JPH09507488A

JPH09507488A - 新規なポリアミノカルボキシレートキレート化剤

Info

Publication number: JPH09507488A
Application number: JP7518569A
Authority: JP
Inventors: サブラメイニアン，ラマスワミイ; コロニイ，ジエイムズ
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1994-01-07
Filing date: 1995-01-05
Publication date: 1997-07-29
Also published as: FI962772A; CA2180662A1; AU1597595A; EP0738283A1; KR970700698A; EP0738283A4; AU692224B2; FI962772A0; WO1995018832A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、金属イオンをポリペプチド分子に結合するのに適した一連の新規なポリアミノ−カルボキシレートキレート化剤を記載する。新規なキレート化剤を用いて製造したポリペプチド−ポリアミノカルボキシレート接合体は、金属イオンと安定な複合体を形成する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なポリアミノカルボキシレートキレート化剤本発明は、金属イオンを、ペプチドやタンパク質（例えばアルブミン、トランスフェリン、抗体及び抗体断片）に結合するための新規なキレート化剤に関する。発明の背景金属イオンをタンパク質に結合すると、数種の有用な生成物が得られる。これらには、蛍光、放射性及び常磁性金属イオンに結合して、生物系のｉｎｖｉｖｏプローブや、ラジオイムノアッセイのような分析系のｉｎｖｉｔｒｏプローブとして使用できるタンパク質が含まれる。例えば、腫瘍関連抗原を認識するモノクローナル抗体に放射性核種を結合すると、癌の診断や治療に有用な放射性免疫接合体が得られる。モノクローナル抗体は、ｉｎｖｉｖｏで特異部位に対する所望物質のキャリヤーとして使用される。ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び大環状物質のようにタンパク質に結合すると安定な複合体を形成すると報告されたキレート化剤もある。しかしながら、放射性免疫接合体又はキレート化合物は生理学的条件下では動力学的に不安定なので、これらの複合体は分解する。結合方法やキレート化合物の構造等を変えようと何度か試みられたが、このような放射性免疫接合体をｉｎｖｉｖｏ投与すると、非標的組織、特に肝臓に放射能が蓄積した。従って、明らかに、患者に投与したときに解離しない複合体を形成するように放射性金属を抗体に結合する新規なキレート化剤が必要となる。金属イオンをタンパク質に結合するための新規な１組のキレート化剤を提供し、それによりｉｎｖｉｖｏで安定な抗体−キレート化合物接合体を含む水溶液を提供することが本発明の目的である。種々の金属イオン（例えばＩｎ、Ｙ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｅｕ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｓｍ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｒｅ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｔｃ、Ｆｅ、Ｐｂ、Ｂａ、Ｌｕ、並びに他のアクチニド、ランタニド及び遷移金属イオン）と結合する１組のキレート化剤を提供することが本発明の別の目的である。金属イオンをタンパク質（例えばモノクローナル抗体）に結合するのに有用な新規なキレート化構造体を合成することが本発明の別の目的である。低分子量タンパク質（例えばアルブミン及びＩｇＧ）だけでなく、高分子量タンパク質（例えばＩｇＭ（９×１０⁵）及びリポタンパク質（２×１０⁶））との結合にも適した多目的なキレート化剤を得ることが本発明の他の目的である。金属キレート化合物に接合した抗体を製造するための改良された方法を得ることが本発明の更に別の目的である。本発明の更なる目的は、接合タンパク質の生物活性をそれほど損なわずに、抗体分子当たりの金属イオン濃度を高くするキレート化構造体を得ることである。蛍光／発光金属イオンをタンパク質−キレート化合物接合体に結合することによって蛍光標識タンパク質を得ることが本発明の更に別の目的である。クロマトグラフィーカラム材料（例えばポリマー及びゲル）に結合して、キレート化合物親和性カラムを形成し得る金属イオン結合試薬を得ることが本発明の別の目的である。