似体番号９、１５、１５ｉ、１６、１ ６ｉおよび１８を合成した。 図６に示す、ＢＢＮ−４０、ＢＢＮ−４１、ＢＢＮ−４２、ＢＢＮ−４３、Ｂ ＢＮ−４４、ＢＢＮ−４５、およびＢＢＮ−４９を例とするような、種々のつな いだＮ末端（Ｔｒｐ⁸を介す）ＢＢＮ類似体も、ＳＰＰＳにより合成した。これ らの特定のつないだペプチドにおいてＧｌｕ残基をＴｒｐ⁸に結合させ、次に３ −、４−、５−、６−、８−および１１−炭素鎖（ＣＨ）スペーサーにより−Ｃ ＯＯＨ基から分離したＦｍＯＣ保護末端アミン基を結合させた（図６）。これら のＦｍＯＣ保護酸は、ＳＰＰＳサイクル中の最終工程として付加した。前述のよ うにＢＢＮ類似体のそれぞれは、逆相ＨＰＬＣにより精製して高分解能質量分析 により性状解析した。ペプチド４９では、グルタミンだけをスペーサー基として 利用した。 ［１６］ａｎｅＳ₄マクロサイクリックリガンドは、図６に示す、選択された 鎖でつないだＢＢＮ類似体に結合させた。［１６］ａｎｅＳ₄マクロサイクル誘 導体上の−ＯＣＨ₂ＣＯＯＨ基をＨＯＢｔ／ＨＢＴＵにより活性化して、これが スペーサー側アーム上の末端ＮＨ₂基とのアミド結合（脱保護後）を効率的に形 成することができるようにした。対応する［１６］ａｎｅＳ₄でつないだＢＢＮ 誘導体を生成させて、これらの誘導体の４つの例（すなわち、ＢＢＮ−２２、− ３７、−４６および−４７）を図７に示す。前述のように、各［１６］ａｎｅＳ₄ ＢＢＮ誘導体は、逆相ＨＰＬＣにより精製してＦＡＢ質量分析により性状解析 した。Ｂ．インビトロ結合親和性 合成ＢＢＮ誘導体の結合親和性は、スイス３Ｔ３細胞およびある場合にはＧＲ Ｐ受容体を発現する種々のヒト癌細胞株上のＧＲＰ受容体について評価した。各 誘導体のＩＣ₅₀は、¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮ（スイス３Ｔ３細胞におけるＧＲＰ 受容体の¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮのＫ_dは、１．６±０．４nMであると報告され ている）［ズエト（Ｚｕｅｈｔ）ら、１９９１］に対して（すなわち、これと競 合させて）求めた。ＩＣ₅₀を測定するために使用した細胞結合測定法は、標準的 であり、以前に報告された方法により使用された［ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ） ら、１９９３；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９４；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９２］。 全ての細胞株上のＧＲＰ受容体の全てのＧＲＰ受容体結合についてＩＣ₅₀を求め るのに使用した方法は同様であった。スイス３Ｔ３細胞のＩＣ₅₀を測定するため に使用した具体的な方法を、以下に簡単に述べる： スイス３Ｔ３マウス繊維芽細胞は、４８ウェルマイクロタイタープレートでコ ンフルエンスまで増殖させる。ヘペス（１１．９１６g/l）、ＮａＣｌ（７．５ ９８g/l）、ＫＣｌ（０．５７４g/l）、ＭｇＣｌ₂（１．１０６g/l）、ＥＧＴＡ （０．３８０g/l）、ＢＳＡ（５．０g/l）、キモスタチン（０．００２g/l）、 ダイズトリプシンインヒビター（０．２００g/l）、およびバシトラシン（０． ０５０g/l）からなるインキュベーション培地を調製した。増殖培地を除去し、 細胞をインキュベーション培地で２回洗浄して、インキュベーション培地を細胞 に戻した。増大する濃度の適切な競合ペプチドの存在下で、¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−Ｂ ＢＮ（０．０１ｕＣｉ）を各ウェルに加えた。置換ペプチドの典型的濃度は、ウ ェル当たり１０^-12〜１０^-5モルの置換リガンドの範囲であった。細胞は、９５ ％ Ｏ₂／５％ ＣＯ₂加湿環境中で３７℃で４０分間インキュベートした。イン キュベーションの開始後４０分で培地を廃棄して、細胞を冷インキュベーション 培地で２回洗浄した。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液中で３７℃で５分間のインキュ ベーション後、細胞をウェルから回収した。続いて、ウェル当たりの放射活性を 求めて、放射標識ペプチドの最大総取り込み％を求め、１００％に標準化した。Ｃ．結合親和性測定の結果 本発明により悟性したＢＢＮ誘導体について測定したＩＣ₅₀値は、Ｎ末端ＢＢ Ｎ−８残基（すなわち、Ｔｒｐ⁸）を介してペプチド側鎖および他の残基を付加 すると、広範なＩＣ₅₀値が得られることを示した。例えば、図５と８のＢＢＮ １１、１５ｉ、１６ｉ、および１８について示すＩＣ₅₀値を参照のこと。この観 察は、主として短鎖のアミノ酸残基でＢＢＮ（８−１３）またはＢＢＮ（８−１ ４）を誘導体化した時非常に多様なＩＣ₅₀値を示す以前の報告と矛盾しない［ホ フケン（Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４］。これとは対照的に、３−〜１１−炭素 の炭化水素スペーサーをＢＢＮ（７−１４）と［１６］ａｎｅＳ₄マクロサイク ルの間に付加すると、ＩＣ₅₀は、驚くほど相対的に一定であり、１〜５nMの範囲 にあることが見い出された（すなわち、図７に示すＢＢＮ−２２、−３７、−４ ６および−４７のＩＣ₅₀値を参照のこと）。これらのデータは、比較的単純なス ペーサー基を使用してＢＢN結合領域［例えば、ＢＢＮ（８−１４）］からある 程度リガンドを離すと、１〜５nmol範囲の結合親和性を維持する誘導体が得られ ることを示唆している。Ｄ．細胞結合試験 図９に示す結果は、ＲｈＣｌ₂−［１６］ａｎｅＳ₄錯体をＴｒｐ⁸からわずか １グルタミン（Ｇｌｕ⁷）離すと、この結合体（すなわち、Ｒｈ−ＢＢＮ−２２ ）のＩＣ₅₀は３７．５nMであることを示す。しかし、５個の炭素スペーサーまた は８個の炭素スペーサーが存在すると（すなわち、Ｒｈ−ＢＢＮ−３７およびＲ ｈ−ＢＢＮ−４７）、ＩＣ₅₀は図９に示すように５nM未満を維持した。これらの データは、＋１荷電Ｒｈ−Ｓ₄−キレートをＢＢＮ結合領域から引き離すための 直鎖スペーサー（ｇｌｕ⁷に沿う）は、インビボ腫瘍ターゲティング応用のため に充分に高いＧＲＰ受容体に対する結合親和性を有する金属化したＢＢＮ類似体 が生じることを証明している。Ｅ．¹⁰⁵Ｒｈ放射標識ＢＢＮ類似体 ＢＢＮ−２２、ＢＢＮ−３７、ＢＢＮ−４６およびＢＢＮ−４７の¹⁰⁵Ｒｈ結 合体は、ミズーリ大学研究用原子炉（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｃｔｏr）（ＭＵＲＲ）からの¹⁰⁵Ｒｈ−クロリド試 薬を使用して合成した。この試薬は、０．１〜１Ｍ ＨＣｌ中の非担体付加（ｎ ｏ−ｃａｒｒｉｅｒ−ａｄｄｅｄ）（ＮＣＡ）生成物の¹⁰⁵Ｒｈ−クロリドとし て得られた。この試薬のｐＨは、０．１〜１．０Ｍ ＮａＯＨの滴下を利用して ４〜５に調整し、そしてこれを０．９％ ＮａＣｌ水溶液および１０％エタノー ル中の約０．１mgの［１６］ａｎｅＳ₄結合ＢＢＮ誘導体に加えた。試料を８０ ℃で１時間加熱後、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ類似体はＨＰＬＣを使用して精製した。各 場合に、非金属化Ｓ₄−ＢＢＮ結合体が、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ結合体が溶出した充分 後の保持時間で溶出したため、ＮＣＡまたは高比活性生成物が得られた。例えば 、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の保持時間は、７．１分であるが、一方ＢＢＮ−３７ は、図１０Ａ−Ｂに示すように、０．１％ ＴＦＡを含有するＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ で溶出したＣ−１８−逆相カラムから１０．５分に溶出した。