JP2865112B2 - 金属イオンをタンパク質に結合するためのキレート化剤 - Google Patents

金属イオンをタンパク質に結合するためのキレート化剤

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JP2865112B2 JP2513354A JP51335490A JP2865112B2 JP 2865112 B2 JP2865112 B2 JP 2865112B2 JP 2513354 A JP2513354 A JP 2513354A JP 51335490 A JP51335490 A JP 51335490A JP 2865112 B2 JP2865112 B2 JP 2865112B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アルブミン、トランスフェリン、抗体等の
タンパク質に金属イオンを結合するための新規のキレー
ト化剤に係わる。
発明の背景 金属イオンをタンパク質に結合すると幾つかの有効な
主成分がもたらされる。これらの生成物としては、生物
学的系におけるin vivoプローブとして、またラジオイ
ムノアッセイのような分析系におけるin vitroプローブ
として使用し得る、蛍光性、放射性及び常磁性金属イオ
ンを結合したタンパク質を挙げることができる。例え
ば、腫瘍関連抗原を認識するモノクローナル抗体に放射
性核種を結合すると、癌の診断及び治療に有効な放射免
疫複合体（radioimmunoconjugates）が与えられる。モ
ノクローナル抗体は、in vivoにおける特異的部位に対
する所望の物質の運搬体として使用される。ジエチレン
トリアミンペンタ酢酸（DTPA）、エチレン−ジアミンテ
トラ酢酸（EDTA）及び大環状化合物（macrocyclics）と
いった幾つかのキレート化剤は、タンパク質に結合して
安定な複合体を形成することが報告されている。しかし
ながら放射免疫複合体またはキレートは生理学的条件下
で動力学的に不安定であり、その結果これらの複合体は
分解を起こす。結合の様式、キレートの構造等を変更す
る試みも幾つかなされたが、かかる放射免疫複合体のin
vivo投与の結果、放射能が非標的組織、特に肝臓に蓄
積した。従って、放射性金属を抗体に結合して、患者に
投与したときに解離しない複合体を形成する新規のキレ
ート化剤が必要とされていることは明らかである。
発明の概要 本発明の目的は、金属イオンをタンパク質に結合する
ための新規の一連のキレート化剤を提供し、それによっ
てin vivoで安定な抗体−キレート複合体を含む水溶液
を提供することである。
本発明の他の目的は、In、Ｙ、Gd、Tb、Cu、Co、Sm、
Rh、Ru、Re、Tc、Fe、Pb、Ba、アクチニド、ランタニド
及び遷移金属イオンを含む種々の金属イオンを結合する
一連のキレート化剤を提供することである。
本発明の他の目的は、モノクローナル抗体を含むタン
パク質に金属イオンを結合するのに有効な新規のキレー
ト化構造を合成することである。
本発明の他の目的は、アルブミン及びIgGのような低
分子量タンパク質だけでなく、IgM（９×105）、リポタ
ンパク質（２×106）等の高分子量タンパク質にも結合
するのに適している多目的のキレート化剤を得ることで
ある。
本発明の更に他の目的は、金属キレート結合抗体を製
造する改良方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、複合タンパク質の生物学的
活性を有意な程度に破壊することなく、抗体分子１つ当
たりの金属イオン濃度が高いキレート化構造を得ること
である。
本発明の更に他の目的は、蛍光性／発光性金属イオン
をタンパク質−キレート複合体に結合することにより蛍
光物質標識されたタンパク質を得ることである。
本発明の更に他の目的は、ポリマー及びゲルのような
クロマトグラフィーカラム材料に結合してキレートアフ
ィニティーカラムを形成し得る金属イオン結合試薬を得
ることである。
上記目的及び他の目的は、本発明の１つ以上の実施態
様によって実現される。
図面の簡単な説明 第１図は本発明の二官能性キレート化剤を示す図であ
り、“a"はLiLo1であり、“b"はLiLo2であり、“c"はDI
CAPであり、更に“d"はIDACである。
第2A図及び第2B図は、金属結合キレート化剤DICAP、I
DAC及びLiLoを得るための合成手順を示す図である。
第３図は、37℃におけるリン酸緩衝塩水（PBS）（0.0
5M,pH7.2）中のインジウム−111で標識されたHSA−LiLo
1及びHSA−DTPAの安定性を比較した図である。