上記目的及び他の目的は本発明の一つ以上の実施態様によって達成されよう。図面の簡単な説明図１はポリアミンの構造を示す。図２は、ＬｉＬｏ２’の構造を示す。図３はＨＥＴＡ２の構造を提供する。図４は、ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２’の製造に使用される合成法を示す。図５は、ヒト血清でのＹ（９０）標識１６．８８−ＬｉＬｏ２’の安定性を示す。この図では、インキュベーション時間（３７℃）を１６．８８−ＬｉＬｏに結合したＹ（９０）のパーセンテージに対してプロットする。表１は、過剰ＤＴＰＡ（インジウム−１１１．ＭｏＡｂ：ＤＴＰＡ＝１：＞５０００）の存在下及び１％ＨＳＡ溶液を含むリン酸緩衝食塩水中に３７℃で１６．８８−ＬｉＬｏ２’に結合したインジウム（１１１）のパーセンテージをインキュベーション時間の関数として示す。表２は、数種の溶液：過剰ＤＴＰＡ（インジウム−１１１．ＭｏＡｂ：ＤＴＰＡ＝１：＞５０００）の存在下、正常ヒト血清中及び１％ＨＳＡ溶液を含むリン酸緩衝食塩水中での３７℃での８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２．Ｉｎ（１１１）の安定性を示す。発明の要約本発明は、新規なポリアザ大環状試薬及びポリアミノカルボキシレートに関する。ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２’は、金属をタンパク質に結合するのに適した２種のポリアミノカルボキシレート型キレート化剤である。特に、これらの化合物は、放射性金属（例えばインジウム−１１１、イットリウム−９０、テクネチウム−９９ｍ、レニウム−１８６、レニウム−１８８、銅− ６４、銅−６７、ルテニウム−９３、ロジウム、ガロジニウム、サマリウム−１５３、ビスマス−２１２、鉛−２１３及びアクチニウム−２２５）をタンパク質（例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びこれから誘導される断片、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成ポリマー並びにコポリマー）に結合するのに有用である。好ましい実施態様の説明ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡのようなポリアミノカルボキシレートは、金属イオン（例えば銅、テクネチウム、インジウム及びイットリウム）を結合するためのキレート化剤として使用されている。ＴＥＴＡのような大環状試薬（例えばＭｅａｒｅｓ等、米国特許第４，６７８，６６７号、１９８７年７月７日を参照されたい）が医薬用途でのｉｎｖｉｖｏ使用に適した安定な放射性免疫診断用及び治療用試薬を生成することも知見されている。本発明者らは、ポリアミノカルボキシレート枝が窒素に結合しており、金属をキレート化すると安定な構造が得られると考えられる新規なキレート化剤を発見した。本発明は、新規なポリアザ大環状試薬及びポリアミノカルボキシレートを包含する。本発明の新規化合物は、金属をアミノ酸配列に結合するのに有用である。これらの化合物の好ましい用途は、ｉｎｖｉｖｏ免疫診断又は放射性免疫治療のための放射性金属で標識した抗体又は抗体断片の製造である。他の用途、例えばカラム精製は当業者には公知である。本発明の目的のために、「金属」とは、放射性金属、非放射性金属、金属錯体、及び結合のために金属イオンにさらされる化合物を指す。キレート化剤の反対側はアミノ酸配列（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質又は類似化合物であり得る）に結合する。唯一の限定事項は、−ＮＣＳ−基又は他の適切な反応性部分に結合することである。本発明の目的のために、「ポリペプチド」という用語はこれら全ての化合物を包含するために使用する。好ましい「ポリペプチド」は抗体又は断片である。本発明のポリアザ大環状化合物及びポリアミノカルボキシレートは、図１に示す一般式で表されるポリアミンを誘導体化することによって製造され得る。ポリアミン中間体化合物は、（ｐ−ニトロフェニル）エチルアミンのような出発材料から製造され得る。ブロモエチルアセテート又は同等試薬を用いてこれらの第一級アミンをカルボキシメチル化すると、カルボキシメチル化アミン誘導体が得られ、この誘導体は第一級アミンに変換することができる。Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，３，２４８−２５５（１９９２）に記載の方法と同様の方法を用いて、これらの化合物をジエチレントリアミンペンタ酢酸二無水物で縮合する。この反応経路により、ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２’のような二官能キレート化剤が得られる。