NO173874B - Konjugat til bruk ved fremstilling av spormerkede konjugater, bestaaende av et maalsoekende, biologisk aktivt molekyl og en forbindelse inneholdende et ikke-radioaktivt metall - Google Patents

Abstract

Konjugat av (i) et målsøkende biologisk aktivt molekyl valgt blant antistoffer, fragmenter av antistoffer, hormoner, peptider, proteiner og droger som binder seg til reseptorer og lokaliserer seg i visse organer, vev og celler i legemet hos mennesker og pattedyr og (ii) en forbindelse inneholdende et metall. Forbindelsen inneholdende et metall er et metallothionein eller metallothioneinfragment, og alt metall i metallothioneinet eller fragmentet er ikke-radioaktivt og har mindre affinitet til metallothionein enn kationene i gruppen bestående av Tc, Ag,. Au, Hg og Cu(II). Konjugatet er anvendelig som mellomprodukt for fremstilling av tilsvarende konjugater inneholdende spormerkende metall.

Description

Denne oppfinnelse angår et nytt konjugat av et mål-søkende, biologisk aktivt molekyl og en forbindelse inneholdende ikke-radioaktivt metall, hvilket konjugat er anvendelig for fremstilling av tilsvarende konjugater inneholdende spormerkende metall.

De spormerkede konjugater for hvis fremstilling konjugatet ifølge oppfinnelsen skal anvendes, er gjenstand for norsk patent nr. 166.267, gitt på basis av patentsøknad nr. 844017, fra hvilken den foreliggende patentsøknad er avdelt.

Konjugatet ifølge patent nr. 166.267 er et konjugat av (i) et målsøkende, biologisk aktivt molekyl valgt blant antistoffer, fragmenter av antistoffer, peptider og proteiner som binder seg til reseptorer og lokaliserer seg i visse organer, vev og celler i legemet hos mennesker og pattedyr og (ii) en forbindelse inneholdende spormerkende metall, hvilken forbindelse er et metallothionein eller metallothioneinfragment hvor i det minste en del av metallet utgjøres av et spormerkende metall som har tilstrekkelig affinitet til thioneinet eller thioneinfragmentet til å bindes til dette.

Konjugatet ifølge norsk patent nr. 166.267 er anvendelig ved diagnostisering av sykdomstilstander hos mennesker og pattedyr. Det vises til norsk patentskrift nr. 166.267 for en nærmere redegjørelse for dette konjugat og dets anvendelse for medisinske formål.

Det nye konjugat ifølge den foreliggende oppfinnelse er et konjugat til bruk ved fremstilling av et spormerket konjugat som ovenfor angitt og består av (i) et målsøkende, biologisk aktivt molekyl valgt blant antistoffer, fragmenter av antistoffer, peptider og proteiner som binder seg til reseptorer og lokaliserer seg i visse organer, vev og celler i legemet hos mennesker og pattedyr og (ii) en forbindelse inneholdende et metall. Konjugatet er karakteristisk ved at forbindelsen inneholdende et metall er et metallthionein eller metallothioneinfragment, og at alt metall i metallothioneinet eller fragmentet

(a) er ikke-radioaktivt og

(b) har mindre affinitet til metallothionein enn kationene i gruppen bestående av Tc, Ag, Au, Hg og Cu(II).

Som ikke-radioaktivt metall foretrekkes det å anvende sink, Zn.

Metallothioneiner er beskrevet i Metallothioneins: Proceedings of the First International Meeting on Metallothionein and Other Low Molecular Weight Metal-Binding Proteins, Zurich, Juli 17-22, 1978, redigert av Kagi og Nordberg, Birkhauser Verlag Basel, 1979 (heretter "Kagi og Nordberg"), s. 46-92. Et sammendrag er gitt nedenfor. Metallothionein ble oppdaget i 1957. Det kadmium- og sinkholdige protein ble isolert fra hestenyrer. Praktisk talt det samme protein ble senere funnet hos kaniner, mennesker, aper, kveg, sauer, griser, hunder, hamstere, rotter, mus og seler. Metallothionein fra hest ble angitt å ha: en molekyl vekt på 6000-7000, et høyt metallinnhold, et høyt cysteininnhold, intet innhold av aromatisk aminosyre, optiske egenskaper som for metallthiolater (mercaptider) og en fast fordeling av cysteinylrester. Det var enighet på plenumsmøte i det ovenfor omtalte First International Meeting on Metallothioneins om at proteiner som ligner på renalt metallothionein fra hest med hensyn til flere av disse trekk, kan betegnes som "metallothionein" (Kagi og Nordberg, s. 48), og slik benyttes beteg-nelsen i denne beskrivelse. Selvfølgelig er også metallo-thioneinfragmenter nyttige ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse, og likeledes funksjonelt likeartede polypeptider med minst seks aminosyrerester.