第４図は、タンパク質−キレート複合体（IgMアイソ
タイプヒトモノクローナル抗体16−88に結合されたLiLo
1）と複合体を形成していないタンパク質（16−88）と
の生物学的活性（免疫反応性）を比較した図である。
第５図は、ゲル過クロマトグラフィーによる（16.8
8）LiLo111Inの精製を示す図である。
第６図は、窒素（Ｎ）列の選択により所定数のＮ［CH
2COO］２結合部位を取り込むことができるスターバース
ト配位子（starburst ligand）を示す図である。
第７図は、結合部位が第１図に示したようにLiLo型の
基であるスターバーストLiLo配位子を示す図である。結
合部位の数は設計によって予め選択することができる。
発明の好ましい実施態様 本発明の１つの実施態様は、全ての金属イオンがキレ
ート試薬を介してタンパク質に結合している抗体または
タンパク質キレート複合体を含む緩衝溶液に関する。
放射性金属を抗体に結合するには、まず配位子を抗体
に結合する必要がある。キレート試薬（chelator）また
はキレート化剤（chelating agent）とも称される配位
子は、配位結合の形成によって放射性金属に効果的に結
合し得る化合物である。ポリアミノカルボン酸、大環状
化合物、クラウンエーテル、クリプタンド及びシクラム
（cyclam）といった配位子を使用して放射性金属を結合
することができる。配位子の選択は、関与する放射性核
種の選択と結合されるタンパク質の特性とに従う。ラジ
オイムノイメージング及び診療するための興味ある放射
性核種には、111In、90Y、203Pb、155Sm、101Rh、97R
u、67Cu、201Tl、99mTc、55Co、186Re、188Re、212Bi及
び213Biが含まれる。常磁性金属イオンに関しては、Gd
及び他の同様の金属イオンを使用することができる。蛍
光性または発光性に基づく検査に対しては、Tb、Eu、Ru
及びRhのような金属イオンを使用することができる。タ
ンパク質及び金属イオンの両方に結合するのに適した配
位子は二官能性キレート化剤と称されることが多い。こ
のような化合物は金属結合部分を有する上に、タンパク
質に結合するのに有効な反応性官能基も有している。反
応性官能基は既に当業者には公知である。このような基
の例としては、イソチオシアナート、ブロモアセトアミ
ド、ジアゾ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及
び無水物を挙げることができ、このような基をキレート
化剤に取り込むことができる。金属イオンは、幾つかの
炭素原子［（CH2）ｎ］と幾つかの他の基とを含むリン
カー分子の一部分であってもよい。免疫複合体を構築す
る上で配慮すべき幾つかの要因としては、（１）安定で
あらねばならないこと、（２）金属イオンに容易に結合
すること、及び（３）タンパク質の生物学的活性を保持
することがある。本発明に記載のキレート化構造体はこ
れらの条件を満足する。
キレート化剤に加えて本発明は、（ｐ）−ニトロベン
ジルブロミド及びマロン酸ジエチルから出発して一連の
二官能性キレート化剤を合成することを含む。縮合生成
物から、（ｐ）NO2−Ph−CH2−CH（CH2NH2）２、（ｐ）
NO2−Ph−CH（CH2・CH2・NH2）２、及びＣ−３位に
（ｐ）NO2−Ph−CH2を有する といった数種のアミンを製造することができる。これら
のアミンは、第１図に示した金属結合キレート化剤ａ〜
ｄを合成し得る主要な中間生成物である。かかる試薬は
更に、これらをタンパク質に結合するのに使用し得る反
応性官能基、例えば−NCS、−NH−CO−CH2Brまたは−N2
Brをも有する。
通常のキレート化剤は、タンパク質と結合すると数種
の異なる生成物をもたらす（例えば凝集体）。二無水物
のようなリンカーをしばしば使用するのはこのためであ
る。イソチオシアナートまたは−NH−CO−CH2Brのよう
なリンカーを使用することにより、かかる複雑化は解消
される。
本発明のキレートを製造するためには、全ての反応
は、メタノールメチレンクロリド及びTHFのような非水
性溶剤中で実施し、精製はシリカゲルクロマトグラフィ
ーによって実施する。この方法においては幾つかの重要
な点がある。同じ反応順序を使用し、本発明者らは、カ
ルボキシル基及び／またはフェノキシル基を含むキレー
トと、大環状キレート化剤と、幾つかの金属結合基を含
む試薬と、立体構造的に剛直な部分を含む試薬とを得
た。こような試薬は、固有で且つ有効な特性を有する広
範囲にわたる種々の金属キレートを提供する。更に、規
定された反応順序は、幾つかの他の二官能性試薬及びポ