上述のポリアミン構造(図１)中のメチレン主鎖の炭素数を変える（ｌ、ｑ、ｍ、ｎを変える）と、本発明の種々の二官能キレート化剤を合成することができる。実施例：Ｉ（ジエステルアミン）の合成：１５ｇの４−ニトロベンジル−エチルアミン塩酸塩、２１ｍｌのエチルブロモ酢酸塩及び２６ｇの炭酸カリウムを２００ｍｌのアセトニトリル中に合わせ、強く攪拌しながら還流加熱した。連続攪拌しながら一晩反応混合物を還流させた。次いで、反応混合物を室温に冷却し、次いで濾過し、酢酸エチルを添加しながら回転蒸発させた。生成物をシリカゲルカラム（塩化メチレン中０．２％メタノール）に通した。純粋画分を合わせ、回転蒸発させた。収量１６．５ｇ。ＩＲ（ＫＢｒペレット）：１７４２．９ｃｍ^-1，１６００．２ｃｍ^-1 ，１５１９．５ｃｍ^-1，１３４６．３ｃｍ^-1，１１８９．８ｃｍ^-1，１０３０．４ｃｍ^-1。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３（ｔ，６Ｈ），３（ｓ，４Ｈ），３．６（ｓ，４Ｈ），４．３（ｑ，４Ｈ），７．５（ｄ，２Ｈ），８．３（ｄ，２Ｈ）。Ｒｆ，０．６１（塩化メチレン中０．１％メタノール）。 II（ジエステルアミド）の合成：１４．３ｇのジステルアミン（Ｉ）を５００ｍｌのメタノールに溶解し、氷浴中に冷却した。飽和点までアンモニアガスを溶液中にバブリングし、この溶液を３０分間氷中冷却し、アンモニアガスを再度飽和点まで溶液中にバブリングさせた。次いで、これを冷却器内（２〜８℃）に一晩置いた。次いで、この溶液を蒸発により３０ｍｌまで濃縮した。これにより、白色沈殿物が発生した。これを濾去し、少量のメタノールで洗浄し、乾燥した。収量は６．１ｇであった。この溶液を塩化メチレンで希釈し、フリーザー（−２５℃ ）内に置くと、結晶産物が生成した。収量は４．６ｇ（総収率は９％）であった。ＴＲ（ＫＢｒペレット）：３３８２．９ｃｍ^-1，３２６３．２ｃｍ^-1，２８３２．５ｃｍ^-1，１６５２．８ｃｍ^-1，１５１３．８ｃｍ^-1，１３４３．７ｃｍ^-1 ，１１３６ｃｍ^-1。１ＨＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２．９（ｓ，４Ｈ），３．３（ｓ，４Ｈ），７．４（ｄ，２Ｈ），８．１（ｄ，２Ｈ）。 III（トリアミン）の合成：窒素雰囲気下で攪拌しながら、２００ｍｌの１Ｍボランテトラヒドロフラン溶液を１０．７ｇのジアミド−アミン（II）に添加した。この溶液を還流加熱し、還流を一晩継続した。反応溶液を冷却し、濃縮した。ＨＣｌ（１５０ｍｌ）をこの溶液に添加して過剰ＢＨ₃をクエンチさせた。この溶液を回転蒸発乾固した。塩基性になるまで水酸化ナトリウム溶液を添加し、塩化メチレンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した。更に沈殿物が生成した。この沈殿物を濾去し、乾燥し、真空デシケーター内に置いた。固体を５ＭＨＣｌ溶液中で再結晶化させ、フリーザー（−２５℃）内で一晩冷却した。白色固体を濾去し、冷５ＭＨＣｌで洗浄し、乾燥した。ＩＲ（ＫＢｒペレット）：３４７４．６ｃｍ^-1 ，３３７４．６ｃｍ^-1，２９４１ｃｍ^-1，１６４６．５ｃｍ^-1，１６０４ｃｍ^-1 ，１５１３．１ｃｍ^-1，１３４９．４ｃｍ^-1。ＨＥＴＡ２の合成：ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２’は共に、トリアミン（III）を出発材料として同一の合成手順を用いて得ることができるが、ＨＥＴＡ２の製造には以下の方法が好ましい。 IV（ニトロＨＥＴＡ２エステル）の合成：ＤＭＦ及び塩化メチレンの１：１混合物５０ｍｌに１ｇのトリアミン（III）を溶解した。この反応混合物に１０ｍｌのトリエチルアミンを添加した。窒素雰囲気下で強く攪拌しながら、この溶液を８００ｍｌのアセトニトリルに添加すると、不透明な溶液が生じた。これを室温で攪拌した。この溶液を真空下で回転蒸発させて、全ての溶媒を除去した。２００ｍｌの無水エタノールを反応混合物に添加し、塩化水素ガスを飽和点まで溶液中にバブリングした。次いで、溶液を強く攪拌しながら還流加熱した。この方法を一晩継続した。還流を停止し、溶液を回転蒸発させて油状物を得た。次いで、この油状物を炭酸ナトリウム飽和溶液に溶解し、塩化メチレンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、回転蒸発させた。溶離用溶媒混合物として１％メタノールを含む塩化メチレン溶液を用いて、この混合物をシリカゲルカラムに通した。ＩＲ（ＫＢｒペレット）：１７３５．９ｃｍ^-1，１６６５．２ｃｍ^-1，１６００．８ｃｍ^-1，１５１８．６ｃｍ^-1，１３４５．９ｃｍ^-1，１１９３．９ｃｍ^-1 。ＦＡＢ−ＭＳ，Ｍ＋１，６９４．２，Ｒｆ＝０．６６（塩化メチレン中０．