Generelt sett er metallothioneiner lavmolekylære proteiner som produseres in vivo, og som chelaterer et bredt utvalg av metallioner med høy affinitet. Metallothioneinenes fysiologiske funksjon er ikke helt klarlagt, men det er ålment akseptert at de utøver en funksjon ved homeostasen av viktige metaller og ved detoksifiering av tungmetaller. Metallothioneiner finnes hos alle høyere hvirveldyr, hvirvelløse dyr og eukaryotiske og prokaryotiske mikroorganismer. Mange orga-nismer vil, når de utsettes for metallioner, for eksempel ioner av Cd, Hg, Zn. eller Cu, igangsette hurtig ny syntese av metallothioneiner gjennom øket produksjon av mRNA for apo-proteinthionein. Derfor er også molekyler, som f.eks. cadystin, som produseres av visse mikroorganismer i respons til Cd-injeksjon, også aktuelle for anvendelse i henhold til oppfinnelsen.

Alle thioneiner fra pattedyr inneholder 60-61 aminosyrerester og kan binde 7 atomer toverdig metallion eller inntil 10 atomer énverdig metallion pr. molekyl. Thioneiner inneholder ingen aromatiske rester eller histidinrester, og 20 av aminosyrerestene i thioneiner fra pattedyr er cysteiner. Spektroskopiske undersøkelser viser at thioneins metall-tilbinding skjer nesten utelukkende gjennom cysteinenes sulf-hydrylgrupper.

Fordi sulfhydrylgruppene i metallothioneiner er bundet til metallioner, er de vanligvis ikke tilgjengelige for å tjene som funksjonelle grupper for tilbinding til BAM-er, men andre grupper, som f.eks. -NH2'~0H °9 -C00H er tilgjengelige, og metallothioneinene kan således bindes kovalent til BAM-er under anvendelse av reagenser og metoder hvor slike grupper benyttes, slik dette vil bli redegjort for mer detaljert nedenfor.

Komplette aminosyresekvenser for flere metallothioneiner er blitt bestemt. De er angitt på side 60 i Kagi og Nordberg, og utvalgte slike sekvenser gjengis her:

En-bokstavsymboler: A = Alanin

C = Cystein

D = Aspartinsyre

E = Glutaminsyre

G = Glycin

I = Isoleucin

K = Lysin

L = Leucin

M = Methionin

N = Asparagin

P = Prolin

Q = Glutamin

R = Arginin

S = Serin

T = Threonin

V = Valin

Andre symboler: Ac = Acetyl

H = Fri amino-endegruppe

OH = Fri carboxyl-endegruppe

Det vil sees at cysteinrestene er fordelt langs kjeden, og at det forekommer et antall rester -C-X-C-, hvor X betegner en aminosyre som er forskjellig fra cystein. Tabellen innbefatter et metallothionein fra Neurospora crassa med meget lavere molekylvekt enn metallothioneinene fra pattedyr. Som angitt på side 55 i Kagi og Nordberg er høymolekylære metallothioneiner (9 500-10 000) blitt isolert fra andre mikroorganismer. Alle disse metallothioneiner faller innenfor opp-finnelsens ramme, skjønt metallothioneiner fra pattedyr foretrekkes. For diagnostiske og terapeutiske formål in vivo foretrekkes det spesielt å anvende et metallothionein fra samme art som pattedyret som behandles.

Metallbindende fragmenter av thionein, for eksempel de som beskrives i Yoshida et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 76:486-490 og i Kondo et al., Tetrahedron Letters, 24:925-928, som begge innlemmes heri ved henvisning, kan også benyttes i henhold til oppfinnelsen. Fragmentene av thionein fra mus, som er blitt syntetisert av Yoshida et al., har de følgende aminosyresekvenser, hvor bokstavsymbolene har de samme betydninger som i den ovenstående tabell 1.

