JPH01294700A - 追跡標識接合体 - Google Patents

追跡標識接合体

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JPH01294700A
JPH01294700A JP1084174A JP8417489A JPH01294700A JP H01294700 A JPH01294700 A JP H01294700A JP 1084174 A JP1084174 A JP 1084174A JP 8417489 A JP8417489 A JP 8417489A JP H01294700 A JPH01294700 A JP H01294700A
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Glen L Tolman
グレン・ルイス・トルマン
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EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はキレート中の金属の少くとも一部が診断または
治療適用に適した二官能性金属キレートへの共有結合コ
ンジュゲーションにより追跡標識された求標的生物活性
分子に関する。そのような求標的生物活性分子としては
抗体または抗体フラグメントまたはその他任意の哺乳類
の身体のある臓器、組織または細胞中に選択的に局在し
ている化合物があげられる。
診断および治療目的に放射能標識求標的生物活性分子（
以後本明細書中ではＢＡＭと称する）、特に抗体および
その他の蛋白質を使用することは非常に活発に行われて
いる分野である。そのような放射能標識の論義に関じて
はｒ　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｊ第４０巻第３
０３６〜３０４２頁（１９８０）および「Ｌ　Ｎｕｃｌ
ｏＭａｄ、　Ｊ第２３巻第８４０〜８５０頁（１９８２
）を参照されたい。放射標識抗体の最も広く使用されて
いる方法はニー１３１、ニー１２５またはニー１２３に
よる直接的沃素化である。しかしこれら放射性核種はあ
る種の線量計的な、セして画儂形成の不利点を有してい
る。ある種の金属放射性核種例えばＴｃ−９９ｍおよび
工ｎ−１１１はジシチレーション写真画像形成により適
している。しかし、これまではこれら金属放射性核種を
直接はとんどのＲＡＭに結合させることは困難であった
。その理由は一般に放射性核種とＲＡＭとの間には充分
な親和性が存在していないからである。
更にそのような結合がある場合には、その放射性核種の
結合が時によりＲＡＭの生物学的活性を部分的または完
全に消失させる結果となる。
これらの理由のために当該技術では、金属キレート剤を
使用する共有結合コンジュケ゛−ト化によって金属放射
性核種を用いるＢＡＭの放射能標識化が多くの八によシ
提案されている。例えばｒｓｃｉｅｎｃｅＪ第２０９巻
第２９５〜２９７頁（１９８０）によると、工ｎ−１１
１ジエチレントリアミンはンタ酢酸（ＤＴＰＡ　）で標
識付した心臓ミオシンの抗体および心筋梗塞のためのこ
の標識抗体の画像形成用使用が開示している。ｒＢｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、Ｊ第７７巻第５８１〜５８５
頁（１９７７）は金属放射性核種による人血清アルブミ
ンのような蛋白質の標識付のためのＤＴＩ’Ａの使用を
開示している。ｒｐｒｏｃ、　ｓｏｃ、　Ｅｃｐ、　Ｂ
ｉｏ１．　Ｍｅｄ、　Ｊ第１５１頁第２９７〜３０２頁
（１９７６）は工ｎ−１１１をキレート化しうる種々の
薬剤例えばトランスフェリン、　　Ｄ−ｄニジラミンお
よびデフエロキサミンへの抗体のコンジュゲーションを
開示している。ヨーロッパ特許出願第３５，７６５号明
細書は蛋白質（例えばＨ８Ａ　、ウロキナーゼ、フィブ
リノゲン）、抗生物質（例えば「プレオマイシン」、「
カナマイシン」）ホルモン、サツカライドおよび脂肪酸
を含む種々のＲＡＭの放射能標識のための二官能性キレ
ータ−としてのデフェロキサミンを開示している。ヨー
ロッノぐ特許出願第３８，５４６号明細書はＤＴＰＡ　
１エチレンジアミンテトラ酢酸（１！ｊ）Ｔ　Ａ　）お
よびエチレンジアミンを抗体、抗原および抗体フラグメ
ントを含む蛋白質の放射能標識のための二官能性キレー
タ−として開示している。米国特許第４，２８７，３６
２号明細書は蛋白質放射能標識のための二官能性キレー
ト剤として３−カルボキシ−２−オキソプロピオンアル
デヒドビス（Ｎ−メチルチオセミカルバゾン）　（ＯＰ
ＢＭＴ）およびその同族体を馴示している。米国特許第
５，９９４，９６６号および同第４．０４３，９９８号
各明細書およびｒ工ｎｔ、　１．　Ａｐｐ。
Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　　工５ｏｔｏｐｅｓＪ第２
９巻第６８７〜６９２頁（１９７８）によると二官能性
ＥＤＴム同族体例えば１−（ｐ−ベンゼンジアゾニウム
）　−ＫＤＴＡおよび１−ｐ−アミノフェニル−１！：
Ｄ’ｒＡを蛋白質標識用として開示している。ｒＪ　、
ＲａｄｉｏａｎａＬＣｈｅｍ、Ｊ第５７巻第５５３〜５
６４頁（１９８０）はＤＴＴＡ−アゾイミデートと呼ば
れる二官能性キレータ−としてのＤＴ１’Ａのアゾ誘導
体および工ｒｈ−１１１によるＨ８Ａ標識のためのその
使用を開示している。しかし、これまで記載されている
二官能性キレータ−の各々は一般に特定の金属放射性核
種を配位するために計画されている。従ってＲＡＭの生
物活性を保持させつつ、種々の金属陽イオンを配位しう
る、且つＢＡＭとコンジュケ゛−トしうるキレータ−を
開発することが望ましい。
更に現在の静脈内放射線写真用コントラスト剤は沃素化
芳香族化合物に基づいている。しかしながら、これら化
合物はしばしば有用な濃度においては生理学的に非和合
性であることが見出されている。従って生理学的に和合
性のそのような沃素化化合物に代るものを開発すること
が望ましい。
また急速に発展しつつある核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像形
成分野においては、特にＲＡＭとコンジュゲートしうる
場合の有用なコントラスト剤は価値あるものであろう。
ＮＭＲ画像形成のコントラスト強化法の総説、ｒＲａｄ
ｉｏ１ｏｇｙＪ第１４７巻第７８１〜７８８頁（１９８
３）　　は「理想的」コントラスト強化剤の判定基準の
中で、その化合物は低濃度で強いＮＭＲ活性を有してお
り、生体内で非反応性であり、そして診断用量で無毒性
であるべきであると記している。
本発明はＢＡＭ標識の追跡標識金属の担体としてのメタ
ロチオネインの使用に関する。メタロチオネインは広範
な種々の金属に配位結合することの外にそれはまた１分
子当ｆｉ１０Ｆ原子もの金属と結合するという利点を与
える。従って、メタロチオネインは広範な種々の追跡標
識金属と結合しそして二官能性キレータ−１モル当り１
〜１０モルの金属の選択的包含を提供する。
驚くへきことに、メタロチオネインとｐＡＭのコンジュ
ケ゛−ジョンはＲＡＭの生物活性を損なわない。
本発明はメタロチオネインまたはフラグメントの金属の
少くとも一部がメタロチオネインまたはフラグメントに
それを結合させるに充分な親和性を有する放射性核種ま
たは非放射性追跡標識金属である。　ＢＡＭとメタロチ
オネインまたはメタロチオネインフラグメントとのコン
ジュケ゛−トを提供する。好ましくはそのようなトレー
ス標識金属はＩｎ、　Ｐｂ％Ｔｃ、　Ｒｕ、　Ｈｇ、　
Ａｇ、　Ａｕ１Ｐ（１，０ｕ１Ｒｅ、　Ｓｂ、　Ｂｉ、
Ｇａ、　Ｐｔ、　Ｗ、　Ｃｏ、　Ｎｉ、北およびＯｓよ
シ選ばれる。
更に本発明はメタロチオネインまたはフラグメント中の
すべての金属が非追跡標識金属例えばＺｎであるような