５％メタノール），１ＨＮＭＲ１．３（ｔ，９Ｈ），２．８（ｓ，１０Ｈ），３．１−３．９（ｍ，２０Ｈ），４．２（ｑ，６Ｈ），７．８（ｄ，２Ｈ），８．２（ｄ，２Ｈ）。アミノ−ＨＥＴＡ２エステル（Ｖ）の合成：１．８６のＨＥＴＡ２−ニトロエステル（IV）を塩化メチレンに溶解し、２００ｍｇの１０％パラジウム炭を含む攪拌エタノール溶液に添加し、水素ガスでバブリングした。水素のバブリングを更に３時間継続し、その後ＴＬＣ分析を行うと、フルオレスカミン陽性試験によって指摘されるようなアミン基の存在が判明した。ＵＶ分析もアミノ基の存在を示した。触媒を濾去し、溶液を回転蒸発させた。イソチオシアネート−ＨＥＴＡ２エステル(VI)の合成：アミノ−ＨＥＴＡ２エステル（Ｖ）を２００ｍｌの塩化メチレンに溶解し、窒素雰囲気下で攪拌しながらこの溶液にチオホスケンを添加した。これを室温で一晩反応させた。最後にこの溶液にメタノールを添加した。１０分後、この溶液を回転蒸発させた。これを炭酸ナトリウム飽和水溶液に溶解し、塩化メチレンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、回転蒸発させた。生成物をシリカゲルカラム（塩化メチレン中１−３％メタノール）に通した。VIのためにＴＬＣで主要スポットを示す画分を合わせて回転蒸発させた。ＨＥＴＡ２（VII）の合成：上述の手順（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，３，２４８，１９９２）と同様の手順を用いて、イソチオシアネート−ＨＥＴＡ２エステルをＨＣｌで加水分解してＨＥＴＡ２を得た。ＮＭＲ（１Ｈ）スペクトル分析によりエステル基の加水分解が確認された。赤外スペクトル分析により、イソチオシアネート基の存在が判明した。ＩＲ（ＫＢｒペレット）：３４１８．２ｃｍ^-1，２１１４．３ｃｍ^-1，１７３５．７ｃｍ^-1，１６７０．３ｃｍ^-1，１４００．８ｃｍ^-1，１２１５．７ｃｍ^-1 。この材料（ＨＥＴＡ２）は、ニトロＨＥＴＡ２エステル（IV）を塩基加水分解し、次いで還元し、イソチオシアネートに変換することによって製造することもできる。ＬｉＬｏ２’（Ｘ）の合成：ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２は共に同一の手順を用いて得ることができるが、ＬｉＬｏ２’の製造には以下の方法が好ましい。ニトロＬｉＬｏ２’エステル（VIII）の合成：窒素雰囲気下で、トリエチルアミン（５０ｍｌ）、ジメチルホルムアミド（６０ｍｌ）及びアセトニトリル（５０ｍｌ）を含む攪拌溶液に２５ｇのＤＴＰＡ二無水物を添加した。約１５分後、反応混合物に３．８ｇのトリアミンIIIを１時間に３２０ｍｇずつ添加した。計１２回添加し、溶液を室温で攪拌した。反応終了後、大半のＤＭＦが除去されるまで溶液を回転蒸発させた。エタノール処理により、反応混合物を更にエステル化した。反応混合物に３００ｍｌの無水エタノールを添加し、飽和点まで塩化水素ガスを溶液中にバブリングした。これを還流加熱した。５時間後、反応混合物を回転蒸発させて油状物を得た。次いで、この油状物を別の３００ｍｌのエタノールに再度溶解し、再度還流加熱した。還流を一晩継続した。次いで、この溶液を回転蒸発し、２００ｍｌの炭酸ナトリウム飽和溶液を添加し、全てが溶解するまでフラスコを強く振盪した。水性層を塩化メチレンで４度抽出し、これを硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、回転蒸発させて油状溶液を得た。この油状溶液をシリカゲルカラム（塩化メチレン中１％メタノール）に通した。メタノール含量を非常にゆっくりと増した。ＴＬＣ分析によりＬｉＬｏ２’ニトロエステルを示す画分を合わせた。このようにして製造したＬｉＬｏ２’ニトロエステル（VIII）を、上記手順と同様の手順を用いて活性炭上パラジウムで還元した。これにより、ＬｉＬｏ２’ アミノエステル（IX）が生成した。約８６０ｍｇのＬｉＬｏ２’ニトロエステル（VIII）を３０ｍｌの無水エタノールに溶解し、水素ガスでバブリングした３００ｍｇの１０％パラジウム炭のエタノール攪拌溶液に添加した。強く攪拌しながら、この溶液に水素ガスを連続的に添加した。約２．５時間後に吸収スペクトルを測定すると、２３７ｎｍで最大吸収を示した。反応混合物を濾過し、回転蒸発させた。ＴＬＣ分析は単一のスポットを示し、これはフルオレスカミン陽性であった。ＬｉＬｏ２’アミノエステル（IX）をまずイソチオシアネート誘導体に変換し、次いで酸加水分解によってＬｉＬｏ２’に変換することにより、ＬｉＬｏ２’ （Ｘ）を生成した。まずニトロ又はアミノＬｉＬｏ２’エステル誘導体を塩基（ＮａＯＨ）で加水分解し、次いでＬｉＬｏ２’に変換することによっても製造することができた。通常の酸加水分解反応を以下のように実施した。