JP4836455B2 - 改善されたガストリン関連ペプチド化合物 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、診断用造影剤または放射線治療薬として有用な、新規のガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）化合物に関する。これらのＧＲＰ化合物は、放射性核種またはｉｎｖｉｖｏ光造影により検出可能な標識で標識され、薬物動力学の改善をもたらすこの標識とターゲティングペプチドとの間の新規なリンカーの使用を含む。
発明の背景
癌の検出および処置を目的とした放射性医薬品（例えば、診断用造影剤、放射線治療薬）の使用はよく知られている。さらにここ数年、癌の検出および／または処置のための部位特異的な放射性医薬品の発見により、そのような化合物の特異性、有効性および有用性を正しく認識している医療専門家たちの数も増え、育成されてきている。
これらのより新しい放射性医薬品は、典型的には、金属キレート化剤に結合するターゲティング剤からなり、金属キレート化剤は診断用金属放射性核種、例えば、テクネチウムまたはインジウム、または治療用金属放射性核種、例えば、ルテチウム、イットリウム、またはレニウムとキレートを形成する（例えば、複合体を形成する）ことができる。金属キレート化剤の役割は、放射性薬剤が目的の部位へと送達されたときに、金属放射性核種を保持（即ち、キレート化）することである。金属放射性核種に強く結合しない金属キレート化剤では、目的の部位には到達しないので、放射性薬剤は目的の用途には有効とは言えない。したがって、例えば、本明細書の一部を構成する、米国特許第5,662,885（Pollak et. al., ）に報告されているようなさらなる研究や開発は、金属放射性核種と強力に結合する能力および治療物質と抱合体を形成する能力を示す金属キレート化剤の発見につながった。その後、例えば、本明細書の一部を構成する米国特許第5,976,495（Pollak et. al., ）にあるように、金属キレート化剤とターゲティング剤との間を物理的に離す「スペーサー」を用いる概念がさらに導入された。
ターゲティング剤の役割は、ある特定の結合部位に対するその親和性に基づいて、金属放射性核種を含有する放射性薬剤などの診断用薬剤を、検出または処置の目的の部位へと向かわせることである。典型的には、ターゲティング剤には、タンパク質、ペプチドまたは所定の受容体に対する特異的な親和性を示す他の巨大分子が含まれる。他の既知のターゲティング剤には、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、抗体断片（Ｆab‘ｓおよび（Ｆab）2‘ｓ）、および受容体-avid ペプチドが含まれる。Donald J. Buchsbaum, “Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies; Pharmacokinetics of Antibodies and Their Radiolabels; Experimental Radioimmunotherapy and Methods to Increase Therapeutic Efficacy, "CRC Press, Boca Raton, Chapter 10, pp. 115-140, (1995); Fischman, et al. "A Ticket to Ride: Peptide Radiopharmaceuticals," The Journal of Nuclear Medicine, vol. 34, No. 12, (Dec. 1993).
ここ数年、いくつかの癌細胞は、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体ｓ（ＧＲＰ−Ｒ）を含み、ＧＲＰ−Ｒには多くのサブタイプが存在することが分かってきた。特に、いくつかの種類の癌細胞は、ＧＲＰ受容体の過剰発現または独特な発現をすることが分かっている。このため、ＧＲＰ受容体ファミリーに結合するＧＲＰおよびＧＲＰアナログについての一層の研究や実験がなされた。このようなアナログの１つは、これはカエルの皮膚から単離された１４アミノ酸ペプチド（即ち、テトラデカペプチド）であるボンベシン（ＢＢＮ）であり、これはヒトＧＲＰの類縁体であり、高い特異性と、ＧＲＰに類似した親和性でもってＧＲＰ受容体と結合する。
ボンベシンおよびＧＲＰ類縁体は、アゴニストの形態もアンタゴニストの形態もとりうる。ＧＲＰ受容体に対するＧＲＰまたはＢＢＮアゴニストの結合は、これら癌細胞の細胞分裂の速度を増大させ、このようなアゴニストは細胞によって内在化されるのに対し、ＧＲＰまたはＢＢＮアンタゴニストの結合は、細胞による内在化または増大した細部分裂速度を徐々に生じない。そのようなアンタゴニストは、内因性のＧＲＰのＧＲＰ受容体に対する結合を拮抗的に阻害して癌細胞の増殖速度が減少するように設計される。例えば、Hoffken, K.; Peptides in Oncology II, Somatostatin Analogues and Bombesin Antagonists (1993), pp. 87-112を参照。この理由のため、かなりの研究がなされ、アンタゴニストであるＢＢＮまたはＧＲＰ類縁体の開発が現在もなされている。例えば、Davis et al., Metabolic Stability and Tumor Inhibition of Bombesin/GRP Receptor Antagonists, Peptides, vol. 13, pp. 401-407, 1992
癌のための診断用または治療剤としての使用のための有効な化合物の設計では、その薬物が、適当なインビボのターゲティングおよび薬物動態学的特性を有することが重要である。例えば、放射性医薬には、放射性標識ペプチドが、癌細胞による（例えば、ＧＲＰ受容体を介して）高い特異性での取込を有することが好ましい。また、放射性核種が一旦癌の部位に局在すれば、高度に局在化された放射線量がその部位に送達されるように所望の合計時間そこへ留まることが好ましい。
さらに、正常な組織から効率的に排出される放射性ペプチドの開発もまた、放射性薬剤の重要な要素である。金属の放射性核種で標識された（キレート抱合体形成による）生体分子（例えば、ＭＡｂ、Ｆabまたはペプチドｓ）をヒト等の動物に投与する場合、金属放射性核種（いくつかの化学的形態の）の大部分のパーセンテージが腎臓または肝臓実質に「トラップ」される（即ち、尿または胆汁に排出されない）。Duncan et al.; Indium-111-Diethylenetriaminepentaacetic Acid-Octreotide Is Delivered in Vivo to Pancreatic, Tumor Cell, Renal, and Hepatocyte Lysosomes, Cancer Research 57, pp. 659-671, (Feb. 15, 1997)。より小さな放射能標識された生体分子（即ち、ペプチドまたはＦab）の場合は、活性の排出の主な経路は、高レベルの放射性金属が滞留し得る腎臓である（即ち、通常注射用量の＞１０〜１５％）。腎臓または肝臓における金属放射性核種の滞留が望ましくないことは明らかである。したがって、長期間の造影診断または放射線治療のための高レベルの腫瘍取込が必要な場合は、腎臓による血流からの放射性医薬の排出が速すぎるのも望ましくない。
本明細書の一部を構成する米国特許第6,200,546号およびUS 2002/0054855（Hoffman, et. al）にあるような、その後の研究は、一般式Ｘ−Ｙ−Ｂ（式中、Ｘは金属と複合体を形成することが可能な基であり、Ｙはスペーサー基における共有結合であり、Ｂはボンベシンアゴニスト結合部分である）を有する化合物を形成することによってこの問題点を克服しようとするものであった。そのような化合物は、ＧＲＰ受容体に対する高い結合親和性を有することが報告されており、ある一定の期間細胞の内部に放射能が保持される。さらに、正常マウスにおけるインビボでの研究は、腎臓における放射性金属の滞留が当分野で既に知られているものよりも低く、放射能の大部分が尿中に排出されることを示した。
断造影および治療用途のための、改善された薬物動力学および改善された腎臓排出を有する新しいおよび改善された放射性医薬および他の診断用化合物（即ち、腎臓における放射能の低い滞留）がここに見出された。造影診断については、放射能の急速な腎臓排出と低い停留レベルが、改善された造影にとって非常に重要である。放射線治療における用途については、低い腎臓滞留と共に、より高い腫瘍取込を可能にするゆっくりとした血液クリアランスと良好な腫瘍ターゲティングが重要である。
発明の概要
本発明の一態様では、造影診断または放射線治療において用いるための新規のそして改善された化合物を提供する。この化合物は、リンカーまたはスペーサー基によってＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドに結合した医学的に有用な金属イオンまたは放射性核種（金属キレート化剤）と複合体を形成することが可能な化学的部分を含んでいる。他の態様では、これらの化合物は、リンカーまたはスペーサー基によってＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドに結合した光標識（例えば光標識または光造影、光音響学的造影または光ルミネセンスによって検出可能な他の標識）を含んでいる。
一般に、本発明の化合物は、次式：
Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇ
［式中、
Ｍは金属キレート化剤（金属放射性核種と複合体を形成したまたは形成していない形態の）または光標識であり、
Ｎ−Ｏ−Ｐはリンカーであり、
ＧはＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドである］
を有する。
金属キレート化剤Ｍは、当分野において、医学的に有用な金属イオンまたは放射性核種と複合体を形成することが知られている任意の金属キレート化剤であってよい。好ましいキレート化剤としては、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡ、ＥＨＰＧ、ＨＢＥＤ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＴＥＴＭＡ、ＰＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＬＩＣＡＭ、ＭＥＣＡＭ、またはペプチドキレート化物質（例えば本明細書に記載の）が挙げられる。金属キレート化剤は、金属放射性核種と複合体を形成していてもいなくてもよく、適宜、単一のアミノ酸等のスペーサーを含んでいてもよい。シンチグラフィーまたは放射線治療のための好ましい金属放射性核種としては、99mＴｃ、51Ｃｒ、67Ｇａ、68Ｇａ、47Ｓｃ、51Ｃｒ、167Ｔｍ、141Ｃｅ、111Ｉｎ、168Ｙｂ、175Ｙｂ、140Ｌａ、90Ｙ、88Ｙ、153Ｓｍ、166Ｈｏ、165Ｄｙ、166Ｄｙ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、203Ｐｂ、211Ｂｉ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、214Ｂｉ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、117mＳｎ、149Ｐｍ、161Ｔｂ、177Ｌｕ、198Ａｕおよび199Ａｕが挙げられる。金属の選択は、適用する所望の治療または診断に基づいて決定する。例えば、診断目的の場合は、好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、99mＴｃ、および111Ｉｎが挙げられ、99mＴｃ、および111Ｉｎが特に好ましい。治療目的の場合は、好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、90Ｙ、105Ｒｈ、111Ｉｎ、117mＳｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、175Ｙｂ、177Ｌｕ、186／188Ｒｅおよび199Ａｕが挙げられ、177Ｌｕおよび90Ｙが特に好ましい。本発明の化合物において用いられる最も好ましいキレート化剤は、１−置換された４,７,１０−トリカルボキシメチル１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）である。
光標識Ｍは、当分野において既知の様々な光標識のうちのいずれかであってよい。好ましい標識としては、有機発色団または蛍光を含む光学色素、例えばシアニン色素、光吸収化合物、光反射化合物および光散乱化合物および生物発光分子が挙げられるがこれに限定されない。
１つの態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐは、少なくとも１つの非アルファアミノ酸を含む。
さらなる態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐは、少なくとも１つの置換された胆汁酸を含む。
さらに別の態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐは少なくとも１つの環状基を有する非アルファアミノ酸を含む。
ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドは、ＧＲＰ、ボンベシンまたはその任意の誘導体または類縁体であってよい。好ましい態様では、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドは、ＧＲＰまたはアゴニストとして作用するボンベシン類縁体である。好ましい態様では、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドは、本明細書の一部を構成する米国特許第６,２００,５４６号およびＵＳ２００２／００５４８５５に開示されたボンベシンアゴニスト結合部分である。
さらに、本発明の化合物を用いる新規の造影方法も提供する。
本発明の診断用または治療剤を製造するために必要な化合物を含んでいる単一容器または複数容器のキットは、本発明の典型的な態様において提供される。
さらに、本発明の化合物を含有する物質を注射用造影媒体に添加する工程を含んでなる診断用造影剤の新規製造方法を提供する。
放射線治療薬の新規製造方法と同様に、本発明の化合物を含有する物質を注射用造影媒体に添加する工程を含んでなる本発明の化合物を用いる放射線治療の新規な方法もまた提供される。
本発明の詳細な記載
以下の記載において、本発明の様々な態様をさらに詳細に説明する。説明のため、具体的な構成および詳細は本発明の全体の理解のために記載する。但し、詳細に記載されていなくても本発明を実施できるということは当業者には自明であろう。さらに、本発明を分かりづらくしないために、周知の特徴を省略または単純化するかもしれない。
本発明の一態様では、造影診断または放射線治療において用いるための新規のおよび改善された化合物を提供する。化合物としては、リンカーまたはスペーサー基によってＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドに結合した医学的に有用な金属イオンまたは放射性核種（金属キレート化剤）と複合体を形成することが可能な光標識または化学的部分が挙げられる。
一般に、本発明の化合物は次式：
Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇ
［式中、
Ｍは金属キレート化剤（金属放射性核種と複合体を形成したまたは形成していない形態の）または光標識であり、
Ｎ−Ｏ−Ｐはリンカーであり、
ＧはＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドである］
を有する。金属キレート化剤、光標識、リンカー、およびＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドを各々以下に記載する。
本発明の他の態様では、光標識または金属キレート化剤をＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドに連結することが可能な新規のおよび改善されたリンカーまたはスペーサー基を提供する。一般に、本発明のリンカーは、次式：
Ｎ−Ｏ−Ｐ
［式中、Ｎ、ＯおよびＰは各々、本明細書において定義したものである］
を有する。
本明細書において定義した基準を満たす化合物は、当分野で知られている他のＧＲＰ受容体ターゲティングペプチド抱合体と比較して、改善された薬物動態特性を有することを発見した。例えば、本発明のリンカーを含む化合物は、長時間血流に留まるため、これまで知られている化合物よりも長い半減期を有する。この長い半減期は、造影診断、そして特に癌細胞および腫瘍がより多くの量の放射性ペプチドを取り込む治療目的での使用に有用な、より良好な腫瘍ターゲティングが可能になるため、医学的に有益である。
１Ａ．金属キレート化剤
用語「金属キレート化剤」は、金属原子と複合体を形成する分子であって、生理学的条件下で安定である分子を意味する。即ち、金属は、ｉｎｖｉｖｏでキレート化剤骨格との複合体を維持する。より具体的には、金属キレート化剤は、放射性核種金属と複合体を形成し、且つ生理学的条件下で安定であり、リンカーＮ−Ｏ−Ｐとの抱合体形成のための反応性の官能基を少なくとも１つ有する金属複合体を形成する分子である。金属キレート化剤Ｍは、医学的に有用な金属イオンまたは放射性核種との複合体を形成することが当分野で知られている任意の金属キレート化剤であってよい。金属キレート化剤は、金属放射性核種と複合体を形成していてもいなくてもよい。さらに、金属キレート化剤は、適宜、スペーサー、例えば金属と複合体を形成しないが金属キレート化剤とリンカーとの間の物理的な分離をもたらす１個のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含むことができる。
本発明の金属キレート化剤には、例えば、直鎖状の、大環状の、テルピリジン、およびＮ3Ｓ、Ｎ2Ｓ2、またはＮ4キレート化剤（本明細書の一部を構成する米国特許第５,３６７,０８０号、米国特許第５,３６４,６１３号、米国特許第５,０２１,５５６号、米国特許第５,０７５,０９９号、米国特許第５,８８６,１４２号も参照）およびＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ,およびビスアミノビスチオール（ＢＡＴ）キレート化剤（米国特許第５,７２０,９３４号も参照）が含まれるがこれに限定されない当分野で知られている他のキレート化剤が挙げられる。例えば、Ｎ4キレート化剤は、本明細書の一部を構成する米国特許第６,１４３,２７４号；米国特許第６,０９３,３８２号；米国特許第５,６０８,１１０号；米国特許第５,６６５,３２９号；米国特許第５,６５６,２５４号；および米国特許第５,６８８,４８７号に記載されている。特定のＮ3Ｓキレート化剤は、本明細書の一部を構成するＰＣＴ／ＣＡ９４／００３９５、ＰＣＴ／ＣＡ９４／００４７９、ＰＣＴ／ＣＡ９５／００２４９および米国特許第５,６６２,８８５号；米国特許第５,９７６,４９５号；および米国特許第５,７８０,００６号に記載されている。キレート化剤には、キレート化リガンド、メルカプト−アセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）の誘導体も含まれ、ＭＡＭＡ（モノアミドモノアミンジチオール）、ＤＡＤＳ（Ｎ2Ｓジアミンジチオール）、ＣＯＤＡＤＳなどＮ3Ｓ、およびＮ2Ｓ2系を含んでいる。これらおよびその他様々なリガンド系は、本明細書の一部を構成するLiuおよびEdwards, Chem Rev. 1999, 99, 223５−2268およびそこに引用されている文献に記載されている。
金属キレート化剤には４配位で金属に配位していないリガンド原子を含む複合体も含まれる。これらには、例えば、本明細書の一部を構成する米国特許第５,１８３,６５３号；米国特許第５,３８７,４０９号；および米国特許第５,１１８,７９７号に記載の、テクネチウムおよびレニウムジオキシムのボロン酸アダクトが挙げられる。
好ましいキレート化剤の例としては、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）,１,４,７,１０テトラアザシクロテトラデカン１,４,７,１０テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）,１−置換された１,４,７,−トリカルボキシメチル１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、４−カルボニルメチル−１０−ホスホノメチル−１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,７−二酢酸（Ｃｍ４ｐｍ１０ｄ２ａ）；および１,４,８,１１−テトラアザシクロテトラデカン−１、４、８、１１−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）が挙げられるがこれに限定されない。さらなるキレートリガンドは、エチレンビス−（２−ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）、およびその誘導体（５−ＣｌＥＨＰＧ、５−ＢｒＥＨＰＧ、５−ＭｅＥＨＰＧ、５−ｔＢＵＥＨＰＧ、および５−ｓｅｃＢＵＥＨＰＧを含む）；ベンゾジエチレントリアミンペンタ酢酸（ベンゾＤＴＰＡ）およびその誘導体（ジベンゾＤＴＰＡ、フェニルＤＴＰＡ、ジフェニルＤＴＰＡ、ベンジルＤＴＰＡ、およびジベンジル−ＤＴＰＡを含む）；ビス−２（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）およびその誘導体；少なくとも３個、より好ましくは少なくとも６個の炭素原子と、少なくとも２個のヘテロ原子（Ｏおよび／またはＮ）を含み、大環状化合物が１個の環またはヘテロ環と共に連結した２または３個の環からなる大環状化合物のクラス、例えば、ベンゾＤＯＴＡ、ジベンゾＤＯＴＡ、およびベンゾＮＯＴＡ（ここに、ＮＯＴＡは１,４,７−トリアザシクロノナンＮ,Ｎ’,Ｎ”三酢酸である）、ベンゾＴＥＴＡ、ベンゾＤＯＴＭＡ（ここにＤＯＴＭＡは１,４,７,１０テトラアザシクロテトラデカン１,４,７,１０テトラ（メチルテトラ酢酸である）、およびベンゾＴＥＴＭＡ（ここに、ＴＥＴＭＡは１,４,８,１１−テトラアザシクロテトラデカン１,４,８,１１−（メチルテトラ酢酸）である）；１,３−プルピレンジアミンテトラ酢酸（ＰＤＴＡ）およびトリエチレンテトラアミンヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１,５,１０Ｎ,Ｎ’,Ｎ”トリス（２,３−ジヒドロキシベンゾイル）トリカテコレート（ＬＩＣＡＭ）および１,３,５−Ｎ,Ｎ’,Ｎ”トリス（２,３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）の誘導体である。本発明が意図する代表的なキレート化剤およびキレート化基の例は、本明細書の一部を構成する、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ８６／０６６０５、ＷＯ９１／０３２００、ＷＯ９５／２８１７９、ＷＯ９６／２３５２６、ＷＯ９７／３６６１９、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１４７３、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０１８２,および米国特許第４,８９９,７５５号,米国特許第５,４７４,７５６号,米国特許第５,８４６,５１９号および米国特許第６,１４３,２７４号に開示されている。
特に好ましい金属キレート化剤としては、以下の、式１，２および３で示される化合物（111Ｉｎおよび放射性ランタニド、例えば177Ｌｕ，90Ｙ，153Ｓｍ，および166Ｈｏについて）および式４，５および６で示される化合物（放射性99mＴｃ，186Ｒｅ，および188Ｒｅについて）が挙げられる。これらのおよび他の金属キレート化基は、本明細書の一部を構成する米国特許第６,０９３,３８２号および米国特許第５,６０８,１１０号に記載されている。さらに、式３のキレート化基は、例えば、米国特許第６,１４３,２７４に、式５のキレート化基は、例えば、米国特許第５,６２７,２８６号および米国特許第６,０９３,３８２号に、および式６のキレート化基は、例えば、米国特許第５,６６２,８８５号、米国特許第５,７８０,００６号および米国特許第５,９７６,４９５号に記載されている（これらはすべて本明細書の一部を構成する）。式６で示される具体的な金属キレート化剤としては、Ｎ,Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ；Ｎ,Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ；Ｎ,Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ；Ｎ,Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ；および他のその変異体が挙げられる。例えば、金属放射性核種と実際には複合体を形成しないスペーサー、例えば１個のさらなるアミノ酸Ｇｌｙをこれらの金属キレート化剤（例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ；Ｎ,Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ；Ｎ,Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ；Ｎ,Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）に結合させてもよい。他の有用な金属キレート化剤、例えば米国特許第６,３３４,９９６に開示されているもの全て（例えば、ジメチルｇｌｙ−Ｌ−ｔ−ブチルｇｌｙ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ；ジメチルｇｌｙ−Ｄ−ｔ−ブチルｇｌｙ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ；ジメチルｇｌｙ−Ｌ−ｔ−ブチルｇｌｙ−Ｌ−Ｃｙｓ,など）もまた本明細書の一部を構成する。
さらに、硫黄保護基、例えばＡｃｍ（アセトアミドメチル）、トリチルまたは他の既知のアルキル、アリール、アシル、アルカノイル、アリロイル、メルカプトアシルおよび有機チオール基をこれら金属キレート化剤のシステインアミノ酸に結合させることができる。
さらに、他の有用な金属キレート化剤としては、
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 が挙げられる。
上記式１および２において、Ｒはアルキル、好ましくはメチルである。上記式５ａおよび５ｂにおいて、ＸはＣＨ2またはＯであり；Ｙは分岐したまたは分岐していないＣ1-Ｃ10アルキル；アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシル；アリールアルキル（ここで、アルキル基またはアリール基に結合する基は、Ｃ1-Ｃ10の分岐したまたは分岐していないアルキル基、Ｃ1-Ｃ10の分岐したまたは分岐していないヒドロキシまたはポリヒドロキシアルキル基またはポリアルコキシアルキルまたはポリヒドロキシ−ポリアルコキシアルキル基である）であり；Ｊは必須ではないが、存在する場合はＣ（＝Ｏ）−、ＯＣ（＝Ｏ）−、ＳＯ2−、ＮＣ（＝Ｏ）−、ＮＣ（＝Ｓ）−、Ｎ（Ｙ）、ＮＣ（＝ＮＣＨ3）−、ＮＣ（＝ＮＨ）−、Ｎ＝Ｎ−、合成または天然のアミノ酸に由来するホモポリアミドまたはヘテロポリアミンであり；ｎはすべて１−１００である。これらの構造の他の型は、例えば、米国特許第６,０９３,３８２に記載されている。式６において、基Ｓ−ＮＨＣＯＣＨ3は、ＳＨまたはＳ−Ｚ（ここで、Ｚは例えば上に記載の任意の既知の硫黄保護基である）で置換されていてもよい。式７は、金属キレート化剤として有用なｔ−ブチル化合物の一態様を記載するものである。上記特許、出願および文献のそれぞれの開示は、本明細書の一部を構成する。
好ましい態様において、金属キレート化剤としては、環式または非環式のポリアミノカルボン酸、例えばＤＯＴＡ（１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−テトラ酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、ＤＴＰＡ−ビスメチルアミド、ＤＴＰＡ−ビスモルホリンアミド、Ｃｍ４ｐｍ１０ｄ２ａ（４−カルボニルメチル−１０−ホスホノメチル−１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１、７−二酢酸）、ＤＯ３ＡＮ−［［４、７、１０−トリス（カルボキシメチル）−１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル］アセチル、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ＤＯ３Ａ−モノアミドおよびその誘導体が挙げられる。
シンチグラフィーまたは放射線治療に好ましい金属放射性核種としては、99mＴｃ、51Ｃｒ、67Ｇａ、68Ｇａ、47Ｓｃ、51Ｃｒ、167Ｔｍ、141Ｃｅ、111Ｉｎ、168Ｙｂ、175Ｙｂ、140Ｌａ、90Ｙ、88Ｙ、153Ｓｍ、166Ｈｏ、165Ｄｙ、166Ｄｙ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、203Ｐｂ、211Ｂｉ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、214Ｂｉ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、117mＳｎ、149Ｐｍ、161Ｔｂ、177Ｌｕ、198Ａｕおよび199Ａｕおよびそれらの酸化物または窒化物が挙げられる。金属の選択は、所望の治療または診断の適用に基づいて決定する。例えば、診断目的（例えば、診断および原発腫瘍および転移性腫瘍における治療の進行をモニターするための）では、好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、99mＴｃ、および111Ｉｎが挙げられ、99mＴｃおよび111Ｉｎが特に好ましい。治療目的(例えば、原発腫瘍および前立腺、乳房、肺、などの癌に関連する転移に対する放射線治療を行うための)では、好ましい 放射性核種としては、64Ｃｕ、90Ｙ、105Ｒｈ、111Ｉｎ、117mＳｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、175Ｙｂ、177Ｌｕ、186／188Ｒｅ、および199Ａｕが挙げられ、177Ｌｕおよび90Ｙが特に好ましい。99mＴｃは、低コストで、入手が容易で、高い特異性を有するため、特に有用であり診断用放射性核種として好ましい。99mＴｃの核および放射能の特性によってこの同位体は理想的なシンチグラフィー造影剤となっている。この同位体は、単一の光子エネルギーが１４０ｋｅＶで、放射能半減期が約６時間であり、99Ｍｏ99mＴｃ発生器から容易に入手できる。例えば、99mＴｃ標識ペプチドを用い、原発腫瘍や転移において、診断し、処置の進行をモニターすることができる。177Ｌｕ、90Ｙまたは他の治療用放射性核種で標識したペプチドを用いて、原発腫瘍や前立腺、乳房、肺、などの癌に関連する転移に対する放射線治療を提供することができる。
１Ｂ．光標識
典型的な態様では、本発明の化合物に光標識、例えば広範囲の非局在化された環系を有し、４００〜１５００ｎｍの範囲で最大吸収または最大発光を有する光学色素（有機発色団または蛍光を含む）を結合させることができる。本発明の化合物は、生物発光分子で誘導体化されていてもよい。ヘモグロビンからのシグナルによる干渉を最小限にするための光標識の最大発光の好ましい範囲は、６００〜１０００ｎｍである。好ましくは、光吸収標識は大きいモル吸光係数、例えば１０5ｃｍ-1Ｍ-1を有し、蛍光色素は、高い量子収量を有する。光学色素の例としては、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９５、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９６／１７６２８、ＷＯ９７／１８８４１、ＷＯ９６／２３５２４、ＷＯ９８／４７５３８,およびそれらにおいて引用された文献に記載のものが挙げられるがこれに限定されない。例えば、光標識は、共有結合によって本発明の化合物、例えば、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドからなる化合物および本発明のリンカーに直接結合していてもよい。可視領域、電磁スペクトルの近赤外領域において光を吸収および発光する数日間は、現在、その生体適合性、高いモル吸光係数および／または高い蛍光量子収量のために様々な生物医学的適用に用いられている。造影剤としての色素に関連する光学的モダリティの高い感受性は、核医学と同等であり、電離放射線の望ましくない効果なしに器官や組織の可視化が可能である。近赤外領域（ＮＩＲ）で強い吸収および発光を伴うシアニン色素は、生物学的組織がこの領域では光学的に透明であるので特に有用である。例えば、ＮＩＲ領域で吸収・発光するインドシアニングリーンは、心拍出量、肝臓機能、肝臓血流をモニターするのに用いられており、その官能化誘導体は診断目的で生体分子に結合させるために用いられている(R. B. Mujumdar, L. A. Ernst, S. R. Mujumdar, et al., Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry, 1993, 4(2), 105-111; Linda G. Lee and Sam L. Woo. "N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescent labels", U.S. Pat. No. 5,453,505; Eric Hohenschuh, et al. "Light imaging contrast agents", WO 98/48846; Jonathan Turner, et al. "Optical diagnostic agents for the diagnosis of neurodegenerative diseases by means of near infra-red radiation", WO 98/22146; Kai Licha, et al. "In-vivo diagnostic process by near infrared radiation", WO 96/17628; Robert A. Snow, et al., Compounds, WO 98/48838）。様々な造影技術や試薬は、米国特許第６,６６３,８４７号、同第６,６５６,４５１号、同第６,６４１,７９８号、同第６,４８５,７０４号、同第６,４２３,５４７号、同第６,３９５,２５７号、同第６,２８０,７０３号、同第６,２７７,８４１号、同第６,２６４,９２０号、同第６,２６４,９１９号、同第６,２２８,３４４号、同第６,２１７,８４８号、同第６,１９０,６４１号、同第６,１８３,７２６号、同第６,１８０,０８７号、同第６,１８０,０８６号、同第６,１８０,０８５号、同第６,０１３,２４３号、および公開された米国特許出願第２００３１８５７５６号、同第２００３１６５６４３２号、同第２００３１５８１２７号、同第２００３１５２５７７号、同第２００３１４３１５９号、同第２００３１０５３００号、同第２００３１０５２９９号、同第２００３０７２７６３号、同第２００３０３６５３８号、同第２００３０３１６２７号、同第２００３０１７１６４号、同第２００２１６９１０７号、同第２００２１６４２８７号および同第２００２１５６１１７号に記載されている。