リマースターバースト配位子を得るために使用すること
ができる。
第７図に示したようなポリマースターバーストLiLo配
位子は、IDAC及びLiLoのポリマー類縁体である。これら
は、（IDAC、LiLo等の）カルボキシメチルエステル誘導
体をアンモニアと反応させ、次いで還元し、カルボキシ
メチル化することにより得られる分子である。
アンモニア反応、還元及びカルボキシメチル化の過程
は、所望の数のカルボキシル基を含む分子が得られるま
で継続することができる。アンモニアに代えてエチレン
ジアミン（NH2CH2CH2NH2）、プロピレンジアミン（NH2
−CH2−CH2−CH2−NH2）、ジエチレントリアミン（NH2
（CH2CH2）−NH−（CH2CH2）−NH2）等を使用すること
もできる。これらの複数のカルボキシル部分が３次元的
に広がる能力の故に、本発明者らはこれらをスターバー
スト配位子（starburst ligands）と名付けた。この方
法は更に、自動化システムにおけるキレートの大量生
産、即ち反応ステップを所定の回数だけ自動的に繰り返
すペプチド合成装置に類似の装置を使用する「多価スタ
ーバースト配位子合成装置」に適用することができる。
ポリマー配位子の精製は、ゲル浸透、シリカゲル及び／
またはイオン交換クロマトグラフィーによって行なうこ
とができる。第６図には、ＸがCOO-またはCH2−Ｎ−Ｙ
〔ここでＹはCH2−COO-または、結合に使用し得るCOO-
基の数が2nとなるｎ列の窒素（Ｎ）において所望の数の
COO-結合部位が得られるまでのCH2−Ｎ−Ｙの繰り返し
である〕であるスターバースト配位子を示す。
上述の反応順序を使用すると、種々のタイプの金属イ
オンをタンパク質に結合するのに有効な一連の試薬、例
えば111In/90Yに対してはLiLo、99mTcに対してはIDAC、
並びにGd、Tb、Eu及び放射性金属に対してはスターバー
ストポリマーを得ることができる。
ポリアミンをカルボキシメチル化する代わりに、（Li
Lo1の合成に使用される方法を用いて）それらをDTPAと
縮合させ、幾つかの・Ｎ（CH2COO）２・CH2・CH2・Ｎ
（CH2COO）・CH2・CH2・Ｎ（CH2COO）・CO・NH−基を含
むポリマースターバーストLiLo配位子を得ることもでき
る。このような配位子の例を第７図に示す。第７図にお
いてＺは、・Ｎ（CH2COO）２・CH2・CH2・Ｎ（CH2COO）
・CH2・CH2・Ｎ（CH2COO）・CO・NH−または−Ｎ（CH2
・CH2A）２〔ここでＡは前記Ｚと同じであるか、また
は、結合に使用し得るCOO-基の数が2(n+1)となるｎ列の
窒素（Ｎ）において所望の数のCOO-結合部位が得られる
までの−Ｎ（CH2・CH2A）２の繰り返しである〕であ
る。
これらの試薬は、穏和なまたは単純な手段でタンパク
質に結合することができる。その１つの方法は、タンパ
ク質及びキレート化剤をpH6〜９の適当な緩衝液中37℃
で１〜３時間インキュベートし、形成されたタンパク質
−キレート複合体をゲル過クロマトグラフィーによっ
て精製することを含む。本発明者らはこれらの試薬をヒ
ト血清アルブミンに結合した。得られたキレート結合ア
ルブミンは57Coのような金属を極めて高い効率（＞95
％）で結合する。タンパク質はモノクローナルもしくは
ポリクローナル抗体、またはトラスフェリン、アルブミ
ン及びこれらの誘導体のような他のタンパク質とするこ
とができる。最大の免疫反応性を得るためにリンカーを
改質することもできる。金属イオンは、遷移金属イオン
や、常磁性、放射性及び蛍光性／発光性の金属イオン
や、ランタニド、アクチニド及び他のイオンとすること
ができる。これらには、限定的ではないが、Gd、Tb、E
u、Ru、Rh、Pd、Pb、Sm、Tb、Ga、In、Tl、Fe、Co、N
i、Re、Ｙ、Tc、Cr、Os、Ir、Sb及びCuを挙げることが
できる。金属イオンを結合する方法は、免疫複合体をpH
5〜９の金属塩溶液と、温度20〜37℃で0.5〜６時間また
は４℃で24時間インキュベートし、次いでゲル過クロ
マトグラフィーを実施することを含む。
関与する金属イオンが放射性でない場合には、金属−
キレート錯体をまず製造及び精製し、次いでタンパク質
に結合して金属−キレート−タンパク質複合体を得るこ
とができる。LiLo及び他の高級類縁体の場合にはポリア
ミノカルボキシレートが存在するが故に、高い金属イオ
ン濃度を容易に得ることができる。このことは、患者体
内の腫瘍が取り込む抗体は0.005％I.D/g未満であること
が多いので、放射免疫療法及び磁気共鳴像形式において
は極めて重要である。
第１図の全ての試薬ａ〜ｄは、放射性金属及び他の金