７３ｍｇのＬｉＬｏ２’イソチオシアネートエステルに２ｍｌの１ＭＨＣｌを添加し、完全に溶解するまで振盪させた。これを室温で放置した。必要に応じて混合物に更にＨＣｌを添加して、反応を更に継続した。最後に、溶液を凍結乾燥した。赤外スペクトル分析により、イソチオシアネート基の存在が確認された。ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２’とタンパク質との接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）：当業界でよく知られた方法を用いて、ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２’のようなキレート化剤を１６．８８のようなタンパク質に結合することができる。例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｒ．及びＭｅａｒｅｓ，Ｃ．Ｆ．，「ＢｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈｅｌａｔｉｎｇＡｇｅｎｔｓｆｏｒＲａｄｉｏｍｅｔａｌＬａｂｅｌｅｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ＣａｎｃｅｒＩｍａｇｉｎｇｗｉｔｈＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｅｉｓ（Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ編）ｐｐ１８３−１９９，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９０を参照されたい。通常の接合反応は、キレート化合物及び抗体溶液（比率は１００：１〜１：１）を２℃〜３７℃の温度で適当な時間（５分〜２４時間又はそれ以上）インキュベートすることからなる。このようにして得られた接合体をゲル濾過又はイオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる。ＨＥＴＡ２の８８ＢＶ５９との接合：ＨＥＴＡ２と１６．８８及び８８ＢＶ５９のようなモノクローナル抗体とを２〜３７℃の温度で５分〜４８時間、ｐＨ４〜９でインキュベートして、これら２種の反応体を接合した。反応終了後、ＨＥＴＡ２に結合した抗体をサイズ排除カラムクロマトグラフィーで精製した。イオン交換クロマトグラフィーのような他の方法も使用できる。画分の吸光度を２８０ｎｍで測定し、ＭｏＡｂ− ＨＥＴＡ２を含む画分（サイズ排除クロマトグラフィーを使用すると、抗体接合体が第１ピークでカラムから溶離する）をプールし、必要時に濃縮した。通常の接合反応を以下に示す：８８ＢＶ５９（２．５ｍＬ，９．６ｍｇ／ｍＬ）とＨＥＴＡ２（５０μＬ，３７．５ｍｇ／ｍＬ）をリン酸緩衝食塩水（０．０５Ｍ，ｐＨ７．２）中で合わせた。反応混合物のｐＨを飽和リン酸ナトリウム溶液でｐＨ８．５〜９．０に調整した。反応混合物を２〜８℃で約５時間インキュべートした。最後に、セファクリル高分解能Ｓ−３００カラムクロマトグラフィーを用いたゲル濾過クロマトグラフィーで、抗体接合体を含む混合物を精製した。抗体接合体を含む画分（８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２）は、第１ピークでカラムから溶離した。２８０ｎｍの吸光度測定で同定したこれらの画分を合わせ、ａｍｉｃｏｎ／ｃｅｎｔｒｉｃｏｎメンブランフィルターを用いて６．８ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで濃縮した。８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２の分析：ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＳＥＣ３０００カラムを用いるＨＰＬＣで、抗体接合体を更に分析した。接合体はほぼ純粋で、凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）がないことが判明した。８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２と抗体に対する同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原との結合能力を非接合天然抗体８８ＢＶ５９の場合と比較する同定アッセイで、接合体の免疫反応性を分析した。８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２も８８ＢＶ５９も同様に挙動しており、このことは接合が抗体の免疫反応性に影響しなかったことを示している。