例II：癌細胞における¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ類似体の保持 一旦放射性金属が特異的に癌細胞に「送達」される（例えば、細胞表面上のＧ ＲＰ受容体を特異的に標的とするＢＢＮ結合残基を使用して）と、有効な放射性 薬剤で有効に癌を治療するために、高い割合の「送達」された放射活性原子が、 数時間またはそれ以上の期間細胞と結合したままであることが必要である。この 結合を達成する１つの方法は、細胞表面ＧＲＰ受容体に結合後、放射標識ＢＢＮ 結合体を癌細胞内にインターナリゼーションさせることである。 以前は癌の治療用の合成ＢＢＮ類似体の全ての研究は、アンタゴニストの合成 および評価に集中していた［デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９２；ホフケン（ Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４；ムーディー（Ｍｏｏｄｙ）ら、１９９６；コイ（ Ｃｏｙ）ら、１９８８；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９４；ムーディー（Ｍｏｏｄｙ ）ら、１９９５；レバン（Ｌｅｂａｎ）ら、１９９４；カイ（Ｃａｉ）ら、１９ ９２］。アゴニストまたはアンタゴニストであることが予測される合成ＢＢＮ類 似体の評価後、出願人らは、ＢＢＮ（８−１４）の誘導体（すなわち、ＢＢＮ− １４にメチオニンまたはアミド化メチオニンを含む誘導体）が、細胞表面ＧＲＰ 受容体への結合後、急速に（すなわち、２分以内に）インターナリゼーションさ れることを見いだした。そのインターナリゼーションおよび細胞内捕捉効率を求 めるために試験した幾つかの放射標識ＢＢＮ（８−１４）類似体は、放射性ヨウ 素化（すなわち、¹²⁵Ｉ）誘導体であった。これらの試験の結果は、スイス３Ｔ ３細胞中のＧＲＰ受容体への¹²⁵Ｉ標識ＢＢＮ類似体の結合後の急速なインター ナリゼーションにもかかわらず、図１１に示すように¹²⁵Ｉは急速に細胞から駆 逐される［ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら、１９９７］ことを示した。すなわち 、これらの¹²⁵Ｉ−ＢＢＮ誘導体は、さらに開発するのに適していなかった。 これとは対照的に、ＧＲＰ受容体に結合する¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ（８−１４）誘 導体は、急速にインターナリゼーションされるだけでなく、高い割合の¹⁰⁵Ｒｈ 活性が、数時間（およびある細胞株では＞２４時間）にわたって細胞内に捕捉さ れたまま残る。この観察は、これらの放射性金属化ＢＢＮ誘導体が、ＧＲＰ受容 体を発現する新生物のインビボターゲティングのための放射性薬剤として真の有 用性を有することを示している。 細胞内にインターナリゼーションした放射性トレーサーの割合を求めるために 計画した実験は、細胞インキュベーション培地に過剰の¹²⁵Ｉ−または¹⁰⁵Ｒｈ− ＢＢＮ誘導体を加えることにより実施した。４０分インキュベーショ ンして平衡の確立後、細胞を取り囲む培地を除去して、放射活性を含有しない新 鮮培地で細胞を洗浄した。洗浄後、細胞に結合した射活性の量を測定した（すな わち、細胞に結合した¹²⁵Ｉまたは¹⁰⁵Ｒｈの１分当たりの総カウント（ＴＣＰＭ ））。次に細胞を０．２Ｍ酢酸溶液（ｐＨ２．５）中でインキュベートすると表 面タンパク質（ＧＲＰ受容体を含む）が全ての表面結合放射活性物質を変性およ び放出した。この緩衝液の除去および洗浄後、細胞を再度計測した。この時点で 細胞に結合している１分当たりのカウント（c.p.m.）は、細胞の内側に捕捉され たまま残った¹²⁵Ｉまたは¹⁰⁵Ｒｈだけに関連していた。 細胞内保持を測定するために、同様な方法を利用した。しかし、新鮮な（非放 射活性）インキュベーション培地で細胞を洗浄後、全ての細胞外¹²⁵Ｉ−または^{1 05} Ｒｈ−ＢＢＮ類似体を洗浄後、細胞を種々の時点で新鮮培地中でインキュベー トした。各時間の後、ｐＨ２．５の０．２Ｍ酢酸溶液で洗浄後の総（ＴＯＴＡＬ ）c.p.m.と細胞内c.p.m.を求めるのに使用した方法は上述の方法と同じであり、 細胞の内側に捕捉されたまま残る¹²⁵Ｉまたは¹⁰⁵Ｒｈのパーセントを計算した。 図１２は、¹²⁵Ｉ−Ｌｙｓ³−ＢＢＮによるスイス３Ｔ３細胞を使用する流出実験 の結果のグラフである。この結果は、これらの細胞の内側からの¹²⁵Ｉの急速な 流出が存在することを示しており、図１２に示すように１５分時点で５０％未満 が保持され、そして６０分時点では２０％未満が保持されていた。 これとは対照的に、細胞の内側にインターナリゼーションをする全ての¹⁰⁵Ｒ ｈ−［１６］ａｎｅＳ₄−ＢＢＮアゴニスト誘導体による試験では、ＧＲＰ受容 体発現細胞による¹⁰⁵Ｒｈの実質的な細胞内保持が証明された。例えば、スイス ３Ｔ３細胞と結合した¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７を使用した試験の結果（図９を参 照のこと）では、図１３に示すように、約５０％の¹⁰⁵Ｒｈ活性が洗浄の６０分 後に細胞に結合して残り、そして約３０％の¹⁰⁵Ｒｈが、４時間後に細胞の内側 に残ることが証明された。≧６０分時点で少なくとも５％の¹⁰⁵Ｒｈが表面結合 していることに注目されたい。 図９に示す¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ誘導体は全て、アミド化メチオニンをＢＢＮ−１ ４位に有しており、アゴニストであることが予想される［ジェンセン （Ｊｅｎｓｅｎ）ら、１９９３］。したがって、これらは、細胞表面上のＧＲＰ 受容体に結合後急速にインターナリゼーションすることが予測され［ライル（Ｒ ｅｉｌｅ）ら、１９９４；ビステルボッシュ（Ｂｊｉｓｔｅｒｂｏｓｃｈ）ら、 １９９５；スマイズ（Ｓｍｙｔｈｅ）ら、１９９１］、これは出願人らのデータ により確認された。図１４に関して、ＢＢＮ−１４位にアミノ酸を含まないＢＢ Ｎ類似体である¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−６１（すなわち、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ（８−１３ ）誘導体）を合成して検討した。このＢＢＮ類似体は、高い結合親和性を有する （すなわち、ＩＣ₅₀＝３０nM）。この型の誘導体は、アンタゴニストであること が予想され、そのためインターナリゼーションしないはずである［ジェンセン（ Ｊｅｎｓｅｎ）ら、１９９３；スマイズ（Ｓｍｙｔｈｅ）ら、１９９１］。スイ ス３Ｔ３を使用する¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−６１による流出試験の結果は、新鮮イン キュベーション緩衝液での洗浄直後（すなわち、ｔ＝０）には、これらの細胞に 結合した実質的に全ての¹⁰⁵Ｒｈが予想通り細胞表面上にあることを証明した。 さらには、インキュベーションのわずか１時間後、１０％未満がこれらの細胞に 結合して任意の様式で残っていた（図１５および１６を参照のこと）。これらの データは、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮアゴニストに類似した構造の¹⁰⁵Ｒｈ−アンタゴニス ト（すなわち、図９に示すもの）が、これらは放射性金属化ＢＢＮアゴニストと ほぼ同じ程度にはＧＲＰ受容体発現細胞内外のどちらにも捕捉されないため、放 射性薬剤の開発のための良好な候補ではないことを示している。例III：ヒト癌細胞株試験 それぞれ図１７Ａ−Ｂおよび１８Ａ−Ｂに示す、前立腺ＣＡおよび膵ＣＡの患 者に由来する腫瘍細胞である、ＧＲＰ受容体を発現する２つの異なるヒト癌細胞 株（すなわち、ＰＣ−３およびＣＦ−ＰＡＣ１細胞株）による¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ −３７のインビトロ細胞結合試験を実施した。