PT733072E - Anticorpo contra antigenio carcinoembrionario (cea) - Google Patents

Description

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DESCRICÃO “Anticorpo contra antigénio carcinoembrionário (CEA)” O presente invento refere-se a anticorpos contra o antigénio carcinoembrionário (CEA) e à sua utilização em diagnóstico e terapia. O CEA é um antigénio que é expresso em tumores como os tumores colorrectais e é portanto um marcador para células tumorais. São conhecidos na arte vários marcadores de células tumorais e foi proposto que a terapia contra estes tumores pode ser conseguida orientando agentes contra estes marcadores. Usualmente, o agente é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que foi ligado a um agente citotóxico ou a uma enzima capaz de converter uma prodroga num agente citotóxico activo.

Alternativamente, os anticorpos podem ser ligados a agentes de detecção por formação de imagem. Isto é útil no diagnóstico e prognóstico de condições que envolvem a expressão de um marcador de células tumorais. A utilização de marcadores da superfície celular como agentes alvo foi revista por Begent, 1990 (ver ref. 1 abaixo). Há dois critérios principais a considerar quando se selecciona um anticorpo adequado para a utilização em terapias antitumorais orientadas. É desejável que o anticorpo tenha uma boa afinidade para o seu antigénio alvo. Isto é requerido de modo que, uma vez que o anticorpo tenha atingido o seu alvo, permaneça ligado a esse alvo durante o tempo suficiente para conseguir o resultado desejado, por exemplo a citotoxicidade.

Em adição, o anticorpo deve ter boa especificidade para o antigénio alvo, de modo a que a ligação a antigénios que não sejam o alvo não ocorra em extensão significativa.

Muitos anticorpos são produzidos erh escala comercial por meios recombinantes. Isto usualmente envolve a expressão do anticorpo numa célula hospedeira como a E. coli ou uma levedura. É portanto desejável que o anticorpo seja codificado por uma sequência de ácido nucleico que seja capaz de níveis de expressão elevados numa célula hospedeira. Por razões que ainda não são bem

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 2 percebidas, algumas sequências de ácido nucleico recombinantes podem ser menos bem expressas do que outras por tipos de células particulares. O CEA pode ser usado como um antigénio marcador no cancro, para detecção por formação de imagem (ref. 8) e terapia (refs. 9-13). É conhecido um grande número de anticorpos CEA com especificidades e afinidades diferentes (ref. 7). Um anticorpo que é largamente usado na arte contra o CEA é ο A5B7. Este anticorpo é útil em detecção por formação de imagem e terapia e tem sido usado em ensaios em humanos (refs. 9, 12, 13). Embora existam muitos anticorpos para o CEA, o anticorpo A5B7 tem sido, até à data, considerado o mais promissor.

Verificámos agora que é possível obter um anticorpo de boa especificidade e afinidade consideravelmente superior para o CEA do que ο A5B7 (afinidade cerca de 10 vezes superior). Provou-se que o anticorpo é superior ao A5B7 na localização do tumor in vivo e está localizada no tumor uma proporção e quantidade mais elevadas relativamente a outros tecidos corporais. Um ensaio clínico de detecção por imagem do tumor com o anticorpo começou com a localização do tumor com sucesso em 8 pacientes com carcinoma colorrectal. Não foi observada nenhuma localização não específica de anticorpo. O anticorpo foi obtido inicialmente de uma biblioteca de bacteriófagos. Os genes do anticorpo foram inseridos no bacteriófago e a biblioteca resultante de 107 fagos foi pesquisada quanto à expressão do anticorpo contra o CEA. Foram seleccionados genes que codificam para o anticorpo desejado e os genes foram expressos em bactérias.

Numa primeira concretização, o invento proporciona um anticorpo específico para o CEA, que tem uma constante de dissociação (Kd) de menos de 5,0 nM. O anticorpo tem geralmente uma constante de dissociação de 0,5 a 5,0 nM, por exemplo uma constante de dissociação de 2,5 +/-1,3 nM. Preferivelmente o anticorpo ligar-se-á competitivamente em relação ao epítopo no CEA reconhecido pelo anticorpo MFE-23 abaixo descrito. A especificidade do anticorpo é preferivelmente tal que este se ligue ao adenocarcinoma colorrectal humano mas não se ligue a alguns ou a todos os tecidos normais seguintes: fígado, rins, intestino grosso, amígdalas, pulmões, cérebro, testículos, ovário, cervix, mama, filmes sanguíneos, placenta, baço,

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 3 tiróide, esófago, estômago, pâncreas, nódulos linfáticos e músculos esqueléticos. Isto está em contraste com muitos anticorpos de CEA que comummente mostram reacção cruzada com uma variedade de tecidos normais (ver ref. 7). O termo “anticorpo” é aqui usado para incluir anticorpos completos (i.e. anticorpos possuindo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas) assim como fragmentos de anticorpos que contêm um local de ligação a antigénios, tais como fragmentos Fab, F(ab’)2, Fv e Fv de uma só cadeia (scFv). Contudo, o anticorpo de acordo com o invento é preferivelmente um anticorpo scFv. Os scFv são compostos por uma cadeia leve variável (VL) deste anticorpo ligada a uma cadeia pesada variável (VL) por um ligante flexível. Os scFv são capazes de ligar antigénios e podem ser rapidamente produzidos em bactérias. Foi também agora verificado que os scFv exibem uma localização tumoral superior e oferecem portanto vantagens para utilização in vivo.

Um anticorpo particularmente preferido de acordo com o invento é o anticorpo MFE-23, mostrado na Figura 3 (SEQ ID N° 2). A sequência do MFE-23 pode ser usada para a concepção de outros anticorpos de especificidade semelhante. Em particular, a sequência pode ser usada para a concepção de anticorpos possuindo as regiões determinantes de complementaridade (CDR) do MFE-23. Estas regiões são mostradas nas seguintes localizações na Fig 3 (SEQ ID N° 2): Gly 52 a His 61, Trp 76 a Glu 85, Gly 125 a Tyr 135, Ser 185 a His 194, Ser 210 a Ser 216 e Gin 249 a Thr 257. A sequência do MFE-23 pode também ser usada para a concepção de um anticorpo que tenha uma região de cadeia VH da sequência de Gin 27 a Ser 146 da Figura 3 (SEQ ID N° 2) e uma região de cadeia VL da sequência de Glu 162 a Lys 267 da Figura 3 (SEQ ID N° 2). É também possível fazer um anticorpo tendo uma região variável (V) da sequência de Gin 27 a Lys 267 da Figura 3 (SEQ ID N° 2). Pode ser feito um anticorpo humanizado com CDR de MFE-23, por exemplo de acordo com os métodos divulgados na EP-A-0239400 (Winter).

Em adição, é possível conceber anticorpos que incluam sequências CDR que sejam pelo menos idênticas em 60% às sequências CDR da Figura 3 (SEQ ID N° 2) acima definidas. Tais anticorpos incluem sequências idênticas em preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente em pelo menos 90% ou mesmo 95%, às sequências da Figura 3 (SEQ ID N° 2). Estes anticorpos devem conservar a elevada afinidade e especificidade para o CEA dos anticorpos que contêm sequências idênticas às da Figura 3 (SEQ ID N° 2). Em geral, a natureza

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 4 físico-química das sequências da Figura 3 deve ser preservada nos anticorpos que contêm sequências modificadas. Os aminoácidos nas sequências modificadas devem geralmente ser semelhantes em carga, hidrofobia/hidrofilia e tamanho. As substituições candidatas são aquelas em que um aminoácido de um dos seguintes grupos é substituído por um aminoácido diferente do mesmo grupo:

H, ReK

I. L.VeM

A, G, SeT

D, E, PeN

Além disso, a sequência do MFE-23 pode ser usada para fazer “diacorpos”, i.e. fragmentos de anticorpo biespecífico ou bivalentes que se ligam a dois antigénios diferentes. Por exemplo, um diacorpo biespecífico para o CEA e para o CD16 foi construído a partir de genes de V do anticorpo MFE-23 e anti-CD16 derivados do hibridoma 3G8 (ref. 25). Tais diacorpos prometem ser reagentes poderosos para a destruição de células alvo utilizando mecanismos celulares efectores naturais. O anticorpo de acordo com o invento pode ser ligado a um agente antitumoral ou a um marcador detectável. Isto permite ao anticorpo orientar o agente antitumoral ou o marcador detectável para o tumor e por este motivo permite o dano/destruição ou detecção do tumor. Assim, o anticorpo é adequado para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia ou cirurgia (e.g. cirurgia radioimunoguiada) ou num método de diagnóstico praticado no corpo humano ou animal. Em particular o anticorpo é adequado para utilização em tratamento de um tumor colorrectal por cirurgia ou terapia ou em diagnóstico de um tumor colorrectal. Uma revisão da utilização de anticorpos em diagnóstico e terapia é proporcionada pela ref.26. O agente anti-tumorai ligado ao anticorpo pode ser qualquer agente que destrói ou danifica um tumor ao qual o anticorpo se ligou ou no ambiente da célula à qual o anticorpo se ligou. Por exemplo, o agente antitumoral pode ser um agente tóxico tal como um agente quimioterapêutico ou um radioisótopo, uma enzima que activa uma prodroga ou uma citóquina.

Os agentes quimioterapêuticos adequados são conhecidos pelos peritos na arte e incluem antraciclinas (e.g. daunomicina e doxorubicina), metotrexato, vindesina, neocarzinostatina, cis-platina, clorambucilo, citosina-arabinósido,

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 5 5-fluorouridina, melfalano, ricina e caliquimicina. Os agentes quimioterapêuticos podem ser conjugados com o anticorpo usando métodos convencionais (ver e.g. ref. 27).

Os radioisótopos adequados para utilização como agentes antitumorais são também conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, podem ser usados o 1311 ou a astatina como a At. Estes isótopos podem ser ligados ao anticorpo usando técnicas convencionais (ver e.g. ref 11). O agente antitumoral que é ligado ao anticorpo pode também ser uma enzima que activa uma prodroga. Isto permite a activação de uma prodroga inactiva para a sua forma citotóxica activa no local do tumor e é chamada “terapia de enzima de prodroga dirigida por anticorpos” (ADEPT). Na prática clínica, o conjugado anticorpo-enzima é administrado ao paciente e deixa-sa que se localize na região do tumor a ser tratada. A prodroga é então administrada ao paciente de modo que a conversão na droga citotóxica é localizada na região do tumor a ser tratado sob a influência da enzima localizada.

