NO166267B

NO166267B - Konjugat av et maalsoekende biologisk aktivt molekyl og en forbindelse inneholdende spormerkende metall, samt diagnostisk preparat inneholdende konjugatet.

Info

Publication number: NO166267B
Application number: NO844017A
Authority: NO
Inventors: Glen Lewis Tolman
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1983-10-06
Filing date: 1984-10-05
Publication date: 1991-03-18
Also published as: CA1248090A; FI843930L; ES8605105A1; JPH01294700A; GR80560B; DK480284D0; NO844017L; FI843930A0; EP0137457B1; AU578428B2; FI81263B; ATE32730T1; KR850002961A; IL73183A; DK162105C; IL73183A0; KR860001151B1; IE55709B1; US4732864A; EP0137457A2

Description

Oppfinnelsen angår et konjugat av et målsøkende biologisk aktivt molekyl og en forbindelse inneholdende spormerkende metall, foruten et diagnostisk preparat som inneholder konjugatet som en aktiv bestanddel. Et målsøkende biologisk aktivt molekyl kan være et antistoff, antistoff-fragment, peptid eller protein som binder seg til visse organer, vev og celler i legemet hos mennesker og pattedyr.

Bruken av radiomerkede, målsøkende biologisk aktive molekyler (nedenfor betegnet BAM; BAM = Biologisk Aktive Molekyler) spesielt antistoffer og andre proteiner, for diagnostiske og terapeutiske formål er en meget aktuell metode på et meget aktivt område. For en redegjørelse for slik radiomerking vises det til Eckelman et al., Radiolabeling of Anti-bodies, Cancer Research, 40:3036-3042 (1980) og Sfakianakis et al., Radioimmunodiagnosis and Radioimmunotherapy, J. Nucl. Med. 23:840-850 (1982). Den metode til å radiomerke antistoffer som har funnet mest utstrakt anvendelse, har vært metoden med direkte jodering med J-131, J-125 eller J-123. Imidlertid er disse radionuklider beheftet med visse ulemper hva dosimetri og avbildning angår. Visse metalliske radionuklider, som f.eks. Tc-99m og In-111 er bedre egnet for scintigrafisk avbildning. Imidlertid har det hittil vært vanskelig å binde disse metalliske radionuklider direkte til de fleste BAM-er, fordi det vanligvis er utilstrekkelig affinitet mellom radionuklidet og BAM-et. I enkelte tilfeller hvor slik binding har vært mulig, har tilbindingen av radionuklidet dessuten av og til resultert i partielt eller fullstendig tap av BAM-ets biologiske aktivitet.

Av disse grunner er det av mange i faget blitt fore-slått å radiomerke BAM-er med metalliske radionuklider gjennom kovalent binding under anvendelse av et metallchelaterings-middel. Eksempelvis beskrives det i Khaw et al., Science 209:295-297 (1980) antistoffer til hjertemyosin merket med In-111 diethylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) og bruk av de merkede antistoffer til avbildning av myocardialt infarkt. I Krejcarek et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:581-585

(1977) beskrives anvendelse av DTPA til å merke proteiner, som f.eks. humanserumalbum (HSA) med metallradionuklider. I Prit-chard et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 151:297-302 (1976) beskrives binding av antistoffer til diverse midler som er istand til å chelatere In-111, som f.eks. transferrin, D-peni-cillamin og deferoxamin. I Europeisk patentsøknad nr. 35 765 offentliggjort i 1981 (Yokoyama et al.) beskrives deferoxamin som et bifunksjonelt chelateringsmiddel for radiomerking av diverse BAM-er, deriblant proteiner (f.eks. HSA, urokinase, fibrinogen), antibiotica (f.eks. "Bleomycin", "Kanamycin"), hormoner, saccharider og fettsyrer. I europeisk patentsøknad nr. 38 546, offentliggjort i 1981 (Haber et al.) beskrives DTPA, ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og ethylendiamin som bifunksjonelle chelateringsmidler for radiomerking av proteiner, deri innbefattet antistoffer, antigener og antistoff ragmenter. I US patentskrift hr. 4 287 362, som ble bevilget i 1981 (Yokoyama et al.), beskrives 3-carboxy-2-oxo-propionaldehyd-bis-(N-methylthiosemicarbazon) (OPBMT) og analoge forbindelser som bifunksjonelle chelateringsmidler for radiomerking av proteiner. I US patentskrift nr. 3 994 966, bevilget 1976 (Sundberg et al.), US patentskrift nr. 4 043 998 (Meares et al.) og Leung et al., Int J. App. Radiation and Isotopes 29:687-692 (1978) beskrives bifunksjonelle EDTA-analoger, som f.eks. l-(p-benzendiazonium)-EDTA og 1-p-amino-fenyl-EDTA for merking av proteiner. I Paik et al., J. Radio-anal. Chem. 57:553-564 (1980) beskrives et azo-derivat av DTPA betegnet DTTA-azo-imidat som et bifunksjonelt chelateringsmiddel og dets anvendelse for å merke HSA med In-111. Alle de bifunksjonelle chelateringsmidler som hittil er blitt beskrevet, er imidlertid vanligvis blitt angitt å skulle koordineres med et spesifikt radionuklid. Det ville derfor være ønskelig å frembringe et chelateringsmiddel som ville være istand til å kunne koordineres med forskjellige metallkationer og være istand til å bindes til BAM-er, samtidig som BAM-enes biologiske aktivitet bibeholdes.

Videre er de intravaskulære radiografiske kontrastmidler som for tiden anvendes, basert på joderte aromatiske forbindelser. Disse forbindelser har imidlertid ofte vist seg ikke å være fysiologisk holdbare i de aktuelle konsentrasjoner. Derfor ville det være ønskelig å utvikle fysiologisk forlikelige alternativer til slike joderte forbindelser.

Det har nu vist seg at man med overraskende godt resul-tat kan anvende metallothionein som en bærer for spormerkende metall ved merking av BAM-er. I tillegg til at metallothionein vil kunne koordineres med et bredt utvalg av metaller, frembyr det også den fordel at det er istand til å binde så mange som 10 atomer metall pr. molekyl. Derfor vil metallothionein binde et bredt utvalg av spormerkende metaller og gi mulighet for å innlemme fra ett til 10 mol metall pr. mol bifunksjonelt chelateringsmiddel. Ganske overraskende forstyrrer ikke tilbindingen av metallothionein til BAM-er den biologiske aktivitet av BAM-ene.

Med oppfinnelsen tilveiebringes det således nu et konjugat av (i) et målsøkende biologisk aktivt molekyl valgt blant antistoffer, fragmenter av antistoffer, peptider og proteiner som binder seg til reseptorer og lokaliserer seg i visse organer, vev og celler i legemet hos mennesker og pattedyr og (ii) en forbindelse inneholdende spormerkende metall. Det nye konjugat er særpreget ved at forbindelsen inneholdende spormerkende metall er et metallothionein eller metallothioneinfragment hvor i det minste en del av metallet utgjøres av et spormerkende metall som har tilstrekkelig affinitet til thioneinet eller thioneinfragmentet til å bindes til dette.