ＭｏＡｂ−ＨＥＴＡ２のインジウム−１１１による標識化：酢酸塩／クエン酸塩緩衝液（ｐＨ５〜７）中、２〜３７℃の温度で５分〜２時間免疫接合体（例えば８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２及び１６．８８−ＨＥＴＡ２）を放射性標識した。通常の放射性標識反応を以下に示す：０．９ｍＣｉの塩化インジウム−１１１（ＮＥＮ，ＤｕＰｏｎｔ）に、２０ｕＬの０．６Ｍ酢酸ナトリウム／０．０６Ｍクエン酸ナトリウム緩衝溶液を添加した。この混合物に０．１ｍｌの８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２溶液（６．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で約１時間反応させた。反応終了後、１ｍＭＤＴＰＡ溶液のアリコートを反応混合物に添加した。ＤＴＰＡを添加して、遊離した未結合の又は緩やかに結合したインジウム−１１１を反応混合物から掃去した。（ＤＴＰＡ溶液をスキャベンジャーとして使用せずとも放射性標識反応させることができる。）混合物をゲル濾過カラムに通すと、インジウム−１１１で標識した８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２が第１ピークでカラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０ゲル濾過カラム）から溶離した。画分をプールし、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７）を緩衝液として使用してＩＴＬＣで分析した。放射性同位体検出器に結合したＢｉｏＳｅｐＳＥＣ３０００カラムを使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。カラム精製後のＩＴＬＣ分析は、８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２に結合したインジウム−１１１のパーセンテージが９９．５％であることを示した。ＨＰＬＣ分析は、８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２．Ｉｎ（１１１）の純度が９５％以上であることを示した。８８ＢＶ５９に対する同族抗原（ＣＴＡ−１）に共有結合したセファロースビーズを含む親和性カラムを用いた反応性画分アッセイにより、８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２．Ｉｎ（１１１）の免疫反応性を評価した。１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７）を洗液として使用すると、カラムに結合した放射性標識抗体の反応性画分及び非反応性画分が流出した。洗液及び親和性カラム中の放射能の量を測定することにより、インジウム−１１１で標識した８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２．Ｉｎ（１１１）の免疫反応性を調べた。全放射能［８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ．Ｉｎ（１１１）］の８３．３％が親和性カラムに結合したままであることが判明した。このことから更に、インジウム−１１１を８８ＢＶ５９に結合するためにＨＥＴＡ−２を使用しても、８８ＢＶ５９の抗原との結合能力にはそれほど影響しないことが確認された。安定性の研究：（ａ）過剰ＤＴＰＡ溶液を含むリン酸緩衝食塩水及び（ｂ）正常ヒト血清溶液中で、インジウム−１１１で標識した８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２の安定性を評価した。いずれの場合も、ＩＴＬＣ法を用いて、８８ＢＶ５９に結合したインジウム−１１１のパーセンテージを時間の関数として調べた。（ａ）８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２．Ｉｎ（１１１）のアリコートに少量の１ｍＭＤＴＰＡ溶液を添加し、この混合物を３７℃で６日間インキュベートした。（ｂ）正常ヒト血清を含む溶液に８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２．Ｉｎ（１１１）のアリコートを添加し、この混合物を３７℃で６日間インキュベートした。３７℃での安定性研究の結果を表１に示す。これらの研究は、８８ＢＶ５９− ＨＥＴＡ２．Ｉｎ（１１１）が血清中でも過剰ＤＴＰＡ溶液の存在下のリン酸緩衝食塩水中でも３７℃で６日間以上安定であったことを示している。