Uma enzima preferida é a carboxipeptidase G2 bacteriana (CPG2) cuja utilização é descrita por exemplo em WO 88/07378. Um conjugado entre o anticorpo de acordo com o invento e a CPG2 mostra uma boa localização tumoral. O conjugado enzima-anticorpo pode, se desejado, ser modificado de acordo com o que é ensinado em WO 89/00427, de modo a acelerar a depuração de áreas do corpo não na vizinhança de um tumor. O conjugado anticorpo-enzima pode também ser usado de acordo com WO 89/00427, por exemplo proporcionando um componente adicional que inactive a enzima em áreas do corpo que não na vizinhança do tumor. O agente antitumoral conjugado com o anticorpo pode também ser uma citóquina como a interleucina-2 (IL-2), a interleucina-4 (IL-4), ou o factor α de necrose tumoral (TNF-α). O anticorpo dirige a citóquina ao tumor de modo que a citóquina medeia o dano ou a destruição do tumor sem afectar outros tecidos. A citóquina pode ser fundida ao anticorpo ao nível do ADN usando técnicas convencionais de ADN recombinante. O marcador detectável ligado ao anticorpo pode ser um agente de detecção por formação de imagem para detecção do tumor por imagem tal como um radioisótopo de vida curta, por exemplo o 111ln, o 125l ou o 99mTc. Uma revisão

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 6 da detecção de cancro por formação da magem com anticorpos de CEA é proporcionada pela ref. 8. O 99mTc é um agente de detecção por formação de imagem preferido, principalmente porque pode ser ligado a um anticorpo numa posição fora do local de ligação ao antigénio e este facto promove melhorias na localização tumoral. O 99mTc pode ser ligado ao anticorpo por um resíduo Cys livre proporcionado no, ou perto do terminal N ou C do anticorpo. Um anticorpo contendo um tal resíduo Cys livre pode ser preparado por técnicas de ADN recombinante, por exemplo fazendo um vector que codifique para a fusão anticorpo-Cys e que a expresse numa célula hospedeira tal como uma célula hospedeira bacteriana. O resíduo Cys localiza-se tipicamente no terminal do anticorpo mas pode, por exemplo, ser do 2o ao 20° resíduo a partir do terminal.

Um anticorpo de acordo com o invento contendo uma marca detectável é útil para cirurgia radioimunoguiada (RIGS, refs 30 e 31) em adição a ser útil para o diagnóstico de tumores. A RIGS compreende a administração de um anticorpo marcado a um paciente e subsequentemente a remoção cirúrgica de qualquer tecido ao qual o anticorpo se ligue. Assim, o anticorpo marcado guia o cirurgião na direcção do tecido tumoral e ajuda-o a distingui-lo do tecido normal. O anticorpo de acordo com o invento pode também ser usado para detecção in vitro ou determinação quantitativa do CEA. Por exemplo, o anticorpo pode também ser usado para o imunoensaio com ligação enzimática (ELISA), transferência de Western ou para detecção do CEA in situ numa amostra de tecido. Assim, o anticorpo pode ser usado num método para a detecção ou determinação quantitativa do CEA numa amostra, método este que compreende: (i) contacto da amostra com um anticorpo marcado, e (ii) detecção ou determinação quantitativa de anticorpo marcado ligado a qualquer CEA na amostra.

Tipicamente, um método ELISA para a detecção ou a determinação quantitativa de CEA numa amostra usando um anticorpo de acordo com o invento compreende: (i) a imobilização num suporte sólido de um anticorpo não marcado de acordo com o invento, (ii) a adição da amostra de tal maneira que qualquer CEA na amostra seja capturado pelo anticorpo não marcado, 7 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ (iii) a adição de um anticorpo marcado de acordo com o invento, e (iv) a detecção ou a determinação quantitativa de qualquer anticorpo marcado ligado.

Um anticorpo do invento pode também ser empregue histologicamente para a detecção ou determinação quantitativa de CEA in situ, por exemplo por imumofluorescência ou por microscopia imunoelectrónica. A detecção ou determinação in situ podem ser conseguidas por remoção de um espécime de tecido de um paciente e permitindo que um anticorpo marcado se ligue a qualquer CEA no espécime. Através da utilização de tal procedimento, é possível detectar não só a presença de CEA mas também a sua distribuição espacial.

Pode ser usado um anticorpo do invento para purificar o CEA. Podem ser usados métodos convencionais de purificação de um antigénio usando um anticorpo. Tais métodos incluem métodos de imunoprecipitação e de imunoafinidade em coluna. Num método de imunoafmidade em coluna, um anticorpo de acordo com o invento é acoplado à matriz inerte da coluna e é passada na coluna uma amostra contendo CEA, de maneira a que o CEA seja retido. O CEA é depois eluído. A amostra contendo CEA usada nos métodos de detecção, determinação e purificação acima pode ser um espécime de tecido ou um extracto celular de um paciente. Alternativamente, a amostra pode ser uma amostra produzida como resultado de procedimentos de ADN recombinante, e.g. um extracto de uma cultura de células hospedeiras expressando o CEA. A marca detectável ligada ao anticorpo para a utilização in vitro pode ser um radioisótopo (e.g. o 32P ou o 35 S), biotina (que pode ser detectada por avidina ou steptavidina conjugada com peroxidase), digoxigenina, fosfatase alcalina ou uma marca fluorescente (e.g. fluoresceína ou rodamina). O invento inclui uma molécula de ADN que codifica um anticorpo de acordo com o invento. A molécula de ADN pode, por exemplo, compreender a sequência mostrada na Figura 3 (SEQ ID N°: 1) ou a região de codificação da cadeia VH do nucleótido 79 ao nucleótido 438 da Figura 3 (SEQ ID N°: 1) e a região de codificação da cadeia VL do nucleótido 484 ao nucleótido 801 da Figura 3 (SEQ ID N°: 1). 8 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ

Uma concretização adicional do invento proporciona vectores para a replicação e a expressão de ADN que codifique um anticorpo de acordo com o invento. Os vectores podem ser por exemplo plasmídeos, vírus ou vectores fágicos proporcionados com uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão do dito ADN e operativamente ligado ao dito ADN. Operativamente ligado” refere-se a uma justaposição em que o promotor e a sequência de codificação do anticorpo estão numa relação que permite que a sequência de codificação seja expressa sob o controlo do promotor. O vector pode também compreender um regulador do promotor. O vector pode conter um ou mais genes marcadores seleccionáveis, por exemplo um gene de resistência à ampiciclina no caso de um plasmídeo bacteriano ou um gene de resistência à neomicina para um vector de mamífero. O vector pode ser usado in vitro, por exemplo para a produção de ARN correspondente ao ADN, ou usado para transfectar ou transformar uma célula hospedeira. O invento também proporciona células hospedeiras transformadas ou transfectadas com os vectores para a replicação e a expressão de ADN que codifica um anticorpo de acordo com o invento. As células serão escolhidas de modo a serem compatíveis com o vector e podem, por exemplo, ser bacterianas, de levedura, de insectos ou de mamíferos. As células bacterianas, particularmente as células de E. coli, são preferidas porque admitem elevados níveis de anticorpo produzidos na forma solúvel. O invento inclui um processo para a produção de um anticorpo de acordo com o invento, processo esse que compreende: (i) a cultura de uma célula hospedeira como acima descrito sob condições tais que o anticorpo seja expresso, e (ii) a recuperação do anticorpo da cultura.

Embora este processo seja adequado para a produção em larga escala de um anticorpo de acordo com o invento, não pode com certeza ser usado para efectuar o isolamento inicial do anticorpo. O isolamento inicial pode ser efectuado por pesquisa de uma biblioteca de bacteriófagos quanto a fagos que expressam o anticorpo de CEA. Verificou-se que este sistema permite o isolamento de anticorpos com maior afinidade e especificidade mais elevada. O método de isolamento geralmente compreende: (i) a selecção de um bacteriófago de uma biblioteca de bacteriófagos que expresse o dito anticorpo,

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 9 (ii) a infecção de uma célula hospedeira bacteriana com o bacteriófago seleccionado, (iii) a cultura da célula hospedeira sob condições tais que o dito anticorpo seja expresso,e (iv) a recuperação do dito anticorpo da cultura. O bacteriófago é geralmente um bacteriófago filamentoso. A célula bacteriana hospedeira é geralmente uma célula de E. coli. A biblioteca de bacteriófagos pode ser feita por (a) imunização de um animal com CEA, (b) obtenção de linfócitos do animal, (c) preparação de ADNc que codifica regiões VH e VL do anticorpo a partir do ARNm dos linfócitos, (d) junção das regiões de codificação de VH e VL por uma sequência de codificação de um ligante, e (e) inserção das regiões juntas num bacteriófago. 0 animal imunizado com CEA no passo (a) é adequadamente um ratinho, um rato, um coelho ou uma cabra. No passo (b), os linfócitos são tipicamente obtidos do baço para o animal. É necessário usualmente amplificar os ADNc de codificação para as regiões VH e VL produzidas no passo (c) antes que sejam juntos no passo (d). A amplificação pode ser levada a cabo por reacção em cadeia com polimerase (PCR).

Foi encontrado um método para a purificação de um anticorpo de acordo com o invento num nível adequado para uso clínico. Este método envolve proporcionar uma marca de His de, pelo menos, três resíduos His consecutivos junto ou nos terminais N ou C do anticorpo. A marca facilita a ligação do anticorpo a um suporte sólido que contém iões metálicos e permite portanto que o anticorpo seja separado dos outros componentes. Em acordo, o invento proporciona um método para a purificação de um anticorpo compreendendo uma marca de His, de um líquido biológico, cujo método compreende: (i) o contacto de um suporte sólido contendo iões metálicos com o líquido biológico sob condições tais que o anticorpo se ligue ao suporte, (ii) a remoção do líquido biológico que não está ligado ao suporte, e

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 10 (iii) a recuperação do anticorpo a partir do suporte.

Verificámos que este método é superior aos métodos convencionais como a cromatografia de permuta iónica e de imunoafinidade para a purificação de anticorpos. Em particular; (1) é produzido um rendimento mais elevado de anticorpo, (2) o aumento de escala é simples e barato e (3) é eliminado o risco do antigénio derivado do tumor sofrer lixiviação do suporte. O comprimento e a posição da marca de His no anticorpo são escolhidos de modo a optimizar a ligação aos iões metálicos sem afectar a ligação ao antigénio. A marca de His pode, por exemplo, compreender de 3 a 20 resíduos His, preferivelmente de 3 a 10 resíduos His, mais preferivelmente 5 ou 6 resíduos His. O resíduo de His no fim da sequência que constitui a marca mais perto do terminal do anticorpo está preferivelmente na posição 15 ou inferior, mais preferivelmente 5 ou inferior, a partir do terminal. A marca pode ser manipulada no anticorpo usando técnicas de ADN recombinante.