Fortrinnsvis er det spormerkende metall et radionuklid valgt blant ruthenium-97, technetium-99m, kvikksølv-197, gallium-68, osmium-199, indium-111, indium-113m og bly-203, mest foretrukket technetium-99m.

Metallothioneiner

Metallothioneiner er beskrevet i Metallothioneins: Proceedings of the First International Meeting on Metallothionein and Other Low Molecular Weight Metal-Binding Proteins, Zurich, Juli 17-22, 1978, redigert av Kagi og Nordberg, Birkhauser Verlag Basel, 1979 (heretter "Kagi og Nordberg"), s. 46-92. Et sammendrag er gitt nedenfor. Metallothionein ble oppdaget i 1957. Det kadmium- og sinkholdige protein ble isolert fra hestenyrer. Praktisk talt det samme protein ble senere funnet hos kaniner, mennesker, aper, kveg, sauer, griser, hunder, hamstere, rotter, mus og seler. Metallothionein fra hest ble angitt å ha: en molekylvekt på 6000-7000, et høyt metallinnhold, et høyt cysteininnhold, intet innhold av aromatisk aminosyre, optiske egenskaper som for metallthiolater (mercaptider) og en fast fordeling av cysteinylrester. Det var enighet på plenumsmøte i det ovenfor omtalte First International Meeting on Metallothioneins om at proteiner som ligner på renalt metallothionein fra hest med hensyn til flere av disse trekk, kan betegnes som "metallothionein" (Kagi og Nordberg, s. 48), og slik benyttes betegnelsen i denne beskrivelse. Selvfølgelig er også metallo-thioneinfragmenter nyttige ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse, og likeledes funksjonelt likeartede polypeptider med minst seks aminosyrerester.

Generelt sett er metallothioneiner lavmolekylære proteiner som produseres in vivo, og som chelaterer et bredt utvalg av metallioner med høy affinitet. Metallothioneinenes fysiologiske funksjon er ikke helt klarlagt, men det er ålment akseptert at de utøver en funksjon ved homeostasen av viktige metaller og ved detoksifiering av tungmetaller. Metallothioneiner finnes hos alle høyere hvirveldyr, hvirvelløse dyr og eukaryotiske og prokaryotiske mikroorganismer. Mange orga-nismer vil, når de utsettes for metallioner, for eksempel ioner av Cd, Hg, Zn eller Cu, igangsette hurtig ny syntese av metallothioneiner gjennom øket produksjon av mRNA for apo-proteinthionein. Derfor er også molekyler, som f.eks. cadystin, som produseres av visse mikroorganismer i respons til Cd-injeksjon, også aktuelle for anvendelse i henhold til oppfinnelsen.

Alle thioneiner fra pattedyr inneholder 60-61 aminosyrerester og kan binde 7 atomer toverdig metallion eller inntil 10 atomer énverdig metallion pr. molekyl. Thioneiner inneholder ingen aromatiske rester eller histidinrester, og 20 av aminosyrerestene i thioneiner fra pattedyr er cysteiner. Spektroskopiske undersøkelser viser at thioneins metalltilbinding skjer nesten utelukkende gjennom cysteinenes sulf-hydrylgrupper.

Fordi sulfhydrylgruppene i metallothioneiner er bundet til metallioner, er de vanligvis ikke tilgjengelige for å tjene som funksjonelle grupper for tilbinding til BAM-er, men andre grupper, som f.eks. -NH2, -0H og -COOH er tilgjengelige, og metallothioneinene kan således bindes kovalent til BAM-er under anvendelse av reagenser og metoder hvor slike grupper benyttes, slik dette vil bli redegjort for mer detaljert nedenfor.

Komplette aminosyresekvenser for flere metallothioneiner er blitt bestemt. De er angitt på side 60 i Kagi og Nordberg, og utvalgte slike sekvenser gjengis her: en aminosyre som er forskjellig fra cystein. Tabellen innbefatter et metallothionein fra Neurospora crassa med meget lavere molekylvekt enn metallothioneinene fra pattedyr. Som angitt på side 55 i Kagi og Nordberg er høymolekylære metallothioneiner (9 500-10 000) blitt isolert fra andre mikroorganismer. Alle disse metallothioneiner faller innenfor opp-finnelsens ramme, skjønt metallothioneiner fra pattedyr foretrekkes. For diagnostiske og terapeutiske formål in vivo foretrekkes det spesielt å anvende et metallothionein fra samme art som pattedyret som behandles.

Metallbindende fragmenter av thionein, for eksempel de som beskrives i Yoshida et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 76:486-490 og i Kondo et al., Tetrahedron Letters, 24:925-928, som begge innlemmes heri ved henvisning, kan også benyttes i henhold til oppfinnelsen. Fragmentene av thionein fra mus, som er blitt syntetisert av Yoshida et al., har de følgende aminosyresekvenser, hvor bokstavsymbolene har de samme betydninger som i den ovenstående tabell 1.

1. H2N-K-C-T-C-C-A-0H

2. H2N-A-C-K-D-C-K-C-T-0H

3. H2N-S-C-T-C-T-S-S-C-A-OH

4. H2N-G-C-S-K-C-A-Q-G-C-V-OH

5. H2N-G-C-V-K-G-A-A-D-K-C-T-C-A-OH

Metallbundne fragmenter av thioneiner (dvs. metallo-thioneinfragmenter), som f.eks. dem som er blitt syntetisert av Yoshida et al., egner seg for anvendelse i henhold til oppfinnelsen, skjønt fullstendige metallothioneiner for tiden foretrekkes.

Det vil selvfølgelig være åpenbart for en fagmann på området at polypeptider med tilsvarende funksjonelle egenskaper som metallothionein, og likeledes copolymerer av metallothionein/metallothioneinfragmenter og konvensjonelle monomerer, fremstilt under anvendelse av konvensjonelle synteseteknikker, også kan anvendes ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse, såfremt de oppviser de generelle karakteristika for metallothionein som det er redegjort for i

detalj ovenfor.

Spormerkende metaller

Blant de hittil kjente diagnostiske radionuklider er de følgende anvendelige for utførelse av den foreliggende oppfinnelse (halveringstiden er gitt i dager (d) eller timer (h)):

De diagnostiske radionuklider er gamma-emittorer og/eller positron-emittorer, idet de emitterer energier mellom 30 KeV og 1 MeV og oppviser halveringstider på mellom ca. 1 minutt og 8 dager. Disse radionuklider er anvendelige i forbindelse med konvensjonelle radioscintigrafiske avbildnings-teknikker basert på planare, enkeltfoton- eller positron-tomografiske metoder.

Når radionuklidene benyttes for avbildningsformål, må den benyttede dose være tilstrekkelig stor til at det i diagnostisk henseende oppnås brukbare bilder, og vanligvis er dosen i området fra 0,1 til 20 mCi/70 kg kroppsvekt. Selv-følgelig vil den riktige dose i siste omgang avhenge av radio-nuklidets fysikalske egenskaper, som f.eks. halveringstiden, strålingstypen og strålingsenergien, samt av det radiomerkede middels farmakokinetiske egenskaper.