属イオンを結合し、且つモノクローナル抗体のようなタ
ンパク質にも結合し得るポリアミノカルボキシレートで
ある。試薬の選択は、 a.適用対象（または最終用途） b.金属イオンの性質 c.タンパク質（生物学的特性） に従う。例えば、LiLo1及びIDACをHSAに結合させ、111I
nで標識し、放射免疫複合体の分解速度をDAPA追跡法に
よって37℃において測定すると、HSA−LiLo1−111Inは
111Inを１日当たり１％未満の割合で失い、HSA−IDAC−
111Inは111Inを１日当たり約20％の割合で失うことが判
った。同様の実験条件下で、HSA−DTPA−111Inは111In
を１日当たり10％の割合で失う。これらの結果から、Li
Loはインジウムに対してIDAC及びDTPAよりも優れたキレ
ート試薬であり得ることが判る。しかしながら、例えば
99mTc及び55Co（半減期約６時間）のような短寿命の同
位体に対しては、このような場合には短期間の安定性が
より重要であるが故に、IDACを使用することができる。
スターバーストポリマーLiLo配位子は、治療、in vit
ro診断（蛍光性金属イオン）、MRI造影剤等の高い金属
イオン濃度が要求される場合に有用である。スターバー
スト配位子を使用する大きな長所は、大量の金属イオン
に結合する能力にある。
精製した複合体中の未結合の金属イオンの存在は、も
しあるとすれば、薄層クロマトグラフィー（上昇式）、
NMR、IRまたは可視もしくは蛍光分光法といった標準的
な分析方法を使用して測定することができる。
実施例１ 複合体形成及び安定性試験： 安定性を試験するために、まず、HSA（30mg/ml,0.05M
PBS溶液,pH7.2）をLiLoまたはIDACと（HSA;LiLo/IDAC
のモル比を1:10とし）37℃で２時間反応させることによ
り、HSA−IDACまたはHSA−LiLo複合体を製造した。未結
合のキレートをゲル過クロマトグラフィー（Ｇ−50 S
ephadex,Pharmacia）によって除去し、複合体（HSA−Li
Lo,HSA−IDAC）を回収し、タンパク質濃度を280nmにお
ける吸収により測定した。また、DTPA二無水物をPBS緩
衝液（0.05m,pH7.2）中のHSAに加え、室温で15時間イン
キュベートし、未結合のキレートを前述のごときゲル
過クロマトグラフィーによって除去することにより、HS
A−DTPAを製造した。
複合体を緩衝液（0.05Mクエン酸塩/0.5M酢酸塩,pH5.
5）中の111Inで標識し、DTPAを加えて全ての未結合111I
nと結合させ、標識された複合体をＧ−50またはＧ−25
ゲル過クロマトグラフィーによって精製した。免疫複
合体の純度を、GelmanITLC−SGクロマトグラフィー紙を
使用しPBS緩衝液中のITLCによって測定した。
37℃でpH7.2の0.05M PBS緩衝液中における安定性を試
験した。溶液のアリコートを定期的に取り出し、過剰の
DTPA溶液で処理して解離した全ての111Inをキレート化
した。PBS緩衝液（0.05M,pH7.2）中のITLC−SGストリッ
プ（Gelman Sciences）を使用した薄層クロマトグラフ
ィー分析を実施し、ITLCストリップを２つの切片に切
り、γ計測器を使用してインジウム（111）の放射能を
測定した。
は、タンパク質に結合した111In（％）に等しい。
111In−HSA−LiLo及び111In−HSA−DTPAを用いて得ら
れた結果を第３図に示す。
更にキレート試薬LiLo及びIDACをヒトモノクローナル
抗体16.88と結合させた。ヒトモノクローナル抗体16.88
は、結腸癌患者の末梢血リンパ球から得られ、エプスタ
イン−バー核抗原（the Epstein−Barr nuclear antige
n）を発現する、自発的に形質転換されたヒトリンパ芽
球細胞系によって産生されるIgMアイソタイプである。
放射性金属をIgMモノクローナルに結合することは、IgG
または他のタンパク質と比較して難しいと報告されてい
る。DTPA無水物のような通常のキレート化剤は抗体の凝
集をもたらし、更に、放射性同位体標識されたMoAbの回
収率は低い。このような回収率の低さは、放射性同位体
標識された1688−LiLo及び1688−IDACの場合には見られ
なかった。
IDAC及びLiLoといった新規のキレート化剤は16.88と
結合した。競合的結合測定法によって、複合体を形成し
ていない16.88と比較した場合のこれら複合体の免疫活
性を測定した。この測定法においては、抗原をマイクロ
タイタープレート上にコートし、放射性ヨウ素で標識し
た16.88で処理した。次に、複合体を形成していない16.