これらの試験の結果は、スイス３ Ｔ３細胞を使用した¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の結合および保持試験と矛盾がない ことを証明した。具体的には、表１に示すように両方のヒト癌細胞株とのＲｈ− ＢＢＮ−３７の結合親和性は高かった（すなわち、ＩＣ５０≒７nM）。さらに全 ての細胞において、大部分の¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７がインターナリゼーション したが、恐らく重大な予期しない結果は、図１７と１８に示すように、細胞の内 側の¹⁰⁵Ｒｈ−トレーサーの保持がスイス３Ｔ３細胞の保持よりも有意に良好で あったことである。例えば、ＣＦＰＡＣ−１とＰＣ−３細胞株の両方と結合して 残った¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の割合は、新鮮インキュベーション緩衝液での洗 浄による細胞外活性の除去の２時間後に＞８０％であったことは、特に注目すべ きことである（図１７と１８を参照のこと）。例IV：インビボ試験 正常マウスへの¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２または¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７のいずれ かの静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）により、生体分布試験を行った。これらの試験にお いて、麻酔をかけていないＣＦ−１マウス（体重１５〜２２ｇ）に尾静脈を介し て１〜５μCi（３７〜１８５KBq）の間の¹⁰⁵Ｒｈ標識物質をＩ．Ｖ．注射した。 臓器、体液および組織を、注射後（ＰＩ）３０、６０および１２０分時点で屠殺 したマウスから切除した。組織を秤量し、（適宜）食塩水中で洗浄して、ＮａＩ ウェルカウンターで計測した。次にこれらのデータを使用して、臓器または体液 中の注射用量パーセント（％ＩＤ）および１グラム当たりの％ＩＤを求めた。各 マウスの全血容量は、体重の６．５パーセントと推定した。これらの試験の結果 は、表２と３に要約する。 これらの試験の結果は、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の両 方とも主として腎臓を介して尿中に血流から排除されたことを証明した。具体的 には、ＩＤの６８．４±６．６％および６２．３±５．８％が、それぞれ¹⁰⁵Ｒ ｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７のＰＩ２時間時点で尿中に見い出さ れた（表２と３を参照のこと）。予期しない知見は、これらのマウスの腎臓に沈 着した残った¹⁰⁵Ｒｈの％ＩＤが、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ− ３７のＰＩ２時間時点にわずか２．４±０．６％ＩＤおよび４．６±１．３％Ｉ Ｄであったことである。これは、放射性金属化ペプチドおよび小さいタンパク質 が、＞１０％ＩＤそして通常１０％をはるかに上回る放射性金属の腎保持を示し たという以前報告されたデータから予測されるものよりもはるかに低い［ダンカ ン（Ｄｕｎｃａｎ）ら、１９９７］。¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ類似体の腎保持の低下の 理由は不明であるが、この結果は、存在する放射性金属化ペ プチドからの実質的な改善を証明している。 生体分布試験はまた、これらの放射性金属化ＢＢＮ類似体の別の重要なインビ ボの性質を証明した。¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の両方と も、ＧＲＰ受容体を発現しない臓器および組織（または循環血に接触できるＧＲ Ｐ受容体を有さないもの）から効率的に排除される。マウスにおける生体分布試 験は、膵臓における¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の特異的な 取り込みを証明したが、一方他の非排泄臓器または組織（すなわち、心臓、脳、 肺、筋肉、脾臓）は、取り込みも保持も示さなかった（表２と３）。¹⁰⁵ Ｒｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の両方とも、肝臓と腎臓の両方 により血流から除去され、これらの経路により除去される¹⁰⁵Ｒｈの大部分は、 それぞれ小腸と膀胱に排泄される。¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ− ３７の膵臓における％ＩＤ/gmは、ＰＩ２時間時点でそれぞれ３．９±１．３％ と９．９±５．４％であったことに注目することが重要である。すなわち、筋肉 と血液に対する膵臓における¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２の％ＩＤ/gmの比は、それぞ れ１６．２と７．６であった。筋肉と血液に対する膵臓における¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢ Ｎ−３７の％ＩＤ/gmの比は、それぞれ２５．４と２９．１であった。これらの データは、ＧＲＰ受容体を発現する細胞に対する放射性金属化ＢＢＮ類似体の選 択的インビボターゲティング［ジュー（Ｚｈｕ）ら、１９９１；キン（Ｑｉｎ） ら、１９９４］および非標的組織からの効率的なクリアランスを証明した。ＧＲ Ｐ受容体を発現する癌細胞が体内に存在するならば、これらの結果は、放射性金 属化ＢＢＮ類似体が膵細胞に類似した選択性でこれらをターゲティングできるこ とを示している。 ¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２と¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７との膵臓の取り込みと保持の 比較は、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７が、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２よりも２倍良好な効 率で膵臓内に沈着する（すなわち、ＰＩ１および２時間時点の¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ −３７ではそれぞれ３．６±１．２％ＩＤおよび２．３±１．０％ＩＤに対して 、ＰＩ１および２時間時点の¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−２２では１．２±０．５％ＩＤ および１．０±０．１％ＩＤ）ことを証明した。このデータは、図１６に示すイ ンビトロ試験において見い出された¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７の＞２倍高 い取り込みと保持に矛盾しない。例Ｖ：アミノ酸鎖スペーサーを利用する合成ＢＢＮ結合体類似体の合成とインビ トロ結合測定 Ａ．合成 Ｓ₄−マクロサイクルキレーターをＢＢＮ（８−１４）のＮ末端ｔｒｐ⁸から分 離するために２〜６個の間のアミノ酸スペーサー基を挿入した５個のＢＢＮ類似 体を、ＳＰＰＳにより合成した（図１９）。各ペプチドは、アプライド・バイオ システムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル４３２Ａペプチド 合成機を使用してＳＰＰＳにより調製した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用 して各ＢＢＮ類似体を樹脂から切断後、ペプチドは、ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ ）ＨＳ５４カラムと移動相として０．