Blant de kontrastmidler som hittil har vært ansett som brukbare for radiografisk avbildning anses de metalliske grunnstoffer i det periodiske system med nummer fra 72 til 83 å være anvendelige i forbindelse med oppfinnelsen, og vismut, bly, kvikksølv, gull, platina, rhenium og wolfram foretrekkes.

Spormerkende metallothionein

Det er generelt to fremgangsmåter som kan benyttes for å fremstille spormerket metallothionein. Ved den første fremgangsmåte foretas direkte merking av thionein. Ved den andre fremgangsmåte foretas utvekslingsmerking på et metallothionein, som f.eks. Zn-metallothionein, idet det benyttes et ønsket spormerkende metall.

Den første fremgangsmåte, dvs. fremgangsmåten hvor det foretas direkte merking av thionein med spormerkende metall, tilsvarer den som beskrives av M. Vasak og J. Kagi, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:6709 (1981). Vanligvis oppløses thionein fra pattedyr ved pH 2, og eventuelt uoppløselig materiale fjernes ved filtrering. Til denne oppløsning av thionein settes det spormerkende metallkation og eventuelle ønskede ikke-spormerkende metallkationer. Den totale konsentrasjon av spormerkende metallkation og ikke-spormerkende metallkation må være tilstrekkelig til å sikre at det blir tilgjengelig minst 7 toverdige eller 10 énverdige metallkationer pr. thionein, eller egnede kombinasjoner av toverdige og énverdige kationer til å fylle opp alle metallbindende punkter på metallothioneinet. På grunn av thioneinets unike egenskaper kan det fremstilles metallothioneiner som inneholder mer enn ett metallkation. Da det derfor er mulig at alle thioneinets metallbindende punkter kan opptaes av spormerkende metall, kan det fremstilles spormerkede metallothioneiner av meget høy konsentrasjon.

Konsentrasjonen av det tilsatte radionuklid avhenger av den spesifikke aktivitet som kreves ved den påtenkte anvendelse. For diagnostiske anvendelser kan antall mol radionuklid pr. mol thionein være så lite som 1 eller mindre. Ikke-radioaktive metallkationer kan tilsettes i tilstrekkelige mengder til å oppta metallbindingsseter, som ikke er opptatt av radioaktive kationer. Etter tilsetningen av radionuklider og eventuelt av ikke-radioaktivt metallkation blir den resulterende oppløsning grundig avgasset for å fjerne oxygen og nøytrali-sert i en inert atmosfære, inntil pH-verdien er høyere enn 7,0. Under denne nøytralisering folder thioneinet seg rundt radionuklidet og de ikke-radioaktive metallkationer og danner det ønskede radiomerkede metallothionein. Det merkede metallothionein kan så renses etter konvensjonelle metoder, som f.eks. ved dialyse, separasjon etter størrelse eller ione-vekslingskromatografi. Innholdet av ikke-radioaktivt metall på det radiomerkede metallothionein kan bestemmes ved atomabsorp-sjon, og innholdet av radionuklid kan bestemmes ved telling av den radioaktive spaltning. Dette rensede radionuklid-merkede

metallothionein kan så kobles direkte til et BAM under anvendelse av bifunksjonelle koblings- eller tverrbindingsmidler, som beskrives nedenfor. På grunn av den tid som kreves for å fremstille radionuklid-merket metallothionein og å koble dette til de ønskede BAM-er, foretrekkes det å anvende radionuklider, som f.eks. Ru-97 og Hg-197, som har halveringstid på mer enn 24 timer, for anvendelse ved denne metode for direkte merking.

Ved den andre fremgangsmåte for merking foretas en utveksling av samtlige eller en del av metallothioneinets ikke-spormerkende metallkationer med et spormerkende metallkation. For at denne utvekslingsreaksjon skal forløpe på tilfredsstillende måte kreves det at det spormerkende kation har høyere affinitet til metallothioneinets mercaptider enn det ikke-spormerkende kation i det forhåndsfremstilte metallothionein.

Ved anvendelse for eksempel av radionuklider som det spormerkende metall har sink-kationer lavere affinitet til metallothioneinets mercaptider enn kationer av technetium, kvikksølv eller sølv. I nærvær av kationer av technetium-99m, kvikksølv-197 eller sølv-111 vil Zn (II)-kationer av Zn-metallothionein (MTh) lett fortrenges, slik at det fåes hen-99m 197 111

holdsvis Zn/ Tc-MTh, Zn/ Hg-MTh eller Zn/ Ag-MTh. Da således Zn-MTh lett lar seg fremstille etter den ovenfor omtalte fremgangsmåte ifølge Vasak et al., kan utvekslingsmerking av Zn-MTh eller et konjugat av Zn-MTh-BAM foretas ved å blande Zn-MTh eller Zn-MTh-BAM-konjugat med et oppløselig

9 9m

utvekselbart radionuklid, for eksempel Tc-glucoheptonat, <197>HgCl2 eller <111>Ag(NH3)<*>. Etter utvekslingen kan det radiomerkede metallothionein renses etter konvensjonelle metoder, som f.eks. ved dialyse, separasjon etter størrelse eller ione-vekslingskromatografi. Utbyttet som oppnås ved utvekslingsmerking, kan bestemmes ved telling av den radioaktive spaltning og representerer den prosentandel av den totale radioaktivitet som er innlemmet i metallothioneinet. Kobolt (II)-, nikkel (II)- og sink (II)-kationer danner metallothioneiner som kan anvendes ved en fremgangsmåte ved utvekslingsmerking som involverer radionuklidene oppført i tabell II. Imidlertid er sink (II)-kationer de foretrukne ikke-radioaktive kationer for denne utvekslingsmerking. Fremgangsmåten ved utvekslingsmerking er særlig anvendelig når det benyttes radionuklider med halveringstid kortere enn 24 timer, fordi denne utvekslingsmerking kan utføres på det kliniske sted. Som videre redegjort for nedenfor gjør utvekslingsmerking av et Zn-MTh-BAM-konjugat med kortlivede radionuklider det mulig å innføre radionuklider umiddelbart før bruk, hvorved man unngår det uunngåelige tap av radioaktivitet ved spaltning.

Blant de ovennevnte radionuklider er <99m>Tc mest å foretrekke ved utvekslingsmerking på grunn av dets relativt korte halveringstid, fordi det lett fåes fra Mo-99/Tc-99m-dannere og fordi dette radionuklid har ønskelige fysikalske egenskaper. Radionuklidene Ag-111, Au-198 og Hg-197 er de mest foretrukne enten det gjelder direkte merking av thionein eller utvekslingsmerking, på grunn av den letthet med hvilken begge merkeprosedyrer lar seg utføre. Radionuklidene Ru-97, Pd-103 og Sb-119 lar seg lettest anvende ved fremgangsmåtene for direkte merking av thionein.