88または16.88−LiLo及び16.88−IDACを競合させた。こ
のアッセイによって得られた結果は、16.88−LiLo及び1
6.88−IDACの両方が複合体を形成していない16.88と同
程度の免疫活性を有することを示した。16.88を用いて
得られた結果を第４図に示す。
MoAb当たりのキレートの数を現段階で当業者に公知の
方法で測定した。一般にこの方法は、111InCl3を含むIn
Cl3を既知量だけ免疫複合体に加え、この混合物を0.05M
クエン塩酸/0.5M酢酸塩緩衝液,pH5.5中において室温（2
3〜27℃）で30分間インキュベートすることを含む。次
いで、過剰のDTPA溶液を加えて未結合のインジウムをキ
レート化する。５分後、この混合物のアリコートをTLC
（薄層クロマトグラフィー）上にスポットした。溶離混
合液として10％酢酸アンモニウム（水性）及びメタノー
ル（容積比1:1）を使用してクロマトグラフィーを実施
した。111Inで標識されたタンパク質は原点に残留し、I
n−DTPAは移動した（Rf＝0.75）。反応混合物中に取り
込まれたタンパク質及びインジウムの濃度は分かるの
で、TLCの種々の部分を切断し数えることにより、タン
パク質１つ当たりのキレートの数を決定することができ
た。一般にこの比は１〜５である。
更に上記複合体の免疫反応性を、Lindmo,T.ら,J.Immu
nol.Meth,72（１）,77〜79（1984）によって提案された
直接細胞結合アッセイによって測定した。このアッセイ
においては、16.88−キレート複合体を111Inで標識し、
ゲル過クロマトグラフィーによって精製した。第５図
は、ゲル過（Sephadex,G−25）クロマトグラフィーに
よる（16.88）LiLo111Inの精製を示す。最初のピーク
（フラクション＃３〜＃6,0.9ml/フラクション）は放射
免疫複合体を含んでいる。PBS緩衝液（0.05M,pH7.2）を
溶出液として使用した。標識された複合体を、WiDr細胞
系または抗原のいずれかと一緒にインキュベートし、細
胞または抗原に結合した活性（％）を測定した。16.88
−LiLo−111In及び16.88−IDAC−111Inいずれの場合も
免疫反応性は95％より大きかった。
これらの結果から、キレート試薬IDAC及びLiLoを使用
すると、免疫活性を有意に損失させることなく111Inを
ヒトモノクローナル抗体16.88に結合し得ることが立証
された。
HSA−キレート試薬複合体の場合に認められたよう
に、生理学的条件下にPBS緩衝液中で16.88−LiLo−111I
n（１日当たり１％未満）は16.88−IDAC−111In（１日
当たり10％より大きい）よりもはるかに安定であった。
しかしながら99mTcのような短寿命の同位体に対して
は、16.88−IDACが優れていよう。インジウムと同様の
特性を有する111In及び90Yに対しては、16.88−LiLoがi
n vivo使用においては優れた複合体となろう。
実施例II DICAPの合成： LiLo、DICAP及びIDACの合成を第2A図及び第2B図に示
す。ｐ−ニトロベンジルブロミドをマロン酸ジエチルと
縮合してｐ−ニトロベンジルジエチルマロネートを得、
これを還元してジオールとし、ジニトリルに変換し、次
いでトリアミンに変換する。まずカルボキシメチル化
し、次いで還元し、CSCl2及びCF3COOHで処理してDICAP
を生成した。
ｐ−ニトロベンジルエチルマロネートを直接還元して
ジアミンとし、DTPAと縮合してLiLo1を得た。この縮合
は以下の３つの異なる経路で実施した。
1.ジアミンとDTPAメチルエステルとの縮合 2.ジアミンとDTPA環状酸無水物とのカップリング 3.ジアミンとDTPA酸との間の混合酸無水物法による反応 経路２及び３を用いた実験においては、得られた生成
物をメチルエステルに変換し、シリカゲルクロマトグラ
フィーによって精製し、LiLo1に変換した。ジニトリル
（III）を還元してジアミンとし、次いでカルボキシメ
チル化し、活性炭素担持パラジウムの存在下に水素で還
元し、CSCl2及びトリフルオロ酢酸で処理してLiLo2を生
成した。
ジアミンをまずカルボキシメチル化し、次いで還元
し、CSCl2及びCF3COOHで処理してIDACを生成した。この
合成の詳細を以下に説明する。
A.2−（４−ニトロベンジル）ジエチルマロネート