１％ ＴＦＡを含有するＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ を使用するＣ₁₈逆相ＨＰＬＣにより精製した。所望のＢＢＮペプチドを含有する 画分の回収後、溶媒を留去した。各ＢＢＮペプチドの本体は、ＦＡＢ−質量分析 （化学科−ワシントン大学（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ −Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、セントルイス、ミズーリ州 ）により確認した。 種々のアミノ酸配列（ある場合には異なるＲ基残基を含有する）をＢＢＮ結合 領域のＮ末端に（すなわち、ＢＢＮ−８またはＴｒｐ⁸に）結合させた。ＢＢＮ 類似体番号９６、９７、９８、９９および１０１は、図１９に示すように［１６ ］ａｎｅＳ₄マクロサイクルＢＦＣＡが、種々のアミノ酸配列によりＢＢＮ（８ −１４）上のｔｒｐ⁸から分離されている、Ｎ末端修飾ペプチドの例として合成 した。 ［１６］ａｎｅＳ₄マクロサイクリックリガンドは、選択されたつないだＢＢ Ｎ類似体に結合させた。［１６］ａｎｅＳ₄マクロサイクル誘導体上の−ＯＣＨ₂ ＣＯＯＨ基はＨＯＢｔ／ＨＢＴＵにより活性化して、スペーサー側鎖上の末端Ｎ Ｈ₂基とアミド結合を効率的に形成できるようにした（脱保護後）。対応する［ １６］ａｎｅＳ₄をつないだＢＢＮ誘導体を産生したが、これらの誘導体の５個 の例（すなわち、ＢＢＮ−９６、９７、９８、９９および１０１）を図１９に示 す。前述したように、各［１６］ａｎｅＳ₄ＢＢＮ誘導体は、逆相Ｈ ＰＬＣにより精製して、ＦＡＢ質量分析により特性を決定した。Ｂ．インビトロ結合親和性 合成ＢＢＮ誘導体の結合親和性は、スイス３Ｔ３細胞、ＰＣ−３細胞およびＣ ＦＰＡＣ−１細胞上のＧＲＰ受容体に関して評価した。誘導体のそれぞれのＩＣ₅₀ は、¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮに対して（すなわち、競合させて）測定した。Ｉ Ｃ₅₀を測定するために使用した細胞結合測定法は、標準法であり、以前に報告さ れた技術により使用した［ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら、１９９３；カイ（Ｃ ａｉ）ら、１９９２；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９４］。３つ全ての細胞株上に存 在するＧＲＰ受容体への全てのＢＢN類似体の結合によってＩＣ₅₀を測定するた めに使用した方法は、同様なものであった。スイス３Ｔ３細胞上でＩＣ₅₀を測定 するために使用した具体的な方法を、以下に簡単に述べる： スイス３Ｔ３マウス繊維芽細胞は４８ウェルマイクロタイタープレートでコン フルエンスまで増殖させる。ヘペス（１１．９１６g/l）、ＮａＣｌ（７．５９ ８g/l）、ＫＣｌ（０．５７４g/l）、ＭｇＣｌ₂（１．１０６g/l）、ＥＧＴＡ（ ０．３８０g/l）、ＢＳＡ（５．０g/l）、キモスタチン（０．００２g/l）、ダ イズトリプシンインヒビター（０．２００g/l）、およびバシトラシン（０．０ ５０g/l）からなるインキュベーション培地を調製した。増殖培地を除去し、細 胞をインキュベーション培地で２回洗浄して、インキュベーション培地を細胞に 戻した。各ウェルに、増大する濃度の適切な競合ペプチドの存在下で¹²⁵Ｉ−Ｔ ｙｒ⁴−ＢＢＮ（０．０１μCi）を加えた。置換ペプチドの典型的濃度は、ウェ ル当たり１０^-12〜１０^-5モルの置換リガンドの範囲とした。細胞は、９５％ Ｏ₂／５％ ＣＯ₂加湿環境中で３７℃で４０分間インキュベートした。インキュ ベーションの開始後４０分で、培地を廃棄して、細胞を冷インキュベーション培 地で２回洗浄した。細胞は、トリプシン／ＥＤＴA溶液中で３７℃で５分間のイ ンキュベーション後、ウェルから回収した。続いて、ウェル当たりの放射活性を 求めて、放射標識ペプチドの最大総取り込み％を求め、１００％に対して標準化 した。同様な方法を、ＰＣ−３およびＣＦ_a−ＰＡＣ−１ヒト癌細胞株の両方で 細胞結合測定法を行うのに使用した。Ｃ．結合親和性測定の結果 本発明により合成されたＢＢＮ誘導体について測定したＩＣ₅₀値は、Ｎ末端Ｂ ＢＮ−８残基（すなわち、Ｔｒｐ⁸）によるアミノ酸鎖スペーサー基を介するキ レーターの付加によって、ＩＣ₅₀値の変化がもたらされることを証明した。例え ば、図１９のＢＢＮ９６、９７、９８および１０１について示すＩＣ₅₀値を参照 のこと。この観察は、主として短鎖のアミノ酸残基でＢＢＮ（８−１３）を誘導 体化すると、様々なＩＣ₅₀値を示すという以前の報告と矛盾しない［ホフケン（ Ｈｏｆｆｋｅｎ）、１９９４］。ＢＢＮ−９８、９９および１０１に使用したア ミノ酸スペーサー基をＢＢＮ（７−１４）と［１６］ａｎｅＳ₄マクロサイクル の間に付加すると、ＩＣ₅₀は驚くほど一定であり、そして３つ全ての細胞株につ いて１〜６nMの範囲にあることが見い出された（すなわち、図１９に示すＩＣ₅₀ 値を参照のこと）。これらのデータは、選択されたアミノ酸配列から活性になる 比較的単純なスペーサー基を使用して、ＢＢＮ領域からある距離リガンドを延長 する［例えば、ＢＢＮ（８−１４）］ことによって、１〜６nmolの範囲の結合親 和性を維持する誘導体を製造できることを示唆している。Ｄ．Ｒｈ−ＢＢＮ−結合体による細胞結合試験 図２０に例示した結果は、対応するＲｈＣｌ₂［１６］ａｎｅＳ₄錯体が、４個 の異なるアミノ酸スペーサー基によりＢＢＮ（８−１４）上のＴｒｐ⁸から分離 されると（図２０を参照のこと）、４つ全ての類似体（すなわち、ＢＢＮ−９７ 、−９８、−９９、−１０１）のＩＣ₅₀は、ＰＣ−３およびＣＦＰＡＣ−１細胞 株上のＧＲＰ受容体では０．７３〜５．２９nmoleの間であったことを示してい る。これらの同じＲｈ−ＢＢＮ結合体のＩＣ₅₀は、スイス３Ｔ３細胞株では幾分 高かった（図２０）。これらのデータは、ＢＢＮ結合領域から＋１に荷電したＲ ｈ−Ｓ₄−キレートを除去するのに使用されるスペーサー基を含むアミノ酸鎖が 、インビボの腫瘍ターゲティング応用のためのＧＲＰ受容体に対する充分に高い 結合親和性を有する金属化ＢＢＮ類似体をもたらすことを証明している。例VI：^99mＴｃ標識合成ＢＢＮ類似体の合成とインビトロ結合評価 Ａ．合成 幾つかの四座キレート化のフレームワークを使用して、安定な^99mＴｃまたは¹⁸⁸ Ｒｅ標識ペプチドおよびタンパク質結合体を形成した［エッケルマン（Ｅｃ ｋｅｌｍａｎ）、１９９５；リー（Ｌｉ）ら、１９９６ｂ；パーカー（Ｐａｒｋ ｅｒ）、１９９０；リスター−ジェイムズ（Ｌｉｓｔｅｒ−Ｊａｍｅs）ら、１ ９９７］。これらのリガンドシステムの多くは、少なくとも１つのチオール（− ＳＨ）ドナー基を含有して、生じるＴｃ（Ｖ）またはＲｅ（Ｖ）錯体の形成速度 と安定性（インビトロとインビボの両方）を最大にしている［パーカー（Ｐａｒ ｋｅｒ）、１９９０；エッケルマン（Ｅｃｋｅｌｍａｎ）、１９９５］。最近の 報告からの結果は、二官能性キレート化剤（ＢＦＣＡ）のジメチルグリシル−Ｌ −セリル-Ｌ−システイニル−グリシンアミド（Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡ）がＲｅＯ⁺³お よびＴｃＯ⁺³との明確な錯体を形成することができることを示している［ウォン （Ｗｏｎｇ）ら、１９９７］。このリガンドフレームワークはＳＰＰＳ法により 合成することができるため、このＮ₃Ｓ−ＢＦＣＡを、Ｔｃ−９９ｍ−ＢＢＮ− 類似体結合体の形成において使用するために選択した。ＢＢＮ（７−１４）の３ つの異なるＮ₃Ｓ−ＢＦＣＡ結合体を、図２１に示すようにＳＰＰＳにより合成 した（ＢＢＮ−１２０、−１２１および−１２２）。ＢＢＮ−１２０、ＢＢＮ− １２１およびＢＢＮ−１２２は、３、５および８個の炭素スペーサー基によりＮ₃ Ｓ−ＢＦＣＡがＢＢＮ（７−１４）から分離している一連の類似体である（図 ２１）。