Metallbundne fragmenter av thioneiner (dvs. metallo-thioneinf ragmenter ) , som f.eks. dem som er blitt syntetisert av Yoshida et al., egner seg for anvendelse i henhold til oppfinnelsen, skjønt fullstendige metallothioneiner for tiden foretrekkes.

Det vil selvfølgelig være åpenbart for en fagmann på området at polypeptider med tilsvarende funksjonelle egenskaper som metallothionein, og likeledes copolymerer av raetallothionein/metallothioneinfragmenter og konvensjonelle monomerer, fremstilt under anvendelse av konvensjonelle synteseteknikker, også kan anvendes ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse, såfremt de oppviser de generelle karakteristika for metallothionein som det er redegjort for i detalj ovenfor.

Metallothioneinet inneholdende ikke-radioaktivt metall kan fremstilles som beskrevet av M. Vasak og J. Kagi,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:6709 (1981). Vanligvis oppløses thionein fra pattedyr ved pH 2, og eventuelt uoppløselig mate-riale fjernes ved filtrering. Til denne oppløsning av thionein settes metallkationet. Konsentrasjonen av metallkation må være tilstrekkelig til å sikre at det blir tilgjengelig minst 7 toverdige eller 10 énverdige metallkationer pr. thionein, eller egnede kombinasjoner av toverdige og énverdige kationer til å fylle opp alle metallbindende punkter på metallothioneinet. På grunn av thioneinets unike egenskaper kan det fremstilles metallothioneiner som inneholder mer enn ett metallkation. Da det derfor er mulig at alle thioneinets metallbindende punkter kan opptas av metall, kan det fremstilles metallothioneiner av meget høy konsentrasjon. Etter tilsetningen av metallkation blir den resulterende oppløsning grundig avgasset for å fjerne oxygen og nøytralisert i en inert atmosfære, inntil pH-verdien er høyere enn 7,0. Under denne nøytralisering folder thioneinet seg rundt metallkationene. Metallothioneinet kan så renses etter konvensjonelle metoder, som f.eks. ved dialyse, separasjon etter størrelse eller ionevekslingskroma-tografi. Innholdet av ikke-radioaktivt metall på det radiomerkede metallothionein kan bestemmes ved atomabsorpsjon.

Det rensede metallothionein kan så kobles direkte til et BAM under anvendelse av bifunksjonelle koblings- eller tverrbindingsmidler som beskrevet nedenfor.

Bindingen av målsøkende biologisk aktive molekyler (BAM-er) til metallothioneiner krever binding av metallothioneinenes tilgjengelige grupper -SH, -NH2,

-NHC( =NH)NH2, -C02H eller -0H til komplementære funk-

sjonelle grupper på BAM-et. Dersom BAM-et er et monoklo-

nalt antistoff eller et annet glycoprotein, vil det inneholde de samme funksjonelle grupper som metallothionein,

dvs. -SH, -NH2, -C02H og -NHC(=NH)NH2. Når man har å

gjøre med mindre forbindelser som ikke inneholder slike grupper, kan én av disse grupper innlemmes syntetisk i det lille molekyl, slik at binding til metallothioneinet kan finne sted. For en generell redegjørelse for slike syntetiske modifiseringer vises det til Means og Feeney, "Chemical Modi-fication of Proteins", Holden-Day, Inc. (1971). Deretter kan metallothioneinet og BAM-et sammenbindes direkte, under anvendelse av egnede reagenser og metoder. Vanligvis vil det både for binding av proteiner til metallothionein og for modifisering av metallothioneiner eller proteiner før disse inngår binding, være nødvendig å benytte milde betingelser for å unngå denaturering av metallothioneinet og BAM-et og tap av biologisk aktivitet. Reaksjonsblandingens pH-verdi bør være i området fra 3 til 11, fortrinnsvis i området fra 5 til 9, mens temperaturen bør være i området fra 0 til 60°C og konsentra-sjonene av henholdsvis BAM-et og metallothioneinet i området fra 10"^ til 10"^ M, fortrinnsvis ca. 10~<4> M. Det foretrukne oppløsningsmiddel er vanligvis vann, skjønt varierende mengder oppløsningsmidler som f.eks. dimethylsulfoxyd kan tilsettes

for å oppløse ikke-polare tilbindingsmidler. For tilbinding av ikke-protein-BAM-er til metallothioneiner kan noe strengere betingelser tolereres av metallothioneinet, og reaksjonene kan utføres i organiske oppløsningsmidler, som f.eks. dimethylsulfoxyd.