Os iões metálicos são geralmente iões de metais de transição, preferivelmente iões de metais de transição com carga 2+ tais como o Ni2+, o Zn2+ e o Cu2+. Iões Cu2+ são preferidos porque se verificou que são altamente eficazes na purificação do anticorpo. O suporte sólido é preferivelmente a matriz de uma coluna de afinidade (e.g. uma coluna de ácido iminodiacético (IDA)), embora possam ser usados outros suportes como as pérolas. Quando é usada uma coluna de afinidade, o líquido biológico é carregado na coluna, o líquido não ligado é recolhido no fundo e o anticorpo ligado é então eluído da coluna. Quando são usadas pérolas, o líquido biológico é posto em contacto com as pérolas, as pérolas são separadas do líquido não ligado e o anticorpo ligado é recuperado das pérolas. O líquido biológico é geralmente líquido de uma cultura de células hospedeiras (e.g. células bacterianas) que expressam o anticorpo. O invento inclui uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com o invento, tendo um agente antitumoral ou uma marca detectável a ele ligada e um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável. Em uso clínico, o anticorpo será normalmente administrado parentericamente, e.g. por via intravenosa ou intraperitoneal. Assim, a composição farmacêutica é normalmente uma que seja adequada para

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 11 administração parentérica (e.g. intravenosa ou intraperitoneal). Tal composição convenientemente contém o anticorpo e bicarbonato ou solução salina isotónica como diluente. A dose de anticorpo estará, em última análise, à descrição do médico, que irá ter em conta factores tais como o tipo de terapia ou diagnóstico e o peso, condição e idade do paciente. Doses adequadas de anticorpo são conhecidas na arte; ver, por exemplo, refs 9, 11, 13 e 29. Uma dose adequada pode ser de 0,01 a 100mg, preferivelmente de 0,1 a 10 mg para um paciente humano. O anticorpo de acordo com o invento pode ser usado de uma maneira similar à de anticorpos de CEA conhecidos (refs 8-13).

Os exemplos seguintes ilustram o invento:

Breve Descricão dos Desenhos A Figura 1 mostra um método de produção de um fragmento scFv no fago. No passo (i), são usados os linfócitos de um ratinho imunizado como uma fonte de ARNm, e é preparado o ADNc do gene de V do anticorpo. No passo (ii), são amplificados genes de V dos anticorpos por PCR a partir do ADNc e subsequentemente montados com um ligante para formar o scFv. No passo (iii), os genes V ligados são clonados no fago e os produtos do gene são exibidos na superfície do fago como fragmentos scFv. No passo (iv), são seleccionados fagos que se ligam a CEA por captura em contas magnéticas revestidas com estreptavidina. No passo (v), é produzido em bactérias o scFv solúvel para uso clínico. A Figura 2 mostra a localização de 125I-MFE23 em xenoenxertos de carcinoma humano do cólon. As imagens são imagens de câmera gama a 29 horas (par inferior) e 35 horas (par superior) após injecção. A Figura 3 mostra a sequência do anticorpo MFE23 e a sequência de nucleótidos correspondente. Acredita-se que a sequência do anticorpo comece cerca do aminoácido Gin 27. As localizações das CDR, regiões de estrutura e ligante são como se segue: 12 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ

Estrutura H1: Gin 27 a Ser 51 CDR H1: Gly 52 a His 61 Estrutura H2: Trp 62 a Gly 75 CDR H2: Trp 76 a Glu 85 Estrutura H3: Tyr 86 a Glu 124 CDR H3: Gly 125 a Tyr 135 Estrutura H4: Trp 136 a Ser 146 Ligante: Gly 147 a Ser 161 Estrutura L1: Glu 162 a Cys 184 CDR L1: Ser 185 a His 194 Estrutura L2: Trp 195 a Tyr 209 CDR L2: Ser 210 a Ser 216 Estrutura L3: Gly 217 a Cys 248 CDR L3: Gin 249 a Thr 257 Estrutura L4: Phe 258 a Lys 267.

As Figuras 4 e 5 mostram, em termos de actividade injectada por grama de tecido e das razões tecido para sangue respectivamente, a biodistribuição dos anticorpos MFE-23 e A5-SC após 24 h e 48 h em ratinhos portadores de xenoenxertos de carcinoma humano colorrectal. O anticorpo A5-SC é um anticorpo scFv derivado de um anticorpo monoclonal A5B7. Com respeito aos tecidos testados, Li é fígado, Ki é rim, Lu é pulmão, Sp é baço, Co é cólon, Mu é músculo, Tu é tumor e BI é sangue. A figura 6 mostra uma construção de pUC 119 usado para clonar MFE-cys. O vector contém uma marca de cisteína-histidina. O ligante flexível consiste de 15 aminoácidos (Gly 4 Ser)x323. A sequência de sinal pelB dirige fragmentos de anticorpo para o periplasma bacteriano onde se dobram na conformação de ligação ao antigénio24. As sequências de nucleótidos e aminoácidos da Figura 6 são respectivamente as SEQ ID Nos. 5 e 6. A Figura 7 mostra a localização do "mTc-MFE-cys e 1-125 MFE-23 no xenoenxerto de cólon LS174T: os resultados são expressos como a percentagem de actividade injectada por grama de tecido a 24 e 48 h após injecção. Sangue (BI), Fígado (Li), Rim (Ki), Pulmão (Lu), Baço (Sp), Cólon (Co), Músculo (Mu), Fémur (Fe) e Tumor (Tu). 4 ratinhos por grupo. Barras: Desvio padrão DP. 13 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ A Figura 8 mostra as razões tecido para sangue de "mTc-MFE-cys no xenoenxerto do cólon LS174T a 24 e 48 h após injecção. Fígado (Li), Pulmão (Lu), Baço (Sp), Cólon (Co), Músculo (Mu), Fémur (Fe) e Tumor (Tu). 4 ratinhos por grupo.

As Figuras 9 e 10 mostram a localização de 125l MFE23-CPG2 e 125l CPG2 no xenoenxerto de cólon LS174T. Os resultados são expressos como percentagem de actividade injectada por grama de tecido a 24 horas (Figura 9) e 48 horas (Figura 10). A Figura 11 é uma representação esquemática do MFE23 subclonado para expressão contendo 6 x His no terminal-C. Para expressão do anticorpo o vector contém uma sequência de sinal Pel B que dirige o scFv para o periplasma bacteriano; daqui, o scFv é libertado no sobrenadante. * Denota um codão de paragem. As sequências de nucleótidos e aminoácidos da Figura 11 são respectivamente as SEQ ID Nos. 7 e 8.

EXEMPLO 1: FORMAÇÃO DE UM ANTICORPO A inserção de genes de anticorpo em bacteriófagos filamentosos toma possível gerar e pesquisar bibliotecas de 107 ou mais anticorpos. Cada fago expressa um anticorpo na sua superfície e contém o gene do anticorpo correspondente. Genes que codificam anticorpos com características desejadas são prontamente seleccionados e os seus anticorpos são expressos como proteínas solúveis em Escherichia coli. Este sistema tem sido usado para produzir um anticorpo para o antigénio carcinoembrionário com afinidade superior e melhor especificidade para o tumor do que os anticorpos correntemente em uso. Os resultados sugerem que o sistema de fago será o método de eleição para a produção de anticorpos de diagnóstico e uso terapêutico geral. O conteúdo deste exemplo foi relatado na ref 15.

Pode ser usado o anticorpo marcado radioactivamente para o antigénio carcino embrionário (CEA) para a formação de imagem de tumores colorrectais e pode ser útil para terapia se a eficiência de orientação puder ser melhorada1. Os anticorpos de afinidade superior podem conseguir isto2 e também teria valor uma especificidade melhorada para o tumor. A tecnologia dos fagos é um novo processo para a produção de anticorpos que é baseada na apresentação de fragmentos de anticorpo funcionais na superfície do bacteriófago3 (para revisão

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 14 ver ref 4). Podem ser feitas grandes bibliotecas de tais anticorpos e podem ser obtidos a partir destes fagos clonados que se ligam ao antigénio, após algumas operações de selecção (baseadas no antigénio) 5. A tecnologia dos fagos possibilita também a selecção de anticorpos com características desejadas. Por exemplo, anticorpos de afinidade elevada e anticorpos que se dissociam lentamente dos seus antigénios, podem ser isolados por manipulação das condições de selecção6. A utilidade do sistema de fago é aqui ilustrada pela produção de um anticorpo para o CEA com características melhoradas para se dirigira tumores.

Os ratinhos foram imunizados com CEA (tal como para a produção de anticorpos monoclonais convencionais) porque o ARNm do baço de animais imunizados é grandemente enriquecido nos genes do anticorpo desejado e proporciona um ponto de partida conveniente. Os genes da região variável do anticorpo foram amplificados a partir de ADNc com iniciadores específicos e clonados como uma única cadeia Fv (scFv) (VH e VL juntos por um ligante flexível) em vectores de bacteriófagos produzindo uma biblioteca de 107 membros. Os passos neste processo estão delineados na Figura 1. O anticorpo com especificidade para CEA foi seleccionado permitindo que a biblioteca de fagos se ligasse ao CEA biotinilado e capturando subsequentemente o fago ligado com pérolas revestidas com estreptavidina6. Os fagos seleccionados foram amplificados em número por infecção e crescimento durante a noite em Escherichia coli. Foram efectuadas várias operações de selecção e o progresso foi monitorizado por ELISA do fago3. Foi obtida uma reacção positiva com CEA após a primeira selecção (D.O. de 0,13 comparada com 0,013 para a biblioteca original) e a intensidade do sinal aumentou com duas operações sucessivas para D.O. 1,12. Nesta altura foram examinados os clones individuais por sequenciação de ADN: dos 25 clones sequenciados, foram identificados pelo menos 9 diferentes mostrando que havia diferentes anticorpos anti-CEA presentes. Para obter um scFv que se ligue a CEA em baixas concentrações (i.e. de elevada afinidade) efectuámos mais duas operações adicionais de selecção usando uma concentração baixa de CEA biotinilado (5 nM) e analisámos novamente a biblioteca. Trinta e quatro dos 50 clones individuais foram positivos em ELISA e a sequenciação do ADN revelou que os 5 com o sinal ELISA mais forte eram provenientes do mesmo clone. Este clone foi chamado MFE-23. O MFE-23 foi subclonado para expressão como um scFv solúvel ligado a uma marca myc na extremidade C para ajudar na identificação durante a

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 15 purificação da proteína. A produção de proteína (aproximadamente 20 mg por litro) a partir de culturas de bactérias foi obtida após 24 horas e o scFv foi purificado em cromatografia de afinidade CEA-Sepharose e por filtração em gel por exclusão de tamanho. Mostrou-se que a constante de dissociação (Kd) de MFE-23, por extinção da fluorescência, era de 2,5+/-1,3 nM, indicando a elevada afinidade de ligação a CEA por comparação com uma Kd de 25 nM no mesmo ensaio para A5B7, um anticorpo monoclonal que tinha produzido algumas das melhores orientações para tumores colorrectais até à data1. A imuno-histoquímica com o scFv purificado usando um segundo anticorpo dirigido contra a marca myc mostrou um padrão reactivo com CEA típico em 10/10 de adenocarcinomas colorrectais humanos. Foi examinada a especificidade contra uma gama de tecidos humanos normais e a única reactividade foi fraca e com intestino grosso normal - isto está em contraste com muitos anticorpos monoclonais anti-CEA que mostram comummente reacção cruzada com uma variedade de tecidos normais7. Em particular, verificámos que o scFv se ligou ao adenocarcinoma colorrectal humano mas não se ligou aos seguintes tecidos normais: fígado, rim, intestino grosso, amígdalas, pulmões, cérebro, testículos, ovário, cervix, mama, filmes sanguíneos, placenta, baço, tiróide, esófago, estômago, pâncreas, nódulos linfáticos e músculo esquelético.