各ペプチドは、例１に略述されたＳＰＰＳおよびクロマトグラフィー法 を使用して合成および精製した。システイン上のチオール基は、ＡＣＭ基（これ は、ＴＦＡを使用する樹脂からのこれらＢＢＮ−結合体の切断中に切断されない ）を使用して保護した。ＢＢＮ−１２０、−１２１および−１２２の本体は、Ｆ ＡＢ質量分析により確認した。Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡの合成と精製はまた、ＳＰＰＳ 法、続いてＨＰＬＣ精製を利用して容易に達成することができた（例１を参照の こと）。ＡＣＭ基を使用して、合成および樹脂からの切断中にシステイン上のチ オール基を保護した。Ｂ．インビトロ結合親和性 ^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２（図２２）の合成は、２つの方法により調製した［ すなわち、（１）^99mＴｃ−グルコネートから^99mＴｃＯ⁺³のキレート交換による か、または（２）「前形成」^99mＴｃ−ＢＦＣＡ錯体の形成およびこれに 続くテトラフルオロフェニルによる−ＣＯＯＨ活性化と次のＢＢＮ（７−１４） に付加したＣ₅−炭素スペーサー基との反応による］。両方の場合に、形成され た^99mＴｃ標識ペプチドは図２２に示す。このＴｃ−ＢＢＮ−１２２結合体の構 造は、非放射活性Ｒｅ（Ｔｃの化学的同族体）を使用することにより決定した。 これらの試験において、Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡとの「前形成」ＲｅＯ⁺³錯体は、以前 発表された方法［ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、１９９７］によりｐＨ６〜６．５のリ ン酸ナトリウム緩衝液に溶解した過剰のＮ₃Ｓ−ＢＦＣＡの存在下でＳｎＣｌ₂と のＲｅＯ₄の還元により調製した。ＲｅＯ−Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡ錯体の精製後、この キレートの構造は、以前報告された構造［ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、１９９７］と 同一であることが証明された（質量分析による）。 ＲｅＯ−Ｎ₃−Ｓ−ＢＦＣＡ錯体は、６mg（無水）ＥＤＣと５０μlのＴＦＰに １０mgの錯体を加えることにより、活性化トリフルオロフェニル（ＴＦＰ）エス テルに変換した。この溶液を１分間ボルテックス混合後、混濁が消失するまでＣ Ｈ₃ＣＮを加えた。この溶液をＲＴで１時間インキュベートして、逆相ＨＰＬＣ により精製した。ＲｅＯ−Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡ錯体ＢＢＮ−１２２結合体（図２２ ）を調製するために、ＲｅＯ−Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡ錯体を含有する１μlのＨＰＬＣ 画分を、ｐＨ９で０．２Ｎ ＮａＨＣＯ₃中に１mgのＣ₈でつないだＢＢＮ（７− １４）ペプチドを含有する溶液に加えた。室温で１時間この溶液をインキュベー ション後、試料を分析し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。Ｒｅ−ＢＢＮ−１２２ の収率は、約３０〜３５％であった。 「前形成」^99mＴｃＯ−Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡ錯体を使用する対応する^99mＴｃ−Ｂ ＢＮ−１２２結合体の調製方法は、「前形成」ＲｅＯ−Ｎ₃Ｓ−ＢＦＣＡ錯体で 上述した方法と同一である。この場合に、⁹⁹Ｍｏ／^99mＴｃジェネレーターから の^99mＴｃＯ₄は、過剰のＮ₃Ｓ−ＢＦＣＡの存在下で飽和酒石酸第１スズ水溶液 で還元した。この「前形成」法を使用する^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２生成物の収 率は、約３０〜４０％であった。Ｒｅ−ＢＢＮ−１２２結合体の分析に使用した ものと同じ勾配溶出プログラム ［これらの試験において使用した勾配溶出は、以下の通りである： 流量１．５ml/分；溶媒Ａ＝０．１％ＴＦＡを含むＨＯ；溶媒Ｂ＝０．１％ＴＦ Ａを含むＣＨＣＮ； ］ を使用して、^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の逆相ＨＰＬＣ分析によって、^99m Ｔｃ−ＢＢＮ−１２２と¹⁸⁸Ｒｅ−ＢＢＮ−１２２の両方が同じ保持時間（す なわち、１４．２〜１４．４分）であることを証明した（図２２を参照のこと） 。このことは、^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２とＲｅ−ＢＢＮ−１２２の両方の構造 が同一であることの強力な証拠を与える。 ＢＢＮ−１２２とＲｅ−ＢＢＮ−１２２の結合親和性は、ＧＲＰ受容体を発現 する、スイス３Ｔ３細胞、ＰＣ−３細胞およびＣＦＰＡＣ−１細胞上のＧＲＰ受 容体に関して評価した。各誘導体のＩＣ₅₀は、¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮ（スイス ３Ｔ３細胞におけるＧＲＰ受容体の¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮのＫ_dは、１．６± ０．４nMであると報告されている）［ジュー（Ｚｈｕ）ら、１９９１］に対して （すなわち、これと競合させて）求めた。ＩＣ₅₀を測定するために使用した細胞 結合測定法は、標準的であり、以前に報告された方法により使用した［レバン（ Ｌｅｂａｎ）ら、１９９４；カイ（Ｃａｉ）ら、１９９４；カイ（Ｃａｉ）ら、 １９９２］。全ての細胞株上のＧＲＰ受容体の全てのＧＲＰ受容体結合について ＩＣ₅₀を求めるのに使用した方法は同様であり、他のＢＢＮ−類似体および本明 細書に記述されたＲｈ−ＢＢＮ類似体について前述されている。Ｃ．結合親和性測定の結果 本発明により合成したＢＢＮ−１２２およびＲｅ−ＢＢＮ−１２２について測 定したＩＣ₅₀値は、Ｎ₂Ｓ₁−ＢＦＣＡと対応するＲｅ錯体（すなわち、Ｔｒｐ⁸ ）に結合した８−炭素の炭化水素鎖スペーサーを付加すると、１〜５nmolの範囲 のＩＣ₅₀値を有するＢＢN結合体が得られることを証明した（表Ａを参照のこと ）。^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２をこれらの同じ細胞と共にインキュベートしたと き、≧nmol濃度のＢＢＮが、この^99mＴｃ結合体を＞９０％置換したことが判っ た。この結果は、^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２がＧＲＰ受容体に対す る高くかつ特異的な結合親和性を有することを証明した。これらのデータは、比 較的単純なスペーサー基を使用してＮ₃Ｓリガンドフレームワークおよび対応す るＴｃ−またはＲｅ−Ｎ₃Ｓ₁錯体をＢＢＮ結合領域からある距離延長することに よって、１〜５nmolの範囲の結合親和性を維持する誘導体が得られることを証明 している。 表Ａ． ２つの細胞株（ＧＲＰ受容体を発現するＰＣ−３およびＣＦ−ＰＡＣ−１細胞 株）における非金属化ＢＢＮ−１２２結合体またはＲｅ−ＢＢＮ−１２２結合体 に対するＧＲＰ受容体の結合のＩＣ₅₀値の要約。¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴−ＢＢＮに対し て細胞結合測定法を用いてＩＣ₅₀値を測定した。 例VII：ヒト癌細胞ＰＣ−３およびＣＦ−ＰＡＣ−１細胞における^99mＴｃ−ＢＢ Ｎ−１２２の保持 一旦放射性金属が特異的に癌細胞に「送達」される（例えば、細胞表面上のＧ ＲＰ受容体を特異的に標的とするＢＢＮ結合残基を使用して）と、有効な放射性 薬剤で有効に癌を治療するために、高い割合の「送達」された放射活性原子が、 数時間またはそれ以上の期間細胞と結合したままであることが必要である。