Som ovenfor nevnt kan disse radiomerkede metallothioneiner anvendes som mellomprodukter ved fremstilling av radiomerkede metallothionein-BAM-konjugater ifølge oppfinnelsen. Denne fremstilling vil bli beskrevet mer detaljert nedenfor.

Fremgangsmåter som er analoge med dem som er beskrevet for radiomerking av metallothionein, kan benyttes for innlemmelse av ikke-radioaktive spormerkende metaller. Blant dem som vil være nyttige for å oppnå radiografisk kontrast, nemlig Bi, Rh, Hg, Au, Pt, Re og W, kan kvikksølv og gull innlemmes i metallothionein ved utvekslingsmerking eller ved direkte binding til apoproteinet. Innlemmelse av de øvrige elementer foretas ved direkte merking.

Målsøkende biologisk aktive molekyler

Med betegnelsen "målsøkende biologisk aktive molekyler"

(BAM) menes her antistoffer (spesielt monoklonale antistoffer), Fab-, Fab'- F(ab')2~fragmenter av antistoffer og peptider og proteiner som lokaliserer seg i visse organer, vev eller celler i menneskers og pattedyrs legemer.

Det har overraskende vist seg at BAM-er, f.eks. monoklonale antistoffer Anti-THY 1.1 (L.L. Houston, R.C. Nowinski og I.D. Bernstein, J. Immunology, 125:837 (1980) innlemmet heri ved henvisning) og anti-human brystkreft B6.2 (D. Colcher, et.al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:3199 (1981) og andre kan bindes til Zn-metallothionein og konjugatet ut-vekslingsmerkes med f.eks. Tc-99m uten at det inntrer noen vesentlig reduksjon av BAM-enes immunoreaktivitet.

Binding

BAM-er kan bindes til metallothioneiner enten før eller etter radiomerkingen av metallothioneinet. Det foretrekkes vanligvis å foreta radiomerkingen før tilbindingen, fordi det kan benyttes strengere betingelser for radiomerkingen enn for tilbindingen. Når det imidlertid ønskes å foreta radiomerkingen ved utvekslingsmerking med et kortlivet radionuklid, som f.eks. Tc-99m, like før den kliniske anvendelse, foretrekkes det å foreta bindingen før radiomerkingen, som eksemplifisert nedenfor.

Metallothioneiner fra pattedyr innbefatter i typiske tilfeller de følgende aminosyrerester, som har funksjonelle grupper gjennom hvilke metallothioneiner kan bindes direkte til BAM-er, cystein, 20 thiolgrupper (-SH), lysin, 8 aminogrupper (-NH2); aspartinsyre/glutaminsyre, 4 eller 5 carboxylgrupper (-COOH); og serin/threonin, fra 10 til 14 hydroxylgrupper (-0H). Ikke alle aminosyrerester i metallothioneinet vil være tilgjengelige for binding, fordi enkelte deltar i visse funksjoner i metallothioneinet. SH-gruppene i cystein er involvert i metalltilbinding og reagerer under normale betingelser vanligvis ikke med reagenser beregnet for thioler. Bruken av partielt metallert metallothionein eller partielt metallerte fragmenter av metallothionein gjør det mulig å oppnå reaksjon med grupper -SH som ikke anvendes for metalltilbinding. Fjerning av en del av metallet fra metallothioneinet for å gjøre slike grupper -SH tilgjengelige for direkte tilbinding kan foretas ved behandling med sterke chelateringsmidler, som f.eks. EDTA eller DTPA. Lysin- og argininrestene er i stor utstrekning utilgjengelige for binding, fordi de deltar i elektrostatiske bindinger med de sterkt negative metallgrupper i metallothioneiner. Skjønt enkelte (1 til 3) av lysinene normalt er tilgjengelig, vil utsettelse av metallothioneinet for oppløsninger av høy ione-styrke føre til nedbrytning av elektrostatiske bindinger og resultere i bedre tilgjengelighet av lysin- og argininrester. Carboxyl- og hydroxylgruppene på overflaten av metallothioneinet er vanligvis tilgjengelige for binding til BAM-er, og de kan derfor være de mest foretrukne for tilbinding.

Bindingen av BAM-er til radiomerkede metallothioneiner som er dannet ved direkte merking av thionein eller ikke-radioaktive metallothioneiner for påfølgende utvekslingsmerking med radionuklid krever binding av metallothioneinenes tilgjengelige grupper -SH, NH2, -NHC(=NH)N<H>2, -C02H eller OH til komplementære funksjonelle grupper på BAM-et. Dersom BAM-et er et monoklonalt antistoff eller et annet glyco-protein, vil det inneholde de samme funksjonelle grupper som metallothionein, dvs. -SH -NH2, -OH, C02H og NHC(=NH)NH2. Når man har å gjøre med mindre forbindelser som ikke inneholder slike grupper, kan én av disse grupper innlemmes syntetisk i det lille molekyl, slik at binding til metallothioneinet kan finne sted. For en generell redegjørelse for slike syntetiske modifiseringer vises det til Means og Feeney, "Chemical Modi-fication of Proteins", Holden-Day, Inc. (1971). Deretter kan metallothioneinet og BAM-et sammenbindes direkte, under anvendelse av egnede reagenser og metoder. Vanligvis vil det både for binding av proteiner til metallothionein og for modifisering av metallothioneiner eller proteiner før disse inngår binding, være nødvendig å benytte milde betingelser for å unngå denaturering av metallothioneinet og BAM-et og tap av biologisk aktivitet. Reaksjonsblandingens pH-verdi bør være i området fra 3 til 11, fortrinnsvis i området fra 5 til 9, mens temperaturen bør være i området fra 0 til 60°C og konsentra-sjonene av henholdsvis BAM-et og metallothioneinet i området fra 10~<2> til 10~<6> M, fortrinnsvis ca. 10~<4> M. Det foretrukne oppløsningsmiddel er vanligvis vann, skjønt varierende mengder oppløsningsmidler som f.eks. dimethylsulfoxyd kan tilsettes for å oppløse ikke-polare tilbindingsmidler. For tilbinding av ikke-protein-BAM-er til metallothioneiner kan noe strengere betingelser tolereres av metallothioneinet, og reaksjonene kan utføres i organiske oppløsningsmidler, som f.eks. dimethyl-sulf oxyd .