Foi estudada a localização tumoral in vivo usando xenoenxertos de tumor humano colorrectal LS174T em ratinhos nus. A Figura 2 mostra a detecção por imagem do tumor usando MFE-23 marcado com 125lodo; só são visíveis os tumores. Em experiências separadas, foram removidos os tecidos e foi avaliada a radioactividade localizada; os resultados mostraram o tumor: razões sanguíneas de 11:1 a 24 horas após a administração de MFE-23 e 53:1 a 48 horas. O MFE-23 é o primeiro exemplo de um anticorpo com afinidade elevada, elevada especificidade anti-tumor produzido pela tecnologia dos fagos e os nossos dados indicam que tem potencial para detecção por imagem e terapia de cancro colorrectal melhoradas. Contudo, o sistema não está limitado a este objectivo de tal modo que podem ser obtidos da mesma maneira os anticorpos com as características desejadas para uma larga gama de aplicações. Os anticorpos produzidos usando a tecnologia dos fagos também têm a vantagem de que os seus genes estão já clonados, e portanto podem ser prontamente produzidos produtos derivados de anticorpos manipulados geneticamente, tais como proteínas de fusão de anticorpo com enzimas ou toxinas4. A facilidade de isolamento e a combinação favorável de características do MFE-23 ilustram o 16 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ poder desta abordagem e sugerem que o sistema fago-anticorpo será usado para produzir os anticorpos do futuro. EXEMPLO 2: UMA COMPARAÇÃO DE UM scFv DE ACORDO COM O INVENTO DERIVADO DE UMA BIBLIOTECA DE FAGOS FILAMENTOSOS COM UM scFv DERIVADO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL.

Os scFv podem tanto ser derivados de um anticorpo monoclonal como produzidos directamente usando tecnologia de fagos filamentosos em que os anticorpos com as características desejadas de ligação e purificação podem ser prontamente seleccionados das bibliotecas. Para testar a hipótese de que a última abordagem é mais útil, nós comparámos dois scFv anti-CEA produzidos por estas duas abordagens diferentes. O nosso estudo mostrou que, tanto no processo de purificação como no padrão de biodistribuição, o MFE-23 produzido por tecnologia de fagos filamentosos deu resultados favoráveis comparado com o A5-SC que é derivado do anticorpo monoclonal A5B7. Isto indica o valor da abordagem com base em fagos filamentosos para a obtenção de scFv de orientação para tumores. Métodos e materiais:

Clonaaem de scFv: A5-SC: Foi usado um Fab recombinante quimérico (rcFab) com Fv derivado de A5B7 monoclonal anti-CEA e com regiões constantes humanas16 como uma fonte de ADN plasmídico codificando para as regiões variáveis de A5B7. A VH de A5B7 foi submetida a restrição usando as enzimas Pst I e BstE II, isolada por electroforese em Agarose NuSieve a 2% e purificada usando o sistema de purificação de ADN Promega “Magic PCR". A VL de A5B7 VL foi obtida do mesmo plasmídeo rcFab usando PCR com iniciadores VKBACK17 e um iniciador de síntese no sentido directo VK4FOR-Not 118 para criar um local Not I na extremidade 3’. O fragmento PCR foi purificado usando o sistema de purificação de ADN Promega “Magic PCR” e cortado com Sac I e Not I. As VH e VL de A5B7 foram clonadas sequencialmente nos seus locais de restrição correspondentes num plasmídeo de expressão scFv pUC 119 para originar a construção A5-SC19. MFE-23: o MFE-23 foi produzido por tecnologia de fagos filamentosos como descrito no Exemplo 1 e subclonado no mesmo vector de expressão scFv pUC 119 que o A5-SC. 17 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ

Expressão de scFv em E.coli:

Foram agitadas a 37°C células de E, coli XL1 Blue (Stratagene), transformadas com os plasmídeos, em meio 2X TY com 100 μg/ml de ampicilina e 0,1% de glucose até uma D.O. de 0,9 a 600 nm. A expressão proteica foi então induzida por adição de isopropil-beta-D-tiogalactósido 1 mM e incubação durante a noite a 30°C. Foram então formadas peletes com as células e o sobrenadante contendo o scFv foi decantado e armazenado a 4°C. A actividade anti-CEA foi testada para ambos os scFv por ELISA, usando poços revestidos com CEA (2 pg/ml). O scFv ligado foi detectado pelo anticorpo anti-myc 9E10 (uma oferta do Dr. Gerrard Evan, ICRF London) seguido do conjugado Ig anti-ratinho-HRP (Jackson) e visualizado usando o substrato dicloridrato de o-fenilenodiamina (Sigma).

Purificação de scFv por cromatoarafia em ael de exclusão por tamanho e de afinidade O sobrenadante foi concentrado 5-10 vezes usando um cartucho Spiral (S1Y10 Amicon) e dialisado contra PBS/Az (Fosfato 50 mM, NaCI 150 mM pH 7, contendo 0,02% de azida de sódio). O concentrado foi aplicado a uma coluna de 7 ml de CEA/Sepharose-4B, contendo 7 mg de CEA. O material não ligado foi removido com PBS/Az. O A5-SC ligado foi eluído em 2 etapas. Primeiro, foi aplicada dietilamina 50 mM (pH 11) e depois, tiocianato de amónio 3 Μ. O MFE-23 ligado foi eluído com dietilamina 50 mM (pH 11). Em ambos os casos as fracções de dietilamina foram imediatamente neutralizadas com tampão de fosfato 1 M (pH 7,5). As fracções recolhidas foram reunidas, dialisadas contra PBS/Az, concentradas e aplicadas a Sephacryl S-100 (S-100) (Pharmacia) para separação por exclusão por tamanho. Os scFv isolados e purificados foram ainda mais concentrados para 0,5-1 mg/ml e armazenados a 4°C. A actividade anti-CEA de ambos os anticorpos foi confirmada com um ELISA positivo. pl de scFv:

Os pontos de focagem isoeléctrica dos scFv foram obtidos usando uma placa de Amphaline PAG de pH 3,5-9,5 (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante.

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 18 lodação:

Foram iodados 75 μς de A5-SC e MFE-23 com 0,5 mCi de 1-125 usando o método de Cloramina T/L-Tirosina20. Os produtos marcados radioactivamente foram testados por cromatografia de camada fina para demonstrar a eficiência da captação de 1-125, e por aplicação a uma coluna de CEA/Sepharose de 1 ml, contendo 1 mg de CEA, para testar a ligação a CEA antes da administração aos ratinhos. A estabilidade dos produtos marcados radioactivamente foi testada por filtração em gel em S-100.

Estudos em xenoenxertos O anticorpo marcado radioactivamente foi administrado pela veia da cauda a ratinhos nus portadores do xenoenxerto de carcinoma humano colorrectal LS174T21. Cada ratinho recebeu 4,3 μg/30,12 μΟΐ de A5-SC ou 4,3 μg/7,73 pCi de MFE-23. Os ratinhos foram sacrificados a 24 h e a 48 h, e os tecidos foram removidos e avaliados quanto à actividade usando um contador gama. Foram usados 4 ratinhos para cada ponto temporal.

Resultados:

Rendimentos durante a purificação:

Os rendimentos dos scFv foram estimados após a cromatografia de afinidade e a filtração em gel por exclusão por tamanho, usando a densidade óptica medida a 280 nm. O coeficiente de extinção para A5-SC foi calculado como sendo 0,6 e para o MFE-23, 0,7, usando a fórmula: peso molecular/número de resíduos de tirosina x 1000 + número de resíduos de triptofano x 5000. Todos os resultados são expressos como o rendimento proteico de 1 litro de sobrenadante. Após a cromatografia de afinidade e a concentração da proteína, foram obtidos 0,65 mg de A5-SC, em comparação com 4,3 mg para o MFE-23. Após a filtração em gel S-100 e a concentração, o rendimento protéico do A5-SC aparentou ser muito baixo, só 0,2 mg em comparação com 2,76 mg para o produto final MFE-23, que era 13,8 vezes mais elevado. O perfil de eluição a partir do S-100 mostrou dois picos com o A5-SC, em comparação com um só pico para o MFE-23. O pico do MFE-23 e o segundo pico do A5-SC correspondem a um peso molecular de 27 kD, que é esperado para um monómero de scFv. O primeiro pico do perfil do A5-SC em S-100 foi considerado como sendo um dímero A5B7 e isto foi testado e

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 19 confirmado por SDS-PAGE. ρ| de scFv: . Os pontos de focagem isoeléctrica mostraram que o A5-SC é mais básico do que o MFE-23, uma vez que o pl do A5-SC era 9-9,5, em comparação com um pl mais baixo de 4,5-5,5 para o MFE-23.

Estabilidade após iodação:

Foi testada a estabilidade dos scFv após marcação radioactiva por filtração em gel S-100. O perfil de eluição do A5-SC mostrou um único pico. Não havia nenhum sinal de formação de dímeros e não foi detectada nenhuma agregação. O perfil em S-100 do MFE-23 mostrou um pico, de modo semelhante. Estes resultados confirmaram a estabilidade física do monómero de A5-SC e do MFE-23 após Iodação. A actividade para CEA de ambos os produtos marcados radioactivamente foi testada por ligação a CEA/Sepharose. A percentagem de contagens recuperadas foi calculada como sendo 30,8% para o A5-SC e 38,7% para o MFE-23.

Localização tumoral do A5-SC e MFE-23 em xenoenxertos de tumores humanos. A biodistribuição do A5-SC e do MFE-23 foi examinada a 24 e a 48 horas após a administração. Foram avaliadas a percentagem de actividade injectada por grama de tecido e as razões tecido/sangue. Foi localizada no tumor 1,2% da actividade injectada do A5-SC a 24 horas após a administração, em comparação com 3,2% do MFE-23 (Fig. 4). A 48 horas estas quantidades absolutas no tumor baixaram para ambas as proteínas, dando valores de 0,46% para o A5-SC e 1,2% para o MFE-23 (Fig. 4). Contudo, devido à rápida depuração no sangue dos scFv, estas quantidades resultaram em razões favoráveis de tumor para sangue neste ponto temporal. Estas foram 11:1 para o A5-SC e 24:1 para o MFE-23 (Fig 5). O ponto temporal de 24 h deu razões de 6:1 para o A5-SC e 13:1 para o MFE-23.

Foi detectada uma quantidade significativa de actividade no rim para o A5-SC. A % da dose injectada em ambos os pontos temporais foi ainda mais elevada do que aquela detectada no tumor; 3,2% a 24 horas e 2,4% a 48 horas (Fig. 4).

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 20

Isto deu origem a razões de rim para sangue elevadas (19,7:1 a 24 h e 97,2:1 a 48h). O MFE-23 também mostrou alguma actividade no rim, mas esta foi muito mais baixa do que a observado com o A5-SC originando razões de rim para sangue de respectivamente 4,7:1 a 24 h e 9,6:1 a 48h. Em ambas as instâncias isto foi menos do que a quantidade localizada no tumor. A captação do A5-SC foi também observada no fígado e no baço, dando razões de tecido para sangue respectivamente de 15,6:1 e 8,6:1 a 48 horas. Isto está em contraste com o MFE-23, que não mostrou localização nestes orgãos. A captação do A5-SC no fígado e no rim não pareceu ser devida a agregação, uma vez que não foi detectado nenhum material de peso molecular elevado no perfil em S-100 do A5-SC após marcação radioactiva.