この 結合を達成する１つの方法は、細胞表面ＧＲＰ受容体に結合後、放射標識ＢＢＮ 結合体を癌細胞内にインターナリゼーションさせることである。 細胞内にインターナリゼーションした^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の割合を求め るために設計した実験は、¹⁰⁵Ｒｈ−ＢＢＮ−３７について前述したものと同じ 方法により実施した。簡単に述べると、過剰の^99mＴＣ−ＢＢＮ−１２２をｐｃ −３またはＣＦＰＡＣ−１細胞インキュベーション培地に加えて、４０分のイン キュベーション後平衡を確立させた。細胞を囲む培地を除去して、放射活性を含 まない新鮮培地で細胞を洗浄した。洗浄後、細胞に結合した放射活性の量を測定 した（すなわち、細胞に結合した^99mＴｃの１分当たりの総カウント）。次にＰ Ｃ−３およびCＦＰＡＣ−１細胞を０．２Ｍ酢酸溶液（ｐＨ２．５）中でインキ ュベートすると、この酢酸溶液が、表面タンパク質（ＧＲＰ受容体を含む）を変 性させて全ての表面結合放射性物質を放出させた。この緩衝液を除去および洗浄 後、細胞を再度計測した。この時点で細胞に結合した１分当たりのカウント（c. p.m.）は、ＰＣ−３またはＣＦＰＡＣ−１細胞の内側に捕捉されたまま残った^{99 m} Ｔｃだけに関連していた。 ^99mＴｃ活性の細胞内保持を測定するために、同様の方法を利用した。しかし 、新鮮（非放射活性）インキュベーション培地で細胞を洗浄後、全ての細胞外^{99 m} Ｔｃ−ＢＢＮ−１２２を洗浄後異なる時点に細胞を新鮮培地中でインキュベー トした。各時間間隔の後、総c.p.m.および細胞内c.p.m.を測定するために使用し た方法の後でｐＨ２．５の０．２Ｍ酢酸溶液で洗浄した。 ^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２アゴニストによる試験は、これがＰＣ−３およびＣ ＦＰＡＣ−１細胞の内側にインターナリゼーション（図２３〜２６）し、ＧＲＰ 受容体発現細胞による^99mＴｃの実質的な細胞内保持が起こることを証明してい る。例えば、ＰＣ−３細胞と一緒に^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２を使用する試験の 結果は、高速のインターナリゼーション（図２３）を示し、洗浄の９０分後に約 ７５％の^99mＴｃが細胞に結合したまま残ることを証明した（図２５）。この^99m Ｔｃ細胞結合活性のほぼ全てがＰＣ−３細胞の内側にある。同様の結果が、ＣＦ ＰＡＣ１胞でも見い出され、ここでも、高速の^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２インタ ーナリゼーションおよび細胞からの比較的遅い^99mＴｃの流出があった（すなわ ち、洗浄の１２０分後に５０〜６０％の保持）（図２６）。 図２２に示す^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２ペプチド結合体は、ＢＢＮ−１４位に アミド化メチオニンを有しており、かつアゴニストであることが予想される［ジ ェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら、１９９３］。したがって、細胞表面上のＧＲＰ受 容体への結合後急速にインターナリゼーションをすることが予測される［ビステ ルボッシュ（Ｂｊｉｓｔｅｒｂｏｓｃｈ）ら、１９９５；スマイズ（Ｓｍｙｔｈ ｅ）ら、１９９１］が、このことは図２３〜２６における出願人ら のデータにより確認される。例VIII：インビボ試験 正常マウスへの^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）により、 生体分布試験を行った。これらの試験において、麻酔をかけていないＣＦ−１マ ウス（体重１５〜２２ｇ）に尾静脈を介して、１〜５μCi（３７〜１８５KBq） の間の^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２をＩ．Ｖ．注射した。臓器、体液および組織を 、注射後（ＰＩ）０．５、１、４および２４時間時点で屠殺したマウスから切除 した。組織を秤量し、（適宜）食塩水で洗浄して、ＮａＩウェルカウンターで計 測した。次にこれらのデータを使用して、臓器または体液中の注射用量パーセン ト（％ＩＤ）および１グラム当たりの％ＩＤを求めた。各マウスの全血容量は、 体重の６．５パーセントと推定した。これらの試験の結果を、表ＢとＣに要約す る。 これらの試験の結果は、^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２が、主として肝胆道経路を 介して血流から排除され、約３５％の^99mＴｃ活性が腎臓を介して尿中に排除さ れたことを証明した。具体的には、ＩＤの３３．７９±１．７６％が、ＰＩ１時 間時点で尿中に見い出された（表Ｂ）。腎臓と肝臓における^99mＴｃ活性の保持 は非常に低い（表Ｂ）。これは、放射性金属化ペプチドおよび小さいタンパク質 が、＞１０％ＩＤ、そして通常１０％をはるかに上回る放射性金属の腎保持を示 したという以前報告されたデータから予測されるよりもはるかに低い［ダンカン （Ｄｕｎｃａｎ）ら、１９９７］。^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の腎保持の低下の 理由は不明であるが、この結果は、存在する放射性金属化ペプチドからの実質的 な改善を証明している。 生体分布試験はまた、^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２はＧＲＰ受容体を発現しない 臓器および組織（または循環血に接触できるＧＲＰ受容体を有さないもの）から 効率的に排除されるという点で、この別の重要なインビボの性質を証明した。マ ウスの生体分布試験は、膵臓における^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の特異的な取り 込みを証明したが、一方他の非排泄臓器または組織（すなわち、心臓、脳、肺、 筋肉、脾臓）は、取り込みも保持も示さなかった。^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２は 、肝臓と腎臓の両方により血流から除去され、これらの経路により除去される^{99 m} Ｔｃの大部分は、それぞれ小腸と膀胱に排泄される。^99mＴｃ−ＢＢＮ− １２２の膵臓における％ＩＤ/gmは、１時間時点で１２．６３％/gmであり、ＰＩ ４時間時点ではわずか５．０５％に低下することに注目することが重要である（ 表Ｃ）。すなわち、筋肉と血液に対する膵臓における^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２ の％ＩＤ/gmの比は、ＰＩ４時間時点でそれぞれ９２．２と１４．７８であった 。これらのデータは、ＧＲＰ受容体を発現する細胞に対する^99mＴｃ標識ＢＢＮ 類似体の選択的インビボターゲティング［ジュー（Ｚｈｕ）ら、１９９１；キン （Ｑｉｎ）ら、１９９４］および非標的組織からの効率的なクリアランスを証明 した。ＧＲＰ受容体を発現する癌細胞が体内に存在するならば、これらの結果は 、^99mＴｃ−ＢＢＮ類似体が、膵細胞に類似した選択性でこれらをターゲティン グできることを示している。 表Ｂ．ＩＶ注射後０．５、１、４および２４時間時点の正常ＣＦ−１マウスにお ける^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の生体分布。結果は％ＩＤ／臓器として表される 。 ａ． 表中の各値は、各群５匹のマウスからの平均とＳＤを表す。 ｂ． ４および２４時間時点では、^99mＴｃを含有する糞便が各マウスから排泄 されており、尿中の％ＩＤはＩＤの約６０％であると推定した。 ｃ． 切除した他の全ての臓器（脳、心臓、肺および脾臓を含む）は、ｔ≧１時 間で＜０．１０％を示した。 ｄ． 全血容量を体重の６．５％であると仮定して、血液中の％ＩＤを推定した 。 