Dersom metallothioneinet og BAM-et ikke inneholder komplementære grupper som inngår binding, vil det være mulig, istedenfor å modifisere metallothioneinet og/eller BAM-et syntetisk, å benytte tverrbindingsmidler for å oppnå den ønskede binding. Tverrbindingsmidlet må inneholde to i kjemisk henseende forlikelige reaktive grupper X og Y som danner ko-valente bindinger med funksjonelle grupper på metallothioneinet og BAM-et, og som er forbundet med en alkyl- og/eller aryl-kjede. Tverrbindingsmidlet har således formelen X-Cn~Y hvor Cn er alkyl eller aryl. De reaktive grupper X og Y må være forlikelige i kjemisk henseende, det vil si de må ikke reagere med hverandre under dannelse av polymerer. Da metallothionein og de fleste BAM-er inneholder grupper -NH2, -SH og -OH, vil foretrukne grupper for X og Y blant annet være alkylerende og acylerende grupper. De foretrukne alkylerende grupper for X og Y er halogensyrer, halogenestere eller halogenamider, aryl-halogenider og maleimider. Tverrbindlng under reduktiv alkylering av -NH2 grupper på metallothionein og BAM-et foretrekkes likeledes. Tverrbindingsmidler som f.eks. glutaraldehyd hvor X og Y er aldehyder og n = 3, har vist seg å være anvendelige for å binde radiomerkede metallothioneiner til monoklonale antistoffer ved reduktiv alkylering av slike -NH2 grupper. Foretrukne acyleringsmidler for X og Y innbefatter aktiverte carboxylfunksjonaliteter, som f.eks. klorider og anhydrider, imidoestere, thiolestere og N-hydroxysuccinimidestere. Vanligvis foretrekkes det å acylere aminer fremfor hydroxylgrupper, da amider er kjent for å være mer stabile in vivo enn estere.

De foretrukne grupper for X og Y ved dannelse av ko-valente bindinger med grupper -NHC(=NH)NH2 inkluderer 1,2- og 1,3-dicarbonylforbindelser, som f.eks. malondialdehyd, cyclo-hexan-1,2-dion og camforkinon. Reaksjonen mellom argininrester og disse reagenser er meget selektiv og er reversibel.

Den foretrukne gruppe for X og Y ved anvendelse av carboxygrupper på metallothioneinet og BAM-et for tverrbinding er aminogruppen. Når carboxylgruppen på metallothioneinet eller BAM-et aktiveres med et vannoppløselig carbodiimid, som f.eks. l-cyclohexyl-3-(2-morfolinyl-4-ethyl)-carbodiimid eller l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid, vil den aktiverte carboxylsyre reagere med X og/eller Y = -NH2 i et tverr-bindingsmiddel under dannelse av en amidbinding. Omsetning av slike carboxylgrupper på metallothionein og BAM-er med tverrbindingsmidler som inneholder aminogrupper, utgjør en fore-trukken metode for binding av metallothionein til BAM-er.

Vanligvis kan carbonkjeden som skiller X og Y fra hverandre, være enten alkyl eller aryl med n = 1-12. Valget av kjedelengde varierer med arten av det BAM som skal bindes. For store BAM-er kan det være nødvendig med en lengre kjede for å oppnå optimal dannelse av en kovalent binding mellom tverrbindingsmidlet bundet til metallothioneinet og de angjeldende funksjonelle grupper på det store protein. Ved anvendelse av små BAM-er kan det være nødvendig med en meget lang carbon-kjede for å tillate BAM-et som er bundet til metallothioneinet, å reagere med sin celleoverflatereseptor. Kjedelengden kan således varieres enten for å optimalisere tverrbindings-prosessen eller for å maksimere bibeholdelsen av biologisk aktivitet av metallothionein-BAM-konjugatet.

Enkelte kommersielt tilgjengelige tverrbindingsmidler foretrekkes for binding av metallothioneiner til monoklonale antistoffer. Eksempler på foretrukne tverrbindingsmidler er glutaraldehyd, N-(2-klorethyl)-maleimid, disuccinimidyltarta-rat, succinimidyl-4-p-maleimidofenyl)-butyrat, 2-iminothiolan og dimethyladipimidat.

De spormerkede konjugater ifølge oppfinnelsen anvendes på samme måte som de tidligere kjente sporemerkede BAM-er. De kan lyofiliseres for lagring og transport og deretter rekons-titueres i vanlig fysiologisk saltoppløsning og injiseres intravenøst for diagnostisk avbildning, eller de kan fremstilles umiddelbart før bruk ved utvekslingsmerking. De kan også benyttes ved forsøk in vitro og ved kliniske diagnosti-seringsmetoder på samme måte som de tidligere kjente spormerkede forbindelser.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av kvikksølv- 203- merket metallothionein fra thionein

Thionein ble erholdt fra kaninlever etter fremgangsmåten ifølge M. Vasak, et al., Biochemistry, 20:2852 (1981). 3-5 mg av dette thionein ble oppløst i 1,0 ml metallfri 0,1N HC1 og ble filtrert for å fjerne eventuelt uoppløselig materiale. Konsentrasjonen av det resulterende thionein ble bestemt spektrofotometrisk under anvendelse av en absorpsjons-koeffisient ved 220 nm på 7,9 mg" ml/cm" ved beregningen. Til en oppløsning av dette thionein (0,5 mg/ml) ble det satt

203

0,76 mCi av HgCl, (spesifikk aktivitet = 8,76 x 109mCi/-

203

mmol). Den resulterende thionein/ HgCl2-oppløsning ble grundig avgasset for å fjerne oxygen ved alternerende frysing og opptining av blandingen i vakuum. Under argonatmosfære ble

203

det erholdte thionein/ HgCl2 nøytralisert med metallfri 0,5M tris-(hydroxymethyl)-aminomethanbuffer (Tris-buffer) til en

203

pH-verdi høyere enn 7,0. Det resulterende Hg-MT ble under-kastet størrelsesekskluderende høytrykks væskekromatografi

under anvendelse av en J-60 gelfiltreringssøyle (fra Waters Assoc, Inc., Mllford, Mass.) og eluering med 0,025M fosfatbuffer (pH 7,0) ved 2,0 ml/min. Etter kromatograferingen var

90*3 203

98% av Hg_radioaktiviteten tilbake i Hg-MT_ Fordi det ikke gjør seg gjeldende noen isotopeffekt ved fremstilling av metallothionein, vil man ved i stedet å benytte 1• 97HgCl2 oppnå tilsvarende resultater.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av Zn/ Q Orn Tc- metallothionein ved vekslingsmerking på Zn- metallothionein

Zn-metallothionein ble fremstilt etter metoden ifølge M. Vasak og J. Kagi, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:6709

(1981) under anvendelse av ikke-radioaktivt ZnS04 . 71^0 og dialysert under anvendelse av "Spectra Por 6" dialyserør (skille ved molekylvekt 2000), som fåes fra Spectrum Medical Instruments, Inc., Los Angeles. Calif., mot 0,01M fosfatbuffer

-4

(pH 6,5). Til 0,5 mg Zn-metallothionein (1,0 ml; 10 M) ble det satt 9,7 mCi av 99mTc-GLUCOSCAN™ (New England Nuclear 9 9m Corp.), som fremstilles ved tilsetning av 48,7 mCi Tc-per-technetat i 0,5 ml fysiologisk saltoppløsning erholdt fra det 99 99m

oxydasjonsmiddelfrie eluat fra en Mo/ Tc-radionuklidgene-rator. Den resulterende utvekslingsblanding ble rystet og