Dersom metallothioneinet og BAM-et ikke inneholder komplementære grupper som inngår binding, vil det være mulig, istedenfor å modifisere metallothioneinet og/eller BAM-et syntetisk, å benytte tverrbindingsmidler for å oppnå den ønskede binding. Tverrbindingsmidlet må inneholde to i kjemisk henseende forlikelige reaktive grupper X og Y som danner ko-valente bindinger med funksjonelle grupper på metallothioneinet og BAM-et, og som er forbundet med en alkyl- og/eller aryl-kjede. Tverrbindingsmidlet har således formelen X-Cn-Y hvor Cn er alkyl eller aryl. De reaktive grupper X og Y må være forlikelige i kjemisk henseende, det vil si de må ikke reagere med hverandre under dannelse av polymerer. Da metallothionein og de fleste BAM-er inneholder grupper -NH2, -SH og -0H, vil foretrukne grupper for X og Y blant annet være alkylerende og acylerende grupper. De foretrukne alkylerende grupper for X og Y er halogensyrer, halogenestere eller halogenamider, aryl-halogenider og maleimider. Tverrbinding under reduktiv alkylering av -NH2 grupper på metallothionein og BAM-et foretrekkes likeledes. Tverrbindingsmidler som f.eks. glutaraldehyd hvor X og Y er aldehyder og n = 3, har vist seg å være anvendelige for å binde de angjeldende metallothioneiner til monoklonale antistoffer ved reduktiv alkylering av slike -NH2 grupper. Foretrukne acyleringsmidler for X og Y innbefatter aktiverte carboxylfunksjonaliteter, som f.eks. klorider og anhydrider, imidoestere, thiolestere og N-hydroxysuccinimidestere. Vanligvis foretrekkes det å acylere aminer fremfor hydroxylgrupper, da amider er kjent for å være mer stabile in vivo enn estere.

De foretrukne grupper for X og Y ved dannelse av ko-valente bindinger med grupper -NHC(=NH)NH2 inkluderer 1,2- og 1,3-dicarbonylforbindelser, som f.eks. malondialdehyd, cyclo-hexan-1,2-dion og camforkinon. Reaksjonen mellom argininrester og disse reagenser er meget selektiv og er reversibel.

Den foretrukne gruppe for X og Y ved anvendelse av carboxygrupper på metallothioneinet og BAM-et for tverrbinding er aminogruppen. Når carboxylgruppen på metallothioneinet eller BAM-et aktiveres med et vannoppløselig carbodiimid, som f. eks. l-cyclohexyl-3- (2-morfolinyl-4-ethyl)-carbodiimid eller l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid, vil den aktiverte carboxylsyre reagere med X og/eller Y = -NH2 i et tverr-bindingsmiddel under dannelse av en amidbinding. Omsetning av slike carboxylgrupper på metallothionein og BAM-er med tverrbindingsmidler som inneholder aminogrupper, utgjør en fore-trukken metode for binding av metallothionein til BAM-er.

Vanligvis kan carbonkjeden som skiller X og Y fra hverandre, være enten alkyl eller aryl med n = 1-12. Valget av kjedelengde varierer med arten av det BAM som skal bindes. For store BAM-er kan det være nødvendig med en lengre kjede for å oppnå optimal dannelse av en kovalent binding mellom tverrbindingsmidlet bundet til metallothioneinet og de angjeldende funksjonelle grupper på det store protein. Ved anvendelse av små BAM-er kan det være nødvendig med en meget lang carbon-kjede for å tillate BAM-et som er bundet til metallothioneinet, å reagere med sin celleoverflatereseptor. Kjedelengden kan således varieres enten for å optimalisere tverrbindings-prosessen eller for å maksimere bibeholdelsen av biologisk aktivitet av metallothionein-BAM-konjugatet.