表Ｃ．ＩＶ注射後０．５、１、４および２４時間時点の正常ＣＦ−１マウスにお ける^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の生体分布。結果は％ＩＤ/gmとして表される。ａ． 表中の各値は、各群５匹のマウスからの平均とＳＤを表す。 ｂ． 全血容量を体重の６．５％であると仮定して、血液中の％ＩＤを推定した 。 表Ｄ．ＩＶ注射後１、４および２４時間時点のＰＣ−３腫瘍担持ＳＣＩＤマウス における^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の生体分布。結果は％ＩＤ／臓器として表さ れる。 ａ． 表中の各値は、各群５匹のマウスからの平均とＳＤを表す。 ｂ． ４および２４時間時点では、^99mＴｃを含有する糞便が各マウスから排泄 されており、尿中の％ＩＤはＩＤの約６０％であると推定した。 ｃ． 切除した他の全ての臓器（脳、心臓、肺および脾臓を含む）は、ｔ≧１時 間で＜０．１０％を示した。 ｄ． 全血容量を体重の６．５％であると仮定して、血液中の％ＩＤを推定した 。 表Ｅ．ＩＶ注射後１、４および２４時間時点のＰＣ−３腫瘍担持ＳＣＩＤマウス における^99mＴｃ−ＢＢＮ−１２２の生体分布。結果は％ＩＤ/Gmとして表される 。 ａ． 表中の各値は、各群５匹のマウスからの平均とＳＤを表す。 ｂ． 全血容量を体重の６．５％であると仮定して、血液中の％ＩＤを推定した 。 本発明は例示的に記述しており、使用された用語は、本質的に限定よりはむし ろ記述のための言葉という範疇に入るものとされることを理解されたい。 上記教示事項に照らして本発明の多くの修飾と改変が明らかに可能である。し たがって、本発明は添付された請求の範囲内において、具体的に記述されたもの 以外に実施することができる。 本出願を通して、種々の刊行物が引用と数字により参照されている。刊行物の 完全な引用は以下に列挙する。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術の 現状をさらに充分に記載するために、全体として参照することにより本出願の一 部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 49/02 Ｂ Ｃ (72)発明者 リ，ニン アメリカ合衆国，メリーランド，バルチモ ア，セントポール ストリート 3501，ア パートメント 229 (72)発明者 シークマン，ゲーリー アメリカ合衆国，ミズーリ，アシュラン ド，ノーマ レーン 105 (72)発明者 ヒッゲンボタム，クリス，エイ. アメリカ合衆国，ミズーリ，コロンビア, エス．ウエスト ウェイ 6440

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 治療用または診断用放射性薬剤として使用するための化合物であって、ガ ストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体に結合することができる残基に結合した 金属を錯化することができる基を含んでなる、上記化合物。 2. ガストリン放出ペプチド受容体に結合することができる残基は、ガストリ ン放出ペプチド受容体アゴニストである、請求の範囲第１項に記載の化合物。 3. ガストリン放出ペプチド受容体アゴニストは、ボンベシンアゴニスト結合 残基を含む、請求の範囲第２項に記載の化合物。 4. 金属を錯化することができる基はキレート化基を含む、請求の範囲第１項 に記載の化合物。 5. キレート化基は、スペーサー基によりボンベシンアゴニスト結合残基に結 合している、請求の範囲第４項に記載の化合物。 6. 式： Ｘ−Ｙ−Ｂ ［式中、Ｘは、金属を錯化することができる基であり；Ｙは、スペーサー基また は共有結合であり；そしてＢは、ボンベシンアゴニスト結合残基である］の構造 を有する、請求の範囲第５項に記載の化合物。 7. Ｙは、Ｃ₁−Ｃ₁₀炭化水素鎖である、請求の範囲第６項に記載の化合物。 8. Ｙは、Ｃ₃−Ｃ₉炭化水素鎖である、請求の範囲第７項に記載の化合物。 9. Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求の範囲第６項に記載の 化合物。 10．Ｙは、ＢＢＮ−７位にＬ−Ｇｌｎ残基を含む、請求の範囲第９項に記載の 化合物。 11．キレート化基は、ペプチドボンベシン結合残基のＮ末端で該ボンベシンア ゴニスト結合残基に結合している、請求の範囲第５項に記載の化合物。 12．キレート化基は、ボンベシンアゴニスト結合残基のアミノ酸残基８（ｔｒ ｐ⁸）で該ペプチドボンベシンアゴニスト結合残基に結合している、請求の範囲 第１１項に記載の化合物。 13．スペーサーは、ボンベシンアゴニスト結合残基のＮ末端で該ボンベシンア ゴニスト結合残基に結合している、請求の範囲第１１項に記載の化合物。 14．スペーサーは、ボンベシンアゴニスト結合残基のアミノ酸残基８（Ｄ−ま たはＬ−ｔｒｐ⁸）で該ボンベシンアゴニスト結合残基に結合している、請求の 範囲第１３項に記載の化合物。 15．金属は、診断用または治療用に有用な金属である、請求の範囲第１項に記 載の化合物。 16．遷移金属は、γおよびβ放出同位体を含む群から選択される金属放射性同 位体である、請求の範囲第１５項に記載の化合物。 17．金属放射性同位体は、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、^99mＴｃ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁹⁹Ａｕ、^{1 53} Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏおよび⁹⁰Ｙを含む群から選択される放射性同位体である、請求 の範囲第１６項に記載の化合物。 18．金属同位体は、その酸化物および窒化物を含む、請求の範囲第１６項に記 載の方法。 19．キレート化剤は、配位原子を介して金属との非常に安定な錯体を形成する ことができる多座キレート化構造を含む、請求の範囲第４項に記載の化合物。 20．キレート化構造は、配位原子Ｓ、Ｎ、Ｏ、またはＰを含む、請求の範囲第 １９項に記載の化合物。 21．キレート化構造は、配位原子を含むマクロサイクリック化合物である、請 求の範囲第１９項に記載の化合物。 22．キレート化構造は、Ｓ₄キレーターである、請求の範囲第１９項に記載の 化合物。 23．化合物は、Ｎ₄キレーターである、請求の範囲第１９項に記載の化合物。 24．化合物は、Ｎ₂Ｓ₂キレーターである、請求の範囲第１９項に記載の化合物 。 25．化合物は、ＮＳ₃キレーターである、請求の範囲第１９項に記載の化合物 。 26．化合物は、Ｎ₃Ｓキレーターである、請求の範囲第１９項に記載の化合物 。 27．化合物は、未変性ボンベシンとほぼ等しいかまたはそれ以上のガストリン 放出ペプチド受容体に対する結合親和性を有する、請求の範囲第３項に記載の化 合物。 28．新生物疾患を有する被験体を治療するための方法であって、ガストリン放 出ペプチド受容体に特異的に結合することができる残基に結合したキレート化基 と錯化した金属を含む、有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含んでなる、上 記方法。 29．ガストリン放出ペプチド受容体に結合することができる残基は、ガストリ ン放出ペプチド受容体アゴニストである、請求の範囲第２８項に記載の方法。 30．放射性薬剤を新生物細胞に接触させる工程をさらに含む、請求の範囲第２ ８項に記載の方法。 31．接触工程は、新生物細胞上で発現したガストリン放出ペプチド受容体への 放射性薬剤の結合としてさらに定義される、請求の範囲第３０項に記載の方法。 32．化合物を新生物細胞内にインターナリゼーションさせる工程をさらに含む 、請求の範囲第２８項に記載の方法。 33．新生物細胞の死を始動させるか、または腫瘍の診断イメージを与えるのに 充分な時間、化合物を新生物細胞内に保持させる工程をさらに含む、請求の範囲 第２８項に記載の方法。 