、　ＢＡＭとメタロチオネインまたはメタロチオネイン
フラグメントとの共有結合コンジュゲートを包含してい
る。これらコンジュゲートは交換標識、すなわち非追跡
標識金属の少くとも一部を金属追跡標識で置換させるこ
とによって本発明の追跡標識コンジュゲートを製造する
のに中間体として有用である。
本発明はまた、金属のすべてまたは一部が金属追跡標識
である追跡標識非コンジュゲート化メタロチオネインま
たはメタロチオネインフラグメントを包含する。これら
追跡標識非コンジュゲート化メタロチオネインはなかん
ずく本発明の追跡標識コンジュゲート化メタロチオネイ
ン製造の中間体として使用することができる。
メタロチオネイン メタロチオネインは「メタロチオネイン：Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｌｎｇｓ　ｏｆ　Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇｏｎ　　ＭｅｔａｌｌＯｔｈｉ
ｏｎｅｉｎ　　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　　Ｌｏｗ　　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔ　Ｍｅｔａｌ−Ｂｉｎｄｉ
ｎｇ　ＰｒｏｔｓｉｎｓＪ（チェーリツヒにて１９７８
年７月１７〜２２日）−Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ社（バー
ゼル）（１９７９年版）−に記載されている。この文献
は以下のように要約される。メタロチオネインは１９５
７年に発見され、カドミウムおよび亜鉛含有蛋白質は馬
の腎臓から単離された。実質的に同一の蛋白質が後に兎
、人、サル、牛、羊、豚、犬、ハムスター、ラット、マ
ウスおよびあざらし中に見出された。馬メタロチオネイ
ンは分子量６０００〜７０００、高い金属含量、高いシ
スティン含量を有し、芳香族アミノ酸を含有しないこと
、金属チオレート（メルカゾタイド）の光学的特性およ
びシスティン残基の一定の分散を有することを特徴とす
る。前記の第一回メタロチオネイン国際会議の総会にお
いて、これらの特性のいくらかの馬腎メタロチオネイン
に似た蛋白質を「メタロチオネイン」と称することにな
った。そしてこの意味においてこの用語が本明細書中に
使用されている。勿論メタロチオネインフラグメントも
少くとも約６個のアミノ酸残基を有する機能的に同様な
ポリはゾテドと同じく本発明の実施において有用である
。
一般的に云って、メタロチオネインは生体内で生産され
、且つ高い親和性をもって広範な種］の金属イオンとキ
レート化する低分子量蛋白質である。メタロチオネイン
の生理学的機能ははっきりとは理解されていない。しか
しそれらは必須金属の動的平衡および重金属の解毒に機
能しているものとして一般に受入れられている。
メタロチオネインは高等背椎動物、無背椎動物および真
核および前核微生物に遍在する。例えば＋Ｍ、　Ｈｇ％
ＺｎまたはＣｕの金属イオンに多くの有機体をさらすと
、アポ蛋白チオネインに対するｍＲＮＡの産生が増強さ
れてメタロチオネインの迅速な新たな合成が誘導される
。従ってＣａ注入に反応しである種の微生物により生産
されるカジスチンのような分子もまた本発明で使用を企
図するものである。
哺乳類のすべてのチオネインは６０〜６１個のアミノ酸
残基を有しており、そして１モル轟り７を原子の二価ま
たは１０ｆ原子までの一価の金属イオンを結合しうる。
チオネインは芳香族またはヒスチジン残基を有しておら
ずセして哺乳類チオネイン中のアミノ酸残基の２０個が
システィンである。分光光度計による証明によりチオネ
インの金属結紮はほとんど例外なしにシスティンのスル
フヒドリル部分を介したものである。
メタロチオネインのスルフヒドリル部分は金属イオンに
結合しているので、それらは一般にはＢＡＭ　Ｋ対する
コンジュゲート用の官能基として作用するには役に立た
ない。しかしその他の基例えば−ＮＨ２、−ＯＨおよび
−ｃｏｏＨ基が役に立つ。
すなわち、メタロチオネインは以下に詳細に記載するよ
うにこれらの基を用いる試薬および方法を使用してＢＡ
ＭＫ共有結合的にコンジュゲ−トさせることができる。
数種のメタロチオネインの完全なアミノ酸配列が決定さ
れている。
文字記号の意味 ム諷アラニン　　　　　１ｍプロリン Ｃ−システィン　　　　Ｑ−グルタミンＤ−アスＡ　５
４’ンＲＲ−フルギニンｍ−−グルタミン酸　　　Ｓ−
七すン ａ−グリシン　　　　　Ｔ婁スレオニン工寓イソロイシ
ン　　　Ｖ−バリン に凋リジン　　　　　　ＡＣ諷アセチルＬ−ロイシン　
　　　　Ｈ寓遊離アミノ末端Ｍ−メチオニン　　　　Ｏ
Ｈ−遊動ル＾シル末端１１−アスノラギン システィン残基は鎖に沿って分布しており、そして多数
の−Ｃ−Ｘ−Ｃ残基（式中Ｘはシスティン以外のアミノ
酸を意味する）が存在することが見られる。表は哺乳類
メタロチオネインよりもはるかに低い分子量のＮｅｕｒ
ｏａｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａからのメタロチオネインを
包含している。より高分子量のメタロチオネイン（９５
００〜１０．０００）が他の微生物から単離されている
。これらメタロチオネインのすべては本発明の範囲内に
あるが、哺乳類メタロチオネインがより好ましい。生体
内診断および治療目的には処理される哺乳類と同一種か
らのメタロチオネインを使用することが特に好ましい。
例えば本明細書中に共に参考として包含されているｒＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　８ａｉ、Ｊσ、Ｓ
、ム第７６巻第４８６〜４９０頁およびｒ　Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　ＬｅｔｔｅｒｓＪ第２４巻第９２５〜９
２８頁に報告されている金属結合チオネインフラグメン
トもまた本発明において使用しうる。前者により合成さ
れたマウスチオネインフラグメントは以下のアミノ酸配
列を有しているがここに文字記号は前記表１におけると
同一の意味を有している。
１、　　　Ｈ２Ｎ−に−０−Ｔ−０−０−Ａ−ＯＨ２、
Ｈ２Ｎ−Ａ−０−に−Ｄ−Ｃ−に−Ｃ−Ｔ−ＯＨ五　　
１２Ｎ−８−０−〒−〇−Ｔ−５１−８−Ｃ！−Ａ−Ｏ
Ｈ４、Ｈ２１ｆ−（ａｌ−（ｔ−８−に−（！−Ａ−Ｑ
−Ｇ−０−Ｖ−Ｏｆ！５、　　　Ｈ２Ｎ−Ｇ−０−Ｖ−
に−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｄ−に−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−ＯＨチオネ
インの金属結合フラグメント（すなわちメタロチオネイ
ンフラグメント）例えば前者によシ合成されたものは本
発明の使用にとって適当であるがしかし完全なメタロチ
オネインが現在は好ましい。
メタロチオネインと機能的類似性を有するポリイプチド
ならびに慣用の合成技術を使用して製造されたメタロチ
オネイン／メタロチオネインフラグメントおよび単量体
との共重合体はそれらが前記に詳細を記したメタロチオ
ネインの一般的特性を示す限シは本発明を実施するのに
有用であることは当業者には明白であろう。
金属追跡標識 これまでに知られている診断的および治療用放射性核種
の中で、次のものが本発明の実施に有用である（半減期
はｄ−日、ｈ−時間で与えられている）。
表　　■ 診断用放射性核種　　　　　！ ルテニウム−９７２，９ｄ テクネチウム−９９ｍ　　　　　　６．Ｏｈ水　　銀−
１９７２，７（１ ガリウム−６７７７，９ｈ ガリウム−６８１，１ｈ オスミウム−１９１１５（１ インジウム−１１１２，８（１ インジウム−１１３ｍ　　　　　　１．７ｈ鉛−２０３