99m inkubert i 30 minutter. Det utvekslingsmerkede Zn/ Tc-metallothionein ble renset ved størrelsesekskluderende høy-trykks væskekromatografi på samme måte som i eksempel 1. Etter rensningen var fortsatt 88% av den til Zn-metallothioneinet

99m

tilsatte technetium-99m-aktivitet tilstede i Zn, Tc-MT. Ut fra den forutsetning at det benyttede technetium-99m var fritt for bærer, ble 16 pmol technetium-99m vekslet inn i 0,5 mg Zn-metallothionein.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av Zn/^^ Ag- metallothionein ved utvekslingsmerking av Zn- metallothionein

Zn-metallothionein ble fremstilt som beskrevet i eksempel 2 og dialysert ("Spectra/Por 6" (2000 MWCO)) mot 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0). <110m>AgN03 i 0,5M HN03, skaffet fra New England Nuclear Corp. (spesifikk aktivitet = 1017 mCi/mmol) ble nøytralisert til pH 7,0 ved tilsetning av 0,5N NH40H. Til

-4

0,5 mg Zn-metallothionein (0,5 ml; 10 M) ble det satt 50 uCi 110mAg(NH_)+ Etter 30 minutters inkubering ble det utvekslingsmerkede Zn/ mAg-MT renset ved størrelsesekskluderende høytrykks væskekromatografi på samme måte som i eksempel 1. Etter rensningen var 70% av sølv-110-aktiviteten som var tilsatt i form av <110m>Ag(NH3)<*>, fortsatt tilbake i Zn/<110m>Ag-MT, hvilket vil si at 34 nmol sølv-llOm var blitt vekslet inn i 0,5 mg Zn-MT. Fordi det ikke gjør seg gjeldende noen isotopeffekt ved fremstillingen av metallothionein, vil anvendelse av lllmAg(NH3 )* istedenfor 110mAg(NH3) + gi tilsvarende resultater.

EKSEMPEL 4

99m

Fremstilling og undersøkelse av Zn, Tc- metallothionein ( MT)/ anti- THY- l, 1- konjugat

QQm

a. Fremstilling_av_Zni___Tc=MT/anti=T

-4

Til Zn-metallothionein (1,0 mg/ml; 10 M) i 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0) ble det tilsatt glutaraldehyd (1 mg;

_2

sluttkonsentrasjon 10 M). Etter én time ved romtemperatur ble det uomsatte glutaraldehyd fjernet ved dialyse ("Spectra/ Por 6" (2000 MWCO)) i seks timer mot 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0). Til 0,5 ml av dette glutaraldehyd-behandlede metallothionein

-4

(10 M) ble det satt 1 mg av det monoklonale antistoff (MAb)-anti-THY-1,1 i 0,5 ml 0,2M bicarbonatbuffer (pH 9,5). Reaksjonen mellom det tilsatte anti-THY-1,1 og det glutaraldehyd-behandlede Zn-metallothionein fikk pågå ved 4°C ved pH 9,3 i 18 timer, hvoretter 0,1 ml av en oppløsning av 0,5M tris/0,IM NaBH4 ble tilsatt. Etter reduksjon i én time ved romtemperatur ble Zn-metallothionein/anti-THY-1,1-konjugatet dialysert i 24 timer ("Spectra/Por 6" (50 000 MWCO)) mot 0,01M fosfatbuffer (pH 6,8) for å fjerne uomsatt natriumborhydrid og glutaraldehyd-behandlet Zn-metallothionein. Til 0,1 mg av

QQm TM dette konjugat ble det satt 3,5 mCi av Tc-GLUCOSCAN (New England Nuclear Corporation), og blandingen ble inkubert i

99m 30 minutter. Det utvekslingsmerkede Zn, Tc-metallothionein/- anti-THY-1,1-konjugat ble renset ved høytrykks væskekromatografi under anvendelse av en "BioRad" TSK-250 gelfiltrerings-søyle (fåes fra BioRad Corporation) ved eluering med 0,1M fosfatbuffer (pH 7,0) ved 1,0 ml/min. Etter rensning var det

QQm QQm

tilbake 0,53 mCi av Tc i Zn, Tc-MT/anti-THY-1,1-konjugatet (0,1 mg).

b. Binding av Zn, Tc- MT/ anti- THY- 1, 1- konjugat: til

SLI- og SL2- tumorceller fra mus

QQm

Reaktiviteten av Zn- Tc-MT/anti-THY-1,1-konjugat overfor antigen ble undersøkt under anvendelse av det celle-tilbindingsforsøk som er beskrevet av L.L. Houston, R.C. Nowinski og I.D. Bernstein (J. Immunol., 125, 837(1980)) hvor SLI- og SL2-tumorceller fra mus ble benyttet istedenfor AKR/Jackson-AKR/Cumberland-thymocytter. SL1-(THY-1,1-antigennegative) og SL2-(THY-1,1-antigenpositive) tumorceller (R.C. Nowinski et al., Virology, 81, 363, (1977)) ble dyrket ved 37°C i en fuktet inkubator med 6% CO2 i medium 1640 fra Roswell Park Memorial Institute (RPMI), supplert med 20% hesteserum og 20mM L-glutamin. Celleveksthastigheten var omtrent tre ganger den normale pr. dag for SLI <p>g fem ganger den normale for SL2. Tumorceller for anvendelse ved forsøket ble isolert, oppslemmet på ny i medium 1640 fra RPMI og tellet på vanlig måte. Både SLl-celler og SL2-celler ble inkubert med

QQm

Zn, Tc-MT/anti-THY-1,1 (28 nCi konjugat; 5 mCi/mg) eller

QQm

Zn, Tc-MT (482 nCi MT; 395 mCi/mg) i 30 minutter, adskilt fra ubundet MAb ved sentrifugering, vasket og tellet med

QQm 99m

hensyn til Tc-aktivitet. Omtrent 55% av det Tc-merkede anti-THY-1,1 ble bundet til de antigenpositive SL2-celler,

99m

samtidig som lite eller intet Tc-merket konjugat ble bundet til de antigennegative SLl-celler. Et diagram som viste det 99m

Tc-merkede anti-THY-1,1 avsatt mot konsentrasjonen av det testede antigen, viste ingen tegn på utflating ved 55% binding. Det var lite eller ingen binding av ikke-konjugert QQm

Tc-merket MT til SLI- eller SL2-tumorceller. Det kan konkluderes med at bindingen av anti-THY-1,1 til antigen i stor utstrekning var upåvirket av dets binding MT, og at Zn, 99mTc-MT/anti-THY-1, 1-konjugat har i behold den spesifisitet for 9 9m antigen som kjennetegner anti-THY-1,1. Tilsetning av Tc-MT har således, ganske overraskende, liten innvirkning på den biologiske spesifisitet av anti-THY-1,1.