（Ｉ）： ナトリウム金属6.9g（0.3m）を無水エタノール液300m
lに窒素雰囲気下で撹拌しながら徐々に加えた。全ての
金属が溶解したら、この溶液に、ジエチルマロネート96
g（0.6m）をゆっくり滴下して加え、次いで４−ニトロ
ベンジルブロミド65g（0.3m）を少量ずつ１時間かけて
加えた。この溶液を24時間加熱して還流させ、沈澱した
副産物を別した。次いで溶液を蒸発させ、結晶化した
生成物を過し、エタノールで洗浄した。収量34.9g（4
0％），融点60℃。Ir 1736cm-1,1524cm-1,1346cm-1,115
1cm-1,852cm-1,KBrペレット。NMR,CDCl3,8.14d,2H;7.37
d,4.15,9,4H;3.64,t,1H;3.30,d.2H;1.22,t,6H。
B.2−（４−ニトロベンシル）−1,3−プロパンジオール
（II）： 生成物（Ｉ）11.3g（0.038m）を無水THF20ml中に溶解
し、それを1M BH3−THF溶液190ml中に４℃で窒素雰囲気
下に撹拌しながら注入した。この溶液を18時間ゆっくり
加熱して還流させた。次いで溶液を室温にまで冷却し、
メタノールを少量ずつ加えて過剰のBH3錯体をつぶし
た。次いで溶液を回転して蒸発させ、更にシリカゲルク
ロマトグラフィーによって精製した。収量6.3g（78
％），融点85℃。IR（KBrペレット）3260cm-1,1539c
m-1,1351cm-1,1030cm-1。NMR 3.73ppm,d,4H;2.78ppm,d,
2H;2.35ppm,s,2H;2.03ppm,s,1H。
C.3−（４−ニトロベンジル）−1,5−ペンタンジニトリ
ル（III）： ｐ−トルエンスルホニルクロリド（トシル）6.9g（0.
036m）を乾燥ピリジン10ml中に溶解し、４℃に冷却し
た。生成物（II）2.5g（0.12m）を乾燥ピリジン5mlで希
釈し、撹拌したトシル溶液に冷却しながらゆっくりと加
えた。この溶液を４℃で15分間撹拌し、次いで室温まで
昇温させ、３時間撹拌した。溶液を４℃の30％HCl 100m
l中に撹拌しながらゆっくり注ぎ込むことにより反応を
停止させた。生成物をCH2Cl2で抽出し、蒸発させ、エタ
ノール中で結晶化してトシル誘導体を生成した。融点85
〜89℃。IR（KBrペレット）1524cm-1,1352cm-1,1194cm
-1,1176cm-1。
KCN3.1gを４℃の無水エタノール液30ml中に撹拌しな
がら懸濁させた。上記トシル誘導体をCH2Cl2:EtOHの1:1
混合液中に溶解し、KCN混合物に加えた。この溶液を24
時間ゆっくり加熱して還流させた。次いで溶液を回転蒸
発させ、CH2Cl2で抽出し、過し、蒸発させた。ついで
オイル状生成物をシリカゲルカラムに通すとオレンジ色
のオイル状生成物（III）が分離された。収量1.9g（70
％）,IR（NaClプレート）2248cm-1,NMR 2.96ppm,s,2H;
2.5ppm,s,4H;2.13ppm,m,1H。
D.（４−ニトロベンジル）グルタルイミジン（IV）： 生成物（III）2.2g（0.0096m）を乾燥メタノール100m
l中に溶解し、この溶液にアンモニアガスを飽和するま
で通気した。この溶液を加圧反応器（ボンベ）に入れ、
密閉し、80〜100psiの圧力下に15時間加熱した。ボンベ
を周囲温度に冷却し、反応混合物を取り出し、溶剤を蒸
発させて、濃厚な暗色オイル状の物質とした。IR（NaCl
プレート）1666cm-1。
上記生成物を無水THF（テトラヒドロフラン）25ml中
に溶解し、窒素雰囲気下に４℃で1M BH3・THF（ボラン
テトラヒドロフラン）溶液75mlに加え、次いでこの溶液
を室温まで昇温させ、25℃で４日間撹拌した。その後、
メタノールで反応を停止させ、溶液を蒸発により濃縮し
た。オイル状の物質をCH2Cl2中に溶解し、その溶液にHC
lガスを通気して生成物を沈澱させた。IR（KBrペレッ
ト）1604cm-1,3418cm-1。この生成物は、第一級アミン
の存在を示すフルオレサミン陽性を示した。更に第二級
アミンに対する試験においても陽性を示した。
E.2,6−ジアミノ−４−（４−ニトロベンジル）−１−
アザシクロヘキシル−N,N′,N′,N″,N″−ペンタ酢酸t
ert−ブチルエステル（Ｖ）： 生成物（IV）54mgを乾燥メタノール3ml中に溶解し、