Conclusão:

Este exemplo descreve um estudo comparativo entre dois scFv anti-CEA derivados por abordagens diferentes, sendo o A5-SC derivado de um anticorpo monoclonal enquanto que o MFE-23 é produzido por tecnologia de fagos. Os resultados mostraram uma biodistribuição favorável, com quantidades absolutas mais elevadas e melhores razões tumor para sangue para o MFE-23 em comparação com o A5-SC. O MFE-23 foi também mais fácil de purificar.

EXEMPLO 3: MARCAÇÃO RADIOACTIVA COM ^TC DE UM ANTICORPO DE ACORDO COM O INVENTO COM UMA CISTEÍNA NO TERMINAL C PARA DETECCÃO POR IMAGEM DE TUMOR COLORRECTAL

Os scFv têm potencial para estudos clínicos de detecção por imagem devido à sua rápida penetração tumoral e às elevadas razões tumor para tecido em pontos temporais iniciais. São necessários grupos tiol livres para a marcação de scFv com tecnécio. Para conseguir isto, foi construído um vector que possibilitou que uma cisteína livre fosse ligada ao terminal C dos scFv. O MFE-23 foi clonado neste vector e o MFE-23 com a marca de cisteína foi marcado com tecnécio usando um método de transferência de D-glucarato. O produto marcado radioactivamente aparentou ser estável tanto in vivo como in vitro e mostrou razões tumor para sangue favoráveis in vivo em pontos temporais iniciais; 4:1 a 24h e 8:1 a 48h. Em comparação com o MFE iodado, os MFE marcados com 99mTc mostraram uma % da actividade injectada no tumor mais elevada. 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 21

Materiais e métodos: !

Vector de expressão e clonaaem de MFE-cvs:

Para criar um novo vector de expressão com uma cisteína na extremidade do terminal C, foi usada a mutagénese dirigida a locais por PCR inversa28 para substituir a histidina no vector de expressão baseado no pUC119 previamente descrito19 contendo uma marca de hexa-histidina no terminal C. Foi conseguida uma modificação usando 25 ciclos de PCR com os oligonucleótidos Cys-His-For (5’-TGGTGATGACATGCGGCCGCCCGTTTGAT-3\ SEQ ID N°: 3) e His6-Bak (5’-TCATCACTAATAAGAATTCACTGGCCG-3’, SEQ ID N°: 4) seguidos por ligação própria. Os clones contendo a sequência requerida (Figura 6) foram identificados por sequenciação de ADN. O MFE-23 foi subclonado neste vector na forma de um fragmento Nco1/Not1.

Expressão de MFE-cvs em E. coli: Células de E. Coli “sure” (Stratagene) foram transformadas com a construção do plasmídeo mostrado na Fig. 6. As células foram agitadas a 37°C num meio 2X TY com 100 pg/ml de ampicilina e 0,1% de glucose até que foi obtida uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm. A expressão proteica foi induzida por adição de isopropil-beta-D-tiogalactósido 1 mM durante a noite a 30°C. Foram formadas peletes com as células e o sobrenadante contendo o MFE-cys foi decantado e armazenado a 4°C.

Purificação de MFE-cvs O sobrenadante foi concentrado 10 vezes usando um cartucho Spiral (S1Y10 Amicon) e dialisado contra PBS/Az (Fosfato 50 mM, NaCI 150 mM pH 7, contendo 0,02% de azida de sódio). O concentrado foi aplicado a uma coluna de CEA/Sepharose-4B, contendo 7 mg de CEA. O material não ligado foi lavado com PBS/Az. O MFE-cys ligado foi eluído com dietilamina 50 mM (pH 11), após o que as fracções contendo a proteína foram imediatamente neutralisadas com tampão de fosfato 1 M (pH 7,5). As fracções recolhidas foram reunidas, dialisadas contra PBS/Az e armazenadas a 4°C. Os eluatos reunidos foram então concentrados utilizando membranas de ultrafiltração Diaflo (YM10 Amicon), após o que o material concentrado foi purificado por filtração em gel de exclusão por tamanho sobre Sophacryl S-100 (Pharmacia). O rendimento de MFE-cys durante o

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 22 processo de purificação foi estimado utilizando a densidade óptica medida a 280 nm. O coeficiente de extinção para MFE-cys foi calculado como sendo 0,7 utilizando a fórmula: peso molecular/número de resíduos tirosina x 1000 + número de resíduos triptofano x 5000. O monómero de MFE-cys purificado foi concentrado e armazenado a 4°C.

Marcação de MFE-cvs: O MFE-cys foi marcado radioactivamente com 99mTc usando um método de transferência de "mTc-D-glucarato22. Foi adicionado 1 ml de pertecnetato de sódio 99mTc (40,5 mCi) a 12,5 mg de D-glucarato monopotássico, 16,8 mg de bicarbonato de sódio e 100 μg de cloreto estanoso (o cloreto estanoso foi preparado directamente antes da utilização a uma concentração de 0,2 mg/ml). Esta solução foi deixada à temperatura ambiente durante um minuto. Foram então misturados 0,5 ml com 200 μg de MFE-cys em PBS/ EDTA 1 mM. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 30 min e depois aplicada a uma coluna PD 10 (Pharmacia; iniciada com albumina do soro humano em PBS) para separar a proteína radiomarcada do pertecnetato livre. A eficiência da captação de 99mTc foi testada por cromatografia em camada fina, usando acetonitrilo/água (30:20) como solvente móvel. Foi aplicada uma alíquota (100 μΙ) de scFv marcado radioactivamente diluído (1:30 em PBS/Tween 20) a uma coluna de CEA-Sepharose, contendo 1 mg de CEA para testar a ligação ao CEA. A coluna foi lavada com 8 volumes de PBS/Tween 20 a 0,05% e foi obtido o material de ligado por adição de tiocianato de amónio 3M. Além disso, a estabilidade do scFv marcado foi testada por aplicação do produto (diluído 1:30) a Sephacryl S-100. Para testar a estabilidade do produto marcado radioactivamente in vivo foi também aplicado a Sephacryl S-100 soro recolhido de ratinhos injectados com o scFv marcado 24h após a administração. A estabilidade do produto marcado com 99mTc foi também testada por autorradiografia do gel, como se segue: o MFE-cys marcado radioactivamente foi sujeito a SDS-PAGE usando um gel não redutor de acrilamida a 15%. A proteína foi então transferida segundo Western num Immobilon P (Millipore) e visualizada por autorradiografia usando uma cassete Kodak X-Omatic e um filme Hyperfilm-MP (Amersham).

Estudos de xenoenxertos

Foi usada a linha de células LS174T do adenocarcinoma humano do cólon para desenvolver um modelo de tumor de xenoenxerto11. O MFE-cys marcado

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 23 radioactivamente com 99mTc (11 pg/36,4 uCi por ratinho) foi administrado por meio da veia da cauda. Os ratinhos foram mortos nas 24h e 48h seguintes à administração e foram removidos sangue, o fígado, o rim, o pulmão, o baço, o cólon, o músculo, o fémur (só para MFE-cys marcado com tecnécio) e o tumor. A actividade foi avaliada por contagem no contador gama (LKB, Bromma, Sweden, Wallac 1284 Compugamma) após digestão com KOH 7M. A actividade foi expressa como % da dose injectada por grama de tecido. Foram usados 4 ratinhos para cada ponto temporal.

Resultados:

Rendimentos durante a purificação de MFE-cvs:

Após cromatografia de afinidade e concentração, foi obtido um rendimento proteico de 13,3 mg de MFE-cys de 4 litros de sobrenadante. O perfil de eluição do Sephacryl S-100 mostrou dois picos; o segundo pico correspondia a um peso molecular de 27 kD, o peso molecular correcto para o monómero MFE-cys. Mostrou-se que o primeiro pico era um dímero de MFE-cys, por SDS-PAGE não redutor. Após concentração do monómero MFE-cys, foi conseguido um rendimento final de 8 mg, em comparação com apenas 1 mg do pico do dímero (razão 8:1). A pureza do monómero MFE-cys foi confirmada em SDS-PAGE, que mostrou só uma banda ao peso molecular correcto.

Análise de MFE-cvs marcado com —Tc O MFE-cys foi marcado radioactivamente usando um método de tranferência de "mTc-D-glucarato22. A cromatografia de camada fina mostrou uma incorporação de 99mTc no interior da proteína de mais de 80%. A actividade de ligação do produto marcado radioactivamente ao CEA pareceu ser muito boa; após a aplicação do produto marcado radioactivamente à coluna de CEA/Sepharose, foram recuperadas 55% das contagens na fracção ligada. A sua estabilidade in vitro foi confirmada pela aplicação do produto marcado radioactivamente a Sephacryl S-100; foi detectada pouca degradação. Não foi observado nenhum sinal de formação de dímeros e não foi detectada nenhuma agregação. De acordo com este resultado, a autorradiografia do gel mostrou uma só banda ao peso molecular correcto para este scFv. Quando o soro de ratinhos injectados com scFv marcado com 99mTc, colhido 24 h após a

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 24 administração, foi aplicado a Sephacryl S-100, só foi observado um único pico ao peso molecular correcto, o que confirma também a sua estabilidade in vivo.

Estudos in vivo: A biodistribuição de MFE-cys marcado com 99mTc foi examinada durante um período de 48 horas. Foram avaliadas a percentagem da actividade injectada por grama de tecido e as razões tecido para sangue. Os resultados são mostrados na Fig. 7 e na Fig.8. Estes resultados demonstram que, em ambos os pontos temporais, o MFE-cys marcado com 99mTc mostrou que a 24h estava localizada no tumor aproximadamente 4% da actividade injectada e a 48h estava localizada 2,4%. Estas quantidades resultaram em razões tumor para sangue favoráveis em ambos os pontos temporais, devido à rápida depuração deste scFv. Estas foram 4:1 a 24h e 8:1 a 48h.

Apenas foi observada actividade significativa em tecidos normais no rim. O MFE-cys marcado com tecnécio mostrou uma percentagem mais elevada da actividade injectada no rim do que no tumor, o que resultou em razões razões rim para sangue elevadas em ambos os pontos temporais; 10:1 a 24h e 17:1 a 48h, respectivamente.

Conclusão O MFE-cys marcado com tecnécio mostrou características de biodistribuição in vivo favoráveis para diagnóstico precoce por formação de imagem. A rápida disponibilidade do tecnécio, os seus baixos custos, as propriedades ideais para formação de imagem em câmera gama, a baixa exposição do paciente à radiação por milicurie de radionuclido e por último o facto de não serem necessários agentes bloqueadores da tiróide, tornam o tecnécio muito mais prático para imunocintigrafia.