２Ａ．少なくとも１つの非アルファアミノ酸を含むリンカー
本発明の一態様において、リンカーＮ−Ｏ−Ｐは、少なくとも１つの非アルファアミノ酸を含んでいる。したがって、このリンカーＮ−Ｏ−Ｐの態様では、Ｎは０（ここで、０は不在を意味する）、アルファまたは非アルファアミノ酸または他の連結基であり；
Ｏはアルファまたは非アルファアミノ酸であり；および
Ｐは０、アルファまたは非アルファアミノ酸または他の連結基であって、
ここで、Ｎ、ＯまたはＰの少なくとも１つが非アルファアミノ酸である。
即ち、１つの例では、Ｎ＝Ｇｌｙ、Ｏ＝非アルファアミノ酸およびＰ＝０である。
アルファアミノ酸は当分野で周知であり、天然のアミノ酸および合成アミノ酸が含まれる。
非アルファアミノ酸もまた当分野で知られており、天然のアミノ酸および合成アミノ酸が含まれる。好ましい非アルファアミノ酸としては、
８−アミノ−３、６−ジオキサオクタン酸；
Ｎ−４−アミノエチル−Ｎ−１−酢酸；および
式ＮＨ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−ＣＨ2ＣＯ2ＨまたはＮＨ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ（式中、ｎ＝２〜１００）を有するポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
少なくとも１つの非アルファアミノ酸を有するリンカーを含む式Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇを有する化合物の例をTable 1に示す。これらの化合物は、本明細書、特に実施例に記載した方法、並びに当業者に知られている同様の方法を用いて製造することができる。
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２Ｂ．少なくとも１つの置換された胆汁酸を含むリンカー
本発明の他の態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐは少なくとも１つの置換された胆汁酸を含む。即ち、このリンカーＮ−Ｏ−Ｐの態様では、
Ｎは０（ここで、０は不在を意味する）、アルファアミノ酸または置換された胆汁酸または他の連結基であり；
Ｏはアルファアミノ酸または置換された胆汁酸であり；
Ｐは０、アルファアミノ酸、置換された胆汁酸または他の連結基であって、
ここで、Ｎ、ＯまたはＰの少なくとも１つが置換された酸である。
胆汁酸は、胆汁（肝臓の分泌液）に存在し、ヒドロキシル基と末端がカルボキシル基である５個の炭素原子の側鎖を有するステロイドである。置換された胆汁酸では、胆汁酸の少なくとも１つの原子、例えば水素、が他の原子、分子または化学基で置換されている。例えば、置換された胆汁酸には、場合により７および１２位で水素、ヒドロキシルまたはケト官能基により置換された、３−アミノ、２４−カルボキシル基を有する化合物が含まれる。
本発明における他の有用な置換された胆汁酸としては、置換されたコール酸およびその誘導体が含まれる。具体的な、置換されたコール酸誘導体としては以下のものが含まれる：
（３β,５β）−３−アミノコラン−２４−酸；
（３β,５β,１２α）−３−アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸；
（３β,５β,７α,１２α）−３−アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸；
Ｌｙｓ−（３,６,９）−トリオキサウンデカン−１,１１−ジカルボニル−３,７−ジデオキシ−３−アミノコール酸）；
（３β,５β,７α）−３−アミノ−７−ヒドロキシ−１２−オキソコラン−２４−酸；および
（３β,５β,７α）−３−アミノ−７−ヒドロキシコラン−２４−酸。
少なくとも１つの置換された胆汁酸を有するリンカーを含む式Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇを有する化合物の例をＴａｂｌｅ２に示す。これらの化合物は、本明細書、特に実施例において開示された方法、並びに当業者に知られている同様の方法によって製造することができる。
Figure 0004836455
本発明のさらなる別の態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐは、少なくとも１つの環状基を有する非アルファアミノ酸である。したがって、このリンカーＮ−Ｏ−Ｐの態様では、
Ｎは０（ここで、０は不在を意味する）、アルファアミノ酸、環状基または他の連結基を有する非アルファアミノ酸であり；
Ｏはアルファアミノ酸または環状基を有する非アルファアミノ酸であり；
Ｐは０、アルファアミノ酸、環状基または他の連結基を有する非アルファアミノ酸であり、
ここで、Ｎ、ＯまたはＰの少なくとも１つが環状基を有する非アルファアミノ酸である。
環状基を有する非アルファアミノ酸は、置換されたフェニル、ビフェニル、シクロヘキシルまたは脂肪族または複素環部分を含む他のアミンおよびカルボキシルを含む。
そのような例には以下のものが含まれる：
４−アミノ安息香酸
３−アミノ安息香酸
４−アミノメチチル安息香酸
８−アミノオクタン酸
トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
４−（２−アミノエトキシ）安息香酸
イソニペコチン酸
２−アミノメチル安息香酸
４−アミノ−３−ニトロ安息香酸
４−（３−カルボキシメチル−２−ケト−１−ベンズイミダゾリル−ピペリジン
６−（ピペラジン−１−イル）−４−（３Ｈ）−キナゾリノン−３−酢酸
（２Ｓ,５Ｓ）−５−アミノ−１,２,４,５,６,７−ヘキサヒドロ−アゼピノ［３,２１−ｈｉ］インドール−４−オン−２−カルボン酸
（４Ｓ,７Ｒ）−４−アミノ−６−アザ−５−オキソ−９−チアビシクロ［４．３．０］ノナン−７−カルボン酸
３−カルボキシメチル−１−フェニル−１,３,８−トリアザスピロ［４．５］デカン−４−オン
Ｎ１−ピペラジン酢酸
Ｎ−４−アミノエチル−Ｎ−１−ピペラジン酢酸
（３Ｓ）−３−アミノ−１−カルボキシメチルカプロラクタム
（２Ｓ,６Ｓ,９）−６−アミノ−２−カルボキシメチル−３,８−ジアザビシクロ−［４,３,０］−ノナン−１,４−ジオン
３−アミノ-３−デオキシコール酸
４−ヒドロキシ安息香酸
４−アミノフェニル酢酸
３−ヒドロキシ−４−アミノ安息香酸
３−メチル-４−アミノ安息香酸
３−クロロ-４−アミノ安息香酸
３−メトキシ-４−アミノ安息香酸
６−アミノナフトエ酸
Ｎ,Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−スクシンアミド酸。
少なくとも１つの環状基を有するアルファアミノ酸を有するリンカーを含む式Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇを有する化合物の例をTable 3に示す。これらの化合物は、本明細書、特に実施例において開示した方法、並びに当業者に知られている同様の方法を用いて製造することができる。
Figure 0004836455
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アミノ−（フェニル、ビフェニル、シクロアルキルまたは複素環）カルボン酸および様々なＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドに関連する好ましいリンカーを含む化合物の集団をTable 4に記載する。これらの化合物は本明細書、特に実施例に開示した方法を用いて、並びに当業者に知られている同様の方法により製造することができる。
Figure 0004836455
２Ｄ．他の連結基
リンカーＮ−Ｏ−Ｐにおいて用いることができる他の連結基としては、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドの金属キレート化剤または光標識への結合に供するが、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドのターゲティング機能または金属キレート化剤の金属キレート化機能または光標識の検出能力のいずれかに悪い影響を及ぼさない化学基が挙げられる。適当な他の連結基としては、ペプチド（即ち、アミノ酸が互いに連結した）単独、非ペプチド基（例えば、炭化水素鎖）またはアミノ酸配列と非ペプチドスペーサーとの組み合わせが挙げられる。
１つの態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐにおいて用いるための他の連結基としては、Ｌ−グルタミンおよび炭化水素鎖またはその組み合わせが挙げられる。
他の態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐにおいて用いることができる他の連結基としては、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドのＮ末端残基とポリマー鎖における金属キレート化剤または光標識との間の原子数の合計が１２原子以下である、一連のアミノ酸（例えば、ジグリシン、トリグリシン、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｕ、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙなど）からなる純粋なペプチド連結基が挙げられる。
さらなる態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐにおいて用いるための他の連結基はまた、炭化水素鎖［即ち、Ｒ1-（ＣＨ2）n-Ｒ2］（ここで、Ｎは０−１０、好ましくはｎ＝３〜９であり、Ｒ1はリガンド骨格または予め形成された金属キレート化剤または金属複合体骨格または光標識と共有結合するための部位として用いることができる基（例えば、Ｈ2Ｎ−、ＨＳ−、−ＣＯＯＨ）であり；Ｒ2はＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドのＮ末端のＮＨ2−基に対する共有結合のために用いられる基（例えば、Ｒ2は活性化されたＣＯＯＨ基である）である）が挙げられる。リガンド（即ち、キレート化剤）または好ましい金属キレートを生体分子に結合させるためのいくつかの化学的方法が文献に十分に記載されている[Wilbur, 1992; Parker, 1990; Hermanson, 1996; Frizberg et al., 1995]。１以上のこれら方法を用いて複合体を形成していないリガンド（キレート化剤）または放射性金属キレートまたは光標識のいずれかをリンカーに結合させるかまたはこのリンカーをＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドに結合させる。これらの方法には、酸無水物、アルデヒド、アリールイソチオシアネート、活性化されたエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの形成が含まれる[Wilbur, 1992; Parker, 1990; Hermanson, 1996; Frizberg et al., 1995]。
好ましい態様では、リンカーＮ−Ｏ−Ｐにおいて用いるための他の連結基は、以下に記載する求電子物質または求核試薬を有するリンカー前駆体から形成することができる：
ＬＰ１：リンカーの少なくとも２つの場所に同一の求電子物質Ｅ１または同一の求核試薬Ｎｕ１を有するリンカー前駆体；
ＬＰ２：求電子物質Ｅ１およびリンカーの別の場所に求電子物質Ｅ２を有するリンカー前駆体；
ＬＰ３：求核試薬Ｎｕ１およびリンカーの別の場所に求核試薬Ｎｕ２を有するリンカー前駆体；または
ＬＰ４：一端が求電子物質Ｅ１で官能化され、もう一端が求核試薬Ｎｕ１で官能化されたリンカー前駆体。
好ましい求核試薬Ｎｕ１／Ｎｕ２としては、−ＯＨ、−ＮＨ、−ＮＲ、−ＳＨ、−ＨＮ−ＮＨ2、−ＲＮ−ＮＨ2、および−ＲＮ−ＮＨＲ’（ここで、Ｒ’およびＲは、上記Ｒについて定義したものから独立に選択されるが、Ｒ’はＨではない）が挙げられる。
好ましい求電子物質Ｅ１／Ｅ２としては、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ＝Ｏ（アルデヒド）、−ＣＲ＝ＯＲ’（ケトン）、−ＲＮ−Ｃ＝Ｓ、−ＲＮ−Ｃ＝Ｏ、−Ｓ−Ｓ−２−ピリジル、−ＳＯ2−Ｙ、−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｙおよび
Figure 0004836455
 ［式中、Ｙは、以下の基：
Figure 0004836455
 から選択されされる］
が挙げられる。
３．ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチド
ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチド（即ち、式Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇ中のＧ）は、受容体ファミリーに対する結合親和性を有する任意のペプチド、その等価物、誘導体またはアナログである。
ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドは、アゴニストまたはアンタゴニストの形態をとり得る。ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドアゴニストは、高い親和性でもって結合した後、その細胞を活性化することが知られており、細胞によって内在化され得る。対して、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドアンタゴニストは、細胞によって内在化されることなくおよび細胞を活性化することなく、細胞上のＧＲＰ受容体のみに結合する。好ましい態様では、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドはアゴニストである。
本発明のより好ましい態様では、ＧＲＰアゴニストはボンベシン（ＢＢＮ）類縁体および／またはその誘導体である。ＢＢＮ誘導体またはそのアナログは、好ましくはＢＢＮ結合領域（即ち、ＢＢＮ（７−１４）［配列番号１］）と同じ一次構造を含んでいるかまたは、類似の一次構造を含んでおり、ＢＢＮ単独（即ち、Ｋｄ＜２５ｎＭ）よりも良好なまたは同様の結合親和性でもってＧＲＰ受容体に特異的に結合する特異的なアミノ酸置換を有している。適当な化合物としては、ペプチド、ペプチド模擬物および類縁体およびその誘導体が挙げられる。ＢＢＮ−１４におけるＬ−メチオニン（Ｍｅｔ）の存在は、一般にアゴニストの特性をもたらす一方、ＢＢＮ−１４におけるこの残基の不在は、一般にアンタゴニストの特性をもたらす[Hoffken, 1994]。いくつかの有用なボンベシン類縁体は、本明細書の一部を構成する米国特許出願公開第２００３／０２２４９９８に記載されている。
結合親和性を減少させることなく行うことができるＢＢＮ（８−１４）結合領域における少数の選択的な数の具体的なアミノ酸置換（例えば、Ｌ−Ｇｌｙ11に対してＤ−Ａｌａ11またはＬ−Ｔｒｐ8に対してＤ−Ｔｒｐ8）が存在することは当分野で十分証明されている[Leban et al., 1994； Qin et al., 1994； Jensen et al., 1993]。さらに、ＢＢＮ−８位（即ち、Ｔｒｐ8残基）におけるＮ−末端アミン基へのいくつかのアミノ酸鎖または他の基の結合によって、ＢＢＮ類縁体のＧＲＰ受容体への結合親和性は劇的に減少し得る[Davis et al., 1992； Hoffken, 1994； Moody et al., 1996； Coy, et al., 1988； Cai et al., 1994]。少数の例では、結合親和性の減少なしにさらなるアミノ酸または化学的部分に結合することが可能である。
ＢＢＮ受容体ターゲティングペプチドの類縁体は、ＢＢＮよりも強いまたは同等の結合活性でもってＧＲＰ受容体をターゲティングする分子、突然変異タンパク質、レトロペプチドおよびレトロペプチドおよびレトロインバーソペプチドが含まれる。
当業者は、これら類縁体もまた、これらの修飾が本明細書に記載のペプチドの生物学的活性を負に改変しない限りにおいて１またはいくつかのアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加を含む修飾を含んでいてもよいということを認識する。これらの置換は、１以上のアミノ酸をこれらの同義のアミノ酸で置き換えることにより行うことができる。あるグループ内での同義のアミノ酸は、その分子の生物学的機能を保存するためにあるグループのメンバー間の置換を許容する十分な物理化学的特性を有するアミノ酸として定義する。
アミノ酸の欠失または挿入もまた、特定の配列の生物学的機能を改変しない限りにおいてこの配列に導入することができる。優先的に、このような挿入または欠失は、１、２、３、４または５アミノ酸に限定すべきであり、機能的なコンフォメーションにとって重要であるアミノ酸を除去または物理的に妨害または置き換えてはならない。本明細書に記載のＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドの突然変異タンパク質は、本明細書に開示されている配列に対し、１以上のアミノ酸の位置で置換、欠失または挿入が存在する配列相同性を有していてもよい。突然変異タンパク質は、本明細書に記載のペプチドの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは６０〜７０％、最も好ましくは８０〜９０％の生物学的活性を有していてもよい。但し、これらは、具体的に例示したペプチドよりも高い生物学的活性を有していてもよく、生物学的機能が例示したペプチドと同一である必要はない。
い。ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドの類縁体はまた、ペプチド骨格のアミド結合にチオアミド、メチレンアミンおよびＥ−オレフィンを含む変化を導入する模擬ペプチドまたは偽ペプチドを含んでいてもよい。さらに、ＧＲＰ、ＢＢＮまたはＮ−置換ヒドラジンカルボニル化合物によって置換されたアミノ酸を有するこれらのペプチド類縁体（アザアミノ酸としても知られている）の構造に基づくペプチドもまた本明細書において用いられる同義語に含まれる。
ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドは、選択されたキレート化剤に依存する様々な方法によって製造することができる。このペプチドは、一般的に、固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）等のペプチド合成の分野において一般的に確立されており知られている方法によって最も簡便に製造される。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、アミノ酸残基を、ポリスチレン等の不溶性の支持体またはマトリックスに結合させた伸張ペプチド鎖に段階的に添加する。まず、ペプチドのＣ末端残基を、アミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢｏＣ）またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦｍｏＣ）基等のＮ−保護剤で保護された市販の支持体に固定する。アミノ保護基を適当な脱保護剤（例えば、Ｂｏｃの場合はＴＦＡまたはＦｍｏｃの場合はピペリジン）で脱離し、次のアミノ酸残基（Ｎ−保護の形態）をＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）等のカップリン剤と共に加える。ペプチド結合が形成したら、試薬を支持体から洗い流す。最後の残基を添加した後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または水素フルオライド（ＨＦ）等の適当な試薬を用いてペプチドを支持体から切断する。
次いで、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドのＴｒｐ8残基の遊離アミノ基をリンカーの適当な官能基と反応させることによってリンカーをカップリングさせる。また、上記のキレート化剤の構造全体、リンカーおよびターゲティング部分を樹脂上で構築した後、トリフルオロ酢酸またはＨＦ等の適当な試薬の作用によって切断してもよい。
４．放射性医薬化合物の標識および投与
放射性医薬コンジュゲートへの金属の導入は、錯体化学の分野で一般的に知られている様々な方法により行うことができる。金属が造影診断に好ましい放射性核種99mＴｃである場合、以下の一般的手法を用いてテクネチウム複合体を形成する。ペプチド−キレート化剤コンジュゲート溶液を最初に、コンジュゲートを水、希釈した酸またはエタノール等のアルコールの水溶液中に溶解することにより形成する。次いで、溶液を適宜脱気して溶解している酸素を除去する。ペプチド中に−ＳＨ基が存在する場合は、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）等のチオール保護基、トリチルまたは他のチオール保護基を用いてチオールを酸化から保護してもよい。このチオール保護基を適当な試薬、例えば水酸化ナトリウムで脱離した後、酢酸（ｐＨ６．０−６．５）等の有機酸で中和する。あるいは、チオール保護基をテクネチウムキレート化の間にｉｎｓｉｔｕで脱離することができる。標識工程において、モリブデンジェネレーターから得られた過テクネチウム酸ナトリウムを、塩化スズ等の十分量の還元剤とともにコンジュゲートの溶液に加えてテクネチウムを還元し、室温にて静置するかまたは加熱する。標識したコンジュゲートを不純物99mＴｃＯ4-およびコロイド状の99mＴｃＯ2から、例えばＣ−１８ＳｅｐＰａｋカートリッジ[Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757]を用いたクロマトグラフィーにより、または当業者に知られている方法を用いるHPLCにより分離することができる。
別法では、標識をトランスキレート反応により行うことができる。この方法では、テクネチウム源は、選択したキレート化剤との反応の前に還元して不安定なリガンドと複合体を形成させ、それにより選択したキレート化剤によりリガンド交換が促進される、テクネチウムの溶液である。トランスキレーションに適当なリガンドの例としては、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩およびヘプタグルコン酸塩が挙げられる。コンジュゲートを上記の技術を用いて標識するかまたは、キレート化剤そのものを標識した後、ペプチドとカップリングさせてコンジュゲートを形成する（「前標識キレート（prelabeled chelate）」法と称する方法）ことができる。ＲｅおよびＴｃはいずれも周期表のＶＩＩＢ族であり、これらは化学的に同類である。従って、大部分については、高いインビトロおよびインビボ安定性を示す、これら２種類の金属とリガンド骨格との錯体化学は同じであり［Eckelman, 1995]、同様のキレート化剤および手法を用いてＲｅで標識することができる。ペプチドやタンパク質と安定な放射性金属複合体を形成するために用いられる多くの99mＴｃまたは186／188Ｒｅ複合体は、＋５酸化状態のこれらの金属と錯体を形成する［Lister-James et al., 1997]。この酸化状態は、様々な99mＴｃ（Ｖ）および／または186／188Ｒｅ（Ｖ）の弱いキレート（例えば、99mＴｃ−グルコヘプタン酸、クエン酸塩、グルコン酸塩など）[Eckelman, 1995； Lister-James et al., 1997； Pollak et al., 1996]から構成された、生体分子と既にコンジュゲートを形成したリガンド骨格に99mＴｃまたは186／188Ｒｅを選択的に配置することを可能にする。
５．診断的および治療的使用
診断的および／または治療的に有用な金属または光標識で標識する場合、本発明の化合物を用いてＧＲＰ受容体（またはＮＭＢ受容体）の過剰発現に関与するいずれかの病状を、放射線診断、放射線治療および光学造影の分野で確立されている手順によって治療および／または検出することができる［例えば、Bushbaum, 1995； Fischman et al., 1993； SchubＩｇＥr et al., 1996； Lowbertz et al., 1994； Krenning et al., 1994；光学色素の例としては、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９５、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９６／１７６２８、ＷＯ９７／１８８４１、ＷＯ９６／２３５２４、ＷＯ９８／４７５３８およびそれらにおいて引用された文献に記載されているものが挙げられるがこれに限定されない]。
ＧＲＰ−Ｒ発現は、様々なヒトの腫瘍において高度に情報調節される。例えば、ＷＯ９９／６２５６３を参照。従って、本発明の化合物は、前立腺癌（原発性および転移性）、乳癌（原発性および転移性）、結腸癌、胃癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ガストリノーマ、メラノーマ、グリア芽腫、神経芽細胞腫、子宮平滑筋肉腫腫瘍、前立腺上皮内腫瘍形成［ＰＩＮ］および卵巣癌を含む癌の処置および診断において広範囲に有用であり得る。さらに、本発明の化合物は、ＧＲＰ受容体がアップレギュレートされる条件とそうでない条件を区別するのに有用であり得る（例えば、慢性膵炎および膵管癌それぞれ）。
本発明の化合物は、実施例でより詳細に説明するように、本明細書において開示する新規のリンカーを有しない化合物よりもインビボで腫瘍における高い取込、およびＧＲＰ受容体を発現している腫瘍をターゲティングして、これら組織を造影するまたはこれら組織へ放射線治療を送達するための改善された能力を示す。実際、実施例において示されているように、本発明の化合物を用いる放射線治療はより効果的である（および生存期間が延びる）。
これら化合物は、シンチグラフィー、光学的、音ルミネセンスまたは光音響によるイメージングを用いる新生物細胞の存在についての第一の診断用スクリーニングとして、放射免疫誘導外科手術（ＲＩＧＳ）の分野における携帯型放射線検出器を用いる新生物組織を治療するための物質として、マッチドペア放射線治療化合物の投与の前に線量データを得るための手段として、および一定期間の処置の関数としてのＧＲＰ受容体集団を調べる手段として、診断用に適用することができる。
これら化合物の治療的適用は、癌の処置における第一の利用として用いる物質として、これらの物質がアジュバント化学療法と組み合わせて利用することができる場合は組み合わせ治療として、および／またはマッチドペア治療物質として定義することができる。マッチドペアの概念は、適当な錯体に対する結合について選択された放射性金属に依存して、診断物質および治療物質の両方として作用することができる単一の非金属化化合物を意味する。キレート化剤が所望の金属に適合することができない場合、診断用化合物のインビボでの挙動を用いて放射線治療化合物の挙動を予測できるように薬理学を維持しながら異なる金属に適合するように適当な置換を行うことができる。アジュバント化学療法と組み合わせて利用する場合、例えば、抗新生物薬、例えば白金化合物（例えば、スピロプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン）、メトトレキセート、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサミトシン、ブレオマイシン、シトシン、アラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブチル、メルファラン（例えば、ＰＡＭ、ａ、Ｌ−ＰＡＭまたはフェニルアラニンマスタード）、メルカプトプリン、ミトタン．塩酸プロカルバジン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、塩酸ダウノルブシン、ドキソルビシンハイドロクロライド、タキソール、マイトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸塩ナトリウム、フルタミド、酢酸リュープロレリン、酢酸メゲストロール、タモキシフェンクエン酸塩、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼ）Ｅｒｗｉｎａａｐａｒａｇｉｎａｓｅ、エトポシド−（ＶＰ−１６）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、テニポシド（ＶＭ−２６）、硫酸ビンブラスチン（ＶＬＢ）、およびアラビノシルを含む、任意の適当な化学療法を用いることができる。ある態様では、治療物質はメラノーマ抗原に結合することが可能なモノクローナル抗体であってよい。
99mＴｃ等の放射性核種金属で標識されたコンジュゲートは、製薬的に許容し得る担体および／または等張食塩水のような塩溶液中での静脈内、皮下または腹腔内注射により、ヒトの患者または対象を含む哺乳類に投与することができる。本発明によって提供される放射性標識したシンチグラフィー造影剤は、適当な量の放射能を有する。99mＴｃ放射性複合体の形成では、一般に、約０．０１ミリキュリー（ｍＣｉ）〜１００ｍＣｉ／ｍＬの濃度の放射能を含む溶液中の放射性複合体が好ましい。一般に、投与する単位投与剤型は、約０．０１ｍＣｉ〜約１００ｍＣｉ、好ましくは１ｍＣｉ〜３０ｍＣｉの放射能を有する。単位用量で注射される溶液は約０．０１ｍＬ〜約１０ｍＬである。投与に適当な標識されたコンジュゲートの量は、選択されたコンジュゲートの分布プロファイルに依存する。急速に排出されるコンジュゲートは、それほど急速に排出されないコンジュゲートよりも高い用量で投与する必要があるかもしれない。インビボの分布および局在は、投与後適当な時点で標準のシンチレーション技術によって追跡することができる：典型的には、非標的組織での排出速度に対する標的部位での蓄積の速度に応じて３０分〜１８０分の間。例えば、診断用放射性核種で標識された本発明の化合物を患者に注射した後、造影剤に取り込まれた核種のガンマ線エネルギーについて校正されたガンマカメラを用いて造影剤を取り込んだ領域を造影し、その部位に存在スル放射能の量を定量する。インビボで部位の造影は数分以内に起こる。但し、所望であれば、放射能標識したペプチドを患者に投与してから、１時間またはそれ以上後に造影を起こすこともできる。最も好ましい場合において、投与量の十分な量が、約０．１時間以内に造影される部位に蓄積し、シンチフォトを撮影することが可能である。
本発明の化合物は、単独でまたは賦形剤、希釈剤、ラジカルスカベンジャー、安定化剤、および担体等の当分野で周知の他の成分を含有する組成物の一部として患者に投与することができる。本化合物は、静脈内かまたは非経口で患者に投与することができる。
本発明には多くの利点がある。本発明にしたがって製造される化合物は、安定な、十分に規定された99mＴｃまたは186／188Ｒｅ標識化合物を形成する。同様の本発明の化合物もまた、それぞれの放射性金属についての適当なキレート化剤の構成を用いて、153Ｓｍ、90Ｙ、166Ｈｏ、105Ｒｈ、199Ａｕ、149Ｐｍ、177Ｌｕ、111Ｉｎまたは他の放射性金属で標識された、安定な、十分に規定された生成物を形成することができる。放射性標識されたＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドは、ＧＲＰ受容体を発現する新生物細胞に選択的に結合し、アゴニストを用いる場合は、内在化し、長期間腫瘍細胞内に保持される。癌細胞に到達しない（即ち、結合しない）放射性物質は、腎臓内での放射性金属の最小限の蓄積でもって効率的に尿中に優先的に排出される。
６．光学イメージング、音ルミネッセンス、光音響イメージングおよび光治療
本発明によれば、多くの光学パラメータを用いてインビボの光イメージングを用い、患者に光学的に標識された本発明の化合物を注射した後、標的が存在する位置を決定することができる。画像の調製において検出される光学的パラメーターとしては、透過電磁波、吸収、蛍光またはリン発光、光反射、吸収振幅または最大吸収の変化および弾性散乱放射が挙げられる。例えば、生物学的組織は、６５０−１０００ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）波長の領域の光を比較的透過する。ＮＩＲ放射は数センチまでの組織を貫通することができ、本発明の化合物を使用して標的を含む組織をインビボでイメージングすることができる。臨床現場での可視および近赤外領域（ＮＩＲ）の光の使用は急速に伸びている。電磁気的スペクトルの可視、ＮＩＲまたは長い波長（ＵＶ−Ａ、＞３５０ｎｍ）領域で吸収または発光する化合物は、光学断層イメージング、内視鏡を用いた画像技術、光治療に非常に有用である。
生物医学的光学の主要な利点はその治療上の可能性にある。光治療は、外面および内面両方の様々な表面の病巣の処置に対する安全で有効な手法であることが証明されている。色素は、シグナル検出および／または光学イメージングおよび光治療における組織の感光性を増大させるために重要である。これまでの研究は、ある特定の色素が腫瘍内に局在し得、小さな癌の検出および処置のための有力なプローブとして役立つということを証明している（D. A. Bellnier et al., Murine pharmacokinetics and antitumor efficacy of the photodynamic sensitizer 2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinyl pyropheophorbide-a, J. Photochem. Photobiol., 1993, 20, pp. 55-61; G. A. Wagnieres et al., In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications, Photochem. Photobiol., 1998, 68, pp. 603-632; J. S. Reynolds et al., Imaging of spontaneous canine mammary tumors using fluorescent contrast agents, Photochem. Photobiol., 1999, 70, pp. 87-94）。しかし、これらの色素は、悪性の組織に選択的に局在するわけではない。