Enkelte kommersielt tilgjengelige tverrbindingsmidler foretrekkes for binding av metallothioneiner til monoklonale antistoffer. Eksempler på foretrukne tverrbindingsmidler er glutaraldehyd, N-( 2-klorethyl )-maleimid, disuccinimidyltarta-rat, succinimidyl-4-p-maleimidof enyl)-butyrat, 2-iminothiolan og dimethyladipimidat.

For fremstilling av et spormerket konjugat ifølge norsk patent nr. 166.267 fra et konjugat ifølge den foreliggende oppfinnelse foretas en utveksling av samtlige eller en del av metallothioneinets ikke-spormerkende metallkationer med et spormerkende metallkation. For at denne utvekslingsreaksjon skal forløpe på tilfredsstillende måte kreves det at det spormerkende kation har høyere affinitet til metallothioneinets mercaptider enn det ikke-spormerkende kation i det forhånds-fremstilte metallothionein.

Ved anvendelse for eksempel av radionuklider som det spormerkende metall har sink-kationer lavere affinitet til metallothioneinets mercaptider enn kationer av technetium, kvikksølv eller sølv. I nærvær av kationer av technetium-99m, kvikksølv-197 eller sølv-111 vil Zn( II)-kationer av Zn-metal-» lothionein (MTh) lett fortrenges, slik at det fås henholdsvis Zn/<99m>Tc-MTh, Zn/<197>Hg-MTh eller Zn/<in>Ag-MTh. Da således Zn-MTh lett lar seg fremstille etter den ovenfor omtalte frem-gangsmåte ifølge Vasak et al., kan utvekslingsmerking av Zn-MTh eller et konjugat av Zn-MTh-BAM foretas ved å blande Zn-MTh eller Zn-MTh-BAM-konjugat med et oppløselig utvekselbart radionuklid, for eksempel <99m>Tc-glucoheptonat, <197>HgCl2 eller <111>Ag(NH3)2<+>. Etter utvekslingen kan det radiomerkede metallothionein renses etter konvensjonelle metoder, som f.eks. ved dialyse, separasjon etter størrelse eller ionevekslingskroma-tografi. Utbyttet som oppnås ved utvekslingsmerking, kan bestemmes ved telling av den radioaktive spaltning og represen-terer den prosentandel av den totale radioaktivitet som er innlemmet i metallothioneinet. Kobolt (II)-, nikkel (II)- og sink( II)-kationer danner metallothioneiner som kan anvendes ved fremgangsmåten ved utvekslingsmerking. Imidlertid er sink (II)-kationer de foretrukne ikke-radioaktive kationer for slik utvekslingsmerking. Fremgangsmåten ved utvekslingsmerking er særlig anvendelig når det benyttes radionuklider med halveringstid kortere enn 24 timer, fordi denne utvekslingsmerking kan utføres på det kliniske sted. Som videre redegjort for nedenfor gjør utvekslingsmerking av et Zn-MTh-BAM-konjugat med kortlivede radionuklider det mulig å innføre radionuklider umiddelbart før bruk, hvorved man unngår det uunngåelige tap av radioaktivitet ved spaltning.

Blant de aktuelle radionuklider er 99mTc mest å fore-trekke ved utvekslingsmerking på grunn av dets relativt korte halveringstid, fordi det lett fås fra Mo-99/Tc-99m-dannere og fordi dette radionuklid har ønskelige fysikalske egenskaper. Andre foretrukne radionuklider er Ag-111, Au-198 og Hg-197.

For en nærmere beskrivelse av fremstillingen av de spormerkede konjugater ifølge norsk patent nr. 166.267 vises det til patentskriftet.

Nedenfor illustreres fremstillingen av to konjugater ifølge oppfinnelsen og fremstillingen av et spormerket konjugat ifølge norsk patent nr. 166.267 fra konjugatet ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av et Zn- metallothionein/ anti- THY- 1, l- konjugat.

a) Fremstilling av Zn-metallothionein.

Zn-metallothionein ble fremstilt etter metoden ifølge

M. Vasak og J. Kagi, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:6709

(1981) under anvendelse av ikke-radioaktivt ZnS04.7H20 og dialysert under anvendelse av "Spectra Por 6" dialyserør (skille ved molekylvekt 2000) fra Spectrum Medical Instruments, Inc., Los Angeles. Calif., mot 0,01 M fosfatbuffer (pH 6,5). b) Fremstilling av Zn-metallothionein/anti-THY-1,l-konjugat.