EXEMPLO 4: A BIODISTRIBUIÇÃO DE UM ANTICORPO DE ACORDO COM O INVENTO FUNDIDO A UMA CARBOPEPTIDASE G2 (CPG2I

Este exemplo compara a biodistribuição do 125l MFE23-CPG2 e do 125l CPG2 no modelo tumoral LS174T.

Foram colocados pequenos pedaços de tecidos de xenoenxerto

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 25 subcutaneamente nos flancos de ratinhos nús. Os tumores cresceram durante 2-3 semanas antes de começar a experiência. Eram 4 ratinhos/grupo/ponto temporal. 1. O primeiro grupo (12 ratinhos) recebeu 2,8 pg/3 μΟΐ/8,6 U/0,2 ml de 125l MFE23-CPG2 intravenosamente na veia da cauda. 2. O segundo grupo (8 ratinhos) recebeu 2,8 μg/21 pCi/0,2 mi de 125l CPG2 intravenosamente na veia da da cauda.

Os ratinhos foram sangrados e os tecidos removidos às 24 e às 48 horas. A percentagem da actividade injectada por grama de tecido foi avaliada nos dois pontos temporais. Os resultados são mostrados na Fig. 9 e Fig. 10. Após 24 horas, a 125l MFE23-CPG2 apresentava uma razão tumor: sangue de 9,4:1, enquanto a 125l CPG2 apresentava uma razão de 2:1. Após 48 horas, a 125l MFE23-CPG2 apresentava uma razão de 12,6:1 enquanto que a 125l CPG2 apresentava uma razão de 1,1:1. Assim, 125l MFE23-CPG2 apresenta uma localização favorável para o tumor. EXEMPLO 5: PURIFICAÇÃO DE UM ANTICORPO DE ACORDO COM O INVENTO USANDO UMA MARCA DE His

Este exemplo refere-se a um novo procedimento para a purificação de um anticorpo de acordo com o invento. A inserção de uma cauda de hexa-histidina fundida no terminal C do anticorpo proporciona uma marca de afinidade que selectivamente se liga a iões de metais de transição imobilizados numa matriz de fase sólida derivatizada de ácido iminodiacético (IDA). Este método provou ser superior à cromatografia de afinidade Standard para o antigénio CEA nas seguintes maneiras: (1) Foi produzido um rendimento mais elevado (10 mg por litro em oposição a 2,2 mg por litro de sobrenadante bacteriano). O último número foi largamente afectado pela limitada disponibilidade (tamanho da coluna) do antigénio CEA imobilizado. (2) O aumento de escala foi relativamente simples e menos dispendioso. (3) É eliminado o risco do antigénio derivado do tumor sofrer lixiviação da coluna. Os resultados mostram que os iões Cu2+ imobilizados são mais eficazes do que os iões de Ni2+ e Zn2+ na retenção do produto com a marca de His originando, por eluição, um produto com 90% de pureza. Material de qualidade clínica foi gerado usando cromatografia de exclusão por tamanho para remover material agregado e gel Detoxi para remover endotoxinas bactéria nas.

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Foram efectuados ensaios de validação para medir o ADN, o cobre e as endotoxinas, para avaliar os níveis de contaminantes. O MFE-23 His reteve 84% de ligação ao antigénio após armazenamento durante 6 meses a 4°C e >75% após marcação radioactiva. Experiências adicionais confirmaram que a cauda de His não afectou a biodistribuição e a localização tumoral em ratinhos nús portadores de xenoenxertos de tumores humanos colorrectais.

Materiais e métodos: A preparação de material de qualidade clínica requer precauções particulares que não são necessárias na preparação de produtos de laboratório. O scFv com qualidade clínica aqui produzido estava de acordo com as linhas de orientação especificadas no manual de operações de controlo para produtos recombinantes de Câncer Research Campaign32. Um resumo das linhas de orientação relativas à qualidade e à segurança de produtos clínicos inclui: 1. Equipamento e áreas de trabalho estéreis designadas que evitarão a contaminação do produto purificado. 2. Pormenores completos do desenvolvimento do produto, incluindo sistemas de expressão e sequenciação de ADN. 3. Preparação de um lote de sementeira clínica incluindo teste para a homogeneidade e reactividade em armazenamento. 4. Detalhes de purificação e reprodutibilidade. 5. Caracterização do produto final incluindo níveis de contaminação, potência, actividade biológica e toxicidade. Têm sido redigidos Procedimentos Standard de Operação (SOP) para cada etapa individual do processo de produção acima esboçado.

Subclonaaem e expressão da cauda de poli-histidina O gene que codifica para o MFE-23 foi subclonado num vector de expressão pUC 119 de modo a conter 6 x His no terminal C (Figura 11-Vector MFE-23 His). A construção foi transfectada para células de E. coli. TG1 usando electroporação que foram plaqueadas em ágar 2 x TY contendo ampicilina a 100 pg/ml e glucose a 1%. Foi usada uma colónia individual para produzir um lote de sementeira de acordo com as linhas de orientação de segurança e foi empregue a sequenciação de ADN para confirmação da identidade. Para expressão, foram cultivadas alíquotas do lote de sementeira em meio 2 x ΤΎ contendo ampicilina a

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 27 100 pg/ml e glucose a 1% a 37°C, agitando durante 16-20 h. As células cresceram até uma densidade celular de 0,9 de densidade óptica (DO) a 600 nm. A produção de scFv foi promovida pela adição de isopropil-p-D-tiogalactósido 1 mM e a temperatura reduzida para 30°C por mais 16 h. Foram formadas peletes com as células a 11 300 x g e o sobrenadante contendo o MFE-23 His foi passado através de filtros descartáveis Nalgene de 0,45 pm e depois de 0,2 pm de 1 litro (Fisons, Loughborough, RU).

Concentração e diálise do sobrenadante contendo MFE-23 His O sobrenadante bacteriano foi concentrado usando um sistema de ultrafiltração Amicon CH2 (Amicon, Stonehouse, Glocestershire, RU) incorporando um reservatório RA2000 e um cartucho em espiral S1Y10 com um limite de exclusão de pesos moleculares de 10 kDa. Para esterilizar o sistema de ultrafiltração para o material de qualidade clínica, este foi lavado com detergente neutro Hospec seguido de hidróxido de sódio 0,1 M e água isenta de pirogénios (Baxter, Norfolk, RU) para neutralizar. O sobrenadante da cultura de MFE-23 His (1-4 litros) foi concentrado para 200-300 ml e dialisado sob pressão contra solução salina tamponada com fosfato estéril, pH 7,2 PBS de Dulbecco’s Sigma, Poole, RU). O MFE-23 His em bruto foi centrifugado a 6 300 x g durante 20 min a 4°C e filtrado novamente usando filtros Nalgene de 0,45 μητι e 0,2 μιη para esterilizar e remover quaisquer agregados grandes de proteínas que se possam ter formado durante os passos de concentração.

Purificação A purificação IMAC foi optimizada numa escala pequena usando condições não estéreis. Os procedimentos de purificação clínica foram efectuados sob condições rigorosas, usando material de vidro, descartável e produtos químicos estéreis. Todos os tampões foram preparados com água isenta de pirogénios. As soluções de imizadolo foram tamponadas com PBS estéril de Dulbecco contendo cloreto de sódio (NaCI) 1M para suprimir as interacções iónicas, melhorando assim a selectividade do metal para os ligandos de histidina .

IMAC

Uma coluna Econocolumn 10/2,5 cm (Bio-Rad, Hemel Hempsted, RU) foi compactada com 40 ml de Sepharose quelante de fluxo rápido (Pharmacia

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Biotech, St Albans, RU) e equilibrada com 100 ml de água sob a acção da gravidade. Carregaram-se iões metálicos (100 ml) na forma de sulfato de cobre, cloreto de zinco ou cloreto de níquel 0,1 M (Sigma) em água e lavou-se com o mesmo volume de tampão de equilíbrio (PBS/1M NaCI). O NaCI foi adicionado ao sobrenadante dialisado concentrado até uma concentração final de 1 M para evitar a lixiviação dos iões metálicos da coluna33. Carregaram-se até 300 ml de sobrenadante e recolheu-se o material não ligado. Foi realizada a eluição competitiva usando um gradiente de imidazolo de 40, 60, 80, 100 e 120 mM, recolhendo em porção 250 ml de produto ligado em cada passo. A coluna foi regenerada retirando os iões metálicos com 100 ml de EDTA 50 mM e equilibrada novamente com vários volumes de coluna de água.

Todas as fracções foram dialisadas para PBS para remover o sal, os agentes eluentes e quaisquer iões metálicos que possam ter sido lixiviados da coluna. As fracções foram então reunidas e concentradas usando ultrafiltração em célula agitada e uma membrana PM 10 (Amicon) para análise por SDS-PAGE. Para aumentar a recuperação do material clínico, foram subsequentemente reunidas e novamente aplicadas na coluna todas as fracções dialisadas excluindo a fracção de imidazolo 120mM.

Filtração em gel O material purificado por IMAC foi adicionalmenere purificado por exclusão de tamanho para remover agregados e iões metálicos. A fracção de imidazolo 120 mM concentrada, dialisada e filtrada esterilmente em 0,22 μιτι (Gelman, Northampton, UK) foi aplicada a uma coluna (XK 16/100- Pharmacia Biotech) de 350 ml Sephacryl S-100 (Pharmacia Biotech). Foram medidas fracções a DO 280 nm, as fracções relevantes foram reunidas e concentradas, usando ultrafiltração em célula agitada e armazenadas a 4°C.

Cromatoarafia de afinidade

Foram purificados 2 litros de MFE-23 His que tinha sido concentrado e dialisado em PBS (400 ml) usando uma coluna de afinidade de Sepharose 4B activada com 6 ml de brometo de cianogénio (Pharmacia Biotech) acoplada a CEA (8 mg). O CEA foi obtido de uma metástase no fígado de um tumor colorrectal de um paciente por extracção usando ácido perclórico34. Foi efectuada uma passagem na coluna de 30 ml de sobrenadante por operação. 29 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ

Remoção de endotoxina bacteriana

Uma coluna Econocolumn 10 x 2,5 cm (Bio-Rad) foi compactada com 10 ml de gel Detoxi (Pierce Warriner. Chester, RU) e equilibrada com PBS estéril sob a acção da gravidade. Carregaram-se 10 ml do produto concentrado e purificado, cuidadosamente misturados com o gel e incubados durante a noite à temperatura ambiente numa coluna selada. O produto foi eluído por lavagem com 30 ml de PBS.