まずトリエチルアミン、次いでtert−ブチルブロモアセ
テート250を加えた。この溶液を蒸発乾固し、CH2Cl2
及びそれに含有させるメタノール増量濃度勾配を用いる
シリカゲルカラムに通した。収率25％。NMRは、ベンジ
ルＨ対ｔ−ブチルＨの比4:44.2（計算値4:45）,tert−
ブチルH 1.47ppm,3つの異なるエステル比2:2:1;カルボ
キシメチルH 3.40ppm,9.6H（理論値10）を示した。
F.DICAP（VI）： 生成物（Ｖ）15mgをメタノール5ml中に溶解し、４℃
に冷却した。触媒量の10％パラジウム−炭素を撹拌しな
がら加えた。次いで４℃の反応混合物に撹拌しながらH2
ガスを通気し、10分後、溶液を25℃に暖め、更に12時間
水素を加え続けた。次いで溶液を過して触媒を除去し
た。この生成物は、フルオレサミンアッセイによる第一
級アミンの試験に陽性を示した。
上記溶液を25℃で、チオホスゲン0.1mlをゆっくり加
えながら撹拌した（５時間）。この溶液を蒸発させると
オレンジ色で粘着性のフィルム状物質となった。IR（KB
rペレット）は、2106cm-1にNCSピークを示した。tert−
ブチルエステルを加水分解し、蒸発乾固した。
実施例III A.3−（４−ニトロベンジル）ジアミドマロネート（VI
I）： 生成物（Ｉ）4.3gをメタノール150ml中に溶解し、４
℃に冷却し、この溶液にアンモニアを飽和点まで通気し
た。次いで溶液に栓をし、48時間４℃に維持した。沈澱
した生成物を過し、メタノールで洗った。IR（KBrペ
レット）3441cm-1,3392cm-1,1678cm-1,1657cm-1。
B.2−（４−ニトロベンジル）−1,3−ジアミノプロパン
（VIII）： ジヒドロクロリド塩 生成物（VII）2.0gをTHF（テトラヒドロフラン）（20
ml）中に懸濁させ、４℃の1m BH3・THF溶液60mlに撹拌
しながら加えた。この溶液を15時間ゆっくり加熱して還
流させ、メタノールを用いて反応を停止させ、外部から
冷却せずにHClを通気し、黄色オイル状の生成物を分離
させた。固形物を過し、メタノールで洗った。収量2.
71g（91％）,IR（KBrペレット）2934cm-1,1600cm-1,151
4cm-1,1353cm-1。
C.ニトロ“LiLo"メチルエステル（IX）： 生成物（VIII）300mgとDTPAペンタメチルエステル3.3
gとを乾燥メタノール10ml中に溶解し、７日間加熱して
還流させた。反応混合物を蒸発させ、シリカゲルカラム
クロマトグラフィーによって精製した。生成物はフルオ
レサミン陰性を示した。収率17.5％。IR（KBrペレッ
ト）1741cm-1,1654cm-1,1348cm-1,1204cm-1。
D.ICN−LiLo−メチルエステル（Ｘ）： 前述のごとくDICAPに使用した方法によって、ニトロ
基をまずアミノ基に、次いでイソチオシアナート基に変
換した。
LiLo1の合成： 更に混合酸無水物法によってLiLo−メチルエステル
（IX）を得た。
DTPA 1.0g（0.0025M）を、トリエチルアミン2mlを含
むCH2Cl2 30ml中にN2雰囲気下に懸濁させ、この溶液を2
5℃で24時間撹拌し、次いで氷／塩浴中で約10℃に冷却
した。この溶液にクロロギ酸エチル250ml（0.0025M）を
滴下して加えた。この溶液を25分間撹拌し、生成物（VI
II）367mg（0.00125M）を、トリエチルアミン0.5mlを含
むCH2Cl2 5ml中に溶解し、−５℃に冷却した。これを混
合酸無水物溶液に激しく撹拌しながら滴下して加え、そ
れを２時間０℃以下に維持し、それからゆっくりと室温
まで昇温させ、一晩撹拌した。次いでこの溶液を蒸発さ
せ、残留物を乾燥CH3OH（50ml）中に溶解し、塩化チオ
ニル4mlをN2雰囲気下に滴下して加え、５時間加熱して
還流させた。揮発性物質を蒸発させ、次いで残留物をシ
リカカラム（CH3OH勾配を有するCH2Cl2）に通した。IR
（KBrペレット）1742cm-1,1664cm-1,1520cm-1,1347c
m-1,1207cm-1。
IDAC−NO2（XI）の合成： 生成物（VIII）500mg（0.00177M）をCH3OH 10ml及び
トリエチルアミン2ml中に溶解し、ｔ−ブチルブロモア
セテート2.0mlを加えた。この溶液に栓をして放置し、
トリエチルアミンを用いて溶液を塩基性に維持しながら