Til Zn-metallothionein (1,0 mg/ml; 10"<4>M) i 0,01 M

fosfatbuffer (pH 7,0) ble det tilsatt glutaraldehyd (1 mg; sluttkonsentrasjon 10"<2>M). Etter én time ved romtemperatur ble det uomsatte glutaraldehyd fjernet ved dialyse ("Spectra/Por 6" (2000 MWCO) i seks timer mot 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,0). Til 0,5 ml av dette glutaraldehyd-behandlede metallothionein (10"<4>M) ble det satt 1 mg av det monoklonale antistoff (MAb)-anti-THY-1,1 i 0,5 ml 0,2 M bicarbonatbuffer (pH 9,5). Reaksjonen mellom det tilsatte anti-THY-1,1 og det glutaraldehyd-behandlede Zn-metallothionein fikk pågå ved 4°C ved pH 9,3 i 18 timer, hvoretter 0,1 ml av en oppløsning av 0,5 M

tris/0,1 M NaBH4 ble tilsatt. Etter reduksjon i én time ved romtemperatur ble Zn-metallothionein/anti-THY-1,1-konjugatet dialysert i 24 timer ("Spectra/Por 6" (50.000 MWCO)) mot 0,1 M fosfatbuffer (pH 6,8) for å fjerne uomsatt natriumborhydrid og glutaraldehyd-behandlet Zn-metallothionein.

Eksempel 2

Fremstilling av Zn- metallothionein/ antihuman- brystkreft B6. 2.

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel lb) for fremstilling av Zn-metallothionein/anti-THY-1,1 ble fulgt, idet det ble benyttet 0,6 mg Zn-MT (5 x 10"<5> M), 1 mg glutaraldehyd og 3 mg anti-human-brystkreft B6.2. Det ble så foretatt dialyse av Zn-MT/B6.2 mot 0,01 M fosfatbuffer inneholdende 0,15 M NaCl

(pH 8,0) i seks timer og deretter mot 0,01 M fosfatbuffer inneholdende 0,15 M NaCl (pH 7,0) i 18 timer ("Spectra/Por 6"

(50.000 MWCO)).

Eksempel 3

Fremstilling av Zn- metallothionein/ antihuman- brystkreft- B6. 2- F ( ab' )2.

En oppløsning av 60 ug pepsin fra Sigma Chemical Com-pany, St. Louis, Missouri og 3 mg anti-menneskebrystkreft-B6.2 i 3 ml 0,1 M natriumacetatbuffer (pH 4,0) ble inkubert natten over ved 37<8>C. De dannede proteolyttiske fragmenter ble skilt fra B6.2-F(ab')2 ved dialyse ved 4°C (Spectra/Por 6 (50.000 MWCO)) mot 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 0,15 M natriumklorid. B6.2-F(ab')2 ble analysert ved størrel-sesekskluderende høytrykks væskekromatografi under anvendelse av en "BioRad" TSK-250 søyle og ved eluering med 0,1 M nat-riumfosf atbuf fer (pH 7,0) ved 1,0 ml/min og ikke-reduserende SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese. Etter en andre dialyse for å bringe B6.2-F (ab')2 i 0,2 M carbonat/bicarbonatbuffer (pH 9,5) ble bindingen til Zn-MT fullført som beskrevet for B6.2 i eksempel 2 under anvendelse av 0,6 mg Zn-MT og 1 mg glutaraldehyd.

Claims (2)

1. Konjugat til bruk ved fremstilling av et spormerket konjugat, bestående av (i) et målsøkende, biologisk aktivt molekyl valgt blant antistoffer, fragmenter av antistoffer, peptider og proteiner som binder seg til reseptorer og lokaliserer seg i visse organer, vev og celler i legemet hos mennesker og pattedyr og (ii) en forbindelse inneholdende et metall, karakterisert ved at forbindelsen inneholdende et metall er et metallothionein eller metallothioneinfragment, og at alt metall i metallothioneinet eller fragmentet (a) er ikke-radioaktivt og (b) har mindre affinitet til metallothionein enn kationene i gruppen bestående av Tc, Ag, Au, Hg og Cu(II).

2. Konjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at det ikke-radioaktive metall er Zn.