Teste final ao produto

Foram analisadas amostras em cada etapa de purificação relativamente aos níveis de endotoxinas usando frascos de coágulo de gel de lisado de Limulus ameobocyte (LAL) (Atlas bioscan. Bognor Regis, RU) de acordo com as instruções recomendadas pelo fabricante; uma alíquota adicional (três vezes a dose do paciente) foi testada por injecção em coelhos (Safepharm Laboratories; Derby, UK). O sobrenadante bacteriano contendo MFE-23 His, o MFE-23 His semipurificado e o produto final foram testados quanto à presença de ADN bacteriano usando a marcação de ADN com Digoxigenina (DIG) e o ensaio de detecção (Boeringer Mannheim, Lewes, RU). Foi construída uma sonda usando uma mistura de iguais proporções de ADN plasmídico de MFE-23 e ADN bacteriano total. As sondas de ADN marcadas com DIG foram detectadas após hibridação com amostras alvo por imunoensaio com ligação enzimática usando um conjugado de fosfatase alcalina anti-DIG. A sonda foi sensível a 12 pg de ADN. O produto final foi também ensaiado quanto ao teor de Cu2+ e comparado com etapas de purificação anteriores, usando fotometria de chama (Trace Element Laboratory - University of Surrey). Uma alíquota foi também sequenciada relativamente às proteínas usando análise de aminoácidos nas instalações de sequenciação de proteínas CRC (University college of London) para confirmar a homogeneidade do produto final e o corte da sequência de comando pelB no periplasma. A estabilidade do anticorpo foi determinada por armazenamento de alíquotas a 4°C e -70°C e analisando subsequentemente amostras a certos intervalos de tempo usando uma coluna Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia) de FPLC. A retenção de ligação ao antigénio após 6 meses de armazenamento a 4°C foi medida por aplicação de uma quantidade conhecida de anticorpo purificado à coluna de afinidade ao CEA (referir à secção 2.7) e quantificando a % de ligação (actividade específica). Estes valores foram comparados por aplicação de uma £. 30 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ quantidade conhecida de MFE-23 His previamente purificado usando a mesma coluna. lodação do MFE-23 His: A marcação radioactiva do MFE-23 His com 125lodo (125l) foi efectuada usando o método da Cloramina T35. Tipicamente foram radiomarcados 67-250 pg de produto purificado em 0,5 ml,para dar actividades específicas de 167-481 MBq/pg.

Análise do produto marcado radioactivamente

Foi efectuada cromatografia em camada fina (TLC) para medir a % de incorporação de 125l. A ligação do antigénio foi também determinada por aplicação de uma diluição da marca radioactiva a uma Sepharose 4B acoplada a CEA (1 mg de CEA; 1 ml de volume de coluna). A fracção não ligada foi lavada com dois volumes de coluna de PBS e a fracção ligada, com o mesmo volume de tiocianato de amónio 3 M. Foram testados como comparação um controlo scFv B1,8 que não é específico para CEA e MFE-23 contendo uma marca c-myc (MFE-23 myc). As fracções ligadas e não ligadas foram analisadas quanto a actividade do 125l usando um contador gama. As determinações de estabilidade foram realizadas por aplicação de uma amostra do produto marcado e não marcado radioactivamente a um minigel SDS-PAGE a 15%. O 125l-MFE-23 His foi visualizado por autoradiografia e o produto não marcado por coloração com azul de Coomassie. O 125l-MFE-23 His foi também aplicado a uma coluna de Sephacryl S-100 de 100 ml (115 x 1 cm). Foram recolhidas fracções de 1,5 ml que foram contadas relativamente à actividade de 125l.

Experiência de xenoenxertos in vivo A localização do tumor e a biodistribuição de 125I-MFE His realizada em ratinhos nús portadores de xenoenxertos de tumores humanos LS174T. Foi incluído como comparação o MFE-23 myc, que tinha sido previamente caracterizado, avaliado quanto à afinidade e que se mostrou que se localizava em xenoenxertos de tumores humanos (Exemplo 1). O anticorpo marcado radioactivamente foi administrado na veia da cauda dos ratinhos, quando os tumores tinham o peso aproximado de 0,5 g. Cada ratinho recebeu 5 pg/10 pCi de anticorpo marcado com 125l e 4 ratinhos de cada grupo foram sacrificados 24 h

83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 31 depois. Os tecidos e as amostras de sangue foram removidos, pesados, digeridos em hidróxido de potássio 7 M durante 24 h e avaliados quanto à actividade usando um contador gama.

Resultados

Optimização do IMAC

Compararam-se Ni2+, Zn2+ e Cu2+ quanto à eficácia como iões metálicos para o suporte sólido IMAC. A electroforese SDS-PAGE mostrou que, em geral, a maioria das proteínas não específicas foram lavadas da coluna na fracção não ligada. Foram eluídas mais impurezas por competição com baixas concentrações de imidazolo 10-40 mM. O aumento da concentração de imidazolo para competir por locais de ligação de metais resulta na eluição do produto com a marca de His. Este gradiente de imidazolo em passos foi útil para a comparação da eficiência de ligação do anticorpo a iões metálicos Ni2+, Zn2+ e Cu2+ imobilizados e o nível ao qual o produto puro elui da coluna. Todos os produtos remanescentes eluiram quando a coluna foi limpa com EDTA. Estavam presentes impurezas em todas as eluições com imidazolo e fracções de EDTA quando a coluna foi iniciada com Ni2+. Houve também lixiviação visível do Ni2+ na eluição com imidazolo, reflectindo a fraca afinidade de ligação do Ni2+ à coluna. Em contraste, quando a coluna foi iniciada com Zn2+, o gradiente de imidazolo foi mais eficaz na produção de produto puro do que quando foi usado o Ni2+. Contudo, as fracções de imidazolo 80-120 mM e de EDTA continham algumas impurezas remanescentes. O melhor perfil de eluição foi produzido carregando a coluna com iões Cu2+; o produto puro eluiu com fracções de imidazolo 60-120 mM e de EDTA. Embora o produto puro também tenha eluído na fracção de EDTA, esta não pode ser adicionalmente processada para uso clínico devido à presença de níveis elevados de iões de cobre que foram difíceis de remover mesmo após diálise extensa. Esta fracção foi dialisada e novamente aplicada à coluna. Considerando os resultados, o cobre foi seleccionado como o ião metálico imobilizado para a produção clínica de MFE-23 His. Para facilitar a manipulação de grandes volumes do lote clínico, foi empregue um gradiente em passos de concentrações de imidazolo de 40 e 120 mM. As impurezas foram separadas por eluição com 250 ml de imidazolo 40 mM a partir de produto puro a imidazolo 120 mM (250 ml) num único passo cromatográfico. 32 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ

Pureza e Rendimento A filtração em gel do MFE-23 His de qualidade clínica revelou que 90% do produto estava na forma de monómero após um passo de purificação. O material de grande peso molecular foi eficazmente separado do produto. O rendimento do produto final do lote clínico foi aproximadamente 10 mg por litro de sobrenadante a DO a 280 nm usando o coeficiente de extinção de 0,7. A afinidade do material purificado produziu um rendimento de 2,2 mg por litro com uma passagem única através da coluna.

Avaliação do produto final São mostrados na Tabela I os níveis de contaminação do MFE-23 His de qualidade clínica com endotoxinas bacterianas e cobre em cada passo cromatográfico.

Tabela I. Remoção de endotoxinas bacterianas e cobre em cada passo cromatográfico.

Passo de purificação Sobrenadante

Quelato de Cu2+ eluído da coluna - pré diálise (fracção de 120 mM) - pós diálise (fracção de 120 mM) Eluído da filtração em gel S-100 Eluído do gel Detoxi (produto final)

Endotoxina Eu/ml Cu2+ μΜ/Ι 50 000 - _ 75 750 8 25 3,4 <2,5 -

Os resultados mostraram que o gel Detoxi foi eficaz na remoção de pelo menos uma escala logarítmica de endotoxinas bacterianas do scFv purificado sem diminuição no rendimento. O produto final foi também confirmado como não pirogénico por testes in vivo em coelhos. A extensão da lixiviação do ligando foi também monitorizada por análises de Cu2+. Os níveis de cobre foram largamente reduzidos após diálise extensa e estão presentes níveis muito baixos no produto final. Não foi detectado ADN (sensibilidade do ensaio = 12 pg) no produto final purificado. A sequenciação proteica dos primeiros 15 aminoácidos do terminal N da proteína mostrou consistência com a sequência de ADN. Isto também confirma que a pel B de comando tenha sido clivada no periplasma. As avaliações de estabilidade 33 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ a 4°C e -70°C, até 6 meses, mostraram um pico em análises por FPLC consistente com o peso molecular do scFv e não mostraram nenhuma evidência de agregação. A retenção de ligação ao antigénio em 6 meses de armazenamento a 4°C é mostrada na Tabela II. Isto indica que foi atingido um valor médio de ligação de 75%.

Tabela II. Actividade específica do MFE-23 His purificado usando IMAC (a-c) e a cromatografia de afinidade para o antigénio CEA (d). As actividades específicas foram baseadas em níveis de anticorpos recuperados, uma vez que ocorreram algumas perdas nos passos de concentração e diálise. A % média de actividade de ligação específica para o material purificado por IMAC (a-c) é 75%.

Anticorpo aplicado à coluna (mg) Não ligado (mg) Ligado (mg) Actividade específica (%) a. 2 0,35 0,76 69 b. 1 0,23 0,68 75 c. 0,5 0,09 0,40 81 d. 1 0,10 0,83 89 MFE-23 His marcado radioactivamente

Quando o produto marcado radioactivamente foi testado quanto à % de incorporação usando análises por TLC, os resultados demonstraram que 95-99% do 125lodo estava ligado ao anticorpo. A retenção de ligação ao antigénio foi avaliada após a marcação radioactiva por medição da ligação ao antigénio. Foi aplicada à coluna CEA uma amostra do lote de MFE-23 His clínico marcado radioactivamente. Do número total de contagens recuperadas (1710 cpm), 435 cpm (25%) foram lavadas na fracção não ligada e 1275 cpm (75%) eluiram na fracção ligada. A fracção não ligada foi subsequentemente aplicada de novo à coluna e foram recuperadas mais 58% das contagens totais carregadas na fracção ligada. Foram também aplicadas à coluna com CEA amostras de MFE-23 myc e B1.8 diluídas e marcadas radioactivamente. Para o MFE-23 myc, 56% (23023 cpm) das contagens totais foram recuperadas (40901 cpm) ligadas à coluna e 17878 cpm (43%) foram lavadas na fracção não ligada. Para o anticorpo de controlo não específico B1.8, só 10% (1301 cpm) das contagens totais recuperadas (12717 cpm) ligadas à coluna e 89% (17878 cpm) estavam contidas 34 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ na fracção não ligada. A estabilidade do produto marcado radioactivamente foi determinada por SDS PAGE e filtração em gel, revelando que era monomérico e estava intacto e não agregado.