例示的な態様では、本発明の化合物は、広範囲に非局在化した環系を有し４００−１５００ｎｍの範囲で最大の吸収または発光を有する、有機発色団または蛍光を含む光学色素等の光標識とコンジュゲートすることができる。また、本発明の化合物は、生物発光分子で誘導体化されていてもよい。ヘモグロビンからのシグナルによる干渉を最小限にするために、光標識の最大吸収の好ましい範囲は６００〜１０００ｎｍの間である。好ましくは、光吸収標識は大きなモル吸光係数、例えば＞１０5ｃｍ-1Ｍ-1を有するが、蛍光光学色素は、高い量子収率を有するであろう。光学色素の例としては、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９５、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９６／１７６２８、ＷＯ９７／１８８４１、ＷＯ９６／２３５２４、ＷＯ９８／４７５３８,およびそれらにおいて引用されている文献に記載されているものが挙げられるがこれに限定されない。例えば、例えば、ＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドおよび本発明のリンカーから構成される化合物のように、光標識を本発明の化合物に直接共有結合させることができる。電磁気スペクトルの可視および近赤外領域で吸収および発光するいくつかの色素は、その生体適合性、高いモル吸光係数および／または高い蛍光量子収量のために様々な生物医学的適用に用いられている。造影剤としての色素に関連する光学的モダリティの高い感受性は、核医学の感受性に匹敵し、電離放射線の望ましくない効果を有することなく、器官や組織の可視化を可能にする。近赤外領域（ＮＩＲ）で強い吸収および発光を有するシアニン色素は、生物学的組織がこの領域において光学的に透明なので特に有用である(B. C. Wilson, Optical properties of tissues. Encyclopedia of Human Biology, 1991, 5, 587-597).例えば、 ＮＩＲ領域で吸収および発光するインドシアニングリーンは、心拍出量、肝臓機能および肝臓血流をモニターするために使用されており（Y-L. He, H. Tanigami, H. Ueyama, T. Mashimo, and I. Yoshiya, Measurement of blood volume using indocyanine green measured with pulse-spectrometry: Its reproducibility and reliability. Critical Care Medicine, 1998, 26(8), 1446-1451; J. Caesar, S. Shaldon, L. Chiandussi, et al., The use of Indocyanine green in the measurement of hepatic blood flow and as a test of hepatic function. Clin. Sci. 1961, 21, 43-57）、その官能化誘導体は、診断の目的で生物分子にコンジュゲートするために用いられている。R. B. Mujumdar, L. A. Ernst, S. R. Mujumdar, et al., Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry, 1993, 4(2), 105-111; Linda G. Lee and Sam L. Woo. "N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescent labels", U.S. Pat. No. 5,453,505; Eric Hohenschuh, et al. "Light imaging contrast agents", WO 98/48846; Jonathan Turner, et al. "Optical diagnostic agents for the diagnosis of neurodegenerative diseases by means of near infra-red radiation", WO 98/22146; Kai Licha, et al. "In-vivo diagnostic process by near infrared radiation", WO 96/17628; Robert A. Snow, et al., Compounds, WO 98/48838。
光学的に標識された化合物を注射した後、患者を、その物質に用いた光標識の適当な波長範囲の１以上の光源でスキャンする（例えば、レーザー）。用いる光は、単色でも多色でもよく、連続的でもパルスでもよい。透過、散乱または反射光を、１または複数の波長に調整した光検出器により検出して、患者における標的を含む組織の存在位置を決定する（例えば、ＧＲＰを含む組織）。光学的パラメーターの変化を所定の時間モニターして標的部位での光学的に標識された試薬の蓄積を検出することができる（例えば、腫瘍またはＧＲＰ受容体を有する他の部位）。標準的なイメージングプロセシングおよび検出機器を本発明の光学イメージング試薬と組み合わせて用いることができる。
上記の光学イメージング剤はまた、光学的に標識されたイメージング剤により行われる音響光学または音響ルミネセンスイメージングに用いることもできる（米国特許第５,１７１,２９８号、ＷＯ９８／５７６６６、およびそれらにおいて引用されている文献を参照）。音響光学イメージングにおいては、超音波を対象に照射し、透過光、発光または反射光の光学的パラメーターに影響を与える。音響ルミネセンスイメージングでは、適用した超音波は実際に検出される光を生じる。そのような技術を用いる適当なイメージング方法は、ＷＯ９８／５７６６６に記載されている。
様々なイメージング技術および試薬は、米国特許第６,６６３,８４７号、同第６,６５６,４５１号、同第６,６４１,７９８号、同第６,４８５,７０４号、同第６,４２３,５４７号、同第６,３９５,２５７号、同第６,２８０,７０３号、同第６,２７７,８４１号、同第６,２６４,９２０号、同第６,２６４,９１９号、同第６,２２８,３４４号、同第６,２１７,８４８号、同第６,１９０,６４１号、同第６,１８３,７２６号、同第６,１８０,０８７号、同第６,１８０,０８６号、同第６,１８０,０８５号、同第６,０１３,２４３,および公開された米国特許出願第２００３１８５７５６号、同第２００３１６５６４３２号、同第２００３１５８１２７号、同第２００３１５２５７７号、同第２００３１４３１５９号、同第２００３１０５３００号、同第２００３１０５２９９号、同第２００３０７２７６３号、同第２００３０３６５３８号、同第２００３０３１６２７号、同第２００３０１７１６４号、同第２００２１６９１０７号、同第２００２１６４２８７,および２００２１５６１１７に記載されている。
７．放射線治療
ラジオアイソトープ治療は、標的となる組織に損傷を与えるまたは破壊するのに十分な量の放射能標識した化合物の投与するものである。その化合物を投与（例えば、静脈内、皮下または腹腔内注射によって）した後、放射能標識した医薬が疾患を有する部位に選択的に存在する（この場合は、ＧＲＰ受容体を発現する腫瘍組織または他の組織）。存在したら、その放射能標識された化合物は、投与した放射性同位体の放射能減衰の間に放出されるエネルギーにより疾患を有する組織に損傷を与えるかまたは破壊する。上記のとおり、本発明はさらに、アジュバント化学療法と組み合わせた（または他のいずれかの適当な治療剤を組み合わせた）放射線治療の使用を包含する。
成功する放射線治療の設計にはいくつかの重要な因子が存在する：
１．疾患を有する部位に放射能を送達するための適当なターゲティングする基の選択；
２．近隣の正常な組織に実質的な損傷を与えることなく、疾患を有する部位に損傷を与えるのに十分なエネルギーを放出する適当な放射性核種の選択；
３．疾患を有する部位にコンジュゲートを存在させる能力に悪影響を及ぼすことのない、ターゲティングする基と放射性核種の適当な組み合わせの選択。
放射性金属については、しばしば、キレートをターゲティングする基にカップリングするリンカーを組み合わせた放射性核種に強固に配位し、化合物の全体の生体分布に影響を与えて標的組織における取込を最大にし、正常な非標的器官における取込を最小限にする、キレート化基を有する。
本発明は、放射性核種、金属錯体およびリンカーの適切な選択によって上記３つの基準の全てを満足する放射線治療薬を提供する。
放射線治療薬は、ランタニド（元素番号５７〜７１の元素）として知られているクラスの元素に由来するキレート化された３＋金属イオンおよびそれらの類縁体（即ち、イットリウムおよびインジウム等のＭ3+金属）を含むことができる。このクラスにおける典型的な放射性金属としては、同位元素９０−イットリウム、１１１−インジウム、１４９−プロメチウム、１５３−サマリウム、１６６−ジスプロシウム、１６６−ホルミウム、１７５−イッテルビウム、および１７７−ルテチウムが挙げられる。これら金属のすべて（およびその他のランタニド）は、＋３の酸化状態で存在する点において非常に類似した特性を有しており、周知のキレートＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）およびＤＯＴＡ（１,４,７,１０−テトラザシクロドデカン−Ｎ,Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’’−テトラ酢酸等の大環状ポリアザ−ポリカルボキシレートの誘導体やそれに近い類縁体が典型的であるように、硬いドナー（酸素／窒素）原子（「hard donor atom」）を有するリガンドと錯体を形成することが好ましい。これらキレートリガンドの構造を、それらの完全に脱プロトン化された形態で以下に示す。
Figure 0004836455
これらのキレートリガンドは、複数の窒素および酸素原子を介して放射性金属に結合することにより放射性金属を包み込み、フリーの（結合していない）放射性金属が体内へ放出するのを防ぐ。インビボでの３+放射性金属のこれらのキレートからの解離は、肝臓、骨、膵臓における放射性金属の取込を生じうるので、この点は重要である[Brechbiel MW, Gansow OA, “Backbone-substituted DTPA ligands for 90Y radioimmunotherapy”, Bioconj. Chem. 1991; 2: 187-194; Li, WP, Ma DS, Higginbotham C, Hoffman T, Ketring AR, Cutler CS, Jurisson, SS, " Development of an in vitro model for assessing the in vivo stability of lanthanide chelates." Nucl. Med. Biol. 2001; 28(2): 145-154; Kasokat T, Urich K. Arzneim.-Forsch, “Quantification of dechelation of gadopentetate dimeglumine in rats”. 1992; 42(6): 869-76]。これら器官が特異的にターゲティングされていなければ、ターゲティングしていない組織の非特異的な照射につながり、骨髄の照射に起因する造血の抑制のような問題につながりうるので、そのような非特異的な取込は非常に望ましくない。
放射線治療の適用のために、本明細書において開示した治療用放射性核種の任意のキレート化剤を用いることができる。しかし、DOTAキレートの形態[Tweedle MF, Gaughan GT, Hagan JT, “1-Substituted-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane and analogs.” US Patent 4,885,363, Dec. 5, 1989]は、ＤＴＰＡまたは他の直鎖状のキレートよりも体内であまり脱キレート化されないと予想されるので、特に好ましい。
ＤＯＴＡ−型の巨大分子をリンカーを介してターゲティングする基にカップリングするための一般的方法（例えば、ＤＯＴＡのカルボキシレートの１つの活性化して活性なエステルを形成し、リンカーのアミノ基と反応させて安定なアミド結合を形成することにより）は、当業者に知られている（例えば、Tweedle et al. US Patent 4,885,363を参照)。カップリングはまた、ポリアザ環の骨格上で修飾されたDOTA型の巨大分子に対しても行うことができる。
特定の放射線治療の適用に使用する適当な核種の選択は以下を含む多くの因子に依存する：
ａ．物理的半減期−これは、放射性金属およびコンジュゲートから構成される放射線治療構築物の合成および精製と、注射の前の有意の放射能減衰なしに、注射部位への該構築物の送達が可能なように十分長いものでなければならない。好ましくは、放射性核種の物理的半減期は約０．５〜８日である。
ｂ．放射性核種からの放射のエネルギー−放射体（例えばアルファ線放射体、ベータ線放射体およびAuger電子放射体である放射性核種は、短い距離でエネルギーをため込む高エネルギーの粒子を放出し、それにより高度に局在化された損傷を与えるので特に有用である。これらの同位体からのベータ線照射体からのエネルギーは５〜約１５０細胞直径内でため込まれるので、ベータ線を発する放射性核種は特に好ましい。これらの核種から調製される放射線治療薬は、それらの存在部位に比較的近い疾患を有する細胞を死滅させることができるが、長い距離を移動して骨髄等の近くの正常な組織を破壊することはできない。
ｃ．比活性（即ち、放射性核種の質量あたりの放射能）−高い比活性を有する放射性核種（例えばジェネレーターで発生した９０−Ｙ、１１１−Ｉｎ、１７７−Ｌｕ）は特に好ましい。放射性核種の比活性は、その製造方法、それを製造するために用いる特定の標的、および問題となる同位体の特性によって決まる。
ランタニドおよびランタノイドの多くは、それらがベータ線を放射するとき、それらを放射線治療剤として使用するのに適当にする核特性を有するラジオアイソトープを含んでいる。これらのいくつかを以下の表に記載する：
Figure 0004836455
ベータ線を放射するランタニドラジオアイソトープ等の放射性金属の製造方法は当業者に知られており、広範に記載されている［例えばCutler C S, Smith CJ, Ehrhardt GJ.; Tyler TT, Jurisson SS, Deutsch E. “Current and potential therapeutic uses of lanthanide radioisotopes.” Cancer Biother. Radiopharm. 2000; 15(6): 531-545]。これら同位体の多くは、比較的低いコストで高収率で製造することができ、多く（例えば90−Ｙ、149-Ｐｍ、177-Ｌｕ）は無担体の比活性に近い活性で製造することができる（即ち、原子の圧倒的多数が放射性である）。非放射性の原子は、標的組織の受容体に対する結合について、それらの放射性類縁体と競合するので、できるだけ高い放射能用量を標的の組織に送達することを可能にするために高い比活性のラジオアイソトープの使用は重要である。
ベータ線を放射する、レニウム（186-Ｒｅおよび188-Ｒｅ）の同位体を含む本発明の放射線治療誘導体は特に好ましい。
８．用量および添加物
本発明の化合物のための適切な投与スケジュールは当業者に知られている。化合物を、単回または複数回の静脈内または腹腔内注射を含むがこれに限定されない多くの方法を用いて投与することができる。放射性医薬品については、イメージングを可能にするまたは、放射線治療の場合はＧＲＰ受容体を有する組織の損傷または除去を引き起こすのに十分な放射能の量を投与するが、実質的な損傷が非標的（正常組織）に対して引き起こされる程の量ではない。シンチグラフィーイメージングに必要な量および投与量は上に記載している。放射線治療に必要な量および投与量はまた、使用した同位体のエネルギーおよび半減期に依存して、取込の程度および体内からの試薬の排出および腫瘍の質量に応じて、異なる構築物で異なる。一般に、投与量は、１回用量で約３０〜５０ｍＣｉから蓄積線量で約３キュリーまでである。
本発明の組成物は、生理学的に許容し得る緩衝剤を含有し、注射の前に放射線による化合物への損傷を防止するために安定化剤が必要であることもある。放射線安定化剤は、当業者に知られており、例えば、パラ−アミノ安息香酸、アスコルビン酸、ジェンティシック酸などが挙げられる。
本発明の診断用または治療剤を製造するのに必要とされる全ての化合物を含む一回または複数回用のバイアルキットは、本発明の欠くことのできない部分である。放射性医薬品の場合、そのようなキットにはしばしば、放射性核種を除く全ての必要な成分が含まれている。
例えば、本発明の放射性医薬を調製するための１回用のバイアルキットには、好ましくは式Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇで示されるキレート化剤／リンカー／ターゲティングペプチドコンジュゲート、スズ塩源（還元が必要であれば、例えば、テクネチウムを用いる場合）、または他の製薬的に許容し得る還元剤を含有し、製薬的に許容し得る酸または塩基で適当に緩衝化され、約３〜約９のｐＨに調整されている。使用する還元剤の量および種類は、形成される交換複合体の性質に高度に依存する。適当な条件は当業者似よく知られている。キットの内容物が凍結乾燥された形態であることは好ましい。そのような１回用のバイアルキットは、場合によりグルコヘプタン酸塩、グルコン酸塩、マンニトール、リンゴ酸塩、クエン酸塩または酒石酸等の変化しやすいまたは交換リガンドを含み、またジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）等の反応修飾剤を含み、またはα、β、または、放射化学純度および最終化合物の安定性を改善するのに役立つγ−シクロデキストリンを含む。さらにキットは、凍結乾燥過程において助けとなるよう設計される安定化剤、マンニトール等の賦形剤および当業者に知られているその他の添加物を含んでいてもよい。
複数のバイアルキットは、好ましくは同一の成分化合物を含んでいるが、放射性医薬を再構成する際には１以上のバイアルを用いる。例えば、１つのバイアルは、過テクネチウム酸塩（例えばスズ源または他の還元剤）の添加により不安定なＴｃ（Ｖ）複合体を形成するために必要な全ての成分を含む。過テクネチウム塩をこのバイアルに加え、適当な時間待った後、このバイアルの内容物をキレート化剤およびターゲティングペプチド、並びにｐＨを最適値に調整するのに適当な干渉剤を含む別のバイアルに加える。約５〜６０分間反応させた後、本発明の複合体形成される。この複数バイアルキットのバイアルの内容物はいずれも凍結乾燥するのが有利である。上記のとおり、反応修飾剤、交換リガンド、安定化剤、賦形剤等は、一方または両方のバイアルに存在していてもよい。
化合物の一般的製造
本発明の化合物は、選択したキレート化剤に応じて様々な方法により製造することができる。本化合物のペプチド部分は、例えば、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法等のペプチド合成の分野において一般的に確立され知られている技術によって最も便利に製造することができる。固相合成に適しているので、ＦＭＯＣ保護と脱保護を交互に用いるのは短いペプチドを製造する好ましい方法である。組換えＤＮＡ技術もまたタンパク質およびその長い断片を製造するのに好ましい方法である。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、ポリスチレン等の不溶性の支持体またはマトリックスに結合させた伸張用ペプチド鎖にアミノ酸残基を段階的に付加していくものである。最初に、アミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢｏＣ）またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦｍｏＣ）基等のＮ−保護剤で保護したペプチドのＣ末端残基を、商業的に入手可能な支持体に固定する。アミノ保護基を、ＢＯＣの場合はＴＦＡ等の適当な脱保護剤で、Ｆｍｏｃの場合はピペリジンで脱離し、次のアミノ酸残基（Ｎ−保護された形態）を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等のカップリング剤により付加する。ペプチド結合が形成したら、試薬を支持体から洗浄する。最後の残基を加えた後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または水素フルオライド（ＨＦ）等の適当な試薬によりペプチドを支持体から切断する。
セグメントカップリングによる化合物の製造別法
本発明の化合物は、セグメントカップリングあるいはフラグメント縮合として当分野ＤＮＡ知られている製造方法によっても製造することができる（Barlos, K. and Gatos, D. ; 2002 “Convergent Peptide Synthesis” in Fmoc Solid Phase Synthesis A Practical Approach; Eds. Chan, W.C. and White, P.D.; Oxford University Press, New York; Chap. 9, pp 215-228)。この方法では、通常、側鎖が保護されている形態のペプチド断片を、溶液相合成または固相合成のいずれかまたはその２つの方法の組み合わせにより別々に調製する。断片の選択は重要であり、Ｃ末端残基とＮ末端残基がペプチド合成において最も正確にカップリングするように計画された、扱いやすい数の断片を生じることができるディビジョンストラテジー（division strategy）を用いて行うことができる。最良の断片のＣ末端はキラルのアルファ炭素を欠いている(グリシンまたはカップリング工程において活性化されるカルボキシル基に対してα炭素でアキラルな他の部分)かまたはアミノ酸はその活性化およびカップリングの間のそのラセミ化の傾向が可能な選択肢の中で最も低い。各断片のためのＮ末端アミノ酸の選択は、活性化されたアシル中間体とアミノ基とのカップリングのしやすさに基づく。ディビジョンストラテジーを選択したら、断片のそれぞれをカップリングする方法は、必要な中間体の合成の可能性および得られた生成物の取り扱いおよび精製（必要であれば）の相対的な容易さに基づいて選択する。次いで、断片をいずれも溶液中、または一方は固相で他方は溶液中で互いにカップリングして、完全にまたは部分的に保護された形態の最終構造を調製する。
次いで、保護されたターゲティング合物を保護基の脱離、精製および単離に付して最終の所望の化合物を得る。セグメントカップリング法の利点は、それぞれの断片を別々に精製することができ、不完全なカップリングから生じた欠失配列またはカップリング工程中の側鎖アミド脱水素化等の反応から誘導された副生成物等の副生成物、またはＦｍｏｃ基の脱保護中の側鎖の（Ｇｌｎの側鎖等）アルファアミノ基への内部環化の除去が可能であるという点である。そのような副生成物は、慣用の樹脂ベースの「直線状」ペプチド鎖アセンブリーのすべての最終生成物に存在し得るが、これら物質の除去は、必要であれば、セグメントカップリング法における多くの工程で行うことができる。セグメントカップリングの他の重要な利点は、異なる溶媒、試薬、および条件を適用して、断片のそれぞれの合成を高純度および高収率に最適化して最終生成物の改善された純度および収率をもたらすことができるということである。理解される他の利点は試薬の消費が減り、コストが低いということである。
実施例
以下の実施例は、様々な本発明の化合物を製造するために用いることができる様々な方法の例示として記載するものである。各実施例において単一の太字文字（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ）で表示される化合物は、図面においてこの文字で表示された同一の標識された対応化合物に対応している。
一般的実験手順
Ａ．使用する略語の定義
以下の共通の略語を本明細書において用いる：
１,１−ジメチルエトキシカルボニル（ＢｏｃまたはＢｏＣ）；
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦｍｏＣ）；
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）；
Ｎ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）；
Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）；
無水酢酸（Ａｃ2Ｏ）；
（４,４−ジメチル−２,６−ジオキソシクロヘキサン−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖ−Ｄｄｅ）；
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；
試薬Ｂ（ＴＦＡ：Ｈ2Ｏ：フェノール：トリイソプロピルシラン、８８：５：５：２）；
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）；
Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルウロニウム；
ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）；
Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム；
ヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）；
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）；
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；
ジクロロメタン（ＤＣＭ）；
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；
ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）；
１,４,７,１０−テトラアザシクロテトラデカン−１,４,７,１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）；
トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）；
１,４,７,１０−テトラアザシクロテトラデカン−１,４,７,１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）；
（１Ｒ）−１−［１,４,７,１０−テトラアザ−４,７,１０−トリス（カルボキシメチル）シクロドデシル］；
エタン−１,２−ジカルボン酸（ＣＭＤＯＴＡ）；
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；
ヒト前立腺癌細胞系（ＰＣ３）；
イソブチルクロロホルメート（ＩＢＣＦ）；
トリブチルアミン（ＴＢＡ）；
放射化学的純度（ＲＣＰ）；および
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）。
Ｂ．材料
用いたFmoc-保護アミノ酸は、Nova-Biochem (San Diego, CA, USA), Advanced Chem Tech (Louisville, KY., USA), Chem-Impex International (Wood Dale Ill., USA),およびMultiple Peptide Systems (San Diego, CA., USA)から購入した。合成に必要な他の化学物質、試薬および吸着剤は、Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA)およびVWR Scientific Products (Bridgeport, NJ., USA)から購入した。ペプチド合成のための溶媒は、Pharmco Co. (Brookfield CT., USA)から入手した。HPLC解析および精製のためのカラムはWaters Co. (Milford, MA., USA)から入手した。商業的に入手できないものについては実験の詳細を以下に記載する。
Ｃ．ペプチド合成のための器具
Advanced ChemTech 496ΩMOSシンセサイザー、Advanced ChemTech 357 FBS シンセサイザー および／または手動によるペプチド合成を用いてペプチドを製造した。但し、用いた反復脱保護および鎖伸張のプロトコルは全て同じである。
Ｄ．Symphony装置 (Rainin製)を用いた自動化された合成
Protein Technologies Inc. より提供されたSymphony Version 3を用いて合成を行った。Novagel TGR 樹脂（0.25 mmol/gの置換）を用い、各ウェルに０．２ｇの樹脂（５０μｍｏｌ）を加えた。アミノ酸をＮＭＰに溶解し、濃度を０．２５Ｍにした。ＨＢＴＵおよびＮ−メチルモルホリンの０．２５ＭＤＭＦ溶液を調製し、カップリングに用いた。カップリングはすべて２時間行った。樹脂を別の反応容器に移し、手動の合成のように試薬Ｂを用いることにより、開裂を機械の外で行った。
Ｅ．分析および精製に用いた器具
分析ＨＰＬＣは島津−ＬＣ−１０Ａデュアルポンプグラジェント分析ＬＣシステムを用いて行い、システムのコントロール、データの取得および操作後の処理に島津-ClassVP ソフトウェアversion 4.1を利用した。質量スペクトルは、Hewlett-Packard Series 1100デュアルポンプグラジェントＨＰＬＣシステムと連動させたHewlett-Packard Series 1100 MSD 質量分析計により入手し、Agilent Technologies 1100シリーズオートサンプラーを取り付け、ダイレクトフローインジェクションまたはWaters Associates XTerra MS C18 カラム (４．６ｍｍｘ５０ｍｍ、５μ粒子、孔径１２０Å)へのインジェクションに適合させた。この装置はHP Kayak ワークステーションにより動作させ、サンプルの添加に‘MSD Anyone’ソフトウェアおよび装置のコントロールおよびデータ入手にHP Chemstation ソフトウェアを用いた。多くの場合は、試料を濃度１ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液５μＬをダイレクトインジェクションにより加え、陽イオン電子スプレーを用いて解析し、構造の確認のためにｍ／ｅおよびｍ／ｚ（多価）イオンを得た。1H-NMRスペクトルをVarian Innova 分光計（500 MHz）により入手した。13C-NMRスペクトルは、同じ装置を用い125.73 MHzにて得た。一般に、用いた溶媒の残りの1H吸収、または13C-NMRの場合は13C 吸収を内部参照として用いた； その他の場合はテトラメチルシラン (μ＝0.00 ppm)を用いた。共鳴値はμ単位で表示した。マイクロ分析のデータは、Quantitative Technologies Inc. Whitehouse NJから得た。調製用ＨＰＬＣは、島津-LC-8Aデュアルポンプグラジェント調製用ＨＰＬＣシステムを用いて行い、システムのコントロール、データの取得および操作後の処理に島津-ClassVP ソフトウェアversion 4.3を利用した。
Ｆ．ペプチド合成の一般的手順
Rink アミド-Novagel HL樹脂(0.6 mmol/g)を固体の支持体として用いた。
Ｇ．カップリング手順
典型的な実験では、最初のアミノ酸０．１ｇを樹脂に加えた (0.06 mmol)。NMP中の適当なFmoc-アミノ酸の溶液(0.25M溶液； 0.960 mL、次いで、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール (0.5M（NMP中）；0.48 mL) を樹脂に加えた)および反応ブロック(自動化されたペプチド合成の場合)または個々の反応容器(手動のペプチド合成の場合)を約2 分間振盪した。上記の混合物に、ジイソプロピルカルボジイミド (NMP中0.5M； 0.48 mL)を加え、反応混合物を室温で４時間振盪した。次いで、乾燥窒素の陽圧を適用することにより反応ブロックまたは個々の反応容器から反応物を取り出した。
Ｈ．洗浄手順
反応ブロックの各ウェルに1.2 ｍLのNMPを加え、ブロックを5 分間振盪した。窒素の陽圧下で溶液を排出した。この手順を３回繰り返した。個々の容器を用いる手動の合成の場合は、適当な体積のＮＭＰを用いて同じ手順を行った。
Ｉ．Ｆｍｏｃ基の脱離
Fmoc保護されたアミノ酸を含有する樹脂を、1.5 ｍLの20％ ピペリジンのDMF (v/v)溶液で処理し、反応ブロックまたは個々の手動の合成容器を15 分間振盪した。この溶液を樹脂から排出させた。この手順をさらに１回繰り返し、上記の洗浄手順を用いて樹脂を洗浄した。
Ｊ．リガンド（ＤＯＴＡおよびＣＭＤＯＴＡ）の最終カップリング
樹脂に結合したペプチドリンカー構築物のＮ末端アミノ基を脱保護し、樹脂を洗浄した。NMP中の所望のリガンドおよびHBTUの0.25M溶液を調製し、２倍当量のDIEAで処理した。活性化されたリガンドの得られた溶液を樹脂に加え(1.972 mL； 0.48 mmol)および反応混合物を常温で2４〜３０時間振盪した。この溶液を排出し、樹脂を洗浄した。この樹脂の最後の洗浄は、1.5mLジクロロメタン (3X)で行った。
Ｋ．最終ペプチドの脱保護および精製
試薬Ｂの溶液(2 mL； 88:5:5:2−ＴＦＡ:フェノール:水:TIPS)を樹脂に加え、反応ブロックまたは個々の容器を常温で４．５時間振盪した。脱保護されたペプチドを含有する得られた溶液をバイアルに排出した。１ｍLの試薬Ｂを用いてこの手順をさらに２回繰り返した。集めた濾液をGenevac HT-12シリーズII遠心濃縮機を用いて減圧下で濃縮した。次いで、各容器の残留物を2 ｍLのＥt2Oでトリチュレーションし、上清は捨てた。この手順を２回繰り返してペプチドを無色の固体として得た。粗製のペプチドを水/アセトニトリルに溶解し、Waters XTerra MS C18 調製用ＨＰＬＣ カラム (50 mm x 19 mm, 粒子サイズ5ミクロン、孔径120Å)またはWater s-YMC C18 ODS カラム (250 mm x 30 mm i.d., 粒子サイズ10ミクロン、孔径120Å)を用いて精製した。生成物を有する画分を集め、HPLCにより解析した。95％を超える純度の画分をプールし、凍結乾燥によりペプチドを単離した。
調製用ＨＰＬＣ (Waters XTerra カラム)の条件:
溶出速度: 50 mL／分
検出: UV, λ＝220 nm
溶出液Ａ: 0.1％ 当量ＴＦＡ； 溶媒Ｂ: アセトニトリル (0.1％ ＴＦＡ)
ＨＰＬＣ解析の条件
カラム: Waters XTerra (Waters Co..； 4.6 x 50 mm； MS C18；粒子サイズ5ミクロン、孔径120Å)
溶出速度: 3 mL／分； 検出: UV, λ = 220 nm.