５２ｈ 治療放射性核種　　　　　　半減期 パラジウム−１０３１７，０（１ 銀−１１１７，５＋１ アンチモニー−１１９１，６＋１ 金−１９８２，７４ 鋼−６７２，６＋１ Ｖ＝ウム−１８８１７，Ｏｈ ビスマス−２１２１，Ｏｈ 診断用放射性核種はｒ−放出体および／″！たけ陽電子
放出体であってｓ　　３０　ＫｅＶおよびＩＭｅＶの間
のエネルギーを放出させ、そして約１分〜８日の半減期
を有している。これら放射性核種は例えば平面単一光子
または陽電子断層撮影法に基づく慣用の放射能シンチグ
ラフ画像形成技術と組合せて用いるのが有用である。治
療用放射性核種はα−１β−１ｒ−変換電子または１ｏ
ｏｅｖ〜２　ＭｅＶのエネルギーのアウガー電子を放出
し、そして生体内で細胞を殺すことができる。
勿論、これらの種々の放射性核種の診断および治療への
使用を論する場合には使用される用量は多くの変数に依
存することを当業者は理解しているであろう。画像形成
目的のために放射性核種を使用する場合には、使用され
る特定の用量は一般には体重７０にｇ当りα１〜２Ｑｍ
Ｃ１の範囲の診断上有用な画像を得るのに充分な高いも
のであるということのみが必要である。それと対照的に
、治療目的のためＫは一般に体重７０９轟りα１〜５０
０　ｍｃｉの範囲のよシ高い用量を使用しうる。勿論適
当な用量は最終的には放射性核種の物理的性質例えば半
減期、放射のタイプおよび放射エネルギーおよび放射能
標識された薬剤の薬品作用機構に依存する。
ＮＭＲ画像形成に対して有用であることがこれまで知ら
れているコントラスト剤の中で、コバルト、ニッケル、
銅およびルテニウムは本発明の実施において有用である
と考えられている。
放射線写真画像形成に有用であることがこれまでに知ら
れているコントラスト剤の中で、周期律表７２〜８３番
の金属元案が本発明の実施にオイテ有用でちると考えら
れ、そしてビスマス、鉛、水銀、金、白金、レニウムお
よびタングステンが好ましい。
追跡標識メタロチオネイン 追跡標識メタロチオネイン生成に使用しうる二つの一般
法がある。第一のはチオネインの直接標識である。第二
のはメタロチオネイン例えばＺｎ−メタロチオネインを
所望の金属追跡標識を用いて交換標識させるものである
。
第一の方法、すなわちチオネインの追跡標識による直接
標識はここに参考として包含されているｒＰｒｏｃ、　
Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）Ｊ第７
８巻第６７０９頁（１９８１）に報告されているものと
同様である。一般に哨乳類チオネインをｐＨ２で溶解さ
せそして生じた不溶性物質をすべて濾過により除去する
。このチオネイン溶液に金属追跡標識および任意の所望
の非追跡標識金属陽イオンを加える。追跡標識および非
追跡標識金属陽イオンの全濃度はチオネイン当り少くと
も７個の二価金属陽イオンまたは１０個の−価金属陽イ
オンが確実に使用しうるまたは二価陽イオンおよび一価
陽イオンの適当な組合せがメタロチオネインの金属結合
部分のすべてを確実に満すに充分なものであるべきであ
る。チオネインの独特の性質のために１個以上の金属陽
イオンを有するメタロチオネインを製造することができ
る。従ってチオネインの全部の金属結合部分が金属追跡
標識により占有されうる可能性があるので、非常に高濃
度の追跡標識メタロチオネインを製造することができる
。
金属追跡標識として放射性核種を使用する場合、添加さ
れる放射性核種の濃度は問題の臨床上の応用に必要とさ
れる比活性に依存する。診断の適用に対しては、チオネ
イン１モル当りの放射性核種のモル比は１ｔ７１ｃはそ
れ以下の小さいものであってよい。治療の応用に対して
は、この比はもつと高いものであってよい。非放射性金
属陽イオンは放射性陽イオンにより占有されていない金
属結合部分を占有させるに充分な量で加えることができ
る。放射性核種および場合によシ非放射性金属陽イオン
を加えた後、得られた溶液を完全に抜気して酸素を除去
し、そして不活性雰囲気中でｐＨがｚＯよシ高くなるま
で中和させる。この中和の間にチオネインは放射性核種
および非放射性金属陽イオンのまわυに折りたたまれて
所望の放射能標識メタロチオネインを生成する。標識メ
タロチオネインは慣用の技術例えば透析、サイズ排除（
ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）またはイオン交換クロ
マトグラフィーにより精製することができる。放射能標
識メタロチオネインの非放射性金属含量は原子吸光によ
りまたは放射性崩壊を計数するととＫより算定される放
射性核種の含量により決定することができる。
この精製放射性核種標識メタロチオネインは以下に記載
の二官能性カップリング剤または交叉結合剤を使用して
直接ＲＡＭにカップリングさせることができる。放射性
核種標識メタロチオネインの製造およびそれらを所望の
ＲＡＭへカップリングするのに要する時間のために、こ
の直接標識技術での使用については、例えば２４時間よ
り長い半減期を有するＲｕ−９７およびＨｇ−１９７の
ような放射性核種が好ましい。
第二の標識法は追跡標識金属陽イオンをメタロチオネイ
ンの非追跡標識金属陽イオンの全部ま九はその一部と交
換することを包含する。この交換反応を成功させるには
追跡標識陽イオンが前に形成されているメタロチオネイ
ンにおいて非追跡標識陽イオンよりもよシ大きな親和性
をメタロチオネインのメルカプチドに対して有している
ことが必要である。
例えば金属追跡標識として放射性核種を使用する場合、
亜鉛陽イオンはテクネチウム、水銀または釧の陽イオン
のいずれかよシも低い親和性をメタロチオネインのメル
カプチドに対して有している。従って、テクネチウム−
９９ｍ１水銀−１９７、または鎖−１１１の陽イオンの
存在下にｚｎ−メタロチオネイン（ＭＴｈ）のＺｎ（Ｉ
Ｉ）陽イオンは容易に置換されてそれぞれＺｎ／””Ｔ
Ｏ−ＭＴｈ　。
Ｚｎ／”　’Ｈｇ−ＭＴｈまたはＺｎ／”　’　Ａｇ−
ＭＴｈを与える。
すなわちＺｎ−ＭＴｈは前記の方法によって容易に製造
されるので、ｚｎ−ＭＴｈまたはＺｎ−ＭＴｈ−ＢＡＭ
コンジュゲートの交換標識はＺｎ−ＭＴｈまたはＺｎ−
Ｍｌ’ｈ−Ｂ心コンジュゲートを可溶性の交換可能な放
射性核Ｗ１例ｊＬハ９９！ｎ、ｒＣ−１’ルコヘフトネ
−）、′９２ＨｇＣ２２または１１１　Ａｇ＜　ＮＦ１
３＞２＋のものと混合することによって達成することが
できる。交換の後で放射能標識メタロチオネインを慣用
の技術例えば透析、サイズ排除またはイオン交換クロマ
トグラフイーにより精製することができる。交換標識の
収率は放射性崩壊を計数することＫより測定されうるし
、そしてこれはメタロチオネイン中に包含された全放射
活性のチを表わす。コバルト値）、ニッケル（■）、お
よび亜鉛値）陽イオンは表２に列記されている放射性核
種を用いる交換標識法で使用しうるメタロチオネインを
生成する。しかしこの交換標識には亜鉛ω）陽イオンが
好ましい非放射性陽イオンである。交換標識法の使用は
２４時間よシ短い半減期を有する放射性核種を使用する
場合に特に有用である。その理由はこの交換標識が臨床
現場で実施されうるからである。以下に更に論じられて
いるように、Ｚｎ−Ｍｆｈ−ＢＡＲコンジュゲートの短
い寿命の放射性核種による交換標識は使用直前の放射性
核種の導入を可能にし、そして崩壊による放射能の避け
られない損失を除く。
前記にあげた放射性核種の中でｓ　Ｍｏ−９９／Ｔｃ　
−９９ｍ発生体から容易に得られ、そしてその放射性核
種の望ましい物理的特性の故に９９ｍＴｃがその比較的
短い半減期によυ本発明の実施の際の交換標識に最も好
ましい。放射性核種Ａｇ−１１１、Ａｕ−１９８および
２１１ｇ−１９７は両標識法を実施しうる容易さのため
にチオネインの直接標識または交換標識のいずれかに対
して最も好ましい。放射性核種Ｒｕ−９７、Ｐｄ−１０
３および５ｂ−１１９は直接チオネイン標識法によって