25℃で７日間反応させた。この溶液を蒸発させ、残留物
をシリカカラム（CH2Cl2,CH3OH勾配）に通すと、淡黄色
オイルの生成物が得られた。収量818mg（69％）。IR（K
Brペレット）1736cm-1,1522cm-1,1368cm-1,1345cm-1,11
49cm-1。
DICAP−ICNを製造するのと同様のステップを使用し、
IDAC−ICN（XII）を製造した。
実施例IV 更にDTPA二無水物を使用する別の方法によって、LiLo
1を製造した。生成物（VIII）20mgを水10ml中に溶解
し、DTPA二無水物105mgを加え、溶液を振盪して溶解さ
せた。これを５日間４℃に維持し、それから直ちに還元
した。触媒量の10％Pd/Cを加え、溶液に水素を室温で６
時間通気し、次いで水素雰囲気下に一晩撹拌した。この
溶液を過し、チオホスゲンを使用してイソチオシアナ
ートに変換し、過剰なチオホスゲンをエーテルで抽出し
た。IRスペクトルは、イソチオシアナートに特徴的な21
26cm-1にピークを示した。
実施例Ｖ 更に別の方法でDICAP（VI）を製造した。生成物（V
I）200mgを水1ml中に溶解し、それに1N NaOH溶液を加え
て塩基性とした。ブロモ酢酸680mgを徐々に加え（pH＞
８）、この溶液を３日間37℃に維持した。溶液はフロオ
レサミンアッセイに陰性を示した。この溶液を濃縮し、
1Mから7Mのギ酸勾配溶離を使用するAGlx8アニオン交換
カラムに通し、フラクション（3ml）を凍結乾燥した。D
ICAPはフラクション271〜304から溶離した。IR（KBrペ
レット）3424cm-1,2934cm-1,1736cm-1,1233cm-1,1063cm
-1。
上述の実施例は単に説明の目的で与えたものであっ
て、本発明を制限するものではない。更に、記載されて
いるタンパク質、抗体、放射性核種及び金属は単に例と
して与えたにすぎない。本発明は本発明の請求の範囲の
範囲内において、いかなるペプチド、タンパク質もしく
はポリマー及びいかなる放射性核種もしくはいかなる金
属との結合をも包含するものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 331/28 Ｃ０７Ｄ 211/56 Ｃ０７Ｄ 211/56 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/532 Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C09K 3/00 108 A61K 49/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： ［式中、Ｒは、−NCS、−NH−CO−CH2−Br又は−N2−Br
    である］ で示されるキレート化剤（DICAP）。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のキレート化剤に結合して
    いる放射性核種を含む錯体。
  3. 【請求項３】請求項１に記載のキレート化剤に結合して
    いる金属を含む錯体。
  4. 【請求項４】請求項１に記載のキレート化剤に結合して
    いるポリペプチドを含む複合体。
  5. 【請求項５】前記ポリペプチドが抗体である請求項４に
    記載の複合体。
  6. 【請求項６】前記キレート化剤に結合している放射性核
    種を含む請求項４に記載の複合体。
  7. 【請求項７】式： ［式中、ｎは１または２であり、Ｒは−NCS、−NH−CO
    −CH2−Br又は−N2−Brである］ で示されるキレート化剤（LiLo）。
  8. 【請求項８】請求項７に記載のキレート化剤に結合して
    いる放射性核種を含む錯体。
  9. 【請求項９】請求項７に記載のキレート化剤に結合して
    いる金属を含む錯体。
  10. 【請求項１０】請求項７に記載のキレート化剤に結合し
    ているポリペプチドを含む複合体。
  11. 【請求項１１】前記ポリペプチドが抗体である請求項10
    に記載の複合体。
  12. 【請求項１２】前記キレート化剤に結合している放射性
    核種を含む請求項10に記載の複合体。
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