溶出液Ａ:0.1％ 当量ＴＦＡ； 溶媒Ｂ: アセトニトリル (0.1％ ＴＦＡ)。
実施例Ｉ−図1A-B
L62の合成
概要：図1A-Bに示すとおり、以下の工程を用いてL62を製造した： (3β,5β)-３−アミノコラン-2４−酸メチルエステル AをNaOHで加水分解して対応の酸Ｂを得た後、これをFmoc-Clと反応させて中間体 Cを得た。オクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1])で官能化したRink アミド樹脂をC, Fmoc-グリシンおよびDOTA トリ−ｔ−ブチルエステルと順次に反応させた。試薬Ｂで開裂、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL62を得た。全体の収率2.5％。さらなる詳細を以下に記載する。
Ａ．ボンベシン［７−１４］で官能化したＲｉｎｋアミド樹脂（Ａ）
固相ペプチド合成容器 (see enclosure No. 1)内で、Fmoc-アミノ酸 (24 mmol)、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt) (3.67 g； 24 mmol),およびN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド (DIＣ） (3.75 mL； 24 mmol) を、ＤＭＦ(45ｍL）中のRink アミド NovaGelTM 樹脂 (10 g； 6.0 mmol) Aの懸濁液に順次に加えた。混合物をベンチトップシェーカーを用いて室温にて３時間振盪した後、溶液を除去し、樹脂をDMF (5 x 45ｍL）で洗浄した。樹脂をDMF (45 mL)中の25％ピペリジン で４時間振盪した。溶液を除去し、新しいDMF 中の25％ ピペリジン(45 mL)を加えた。懸濁液を10分間振盪した後、溶液を除去し、樹脂をDMF (5 x 45ｍL）で洗浄した。この手順を以下のアミノ酸に対して順次に用いた: N-α-Fmoc-L-メチオニン、Ｎ−α-Fmoc-L-ロイシン、Ｎ−α-Fmoc- N-im-トリチル-L-ヒスチジン、Ｎ−α-Fmoc-グリシン、Ｎ−α-Fmoc-L-バリン、Ｎ−α-Fmoc-L-アラニン、Ｎ−α-Fmoc- N-i n-Boc-L-トリプトファン。最後のカップリング反応では、N-α-Fmoc- N-γ-トリチル-L-glutアミン (14.6 g； 24 mmol)、ＨＯＢＴ (3.67 g； 24 mmol),およびDIC (3.75 mL； 24 mmol）をDMF (45ｍL）中の樹脂に加えた。混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMF (5 x 45 mL), ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 45 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。
Ｂ．中間体ＢおよびＣの製造（図１Ａ）：
1. (3β,5β)-３−アミノコラン-2４−酸(B)の合成
NaOHの１Ｍ溶液(16.6 mL； 16.6 mmol)を、MeOH (65 mL)中の(3β,5β)-３−アミノコラン-2４−酸メチルエステル (5.0 g； 12.8 mmol) の45 ℃の溶液に滴加した。45℃で３時間攪拌した後、混合物を濃縮して25 mLにし、H2O (40 mL)および1 M HCl (22 mL)を加えた。沈殿した固体を沈殿した固体を濾過し、H2O (2 x 50 mL)で洗浄し、減圧乾燥してＢを白色の固体 (5.0 g； 13.3 mmol)として得た。収率80％。
2. (3β,5β)-３−(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノコラン-2４−酸(Ｃ）の合成
１,４−ジオキサン (9 mL)中の９−フルオレニルメトキシカルボニル クロリド (0.76 g； 2.93 mmol) の溶液を、０℃で攪拌した10％Ｎa2CO3水溶液 (16 mL)および１,４−ジオキサン (9 mL)中の (3β,5β)-３−アミノコラン-2４−酸Ｂ (1.0 g； 2.66 mmol)の懸濁液に滴加した。室温にて６時間攪拌した後、H2O (90 mL)を加え、水相をＥt2O (2 x 90 mL)で洗浄した後、2 M HCl (15 mL)を加えた(最終のpH: 1.5)。水相をEtＯＡc (2 x 100 mL)で抽出し、有機相をＮa2ＳＯ4で乾燥し、留去した。組成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製してＣを白色の固体として得た(1.2 g； 2.0 mmol)。収率69％。
Ｃ．Ｌ６２（Ｎ−［（３β,５β）−３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ] アセチル]アミノ]-コラン-2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)の合成(図1B)：
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ(7 mL)中の新しい50％モルホリン溶液を加えた。この懸濁液を２０分間振盪した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した(5 x 7ｍL）。(3β,5β)-３−(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノコラン-2４−酸C (0.72 g； 1.2 mmol)、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBT) (0.18 g； 1.2 mmol), N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド (DIＣ） (0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した (5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した(5 x 7ｍL）。N-α-Fmoc-グリシン (0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した (5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した(5 x 7 mL)後、NaClとの1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をＮaＣl(0.79 g； 1.2 mmol)、HOBT (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ(5 x 7 mL), ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL) で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内で４．５時間振盪した (25 mL)。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL) でトリチュレーションして沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄した後、ＨＰＬＣにより解析し、調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥してL62 (6.6 mg； 3.8 x 10-3 mmol)を白色の固体として得た。収率4.5％。
実施例II-図2A-F
L70, L73, L74, L115およびL116の合成
概要：生成物は、Rink アミド 樹脂上でオクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1])（適当な側鎖保護を行う）を種々のリンカーとカップリングした後、DOTA トリ−ｔ−ブチルエステルで官能化することにより得た。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、最終生成物を調製用ＨＰＬＣにより精製した。全体の収率３〜9％。
Ａ．L70の合成 (図2A):
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した(5 x 7ｍL）。Fmoc-４−アミノ安息香酸 (0.43 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL)をこの樹脂に加え、混合物を３時間室温で振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した (5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した (5 x 7ｍL）。Fmoc-グリシン (0.36 g； 1.2 mmol)、HATU (0.46 g； 1.2 mmol)およびDIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)をDMA (7 mL)中１５分間攪拌した後、この溶液を樹脂に加え、混合物を２時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した (5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl (0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内(25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、濾液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (5ｍL）でトリチュレーションした。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 5 mL)で洗浄した後、ＨＰＬＣにより解析し調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥してL70を白色の綿状の固形物として得た(6.8 mg； 0.005 mmol)。収率3％。
Ｂ．Ｌ７３、Ｌ１１５およびＬ１１６の合成（図２Ｂ〜２Ｅ）：
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、 溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Fmoc-リンカー-OH (1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。樹脂をDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (5ｍL）でトリチュレーションした。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 5 mL)で洗浄した後、ＨＰＬＣにより解析し、調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分凍結乾燥した。
Ｃ．Ｌ７４の合成（図２Ｆ）：
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。Fmoc-イソニペコチン酸 (0.42 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。樹脂をDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。Fmoc-グリシン (0.36 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂を、DMA (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (5ｍL）でトリチュレーションした。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 5 mL)で洗浄した後、ＨＰＬＣにより解析し、HPPLCにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、L74を白色の綿状の固体として得た(18.0 mg； 0.012 mmol)。収率8％。
実施例III−図3A〜E
L67の合成
概要： (3β,5β)-３−アミノ-1２−オキソコラン−2４−酸メチルエステル AをＮaＯＨで加水分解して対応の酸Ｂを得、これをFmoc-グリシンと反応させて中間体Ｃを得た。オクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1])で官能化したRink アミド 樹脂をC,およびDOTA トリ−ｔ−ブチルエステルで順次に反応させた。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL67を得た。全体の収率：5.2％。
A．(3β,5β)-３−アミノ-1２−オキソコラン-2４−酸 (B)の合成(図3A)
NaOH (6.6 mL； 6.6 mmol)の１Ｍ溶液を、MeOH (15 mL)中の45℃の(3β,5β)-３−アミノ-1２−オキソコラン−2４−酸メチルエステル A (2.1 g； 5.1 mmol)に滴加した。４５℃で３時間攪拌した後、混合物を２５ｍLまで濃縮した後、H2O (25 mL)および1 M HCl (8 mL)を加えた。沈殿した固体を濾過し、H2O (2 x 30 mL)で洗浄し、減圧乾燥してBを白色の固体として得た(1.7 g； 4.4 mmol)。収率88％。
B． (3β,5β)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-1２−オキソコラン−2４−酸(Ｃ）の合成(図3A)
トリブチルアミン (0.7 mL； 3.1 mmol)を、THF (25 mL)中のN-α-Fmoc-グリシン (0.9 g； 3.1 mmol)の溶液に0 ℃で攪拌しながら滴加した。次いで、イソブチルクロロホルメート (0.4 mL； 3.1 mmol)を加え、１０分後、DMF (30 mL)中のトリブチルアミン (0.6 mL； 2.6 mmol)および(3β,5β)-３−アミノ-1２−オキソコラン−2４−酸B (1.0 g； 2.6 mmol)の懸濁液を滴加し、１時間かけて冷却溶液にした。混合物を加温し、６時間後に溶液を４０ｍLまで濃縮した後、H2O (50 mL)および1 N HCl (10 mL)を加えた(最終pH: 1.5)。沈殿した固体を濾過し、H2O (2 x 50 mL)で洗浄し、真空乾燥し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Cを白色の固体として得た(1.1 g； 1.7 mmol)。収率66％。
C．L67 ( N-[(3β,5β)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ] アセチル]アミノ]-12,2４−ジオキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)の合成(図3Bおよび3E)
樹脂 D (0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、 溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。(3β,5β)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ]-1２−オキソコラン−2４−酸C (0.80 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。樹脂をDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2(5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20ｍL）でトリチュレーションした。
実施例IV−図4A〜H
L63およびL64の合成
概要： (3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸メチルエステル 1bをNaOHで加水分解して中間体 2bを得た後、Fmoc-グリシンと反応させて3bを得た。オクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1])で官能化したRink アミド 樹脂を3bと反応させた後、DOTA トリ−ｔ−ブチルエステルと反応させた。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL64を得た。既に得られている中間体 2aを出発物質として同じ手順を繰り返してL63を得た。全体の収率:それぞれ9および4％。
A． (3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸 (2b)の合成 (図4A)
NaOH (130 mL； 0.13 mol)の１Ｍ溶液を、MeOH (300 mL)中の45 ℃に加熱した(3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸メチルエステル 1b (42.1 g； 0.10 mol)の溶液に滴加した。４５℃で３時間攪拌した後、混合物を150 mLに濃縮してH2O (350 mL)を加えた。ＣＨ2Ｃｌ2 (2 x 100 mL)で抽出した後、水溶液を２００ｍLに濃縮して１M HCl (150 mL)を加えた。沈殿した固体 を濾過し、H2O (2 x 100 mL)で洗浄し、減圧乾燥して2bを白色の固体として得た(34.8 g； 0.08 mol)。収率80％。
B． (3β,5β,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-1２−ヒドロキシコラン-2４−酸 (3a)の合成 (図4A)
トリブチルアミン (4.8 mL； 20.2 mmol)を、THF (120 mL)中のN-α-Fmoc-グリシン (6.0 g； 20.2 mmol)の溶液に０℃で攪拌しながら滴加した。イソブチルクロロホルメート (2.6 mL； 20.2 mmol)を順次に加え、１０分後、DMF (120 mL)中のトリブチルアミン (3.9 mL； 16.8 mmol)および(3β,5β,12α)-３−アミノ-1２−ヒドロキシコラン-2４−酸2a (6.6 g； 16.8 mmol)の懸濁液を滴加し、１時間かけて冷却溶液にした。混合物を加温し、６時間後、溶液を150 mLに濃縮した後、H2O (250 mL)および1 N HCl (40 mL) を加えた (最終pH: 1.5)。沈殿した固体を濾過し、H2O (2 x 100 mL)で洗浄し、真空乾燥しフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、3aを白色の固体として得た(3.5 g； 5.2 mmol)。収率31％。
C．(3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸(3b)の合成(図4A)
トリブチルアミン (3.2 mL； 13.5 mmol)をTHF (80 mL)中のN-α-Fmoc-グリシン (4.0 g； 13.5 mmol) の溶液に０℃で攪拌しながら滴加した。イソブチルクロロホルメート (1.7 mL； 13.5 mmol)を順次に加え、１０分後、DMF (80 mL)中のトリブチルアミン (2.6 mL； 11.2 mmol)および(3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸3a (4.5 g； 11.2 mmol)の懸濁液を滴加し、１時間かけて冷却溶液にした。混合物を加温し、６時間後、溶液を120 mLに濃縮した後、H2O (180 mL)および1 N HCl (30 mL)を加えた(最終のpH：1.5)。沈殿した固体を濾過し、H2O (2 x 100 mL)で洗浄し、真空乾燥しフラッシュクロマトグラフィーにより精製して 3aを白色の固体として得た(1.9 g； 2.8 mmol)。収率25％。
別法では、(3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸（3b)を以下のように製造することができる：
N-ヒドロキシスクシンイミド (1.70 g, 14.77 mmol)およびDIC (1.87 g, 14.77 mmol) をジクロロメタン (15 mL)中のFmoc-Gly-OH (4.0 g, 13.45 mmol) の攪拌した溶液に順次に加えた；得られた混合物を室温にて４時間攪拌した。形成したN,N’−ジイソプロピル尿素を濾過により除き、固体をエーテル (20ｍL）で洗浄した。揮発性物質を除去し、形成したFmoc-Gly-スクシンイミジルエステルの固形物をエーテル (3 x 20ｍL）で洗浄した。次いで、Fmoc-Gly-スクシンイミジルエステルを乾燥ＤＭＦ (15 mL)に再溶解し、３−アミノデオキシコール酸 (5.21 g, 12.78 mmol)をこの透明溶液に加えた。反応混合物を室温にて４時間攪拌し、水（200 mL)を加え、沈殿した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥し、シリカゲルクロマトグラフィー(TLC (シリカ) により精製(Rf: 0.50, シリカゲル, ＣＨ2Ｃｌ2/ＣＨ3OH, 9:1) (溶出液： ＣＨ2Ｃｌ2/ＣＨ3OH (9:1))して (3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸を無色の固形物として得た。収率：7.46 g (85 ％)。
D． L63 ( N-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-1２−ヒドロキシ−2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)の合成(図4B)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、 溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。(3β,5β,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-1２−ヒドロキシコラン-2４−酸3a (0.82 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (5 mL) で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 5 mL)で洗浄した後、ＨＰＬＣにより分析および精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥してL63を白色の綿状の固体として得た(12.8 mg； 0.0073 mmol)。収率9％。
E． L64 ( N-[(3β,5β,7α,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-７,１２−ジヒドロキシ-2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)の合成(図4Ｃ）
樹脂Ａ (0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。(3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸3b (0.81 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。樹脂をDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内(25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (5ｍL）でトリチュレーションした。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 5ｍL）で洗浄した。次いで、これをH2O (20 mL)に溶解し、Ｎa2CO3 (0.10 g； 0.70 mmol)を添加した；得られた混合物を室温にて４時間攪拌した。この溶液をＨＰＬＣにより精製し、、生成物を含有する画分を凍結乾燥してL64白色の綿状の固体として得た(3.6 mg； 0.0021 mmol)。収率4％。
実施例Ｖ−図5A〜E
L71およびL72の合成
概要：生成物を２工程で得た。最初の工程は、上記のRink アミド 樹脂上でのオクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1]) (適当な側鎖保護基を有する)の固相合成である。第２の工程は種々のリンカーとのカップリング、次いで、DOTA トリ−ｔ−ブチルエステルによる官能化である。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、最終生成物を調製用ＨＰＬＣにより精製した。全体の収率 ３〜９％。
A．ボンベシン [７−14]官能化および切断手順 (図5Aおよび5D)
樹脂Ｂ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。Fmoc-リンカー-OH (1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl (0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、濾液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをエーテル(5ｍL）でトリチュレーションした。沈殿を遠心により集め、エーテル (5 x 5 mL)で洗浄した後、分析用ＨＰＬＣにより解析し、調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥した。
B．生成物
1．L71 (４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]ベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)
生成物を白色の綿状の固体として得た(7.3 mg； 0.005 mmol)。収率7.5％。
2．L72 (トランス−４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]シクロヘキシルカルボニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-glycil-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)
生成物を白色の綿状の固体として得た(7.0 mg； 0.005 mmol). 収率4.8％。
C．トランス−４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]シクロヘキサンカルボン酸（D) (図5E)
１,４−ジオキサン (40 mL)中のN-（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)スクシンイミド (4.4 g； 14.0 mmol) の溶液を、10％ Ｎa2CO3 (30 mL)中の０℃に冷却したトランス−４−(アミノメチル)シクロヘキサンカルボン酸 (2.0 g； 12.7 mmol) の溶液に滴加した。次いで、混合物を常温に加温し、室温にて１時間攪拌した後、最終のpＨが２になるまで1 N HCl (32 mL)で処理した。得られた溶液をn-ＢＵOH (100 mL) で抽出し； 揮発性物質を除去し、粗製の残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して D 白色の固体として得た(1.6 g； 4.2 mmol)。収率33％。
実施例VI−図6A-F
L75およびL76の合成
概要：Rink アミド 樹脂上でのオクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1]) (A)の２種類のリンカーEおよびHとのカップリングの後、DOTA トリ−ｔ−ブチルエステルによる官能化により、２種類の生成物を得た。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、最終生成物を調製用ＨＰＬＣにより精製した。全体の収率: 8.5％ (L75)および5.6％ (L76)。
A．２−[(1,3−ジヒドロ−１,３−ジオキソ-2H-isoインドール−2−イル）メチル]安息香酸（Ｃ） (図6A)
文献で報告された手順にしたがって生成物を合成した (Bornstein, J； Drummon, P. E.； Bedell, S. F. Org Synth. Coll. Vol. IV 1963, 810-812)。
B．２−(アミノメチル)安息香酸（D) (図6A)
メチルアミン (6.14 mL； 7.1mmol)の40％溶液を２−[(1,3−ジヒドロ−１,３−ジオキソ-2H-isoインドール−2−イル）メチル]安息香酸 C (2 g； 7.1 mmol)に加えた後、EtOH (30 mL)を加えた。室温にて５分間攪拌した後、反応混合物を５０℃に加熱した。２．５時間後、混合物を冷却し、溶媒を減圧下でエバポレートした。粗製物を50 ｍLの無水エタノールに懸濁し、懸濁液を室温にて１時間攪拌した。固形物を濾過し、EtOH で洗浄して２−(アミノメチル)安息香酸 D (0.87 g； 5.8 mmol)を得た。収率81％。
C．２−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]安息香酸（E) (図6A)
文献で報告された手順にしたがって生成物を合成した (Sun, J-H.； Deneker, W. F. Synth. Commun. 1998, 28, 452５−4530)。
D．４−(アミノメチル)-３−ニトロ安息香酸（G) (図6B)
４−(ブロモメチル)-３−ニトロ安息香酸 (3.2 g； 12.3 mmol)をEtOH (300 mL)中の8％ ＮＨ3に溶解し、得られた溶液を室温にて攪拌した。２２時間後、溶液を留去し残留物をH2O (70ｍL）に懸濁した。この懸濁液を１５分間攪拌し、濾過した。集めた固形物をH2O (40 mL)に懸濁し、25％NH4OH水溶液 (pH 12)を数滴添加することにより溶解した後、6 N HClを加えることにより溶液のpＨを６に調整した。沈殿した固体を濾過し、MeOH (3 x 5 mL)およびＥt2O (10 mL)で順次に洗浄し、真空乾燥（1.3 kPa； P2O5)して４−(アミノメチル)-３−ニトロ安息香酸を淡褐色の固形物として得た(1.65 g； 8.4 mmol)。収率68％。
E．４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−ニトロ安息香酸（H) (図6B)
４−(アミノメチル)-３−ニトロ安息香酸 G (0.8 g； 4 mmol)を10％Ｎa2CO3 (25 mL)水溶液および１,４−ジオキサン (10 mL)に溶解し、溶液を０℃に冷却した。１,４−ジオキサン (10 mL)中の９−フルオレニルクロロギ酸メチル (Fmoc-Cl) (1.06 g； 4 mmol)の溶液を２０分間滴加した。０〜5 ℃で２時間、および10 ℃で１時間後、反応混合物を濾過し、１N HClを加えて溶液をpＨ５に酸性化した。沈殿を濾過し、H2O (2 x 2 mL)で洗浄し、減圧下で乾燥 (1.3 kPa； P2O5) して４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−ニトロ安息香酸を白色の固体として得た(1.6 g； 3.7 mmol)。収率92％。
F．L75( N-[２−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ] メチル]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド) (図6Ｃ）
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。２−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]安息香酸, E (0.45 g； 1.2 mmol)、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBT) (0.18 g； 1.2 mmol), N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド (DIＣ） (0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を24時間室温にて振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体(DOTA トリ−ｔ−ブチルエステル) をNaCl (0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂を、DMA (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、濾液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後沈殿を得た。生じた沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄してL75 (190 mg； 0.13 mmol)を白色の固体として得た。収率44％。
G．L76 ( N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ] メチル]-３−ニトロベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド) (図6D)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、ＤＭＡ中の新しい50％モルホリン溶液 (7 mL)を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、 溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−ニトロ安息香酸 H (0.50 g；1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去した。DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。DOTA トリ−ｔ−ブチルエステル (0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂を、DMA (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20ｍL）でトリチュレーションした。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄して固形物 (141 mg) を得、これをHPLCにより解析した。粗製物の一部37 mgを調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L76 (10.8 mg； 7.2 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率9％。
実施例VII−図7A〜C
L124の合成
概要：４−シアノフェノール Aをアセトン中のブロモ酢酸エチルおよびＫ2ＣＯ3と反応させて中間体Bを得、これをＮaＯＨで対応の酸Ｃに加水分解した。EtOH/CHCl3中、355kPaにてH2およびPtO2によりＣを連続水素化に付し、対応のアミノ酸Ｄを得、これをFmocOSuで直接保護してＥを得た。オクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1])で官能化したRink アミド 樹脂をEと反応させた後、DOTA トリ−ｔ−ブチルエステルと反応させた。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL124を得た。全体の収率：1.3％。
A． (４−シアノフェノキシ)酢酸エチルエステル(B)の合成 (図7A)
文献で報告された手順にしたがって生成物を合成した (Archimbault, P.； LeClerc, G.； Strosberg, A. D.； Pieトリ−Rouxel, F. PCT Int. Appl. WO 980005, 1998)。
B． (４−シアノフェノキシ)酢酸（Ｃ）の合成(図7A)
ＮaＯＨの１Ｍ溶液 (7.6 mL； 7.6 mmol)をMeOH (15ｍL）中の (４−シアノフェノキシ)酢酸エチルエステル B (1.55 g； 7.6 mmol)の溶液に滴加した。１時間後、溶液を1 N HCl (7.6 mL； 7.6 mmol)で酸性化し、留去した。残留物を水（20 mL)に溶解し、CHCl3 (2 x 30ｍL）で抽出した。有機相を留去し、組成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して(４−シアノフェノキシ)酢酸 C (0.97 g； 5.5 mmol）を白色の固体として得た。収率72％。
C．[４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]フェノキシ]酢酸（E)の合成(図7A)
PtO2 (150 mg)を、EtOH (147 mL)およびCHCl3 (3ｍL）中の(４−シアノフェノキシ)酢酸Ｃ(1.05 g； 5.9 mmol) の溶液に加えた。懸濁液を水素雰囲気下(355 kPa； 20 ℃）３０時間攪拌した。混合物をセライト（登録商標）パッドで濾過し、溶液を減圧留去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して酸D (0.7 g)を得、これを０℃のH2O (10 mL), MeCN (2 mL)およびEt3N (0.6 mL) に溶解した後、MeCN (22 mL)中のN-（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)スクシンイミド (1.3 g； 3.9 mmol) の溶液を滴加した。室温にて１６時間攪拌した後、反応混合物を濾過し、揮発性物質を減圧留去した。残留物を1 N HCl (10 mL)で処理し、沈殿した固体を濾過し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して [４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]フェノキシ]酢酸 E (0.56 g； 1.4 mmol）を白色の固体として得た。全体の収率24％。
D．L124 ( N-[[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル] アミノ]メチル]フェノキシ]アセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)の合成(図7B)
樹脂Ａ(480 mg； 0.29 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリン溶液を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。[４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]フェノキシ]酢酸 E (480 mg； 1.19 mmol)、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBT) (182 mg； 1.19 mmol), N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド (DIＣ） (185 μL； 1.19 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。次いで、この樹脂をDMA (6 mL)中、50％ モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、 DMA (６mL)中の新しい50％モルホリン溶液を加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体 をNaCl (750 mg； 1.19 mmol)、ＨＯＢＴ (182 mg； 1.19 mmol), DIEA (404 μL； 2.36 mmol)、ＤＩＣ(185 μL； 1.19 mmol)およびDMA (6 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、この樹脂をDMA (2 x 7 mL)で洗浄し、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、濾液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (5ｍL）でトリチュレーションした。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 5 mL)で洗浄し、固形物(148 mg)を得、これをHPLCにより解析した。粗製物の一部65 mgを調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L124 (図7Ｃ）を白色の固体として得た(15 mg； 0.01 mmol)。収率7.9％。
実施例VIII−図8A-C
L125の合成
概要：４−(ブロモメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステル AをDMF中のNaN3と反応させて中間体アジドＢを得た後、これをＰh3PおよびH2OでアミンＣに還元した。ＣをNaOHで加水分解して酸Dを得、これをFmocOSuで直接保護してＥを得た。オクタペプチド Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14] [配列番号1])で官能化したRink アミド 樹脂 (A)をＥと反応させた後、DOTA トリ−ｔ−ブチルエステルと反応させた。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後 粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL125を得た。全体の収率：0.2％。
A．４−(アジドメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステル(B)の合成 (図8A)
DMF (90 mL)中の４−(ブロモメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステル (8 g； 31 mmol)およびNaN3(2 g； 31 mmol) の溶液を室温にて一晩攪拌した。揮発性成分を減圧下で留去し、粗製物をEtＯＡc (50ｍL）に溶解した。溶液水で洗浄し（2 x 50 mL)、乾燥した。揮発性成分を留去して４−(アジドメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステル (6.68 g； 30 mmol)を得た。収率97％。
B．４−(アミノメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステル(Ｃ）(図8A)
トリフェニルホスフィン (6.06 g； 23 mmol)を、THF (50 mL)中の(４−アジドメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステル B (5 g； 22 mmol) の溶液に加えた:水素が発生し、白色の固体の形成が観察された。混合物を窒素下室温にて攪拌した。24時間以上した後、トリフェニルホスフィン (0.6 g； 2.3 mmol)を加えた。２４時間後、アジドが消費されH2O (10 mL)を加えた。４時間後、白色の固体は消失した。45 ℃で３時間加熱した混合物を一晩室温にて攪拌した。溶液を蒸発乾固し、組成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、４−(アミノメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステル C (1.2 g； 6.1 mmol)を得た。収率28％。
C．４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−メトキシ安息香酸（E) (図8A)
ＮaＯＨの１Ｍ溶液 (6.15 mL； 6.14 mmol)を、40 ℃に加熱したMeOH (25 mL)中の４−(アミノメチル)-３−メトキシ安息香酸 メチルエステルＣ (1.2 g； 6.14 mmol) の溶液に滴加した。４５℃で８時間攪拌した後、溶液を室温にて一晩攪拌した。ＮaＯＨの１Ｍ溶液 (0.6 mL； 0.6 mmol)を加え、混合物を40 ℃に４時間加熱した。溶液を濃縮し、1 N HCl (8 mL； 8 mmol) で酸性化し、EtＯＡc (2 x 10 mL) で抽出した後、水層 を１５ｍLに濃縮した。この溶液 (pH 4.5)を０℃に冷却し、Et3N (936 μL； 6.75 mmol) を加えた(pH 11)。MeCN (30 mL)中のN-（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)スクシンイミド (3.04 g； 9 mmol)の溶液を滴加し (最終のpＨ9)、白色の固体が沈殿した。室温にて１時間後、この固体を濾過し、1N HCl (15 mL)中に懸濁し、その懸濁液を３０分間攪拌した。この固体を濾過して４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−メトキシ安息香酸 Eを白色の固体として得た(275 mg； 0.7 mmol)。濾液を減圧留去して得られた白色の残留物を1N HCl (20 mL)中で懸濁し、３０分間攪拌した。この固体を濾過し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製してさらに酸E (198 mg； 0.5 mmol)を得た。全体の収率20％。
D．L125 ( N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ] メチル]-３−メトキシベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド) (図8B)
樹脂Ａ(410 mg； 0.24 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリン溶液を加えた。この懸濁液を２０分間攪拌した後、 溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−メトキシ安息香酸 E (398 mg； 0.98 mmol)、ＨＯＢＴ (151 mg； 0.98 mmol)、ＤＩＣ(154 μL； 0.98 mmol)およびDMA (6 mL)をこの樹脂に加えた；混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をDMA (5 x 7ｍL）で洗浄した。次いで、この樹脂をDMA (6 mL)中、50％ モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、 DMA (６mL)中の新しい50％モルホリン溶液を加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステルをNaCl(618 mg； 0.98 mmol)、ＨＯＢＴ (151 mg； 0.98 mmol)、ＤＩＣ(154 μL； 0.98 mmol), DIEA (333 μL； 1.96 mmol)およびDMA (6 mL)ともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂を、DMA (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (5ｍL）でトリチュレーションした。生じた沈殿を遠心により集め, Ｅt2O (5 x 5 mL)で洗浄し、ＨＰＬＣにより解析し、調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L125 (図8Ｃ）を白色の固体として得た (15.8 mg； 0.011 mmol)。収率4.4％。
実施例IX−図9A〜9D
L146, L233, L234,およびL235の合成
概要：Rink アミド 樹脂上で、オクタペプチド GlnTrpAlaValGlyHisLeuMetＮＨ2(ＢＢＮ[７−14]) (A)を出発物質として数段階の工程で生成物を得た。試薬Ｂによる最終の切断および脱保護の後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製しL146, L233, L234およびL235を得た。全体の収率: それぞれ10％, 11％, 4.5％, 5.7％。
A．３−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ安息香酸, B (図9A)