最適に使用される。
前述したようにこれら放射能標識チオネインは以下に詳
細に記載するように本発明の放射能標識メタロチオネイ
ン−ＲＡＭコンジュゲート生成の中間体として使用しう
る。また９９ｍＴｃ−標識メタロチオネインまたはメタ
ロチオネインフラグメントはそれ自体は腎機能画像形成
剤として＃に有用でありうる。放射性核種Ｚｎ−６５お
よびＣｄ−１０９を使用した場合の放射能標識メタロチ
オネインの臓器分布は報告されているが、しかしこれら
放射性核種のどちらも生体内診断画像形成に適当な物理
的性質または放射線量測定を有していない。前記に概略
を記した交換標識法により製造された’　”ＴＣ／Ｚｎ
−ＭＴｈは生体内で腎疾患の診断に使用することができ
る。マウスＩＣ９９ｍＴｃ／Ｚｎ−ＭＴｈを静脈内注射
した後、”Ｉ！ｌＴｃ／Ｚｎ−ＭＴｈは直ちに腎により
排泄される。注射後１５分では９９ｍＴｃ活性の７５チ
は腎、膀胱および尿中に存在している。すなわち腎機能
は”ｍＴＯ／Ｚｎ−ＭＴｈの排除を追跡することによっ
て生体内で非常に速やかに評価することができる。その
他の診断用胃薬剤例えば”　ｍＴ　ｃ　ＤＴＰＡに比べ
た場合の９”ＴＣ／Ｚｎ−ＭＴｈ使用する固有の利点は
メタロチオネインが自然に発現される解毒機構の肝要な
一部分であるということである。人においては腎臓は重
金属メタロチオネイン代謝の重要な役割を果している。
メタロチオネイン放射能標識について記載されているも
のと同様の方法を非放射性金属追跡標識の導入に使用す
ることができる。放射線写真対比に対して有用なものす
なわちＢｉ、Ｒｈ、　Ｈ＆Ａｕ、　Ｐｔ、　Ｒｅおよび
Ｗの中で、水銀および金を交換標識またはアポ蛋白への
直接コンジュケ゛−トによってメタロチオネイン中に混
在させることができる。残余の元素の包含は直接標識に
よって達成される。ＩＩＴＭＲ画像形成に有用なものす
なわちＣ０１Ｎ１、Ｏｕ（［）およびＲｕの中で、銅（
Ｉ［）が交換標識によってメタロチオネイン中に最良に
包含される。一方コバルト、ニッケルおよびルテニウム
は直接標識により包含される。
求標的生物活性分子 本明細書に使用されている場合の求標的生物活性分子（
ＲＡＭ）の用語は抗体（特にモノクローン抗体）、抗体
のＰａｂ　、　Ｆａｂ’およびＦ（ａｂつ２７ラグメン
トおよび哺乳類体内のある臓器、組織または細胞中に局
在するその他の分子を意味している。そのようなその他
の分子の例はホルモン例えばインシュリン、グルカゴン
、プロスタグランジン、ステロイドホルモンおよびはプ
チドならびにある細胞型に特異的に結合するその他の蛋
白質例えば卵巣中のレセプターに結合する黄体化ホルモ
ンである。メタロチオネインのコンジュゲートによる放
射能標識に対して蛋白質のような大形分子が一般には好
ましい。しかしいくつかの小形分子のコンジュゲートも
また適している。例えば心臓のムスカリンコリンレセプ
ターに結合するキヌクリジニルベンジンートの数分子の
放射能標識メタロチオネインへのコンジュゲートは生体
内で心臓細胞の生活能力を追跡するための放射性薬物を
提供する。放射性標識メタロチオネインにコンジュゲー
トさせたニストロジエンおよびニューロはプチドは同様
にそれぞれ乳癌および脳潅流剤を与える。
驚くべきことに、ＲＡＭ例えばモノクローン抗体、抗−
ＴＨＹ　１．Ｉ　ＣｒＪ−工ｍｍｕｎＯ１０ｇ７Ｊ第１
２５巻第８３７頁（１９８０）参照〕および抗人乳癌Ｂ
６．２　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、（ＵＪＡ）第７８巻第３１９９頁（１９８１）参照
〕ならびＫその他のものをＺｎ−メタロチオネインにコ
ンジュケ゛−トさせそしてそのコンジュゲートをＢＡＭ
の免疫学的活性を実質的に低下させることなく例えばＴ
ｃ　−９９ｍで交換標識させることができることが発見
された。
コンジュゲーシヨン ＲＡＭはメタロチオネインの放射能標識の前またはその
後でメタロチオネインにコンシュダートさせることがで
きる。コンジュゲートの前に放射能標識することが一般
には好ましい。その理由はコンジュケ゛−トに対するよ
りも放射能標識に対してより厳しい条件が使用されうる
からである。しかし臨床的使用する直前に寿命の短い放
射性核種例えばＴｃ−９９ｍを交換標識させることによ
り放射能標識することが所望されている場合には、以下
の例に示されるように放射能標識ノ前のコンジュゲート
化が好ましい。
哺乳類のメタロチオネインは典型的にはメタロチオネイ
ンを直接ＲＡＭにコンジュゲートさせることのできる官
能基を有している以下のアミノ酸残基、システィン２０
チオール（−８Ｈ）　基、リジン８個のアミン（−ＮＨ
ｚ）基、アスパラギン／グルタミン酸、４または５個の
カルボキシル（−Ｃ！００）Ｉ）　基％　およびセリン
／スレオニン１０〜１４個のヒドロキシル（−ＯＨ）基
を有している。
メタロチオネイン中のすべてのアミノ酸残基がコンジュ
ゲート用に使用可能であるとは限らない。その理由はあ
るものはメタロチオネイン中の種々の機能に関与してい
るからである。システィンＳＨ基は金属結合に関与して
おりそして一般には通常の条件下ではチオールを目的と
した試薬とは反応しない。部分金属化メタロチオネイン
またはメタロチオネインの７ラグメントの使用は、金属
結合に使用されない一６Ｈ基の反応分可能にする。その
ような−８Ｈ基を直接コンジュゲ−ト用に使用しうるよ
うにするためのメタロチオネインからの金属の一部の除
去はＥＤＴＡまたはＤＴＩ’Ａのような強いキレート化
剤を用いる処理により実施されうる。リジンおよびアル
ギニン残基はコンジュゲートに対して大部分使用できな
いものである。その理由はそれらはメタロチオネイン中
で高度に負の金属群との静電気結合に関与しているから
である。リジンのいくらか（１〜３）は通常使用しうる
ものであるけれども、高いイオン強度の溶液へメタロチ
オネインをさらすのは静電結合の破壊をまねきそして一
層大きくリジンおよびアルギニン残基を使用する結果と
なる。メタロチオネインの表面上のカルボキシルおよび
ヒドロキシル基は一般にＲＡＭのコンジュゲートに使用
可能であり、従ってコンジュゲーシヨンに対して最も好
ましいものであシうる。
チオネインの直接標識により生成された放射能標識メタ
ロチオネインへ、または２（後で放射性核種で交換標識
させるための非放射性メタロチオネインにＲＡＭを結合
させるにはメタロチオネインの使用しうる一８Ｈ、−Ｎ
ａ２、−ビＨ区＝ＮＨ）兆２、−ｃｏ２ａまたはＯＨ基
をＢＡＭの補合官能基にコンジュケ゛−トさせることが
必要である。ＢＡＭがモノクローン抗体またはその他の
糖蛋白質である場合には、それはメタロチオネインと同
一の官能基すなわち−ＢＨ，−Ｎａ２、−ＯＨ，−ｃｏ
２ＨおよびＮＨＯ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有している。その
ような基を有しない比較的小さい薬物またはホルモンを
取扱う場合には、これらの基の一つをその小分子中に合
成的に取り込んで、メタロチオネインとのコンジュゲ−
ト化を起させるようにすることができる。当業者には周
知のように１方法論はそのような一つの薬物ま九はホル
モンごとに広く変動する。そして主なる配慮点は生物学
的特異性および親和性の保持である。そのような合成上
の修正についての一般的論議に対しては、ここに参考と
して包含されているｒｃｈｅｍｉｃａＩＭｏｄｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓＪ　（ホルデンーデ
イ社版（１９７１）：１を参照されたい。その後でメタ
ロチオネインとＲＡＭを直接適当な試薬および方法を使
用してコンシュデートさせることができる。一般的に蛋
白質のメタロチオネインへのコンジュケ゛−ジョンなラ
ヒにコンジュゲーフヨンのためのメタロチオネインまた