Ｙ−９０による放射性標識化：酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液の組み合わせの代わりに０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ５）を緩衝液として用いることを除いて上記と同様の手順を用いて、イットリウムによる８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２の放射性標識を実施した。Ｙ−９０で標識した接合体をＧ５０ゲル濾過クロマトグラフィーで精製すると、放射化学的に純粋で、免疫反応性であることが判明した。安定性の研究により更に、８８ＢＶ５９−ＨＥＴＡ２．Ｙ（９０）が血清中で４８時間以上は安定であることが実証された。ＬｉＬｏ２’での研究：参考として本明細書の一部を構成するものとする親出願のＵＳＳＮ０８／０４４,８７５号にＨＥＴＡ２の接合（例えば１３ページを参照されたい）及びＬｉＬｏと１６．８８との接合について記載されたのと同様の手順を用いて、ＬｉＬｏ２’を１６．８８に接合した。ＬｉＬｏ２’と１６．８８との接合の場合、Ｇ −５０セファデックスゲル濾過クロマトグラフィーを精製のために使用した。上述の手順を用いてインジウム−１１１及び／又はイットリウム−９０による放射性標識実験を行った。正常ヒト血清中での１６．８８−ＬｉＬｏ２’．Ｙ（９０）の安定性を図２に示す。１６．８８−ＬｉＬｏ２’．Ｉｎ（１１１）の安定性分析を表２に示す。これらの実験は、インジウム−１１１及びイットリウム−９０のような放射性金属を８８ＢＶ５９及び１６．８８のようなモノクローナル抗体に結合して安定な放射性免疫接合体を形成するためにＬｉＬｏ２’を使用できることを示している。これらの結果は明らかに、ＨＥＴＡ２及びＬｉＬｏ２’によって例示されるような本発明のポリアミノカルボキシレート試薬が安定な複合体をｉｎｖｉｖｏ生成することを示している。従って、これらの試薬はｉｎｖｉｖｏ用途に適している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｃ 237/10 9547−4ＨＣ０７Ｃ 237/10 281/02 9451−4Ｈ 281/02 331/28 7106−4Ｈ 331/28 Ｃ０７Ｈ 21/00 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 9356−4ＨＣ０７Ｋ 16/00 Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８ 7419−4ＨＣ０９Ｋ 3/00 １０８Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．式：（式中、ｎは０〜１２であり、ｍは２〜１２であり、ｏは１〜４であり、ｐは１〜４であり、Ｒ’は−ＣＳ−ＮＨ、−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−、Ｎ₂又は結合であり、ｏ＋ｐが２以上のときには閉環構造が形成され得る）で表されるキレート化剤に結合したポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は合成ポリマーを含んでなる接合体。２．式：（式中、ｎは０〜１２であり、ｍは２〜１２であり、ｏは１〜４であり、ｐは１〜４であり、Ｒはアミノ酸配列に共有結合する反応性部分であり、ｏ＋ｐが２以上のときには閉環構造が形成され得る）で表される化合物。３．式：（式中、Ｒ₃はＮＯ₂であり、Ｒ₄はＨもしくは−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ（ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ）_yＨで、Ｒ₅はＨもしくは−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ（ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ）_zＨであるか、又はＲ₄とＲ₅は一緒になって、を示し、ｎは０〜１２であり、ｍは２〜１２であり、ｙは０〜３であり、ｚは０〜３である）で表される化合物。４．キレート化剤がＬｉＬｏ２’：である請求項１に記載の接合体。５．式：で表される請求項２に記載の化合物。６．キレート化剤がＨＥＴＡ２：で表される請求項１に記載の接合体。７．式：で表される請求項２に記載の化合物。８．金属に結合した請求項２に記載の化合物を含んでなる接合複合体。９．金属に結合した請求項５に記載の化合物を含んでなる接合複合体。１０．金属に結合した請求項７に記載の化合物を含んでなる接合複合体。１１．金属に結合した請求項１に記載の複合体を含んでなる接合複合体。１２．金属に結合した請求項４に記載の複合体を含んでなる接合複合体。１３．金属に結合した請求項６に記載の複合体を含んでなる接合複合体。