THF (20 mL)中の３−アミノ安息香酸 (0.5 g； 3.8 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (DIEA) (0.64 mL； 3.8 mmol) の溶液を、THF (10 mL)およびＣＨ2Ｃｌ2 (10ｍL）中のFmoc-グリシン クロリド (1.2 g； 4.0 mmol) (3) の溶液に滴加した。室温にて２４時間攪拌した後、1 M HCl (50 mL)を加えた (最終のpH：1.5)。沈殿を濾過し、H2O (2 x 100 mL)で洗浄し、真空乾燥し、CHCl3/ＣＨ3OH (1:1) から結晶化してＢを白色の固体として得た(0.7 g； 1.6 mmol)。収率43％。
B．N-[３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L233 (図9D)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。
この懸濁液をさらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。３−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ安息香酸, B (0.50 g；1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて６時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。DOTA トリ−ｔ−ブチルエステル付加体をＮaＣl (0.79 g； 1.2 mmol) (5)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(152 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物(50 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L233 (17.0 mg； 11.3 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率11％。
C． N-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]フェニルアセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L146 (図9D)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液をさらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Fmoc-４−アミノフェニル酢酸 (0.45 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて６時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Fmoc-グリシン (0.36 g； 1.2 mmol), HATU (0.46 g； 1.2 mmol)およびDIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)をDMA (7 mL)中１５分攪拌した後、溶液 を樹脂に加え、混合物を室温にて２時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。DOTA トリ−ｔ−ブチルエステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(203 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (50 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L146 (11.2 mg； 7.4 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率10％。
D．６−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノナフトエ酸C (図9B)
THF (20 mL)中の６−アミノナフトエ酸(500 mg； 2.41 mmol)；およびDIEA (410 μL 2.41 mmol) の溶液を、ＣＨ2Ｃｌ2/THF 1:1 (10 mL)中のFmoc-グリシン クロリド (760 mg； 2.41 mmol)の溶液に滴加し、室温にて攪拌した。２４時間後、溶媒を減圧留去した。残留物を0.5 N HCl (50 mL)に溶解し、１時間攪拌した。沈殿した白色の固体を濾過し、乾燥した。白色の固体をメタノール (30 mL) に懸濁し、５分間煮沸した後、濾過して生成物Ｃ(690 mg； 1.48 mmol)を得た。収率62％。
E． N-[６−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル] アミノ]ナフトイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L234
樹脂Ａ(500 mg； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリン溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。６−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノナフトエ酸C (560 mg； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (184 mg； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(187 μL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて６時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (6 L) 中の50％ モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。DOTA トリ−ｔ−ブチルエステル付加体 をNaCl (757 mg； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (184 mg； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(187 μL； 1.2 mmol),およびDIEA (537 μL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物をフラスコ中で振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ（2 x 7 mL), ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL) で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。この樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(144 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (54 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L234 (8 mg； 5.1 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率4.5％。
F．４−[[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]メチルアミノ]安息香酸, D (図9Ｃ）
THF (20 mL)中の４− N-メチルアミノナフトエ酸(500 mg； 3.3 mmol)およびDIEA (562 μL 3.3 mmol)の溶液を、ＣＨ2Ｃｌ2/THF 1:1 (10 mL)中のFmoc-グリシンクロリド (1.04 g； 3.3 mmol) の溶液に加え、室温にて攪拌した。２４時間後、溶媒を減圧留去した。残留物を0.5 N HCl (30 mL)に溶解し、0 ℃で３時間攪拌した。沈殿した白色の固体 を濾過し、乾燥した。組成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して化合物 Dを得た(350 mg； 0.81 mmol)。収率25％。
G． N-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル] メチルアミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L235 (図9D)
樹脂Ａ(500 mg； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリン溶液を加えた。この懸濁液をさらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。４−[[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]- N-メチル]アミノ-安息香酸 D (510 mg； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (184 mg； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(187 μL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて６時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (７ｍL) 中の50％ モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。DOTA トリ−ｔ−ブチルエステル付加体をNaCl(757 mg； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (184 mg； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(187 μL； 1.2 mmol),およびDIEA (537 μL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物をフラスコ中で振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ（2 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。この樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た
沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(126 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (53 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L235 (11 mg； 7.2 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率5.7％。
実施例 X−図10A-B
L237の合成
概要：１−ホルミル-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン(A)を、pH３にてベンジル クロロホルメートで選択的に保護してＢを得、これをブロモ酢酸ｔ−ブチルでアルキル化し、ヒドロキシルアミン ハイドロクロライドで脱ホルミル化してDを得た。Ｐ(ＯtＢＵ)3およびパラホルムアルデヒドとの反応によりEを得、水素化によりこれを脱保護し、ブロモ酢酸ベンジルでアルキル化してＧを得、これを最後にＨに水素化した。オクタペプチド GlnTrpAlaValGlyHisLeuMetＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14]) (A)で官能化したRink アミド 樹脂を、Fmoc-４−アミノ安息香酸, Fmoc-グリシンおよびHと順次に反応させた。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後 粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL237を得た。全体の収率0.21％。
A．７−ホルミル-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-１−カルボン酸 フェニルメチルエステル 二塩酸塩B (図10A)
１−ホルミル-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン A (14 g； 69.9 mmol) をH2O (100 mL)および12 N HCl (11 mL) に溶解し１,４−ジオキサン (220 mL)をpＨ３になるまで加えた。pHstat装置を用いて2 N NaOH (68.4 mL)を継続的に添加することにより反応混合物のpＨを３に維持しながら、１,４−ジオキサン (15 mL)中のベンジル クロロホルメート (13.8 g； 77 mmol) の溶液を３．５時間かけてゆっくりと滴加した。
添加の終了したら、反応物を１時間攪拌した後、n-ヘキサン (4 x 100 mL)およびiPr2O (4 x 100ｍL）で洗浄した。10 N NaOH (6.1 mL)の添加により水層のpＨを１３にし、CHCl3 (4 x 100ｍL）で抽出した。有機相をブライン (100 mL) で洗浄し、乾燥（Ｎa2ＳＯ4)し、濾過し、留去した。油状の残留物をアセトン (200 mL)に溶解し、6 N HCl (26 mL)を加えた。沈殿した固形物を濾過し、アセトン (2 x 50 mL)で洗浄し、減圧乾燥して化合物 B (23.6 g； 58 mmol)を白色の結晶性の固体として得た。収率83％。
B．４−(フェニルメトキシ)カルボニル-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-１,７−二酢酸 ビス（１,１−ジメチルエチル)エステル D (図10A)
H2O (450 mL)および1 N NaOH (74 mL； 74 mmol)中のB (14.4 g； 35.3 mmol)の溶液を２０分間攪拌した後、CHCl3 (4 x 200ｍL）で抽出した。有機層を留去して油状の残留物(12.3 g) を得、これをＣＨ3CN (180 mL)および N-エチルジイソプロピルアミン (DIEA) (15 mL； 88.25 mmol) に溶解した。ＣＨ3CN (15 mL)中のブロモ酢酸ｔ−ブチル (16.8 g； 86.1 mmol) の溶液を、先程の溶液に２．５時間かけて滴加した。室温にて２０時間後、溶媒を留去し、油状の残留物をCHCl3 (150 mL) に溶解し、H2O (5 x 100ｍL）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎa2ＳＯ4)し、濾過し、蒸発乾固してＣを黄色の 油状物として得た。粗製のＣ (22 g)をEtOH (250 mL) に溶解し、ＮＨ2OH・HCl (2.93g； 42.2 mmol)を加え、この溶液を加熱還流した。４８時間後、溶媒を留去し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2 (250 mL) に溶解し、H2O (3 x 250 mL)、次いで、ブライン (3 x 250ｍL）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎa2ＳＯ4)し、濾過し、留去した。油状の残留物(18.85 g)をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分を集め、留去してガラス状の白色の固体 (17.62 g)を得、これをH2O (600 mL)および1 N NaOH (90 mL； 90 mmol) に溶解し、CHCl3(3 x 250ｍL）で抽出した。有機層を乾燥（Ｎa2ＳＯ4)し、蒸発乾固してD (16.6 g； 31 mmol)を油状物として得た。収率88％。
C．４−(フェニルメトキシ)カルボニル-10-[[ビス（１,１−ジメチルエトキシ)ホスフィニル]メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-１,７−二酢酸 ビス（１,１−ジメチルエチル)エステル, E (図10A)
化合物 D (13.87 g； 26 mmol), Ｐ(ＯtＢＵ)3(7.6 g； 28.6 mmol) (10)およびパラホルムアルデヒド (0.9 g； 30 mmol) の混合物を60 ℃に加熱した。１６時間後、さらにＰ(ＯtＢＵ)3 (1 g； 3.76 mmol)およびパラホルムアルデヒド (0.1 g； 3.33 mmol)を加えた。反応物を60 ℃にさらに２０時間加熱した後、減圧下で80 ℃に８時間加熱して揮発性の不純物を除去した。組成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製してE (9.33 g； 8 mmol)を油状物として得た。収率31％。
D．７−[[ビス（１,１−ジメチルエトキシ)ホスフィニル]メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,10-三酢酸 １−フェニルメチル 4,10-ビス（１,１−ジメチルエチル)エステル G (図10A)
ＣＨ3OH (160 mL)中のE (6.5 g； 5.53 mmol)の溶液に、5％ Ｐd/C (1 g； 0.52 mmol)を加え、混合物を水素雰囲気下、室温にて攪拌した。４時間後、(H2消費量 165 mL；6.7 mmol)、混合物をMillipore（登録商標）フィルター(FT 0.45 μm)で濾過し、溶液 を減圧下でエバポレートした。粗製物（5.9 g)をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して F (4.2 g)を油状物として得た。
ＣＨ3CN (8 mL)に溶解したブロモ酢酸ベンジル (1.9 g； 8.3 mmol)を、ＣＨ3CN (40 mL)およびDIEA (1.5 mL； 8.72 mmol)中のF (4.2 g)の溶液に１時間以内に滴加した。３６時間後、室温にて溶媒を留去し、残留物(5.76 g)をCHCl3 (100 mL), H2O (2 x 100 mL)で洗浄した後、ブライン (2 x 70ｍL）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎa2ＳＯ4)し、濾過し、留去した。粗製物（5.5 g)をフラッシュクロマトグラフィーで２回精製し、画分を集め、蒸発乾固してG (1.12 g； 1.48 mmol)を油状物として得た。収率27％。
E．７−[[ビス（１,１−ジメチルエトキシ)ホスフィニル]メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,10-三酢酸 4,10-ビス（１,１−ジメチルエチル)エステル, H (図10A)
5％ Ｐd/C (0.2 g； 0.087 mmol)をＣＨ3OH (27 mL)中のG (1.12 g； 1.48 mmol) の溶液に加え、混合物を水素雰囲気下、室温にて攪拌した。２時間後(H2消費量 35 mL； 1.43 mmol)、混合物をMillipore（登録商標）フィルター(FT 0.45 μm)で濾過し、溶液を蒸発乾固してＨ (0.94 g； 1.41 mmol)を淡黄色の油状物として得た。収率97％。
F． N-[４−[[[[[4,10-ビス（カルボキシメチル)-７−(ジヒドロキシホスフィニル)メチル-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル−L-メチオニンアミド, L 237 (図10B)
樹脂Ａ(330 mg； 0.20 mmol) (17)を固相ペプチド合成容器内でDMA中の50％モルホリンとともに振盪し (5 mL) for 10 min, 溶液を除去し、新しい50％モルホリン in DMA (5 mL)を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 5ｍL）。Fmoc-４−アミノ安息香酸 (290 mg； 0.80 mmol)、ＨＯＢＴ (120 mg； 0.80 mmol)、ＤＩＣ(130 μL； 0.80 mmol)およびDMA (5 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 5ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (5 mL)中の50％ モルホリンと共に１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (5 mL)中の新しい50％ モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 5ｍL）。Fmoc-グリシン (240 mg； 0.8 mmol), HATU (310 mg； 0.8 mmol)およびDIEA (260 μL； 1.6 mmol)をDMA (5 mL)中で１５分間攪拌した後、溶液を樹脂に加え,混合物を室温にて２時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 5ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (5 mL)中の50％ モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、 DMA (5 mL)中の新しい50％ モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 5ｍL）。Ｈ(532 mg； 0.80 mmol)、ＨＯＢＴ (120 mg； 0.80 mmol)、ＤＩＣ(130 μL； 0.80 mmol),およびDIEA (260 μL； 1.6 mmol)およびDMA (5 mL)を樹脂に加えた。混合物をフラスコ中、室温にて４０時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ（5 x 5 mL)、 ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 5 mL) で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL)で４時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(90 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (50 mg) を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L237 (6 mg； 3.9 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率3.5％。
実施例XI−図11A〜B
L238およびL239の合成
概要：Rink アミド 樹脂上で、オクタペプチド GlnTrpAlaValGlyHisLeuMetＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14]) (A) を出発物質として数段階の工程で生成物を得た。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL238およびL239を得た。全体の収率:それぞれ14および9％。
A．Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシル-L-セリル-[S-[(アセチルアミノ)メチル]]-L-システイニル-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L238 (図11A)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Fmoc-４−アミノ安息香酸 (0.43 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Fmoc-グリシン (0.36 g； 1.2 mmol), HATU (0.46 g； 1.2 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)をDMA (7 mL)中で１５分間攪拌した後、溶液 を樹脂に加え、混合物を室温にて２時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。N-α-Fmoc-S-アセトアミドメチル-L-システイン (0.50 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。N-α-Fmoc-O-ｔ−ブチル-L-セリン(0.46 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol),およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン (0.12 g； 1.2 mmol), HATU (0.46 g； 1.2 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)をDMA (7 mL)中で１５分間攪拌した後、溶液を樹脂に加え. 混合物を室温にて２時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(169 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (60 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L238 (22.0 mg； 0.015 mmol）を白色の固体として得た。収率14％。
B．Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシル-L-セリル-[S-[(アセチルアミノ)メチル]]-L-システイニル-グリシル-(3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシ-2４−オキソコラン−2４−イル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L239 (図11B)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。(3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸B (0.82 g； 1.2 mmol) (7)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。N-α-Fmoc-S-アセトアミドメチル-L-システイン (0.50 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。N-α-Fmoc-O-ｔ−ブチル-L-セリン(0.46 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol)およびDMA (7 mL)をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン (0.12 g； 1.2 mmol)、HATU (0.46 g； 1.2 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)をDMA (7 mL)中で１５分間攪拌した後、溶液を樹脂に加えた。
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。(3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸B (0.82 g； 1.2 mmol)、HOBT (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。N-α-Fmoc-S-アセトアミドメチル-L-システイン (0.50 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、 混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。N-α-Fmoc-O-ｔ−ブチル-L-セリン(0.46 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン (0.12 g； 1.2 mmol), HATU (0.46 g； 1.2 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)をDMA (7 mL)中で１５分間攪拌した後、溶液を樹脂に加えた。
実施例XII−図12A〜F
L240, L241, L242の合成
概要：Rink アミド 樹脂上で、オクタペプチド GlnTrpAlaValGlyHisLeu MetＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14]) (A) を出発物質として数段階の工程で生成物を得た。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL240, L241,およびL242を得た。全体の収率:それぞれ7.4, 3.2, 1.3％。
A．４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−メトキシ安息香酸 A (図12A)
THF (20 mL)中の４−アミノ-３−メトキシ安息香酸 (1.0 g； 5.9 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (1.02 mL 5.9 mmol)の溶液を、ＣＨ2Ｃｌ2 /THF 1:1 (20 mL)中のFmoc-グリシルクロリド (1.88 g； 5.9 mmol)の溶液に滴加し、N2下、室温にて攪拌した。３時間後、溶媒を減圧留去した。残留物を0.5 N HCl (50 mL)に溶解し、０℃で１時間攪拌した後、濾過し、乾燥した。白色の固体をMeOH (30 mL)に懸濁し、１時間攪拌した後、濾過し、CHCl3/ヘキサン 1:4の溶液 (75ｍL）に懸濁した。この懸濁液を濾過して化合物 Aを固形物として得た(1.02 g； 2.28 mmol)。収率39％。
B．N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]グリシル]アミノ]-３−メトキシベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-l-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L240
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。４−[[[ (9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル] アミノ] アセチル] アミノ-３−メトキシ安息香酸、(0.50 g； 1.2 mmol)、HOBT (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて５時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol)、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 20 mL)で洗浄して固形物を得(152 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (52 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L240 (12.0 mg； 7.8 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率7.4％。
C．４−アミノ-３−クロロ安息香酸 C (図12B)
１Ｎ ＮａＯＨ (11 mL； 11 mmol)をMeOH (20 mL)中の４５℃のメチル ４−アミノ-３−クロロベンゾエート (2 g； 10.8 mmoli) の溶液に加えた。反応混合物を４５℃にて５時間、室温にて一晩攪拌した。さらに１Ｎ ＮａＯＨを加え (5 mL； 5 mmol)、反応物を４５℃にて２時間攪拌した。溶媒を濃縮した後、1N HCl (16ｍL）を加えた。この固体の沈殿を濾過し、乾燥して４−アミノ-３−クロロ安息香酸 Cを固形物として得た(1,75 g； 10.2 mmol)。収率94.6％。
D．４−[[ [(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−クロロ安息香酸, D (図12B)
THF (50 mL)中の４−アミノ-３−クロロ安息香酸 (1.5 g； 8.75 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (1.46 mL 8.75 mmol)の溶液を、ＣＨ2Ｃｌ2 /THF 1:1 (30 mL)中のFmoc-グリシルクロリド (2.76 g； 8.75 mmol)の溶液に滴加し、N2下、室温にて攪拌した。３時間後、溶媒を減圧留去した。残留物を0.5N HCl (50 mL)に溶解し、濾過し、乾燥した。
白色の固体をMeOH (30 mL) に懸濁し、１時間攪拌した後、濾過し、乾燥して４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−クロロ安息香酸 (2.95 g； 6.5 mmol)を得た。収率75％。
E． N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]グリシル]アミノ]３−クロロベンゾイル]L-グルタミニル-L-トリプトフィル-l-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L241 (図12E)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−クロロ安息香酸, D (0.54 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて５時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。
次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol)、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて４０時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(151 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (56 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L241 (5.6 mg； 3.6 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率3.2％。
F．４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−メチル安息香酸, E (図12Ｃ）
THF (30 mL)中の４−アミノ-３−メチル安息香酸 (0.81 g； 5.35 mmol)および N-エチルジイソプロピルアミン (0.9 mL 5.35 mmol)の溶液を、ＣＨ2Ｃｌ2 /THF 1:1 (20 mL)中のFmoc-グリシルクロリド (1.69 g； 5.35 mmol)の溶液に滴加し、N2下、室温にて攪拌した。３時間後、溶媒を減圧留去した。残留物を0.5 N HCl (50 mL)に溶解し０℃で３時間攪拌した後、濾過し、乾燥した。白色の固体をMeOH (50 mL) に懸濁し１時間攪拌した後、濾過し、乾燥して化合物 E (1.69 g； 3.9 mmol)を得た。収率73％。
G． N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]グリシル]アミノ]３−メチルベンゾイル]L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L242 (図12F)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。４−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-３−メチル安息香酸, E (0.52 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて５時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl (0.76 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。
混合物を室温にて４０時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(134 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (103 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L242 (4.5 mg； 2.9 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率1.3％。
実施例 XIII−図13A-C
L244の合成
概要：生成物を、Rink アミド 樹脂 (A)上で、オクタペプチドGlnTrpAlaValGlyHisLeuMetＮＨ2(ＢＢＮ［７−14］)を出発物質として数段階の工程で得た。最後のカップリング工程は、DOTA トリ−ｔ−ブチルエステルを用いて溶液相で行った後、試薬Ｂを用いてリンカー-ボンベシン [７−14]を開裂し、脱保護した。粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL244を得た。全体の収率：0.4％。
A．N,N’-(イミノジ−2,１−エタンジイル)ビス［２,２,２−トリフルオロアセトアミド］、(図13A)
トリフルオロ酢酸エチルエステル (50 g； 0.35 mol)を、THF (180 mL)中の０℃のジエチレントリアミン (18 g； 0.175 mol)の溶液に１時間以内に滴加した。室温にて２０時間後, 混合物を留去して油状の残留物を得た (54 g)。この油状物をＥt2O (50 mL)から結晶化し、濾過し、Ｅt2O (2 x 30 mL)で洗浄し、乾燥してＡを白色の固体として得た(46 g； 0.156 mol)。収率89％。
B．４−[N,N’-Bis[２−(トリフルオロアセチル)アミノエチル]アミノ]-４−オキソ酪酸, B (図13A)
無水コハク酸 (0.34 g； 3.4 mmol)をA (1 g； 3.4 mmol)のTHF (5 mL)溶液に室温にて加えた。２８時間後、粗製物を濃縮して残留物(1.59 g) を得、EtＯＡc (2 x 10 mL)および1 N HCl (2 x 15ｍL）で洗浄した。有機層をＮa2ＳＯ4で乾燥し, 濾過し、留去して油状の残留物 (1.3 g) を得、これをフラッシュクロマトグラフィーにより精製し (5) てＢを油状物として得た (0.85 g； 2.15 mmol)。収率63％。
C．４−［N,N’-Bis［２−［(９−H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル］アミノエチル］アミノ］-４−オキソ酪酸, D (図13A)
無水コハク酸 (2 g； 20 mmol)を、THF (25 mL)中のＡの溶液 (5 g； 16.94 mmol)に室温にて加えた。２８時間後、粗製物を濃縮して残留物(7 g) を得、酢酸エチル(100 mL)および1 N HCl (2 x 50ｍL）で洗浄した。有機層をＮa2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、留去して粗製物Ｂを油状の残留物として得た (6.53 g). 2 N NaOH (25 mL)をEtOH (35 mL)中の粗製物Ｂ (5 g)の懸濁液に加え、室温にて１時間後完全な溶液を得た。２０時間後、溶媒溶液を留去してＣを油状物として得た (8.48 g)。１,４−ジオキサン (30 mL)中の９−フルオレニルクロロギ酸メチル (6.54 g, 25.3 mmol)の溶液を10％ aq. Ｎa2CO3 (30 mL)水溶液中の０℃のＣの溶液に１時間以内に滴加した。室温にて２０時間後、ゼラチン質の懸濁液を得、濾過して白色の固体 (3.5 g)および黄色の溶液を得た。溶液を留去し残存する水溶液をH2O (150 mL)中に希釈し、EtＯＡc (70ｍL）で抽出した。新しいEtＯＡc (200 mL)を水相に加え、懸濁液を得、これを０℃に冷却し、濃HClで酸性化してpＨを２にした。有機層を、中性のpＨになるまでH2O (5 x 200 mL)で洗浄した後、乾燥してガラス状の固形物を得た(6.16 g)。この化合物を沸騰したn-ヘキサン (60 mL)中で１時間懸濁し、濾過してDを白色の固体として得た(5.53 g, 8.54 mmol)。全体の収率50％。
D． N-［４−［［４−［Bis［２−［［［4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル］アセチル］アミノ］エチル］アミノ-１,４−ジオキソブチル］アミノ］ベンゾイル］-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L244 (図13B)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。４−［N,N’-Bis［２−［(９−H-フルオレン−９−イル メトキシ) カルボニル］ アミノエチル］ アミノ］-４−オキソ酪酸(777.3 mg； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (184 mg； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(187 μL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて４０時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物を２０分間振盪した。溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ（2 x 7 mL)およびＣＨ2Ｃｌ2(5 x 7 mL)で洗浄した後、新しい試薬Ｂを加えたフラスコ内 (25 mL) で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 20 mL)で洗浄してFを白色の固体として得た(140 mg)。DOTA トリ−ｔ−ブチルエステル (112 mg； 0.178 mmol）、ＨＡＴＵ(70 mg； 0.178 mmol)およびDIEA (60 μL； 0.356 mmol)をDMA (3 mL)およびＣＨ2Ｃｌ2 (2 mL)中のF (50 mg； 0.0445 mmol)の溶液に加え、室温にて２４時間攪拌した。粗製物を留去して体積を減らし (1 mL)および試薬Ｂ (25 mL)とともに４．５時間振盪した。溶媒を留去した後、残留物をＥt2O (20 mL)で処理して沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (5 x 20 mL)で洗浄してベージュ色の固体を得た(132 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (100 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥してL244 (図13Ｃ） (3.5 mg； 1.84 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率0.8 ％。
実施例XIV〜実施例XLIIの一般的実験
L20１−L228
マニュアルカップリング
6.0当量の適当に保護されたアミノ酸をHOBTおよびDICそれぞれ６当量で処理し、反応容器の外で活性化した。次いで、ＮＭＰ中のこの活性化したカルボン酸をアミンを含有する樹脂に移し、４〜６時間反応を行った後、樹脂から溶液を排出し、洗浄した。
４−アミノ安息香酸およびアミノビフェニルカルボン酸 アミドへのFmoc-Gly-OHの特別なカップリング：
Fmoc-Gly-OH (10.0当量)をNMP (10 ｍLのNMPを１ｇのアミノ酸に用いた)中のHATU (10.0当量)およびDIEA (20.0当量)で処理し、この溶液を室温で10〜15分攪拌した後、アミンを加えた樹脂を含む容器に移した。溶液の体積を樹脂１グラムあたり15.0 mlとした。カップリングを室温で２０時間継続し、樹脂から全ての反応物を排出させた。この手順をさらにもう一回繰り返した後、ＮＭＰで洗浄した後、次の工程に進んだ。
D03A モノアミドの調製：
8.0当量のDOTAモノ酸をNMPに溶解し、8.0当量のHBTUおよび16.0当量のDIEAで処理した。この溶液を室温で１５分間攪拌した後、樹脂上のアミンに移し、カップリングを室温で２４時間継続した。樹脂から溶液を排出し、洗浄した後、ペプチドを切り離し、精製した。
粗製ペプチドの切り離しおよび精製：
樹脂を試薬Ｂに懸濁し (15.0 ml/g)、室温で４時間振盪した。次いで、この樹脂から溶液を除去し、2 x 5 ｍLの試薬Ｂで再度洗浄し、先程の濾液と合わせた。次いで、濾液を減圧下、室温にてペースト／液濃縮し、25.0 ｍLの無水エーテルでトリチュレーションした(使用した樹脂１ｇあたり）。次いで、この懸濁液を遠心し、エーテル層を傾斜した。この手順をさらに２回繰り返し、無色の沈殿をエーテルで洗浄した後、調製用ＨＰＬＣにより精製した。
実施例XIV−図21
L201の合成
0.5ｇのthe Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-M-樹脂 (0.4 mmol/g, 0.5g, 0.2 mmol) (樹脂 A)を用いた。残りのアミノ酸単位を一般的方法に記載したとおりに加え、(1R)-１−(Bis{２−[ビス（カルボキシメチル)アミノ]エチル}アミノ)プロパン-３−カルボン酸-１−カルボキシル-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L201)を調製した。収率：17.0 mg (5.4％)。
実施例XV−図22Aおよび22B
L202の合成
４−Fmoc-ヒドラジノ安息香酸 (図22A)：
水（100 ml)中の４−ヒドラジノ安息香酸 (5.0 g, 32.9 mmol)の懸濁液を炭酸セシウム (21.5 g, 66.0 mmol)で処理した。Fmoc-Cl (9.1 g, 35.0 mmol)のTHF (25 mL)溶液を、攪拌しながら１時間上記の溶液に滴加した。添加後、溶液をさらに４時間攪拌し、反応混合物を約75 mLに濃縮し、エーテル (2 x 100ｍL）で抽出した。エーテル層を廃棄し、水層 を2N HClで酸性化した。分離した固形物を濾過し、水（5 x 100 mL)で洗浄した後、アセトニトリルから再結晶して生成物 (化合物 B)を無色の固形物として得た。収率：11.0 g (89％). 1Ｈ ＮＭＲ (DMSO-d6) : δ 4.5 (m, 1H, Ar-ＣＨ2−ＣＨ）, 4.45 (m, 2H, Ar-ＣＨ2), 6.6 (bs, 1H, Ar-H), 7.4−7.9 (m, 9, Ar-HおよびAr-ＣＨ2), 8.3 (s, 2H, Ar-H), 9.6 (s, 2H, Ar-H). M. S.−m/z 373.2 [M-H]
0.5ｇのthe Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-M-樹脂 (0.4 mmol/g, 0.5g, 0.2 mmol) (樹脂 A)を用いた。化合物Ｂを含め、アミノ酸単位を一般的方法に記載したとおりに加え、N-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-４−ヒドラジノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L202)を調製した(図22B), 収率：25.0 mg (8.3％)
実施例XVI−図23Aおよび図23B
L203の合成
４−Boc-アミノベンジルベンゾエート 化合物Bの製造（図23A）:
乾燥アセトニトリル (10.0 mL)中の４−boc-アミノ安息香酸 (0.95 g, 4.0 mmol)の懸濁液を炭酸セシウム粉末 (1.3 g, 4.0 mmol)で処理し、窒素下で十分に攪拌した。臭化ベンジル (0.75 g, 4.4 mmol)を加え、反応混合物を窒素下で２０時間還流した。次いで、反応混合物を氷水（200 mL)に注ぎ、分離した固体を濾過し、水で洗浄した（5 x 50ｍL）。次いで、粗製物を水性メタノールから再結晶して生成物を無色の固形物として得た (化合物 B)。収率：0.8 g (61％)。1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3): δ 1.5 (s, 9H, Tertiary メチル), 5.4 (s, 2H, Ar-ＣＨ2), 7.4 (m, 7H, Ar-H)および8.0 (m, 2H, Ar-H). M. S.−m/z 326.1 [M+H].