は蛋白質の変形には、メタロチオネインおよびＢＡＭの
変性および生物活性損失を避けるために緩和な条件が要
求される。反応のｐＨは約３〜１１、好ましくは５〜９
の範囲であり温度は０〜６０℃の範囲であり、ＲＡＭお
よびメタロチオネイン各々の濃度は１０−２〜１０”’
Ｍのの範囲、好ましくは約１０　　Ｍであるべきである
。
好ましい溶媒は一般には水である。しかし種々の量の溶
媒例えばりメチルスルホキサイドを加えて非極性コンジ
ュゲ−ト剤を溶解させることができる。非蛋白質ＢＡＭ
をメタロチオネインにコンシュデートさせるためＫはメ
タロチオネインはいくらか一層厳しい条件を許容しうる
し、そして反応はりメチルスルホキサイドのような有機
溶媒中で実施しうる。
メタロチオネインとＢＡＭが補合コンシュケート部分を
含有していない場合には、メタロチオネインまたは−Ｂ
ＡＭのどちらかまたはその両方を合成的に修正する代り
に所望のコンジュケ゛−トを行わせる交叉結合剤を使用
することができる。
交叉結合剤はメタロチオネインとＢＡＭの官能基と共有
結合を形成し、且つアルキルおよび／またはアリール鎖
によ多結合されている二つの化学的に相容性の反応性基
ＸおよびＹ、すなわちＸ−０ｎ−Ｙ（式中ａｎはアルキ
ルまたはアリールである）を有しているべきである。こ
の反応、性基ＸおよびＹは化学的に相容性であるべきで
ある。すなわちそれらは相互に反応して重合体物質を生
成させてはならない。メタロチオネインおよびほとんど
のＲＡＭは−ＮＨ２、−８Ｒおよび一〇Ｈ基を有してい
るのであるからＸおよびＹに対する好ましい反応性基は
アルキル化およびアシル化基である。ＸおよびＹに対す
る好ましいアルキル化基バー　ハｏ　ｆｌｌ　、−ハロ
エステルマタハーハロアミ゛ド、アリールハライドおよ
びマレイミドである。
メタロチオネインおよびＢＡＭの−ＮＨ２基の還元アル
キル化の使用による交叉結合もまた好ましい。
交叉結合剤例えばＸとＹがアルデヒドであり、そしてｎ
＝３であるグルタルアルデヒドはその：うな−［２基の
還元アルキル化により七ツクローン抗体に放射能標識メ
タロチオネインを結合させることに有用性を示す。Ｘお
よびＹに対する好ましいアシル化剤としては活性化カル
ボキシル官能分、例えばクロリドおよび無水物、イミド
エステル、チオールエステルおよびＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルがあげられる。
一般にアミンのアシル化がヒドロキシルよりも好ましい
。それはアミドが生体内ではエステルよりも安定である
ことが知られているからである。
−ＮＦｉＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ基との共有結合形成におい
て好ましいＸおよびＹに対する部分としては、　　１．
２−および１，３−ジカルボニル化合物、例えばマロン
ジアルデヒド、シクロヘキサン−１，２−ジオンおよび
カンファーキノンがあげられる。アルギニン残基とこれ
ら試薬との反応は非常に選択的でありかつ可逆的である
。
交叉結合に対してメタロチオネインとＲＡＭのカルボキ
シル基を使用する場合における好ましいＸおよθＹ部分
はアミン基でおる。水溶性カルボジイミド例えば１−シ
クロへキシル−３−（２−モルホリニル−・４−エチル
）カルボジイミドｔたは１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドにより活性化された
場合、メタロチオネインまたはＢＡＭの活性化カルボキ
シル基は交叉結合剤のＸおよび／またはＹ　＝−ＮＨ２
と反応してアミド結合を生成する。
メタロチオネインおよびＲＡＭのそのようなカルボキシ
ル基とアミノ基を含有する交叉結合剤との反応はメタロ
チオネインｔｌ−ＢＡＭ　Ｋ結合させるための好ましい
方法である。
一般にＸとＹを分離させている炭素鎖はｎが１〜１２個
のアルキルまたはアリールでありうる。鎖長の選択は結
合させるＲＡＭの性質によって変動する。大形のＲＡＭ
の場合には、メタロチオネインに結合された交叉結合剤
と大型蛋白質上の標的官能基との間に至適な共有結合を
形成させるために、より長鎖が必要である。小形のＲＡ
Ｍの場合には、メタロチオネインに結合されたＲＡＭを
その細胞表面レセプターと相互反応させるためには非常
に長い鎖が必要となるかもしれない。すなわち鎖長は交
叉結合法を至適化させるために、またはメタロチオネイ
ン−ＲＡＭコンジュゲートの生物学的活性保持を最大化
させるために変動させることができる。
メタロチオネインのモノクローン抗体への結合において
はいつくかの市販の交叉結合剤が好ましい。好ましい交
叉結合の例としてはグルタルアルデヒド％　　Ｎ−（２
−クロロエチル）マレイミド、ジサクシンイミジルター
タレート、ザクシンイミジル４−ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート、２−イミノチオレインおよびジメチル
アジピイミデートがあげられる。
本発明の追跡標識コンジュゲートは従来技術の追跡標識
ＲＡＭと同一の方法で使用することができる。これらは
保存および輸送のために凍結乾燥させ、次いで通常の生
理学的食塩水中で復元して診断用画像形成または治療の
ために静脈内注射することができるし、またはそれらを
交換標識によって使用直前に製造することができる。そ
れらはまた従来技術の追跡標識化合物と同一の方法で生
体外検定および臨床的診断法で使用することができる。
／ ／ 例　　１ チオネインからの水銀−２０３標識メタロチオネインの
製造 チオネインは「ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ第茸巻第２
８５２頁（１９８１）の方法によって兎肝臓から製造さ
れた。このチオネイン（３〜５■ンを１．０　ｍＱの金
属不含の０．ＩＮ！（ＣｆＫ溶解させ、そしてすべての
不溶性物質を戸別した。得られたチオネインの讃度は計
算のために２２０ｎｍで７．９１Ｎ１　　ｍＱ　／ａｎ
−’の吸光係数を使用して分光光度計的に測定された。
このチオネインの溶液（０，５ｑ／ｍｆｆ１　）に０．
７６ｍｃｉの２０５ＨｇＣＡ　２（比活性−８，７６Ｘ
　１０２ｍＣ１／ｍモル）を加えた。真空下にこの混合
物を交互に凍結および融解させることによって得られた
チオネイン／　”３ＨｇＣｊ！２ｆｇ液を完全に脱気さ
せて酸素を除去した。アルゴン雰匹気下にチオネイン／
２０〜ａ２を金属不含の０．５　Ｍ　）リス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（トリス）バッファーでｚＯよ
り大きいｐＨまで中和させた。得られた２０’Ｈｇ−Ｍ
Ｔを１〜６０ゲルＰ通カラム（クオーターズ・アンシエ
イツ社製）を使用して、２．０ｍｆｆ１／分で０．０２
５Ｍホスフェートバッファー（ｐＩ（７，０）で溶出す
せるサイズ排除ＨＰＬＣにより評価した。クロマトグー
）フィーの後、添加された２　０５Ｈｇ放射性の９８チ
が２０５ａｇ−ＭＴと共に残っていた。メタロチオネイ
ン製造に関しては同位元素効果は存在しないので、　　
　Ｈｇｃｆ２の置換は比肩しうる結果を与えた。
例　　「 Ｚｎ−メタロチオネインの交換標識による加／９″ｍ艷
−メタロチオネインの製造 Ｚｎ−メタロチオネインを「Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ　、
Ａｃａｄ。
ＳＣ１，（ＵＳＡ）Ｊ勲■巻第６７０９頁（１９８１）
の方法によって製造されそしてＯＤ１Ｍホスフェートバ
ッファー（ｐＨ６，５）で「スペクトラ／ポル６」透析
管「２０００ＭＷ　　カットオフ」（スペクトラム、メ
ディカル・インストルメンツ社製）を使用して透析した
。９５１Ｍ０７９９１ｎＴＣ放射性核種発生体の酸化成
分不含溶出液から得られたｏ、　ｓ　ｍｅ生理学的食塩
水中の４８．７ｍＣ１”ｍＴｃ−バーテクネテートの添