34．ガストリン放出ペプチド受容体アゴニストは、ボンベシンアゴニスト結合 残基を含む、請求の範囲第２９項に記載の方法。 35．キレート化金属は、スペーサーによりボンベシンアゴニスト結合残基に結 合している、請求の範囲第３４項に記載の方法。 36．化合物は、式： Ｘ−Ｙ−Ｂ ［式中、Ｘは、金属を結合することができる基であり；Ｙは、該スペーサー基ま たは共有結合であり；そしてＢは、ボンベシンアゴニスト結合残基である］の構 造を有する、請求の範囲第３４項に記載の方法。 37．Ｙは、Ｃ₁−Ｃ₁₀炭化水素鎖である、請求の範囲第３６項に記載の方法。 38．Ｙは、Ｃ₃−Ｃ₉炭化水素鎖である、請求の範囲第３７項に記載の方法。 39．Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求の範囲第３６項に記載 の方法。 40．Ｙは、ＢＢＮ−７位にＬ−Ｇｌｎ残基を含む、請求の範囲第３９項に記載 の方法。 41．キレート化基は、ボンベシンアゴニスト結合残基のＮ末端でペプチドボン ベシンアゴニスト結合残基に結合している、請求の範囲第３６項に記載の方法。 42．キレート化基は、ボンベシンアゴニスト結合残基のアミノ酸残基８（Ｄ− またはＬ−ｔｒｐ⁸）でボンベシンアゴニスト結合残基に結合している、請求の 範囲第４１項に記載の方法。 43．スペーサーは、ボンベシンアゴニスト結合残基のＮ末端でボンベシンアゴ ニスト結合残基に結合している、請求の範囲第４１項に記載の方法。 44．遷移金属は、診断用または治療用に有用な放射活性金属である、請求の範 囲第２８項に記載の方法。 45．金属は、γおよびβ放出同位体を含む群から選択される金属放射性同位体 である、請求の範囲第４４項に記載の方法。 46．金属放射性同位体は、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、^99mＴｃ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁹⁹Ａｕ、^{1 53} Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏおよび⁹⁰Ｙを含む群から選択される放射性核種である、請求の 範囲第４５項に記載の方法。 47．金属放射性同位体は、その酸化物および窒化物を含む、請求の範囲第４６ 項に記載の方法。 48．キレート化剤は、配位原子を介して金属と非常に安定な錯体を形成するこ とができる多座キレート化構造を含む、請求の範囲第２８項に記載の化合物。 49．キレート化構造は、配位原子Ｓ、Ｎ、Ｏ、またはＰを含む、請求の範囲第 ４８項に記載の方法。 50．キレート化構造は、配位原子を含むマクロサイクリック化合物である、請 求の範囲第４８項に記載の方法。 51．化合物は、Ｓ₄キレーターである、請求の範囲第４８項に記載の方法。 52．化合物は、Ｎ₄キレーターである、請求の範囲第４８項に記載の方法。 53．化合物は、Ｎ₂Ｓ₂キレーターである、請求の範囲第４８項に記載の方法。 54．化合物は、ＮＳ₃キレーターである、請求の範囲第４８項に記載の方法。 55．化合物は、Ｎ₃Ｓキレーターである請求の範囲第４８項に記載の方法。 56．化合物は、未変性ボンベシンとほぼ等しいかまたはそれ以上のガストリン 放出ペプチド受容体に対する結合親和性を有する、請求の範囲第２８項に記載の 方法。 57．キレート化基と錯化した金属を、ガストリン放出ペプチド受容体に反発的 （ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）に結合することができる残基と反応させる工程を含む、 治療用または診断用化合物を形成する方法。 58．金属を、ガストリン放出ペプチド受容体に反発的（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ） に結合することができる残基に既に共有結合したキレート化基と反応させる工程 を含む、治療用または診断用化合物を形成する方法。 59．ガストリン放出ペプチド受容体に結合することができる残基は、ガストリ ン放出ペプチド受容体アゴニストである、請求の範囲第５７項に記載の方法。 60．ガストリン放出ペプチド受容体アゴニストは、ボンベシンアゴニスト結合 残基を含む、請求の範囲第５７項に記載の方法。 61．キレート化金属は、スペーサー基によりボンベシンアゴニスト結合残基に 結合している、請求の範囲第６０項に記載の方法。 62．化合物は、式： Ｘ−Ｙ−Ｂ ［式中、Ｘは、金属を結合することができる基であり；Ｙは、スペーサー基また は共有結合であり；そしてＢは、ボンベシン結合残基である］の構造を有する、 請求の範囲第６０項に記載の方法。 63．Ｙは、Ｃ₁−Ｃ₁₀炭化水素鎖である、請求の範囲第６２項に記載の方法。 64．Ｙは、Ｃ₃−Ｃ₉炭化水素鎖である、請求の範囲第６３項に記載の方法。 65．Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求の範囲第６０項に記載 の方法。 66．Ｙは、ＢＢＮ−７位にＬ−Ｇｌｎ残基を含む、請求の範囲第６５項に記載 の方法。 67．キレート化基は、ボンベシンアゴニスト結合残基のＮ末端でボンベシンア ゴニスト結合残基に結合している、請求の範囲第６２項に記載の方法。 68．キレート化基は、ボンベシン分子またはその誘導体のアミノ酸残基８（Ｄ −またはＬ−ｔｒｐ⁸）でボンベシンアゴニスト結合残基に結合している、請求 の範囲第６０項に記載の方法。 69．スペーサーは、ボンベシンアゴニスト結合残基のＮ末端でボンベシンアゴ ニスト結合残基に結合している、請求の範囲第６０項に記載の方法。 70．スペーサーは、ボンベシンアゴニスト結合残基のアミノ酸残基８（Ｄ−ま たはＬ−ｔｒｐ⁸）でボンベシンアゴニスト結合残基に結合している、請求の範 囲第６０項に記載の方法。 71．金属は、診断用または治療用に有用な放射活性金属である、請求の範囲第 ５７項に記載の方法。 72．金属は、γおよびβ放出同位体を含む群から選択される金属放射性同位体 である、請求の範囲第７１項に記載の方法。 73．金属放射性同位体は、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、^99mＴｃ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁹⁹Ａｕ、^{1 53} Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏおよび⁹⁰Ｙを含む群から選択される放射性核種である、請求の 範囲第７２項に記載の方法。 74．金属同位体は、その酸化物および窒化物を含む、請求の範囲第７３項に記 載の方法。 75．キレート化剤は、配位原子を介して金属と非常に安定な錯体を形成するこ とができる多座キレート化構造を含む、請求の範囲第５７項に記載の方法。 76．キレート化構造は、配位原子Ｓ、Ｎ、Ｏ、またはＰを含む、請求の範囲第 ７５項に記載の方法。 77．キレート化構造は、配位原子を含むマクロサイクリック化合物である、請 求の範囲第７５項に記載の方法。 78．化合物は、Ｓ₄キレーターである、請求の範囲第７５項に記載の方法。 79．化合物は、Ｎ₄キレーターである、請求の範囲第７５項に記載の方法。 80．化合物は、Ｎ₂Ｓ₂キレーターである、請求の範囲第７５項に記載の方法。 81．化合物は、ＮＳ₃キレーターである、請求の範囲第７５項に記載の方法。 82．化合物は、Ｎ₃Ｓキレーターである、請求の範囲第７５項に記載の方法。 83．化合物は、未変性ボンベシンとほぼ等しいかまたはそれ以上のガストリン 放出ペプチド受容体に対する結合親和性を有する、請求の範囲第５７項に記載の 方法。 84．被験体に診断的に有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物を投与するこ とによる、腫瘍部位をイメージングする方法。 85．金属は、所定量の請求の範囲第１項に記載の化合物および還元剤を含有す る密閉バイアルに加えられる、キット型の方法を使用する薬剤を処方する方法。