４−アミノベンジル ベンゾエート 化合物 C 図23A:
４−Boc-アミノベンジル ベンゾエート (0.8 g, 2.5 mmol)をＴＦＡ (25％ by volume)を含むDCM (20 mL)に溶解し、室温で２時間攪拌した。反応混合物を100.0ｇの砕いた氷に注ぎ、飽和炭酸水素ナトリウム溶液でpＨが約8.5になるまで中和した。有機層を分離し、水層をDCM (3 x 20 mL)で抽出し、すべての有機層を合わせた。次いで、DCM層を1 x 50 ｍLの飽和炭酸水素ナトリウム、水（ 2 x 50 mL)および乾燥（硫酸ナトリウム) で洗浄した。溶媒を除去して無色の固形物(化合物 Ｃ）を得、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。収率：0.51 g (91％). 1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3): δ 5.3 (s, 2H, Ar-ＣＨ2), 6.6 (d, 2H, Ar-H, j =1.0 Hz), 7.4 (m, 5H, Ar-H, J = 1.0 Hz)および7.9 (d, 2H, Ar-H, J = 1.0 Hz).
４−(２−クロロアセチル)アミノベンジル ベンゾエート 化合物 D 図23A:
このアミン (0.51 g, 2.2 mmol)を乾燥ジメチルアセトアミド ( 5.0 mL) に溶解し、氷中で冷却した。クロロ塩化アセチル (0.28 g, 2.5 mmol)をシリンジで滴加し、溶液を室温にし、２時間攪拌し。さらに2.5 mmolのクロロ塩化アセチルを加え、攪拌をさらに２時間継続した。次いで、反応混合物を氷水（100ｍL）に投入した。沈殿した固体を濾過し、水で洗浄した後、ヘキサン/エーテルから再結晶して無色の固体を得た (化合物 D)。収率：0.38 g ( 56％ ). 1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3): δ 4.25 (s, 2H, ＣＨ2−Cl), 5.4 (s, 2H, Ar-H), 7.4 (m, 5H, Ar-H), 7.6 (d, 2H, Ar-H) , 8.2 (d, 2H, Ar-H)および8.4 (s, 1H, -ＣＯＮＨ).
ter-ブチル ２−{1,4,7,10-テトラアザ−7,10-ビス{[(tert−ブチル)オキシカルボニル]メチル}-４−[( N-{４−[ベンジルオキシカルボニル]フェニル}カルバモイル]シクロドデシル}acetate, 化合物 E 図23A:
ＤＯ３Ａ-トリ−ｔ−ブチルエステル.HCl (5.24 g, 9.5 mmol)を30.0 ｍLの乾燥アセトニトリルに懸濁し、無水 炭酸カリウム (2.76 g, 20 mmol)を加え、３０分間攪拌した。次いで、乾燥アセトニトリル (20.0 mL)中のクロロアセトアミド D (2.8 g, 9.2 mmol)を上記の混合物に１０分間滴加した。次いで、反応混合物を一晩攪拌した。この溶液を濾過した後、減圧下で濃縮してペーストを得た。このペーストを約200.0 ｍLの水に溶解し、5 x 50 ｍLの酢酸エチルで抽出した。集めた有機層を水（ 2 x 100 mL)で洗浄し、乾燥（硫酸ナトリウム)した。溶液を濾過し、減圧下でエバポレートしてペーストを得、このペーストをフラッシュシリカゲル (600.0 g)でクロマトグラフィーに付した。ＤＣＭ中の5％ メタノールで生成物を溶出した。TLC上で均一な画分の全てをプールし、留去して無色のがゴム物質を得た。このゴム状物質をイソプロピルエーテルおよびDCMから再結晶し、化合物 Eを製造した。収率：4.1 g (55％). 1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3): δ 1.5 (s, 27H, メチル), 2.0−3.75 (m, 24H, NＣＨ2s), 5.25 (d, 2H, Ar-ＣＨ2), 7.3 (m, 5H, Ar-H), 7.8 (d, 2H, Ar-H)および7.95(d, 2H, Ar-H). M. S.−m/z 804.3 [M+H].
化合物 Fの製造のための上記Eの還元, 図23A:
上記で得たベンジルエステル E (1.0 g, 1.24 mmol)をメタノール-水混合物(10.0 mL, 95:5) に溶解し、パラジウム炭素(10％, 0.2 g) を加えた。次いで、Parr apparatusを用い50.0 psiで８時間この溶液を水素化した。この溶液を濾過して触媒を除去した後、減圧下で濃縮して無色の綿状の固形物Ｆを得た。これは、さらに精製することなく、すぐに次の工程に用いた。MS: m/z 714.3 [M+Na].
L203の製造 図23B
上記の標準的なカップリング方法を用い、樹脂 [H-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂] 樹脂 Aおよび上記で得たF上で、上記の酸Fをこのアミンとカップリングした。0.5 g (0.2 mmol)の樹脂から31.5 mgの最終の精製されたペプチド(10.9％) N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L203)を得た(図23B)。
実施例XVII−図24
L204の合成
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.5 g, 0.2 mmol) (樹脂 A)を用いた。標準的なカップリング条件を用いて、Fmoc-Gly-OHを最初に加え、次いで上記手順により得たＦを加えた(図23A)。収率：24.5 mg (8.16％) of N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-４−アミノベンゾイル-グリシル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L204) (図24).
実施例XVIII−図25
L205の合成
Fmoc-６−アミノニコチン酸1を文献に記載されたとおりに製造し (“合成 of ジアシルhydrazine compiounds for therapeutic use”. Hoelzemann, G.； Goodman, S. (Ｍｅｒｃｋ Patent G.m.b.H.., Germany). Ger.Offen. 2000, 16 pp. CODEN: GWXXBX DE 19831710 A1 20000120)、予め加えたFmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.5 g, 0.2 mmol) 樹脂 A、次いで他のアミノ基と上記のとおりカップリングさせてN-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-４−アミノベンゾイル-グリシル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L205)を製造した。収率：1.28 mg (0.4％).
実施例XIX−図26Aおよび26B
L206の合成
4’-Fmoc-アミノ-3’-メチルビフェニル-４−カルボン酸 B:
アミノ酸(0.41 g, 1.8 mmol)を10.0 ｍLの水中の炭酸セシウム (0.98 g, 3.0 mmol)の溶液に溶解した。 “Rational Design of Diflunisal 類縁体 with Reduced Affinity for ヒト 血清 アルブミン “ Mao, H. et al J. Am. Chem. Soc., 2001, 123(43), 1042９−10435を参照。この溶液を氷浴中で冷却し、THF (10.0 mL)中のFmoc-Cl (0.52 g, 2.0 mmol)を十分に攪拌しながら滴加した。添加後、反応混合物を室温で２０時間攪拌した。次いで、この溶液を2N HClで酸性化した。沈殿した固体を濾過し、水（3 x 20 mL) で洗浄し、空気乾燥した。次いで、粗製の固体をアセトニトリルから再結晶して無色の綿状の固形物Ｂを得た図26A。収率：0.66 g (75％). 1Ｈ ＮＭＲ (DMSO-d6): δ 2.2 (s, Ar-Me), 4.25 (t, 1H, Ar-CH, j = 5Hz), 4.5 (d, 2H, O-ＣＨ2, j = 5.0 Hz), 7.1 (bs, 1H, ＣＯＮＨ), 7.4−8.0 (m, 8H, Ar-H)および9.75 (bs, 1H, -ＣＯＯＨ). M. S.: m/z 472.0 [M-H].
上記で得たこの酸Bを標準的なカップリング条件を用いてFmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.2g, 0.08 mmol) 樹脂Ａにカップリングした。さらなる基を上記のとおり加えてN-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]- [4’-アミノ-2’-メチル ビフェニル-４−カルボキシル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L206)を得た。収量 30.5 mg (24％)。
実施例XX−図27A-B
L207の合成
3’-Fmoc-アミノ-ビフェニル-３−カルボン酸を上記の手順を用いて対応するアミンから製造した。See “合成 of 3’-メチル-４−‘-ニトロビフェニルカルボン酸s by the反応 of ３−メチル-４−ニトロベンゼンneジアゾnium acetate with メチル ベンゾエート”, Boyland, E.およびGorrod, J., J. Chem. Soc., Abstracts (1962), 220９−11参照。
このアミン０．７ｇから0.81ｇのthe Fmoc-誘導体 (58％) (化合物 B, 図27A)を得た。1Ｈ ＮＭＲ (DMSO-d6): δ 4.3 (t, 1H, Ar-ＣＨ）, 4.5 (d, 2H, O-ＣＨ2), 7.2５−8.25 (m, 16H, Ar-H)および9.9 (s, 1H, -ＣＯＯＨ). M. S.−m/z 434 [M-H]
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.2g, 0.08 mmol) 樹脂を上記の酸Bおよび上記のさらなる基とカップリングした(図27B)。29.0 mgのN-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]- [3’-アミノ-ビフェニル-３−カルボキシル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L207)を製造した (23％)。
実施例XXI−図28
L208の合成
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.2g, 0.08 mmol)Ａを脱ブロック化し、カップリング剤としてHATUを用いてテレフタル酸とカップリングした。樹脂上で得られた酸をDICおよびNHSで活性化した後、エチレンジアミンとカップリングさせた。DOTA-モノ酸をこの樹脂上で最後にこのアミンとカップリングさせた。N-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]- [１,２−ジアミノエチル-テレフタリル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L208)を製造した（収量： 17.5 mg (14％)）。
実施例XXII−図29A〜B
L209の合成
Boc-Glu(G-OBn)-G-OBn:
Boc-グルタミン酸(5.0 g, 20.2 mol)をTHF (50.0 mL)に溶解し、氷浴中０℃に冷却した。HATU (15.61 g, 41.0 mmol)、次いでDIEA (6.5 g, 50.0 mmol)を加えた。反応混合物 を０℃で３０分間攪拌した。グリシンのベンジルエステル [8.45 g, 50 mmol, generated from neutralizing ベンジル グリシン ハイドロクロライドを炭酸ナトリウムにより中和し、DCMで抽出し、溶媒を留去することにより調製した]をTHF (25.0ｍL）に加えた。
反応混合物を室温にし、室温で２０時間攪拌した。全ての揮発性成分を減圧下で留去した。残留物を飽和 炭酸ナトリウム溶液 (100 mL)で処理し、酢酸エチル (3 x 100ｍL）で抽出した。有機層を合わせ、1N HCl ( 2x 100 mL)および水（2 x 100 mL)で洗浄し、乾燥（硫酸ナトリウム)した。この溶液を濾過し、溶媒を減圧下で留去してペーストを得、これをフラッシュシリカゲル (500.0 g)でクロマトグラフィーに付した。DCM中の2％ メタノールで溶出して、生成物を無色のペーストとして得た (化合物 B, 図29A)。収量8.5 g (74.5％)。1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3):δ 1.4 (s, 9H, -ＣＨ3s), 2.0−2.5 (m, 4H,-CH-ＣＨ2およびCO-ＣＨ）, 4.2 (m, 5H、Ｎ−ＣＨ2 CO), 5.15 (s, 4H, Ar-ＣＨ2), 5.45 (bs, 1H, Boc-NH), 7.3 (m, 10H, Ar-H)および7.6 (2bs, 2H, ＣＯＮＨ). M. S.−m/z 564.1 [M+H]. 分析用HPLC 保持時間−8.29分(純度>97％, 20-65％B（１５分）).
H-Glu(G-OBn)-G-OBn:
上記で得た完全に保護されたグルタミン酸誘導体 (1.7 g, 3.2 mmol) BをDCM/ＴＦＡ (4:1, 20 mL)に溶解し、TLCにより出発物質画商質するまで攪拌した (2時間)。反応混合物を氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム溶液（200 mL)に注ぎ、有機層を分離し、水層を2 x 50 ｍLのDCMで抽出し、有機層を集めた。DCM層を飽和炭酸水素ナトリウム (2 x 100 mL)、水（2 x 100 mL)で洗浄し、乾燥（硫酸ナトリウム)し、溶液を濾過し、減圧下でエバポレートし、残留物を減圧下で乾燥してガラス状物質(化合物 C, 図29A) を得、これをこれを精製することなく次の工程に用いた。収率：0.72 g (95％). M. S.−m/z 442.2 [M+H].
(DOTA-トリ−ｔ−ブチル)-Glu-(G-OBn)-G-OBn:
無水 DCM (10.0 mL)中の上記で得たアミン C (1.33 g, 3 mmol)をDOTA-トリ−ｔ−ブチルエステルの活性化溶液に加え [2.27 g, 3.6 mmolをHBTU, 1.36 g, 3.6 mmolおよびDIEA 1.04 g, 8 mmolで処理し、25 ｍLの乾燥DCM中室温にて３０分間攪拌した]室温で２０時間攪拌した。反応混合物200 ｍLのDCMで希釈し、飽和 炭酸ナトリウム (2 x 150 mL)で洗浄し、乾燥（硫酸ナトリウム)した。溶液を濾過し、溶媒を減圧下で留去して褐色のペーストを得た。粗製物をフラッシュシリカゲル (500.0 g)でクロマトグラフィーに付した。DCM 中の2％ メタノールで溶出し、生成物を無色のゴム状物質として得た(化合物Ｄ, 図29A). 収量：1.7 g (56.8％).1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3): δ 1.3および1.4 (2s, 9H,遊離塩基からそれぞれ得た３種類のメチルおよびDOTAのナトリウム付加体)。2.0−3.5 (m, 20H、Ｎ−ＣＨ2sおよびCH-ＣＨ2およびCO-ＣＨ2), 3.75−4.5 (m, 13H、Ｎ−ＣＨ2−CO), 5.2 (m, 4H, Ar-ＣＨ2)および7.25 (m, 10H, Ar-H). M. S. m/z−1018.3 [M+Na]および996.5 [M+H]および546.3 [M+Na+H]/2. HPLC−保持時間: 11.24分(>90％ , 20-80％ B（３０分間）).
(DOTA-トリ−ｔ−ブチル)-Glu-(G-OH)-G-OH:
上記で得たビス ベンジルエステル (0.2 g, 0.2 mmol) Dメタノール-水（20 mL, 9:1)に溶解し、10％ Ｐd/C 触媒 (0.4 g, 50％ by wt. 水) の存在下で50 psiにて水素化した。HPLCおよびTLC上で出発物質が消失したら（４時間）、溶液を濾過して触媒を除去し、溶媒を減圧下で留去して残留物を高真空下で約２０時間乾燥 (<0.1 mm)して生成物を無色の泡状物 (化合物 E, 図29A)として得た。収量0.12 g (73.5％)。1Ｈ ＮＭＲ (DMSO-d6): δ 1.3および1.4 (2s, 遊離塩基のメチルに対応する9HおよびDOTAのナトリウム付加体)。1.8−4.7 (m, 33H, NＣＨ2s, COＣＨ2およびCH-ＣＨ2およびNH-CH-CO), 8.1, 8.2および8.4 (3bs, ＮＨＣＯ). M. S.: m/z−816.3 [M+H]および838.3 [M+Na]. HPLC 保持時間: 3.52分(20-80％ B（３０分間）> 95％ 純度)。
H-８−アミノ-３,６−ジオキサオクタノイル-８−アミノ-３,６−ジオキサオクタノイル-Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2:
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.5 g, 0.2 mmol) Aを脱ブロック化し、８−アミノ-３,６−ジオキサオクタン酸と２回カップリングした後、調製用ＨＰＬＣで精製して上記の脱保護されたペプチド(化合物 F, 図29B)を得た。収量91.0 mg (37％).
HPLC 保持時間: 8.98分(>95％ 純度, 10-40％ B（１０分間）). M. S.: m/z−1230.6 [M+H], 615.9 [M+2H]/2.
ビス−酸Eと上記で得たアミンＦの溶液相のカップリング(図29B)
ビス−酸(13.5 mg, 0.0166 mmol) Eを100μLの乾燥アセトニトリルに溶解し、NHS (4.0 mg, 0.035 mmol)およびDIC (5.05 mg, 0.04 mmol)で処理し、室温で２４時間攪拌した。この活性化した酸に遊離アミン F (51.0 mg, 0.41 mmol)[generated from the ＴＦＡ salt by treatment with 飽和炭酸水素ナトリウムおよびfreeze drying the溶液 to 収率このアミン as a fluffy solid]、次いで100μLのNMPを加え、室温にて攪拌をさらに４０時間継続した。この溶液を無水エーテル (10 mL)で希釈し、沈殿を遠心により集め、2 x 10 ｍLの無水エーテルで再度洗浄した。次いで、粗製の固体を調製用ＨＰＬＣにより精製して生成物を、図２９Ｂのあるとおり無色の綿状の固体L209として得た。収量7.5 mg (14.7％)。
実施例XXIII−図30A-B
L210の合成
H-８−アミノオクタノイル-８−アミノオクタノイル-Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ＮＨ2:
これは、化合物 F 図29Bの場合とまったく同じようにして製造したが、１−アミノオクタン酸を用い、このアミン (化合物 B, 図30A)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。収量：95.0 mg (38.9％). HPLC 保持時間: 7.49分(>95％ 純度； 10-40％B （１０分間））M. S.: m/z−1222.7 [M+H], 611.8 [M+2H]/2.
(DOTA-トリ−ｔ−ブチル)-Glu-(G-OH)-G-OH (0.0163 g, 0.02 mmol)を、100μLの アセトニトリル中で、L209の場合と同じようにしてそのビス−NHSエステルに変換し、遊離塩基１00μLの NMP中の化合物 B (60.0 mg, 0.05 mmol) で処理し、反応を４０時間継続した後、上記のとおり処理および精製してL210を得た（図30B、収量11.0 mg (18％)）。
実施例XXIV−図31
L211の合成
標準的なプロトコルを用いて0.2ｇのFmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.08 mmol)から製造した。N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L211を製造した（収量4.7 mg (3.7％)）(図31).
実施例XXV−図32
L212の合成
標準的なプロトコルによって樹脂上で配列を構築することによって、Rink アミド Novagel 樹脂 (0.47 mmol/g, 0.2 g, 0.094 mmol)から製造した。N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L212を製造した（収量25.0 mg (17.7％)）(図32).
実施例XXVI−図33
L213の合成
Fmoc-Met-２−クロロトリチル クロリド 樹脂 (NovaBioChem, 0.78 mmol/g, 0.26 g, 0.2 mmol)から製造し、残りの配列を標準的な方法論を用いて構築した。N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニン L213 を製造した（収量49.05 mg (16.4％) (図33)。
実施例XXVII−図34
L214の合成
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.2 g, 0.08 mmol) Aを用い、標準的な条件を用いて、N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L214を得た。8.5 mg の生成物を得た(6.4％) (図34).