加により製造された９、　７　ｍｃｉの９９ｍＴＣ−グ
ルコスカン０にューイングランド・ニュークリアー社製
）を０．５〜のＺｎ−メタロチオネイン（１，０ｌｉｔ
、１０−’Ｍ）に加えた。得られた交換混合物を３０分
間振盪およびインキュベートさせた。交換標識Ｚｎ””
ｒｅ−メタロチオネインは例ＩＫおけるようにサイズ排
除ＨＰＬＣにより精製された。
精製後Ｚｎ−メタロチオネインに加えられたテクネチウ
ム−９９ｍ活性の８８％がＺｎ、　”！ｎＴｃ−ＭＴと
共に残留した。テクネチウム−９９ｍの担体不含を考え
ると、１６ピコモルのテクネチウム−９９ｍＩＥ　ｏ、
　５　！のＺｎ−メタロチオネインに交換された。
例■ Ｚｎ−メタロチオネインの交換標識にょるｚｎ／１１０
ｍＡｇ−メタロチオネインの製造 Ｚｎ−メタロチオネインを例１１に記載のようにして製
造されそして０．０１ＭホスフェートバッファーＣｐＨ
７，０）で透析したＣＦスペクトラ／ポル６　Ｊ　（２
０００ＭＷＯＯ）使用〕。ニューインクランド、スフレ
アー社より入手した０、　５　Ｍ　ＨＮＯ３１ＱＩｎ 中の　　ＡｇＮＯ３（比活性−１０１７ｍ０１７ミリモ
ルンを０．５　Ｎ　！６４（Ｅの添加忙よってｐＨ７，
０に中和させ１０ｍ た。５０ｕＣ１の　　ｋｇ（ＮＨｓ　）　２をｏ、ｓｑ
のＺｎ−メタロチオネイン（ｏ、ｓｍ１．　１０−’Ｍ
）　　に加えた。３０分間インキュベートさせた後、交
換標識Ｚｎ／”０ｍＡｇ−ＭＴを例Ｉにおけるようにし
てサイズ排除ＨＰＬ、Ｃにより精製させた。精製後　１
１０！ｎＡｇ（ＮＨ３）；としテ加ｔ　ラレタ（ＩＩ’
　−１１０ｉ性Ｏ７０％　カなり′”。ＸｎＡｇ−ＭＴ
と共に残存した。すなわち３４ｎモルの＃−１１０ｍが
０，５〜Ｚｎ−ＭｌｒＫ交換された。メタロチオネイン
製造に関しては同位元素効果は存在してぃないので　１
１１　Ａｇ　（ＮＨｓ　）　　の　　Ａｇ　（ＮＨｓ　
）　２への置換は比肩しうる結果を与える。
例　　■ Ｚｎ、　””Ｔｃ−メタロチオネイン（ＭＴ）／抗ＴＨ
Ｙ１．１＝ンジュゲートの製造および評価 ａ）　　Ｚｎ、”！ＩＩＴｃ−ＭＴ／抗ＴＨＹ１．１−
フンシュゲートの製造 ０．０１Ｍホスフェートパフ　７７−　（ｐＨ７，０）
中ＯＺｎ−メＩ　Ｃ１テオネイ７　＜　１．　ＯＷ／ｍ
１．１０−’Ｍ）にグルタルアルデヒド（１■、最終清
度１０−２Ｍ）を加えた。１時間室温に置いた振、未反
応グルタルアルデヒドを６時間０．０１Ｍホスフェート
バッファーＣｐＨ７０ンで透析（「スＲクトラ／ポル６
Ｊ（２０００ＭＷＣＯ））！せることＫよ’ｌｊ：去し
た。このグルタルアルデヒド処３！メタロチオネイン＜
１０−’Ｍ）　０．５　ｍｌにモノクローン抗偉（ＭＡ
ｂ）　Ｏ０，２ＭＸ炭１１１塩ノ”／　７７−（ｆｉ９
．５）０．５峨中の抗ＴＨＹ１．１１■を加えた。抗Ｔ
ＨＹ１．１とグルタルアルデヒド処理Ｚｎ−メタロチオ
ネインとの間の反応を４℃でｐＨ９，３で１８時間続け
た。この時０．１　ｍｆｆ１の０．５Ｍ）リス１０．１
ＭＮａＢＨ４の溶液を加えた。室温で１時間還元させた
後、Ｚｎ−メタロチオネイン／抗ＴＨＹ１．１−フンシ
ュゲートを２４５＃間０．　ＯＩ　Ｍホスフェートバッ
ファー（ＰＨ６，８）で透析して〔「スペクトラ／ボ／
ｌ’　６　Ｊ　（、５０，ＯＯＯＭＷＣＯ）　）未反応
水素化硼素ナトリワムおよびグルタルアルデヒド処理Ｚ
ｎ−メタロチオネインを除去した。このコンジュゲー）
　０．１１９　Ｋ　３．５　ｍｃｉ　Ｏ””Ｔｃ−クル
コスカン■にユーイングランドーニユークレア−社製）
を加えそしてこの浪合物を３０分インキエベートさせた
。この又換標識ｚｎ、ｓｌＰｍＴｃ−メタロチオネイン
／抗−ＴＨＹ１．１コンジュヶ゛−トを、ビオラドＴＳ
Ｋ−２５０ゲル戸通カラム（ビオラド社Ｈ）を使用して
、０．１Ｍホス７エートパツ７７−（ｐＨ７，０）で１
．０　ｍｌ　／分で溶出させるＨＰＬＯＫより′精製さ
せた。精製後、０．５３　ｍｃｉの２９ｍＴｃがＺｎ　
、　９”ＴＣ！　−ＭＴ　／抗ＴＨＹ１．１＝＋ンジュ
ケ゛−ト（０，１１ｊｐ）と共に残存した。
ｂ　）　　Ｚｎ　＊　９９ｍＴｃ　−ＭＴ　／抗ＴＨＹ
　１．１−　コアシュゲートのマウスＳＬ１およびＳＬ
２腫瘍細胞への結合 抗原に対するＺｎ、　””Ｔｃ−ＭＴ　７抗ＴＩ（Ｙ１
．１コンジユゲートの活性をマウスＳＬ１およびＳＬ２
騰瘍細胞をＡＫＲ／ジャクソンおよびＡＫＲ／カンバー
ランド胸ａｍ胞と置き洪える「Ｊ、−腸。１．」第２５
巻第８３７頁（１９８０）記載ｔｖｍａ、結合検定法を
使用して評価した。ＳＬ　１　（’Ｉ’ＨＹ　１．１抗
原陰性）およびＳＬ２　（ＴＨＹ　１．１抗原陽性）＠
癌細胞（「ｖｔｒｏｌｏｇｙＪ第旦」１巻第３６３頁（
１９７７）参照〕を３７℃で湿った６％ｃｏ２定温器中
で２０％馬血清および２０ｍＭＬ−グルタミンを補充し
ただロスウェルパーク・メそリアル・インステイテユー
ト（ＲＰＭＩ）１６４０培地で増殖させた。細胞の増殖
速度はＳＬＩに対しては１日当り約３倍、そしてＳＬ２
に対しては１日当り５倍であった。検定に使用するため
に腫瘍細胞を単離し、ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁
し、そして標準技術を使用して計算した。ＳＬｌおよび
ＳＬ２細胞を共にＺｎ、”ｍＴｃ−ＭＴ／抗ＴＨＹ　１
．１　（２８ｎＣｉコンジュケ゛−ト、５ｍＣ１／〜〕
またはＺｎ、　”ｍＴｃ’−ＭＴ　（４８２ｎＣ１ＭＴ
　。
３９５ｍＣ１／キ）と共に３０分インキュベートし、遠
心によって非結合ＭＡｂから分離させ、洗い、そして”
ｍＴｅ活性を計算した。約５５％のＷ′ｍＴＣ標識抗−
ＴＨＹ１．１が抗原陽性ＳＬ２細胞に結合し、−万抗原
＃Ｅ牲ＳＬ１細胞には？９ｍ、Ｃ−標識コンジュゲート
はｔまとんどまたは全く結合しなかった。事実、９９ｍ
ＴＣ−標識抗−ＴＨＹ１．１のテストされた抗原濃度に
対するプロットは５５チ結合忙おいて水平化の徴候を示
さなかった。非コンジュゲート化９９！１ｌＬＴｃ−標
＃ｔＭＴはＳＬｌまたはＳＬ２腫瘍細胞のどちらＫもほ
とんどまたは全く結合しなかった。結論として抗原によ
る抗Ｔ）ｒＹ−１，１の結合はそのコンジュゲーシヨン
ＭＴＫより大きな悪影響を受けず、セしテＺｎ　、　”
ｍＴｃ−ＭＴ　／抗−ＴＨＹ１．１：＋ンｕユゲートは
抗ＴＨＹ−１，１について見られる抗原特異性を保持し
ていた。従って驚くべきことに、９９！１ｌＴＣ−項の
添加は抗ＴＨＹ−１，１の生物学的特異性にほとんど影
響を与えなかった。
例　　Ｖ ｚｎ、？’ｍＴｃ−メタロチオネイン／抗人乳＠　Ｂ６
．２の製造および評価 ａ）　　Ｚｎ、””Ｔｃ−ＭＴ／Ｂ６．２コンジユゲー
トの製造Ｚｎ、”ｍＴｃ−メｆｉ　Ｃ２？オネイン／抗
−ＴＨＹ１．１の製造のための例■記載の方法を０．６
キＺｎ−ＭＴ　（５Ｘ　１０″″５Ｍ）、１１５１グル
／　ルア　／Ｉ／デヒドおよび３岬抗人乳癌Ｂ６．２を
使用して実施した。Ｚｎ−ＭＴ／Ｂ６　、２を最終的に
０．１５Ｍ　ＮａＣｎ含有の０．０１Ｍのホス７エート
パツフアー（ｐＨ８，０）で６時間、次いで０．１５Ｍ
　ＮａＣｊｌ！含有の０．ＯＩＭホｘ７エートパ：ｙ７
７−（ｐＨ７，０）　テ１８時間〔「スペクトラ／ポル
６　Ｊ　（５０，０００ＭＷＯＯ）　）透析した後、１
５０ｍＣ１の９９ｍＴｃ　−グルロスカン■にューイン
グランド・ニューク１Ｊ７−社ｌ！りを加えそして３０
分混合させることによりこのコンジュゲート（２岬ンを
交換標識させた。
ビオラドＴＳＫ　−２５０ゲルＦ通カラムを使用するｔ
ＯｒＩｄＺ分で０．１Ｍホスフェートバッファー（ｐＨ
７Ｏ）で溶出させるサイズ排除ＨＰＬＣＫよってこの９
９ｍＴＣ−■−標識Ｂ６．２を精製させた。精製後、３
０　ｍｏｉｏ　”ＩｎＴｃ　カＺｎ、　”ｍＴｃ　ＭＴ
／Ｂ５．２　コアシュゲートと共に残存した。
ｂ）　　Ｚｎ、”−ｃ　−ＭＴ／Ｂ　６　、２　　コン
ジュゲートの六Ｍ】−７およびＡ３７５腫瘍細胞への結