Estudos in vivo O 125l-MFE-23 His localizou-se selectivamente no tumor originando uma razão terapêutica tumor para sangue de 22:1. O MFE-23 myc produziu resultados semelhantes com uma razão tumor para sangue de 9:1. A captação de MFE-23 His em tecidos normais foi também comparável à do MFE-23 myc caracterizada previamente, excepto quanto aos níveis elevados no rim, que é a principal via de depuração do anticorpo. (Seguem Referências)

Claims (35)

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    83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 39 LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Câncer Research Campaign Technology Limited (B) RUA: Cambridge House, 6-10 Cambridge Terrace. Regenfs Park (C) CIDADE: London (D) ESTADO: não aplicável (E) PAÍS: Reino Unido (F) CÓDIGO POSTAL(ZIP): NW1 4JL (A) NOME: CHESTER, Kerry Anne (B) RUA: CRC Laboratories, Royal Free Hospital School of Medicine (C) CIDADE: London (D) ESTADO: não aplicável (E) PAÍS: Reino Unido (F) CÓDIGO POSTAL(ZIP): NW3 2PF (A) NOME: HAWKINS, Robert Edward (B) RUA: Department of Clinicai Oncology and MRC Centre, Hills Road (C) CIDADE: Cambridge (D) ESTADO: não aplicável (E) PAÍS: Reino Unido (F) CÓDIGO POSTAL(ZIP): C82 2QH (A) NOME: BEGENT, Richard Henry John (B) RUA: CRC Laboratories, Royal Free Hospital School of Medicine (C) CIDADE: London (D) ESTADO: não aplicável (E) PAÍS: Reino Unido (F) CÓDIGO POSTAL(ZIP): NW3 2PF (ii) TÍTULO DO INVENTO: ANTICORPO TUMORAL (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 (iv) FORMA LEGÍVEL NO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquette (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0. Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 810 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear I 40 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (Β) LOCAL: 1 ..810 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GAG ACA GTC ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG 48 Glu Thr Vai Ile Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu 1 5 10 15 πΑ TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG AAA CTG CAG CAG 96 Leu Leu Leu Ala Ala Gin Pro Ala Met Ala Gin Vai Lys Leu Gin Gin 20 25 30 TCT GGG GCA GAA CTT GTG AGG TCA GGG ACC TCA GTC AAG TTC TCC TGC 144 Ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg Ser Gly Tnr Ser Vai Lys Leu Ser Cys 35 40 45 ACA GCT TCT Guu TTC AAC ATT AAA GAC TCC TAT ATG CAC TGG TTG AGG 192 Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg 50 55 60 CAG GGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA TGG ATT GAT CCT GAG 240 Gin Gly Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu 65 70 75 80 AAT GGT GAT ACT GAA TAT GCC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT TTT 288 Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr Phe 85 90 95 ACT ACA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC CTG CAG CTC AGC AGC CTG 336 Tnr Thr Asp Tnr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu 100 105 110 ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAT TGT AAT GAG GGG ACT CCG ACT 384 Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr 115 120 125 GGG CCG TAC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 432 Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai 130 135 140 TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA 480 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 TCA GAA AAT GTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA 528 Ser Glu Asn Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro 165 170 175 GGG GAG AAG GTC ACC ATA ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC 576 Gly Glu Lys Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr 180 185 190

    83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 41 ATG CAC TGG TTC CAG CAG AAG CCA GGC ACT TCT ccc AAA CTC TGG ATT 624 Het His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile 195 200 205 TAT AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC 672 Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly 210 215 220 AGT GGA TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT 720 Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala 225 230 235 240 GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAA AGG AGT AGT TAC CCA CTC 768 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Ser Tyr Pro Leu 245 250 255 ACG TTC GGT GCT GGC ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG GCG GCC 810 Tnr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala 260 265 270 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 270 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: Glu Tnr Vai Ile Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Gin Pro Ala Met Ala Gin Vai Lys Leu Gin Gin 20 25 30 Ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg Ser Gly Thr Ser Vai Lys Leu Ser Cys 35 40 45 Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg 50 55 60 Gin Gly Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu 65 70 75 80 Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr Phe 85 90 95 Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu 100 105 110 Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr 115 120 125 Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai 42 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 130 135 140 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly H5 150 155 160 Ser Glu Asn Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala IIe Met Ser Ala Ser Pro 165 170 175 Gly Glu Lys Vai Thr IIe Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr 180 185 190 Met His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp IIe 195 200 205 Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Ara Phe Ser Gly 210 215 220 ' Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr IIe Ser Ara Met Glu Ala 225 230 235 " 240 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Ser Tyr Pro Leu 245 250 255 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala 260 265 270 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: TGGTGATGAC ATGCGGCCGC CCGTTTGAT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4: 43 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ TCATCACTAA TAAGAATTCA CTGGCCG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 183 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL:40..177 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5: AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATA ATG AAA TAC CTA TTG Met Lys Tyr Leu Leu 275 CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG ΤΓΑ πΑ CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gin Pro Ala Met 280 285 290 GCC CAG GTG CAG CTG CAG GTC GGC CTC GAG ATC AAA CGG GCG GCC GCA Ala Gin Vai Gin Leu Gin Vai Gly Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala 295 300 305 TGT CAT CAC CAT CAT CAC CAT TAA TAA GAATTC Cys His His His His His His * * 310 315 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15 Ala Gin Pro Ala Met Ala Gin Vai Gin Leu Gin Vai Gly Leu Glu Ile 20 25 30 Lys Arg Ala Ala Ala Cys His His His His His His * * 35 40 45 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 7: 44 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL: 1..24 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 7: CAT CAC CAT CAT CAC CAT TAA TAA 24 His His His His His His * * 50 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: His His His His His His * * 1 5 Lisboa, MM 2000 Por CÂNCER RESEARCH CAMPAIGN TECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

    O ADJUNTO :MG.e ANTÓNIO JOAO )A CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. des Flores, 74 - 4.· ieeo lisbqa

    83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo específico para o antigénio carcinoembrionário (CEA) que tem uma constante de dissociação (Kd) de menos de 5,0 nM para o dito antigénio e cujas seis regiões determinantes de complementaridade (CDR) têm cada uma, respectivamente pelo menos 80% de identidade de sequência relativamente às seis sequências mostradas nos seguintes localizações na SEQ ID N°: 2 Gly 52 a His 61, Trp 76 a Glu 85, Gly 125 a Tyr 135, Ser 185 a His 194, Ser 210 a Ser 216 e Gin 249 a Thr 257. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, cujas seis CDR têm cada uma respectivamente as seis sequências mostradas nas seguintes localizações na SEQ ID N°: 2: Gly 52 a His 61, Trp 76 a Glu 85, Gly 125 a Tyr 135, Ser 185 a His 194, Ser 210 a Ser 216 e Gin 249 a Thr 257. 3. Anticorpo específico para o CEA que tem um Kd de menos de 5,0 nM para o CEA e tem regiões de cadeia pesada variável (VH) e regiões de cadeia leve variável (VL) de sequências idênticas em pelo menos 80% às sequências de Gin 27 a Ser 146 e Glu 162 a Lys 267 da SEQ ID N°:2, respectivamente. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3 tendo uma região de cadeia VH da sequência de Gin 27 a Ser 146 da SEQ ID N°:2 e uma região de cadeia VL da sequência de Glu 162 a Lys 267 da SEQ ID N°:2. 5. Anticorpo específico para o CEA, que tem um Kd de menos de 5,0 nM para o CEA e tem uma região variável (V) de uma sequência idêntica em pelo menos 80% à sequência de Gin 27 a Lys 267 da SEQ ID N°:2. 6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5 tendo uma região V da sequência de Gin 27 a Lys 267 da SEQ ID N°:2. 7. Anticorpo específico para o CEA que tem uma Kd de menos de 5,0 nM para o CEA e tem uma sequência idêntica em pelo menos 80% à sequência da SEQ ID N°:2. 8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência mostrada na SEQ ID N°:2.

    83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 2/4 9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes que se liga ao adenocarcinoma colorrectal humano mas não se liga aos seguintes tecidos normais: fígado, rim, amígdalas, pulmão, cérebro, testículos, ovário, cervix, mama, filmes sanguíneos, placenta, baço, tiróide, esófago, estômago, pâncreas, nódulos linfáticos e músculos esqueléticos. 10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que é um anticorpo de cadeia simples Fv (scFv). 11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que é obtenível de uma biblioteca de bacteriófagos. 12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes possuindo um agente antitumoral ou uma marca detectável a ele ligada. 13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, possuindo um resíduo Cys livre nos ou perto dos terminais N ou C. 14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, em que 99mTc está ligado ao dito resíduo Cys. 15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 possuindo uma marca de His de pelo menos três resíduos His consecutivos nos ou perto dos terminais N ou C. 16. Anticorpo de acordo com á reivindicação 12 em que o agente antitumoral é uma enzima que activa uma prodroga ou é um citóquina. 17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16 em que a dita enzima que activa uma prodroga é a carboxipeptidase bacteriana G2 (CPG2). 18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16 em que a dita citóquina é o factor alfa de necrose tumoral (TNF-a). 19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16 em que a dita citóquina é a interleucina-2 (IL-2). 20. Anticorpo biespecífico que compreende duas regiões variáveis, uma

    83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 3/4 das quais é a região variável de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19. 21. Molécula de ADN codificando um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 15 a 19. 22. Vector de expressão replicável compreendendo uma molécula de ADN tal como reivindicada na reivindicação 21. 23. Célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector de acordo com a reivindicação 22. 24. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 23 que é uma célula bacteriana. 25. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24 que é uma célula de Escheríchia coli. 26. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 23 que é uma célula de mamífero. 27. Processo para a produção de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 15 a 20, processo que compreende: (i) cultura de uma célula hospedeira como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 23 a 26 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e (ii) recuperação do anticorpo a partir da cultura. 28. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 20 para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia ou cirurgia, ou num método de diagnóstico praticado no corpo humano ou animal. 29. Anticorpo de acordo com a reivindicação 28 para utilização em tratamento por cirurgia ou terapia de um tumor colorrectal, ou em diagnóstico de um tumor colorrectal. 30. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. 83 853 ΕΡ Ο 733 072/ΡΤ 4/4 31. Método para obtenção de um anticorpo scFv de acordo com a reivindicação 10, método que compreende (i) selecção de um bacteriófago de uma biblioteca de bacteriófagos que expresse o dito anticorpo, (ii) infecção de uma célula bacteriana hospedeira com o bacteriófago seleccionado, (iii) cultura de uma célula hospedeira sob condições tais que o dito anticorpo seja expresso, e (iv) recuperação do dito anticorpo da cultura. 32. Método de acordo com a reivindicação 31 em que a biblioteca de bacteriófagos é feita por (a) imunização de um animal com CEA, (b) obtenção de linfócitos do animal, (c) preparação de ADNc que codificam regiões VH e VL do anticorpo a partir do ARNm dos linfócitos, (d) junção das regiões de codificação de VH e VL por uma sequência de codificação de um ligante, e (f) inserção das regiões juntas no bacteriófago. 33. Método para purificação de um anticorpo compreendendo uma marca de His de acordo com a reivindicação 15, de um líquido biológico, método que compreende (i) contacto de um suporte sólido contendo iões metálicos com o líquido biológico sob condições tais que o anticorpo se liga ao suporte, (ii) remoção do líquido biológico que não está ligado ao suporte, e (iii) recuperação do anticorpo do suporte. 34. Método de acordo com a reivindicação 33 em que os iões metálicos são iões Cu2+.
35. 35. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34 em que o suporte sólido é a matriz de uma coluna de cromatografia de afinidade. Lisboa, & WAt 2000 Por CÂNCER RESEARCH CAMPAIGN TECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

    O ADJUSTO

    Re· ,· ANTÔNIO CUNHA FERREIRA A§. Of. Pr. Ind. das Flores, 74-4.· ie@o LISBOA