実施例XXVIII−図35
L215の合成
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.2 g, 0.08 mmol) Aを用いてN-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-アルギニル-L-ロイシル-グリシル-L-aspアルギニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L215を製造した。9.2 mg (5.5％) が得られた (図35)。
実施例XXIX−図36
L216の合成
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂 (0.2 g, 0.08 mmol) Aを用いてN-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-アルギニル-L-チオシニル-グリシル-L-aspアルギニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L216を製造した。25.0 mg (14.7％)が得られた (図36)。
実施例XXX−図37
L217の合成
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂Ａ(0.2g, 0.08 mmol)を用いてN-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-リシル−L-チオシニル-グリシル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L217を製造した。58.0 mg (34.7％)が得られた (図37)。
実施例XXXI−図38
L218の合成
Fmoc-Q(Trt)-W(BoＣ）-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹脂Ａ(0.2g, 0.08 mmol)を用いた。リジンの導入のためFmoc-Lys(ivDde)を用いた。直鎖状の配列が完成したらリジンの保護基をDMF 中の10％ヒドラジンを用いて脱離した(2 x 10 mL；それぞれ10分、次いで洗浄)。次いで、残りのアミノ酸を「一般的」の節で記載した手順を用いて導入し、必要なペプチド配列を完成させた。図３８のL218を収量40.0 mg (23.2％)で得た。
実施例XXXII−図39
L219の合成
４−スルファミルブチリル AM Novagel 樹脂を用いた(1.1 mmol/g； 0.5 g； 0.55 mmol)。最初のアミノ酸を−２０℃にて２０時間この樹脂に加えた。通常のカップリング手順を用いて残りの配列を完成させた。洗浄後、樹脂を20.0当量のヨードアセトニトリルおよび10.0当量のDIEAで２０時間アルキル化した。次いで、樹脂から溶液を除去し、洗浄した後、5.0 ｍLのTHF中の2.0当量のペンチルアミンで２０時間開裂させた。樹脂を2 x 5.0 ｍLのTHFで洗浄し、全ての濾液を合わせた。次いで、ＴＨＦを減圧下でエバポレートし、残留物を 10.0 ｍLの試薬Ｂで脱ブロック化し、ペプチド N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-アミノペンチル, L219を上記のとおり精製した。28.0 mg (2.8％)が得られた (図39)
実施例XXXIII- 図40
L220の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-D-アラニル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L220を製造した。31.5 mg (41.4％)が得られた (図40)。
実施例XXXIV−図41
L221の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-ロイシンアミド, L221を製造した。28.0 mg (34.3％)が得られた (図41)。
実施例XXXV−図42
L222の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-チオシニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-betaアラニル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-ノルロイシンアミド, L222を製造した。34.0 mg (40.0％)が得られた (図42).
実施例XXXVI−図43
L223の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-betaアラニル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-ノルロイシンアミド, L223を製造した。31.2 mg (37.1％)が得られた (図43)。
実施例XXXVII−図44
L224の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-グリシル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-ロイシンアミド, L224を製造した。30.0 mg (42.2％)が得られた (図44)。
実施例XXXVIII−図45
L225の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-ロイシル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリニル-グリシル-L-セリニル−L-フェニルアラニル-L-メチオニンアミド, L225を製造した。15.0 mg (20.4％)が得られた (図45)。
実施例XXXIX−図46
L226の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-ヒスチジル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L226を製造した。40.0 mg (52.9％)が得られた (図46).
実施例XL−図47
L227の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-ロイシル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-トレオリルl-グリシル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-メチオニンアミド L227を製造した。28.0 mg (36.7％)が得られた (図47).
実施例XLI−図48
L228の合成
NovaSyn TGR (0.25 mmol/g； 0.15 g, 0.05 mmol) 樹脂Ａを用いてN-[(3α,5α,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-メチオニンアミド, L228を製造した。26.0 mg (33.8％)が得られた (図48).
実施例 XLII−さらなるGRP化合物の合成
A．4,4’-アミノメチルビフェニルカルボン酸 (B2)および3,3’-アミノメチルビフェニルカルボン酸 (B3)の一般的製造方法:
1．メチル-ヒドロキシメチルビフェニルカルボキシレート:
商業的に入手可能な (Aldrich Chemical Co.) ４−ヒドロキシメチルフェニルホウ酸または３−ヒドロキシメチルフェニルホウ酸 (1.0 g, 6.58 mmol)を、溶液が均一になるまでイソプロパノール (10 mL)および2M 炭酸ナトリウム (16 mL)と共に攪拌した。この溶液を窒素をこの溶液に通気することにより脱気した後、固体のメチル-３−ブロモベンゾエートまたはメチル-４−ブロモベンゾエート (1.35 g, 6.3 mmol)、次いで、Ｐd (0) 触媒で処理した{[(C6H5)3P]4Ｐd； 0.023g, 0.003 mmol}。反応混合物を、ＴＬＣ解析により出発物質のブロモベンゾエートが消費されたと決定されるまで(２〜３時間）窒素下で還流温度に維持した。次いで、反応混合物を250 ｍLの水で希釈し、酢酸エチル (3 x 50ｍL）で抽出した。有機層を集め、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（2 x 50 mL)で洗浄し、乾燥（Ｎa2ＳＯ4)し、溶媒を減圧下で留去し、残留物をフラッシュシリカゲル (100 g)でクロマトグラフィーに付した。ヘキサン中の40％ 酢酸エチルで溶出して生成物を固体または油状物として得た。
収量：
B2 -0.45g (31％)；融点 170-171℃.
B3 0.69 g (62％)； 油.
1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3) δ B２− 3.94 (s,3H, -COＯＣＨ3), 4.73 (s, 2H, -ＣＨ2−Ph), 7.475 (d, 2H, J= 5Hz), 7.6 (d, 2H, J = 10 Hz), 7.65 (d, 2H, J = 5Hz)および8.09 (d, 2H, J = 10 Hz).
M. S.−m/e−243.0 [M+H]
B3−3.94 (s, 3H, -COＯＣＨ3), 4.76 (s, 2H, -ＣＨ2−Ph), 7.50 (m, 4H), 7.62 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 8.00 (s, 1H)および8.27 (s, 1H).
M. S.−m/e−243.2 [M+H]
2．アジドメチルビフェニル カルボキシレート:
乾燥ジクロロメタン (10 mL)中の上記のビフェニル アルコール (2.0 mmol)を氷中で冷却し、ジフェニルホスホリル アジド (2.2 mol)およびDＢＵ (2.0 mmol)で処理し、窒素下で２４時間攪拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチル (2 x 25ｍL）で抽出した。有機層を集め、0.5 M クエン酸溶液 (2 x 25 mL), 水（2 x 25 mL)で順次に洗浄し、乾燥（Ｎa2ＳＯ4)した。この溶液を濾過し、減圧下でエバポレートして粗製物を得た。4,4’-異性体をヘキサン/エーテルから結晶化し、3,3’-異性体をイソプロピルエーテルでトリチュレーションして全ての不純物を除去した；ＴＬＣ解析により生成物は均一であり、さらなる精製は不要であった。
収率：
メチル-４−アジドメチル-４−ビフェニルカルボキシレート−0.245 g (46％)；融点 10６−108℃.
メチル-４−アジドメチル-４−ビフェニルカルボキシレート−0.36 g (59％, 油)
1Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl3) δ - 4,4’-異性体−3.95 (s, 3H, -COＯＣＨ3), 4.41 (s, 2H, -ＣＨ2N3), 7.42 (d, 2H, J = 5 Hz), 7.66 (m, 4H)および8.11 (d, 2H, J = 5 Hz)
3,3’-異性体−3.94 (s, 3H, -COＯＣＨ3), 4.41 (s, 2H, -ＣＨ2N3), 7.2６−7.6 (m, 5H), 7.76 (d, 1H, J = 10 Hz), 8.02 (d, 1H, J = 5 Hz)および8.27 (s, 1H).
3．フェニルカルボキシレートのメチル エステルの加水分解:
約４mmolのメチル エステルを20 ｍLの2M 水酸化リチウム溶液で処理し、溶液が均一になるまで攪拌した (20〜24時間)。水層を2 x 50 ｍLのエーテルで抽出し、有機層を廃棄した。次いで、水層を0.5 M クエン酸で酸性化し、沈殿した固体を濾過し、乾燥した。さらなる精製は不要であり、この酸を次の工程に用いた。
収率：
4,4’-異性体−0.87ｇのメチルエステルから0.754ｇの酸(86.6％)を得た；融点 20５−210℃
3,3’-異性体−0.48ｇのメチルエステルから0.34ｇの酸(63.6％)を得た；融点 10２−105℃.
1Ｈ ＮＭＲ (DMSO-d6) δ: 4,4’-異性体−4.52 (s, 2H, -ＣＨ2N3), 7.50 (d, 2H, J = 5 Hz), 7.9 (m, 4H),および8.03 (d, 2H, J = 10 Hz)
3,3’-異性体−4.54 (s, 2H, -ＣＨ2N3), 7.4 ( d, 1H, J = 10 Hz), 7.５−7.7 (m, 4H), 7.92 (ABq, 2H)および8.19 (s, 1H).
4．アジドのアミンへの還元:
これを固相で行ったが、アミンは単離されなかった。アジドカルボン酸を標準的なペプチドカップリングプロトコルを用いて樹脂に加えた。洗浄した後、アジドを含む樹脂をTHF/水（95:5)中の20当量のトリフェニルホスフィンとともに２４時間振盪した。窒素の陽圧下で溶液を排出した後、標準的な洗浄手順を用いて洗浄した。得られたアミンを次のカップリングに用いた。
5．(3α, 5α, 7α, 12α)-３−[{(9H-フルオレン-9−イルメトキシ)アミノ]アセチル}アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸:
トリブチルアミン (3.2 mL)； 13.5 mmol) をTHF (80 mL)中のFmoc-グリシン (4.0 g, 13.5 mmol)の溶液に滴加し、０℃で攪拌した。イソブチルクロロホルメート (1.7 mL； 13.5 mmol)を順次に加え、１０分後、DMF (80 mL)中のトリブチルアミン (2.6 mL； 11.2 mmol)および(3α, 5α, 7α, 12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸(4.5 g； 11.2 mmol)の懸濁液を滴加し、１時間かけて冷却溶液にした。混合物を常温まで加温し、６時間後、この溶液を120 mLに濃縮した後、水（180 mL)および1N HCl (30 mL)を加えた(最終のpＨ1.5)。沈殿した固体を濾過し、水で洗浄した（2 x 100 mL), 真空乾燥し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。クロロホルム/メタノール (8:2)で溶出して、生成物を無色の固体として得た。
収量：１．９ｇ(25％)。TLC: Rf 0.30 (CHCl3/MeOH/NH4OH−6:3:1)
化合物のインビトロおよびインビボ試験
実施例XLIII: PC3 細胞系におけるGRP 受容体のインビトロ結合アッセイ
図14 A-B
可能性のあるリード化合物を同定するために、GRP-Rに対する高い親和性を有する化合物を同定するインビトロアッセイを用いた。ヒト前立腺癌に由来するPC3 細胞系は、細胞表面上のＧＲＰ−Ｒの高度の発現を示すことが知られているので、９６ウェルプレートフォーマットでの放射性リガンド結合アッセイを開発し、GRP-R陽性PC3 細胞に対する125I-ＢＢＮの結合およびこの結合を阻害する本発明の化合物の能力を測定した。このアッセイは、GRP-Rに対する125I-ＢＢＮの結合を阻害するRP527リガンド, L134リガンド (コントロール)および本発明の化合物のIC50を測定するために用いた。
(RP527 =Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン-Ser-Cys(Acm)-Gly-５−アミノペンタン酸-ＢＢＮ （７−１４） [配列番号1], MS = 1442.6およびIC50 - 0.84)。Van de Wiele C, Dumont F et al., テクネチウム-99m RP527、GRP類縁体 for visualization of GRP 受容体-expressing malignancies: a feasibility study. Eur.J.Nucl.Med., (2000) 27； 169４−1699.； L134= ＤＯ３Ａ-モノアミド-８−アミノ-オクタン酸-ＢＢＮ （７−１４） [配列番号1]、MS=1467.0. L134はＤＯ３Ａ モノアミド-アミノオクタニル-ＢＢＮ[７−14]。
放射性リガンド 結合プレートアッセイを、放射性リガンドとして99mTc RP527もさらに用いてＢＢＮおよびＢＢＮ 類縁体(商業的に入手可能なＢＢＮおよびL1を含む) ついて行った。
A．材料および方法:
１．培養細胞
PC3 (ヒト 前立腺癌 細胞系)は、American Type Culture Collectionから入手し、組織培養フラスコ中、 (Corning) RPMI 1640中で培養した。この増殖培地には、最終濃度のペニシリン-ストレプトマイシン (100 units/mL)およびファンギゾン(0.25 μg/mL)に対して10％熱不活化FBS (Hyclone, SH30070.03), 10 mM HEPES (GibcoBRL, 15630-080),および抗生物質／抗真菌剤(GibcoBRL, 15240-062) を添加した。培養細胞は全て、5％ CO2/95％空気を含む３７℃の湿気のある環境に維持し、示す場合は、0.05％ トリプシン/EDTA (GibcoBRL 25300-054)を用いて定期的に継代した。実験用の細胞を、９６ウェル白／透明底マイクロタイタープレート(Falcon Optilux-I)または９６ウェル黒／透明コラーゲンＩCellwareプレート(Beckton Dickinson Biocoat)に、2.0x104/ウェルの濃度でプレートした。プレートしてから１日または２日目にプレートを結合試験に用いた。
2．結合緩衝液
RPMI 1640に20mM HEPES, 0.1％ BSA (w/v), 0.5 mM PMSF (AEBSF), バシトラシン (50 mg/500 ml)を添加、pH 7.4.
Perki n-Elmerから125I-ＢＢＮ (キャリアーフリー, 2200 Ci/mmole)を得た。
B．PC3 細胞におけるGRP-R に対する125I-ＢＢＮの競合アッセイ：
9６−ウェルのプレートアッセイを用いて、本発明の種々の化合物の125I-ＢＢＮのヒト GRP-Rに対する結合の阻害するIC50を決定した。一般的手順は以下のとおりである：
試験した化合物はすべて結合緩衝液に溶解し、結合緩衝液中で適当な希釈を行った。アッセイのためのPC3 細胞 (ヒト 前立腺癌 細胞系)を濃度 of 2.0x104/wellの濃度で希釈し、９６ウェル白／透明底マイクロタイタープレート(Falcon Optilux-I)または９６ウェル黒／透明コラーゲンＩCellwareプレート(Beckton Dickinson Biocoat)に、2.0x104/ウェルの濃度でプレートした。プレートしてから１日または２日目にプレートを結合試験に用いた。アッセイの前に細胞の密集度についてプレートをチェックし (集密度>90％)。アッセイは、RP527またはL134リガンド, (対照),または1.25x10-9M〜5x10-9Mの範囲の濃度の本発明の化合物を125I-ＢＢＮ (25,000 cpm／ウェル)とコインキュベーションした。７５μL／ウェルの分析容量でこれらの試験を継続した。各データポイントについて３つのウェルを用いた。適当な 溶液を添加した後、プレートを４度で１時間インキュベーションしてリガンド受容体複合体の内在化を防止した。２００μLの氷冷インキュベーション緩衝液を添加することによりインキュベーションを終了した。プレートを５回洗浄して、ブロットを乾燥した。放射能をLKB CompuGammaカウンターまたはマイクロプレートシンチレーションカウンターを用いて検出した。
RP527（対照）および本発明化合物L70の競合結合曲線は図14A-Bに示される。これらのデータは対照のRP527のIC５０が2.5nMであり、本発明の化合物であるL70のIC50が5nMであることを示している。対照のL134のIC50は5nMであった。試験したこれらの本発明化合物のIC50値を上の表１〜３に示す。これら化合物は対照の化合物と競合し、受容体に対する十分な親和性を有し、インビボでの受容体を有する細胞による取込を可能にすると考えられる。
C．内在化および流出アッセイ：
これらの試験を9６ウェルプレートにて行った。洗浄して血清 タンパク質を除去した後、PC3 細胞を125I-ＢＢＮ, 177Lu-L134または放射能標識した本発明の化合物と３７℃にて４０分間インキュベーションした。２００μLの氷冷結合緩衝液を添加することによりインキュベーションをストップした。結合緩衝液でプレートを２回洗浄した。表面に結合した放射性リガンドを除去するために、細胞を0.2M 酢酸 (生理食塩水中)（pH 2.8）と２分間インキュベーションした。プレートを遠心し、酸で洗浄した培地を集め手内在化されなかった放射能の量を測定した。細胞を集めて、内在化された125I-ＢＢＮの量を測定し、全てのサンプルをガンマカウンタで解析した。内在化アッセイのデータを、種々の時点で得たカウントと終了時（T40分）で得たカウントとを比較することにより標準化した。
流出試験は、PC3 細胞に125I-ＢＢＮまたは放射能標識した本発明の化合物を３７℃にて40分間導入させた後、結合しなかった物質を洗い流し、上記の通りにして内在化の百分率を測定した。次いで、細胞を３７℃の結合緩衝液に３時間まで再懸濁した。0.5, 1, 2, または3時間の時点で、初発の導入レベルに対する内在化の残存量を上記のとおり測定し、Table5に記録される流出百分率を計算するのに用いた。
Figure 0004836455
 I-ＢＢＮおよびL134（対照）および本発明の化合物のLu-177複合体の内在化および流出
これらのデータは、本発明の化合物が対照と同程度にPC3 細胞に内在化され保持されていることを示す。
実施例XLIV−Tc-標識GRP 化合物の調製
Table6に示される本発明化合物のペプチド溶液を、0.1％ＴＦＡ水溶液中1 mg/mLの濃度に調製した。塩化スズ溶液を、SnCl2.2H2O (20 mg/mL)を1 N HClに溶解することにより調製した。SnCl2溶液のアリコート (10 μL)を、13 mgのグルコン酸ナトリウムを水に溶解することにより調製したグルコン酸ナトリウム溶液に添加することにより、20 μgSnCl2.2H2O/100 μLを含有するグルコン酸錫溶液を調製した。50ｍgのＨＰ−γ−CDを1 ｍLの水に溶解することにより、ヒドロキシプロピルガンマシクロデキストリン [HP-γ-CD]溶液を調製した。
以下に示す99mTc 標識化合物を、20 μLの非標識化合物 (20 μg)溶液、50 μLの HP-γ-CD溶液, 100 μLの S n-グルコン酸溶液および20〜50 μLの 99mTc過テクネチウム酸(5〜8 mCi, Syncor)を混合することにより調製した。最終の体積は大体200 μLであり、最終のpＨは4.5〜5であった。反応混合物を１００℃に１５〜２０分間加熱した後、逆相HPLCにより解析して放射化学的純度 (RCP)を測定した。所望の生成物のピークをHPLCにより単離し、5 mg/mLのアスコルビン酸、16 mg/mL HP-γ-CDおよび50 mM リン酸塩緩衝液を含有するpＨ４．５の安定化緩衝液に集め、急速吸引を用いて濃縮してアセトニトリルを留去した。解析および精製に用いたHPLC系は以下のとおりである: C18 Vydac カラム, 4.6 x 250 mm, 水相: 0.1％ＴＦＡ（水中）, 有機相: 0.085％ ＴＦＡ（アセトニトリル）。流速：1 mL/分間。個々のペプチドの性質に応じて20％〜25％ アセトニトリル/0.085％ ＴＦＡの定組成溶離を用いた。
標識結果をTable 6にまとめる。
Figure 0004836455
実施例XLV−細胞結合および生体内分布試験のための177Lu-L64の調製
この化合物は10 μgのL64リガンド (10μLの１mg/mL水溶液)、100 μLの酢酸アンモニウム緩衝液 (0.2M, pH 5.2)および約１〜2 mCiの177LuCl3（0.05N HCl） (MURR)を90℃で15 分間インキュベーションすることにより合成した。遊離の177Luを20 μLの1％ Na2EDTA.2H2O (AldriＣＨ）水溶液を添加することにより除去した。得られた放射化学的純度 (RCP)は約95％であった。放射能標識した生成物を、HPLCにより、非標識リガンドおよび他の不純物から分離した（YMC Basic C8 カラム [4.6 x 150 mm]、カラム温度30℃および流速1 mL／分、68％A/32％B〜66％A/34％Bのグラジェント（30 分間）、Ａはクエン酸緩衝液 (0.02M, pH 3.0)であり、Ｂは80％ ＣＨ3CN/20％ ＣＨ3OHである）。単離された化合物のＲＣＰは約１００％であり、HPLC 保持時間は23.4分であった。
生体内分布および細胞結合のためのサンプルは、所望のＨＰＬＣピークを１０００μLのクエン酸緩衝液 (0.05 M, pH 5.3, １％のアスコルビン酸および0.1％ HSAを含有する)に回収することにより調製した。回収した溶出液中の有機の溶離液を３０分間遠心濃縮することにより留去した。細胞結合試験については、精製したサンプルをインビトロ試験の３０分以内に細胞結合緩培地で希釈して1.5 μCi/mLの濃度にした。生体内分布試験については、サンプルをクエン酸緩衝液 (0.05 M, pH 5.3, 1％ アスコルビン酸ナトリウムおよび0.1％ HSAを含有する)で希釈してインビボ試験の３０分以内に最終濃度50 μCi/mLにした。
実施例XLVI−放射線治療試験のための177Lu-L64の調製:
この化合物は、70 μgのL64リガンド (70 μLの1 mg/mL水溶液), 200 μLの酢酸アンモニウム緩衝液(0.2M, pH 5.2)および約30〜40 mCiの177LuCl3(MURR)（0.05N HCl中）85℃で10 分間インキュベーションすることにより合成した。室温に冷却した後、遊離の177Lu 20 μLの2％ Na2EDTA.2H2O (AldriＣＨ）水溶液を添加することにより除去した。得られた放射化学的純度(RCP)は約95％であった。この放射能標識した生成物を、HPLCにより、非標識リガンドおよび他の不純物から分離した（300VHP 陰イオン交換カラム (7.5 x 50 mm) (VydaＣ）を用い、流速 1 mL／分で水、50％ アセトニトリル/水次いで1g/L酢酸アンモニウム水溶液で順次に溶出する）。所望の化合物を50％ＣＨ3CNによりカラムから溶出し、5％ アスコルビン酸, 0.2％ HSA,および0.9％ (v:v) ベンジルアルコールを含有する約１ｍLのクエン酸緩衝液 (0.05 M, pH 5.3)を混合した。単離した画分の有機部分を４０分間のスピンバキュームにより留去し、5％ アスコルビン酸, 0.2％ HSA,および0.9％ (v:v) ベンジルアルコールを含有するクエン酸緩衝液 (0.05 M, pH 5.3)を用いて、濃縮した溶液（約20〜25 mCi)をインビボ試験の３０分以内に7.5 mCi/mLの濃度に調整した。得られた化合物のRCPは>95％である。
実施例XLVII−111I n-L64の調製：
この化合物は10 μgのL64リガンド (5 μLの a 2 mg/mL溶液（0.01 N HCl中）), 60 μL エタノール, 1.12 mCiの111InCl3（0.05N HCl (80 μL)中）および155 μLの酢酸 ナトリウム緩衝液(0.5M, pH 4.5)を８５℃にて３０分間インキュベーションすることにより合成した。遊離の111Inを20 μLの1％ Na2EDTA.2H2O (Aldrich）水溶液を加えることにより除去した。得られた放射化学的純度 (RCP)は87％であった。放射能標識した生成物をHPLCにより、非標識リガンドおよび他の不純物から分離した（Vydac C18 カラム, [4.6x250 mm]、カラム温度50℃および流速1.5 mL/分間、75％A/25％B〜65％A/35％B のグラジェント（20分）、Ａは0.1％ ＴＦＡ水溶液, Bは0.085％ ＴＦＡアセトニトリル溶液）。このシステムでの111I n-L64の保持時間は15.7 分間であった。単離した化合物のRCPは96.7％であった。
実施例XLVIII−177Lu-L134（対照）の調製
ペプチドのストック溶液は、L134リガンド (本明細書の一部を構成する、米国特許出願公開第2002/0054855およびWO 02/87637に記載のとおり調製）を0.01 N HClに溶解し、1 mg/mLの濃度にすることにより調製した。177Lu-L134は以下に示す順序で試薬を混合することにより調製した。
0.2 M NH4ＯＡc, pH 6.8 100 μl
ペプチドストック, 1 mg/mL,（0.01 N HCl中） 5 μl
177LuCl3 (MURR)（0.05M HCl中） 1.2μl (1.4 mCi)
反応混合物を85 ℃で１０分間インキュベーションした。水浴中で室温に冷却した後、20 μLの1％EDTA溶液および20 μLのEtOHを加えた。化合物をC18 カラム (VYDAC カタログ番号# 218TP54) を用いるHPLCにより解析した（流速1 mL／分の 21〜25％のＢのグラジェント（２０分間）、Ａは0.1％ＴＦＡ/H2OでありＢは0.1％ＴＦＡ/ＣＨ3CNである)。177Lu-L134の収率は97.1％ (RCP)でありこの系での保持時間は約16.1分であった。
実施例XLIX−177Lu-L63の調製
化合物は、177Lu-L134について記載したとおりに製造した。化合物をC18 カラム (VYDAC カタログ番号# 218TP54) を用いるHPLCにより解析した（流速1 mL／分の ３０〜３４％のＢのグラジェント（２０分間）、Ａは0.1％ＴＦＡ/H2OでありＢは0.1％ＴＦＡ/ＣＨ3CNである)。177Lu-L63のRCPは97.8％であり、この系での保持時間は約14.2分であった。
実施例L−細胞結合および生体内分布試験のための177Lu-L70の調製：
この化合物は、L70（実施例ＩＩのリガンド）に置き換えて上に記載した手順にしたがって製造した。YMC Basic C8 カラム (4.6 x 150 mm)を用いて精製を行った（カラム温度30℃および流速1 mL/分間、80％A/20％B〜75％A/25％Bのグラジェント（４０分間）、Ａはクエン酸緩衝液 (0.02M, pH 4.5)であり、Ｂは80％ ＣＨ3CN/20％ ＣＨ3OH）。単離された化合物のＲＣＰは約100％であり、HPLC 保持時間は25.4 分であった。
実施例LI−放射線治療試験のための177Lu-L70の調製:
この化合物はL64について記載したとおりに製造した。
実施例LII−細胞結合および生体内分布試験のための111I n-L70の調製:
この化合物は、10 μgのL70リガンド (10 μLの1 mg/mL溶液（0.01 N HCl中）), 180 μLの酢酸アンモニウム緩衝液(0.2M, pH 5.3), 1.1 mCiの111InCl3（0.05N HCl中） (61 μL, Mallinckrodt)および50 μLの生理食塩水を８５℃にて３０分間インキュベーションすることにより合成した。遊離の111Inを20 μLの1％ Na2EDTA.2H2O (AldriＣＨ）水溶液を加えることにより除去した。得られた放射化学的純度 (RCP)は86％であった。放射能標識した生成物をHPLCにより、非標識リガンドおよび他の不純物から分離した（Vydac 強陰イオン交換カラム [7.5 x 50 mm]につないだWaters XTerra C18カートリッジ、カラム温度30℃および流速1 mL/分間、以下のTableに記載のグラジェント、Ａは0.1 mM NaOH水溶液（pH 10.0）であり、Bは1 g/L 酢酸アンモニウム水溶液（pH 6.7）であり、Cはアセトニトリルである。この系では、111I n-L70の保持時間は15分であり、L70リガンドの保持時間は27〜28分間である。単離された化合物のＲＣＰは96％であった。
生体内分布および細胞結合試験のためのサンプルは、望ましい HPLCピークを500 μLの クエン酸緩衝液 (0.05 M, pH 5.3, 5％ アスコルビン酸, 1 mg/mL L-メチオニンおよび0.2％ HSAを含有する)中に回収することにより調製した。
回収液の有機部分を３０分間のスピンバキュームにより留去した。細胞結合試験については、精製し、濃縮したサンプルをインビトロ試験で３０分以内に用いた。生体内分布試験について、サンプルをクエン酸緩衝液 (0.05 M, pH 5.3, 5％ アスコルビン酸ナトリウムおよび0.2％ HSA)で、インビボ試験で３０分以内に希釈して最終濃度を10μCi/mLにした。
Figure 0004836455
実施例LIII−インビボ薬物動力学試験
Ａ．トレーサー線量生体内分布：
低用量薬物動態試験（例えば生体内分布試験）は、異種移植したＰＣ３腫瘍を有するヌードマウス（［Ｎｃｒ］−Ｆｏｘｎ１＜ｎｕ＞）において以下に示す本発明化合物を用いて行った。すべての試験において、群（ｎ＝３〜４）あたり１および２４時間の滞留時間で、177Ｌｕ標識試験化合物１００μＬを２００μＣｉ／ｋｇにてマウスに投与した。適切な基準を用いてLKB 1282 CompuGammaカウンターにて組織を分析した。
Figure 0004836455
 Ｌｕ−１７７標識本発明化合物の対照と比較したＰＣ３腫瘍保持ヌードマウス（２００μＣｉ／ｋｇ；％ＩＤ／ｇとしての値）における１時間と２４時間における薬物動態的比較
Ｌ６４およびＬ７０の注入後の血液、肝臓および腎臓における放射能の分布が対照化合物Ｌ１３４のものと類似である一方、腫瘍の摂取はＬ６４およびＬ７０両方についての１および２４時間においてもっとも高いものであった。Ｌ６３はまた、初期の段階で血液および肝臓値が増大したにもかかわらず、高腫瘍摂取を示した。ＧＲＰ受容体を有すると知られている正常組織であるマウス膵臓における摂取は、Ｌ１３４よりもＬ６４、Ｌ７０およびＬ６３についてはるかに高い。
実施例LIV-受容体 サブタイプ特異性
現在、GRP 受容体ファミリーの次の４種類の哺乳類メンバーが知られている：GRP受容体(GRP-R), ニューロメジンＢ受容体 (NMB-R)、ボンベシン受容体サブタイプ３(BB３−R)およびBB4受容体 サブタイプ。177Lu-L245の受容体サブタイプの特異性を調べた。結果は、177Lu-L245がGRP-RおよびNMB-Rに特異的に結合し、BB３−Rに対する親和性がほとんどないことを示している。L245 [177Lu-L24]のルテチウム複合体(上記のとおり製造した)のサブタイプ特異性を、Reubi et al., “ボンベシン 受容体 サブタイプ in ヒト 癌: Detection with the Universal 放射性リガンド (125)I-[D-TYR(6),ベータ-ALA, PHE(13), NLE(14)] ボンベシン (６−14)”, Clin.癌 Res. 8:113９−1146 (2002)に記載されている手順を用いるインビトロ 受容体オートラジオグラフィーおよびGRP 受容体の１種類のサブタイプのみを発現することが予め分かっている組織サンプルを用いることにより実証した。ヒト の回腸カルチノイド組織をNMB-Rの供給源として、ヒト前立腺癌をGRP-Rの供給源として、およびヒト気管支カルチノイドをBB３−R サブタイプ 受容体の供給源として用いた。ユニバーサルリガンドとして知られている化合物125I-[DTyr6, βAla11, Phe13, Nle14]-ＢＢＮ(６−14)（GRP-Rの３つの全てのサブタイプに結合する）をポジティブコントロールとして用いた。結果を以下に示す。
Figure 0004836455
 これらの結果はL245 誘導体は、主としてGRP-Rを発現するヒト前立腺癌によく結合すると考えられるということを示している。また、L245 誘導体は、正常なヒト膵臓 (主としてBB３−R 受容体を発現する)または主としてBB３−R 受容体 サブタイプを発現する癌にはあまり結合しないと考えられるということを示している。
実施例LV−放射線治療試験
Ａ．短期間有効性研究：
ＰＣ３腫瘍保持ヌードマウスモデルを用いた放射線治療研究を行った。本発明のＬｕ−１７７標識化合物Ｌ６４、Ｌ７０、Ｌ６３および治療対照化合物Ｌ１３４を未治療対照群と比較した（各治療群についてｎ＝１２であり、未治療対照群についてｎ＝３６である）。最初の研究について、無菌条件下、本発明の１７７Ｌｕ標識化合物１００μＬを３０ｍＣｉ／ｋｇにてマウスに静脈注射または皮下注射により投与した。３０日まで対象を仕切った環境で飼育した。体重および腫瘍サイズ（キャリパー測定による）を研究期間中、各対象にて毎週３回集めた。期限前終了についての基準としては次が挙げられる：死亡；総体重（ＴＢＷ）の２０％以上の欠乏；２ｃｍ３以上の腫瘍サイズ。結果を図１５Ａに示す。これらの結果により、Ｌ７０、Ｌ６４またはＬ６３で治療された動物は、未治療の対照動物および同用量のＬ１３４を投与された動物よりも生存期間が増大したことが示された。
繰り返し研究は、前と同じ用量のＬ６４およびＬ７０を用いて行ったが、化合物あたりより多くの動物（ｎ＝４６）を用い、より長い期間用いた。繰り返し研究の結果を図１５Ｂに示した。前と同じ対照（ｎ＝３６）と比較して、Ｌ６４およびＬ７０治療は有意に生存期間を増大させ（ｐ＜０．０００１）、Ｌ７０はＬ６４よりも増大させた（ｐ０．０７９）。
実施例LVI
セグメントカップリングを用いたL64およびL70の製造別法
化合物 L64およびL70は、一般にＡ〜Ｄ（図１９）に示した中間体の集合を用いて製造することができ、それ自身は固相および溶液相のペプチド合成の分野で知られている標準的な方法で製造する (本明細書の一部を構成する合成ペプチド−A User’s Guide 1992, Grant, G., Ed. WH. Freeman Co., NY, Chap 3およびChap 4 pp 77−258； Chan, W.C.およびWhite, P.D. Basic Procedures in Fmoc 固相ペプチド合成−A Practical ApprＯＡch 2002, Chan, W.C.およびWhite, P.D. Eds Oxford University Press, New York, Chap. 3 pp 41−76； Barlos, KおよびGatos, G. Convergentペプチド合成 in Fmoc 固相ペプチド合成−A Practical ApprＯＡch 2002, Chan, W.C.およびWhite, P.D. Eds Oxford University Press, New York, Chap. 9 pp 216−228.)。
これらの方法には、Aloc, Boc, Fmocまたはベンジルオキシカルボニル-ベースのペプチド合成法または固相でのまたは溶液中でのこれらの方法の慎重に選択された組み合わせ
が含まれる。与えられた工程で使用する中間体は、図１に示す基のリストから選択することができる、その分子のそれぞれの位置についての適当な保護基の選択に基づいて選択する。当業者はさらに、ペプチド合成の方法論に適合し、別の保護基からなる中間体も使用することができ、上に示した保護基についての例示した選択肢が実例であって、包括的なものではなく、そのような選択肢が当分野においてよく知られていることを理解する。
これは、この方法を説明している図２０に十分に示されている。同じ合成方法を利用した場合、L64の合成において示したＣ１の中間体をＣ２に置き換えることによりＬ７０を生じる。
実施例LVII−図49および50
Ｌ69の合成
概要：(3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸AとFmoc-Clの反応により、中間体Bを得た。オクタペプチド GlnTrpAlaValGlyHisLeuMetＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14]) (A)で官能化したRink アミド樹脂を、B, Fmoc-８−アミノ-３,６−ジオキサオクタン酸およびDOTA トリ−ｔ−ブチルエステルと順次に反応させた。試薬Ｂを用いて開裂し、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL230 B 24280を得た。全体の収率：4.2％。
A．(3β,5β,7α,12α)-３−(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸, B (図49)
１,４−ジオキサン (18 mL)中の９−フルオレニルメトキシカルボニル クロリド (1.4 g； 5.4 mmol) の溶液を、10％ aq. Ｎa2CO3 (30 mL)および１,４−ジオキサン (18 mL)中の０℃で攪拌した(3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸A (2.0 g； 4.9 mmol) (3)の懸濁液に滴加した。室温にて６時間攪拌した後、H2O (100 mL)を加え、水相をＥt2O (2 x 90 mL)で洗浄した後、2 M HCl (15 mL)を加え(最終のpH：1.5)。沈殿した固体を濾過し、H2O (3 x 100 mL)で洗浄し、真空乾燥した後、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して Bを白色の固体として得た。(2.2 g； 3.5 mmol). 収率71％。
B． N-[3β,5β,7α,12α)-３−[[[２−[２−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-７,１２−ジヒドロキシ-2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L69 (図50)