合 ＭＡｂ９６．２の、それが標的とする抗原を結合する能
力に対する■＝ンジュゲーションの効果を細胞結合検定
法で評価した。これには組織培養で保存されている二つ
の人腫瘍セルラインすなわち人乳帰ＭＯＰ−７（「Ｊ　
、Ｎａｔｌ　、ＣａｎｃｓｒＩｎｇｔＪ第１ユ巻第１４
０９〜１４１６頁（１９７３ン参！、）　オヨ’Ｃｆｉ
人メ５　／−マＡ１７５　（ｒＪ、ＮａｔｘＣａｎｃｅ
ｒ　Ｉｎ５ｔ、Ｊ第旦ユ巻第１４１７頁（１９７３）参
照〕が使用された。ＭＣＦ−７腫瘍細胞はＢ６，２が結
合する抗原を有しており、　（「Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ月第１ｊ％第３１９９Ｎ＋
（１９８１）参照〕、−万Ａ３７５細胞はこれを有して
いない。それらは放射能標ｍＢ６．２の非特異的結合に
関するコントロールとして働く。検定に使用するための
腫瘍細胞は次の方法により得られる。接種３〜４日後ト
リプシン／　ＥＤＴＡ試薬〔カタログＮα６１０〜５３
００　（ギブコ・ラボラトリーズ社製）」を増殖培地の
中の腫瘍細胞のモルイヤーに加えた。１〜２分振盪後、
トリプシン／　ＥＰｒＡＰｒ−を除去しそして新しい同
一混合物の区分貴で置換させた。得られた混合物を３７
℃で５〜１０分インキュベートして完全な細胞剥離を確
実（てした。この細胞を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）含有のＲＰＭ１１６４Ｄ培地に８濁させ、そして標準
茂術を使用して計算した。このようにして製造されたＭ
ＣＦ−７およびＡ３７５細胞をＢＳＡでコーティングさ
せたミクロ遠心管中で２時間３７℃でＺｎ　、　９９ｍ
Ｔｃ−ＭＴ／Ｂ６．２（０，０１６６５ｕＣｉのコンジ
ュケ゛−ト、１、５３　ｍｃｉ　／■）と共にインキュ
ベートした。
インキュベーションの終りに細胞を遠心分離によって非
結合ＭＡｂから分離させ、　ＲＰＭ工１６４０培ｊＪｋ
　（＋１　’ＩｓＡ　）テ３　回Ｒイ、ソシテ９９ｍＴ
Ｃ活性を計算した。Ｔｃ−標＠Ｂ６．２の約７０％が単
一細胞懸濁において抗原陽性ＭＣＦ−７細胞に結合し、
一方対照Ａ３７５細胞には９９ｍＴＣ活性の５％未満し
か結合しなかった。抗−ＴＨＹ１．１ＭＡｂに見られる
ように、ｆとＢ６．２のコンジュゲートは抗原に対する
特異性が全般的に保持されたコンプレックスを生成させ
る。
ｃ）　　Ｚｎ、９９ｍＴｃ−メタロチオネイン／Ｂ６．
２の生体薬品作用機構 放射性沃素化Ｂ６．２は無胸腺マウスで生体内で人乳癌
異種移植を標的としてきたことが示されている（「Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ　ｉｇ　４３巻第７３６
頁（１９８３）参照〕。ＭＴのコンジュゲートがＢ６．
２の人乳癌を標的とする能力に及ぼす効果を測定するた
めに、クラウザーまたはＡ３７５固型膿瘍を有する無胸
腺マウスにおいて″９ｍＴｃ標識ＭＴ／Ｂ６．２を評価
した。Ｂ６．２抗原陽性であるクラウザー腫瘍（「Ｃａ
ｎｃｅｒＪ第ａ巻第２２６９頁（１９７８））およびＢ
６．２抗原陰性のＡ３７５腫瘍（「Ｊ、Ｎａｔ１．ｃａ
ｎｃｅｒ　工ｎｓｔ、Ｊ第辷巻第」４１７頁（１９７３
））を無胸腺マウスの背中の表面上の皮下部位で増殖さ
せた。２００〜６００ｖｆの腫瘍を有する各マウス（１
７〜２５り）に５０　ｕＣｌのＺｎ　、　９９ｍＴｃ−
ＭＴ／Ｂ６．２を注射しそして４８時間にわたって種々
の時点で殺害した（一つの時点あたり３〜４匹のマクス
）。選ばれた臓器を取り出し、秤量しそして９９ｍＴＣ
活性を測定した。抗原陽性（Ａｇ＋）クラウザーおよび
非特異性抗原陰性（Ａｇ″″）対照Ａ３７５臘瘍におい
て見出されたＺｎ　、　’　”Ｔｃ／Ｂ６．２の１２当
りのチ注入用量は表ｍに与えられている。表■に示され
ているデータに基づいてＺｎ、９９融Ｃ−■Ｖ院、２は
生体内でＢ６．２の人乳癌を標的とする能力を保持して
おり、特に２４時間ではタラワザー腫瘍中の取込みはＡ
３７５に比べて約３：１である。
放射性沃素化Ｂ６．２に対して発表された生体分布デー
タと比べた場合〔前記「ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｓａｒｃ
ｈＪ第５ｓａｒｃｈＪ第旦９８３）参照〕　９９融Ｃ−
標識Ｂ６．２ははるか罠より速やかに血液から除去され
る。結論として、　ＭＴのＢ６．２へのコンジュゲート
はその人乳癌に特異的に局在する能力を損なうことはな
（そして血液からの放射能源＠Ｂ６．２の除去を促進さ
せる。
表　　■ ”ｍＴｃ−）”ｏチオネイ７／Ｂ６．２＜注入薬量％／
９　）り５ウザー　腫瘍　　３．３７−１＝０．３９　
　７．７２±３．３８　１７．００±４．５０　　６．
１８±１．０１血液　３３．６２±２．８３　１３．５
８±２２９　７．７４±６．０４　２．．５３士０．２
４牌臓　１３．９９±３．３６　１４．１７±３．０６
　３４．６６±１４．４８５．６４±０．４９肝臓　１
５．７２±１．７８　１４．５３±０．９７　２１．９
３±４．７４　３．６１士０．７１腎臓　１８．０７±
０．９１　１４．２７−？２．４２　１８．５４±２．
３４　３．５０±０．５９筋肉　０．９６＝０．１４　
０．８６±０．１１　２．９２１：２．００　０．５２
±０．１６肺　　１０．２５±１．５３　４．７６±０
．６８　２．１１±０．４６　１．１７±０．１４Ａ３
７５　　腸瘍　　２６３±１．３０　　１．９８±１．
０６　５．４ｉ±０．４７　２．１５±０．２４血液　
３１．０５±３．８０　１７．１５±１．０６　６．４
９±７．５７　６．９５±０．０８牌臓　１７４３±９
．３３　９．５８±４．０５　２３．５３±１０．４３
　６．２５±４．３０肝臓　１５．４２±６．０８１２
．９４±２．３９　１６．２社５．８７　５．７０士０
．７２腎臓　１Ｚ０６±２．４４１３．５４±１．５２
１８．０１±２．０１　５．９５±０７５筋肉　　１．
６２±０．９２　１．０３±０．２５　２３１±２．０
’　　０．４７±０，６６肺　　　７．２４±０．６９
　　６．１４±０．３２　３．８９ｆ１．３８　２．６
９±０．１２ａ）　　Ｚｎ、９９ｒｎＴｃ−ＭＴ／Ｂ６
．２１ｉ２’用（７）腫瘍（’）検出乳癌の検出・に対
して”ｍＴｃ−ＭＴ／Ｂ６．２がＭ用であることを示す
ために、２００ｕＣ１のＺｎ、　””ｒｃ−ＭＴ／Ｂ６
．２をクラクザーまたはＡ３７５腫瘍を有する無胸腺マ
ワスに静脈内に注射した。各動物を５．０＋ｍピンホー
ルコリメーターを有する標準ｒ線カメラを使用して画像
形成させた。注射後６時間の早い時点で、クラウザー腫
瘍（Ａｇ”）中には可視的な特異的すＺｎ　、　９９ｍ
Ｔｃ　−ＭＴ／Ｂ６．２７５：蓄積されているのが証明
された。Ａ３７５腫ｉ１ｉＡＡｇ−）中には取込みは証
明されなかった。画像中ば出現した唯一のその他の臓器
は肝臓であった。
注射後２４時間ではクラワザー腫瘍は明らかに輪郭が描
かれていた。腫瘍中で観察された９９Ｈ１Ｔｃのカクン
トは肝臓中で観察されたものに等しいように思われた。
膀胱および腎臓中にもまた活性が存在していた。それと
対照的にＡ３７５腫瘍中には９９ｍＴｃ−標識Ｂ６．２
の可視的蓄積は存在しなかった。こｎらの結果は、生体
内Ｋｇける乳癌組織中の９９ｍＴｃ−標識■／Ｂ６．２
の迅速で特異的局在性？よび人乳癌の診断およびステー
ジ決定ＫＸいて９９ｍＴｃ−標識ＭＡｂが有しうる有用
性を示している。
例　　■ Ｚｎ　、　’　９ｍＴｃ−メタロチオネイン／抗人乳癌
Ｂ　６−２　Ｆ　（ａｂ’　）２の製造および評価 ａ）　　Ｚｎ、　９９ｍＴｃ−ＭＴ／８６．２　Ｆ（ａ
ｂ’）２の製法シグマ・ケミカル社より入手したペプシ
ン（６０ｕｇ）および３　ｒｎＱの０．１Ｍ酢酸ナトリ
ワムバツファー（ｐＨ４，０）中の抗人乳＠、Ｂ６．２
　（３１ｎ９）の溶液を３７℃で１晩インキユベートさ
せた。生成した蛋白質分解フラグメントを０．０５Ｍ燐
酸ナトリワムバツファー（０，１５Ｍ塩化ナトリワム含