EKSEMPEL 5

99m

Fremstilling og undersøkelse av Zn, Tc- metallothionein/ anti-human- brystkreft B6. 2

99m a. Fremstilling av Zn^ Tc-MT/Be^^-konjugat

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4 for fremstilling Q Om

av Zn, Tc-metallothionein/anti-THY-1,1 ble fulgt, idet det ble benyttet 0,6 mg Zn-MT (5 x 10 _5M), 1 mg glutaraldehyd og 3 mg anti-human-brystkreft B6.2. Etter avsluttende dialyse av Zn-MT/B6.2 mot 0,01M fosfatbuffer inneholdende 0,15M NaCl (pH 8,0) i seks timer og deretter mot 0,01M fosfat buffer inneholdende 0,15M NaCl (pH 7,0) i 18 timer ("Spectra/ Por 6"

(50 000 MWCO)), ble 2 mg av konjugatet utvekslingsmerket ved

99m TM

tilsetning av 150 mCi av Tc-GLUCOSCAN , (New England

9 9m Nuclear Corporation) og blanding i 30 minutter. Det Tc-MT-merkede B6.2 ble renset ved størrelsesekskluderende høytrykks væskekromatografi under anvendelse av en "BioRad" TSK-250 gel-filtreringssøyle ved eluering med 0,1M fosfatbuffer (pH 7,0) ved 1,0 ml/min. Etter rensningen var det tilbake 30 mCi av Q Qm QQm

Tc i Zn, Tc-MT/B6.2-konjugatet.

QQm

b. Binding av Zn, TC-MT/B6.2 til human-MCF-7 og A375-tumorceller

Den virkning som binding av MT har på evnen til MAb-B6.2 til å binde det antigen mot hvilket det er rettet, ble undersøkt i et celletilbindingsforsøk hvor det ble benyttet to linjer humantumorcéiler som ble holdt i vevkultur, nemlig en human-brystkreft-MCF-7 (H.D. Soule, J. Vazguerz, A. Long, S. Alberg og M. Brennan, J. Nati. Cancer Inst., 51:1409-1416

(1973)) og en human-melanoma-A375 (D.J. Giard, S.A. Aaronson, G.J. Todaro, P. Arnstein, J.H. Kersy, H. Dosik og W.P. Parks. J. Nati. Cancer Inst., 51:1417 (1973)). MCF-7-tumorcellene har antigenet til hvilket B6.2 bindes (D. Colcher, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:3199 (1981)), mens A375-cellene ikke er i besittelse av dette antigen. De tjener som en kontroll på ikke-spesifikk binding av radiomerket B6.2. Tumorceller for anvendelse ved forsøket fåes ved hjelp av den følgende fremgangsmåte. Tre eller fire dager etter podingen ble et tryp-sin/EDTA-reagens (Cat. 610-5300, Gibco Laboratories, Grand Island, New York) tilsatt enkeltskikt av tumorceller istedenfor vekstmedium. Etter rysting i ett eller to minutter ble trypsin/EDTA-blandingen fjernet og erstattet med en frisk alikvotdel av den samme blanding. Den resulterende blanding ble inkubert ved 37°C i 5-10 minutter for å sikre fullstendig løsrivelse av cellene. Cellene ble oppslemmet i medium 1640 fra RPMI inneholdende 1% kvegserumalbumin (BSA) og ble tellet på vanlig måte. MCF-7- og A375-cellene fremstilt på denne måte

QQm

ble inkubert med Zn, Tc-MT/B6.2 (0,01665 uCi konjugat;

1,53 mCi/mg) ved 37°C i to timer i mikrosentrifugerør belagt med BSA. Etter endt inkubering ble cellene skilt fra ubundet MAb ved sentrifugering, vasket tre ganger med medium 1640 fra

QQm

RPMI (+1% BSA) og tellet med hensyn til Tc-aktiviteten. Omtrent 70% av det Tc-merkede B6.2 hadde bundet seg til antigenpositive MCF-7-celler i enkeltcellesuspensjon, mens mindre

QQjn

enn 5% av Tc-aktiviteten var blitt bundet til A375-kontrollcellene. Som iakttatt for anti-THY-1,1-MAb resulterer binding av MT til B6.2 i et kompleks hvis spesifisitet for antigen stort sett var bibeholdt.

QQm

c. In vivo farmakokinetiske egenskaper av Zn, Tc-metal !D§iaii25kigne^n/B6;2

Radiojodert B6.2 har vist seg å sikte seg inn på human-brystkreft-xenografer hos athymiske mus in vivo. (D. Colcher, M. Zalutsky, W. Kaplan, D. Kufe, F. Austin, J. Schlom, Cancer Research, 43:736 1983)). For å bestemme den innvirkning bindingen av MT har på evnen til B6.2 til å sikte seg inn på

99m

brystkreft hos mennesker ble Tc-merket MT/B6.2 prøvet på athymiske mus med Clouser-tumorer eller faste A375-tumorer. Clouser-tumorer (B.C. Giovanella, J.S. Stehlin, L.J. Williams, S.S. Lee og R.C. Shepart, Cancer, 47:2269 (1978)), som er B6.2-antigenpositive, og A375-tumorer (D.J. Giard, S.A. Aaronson, G.J. Todaro, P. Arnstein, J.H. Kersy, H. Dosik og W.P. Parks, J. Nati. Cancer Inst., 51:1417 (1973)), som er B6.2 antigennegative, ble dyrket subkutant i ryggflaten av athymiske mus. Musene (17-25 g), som bar på 200-600 mg tumor,

QQm

ble injisert med 50 uCi av Zn Tc-MT/B6.2 og avlivet på forskjellige tidspunkter (tre eller fire mus pr. tidspunkt) over et tidsrom av 48 timer. Utvalgte organer ble fjernet,

QQm

veiet og tellet med hensyn til Tc-aktivitet. Prosentandelen

av den injiserte dose pr. gram Zn,99mTc-MT/B6.2 som ble funnet i antigenpositive (Ag<+>) Clouser-tumorceller og i de ikke-spesifikke antigennegative (Ag") A375-kontrolltumorceller er angitt i tabell III. Dataene i tabell III viser at Zn, Tc-MT/B6.2 har i behold evnen til B6.2 til å sikte seg inn på menneskebrystkreft in vivo, spesielt på tidspunktet 24 timer, da opptaket i Clouser-tumorcellene i forhold til A375-tumorcellene er omtrent 3:1. Ved sammenligning med publiserte biofordelingsdata for radiojodert B6.2 (Colcher, et al., op.