樹脂Ａ(0.5 g； 0.3 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。(3β,5β,7α,12α)-３−(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸B (0.75 g； 1.2 mmol)、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt) (0.18 g； 1.2 mmol), N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド (DIＣ） (0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL) をこの樹脂に加え、混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。Fmoc-８−アミノ-３,６−ジオキサオクタン酸 (0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL； 1.2 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて３時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。次いで、この樹脂をDMA (7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、DMA (7 mL)中の新しい50％モルホリンを加え、混合物をさらに２０分間振盪し溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7 mL) 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸トリス（１,１−ジメチルエチル)エステル付加体をNaCl(0.79 g； 1.2 mmol)、ＨＯＢＴ (0.18 g； 1.2 mmol)、ＤＩＣ(0.19 mL: 1.2 mmol), N-エチルジイソプロピルアミン (0.40 mL； 2.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂ(25 mL) (2)を加えたフラスコ内で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(248 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (50 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して L69 (6.5 mg； 3.5 x 10-3 mmol) (図50）を白色の固体として得た。収率5.8％。
実施例 LVIII−図51
L144の合成
概要：オクタペプチドで官能化したRinkアミド樹脂
GlnTrpAlaValGlyHisLeuMetＮＨ2 (ＢＢＮ[７−14]) (A)を４−[２−ヒドロキシ−３−[4,7,10-トリス[２−(１,１−ジメチルエトキシ)-２−オキソエチル]-1,4,7,10-テトラザシクロドデカー１−イル]プロポキシ] 安息香酸と反応させた。試薬Ｂ(2)を用いて開裂し、脱保護した後、粗製物を調製用ＨＰＬＣにより精製してL144を得た。全体の収率：12％。
A．N-[４−[２−ヒドロキシ−３−[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]プロポキシ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L144 (図51)
樹脂Ａ(0.4 g； 0.24 mmol)を固相ペプチド合成容器内でDMA(7 mL)中の50％モルホリンとともに１０分間振盪し、溶液を除去し、新しい50％ モルホリンDMA (7 mL)溶液を加えた。この懸濁液さらに２０分間攪拌した後溶液を除去し、樹脂をＤＭＡで洗浄した（5 x 7ｍL）。４−[２−ヒドロキシ−３−[4,7,10-トリス[２−(１,１−ジメチルエトキシ)-２−オキソエチル]-1,4,7,10-テトラザシクロドデカー１−イル]プロポキシ] 安息香酸 B (0.5 g； 0.7 mmol)、ＨＯＢＴ (0.11 g； 0.7 mmol)、ＤＩＣ(0.11 mL； 0.7 mmol))、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン (0.24 mL； 1.4 mmol)およびDMA (7 mL)とともに樹脂に加えた。混合物を室温にて２４時間振盪し、溶液を除去し、樹脂をＤＭＡ (5 x 7 mL)、ＣＨ2Ｃｌ2 (5 x 7 mL)で洗浄し、減圧乾燥した。樹脂を、新しい試薬Ｂ(25 mL) (2)を加えたフラスコ内で４．５時間振盪した。樹脂を濾過し、溶液を減圧留去して粗製の油状物を得、これをＥt2O (20 mL）で処理した後、沈殿を得た。沈殿を遠心により集め、Ｅt2O (3 x 20 mL)で洗浄し、固形物を得(240 mg)、これをHPLCにより解析した。粗製物 (60 mg)を調製用ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥してL144 (10.5 mg； 7.2 x 10-3 mmol）を白色の固体として得た。収率12％。
A (メチル-(3β, 5β)-３−アミノコラン-2４−エート)およびB ( (3β, 5β)-３−アミノコラン-2４−酸)からの、実施例Ｉに記載の中間体 C ((3β, 5β)-３−(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノコラン-2４−酸)の合成の一連の化学反応を示す。 実施例Ｉに記載のN-[(3β,5β)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ] アセチル]アミノ] コラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L62) の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＩに記載のN-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L70) の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＩに記載のN-[４−[２−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]エトキシ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L73)、Ｎ−[３−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L115),および N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]フェニルアセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L116) の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＩに記載のN-[４−[２−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]エトキシ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L73)の合成のための図２Bのの合成反応に用いたリンカーの化学構造である。 実施例ＩＩに記載のN-[３−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L115)の合成のための図２Bの合成反応に用いたリンカーの化学構造である。 実施例ＩＩに記載のN-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]フェニルアセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L116) の合成のための図２Bのの合成反応に用いたリンカーの化学構造である。 実施例ＩＩに記載のN-[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]グリシル-４−ピペリジンカルボニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L74) の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＩＩに記載の中間体 (3β,5β)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-1２−オキソコラン−2４−酸(Ｃ）の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＩＩに記載のN-[(3β,5β)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-12,2４−ジオキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L67) の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＩＩに記載の(3β,5β)-３−アミノ-1２−オキソコラン−2４−酸(B) の化学構造である。 実施例ＩＩＩに記載の(3β,5β)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-1２−オキソコラン−2４−酸(Ｃ）の化学構造である。 実施例ＩＩＩに記載のN-[(3β,5β)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-12,2４−ジオキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L67) の化学構造である。 実施例ＩＶに記載の中間体 (3β,5β,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-1２−ヒドロキシコラン-2４−酸(3a)および(3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸(3b) を得るための一連の化学反応を示す。 実施例ＩＶに記載のN-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-1２−ヒドロキシ−2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L63) の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＶに記載のN-[(3β,5β,7α,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロ ドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-７,１２−ジヒドロキシ-2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L64) の合成の一連の化学反応を示す。 実施例ＩＶに記載の(3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸(2b)の化学構造である。 実施例ＩＶに記載の(3β,5β,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-1２−ヒドロキシコラン-2４−酸(3a) の化学構造である。 実施例ＩＶに記載の(3β,5β,7α,12α)-３−[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ]アセチル]アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸(3b)の化学構造である。 実施例ＩＶに記載のN-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-1２−ヒドロキシ−2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L63) の化学構造である。 実施例ＩＶに記載のN-[(3β,5β,7α,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロ ドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-７,１２−ジヒドロキシ-2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L64) の化学構造である。 実施例Ｖに記載の４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]ベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L71)；およびトランス−４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]シクロヘキシルカルボニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L72)の合成の一連の化学反応（リンカーはそれぞれ図5Bおよび5Cのものである）を示す。 図5Aに示したおよび実施例Ｖに記載の化合物 L71に用いたリンカーの化学構造である。 図5Aに示したおよび実施例Ｖに記載の化合物 L72に用いたリンカーの化学構造である。 実施例Ｖに記載のボンベシン[７−14] (B)で官能化された Rink アミド 樹脂の化学構造である。 実施例Ｖに記載のトランス−４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]シクロヘキサンカルボン酸 (D) の化学構造である。 実施例ＶＩに記載の中間体 リンカー ２−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]安息香酸 (E) の合成のための一連の反応を示す。 実施例ＶＩに記載の中間体 リンカー ４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−ニトロ安息香酸 (H) の合成のための一連の反応を示す。 実施例ＶＩに記載のN-[２−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L75) の合成を示す。 実施例ＶＩに記載のN-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]-３−ニトロベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L76) の合成を示す。 実施例ＶＩに記載の(N-[2-[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカ-1-イル］アセチル]アミノ] メチル]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)(L75)の構造を示す。 実施例ＶＩに記載の(N-[4-[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカ-1-イル］アセチル]アミノ] メチル]-3-ニトロベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド)(L76)の構造を示す。 実施例ＶＩＩに記載の中間体 リンカー [４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]フェノキシ]酢酸 (E) の合成のための一連の反応を示す。 実施例ＶＩＩに記載のN-[[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]フェノキシ]アセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L124)の合成を示す。 実施例ＶＩＩに記載のN-[[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]フェノキシ]アセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L124) の化学構造である。 実施例ＶＩＩＩに記載の中間体 ４−[[[9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]メチル]-３−メトキシ安息香酸 (E) の合成のための一連の反応を示す。 実施例ＶＩＩＩに記載のN-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]-３−メトキシベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L125) の合成を示す。 実施例ＶＩＩＩに記載のN-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]メチル]-３−メトキシベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, (L125) の化学構造である。 実施例ＩＸに記載の３−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ安息香酸（B) の合成のための反応を示す。 実施例ＩＸに記載の６−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノナフトエ酸(Ｃ）の合成のための反応を示す。 実施例ＩＸに記載の４−[[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]メチルアミノ]安息香酸（D) の合成のための反応を示す。 実施例ＩＸに記載のN-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]フェニルアセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, (L146)； N-[３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L233)； N-[６−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル] アミノ]ナフトイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, (L234),および N-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル] メチルアミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, (L235) の合成のための反応を示す。 実施例Ｘに記載の７−[[ビス（１,１−ジメチルエトキシ)ホスフィニル]メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,10-三酢酸 4,10-ビス（１,１−ジメチルエチル)エステル Hの合成のための反応を示す。 実施例Ｘに記載のN-[４−[[[[[4,10-ビス（カルボキシメチル)-７−(ジヒドロキシホスフィニル)メチル-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル−L-メチオニンアミド, (L237) の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩに記載のＮ,Ｎ−ジメチルグリシル-L-セリニル−[S-[(アセチルアミノ)メチル]]-L-システイニル-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L238) の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩに記載のＮ,Ｎ−ジメチルグリシル-L-セリニル−[S-[(アセチルアミノ)メチル]]-L-システイニル-グリシル-(3β,5β,7α,12α)-３−アミノ-７,１２−ジヒドロキシ-2４−オキソコラン−2４−イル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド(L239)の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩＩに記載の４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−メトキシ安息香酸 (A) の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩＩに記載の４−[[ [(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−クロロ安息香酸（D) の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩＩに記載の４−[[[(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセチル]アミノ-３−メチル安息香酸 (E) の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩＩに記載のN-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]グリシル]アミノ]-３−メトキシベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-l-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L240)の化学構造である。 実施例ＸＩＩに記載の化合物 N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]グリシル]アミノ]３−クロロベンゾイル]L-グルタミニル-L-トリプトフィル-l-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, (L241) の化学構造である。 実施例ＸＩＩに記載のN-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]グリシル]アミノ]３−メチルベンゾイル]L-グルタミニル-L-トリプトフィル-l-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-ロイシル-L-メチオニンアミド (L242) の化学構造である。 実施例ＸＩＩＩに記載の４−［N,N’-Bis［２−［(９−H-フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル］アミノエチル］アミノ］-４−オキソ酪酸, (D) の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩＩＩに記載のN-［４−［［４−［Bis［２−［［［4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル］アセチル］アミノ］エチル］アミノ-１,４−ジオキソブチル］アミノ］ベンゾイル］-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, (L244) の合成のための反応を示す。 実施例ＸＩＩＩに記載の化合物 L244の化学構造である。 実施例XLIIIに記載した結合および競合曲線を示す。 実施例XLIIIに記載した結合および競合曲線を示す。 実施例LVに記載した放射線治療の結果を示す。 実施例LVに記載した他の放射線治療実験の結果を示す。 N-[４−[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10テトラアザシクロドデカー１−イル] アセチル]グリシル]アミノ]-L-リシニル-(3,6,9)-トリオキサウンデカン-１,１１−ジカルボン酸-３,７−ジデオキシ-３−アミノコール酸)-L-アルギニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L65) の化学構造である。 N-[２−S-[[[[[12α-ヒドロキシ−17α-(１−メチル-３−カルボキシプロピル)etioコラン−3β-カルバモイルメトキシエトキシエトキシアセチル]-アミノ -６−[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ] ヘキサノイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L66) の化学構造である。 N-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L70) の化学構造である。 N-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]-３−カルボキシプロピオニル]アミノ]アセチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L114) の化学構造である。 N-[４−[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]-２−ヒドロキシ−３−プロポキシ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L144) の化学構造である。 N-[(3β,5β,7α,12α)-３−[[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]エトキシエトキシ]アセチル]アミノ]-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L69) の化学構造である。 N-[４−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]フェニルアセチル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L146) の化学構造である。 実施例LVIに記載したＬ６４およびＬ７０を製造するために用いることができる中間体の化学構造を示す。 実施例LVIに記載したセグメントカップリングを用いるＬ６４の製造を示す。 (1R)-１−(Bis{２−[ビス（カルボキシメチル)アミノ]エチル}アミノ)プロパン-３−カルボン酸-１−カルボキシル-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L201) の製造を示す。 Ｌ２０２を製造するために用いた中間体化合物の化学構造を示す。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]-４−ヒドラジノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L202) の製造を示す。 Ｌ２０３を製造するために用いた中間体化合物の化学構造を示す。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L203) の製造を示す。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-４−アミノベンゾイル-グリシル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L204) の製造を示す。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-４−アミノベンゾイル-グリシル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L205) の製造を示す。 L206の製造に用いた中間体化合物の化学構造を示す. N-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]- [4’-アミノ-2’-メチル ビフェニル-４−カルボキシル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L206) の製造を示す。 L207の製造に用いた中間体化合物の化学構造を示す。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]- [3’-アミノ-ビフェニル-３−カルボキシル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L207) の製造を示す。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]- [１,２−ジアミノエチル-テレフタリル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L208) の製造を示す。 L209の製造に用いた中間体化合物の化学構造を示す。 L209の製造を示す。 L210の製造に用いた中間体化合物の化学構造を示す。 L210の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L211の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L212の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニン カルボキシレート L213の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L214の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-アルギニル-L-ロイシル-グリシル-L-aspアルギニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L215の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-アルギニル-L-チオシニル-グリシル-L-aspアルギニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L216の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-リシル−L-チオシニル-グリシル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド L217の化学構造である。 L218の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-アミノペンチル, L219の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-セリニル−L-バリル-D-アラニル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L220の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-ロイシンアミド, L221の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-D-チオシニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-betaアラニル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-ノルロイシンアミド, L222の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-フェニルアラニル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-betaアラニル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-ノルロイシンアミド, L223の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-グリシル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-ロイシンアミド, L224の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-ロイシル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリニル-グリシル-L-セリニル−L-フェニルアラニル-L-メチオニンアミド, L225の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-ヒスチジル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, L226の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-ロイシル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-セリニル−L-フェニルアラニル-L-メチオニンアミド L227の化学構造である。 N-[(3β,5β,12α)-３−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]-グリシル-４−アミノベンゾイル-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-フェニルアラニル-L-メチオニンアミド, L228の化学構造である。 実施例ＬＶＩＩに記載の(3β,5β,7α,12α)-３−(9H-フルオレン−９−イルメトキシ)アミノ-７,１２−ジヒドロキシコラン-2４−酸(B) の合成のための反応を示す。 実施例ＬＶＩＩに記載のN-[3β,5β,7α,12α)-３−[[[２−[２−[[[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-７,１２−ジヒドロキシ-2４−オキソコラン−2４−イル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド, (L69) の合成のための反応を示す。 実施例LVIIIに記載のN-[４−[２−ヒドロキシ−３−[4,7,10-トリス（カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカー１−イル]プロポキシ]ベンゾイル]-L-グルタミニル-L-トリプトフィル-L-アラニル-L-バリル-グリシル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-メチオニンアミド (L144) の合成のための反応を示す。

Claims (9)

  1. 一般式：
    Ｍ−Ｎ−Ｏ−Ｐ−Ｇ
    ［式中、
    Ｍは、放射性核種と複合体を形成していてもよいＤＯ３Ａであり；
    Ｎはアルファアミノ酸であり；
    Ｏは（３β,５β,１２α）−３−アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸または（３β,５β,７α,１２α）−３−アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸から選択される置換された胆汁酸であり；および
    Ｐは不在であり；および
    ＧはＱＷＡＶＧＨＬＭ−ＯＨ（配列番号１）、ＱＲＬＧＮＱＷＡＶＧＨＬＭ−ＮＨ 2 （配列番号３）、ＱＲＹＧＮＱＷＡＶＧＨＬＭ−ＮＨ 2 （配列番号４）、ＱＫＹＧＮＱＷＡＶＧＨＬＭ−ＮＨ 2 （配列番号５）、ＱＷＡＶＧＨＬ−ＮＨ−ペンチル（配列番号６）、ＱＷＳＶａＨＬＭ−ＮＨ 2 （配列番号７）（ここで「ａ」はアラニンである）、ＱＷＡＶＧＨＬＬ−ＮＨ 2 （配列番号８）、ＱＷＡＶ−Ｂａｌａ−ＨＦ−Ｎｌｅ−ＮＨ 2 （配列番号９）（ここで「Ｂａｌａ」はβアラニンであり、「Ｎｌｅ」はノルロイシンである）、ＱＷＡＧＨＦＬ−ＮＨ 2 （配列番号１０）、ＬＷＡＶＧＳＦＭ−ＮＨ 2 （配列番号１２）、ＨＷＡＶＧＨＬＭ−ＮＨ 2 （配列番号１３）、およびＱＷＡＶＧＨＦＭ−ＮＨ 2 （配列番号１４）からなる群から選択されるＧＲＰ受容体ターゲティングペプチドである］
    で示される化合物。
  2. 以下からなる群から選択される請求項１記載の化合物：
    ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,１２α）−３−アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに,ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）；
    ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,７α,１２α）−３−アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）。
  3. 請求項１に記載の化合物を含有する物質を注射用媒体に添加する工程を含んでなる診断用造影剤の製造方法。
  4. 請求項１に記載の化合物を含有する物質を注射用媒体に加える工程を含んでなる放射線治療薬の製造方法。
  5. 請求項２に記載の化合物を含有する物質を注射用媒体に加える工程を含んでなる放射線治療薬の製造方法。
  6. （ａ）樹脂および少なくとも１つのペプチド構成成分を含む溶液を固相ペプチド合成容器中で振盪し、
    （ｂ）該溶液をフラッシングし、
    （ｃ）該樹脂をＤＭＡで洗浄する
    工程を含んでなる、ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,７α,１２α）−３−アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）の合成方法であって、該少なくとも１つのペプチド構成成分が、ＤＭＡモルホリン、（３β,５β,７α,１２α）−３−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）アミノ］アセチル］アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸、ＨＯＢＴ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵまたはその混合物を含有し、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を各々、ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,７α,１２α）−３−アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）が得られるまで繰り返す、合成方法。
  7. ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,７α,１２α）−３−アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）の標識方法であって、
    ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,７α,１２α）−３−アミノ−７,１２−ジヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）、
    酢酸アンモニウム、
    177ＬｕＣｌ3または111ＩｎＣｌ3からなる群から選択される放射性金属前駆体、
    ＨＣｌ
    を含有する第１の溶液をインキュベーションし、
    該第１の溶液にＮａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏおよび水を含有する第２の溶液を加えて９５％を超える放射化学純度にする工程
    を含んでなる方法。
  8. （ａ）樹脂および少なくとも１つのペプチド構成成分を含む溶液を固相ペプチド合成容器中で振盪し、
    （ｂ）該溶液をフラッシングし、
    （ｃ）該樹脂をＤＭＡで洗浄する
    工程を含んでなる、ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,１２α）−３−アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）の合成方法であって、該少なくとも１つのペプチド構成成分が、ＤＭＡモルホリン、（３β,５β,１２α）−３−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）アミノ］アセチル］アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸、ＨＯＢＴ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵまたはその混合物を含有し、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を各々、ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,１２α）−３−アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）が得られるまで繰り返す、合成方法。
  9. ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,１２α）−３−アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）の標識方法であって、
    ＤＯ３Ａ−モノアミド−Ｇｌｙ−（３β,５β,１２α）−３−アミノ−１２−ヒドロキシコラン−２４−酸−ＢＢＮ（７−１４）（ここに、ＢＢＮ（７−１４）配列は配列番号１である）、
    酢酸アンモニウム、
    177 ＬｕＣｌ 3 または 111 ＩｎＣｌ 3 からなる群から選択される放射性金属前駆体、
    ＨＣｌ
    を含有する第１の溶液をインキュベーションし、
    該第１の溶液にＮａ 2 ＥＤＴＡ・２Ｈ 2 Ｏおよび水を含有する第２の溶液を加えて９５％を超える放射化学純度にする工程
    を含んでなる方法。
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