有、ｐＨ７，０）で４℃で透析〔スはクトラ／ポル（５
０，ＯＯＯＭＷＣＯ））することによりＢ６．２　Ｆ（
ａｂ’）２から分離させた。このＢ６゜７Ｆ（ａｂ’）
２　　をビオラドＴＳＫ−２５０カラムを使用して、１
．　Ｑ　ｍＱ　７分で０．１Ｍ燐酸ナトリウムバッフ７
−　（ｐＨ７０）で溶出させるサイズ排除ＨＰＬＣおよ
び非還元性Ｓ正ポリアクリルアミドゲル電気添加により
分析した。Ｂ６．２　Ｆ（ａｂ’）２を０．２Ｍカーボ
ネート／バイカーボネートバッフ７−　＜　ｐＨ９，５
）　中ノ溶液とする第２の透析の後で例■においてＢ６
．２について記載されているようにして０．６〜Ｚｎ−
ＭＴおよび１１＋１５＋のグルタルアルデヒドを便用し
て、Ｚｎ−ＭＴとのコンジュゲート化を達成した。この
Ｚｎ−ＭＴ／Ｂ６．２　Ｆ（ａｂ’）２　（１，５６１
９）を１６５ｍＣ１の９９ＩｎＴｃ−グル；スカン＠　
（ニューイングランド・ニュークリアー社〜）を加えそ
して３０分混合させることにより交換標識させた。ビオ
ラドＴＳＫ−２５０ゲルＰ通カラムを使用し、且つ１．
０１１１＋！／分で０．１　Ｍ　ホスフェートバッファ
ー（ｐＨ７，０）で浴出させるサイズ′排除ＨＰＬＣＫ
よるＵＳ後、１７．６ｍＣ１のｗ９ｍ、ｒｃがＺｎ。
″”Ｔｃ　−ＭＴ／８６．２　Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２
と共に残った。
ｂ）Ｚｎ、”ｍＴｃ−ＭＴ／８６．２　Ｆ（ａｂ’）２
コンジユゲートの結合 Ｂ６．２が標的とする抗原に対するＢ６．２のＦ（ａｂ
’）２二量体の活性についてＭＴコンジュゲーションの
効果を例Ｖ％　ｂに記載の胤胞結合検定を使用してＦＦ
価Ｌｆ。Ｚｎ、？油Ｔｃ−ＭＴ／Ｂ６．２　Ｆ（ａｂ″
）２コンジユゲート（２，２９ｎｇ、比活性＝　１１．
３ｕＣｉ／ｕｇ　）を才重々のき度のＭＣＦ−７（Ａｇ
”）およびＡ３７５（Ａｇ−ンｉｉａｍとインキュベー
トさせそして結合した”ｍＴｃ　−標識コンジュゲート
のパーセントラ画定した。この結果は％　　９９ｒｎＴ
Ｃ−ａ識コンジュケ゛−トの約７０〜８ｏ％が標的ＭＣ
Ｆ−７細胞に結せし、一方、非標的Ａ３７５　ｍ胞には
５％未満の結せしかなかったことを示した。丁なわちＢ
６．２のＦ（ａｂ’）２　ＫａｇするＺ　ｎ−ＭＴのコ
ンジュゲーシヨンは抗原によりその結合を低下させず。
また抗原に対するその特異性を変化させることもない。
ｃ）　　Ｚｎ、９９！ｎＴｃ−ＭＴ／Ｂ６．２　Ｆ（ａ
ｂ’）２の生体内薬品作用機構 放射性沃素化Ｂ６−２　Ｆ（ａｂ’）２の、無胸腺マヮ
スにおける人乳癌異種移植を標的とする能力は「Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ　制已巻第７３６頁（１９
８３）に示されている。クラワザーおよびＡ３７５腫瘍
を担持する無胸腺マヮスを使用して、　Ｚｎ、　９９融
Ｃ−ＭＴ／Ｂ６．２　Ｆ（ａｂ’）２の生内体特異性お
よび薬品作用機構を測定した。各腫瘍担持マヮスに４８
．５ｕＣ１の９９！ｎＴｃ−標ｍＦ（ａｂ’）２　コン
ジュケ゛−ト（比活性−６，７ｕｃｉ／ｕｇ　）を注射
し、そして種々の時点で１２轟りの注入用量係を測定し
そして表ＩＶＫ記載した。２４時間の時点におけるクラ
ワザー腫瘍の取込みの、　Ａ３７５腫瘍の取込みに対す
る比は約２：１であった。このことはＭＴコンジュゲー
ション後のＥ６．２　Ｆ（ａｂ’）２の腫痩特異性の保
存を明白に示している。
’ｌ　ＶＩ！１ＴＣ−標ａ’　Ｂ６．２　Ｆ（ａｂつ２
の血液よりの排除（ｂ：Ｌｏｏｄ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ
）は９９ｍＴｃ標識無処理のＢ６．２について観察され
たものと大体同一であった。すなわちこの””Ｔｃ−標
ｍ　Ｂ６．２　Ｆ（ａｂ’　）２の特異性およびその迅
速な血液からの排除はＭＴで標識されたＢ６．２の７ラ
グメントがＺｎ、　９′ｍＴｅ−ＭＴ　／無処理Ｂ６゜
２に対して観察されたと同様の生体内腫瘍標的性に対す
る有用性を有していることを示す。
表■ ９９ｍＴｃ−メタロチオネイン−Ｂ６．２−Ｆ（ａｂ’
）２　（注入用量％／２ンクラ７？’−ｆｉ　　３．９
８±０．５（５６，４５＋、１．３６　　６．０８ｆ０
．６８　　　４．５４ｆ０．６４血液５２５４±１２．
９５２７．７１＝！ｊ、０５　１１．４７ｆ１．２７　
　７．３５ｆ１．３６炉期−５７１±α５３　　６．０
０±０．５８　　　６．２吐０．９９　　　　４．８１
±０．３９肝鷹３８２０±５．０１°４５．６０±１３
．４６３６．０９±１０．０６　５３．７２軸腎臓　７
４５工１．０００６．７辷１．５９　　５．８９±２．
４６　　　２２８゜筋肉　２．９１±２５０　　１．８
４±０：２０　　１３９±０．４７　　　２．１８±１
３７ＩＣ艦１０．１５６±３．６４　１０．３８±２２
６　　４．７６±０．７６　　　２．９９±０．８８ｎ
÷　　　　３　　　　　　３　　　　　　　３　　　　
　　　３Ａ３７５　腫瘍　２５６±１．３０　　５．４
６±１．７３　　２．９７±０．５４　　　２ｆ）７”
血液３０．７吐５．４１　２７．６３ｉ−１，７３１０
，９５±Ｏあ４　５７２牌臓　７．２３±０．７７　　
７．２２＋０．４９　　６．２８±０．７９　　　４０
１肝臓５１．５３±１０．７７４６．９６±１８．９８
３３．４５±１３．１０８９．０６腎臓　６，６０±１
．０８　　　ＥＬ５０±５．２５　　６．５５±０．３
２”　　１０．２４筋肉　１．７６±０．４９　　２．
００±０．８２　　２２９±１．８８　　　０．９０１
０艦　８．０１±１．３８　　９．３７±２２７　　３
．１９±１．６６　　　４．３３ｎエ　　　　３　　　
　　　３　　　　　　　３　　　　　　１舎ｎｗ７ ”ｎ冨１

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）求標的生物活性分子とメタロチオネインまたはメタ
    ロチオネインフラグメントとの接合体であって、前記生
    物活性分子がレセプターに結合しかつ哺乳動物体のある
    器官、組織および細胞中に局在する抗体、抗体フラグメ
    ント、ホルモン、ペプチド、蛋白質および薬物よりなる
    群から選ばれそして前記メタロチオネインまたはメタロ
    チオネインフラグメント中のすべての金属が （ａ）非放射性であり、且つ （ｂ）Ｔｃ、Ａｇ、Ａｕ、ＨｇおよびＣｕ（II）よりな
    る群 から選ばれた陽イオンよりもメタロチオネインに対する
    低い親和性を有することを特徴とする接合体。 ２）非放射性金属がＺｎである前記特許請求の範囲第１
    項記載の接合体。 ３）求標的生物活性分子が抗体またはそのフラグメント
    である、前記特許請求の範囲第１または２項記載の接合
    体。 ４）抗体がモノクロナール抗体である前記特許請求の範
    囲第３項記載の接合体。 ５）モノクロナール抗体が抗−ＴＨＹ１．１および抗−
    人乳癌Ｂ６．２よりなる群から選ばれる、前記特許請求
    の範囲第４項記載の接合体。 ６）メタロチオネインまたはメタロチオネインフラグメ
    ントが哺乳類のものである、前記特許請求の範囲第１、
    ２、４または５項のいずれか１つに記載の接合体。 ７）メタロチオネインまたはメタロチオネインフラグメ
    ントが哺乳類のものである、前記特許請求の範囲第３項
    記載の接合体。 ８）メタロチオネインまたはメタロチオネインフラグメ
    ントの金属の少くとも一部がＴｃ−９９ｍである、メタ
    ロチオネインまたはメタロチオネインフラグメント。 ９）メタロチオネインまたはメタロチオネインフラグメ
    ントが哺乳類のものである、前記特許請求の範囲第８項
    記載のフラグメント。
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