99m

eit. (1983)) forsvinner det Tc-merkede B6.2 langt hurtigere fra blodet. Det kan konkluderes med at bindingen av MT til B6.2 ikke kompromitterer sistnevntes evne til å lokalisere spesifikt ved brystkreft hos mennesker, men akselererer fjerningen av det radiomerkede B6.2 fra blodet.

d. Påvisning av tumor under anvendelse av Zn,99mTc_

MT/B6..2

QQm

For å vise at det Tc-merkede B6.2 vil være anvende-99m

lig for påvisning av brystkreft ble 200 uCi Zn, Tc-MT/B6.2 injisert intravenøst i athymiske mus med Clouser- eller A375 tumor. For hvert dyr ble det foretatt avbildning under anvendelse av et standard gamma-kamera med 5,0 mm nålehullkolli-mator. Så tidlig som seks timer etter injeksjonen var der

QQm

synlig bevis på spesifikk akkumulering av Zn, Tc-MT/B6.2 i Clouser-tumorene (Ag<+>), uten at det var noe påviselig opptak i A375-tumorene (Ag~). Det eneste organ som ellers viste seg ved avbildningen, var leveren. 24 timer etter injeksjonen var

99m

Clouser-tumorene klart avtegnet. Tc-tellingen for tumoren syntes å være den samme som for leveren. Det var også aktivitet i blæren og nyrene. I motsetning hertil var der ingen

99m

synlig akkumulering av de Tc-merkede B6.2 i A375-tumorer. Disse resultater viser den hurtige og spesifikke lokalisering

QQm

av et Tc-merket MT/B6.2 i brystsvulstvev in vivo og den

QQm

nytte man kan ha av Tc-merket MAb med hensyn til diagnose av brystkreft hos mennesker.

EKSEMPEL 6

99m

Fremstilling og undersøkelse av Zn, Tc-metallothionein/anti-human-brystkreft-B6.2-F(ab')2

En oppløsning av 60 ug pepsin erholdt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri og 3 mg anti-menneskebrystkreft-B6.2 i 3 ml 0,1M natriumacetatbuffer (pH 4,0) ble inkubert natten over ved 37°C. De dannede proteolyttiske fragmenter ble skilt fra B6.2-F(ab')2 ved dialyse ved 4°C (Spectra/Por 6 (50 000 MWCO)) mot 0,05M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 0,15M natriumklorid. B6.2-F(ab')2 ble analysert ved størrelsesekskluderende høytrykks væskekromatografi under anvendelse av en "BioRad" TSK-250 søyle og ved eluering med 0,1M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) ved 1,0 ml/min og ikke-reduserende SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese. Etter en andre dialyse for å bringe B6.2-F(ab')2 i 0,2M carbonat/bicarbonatbuffer (pH 9,5) ble bindingen til Zn-MT fullført som beskrevet for B6.2 i eksempel 5 under anvendelse av 0,6 mg Zn-MT og 1 mg glutaraldehyd. 1,56 mg Zn-MT/B6.2-F(ab')2 ble

99m utvekslingsmerket ved tilsetning av 165 mCi av Tc-GLUCO-SCAN™ (New England Nuclear Corporation) og blanding i

30 minutter. Etter rensning ved størrelsesekskluderende høy-trykks væskekromatografi under anvendelse av en "BioRad" TSK-250 gelfiltreringssøyle og eluering med 0,1M fosfatbuffer

QQm

(pH 7,0) ved 1,0 ml/min forble 17,6 mCi av Tc tilbake i Zn,99mTc-/B6.2F(ab') 2.

QQm

b. ?i™3ing_av_Zni.__ _T2zMI!/§§i2l5'ia5l22--onju9?5

Virkningen av bindingen av MT på reaktiviteten av F(ab')2~dimeren av B6.2 overfor antigenet mot hvilket B6.2 er innsiktet, ble undersøkt under anvendelse av det celletilbind-99m ingsforsøk som er beskrevet i del b av eksempel 5. Zn, Tc-MT/B6.2-F(ab')2~konjugatet (2,29 ng; spesifikk aktivitet = 11,3 Ci/ug) ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av MCF-7-(Ag<+>)- og A375-(Ag")-celler, og den prosentvise andel 99m

Tc-merket konjugat som ble bundet, ble bestemt. Resultatene

QQm

viser at 70-80% av det Tc-merkede konjugat ble bundet til

MCF-7-målceller, mens mindre enn 5% ble bundet til A375-celler som ikke var målceller. Bindingen av Zn-MT til F(ab')2 av B6.2 reduserer således ikke dets tilbinding til antigenet og heller ikke endrer den dets spesifisitet for antigenet.

99m

c. In vivo farmakokinetiske egenskaper av Zn, Tc-MT/

B6.2=F£abM2

Evnen til radiojodert B6.2-F(ab')2 til å sikte seg inn mot menneskebrystkreft-xenografer i athymiske mus er blitt vist av Colcher et al., (Colcher, et al., op. eit. (1983)). Under anvendelse av athymiske mus med Clouser-tumor og A375-tumor ble spesifisiteten in vivo og de farmakokinetiske egen-QQm

skaper av Zn, Tc-MT/B6.2-F(ab')2 bestemt. Hver tumorbærende

99m

mus ble injisert med 48,5 uCi Tc-merket F(ab')2-konjugat (spesifikk aktivitet = 6,7 uCi/g), og den prosentvise andel av den injiserte dose pr. gram ble bestemt på forskjellige tidspunkter. Verdiene er oppført i tabell IV. Forholdet mellom opptaket i Clouser-tumor og A375-tumor på tidspunktet 24 timer var omtrent 2:1, hvilket klart viser at B6.2-F(ab')2 bibehol-

der tumorspesifisiteten etter binding til MT. Hastigheten med

99m

hvilken Tc-merket B6.2-F(ab')2 ble fjernet fra blodet, var

99m

omtrent den samme som for det Tc-merkede intakte B6.2. Således indikerer spesifisiteten av <99m>Tc-merkede B6.2-F(ab')2 og dets hurtige forsvinnen fra blodet at fragmenter av B6.2 som er merket med MT, har en anvendelighet med hensyn til innsikting på tumorer in vivo som tilsvarer den iakttatt for

QQm

Zn, Tc-MT/intakt B6.2.

Claims

1. Konjugat av (i) et målsøkende biologisk aktivt molekyl valgt blant antistoffer, fragmenter av antistoffer, peptider og proteiner som binder seg til reseptorer og lokaliserer seg i visse organer, vev og celler i legemet hos mennesker og pattedyr og (ii) en forbindelse inneholdende spormerkende metall, karakterisert ved at forbindelsen inneholdende spormerkende metall er et metallothionein eller metallothioneinfragment hvor i det minste en del av metallet utgjøres av et spormerkende metall som har tilstrekkelig affinitet til thioneinet eller thioneinfragmentet til å bindes til dette.

2. Konjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at det spormerkende metall er et radionuklid valgt blant ruthenium-97, technetium-99m, kvikksølv-197, gallium-68, osmium-199, indium-111, indium-113m og bly-203.

3. Konjugat ifølge krav 2, karakterisert ved at det spormerkende metall er technetium-99m.

4. Konjugat ifølge krav 1-3, karakterisert ved at det målsøkende, biologisk aktive molekyl er et antistoff eller et fragment av et antistoff.

5. Konjugat ifølge krav 4, karakterisert ved at antistoffet er et monoklonalt antistoff.

6. Konjugat ifølge krav 5, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er valgt blant anti-THY-1,1 og anti-humanbrystkreft

7. Konjugat ifølge krav 1-6, karakterisert ved at metallothioneinet eller metallothioneinfragmentet er fra et pattedyr.

8. Diagnostisk preparat, karakterisert ved at den aktive bestanddel er et konjugat ifølge krav 1-7.